JPH07502027A

JPH07502027A - 分泌免疫の再構成のためのポリエチレングリコール−イムノグロブリンｇ接合体を含有する経口薬剤組成物および分泌免疫を再構成する方法

Info

Publication number: JPH07502027A
Application number: JP5508435A
Authority: JP
Inventors: カニンガム−ランドルス，シャルロット
Original assignee: マウント　シナイ　スクール　オブ　メディスン　オブ　ザ　シティー　ユニバーシティー　オブ　ニューヨーク
Priority date: 1991-10-28
Filing date: 1992-10-15
Publication date: 1995-03-02
Also published as: EP0614373A4; EP0614373A1; US5169627A; WO1993008838A1; CA2122374A1; AU2885892A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】分泌免疫の再構成のためのポリエチレングリコール−イムノグロブリンＧ接合体を含有する経口薬剤組成物および分泌免疫を再構成する方法産業上の利用分野本発明は、ポリエチレングリコール−イムノグロブリン、特に、ポリエチレングリコール−イムノグロブリンＧ（ＰＥＧ−Ｉ　ｇＧ）接合体を含有する経口薬剤組成物、および分泌免疫を再構成するための胃腸分泌免疫不全である患者へのＰＥＧ−１ｇＧ接合体の経口投与に関するものである。

胃腸免疫機構の成分は、バイエル板に集められたリンパ系組織、上皮内リンパ球、食作用細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ）、抗体、および補体成分からなる。分泌ＩｇＡは胃腸機構の主要な抗体である。分泌ＩｇＡは、２つの付加的ポリペプチド鎖である、Ｊ鎖および分泌成分が存在することにより血清１ｇＡとは異なる。この付加構造のために、分泌ＩｇＡはタンパク質分解消化に抵抗する。

分泌免疫不全は、様々な先天的、生理的、または病的機構から生じ、一般に遭遇する疾病である。乳児は通常、生後数か月に亘りＩｇＡが非常にわずかな量しか産生されないので、分泌１ｇＡ不全を有する。（この状況は、乳児が、分泌１ｇＡを含有する母乳を摂取する場合、改善される。）さらに、選択的なＩｇＡ不全の患者または普通の免疫不全の患者はまた、ＩｇＡが欠如している。化学療法および放射線を受ける患者においては、二次分泌ＩｇＡ不全となるＩｇＡ産生プラズマ細胞が破壊される。さらに、例えば、骨髄移植の宿主、およびＨＩＶ感染による後天性免疫不全において、後天性持続性分泌１ｇＡ不全の実例が生じる。

乳児における分泌１ｇＡ不全を克服する際の母乳の効果から明らかなように、抗体の経口投与には治療の利点があり得る。ヒトの母乳、特にヒトの初乳は、経口から投与するためのイムノグロブリンの理想的な形状を供するかもしれないが、主に困難なことは、この物質の調達、調製、殺菌、および標準化にある。さらに、母乳はウィルス感染を伝染させる可能性がある。

分泌免疫を再構成するための市販のプール血清イムノグロブリンの経口使用を評価する研究はわずかじか行なわれていない（表１を参照のこと）。これらの研究はある程度成功していると報告されているが、非保護血清イムノグロブリンのタンパク質分解消化のために、胃腸系における血清イムノグロブリンの安定性は疑わしい。トリプシンおよびペプシンのような酵素は血清イムノプロプリンを攻撃し、この血清イムノプロプリンをバクテリアのような免疫学的に望ましくない物質に対して無能にする。

本発明の目的は、タンパク質分解消化に抵抗するプールヒト血清イムノグロブリンＧまたは血清ＩｇＡから作られる経口薬剤組成物、およびその経口投与により胃腸免疫不全の患者における分泌免疫を再構成する都合のよい手段を提供することにある。

発明の概要イムノグロブリンＧのような血清イムノグロブリンを有する、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、グルコシド、アルブミン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アミノ酸ポリマー、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸、または好ましいポリエチレングリコールと結合した接合体は、免疫活性を維持しつつ、腸酵素による分解に対して実質的な抵抗性を示す。したがって、これらのイムノグロブリン接合体を、胃腸免疫不全の患者を扱う経口投与治療に用いて、分泌免疫を再構成することができる。ＩｇＧを含有する好ましい接合体は、約２７％未満のＩｇＧリシン残基がＰＥＧに結合するように、１：５から１　：　１０００までの範囲の割合で活性化ＰＥＧとＩｇＧとを反応させることにより作られる。

接合体を好ましくは、接合体および薬学的に許容できる経口担体からなる薬剤組成物に配合する。

特に乳児への投与については、好ましい経口担体はミルク、またはミルク配合物である。

簡単な図面の説明図ＩＡは、補体成分Ｃ３ｃに対する抗体で被覆したマイクロタイタ板（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ）に結合するＰＥＧ接合体ＡＳＢ、およびＣの、天然のＩｇＧと比較して低減した能力を説明している。

図ＩＢは、補体成分Ｃ３ｃに対する抗体で被覆したマイクロタイタ板に結合するＰＥＧ接合体りおよびＥの、天然のＩｇＧと比較して低減した能力を説明している。

図ＩＣは、補体成分Ｃ３ｃに対する抗体で被覆したマイクロタイタ板に結合するＰＥＧ接合体Ｆ５０およびＦ　１００の、天然のＩｇＧと比較して低減した能力を説明している。

図２Ａは、トリプシンによる消化に対する非接合ＩｇＧの感受性を示す。

図２Ｂは、トリプシンによる消化に対するＰＥＧ−ＩｇＧ接合体Ａの低減した感受性を示す。

図２Ｃは、トリプシンによる消化に対するＰＥＧ−ＩｇＧ接合体Ｂの低減した感受性を示す。

図２Ｄは、トリプシンによる消化に対するＰＥＧ−ＩｇＧ接合体りの低減した感受性を示す。

図２Ｅは、トリプシンによる消化に対するＰＥＧ−ＩｇＧ接合体Ｅの低減した感受性を示す。

図２Ｆは、トリプシンによる消化に対するＰＥＧ−ＩｇＧ接合体Ｆ５０の低減した感受性を示す。

図２Ｇは、トリプシンによる消化に対するＰ　ＥＧ−１ｇＧ接合体Ｆ１００の低減した感受性を示す。

図３Ａは、キモトリプシンによる消化に対する非接合ＩｇＧの感受性を示す。

図３Ｂは、キモトリプシンによる消化に対するＰＥＧ−ＩｇＧ接合体りの低減した感受性を示す。

図３０は、キモトリプシンによる消化に対するＰＥＧ−ＩｇＧ接合体Ｅの低減した感受性を示す。

図３Ｄは、キモトリプシンによる消化に対するＰＥＧ−ＩｇＧ接合体Ｆ５０の低減した感受性を示す。

図４Ａは、ペプシンによる消化に対する天然１ｇＧの感受性を示す。

図４Ｂは、ペプシンによる消化に対するＰＥＧ−ＩｇＧ接合体Ｆ１００の低減した感受性を示す。

図４０は、ペプシンによる消化に対するＰＥＧ−ＩｇＧ接合体Ｃの低減した感受性を示す。

実施例ここに用いているように、ポリエチレングリコール−イムノグロブリン接合体は、第１アミン（アミノ末端およびリシン残基）によりポリエチレングリコールに共有結合した血清イムノグロブリンである。特に、接合体中のイムノグロブリンは、血清１ｇＧまたは血清ＩｇＡであってもよい。これらのイムノグロブリンは、血清試料から採取してもよいが、合成技術が利用できれば、合成により作成できる。したがって、「血清イムノグロブリン」という用語は、接合体のイムノグロブリン部分の必要な供給源というよりもむしろ構造を定義することを意図している。

ポリエチレングリコールは、活性を著しく減少させることなくイムノグロブリンを保護するのに十分なサイズでなければならない。約２０００から約８０００までの範囲の分子量を有するＰＥＧを適切に用いる。

そのようなＩ　ｇ−ＰＥＧ接合体は免疫学的に活性であるが、タンパク質分解酵素に対してより大きな抵抗性を有し、したがって、分泌免疫の再構成のために経口に用いられる。

ＰＥＧ−１ｇＦ接合体は、イムノグロブリン分子をＰＥＧに付着する異なる化学方法を含む少なくとも３つの方法により製造できる。ＰＥＧ・イムノグロブリンのモル比は、用いる方法により、約１＝１から１　：　１０００までの範囲で変化してもよい。・本発明に使用するＰＥＧ−Ｉ　ｇ　（Ｉ　ｇＧまたはＩｇＡのいずれか）接合体は、ヒトの血清から得られる濃縮１ｇから形成できる。血清イムノグロブリンを、塩基緩衝液、例えば、０．ＯＩＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，８中に溶解させ、緩衝液に対して透析して残留塩を除去する。次いで濃縮血清１ｇと、１．１′−カルボニルジイミダゾール、または塩化シアヌルもしくはスクシニルスクシンアミドのいずれかを用いる化学工程により得られる活性化ＰＥＧとを結合させて、接合体を形成する。

１．１′−カルボニルジイミダゾールにより活性化されたＰＥＧを用いて製造したＰＥＧ−１ｇ接合体は、天然■ｇＧの抗原結合能と実質的に等しい抗原結合能を示す。ＰＥＧ−ＩｇＧ接合体に含まれるイムノグロブリンＧは、タンパク質またはウィルスのスペクトルを完全に結合することができる。スクシニルスクシンアミドにより活性化したＰＥＧを使用することにより、同様に広い結合特性を有するＩｇ接合体が得られる。しかしながら、塩化シアヌル活性化方法を使用することにより、ｉ　：　ｉｏｏはど低い結合比率で抗体結合能をある程度損失する。１：２８８の比率において、抗体結合能は失われる。これは、１　：　１０００の結合比率で抗体結合能が損失するという公表済結果と一致する。

リング等、免疫学的方法のジャーナル、５９　：　３２７−５３７（１９８３）。

ＰＥＧ−ＩｇＧ接合体はまた、トリプシン、キモトリプシンおよびペプシンによる酵素開裂に対して比較的耐えられるようになる。ＰＥＧはイムノグロブリン分子のりシン残基に主に結合し、トリプシンは、リシンまたはアルギニン残基に与えられたペプチド結合を開裂するという事実の観点から、トリプシンに対する抵抗性が増大する機構は理解できる。ＰＥＧによりリシン残基を塞ぐ比率は明らかに、トリプシン活性をほとんど完全に阻害するのに十分である。

ＰＥＧ−１ｇ接合体はまた、キモトリプシンの作用に感受性がほとんどなく、キモトリプシンはチロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンに隣接したペプチド結合で開裂し、したがって、ＰＥＧ分子により攻撃された立体障害はありそうな機構である。ペプシンについて言えば、ペプシンは、ＩｇＧ分子のヒンジ領域の所定の領域で開裂するので、ペプシン開裂に対するＰＥＧ−Ｉｇ接合体の抵抗性は、ヒンジ領域の近くの結合ＰＥＧ残基による立体障害によるよってある。

したがって、天然分泌ＩｇＡの特性にがなりよく似ている特性を有し胃腸１ｇＡ免疫不全の患者における分泌免疫を再構成する経口投与に適している。分泌１ｇＡのように、ＰＥＧ−１ｇ接合体は、胃腸系に存在する酵素によるタンパク質分解開裂に耐えることができる。分泌１ｇＡと同様に、ＰＥＧ−１ｇもまた、抗原を能率的に結合できる。

さらに、ＰＥＧ−ＩｇＧ接合体は、天然１ｇＧよりもよくは補体を固定せず、Ｆｃ受容体に対する結合は減少している。分泌１ｇＡは、胃腸内腔には通常細胞は発見されない顆粒球および単球上に主に存在するＦｃ受容体に結合する。

特性におけるこれらの類似性は、ＰＥＧ−１ｇ接合体が胃腸系における分泌１ｇＡの役割、すなわち、「慎重な家政婦（ｄｉｓｃｒｅｅｔ　ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｅｒ）　Ｊの役割を努めるのを助ける。

したがって、ＩｇＡと同様に、ＰＥＧ−１ｇ接合体は、能率的に抗原と結合できるが、細胞への補体の固定と結合は制限されるので、局所炎症または他の免疫活性化はほとんどおこらない。

これらの特性により、ＰＥＧ−ＩｇＧまたはＩｇＡ接合体は、分泌１ｇＡ不全のヒトの治療に有用となる。これらの免疫学的に損傷した患者は、生後数か月の乳児、選択的なＩｇＡ不全または普通の様々な免疫不全の患者、化学療法または放射線の結果として二次１ｇＡ胃腸免疫不全により免疫学的に損傷した患者、および骨髄移植またはＨＩＶ感染の結果としての後天性持続性分泌ＩｇＡ不全の患者を含む。そのような患者は、ＰＥＧ−イムノグロブリン接合体の効果的な量の経口投与により助けてもよい。特に、体重１ｋｇ当たり５０ｍ　ｇを１日２回から、体重１ｋｇ当たり１００ｍｇを１日４回までの範囲の投与を行なって、有用な治療結果を得るべきである。

経口投与治療として使用するために、ＰＥＧ−ＩｇＧ接合体は好ましくは、接合体および経口担体からなる経口薬剤組成物として配合する。そのような組成物において、経口担体は、タブレット（例えば、ラクトース）または調製放出もしくは保護（例えば、腸の）コーティングシステムを製造するのに使用する従来の賦形剤であってもよい。経口担体はまた、少なくとも１つのフレーバー成分を含有する水性液体担体であってもよい。特に乳児を治療するための、好ましい液体担体（フレーバー成分を含む）は、ミルク、ミルク代替物（配合物）およびフルーツジュースであるが、人工フレーバーまたは甘味料もしくは天然フレーバー抽出物を含有する液体組成物を使用してもよい。

実施例１ｐＨ７，８の０．ＯＩＭのリン酸ナトリウム緩衝液中に血清イムノグロブリンＧを溶解させることにより、血清イムノグロブリンＧ試料を調製した。緩衝液に対して生成した溶液を透析して、残留塩を除去した。ＩｇＧについてＥ１°’２１！Ｏｎ５として１３８の吸光率を用いて、イムノグロブリンＦの最終濃度の測定を分光光度分析により行なった。プラズマタンパク質中のパトナムＦ、　Ｗｌ、パトナムＦ、　Ｗ、版、アカデミツクプレス１９７５．６２頁を参照のこと。

実施例２ビューロチャンプ等の方法、分析生化学１３１　：２５−３３（１９８３）にしたかって、１．１′　−カルボニルジイミダゾールによるポリエチレングリコール（ミズーリ州、セントルイス、シグマケミカル社）の活性化を行なった。最初に３７℃のジオキサン中にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（分子量が２．０００または８．０００）を溶解させて５０ｍＭの濃度にした。次に、１．１′　 −カルボニルジイミダゾール（シグマ社）を加えて、５００ｍＭの最終濃度とした。ＰＥＧと１．１′　−カルボニルジイミダゾールの溶液を３７℃で撹拌しながら２時間に亘り培養し、活性化ＰＥＧを得た。

７６ｍｍのシアフロ限外濾過膜（Ｘ　Ｍ　５０）を用いて、アミコン細胞中の食塩加リン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）に対して活性化ＰＥＧ混合物を広く透析し、残留カルボニルジイミダゾールを除去した。生成した活性化ＰＥＧ溶液を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥し、乾燥貯蔵した。

実施例３実施例２の方法により製造した活性化ＰＥＧをＯ，ＯＩＭのホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８，５中に様々な血清イムノグロブリン濃度に溶解させ、４℃で９６時間に亘り１：５から１　：　１０００までの範囲のモル比のＰＥＧ−１ｇＧ接合体を得た。これらの溶液を、アミコン細胞において圧透析（ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｄｉａｌｙｓｉｓ　）または凍結乾燥により、生物学的活性を評価する必要に応じて濃縮しまた。

実施例４アブチョウスキー等、生物化学ジャーナル２５２　：　３５７８−３５８１．１９７７の方法を用いて、ポリエチレングリコールの活性化を行なった。１０ｇの無水炭酸ナトリウムを含有する４゜Ｏｍｌの無水ベンゼン中に５．５ｇの塩化シアヌルを溶解させた。Ｐ　Ｅ　Ｇ　２０００または８０００　（１９ｇ）を加え、混合物を１６時間に亘り室温で撹拌した。溶液を濾過して、液体に６００ｍ１の石油エーテルを加え、沈殿物を集積した。沈殿物（活性化ＰＥＧ）をベンゼン中に再度溶解させ、さらに２度石油エーテル中で再形成させた。

実施例５ＰＥＧ−ＩｇＧ接合体を形成するために、実施例４にしたがって調製した活性化ＰＥＧを、１：５がら１：５００まテノ範囲（ＤＰ　ＥＧ　：　ｌ　ｇＧ−Ｔ− ル比て、ｐ　Ｈ９，２）０．１　Ｍホウ酸塩緩衝液中のＩｇＧに加えた。透析溶液としてｐＨ７゜３の０．０１Ｍリン酸塩緩衝液を用い、アミコン細胞中の７６ｍｍシアフロ限外濾過膜（Ｐ　Ｍ　１０）を用いて、混合物を４℃で１時間に亘り培養した。

実施例６ジヨセフＭ、およびルイシＰＬ、（マクロモル、生化学生物理学７　：　１７５ −１９８４）によりポリエチレングリコールを活性化する第３の方法は、以下のようにメトキシポリエチレングリコールを活性化するスクシン無水物を用いることによるものである。４ｍｌのピリジンおよび５ｇのスクシン無水物を含有する２５０　ｍ　ｌの１．２−ジクロロエタン溶液中に５０ｇのＰＥＧを溶解させる。窒素雰囲気下で３日間の還流後、溶液を濾過し、溶媒を蒸発させ、残留物を１００ｍ１の水中に溶解させる。この残留物を５０ｍ　ｌのジエチルエーテルで２度洗浄し、ＰＥＧ−スクシネートを水相から抽出し、５０ｍ　ｌのクロロホルムで２度洗浄する。クロロホルムを蒸発させた後、約４３ｇのＰＥＧ−スクシネートを得る。

アンダーソン等（アメリカ化学協会ジャーナル、８６　二１８３９．１９６４）　、により記載され、アブチョウスキー等により適応された方法にしたがって、ＰＥＧ−スクシネートを、３７℃で２００　ｍ　ｌのジメチルホルムアミド中に溶解させ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１０％モル過剰）を加える。

溶液を０℃に冷却し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとモル量て等しい量のジシクロヘキシルカルボジイミドを１０ｍ１のジメチルホルムアミド中に溶解させ、これを撹拌し続けなから溶液に滴状に加える。混合物を２４時間に亘り室温で放置し、濾過する。１００　ｍ　ｌの冷たいベンゼンを加え、０℃で２００　ｍ　ｌの石油エーテルを滴状に加えることにより、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルスクシネート（ＳＳＳ−ＰＥＧ）を沈殿させる。沈殿物を焼結ガラスフィルタ上に集積する。ベンゼン中の溶解と、石油エーテルにより沈殿を３回繰り返す。５Ｓ−ＰＥＧをデシケータ中に一２０℃で貯蔵する。

実施例７以下の方法により、ＰＥＧ−イムノグロブリンを調製する。実施例６により調製した１５ｇのＰＰ−ＰＥＧを、１００ｍ１の０．０５Ｍリン酸塩緩衝液、０．８５％ＮａＣ１，ｐＨ７，２（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中の１００−１０００ｍｇのイムノグロブリン中に加える。１５ｇ　５Ｓ−ＰＥＧｏ混合物を室温で３０分間に亘り撹拌し、ミリポア濾過（１，２μｍ膜）により浄化する。上述したようにアミコン細胞を用いて１０容量の緩衝液に対する透析により非結合５Ｓ−ｒ’ＥＧを除去する。ｒ’ＥＧ−ＩｇＧの各試料を濾過により殺菌し、４℃で貯蔵する。

実施例８１・５から１．　：　１０００まての範囲のモル比を有する様々なＰＥＧ　ＩｇＧ接合体を製造した。接合の度合いを決定するために、第１アミンの置換の度合いを測定した。これを行なうために、利用できる第１アミンにＯ−フタルアルデヒド試薬（イリノイ州、ロックフォード、ピアース、フルオルアルデヒド）を連結することにより製造したフルオレセインの量を測定した。これについて、Ｉ　ｇＧ−ＰＥＧ接合体または非修飾１ｇＧを、ＰＢＳ中で５０．２５．１２．５および６．２５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。これらの試料のＩｇＧａ度を測定するために、ＰＥＧはこの波長では吸収しないので、２８０ｎｍでの分光光度読取りを用いる紫外線吸収法を用いた。ミクロフルオルマイクロタイタ板中のこれらの溶液の１００μｍのアリコート（バージニア州、アレキサンドリア、ダイナチックラボラトリ−社）に、１００μｌのフルオルアルデヒドを加えた。非修飾１ｇＧを１００％の蛍光として、各々の接合体の蛍光度を測定した；これより、ＰＥＧの第１アミンへの結合百分率が計算できた。活性化ＰＥＧはいずれかの活性化方法により第１アミン（Ｎ−末端およびリシン残基）にほとんど結合するので、蛍光の損失が連結したＰＥＧの量に比例する。表２は使用した連結比および両方法を用いて連結した第１アミンの百分率を示す。

実施例９修飾していない同一濃度のＩｇＧに対するＰＥＧ−ＩｇＧ接合体の抗体結合能を比較することにより、抗体結合の維持について試験した。ＰＥＧ−ＩｇＧ接合体の抗体結合は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにより測定した。これについて、ｐＨ９，６の０．１Ｍ炭酸塩緩衝液中の１０ｇｇ　／　ｍ　ｌの様々なタンパク質の微生物抗原１００μｍを用いて、マイクロタイタ板にューヨーク、パンガードインターナショナル、マキシソープ、ＮＵＮＣ）のウェルを被覆するのに用いた。使用した抗原は、卵白アルブミン（３倍結晶化、シグマ）、ウシカゼイン（シグマ）、ウシイムノグロブリン（シグマ）、破傷風トキソイド（ウェス−アーストラボラトリー）およびおたふくかぜ抗原（マークンヤープスおよびドーム）であった。おたふくかぜ、サイトメガロウィルス、トキソプラズマ症、風疹、単純ヘルペス、およびヘルペス帯状庖疹に対する抗体もまた、市販の標準キット（フロリダ州、マイアミ、ジアメディックス）を用いてＥ　Ｌ　１．　Ｓ　Ａにより測定した。接合体を試験するために、ＰＥＧ−ＩｇＧ接合体、または比較のために非修飾１ｇＧを希釈して、ＰＢＳ含有含有トウレーンｗｅｅｎ　）　０．１％（シグマ）中の０．１ｍｇ／ｍｌとした。これらの溶液の１００μｌのアリコートを、トウィーン０．１％を含有する通常の生理食塩水で事前によく洗浄した抗原被覆ウェルに加えた。３７℃で３時間（または４℃で一晩）後、ウェルを再度洗浄し、ｒ’ Ｂ５−１−ウィーン中で１・１０００に希釈した１００μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ接合体（カリフォルニア州、バーリンゲーム、タイ）を各々のウェルに加えた。これらのウェルを３７℃で３時間に亘り培養して洗浄し、基質溶液にトロフェニルホスフェート（Ｎ　Ｐ　Ｐ）　、０．ＯＯｌ、’ＭのＭｇＣ１を含有する０、１ＭのトリスＨＣＩ中て１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。マルチスキャンタイタテツクマイクロタイタ板読取器（バージニア州、マツクリーン、フローラボラトリーズ）により生成した溶液を読んだ。

表３は、タンパク質抗原、破傷風、ニワトリ卵白アルブミン、おたふくかぜ、ウシイムノグロブリンおよびウシカゼインに対して試験した接合体のデータを示す。全体的に、八からＬまてのＰＥＧ　ＩｇＧ接合体は、抗原被覆板に結合できたか、ある接合体は、いくつかの抗原に対して、天然１ｇＧと比較して、減少した結合能を有した。例えば、接合体Ｆ５０は、破傷風トキソイドについていくぶん減少した結合能を有し、接合体におよびＬはカゼインに対して減少した結合能を有し、接合体Ｃは全ての抗原に対して減少した結合能を有した。約２７％までの遊離リジンがＰＥＧに連結する場合、免疫活性が維持されるようである。接合体Ｉ　（塩化シアヌル；　１　：　２８８の連結比）は、どの抗原被覆板に対する結合能を実質的に損失した。

同様に、試料Ａからしは、標準キットＥＬ　Ｉ　ＳＡ中で試験した様々なタンパク質抗原にきわめて結合することができ、これらの接合体の全ては、標準既知正１ｇＧ試料、および与えられた板対照により判断する場合、保護する量の抗体を含有することが分かった。再度、接合体Ｉ（１：２８８の連結モル比）は不活性であった（表４）。

実施例１０Ｐ・ＥＧ−ＩｇＧ接合体かＦｃ受容体に結合できるか否かを試験するために、接合体を熱凝集させて、次いでＩｇＧの豊富なＦｃ受容体を産生ずるマクロファージ細胞系である、Ｕ９３７への結合について試験した。熱凝集したヒトＩｇＧおよびＰＥＧ−接合体は、Ｐ、ＢＳ中の各々の１０ｍｇ／ｍｌ溶液を３０分間に亘り６３°に加熱することにより製造した。短時間の遠心分離（３０００ｒ　ｐ　ｍで５分から）により最大の（目に見える）凝集物を除去した後、これらの溶液の上澄液に含まれる凝集物を用いて、マクロファージ細胞系Ｕ９３７上に存在するヒ）Ｆｃ受容体への結合について試験した。これらの細胞（Ｄｒ、に、スパーバーの贈与（ｇｉｆｔ））ヲ、１０％のウシ胎児血清、１０ｍＭのグルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６４０にューヨーク州、グランドアイランド、ギブコ）を含有する媒質中において、３７° Ｃて５％の００２インキユベータ中で維持した。２％のＢＳＡおよび０．１％のトウィーン２゜を含有するＰＢＳ中に３回洗浄した２００μｍの５Ｘ］０’°細胞／ｍｌを、１０または５０μ＋の凝集１ｇＧまたはＰＥＧ−ＩｇＧ接合体により、３７℃で３０分間、そして４℃で３０分間培養した。次いて細胞を２％のＢＳＡ／ＰＢＳ４ウィーン中で３回やさしく洗浄し、各々の管に、２５μＩのフルオレセイン接合Ｆ　（ａ　ｂ）　’　２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（タイ）を加えた。４ ℃での４５分間の培養後、細胞を再度洗浄し、各々のアリコートについて、蛍光の度合いをフロー血球計算器（カリフォルニア州、ヘクトンーディケンソンマウンテンビュー、ＦＡＣ３／”ＩＶ）により測定した。

表５に結果を示す。ＰＥＧ−ＩｇＧ接合体はＵ９３７に結合したが、ＰＥＧの量を多く産生ずるイムノグロブリンについて検出した蛍光は減少した。

実施例１１ＰＥＧ−接合体が補体成分Ｃ３を固定できるか否かを測定するために、２つの方法を用いた。第１の方法において、ポリクローナル抗Ｃ３ｃまたはＣ３ｄ抗体にューヨーク州、ウェストベリー、ダコー、精密化学）で被覆したマイクロタイタ板に結合する能力について、熱凝集１ｇＧに対する比較として、熱凝集接合体を試験した。このことについて、マイクロタイタ板をウサギ抗ヒトＣ３ｃまたはＣ３ｄにより、０、ＩＭの炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，６中の２０μｇ／ｍ１にて、４℃で１６時間に亘り被覆した。熱凝集したＰＥＧ　ＩｇＧ接合または非接合１ｇＧの１００μｌの様々に希釈したアリコート（ｔ　ｎ　ｇから１００μ ｇ／ｍｌのＩｇＧを含む）を標準量の新鮮な正常血清（Ｃ３の供給源として）により培養した。３７℃で３時間に亘る培養後、ウェルを再度洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−アルカリ性ホスファターゼ接合体を加えた。ＮＰＰ溶液を加えた後、４０５ｎｍて生じた吸収を測定した。この試験は、ＩｇＧ分画に結合するＰＥＧの量が増加するにつれ、被覆したマイクロタイタ板上に検出されるＩｇＧの量が減少したことを示した（図ＩＡ、ＢおよびＣ）。

第２の方法において、２２５　μｇ／ｍｌ　２２．５μｇ／ｍｌまたは２．２５ μｇ　／′ｍ　ＩのＰＥＧ−Ｉ　ｇＧまたは天然１ｇＧとウシに一カセインとを５０μｌのＰＢＳ中２．５：１のモル比で混合することにより、免疫複合体を形成した。ＰＢＳ−ｏ、ｉ％のトウィーンを加えて、容量を３５０μｍとし、にカセイン結合抗体を含有していない３５０μｌの新鮮な正常ヒト血清を加え、３７ ℃で３時間に亘り培養を続けた。次いで洗浄後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−アルカリ性ホスファターゼ接合体を加え（ＰＢＳ−）ウィーン中テ１：１５ｏｏ）、３７ ℃で３時間に亘り培養を続けた。次いて板を洗浄腰普通にＮＰＰで展開させた。

試験したイムノグロブリンの３つの濃度で、正常ヒト血清に露出した多くのＩｇＧ−に−カゼイン免疫複合体が、ＰＥＧ−ＩｇＧを用いて形成した免疫複合体よりも、マイクロタイタ板に結合できた。表６は１つの濃度（２２，５μｇ／ｍ１）についてのデータを示す。ＰＥＧ　ＩｇＧ結合は、天然ＩｇＧについて発見された結合の４２．０から７９．６パーセ上述した方法のいくつかにおいて、ＰＥＧ−ＩｇＧ接合体の生物学的活性を測定するためのこれらの接合体に対する第２の抗体の結合を用いて、天然１ｇＧに対してＰＥＧ−ＩｇＧ接合体を比較したので、天然１ｇＧに対する比較におけるこれらの接合体に対する第２の抗体の相対結合を測定する実験を行なった。

天然１ｇＧに対する比較においてＰＥＧ−ＩｇＧ接合体の生物学的活性を測定するのに用いた検定は、アルカリ性ホスファターゼに接合したかまたはフルオレセインで標識した第２の、またはサンドウィッチした抗体によるＩｇＧの検出に依存する。これらの実験を説明するために、ＰＥＧ−ＩｇＧ接合体が天然ＩｇＧと同一の度合いで検出できるか否かを測定する必要があった。このことを確認するために、２つの方法を用いた。第１の方法において、ＰＥＧ−ＩｇＧ接合体または天然１ｇＧを、０．ＩＭの炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９，８中で１０Ｍｇ／ｍｌの濃度（２８０ｎｍの吸収により）に希釈し、３７℃で３時間に亘りマイクロタイタ板を被覆するのに用いた。洗浄後、アルカリ性ホスファターゼヤギ抗−ヒトＩｇＧ（タボ）を各々のウェルに加え、さらに３７℃での３時間の培養後、ウェルを洗浄し、ＮＰＰを加えた。板を通常に読み取った。

第２の方法において、ＰＥＧ＝−１ｇＧ接合体および天然ＩｇＧをＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｄｉに希釈し、カリフォルニア州、ブレア、ベックマンアレイタンパク質システムおよびポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ（ベックマン）を用いた標準比濁計方法により試験して、ＩｇＧ標準曲線を引用してＩｇＧ濃度を測定した。

表７は、比濁計により検出についての、マイクロタイタ板のウェルに被覆したＰＥＧ−ＩｇＧ接合体へのアルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトｌ、、ｇＧの結合および非標識ヤギ抗ヒトＩｇＧの結合を示す。接合体Ｂ１Ｃ１およびＦ　１０００をマイクロタイタ板を被覆するのに用いた場合、前記第２の抗体の結合のある程度の減少がこれらの接合体について見られた。同一の接合体を溶液中で試験した場合、接合体Ｃのみが第２の抗体による結合が著しく減少したことを示した。したかって、溶液中で行なった全ての実験について、第２の抗体の使用による接合体の試験は、このシステムにおいて不十分にしか検出されない接合体Ｃを除いて、正当であることが分かった。

実施例１３本発明の主な目的は、ＩｇＧを酵素開裂に対して抵抗性にするために試験した免疫学的活性１ｇＧを提供することにあった。この目的が満たされたか否かを試験するために、ＩｇＧまたは様々なＰＥＧ−ＩｇＧ接合体の溶液をトリプシン、キモトリプシンまたはペプシンに露出した；４次いでＩｇＧの分断度合いを高圧液体クロマトグラフィーにより評価した。

１、トリプシン：　ＩｇＧ−ＰＥＧ接合体または非修飾ＩｇＧの試料（１５ｍ　ｇ／ｍ　１　）をＯ，’０５ＭのトリスＨＣＩ緩衝液、ｐＨ８，０中、３７℃で３時間に亘りトリプシン（タイプＩＩＩ　、シグマ’）　（１：　１００　）で培養した。この後、４倍の過剰のダイズトリプンンインヒビター（シグマ）を加えた。分析まで試料を一７０℃で冷凍した。

２、キモトリプシン：　天然ＩｇＧおよびＰＥＧ−ＩｇＧ接合体の試料（０，２Ｍのリン酸塩緩衝液ｐＨ７，０中４．５ｍｇ／ｍｌ）を、基体に対する酵素の比率か１：２００でキモトリプシン（シグマ、タイプＩＩＩ、ＴＬＣＫ処理、１ｍｇ当たり５４ユニツト）で消化した。これらの試料を室温で８時間に亘り培養し、次いて、ｐＨを６ＮのＨＣＩにより２．０に減少させることにより、反応を終結させた。ＨＰＬＣによる分析の前に、試料を一７０℃で冷凍した。

３、ペプシン：　ＩｇＧ−ＰＥＧまたは非修飾１ｇＧ試料を、３７℃で０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４，５中の１０ｍｇ／ｍｌて、１　：、１００の酵素基、体比率でのペプシンにュージャージー州、フリーホールド、ウォーシントンバイオケミーカル社）により培養した。ある実験において、１．３．５．７．９および１６時間で反応混合物からアリコートを取り出した。別の実験において、全ての反応を６時間で停止させた。反応を停止させるために、固体のトリス塩基を加えて、ｐ、Ｈを８．０にした。試料を分析するまで一７０°に冷凍した。

高圧液体クロマトグラフィーを行なって、酵素消化の前後てＰＥＧ−接合体のサイズを判定した。これを行なうために、スペロース１２カラムを備えた、ＦＰＬＣシステムにューンヤージー州、ピスカタウェイ、ファーマシアーＬＫＢ）を用いた。天然１ｇ’Ｇ、ＰＥＧ接合イムノグロブリン、または酵素消化した天然またはＰＥ、Ｇ接合イムノグロブリンの分画をカラムに装填し、平衡状態にし、０．０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，３中で測定しプこ。流速は０．３ｍｌ／分に設定し、０．５ｍｌの分画を集積１した。

図２は、天然１ｇＧまたはＰＥＧ　ＩｇＧ接合・体Ａ、Ｂ。

Ｄ、Ｅ、ｊ５０およびＦｌｏｏのトリプシン消化の結果を示している。天然ＩｇＧは２つの主なピークに分画されたが、接合体Ａはそのままであり、接合体はこの方法後にはほとんど完全にそのままであった。接合体り、Ｅ、Ｆ２Ｏ、およびＦｌｏｏは１つの主なピークのみを示し、実質的にトリプシンには影響を受けないことが分かった。

図３は、天然１ｇＧと比較したＰＥＧ−接合体のキモトリプシン消化の結果を示している。この酵素はＩｇＧをいくつかの断片に分画した。ＰＥＧ−１ｇＧＣ接合体この酵素の作用に対してほとんど感度はなかった。図３において、接合体り、ＥおよびＦ２Ｏの実施例を示す。

同様に、ペプシンによるＩｇＧまたはＰＥＧ−ＩｇＧ接合体の消化後、ＰＥＧ− １ｇＧＣ接合体よりそのままであることが分かり、主な開裂産生物はほとんどなく、酵素への露出から１０時間後でさえもＦ（ａｂ）’２断片が形成された。図３は、天然１ｇＧ、およびＦｌｏｏとＣ接合体のデータを示す。接合体Ｆ１００およびＣの消化から６時間後にいくつかの開裂産生物が形成されたが、その量は天然ＩｇＧの量の半分てあった。

酵素攻撃に対して著しい安定性を達成するために、約７％のりシンが望ましくは連結しているが、２７％より多くがＰＥＧと連結すると、抗体結合の損失が見られると結論付ける。塩化シアヌル法を用いる場合、より穏やかな方法を用いる場合よりも多くの抗体活性が失われる。Ｐ　Ｅ　Ｇ　２０００に対立するものとしてＰ　Ｅ　Ｇ３０００を用いると、同様の生物学的化合物が生成し、ＰＥＧ３０００を使用することにより、Ｆｃ受容体−・の接合体結合をより塞ぐことになり、おそらくはこれらの化合物の凝集に対する抵抗性のために、固定する補体Ｃ３が少なくなったことが分かる。

本　マイクロタイタ板のウェルに結合した対照１ｇＧ溶液のパーセント；全での溶液は１０μｇ／ｍｌの濃度である。

木本　比濁計により検出した対照１ｇＧ溶液のパーセント：全ての溶液には０．５ｍｇ／ｍｌである。

ＦＩＧ、ＩＡＦＩＧ、ＩＢＦ”ｌＧ、ＩＣＯｊｏ　２０　３０　４０　５０　６０　７０勺」シーｊＪＦＩＧ、　２ＡＦＩＧ、　２８ＦＩＧ、　２ＣＦＩＧ、　２０ＦＩＧ、　２ＦＦＩＧ、　３ＡＦＩＧ、　３８ＦＩＧ、３ＣＦＩＧ、　３Ｄ

Claims

【特許請求の範囲】

１．分泌免疫の再構成のための経口薬剤組成物であって、活性成分として免疫学的活性ポリエチレングリコール血清イムノグロブリン接合体を含有することを特徴とする経口薬剤組成物。
２．前記接合体中の血清イムノグロブリンがイムノグロブリンＧであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の経口薬剤組成物。
３．前記接合体中の血清イムノグロブレンがイムノグロブリンＡであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の経口薬剤組成物。
４．前記イムノグロブリンの利用できるリシンの６．０％から２７％までがポリエチレングリコールにより修飾されていることを特徴とする請求の範囲第１項から第３項いずれか１項記載の経口薬剤組成物。
５．前記経口薬剤組成物がカプセルまたはタブレットに形成されることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項いずれか１項記載の経口薬剤組成物。
６．経口担体がフレーバー成分を含有する水性液体であることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項いずれか１項記載の経口薬剤組成物。
７．前記接合体を、カルボニルジイミダゾール活性化ポリエチレングリコールとイムノグロブリンとを１：５から１：１０００までのモル比で反応させることにより形成することを特徴とする請求の範囲第１項から第６項いずれか１項記載の経口薬剤組成物。
８．前記接合体を、塩化シアヌル活性化ポリエチレングリコールとイムノグロブリンとを１：５から１：５０までのモル比で反応させることにより形成することを特徴とする請求の範囲第１項から第６項いずれか１項記載の経口薬剤組成物。
９．前記経口担体が、ミルク、乳児配合物またはフルーツジュースであることを特徴とする請求の範囲第６項記載の経口薬剤組成物。
１０．前記接合体を、スクシニルスクシンアミド活性化ポリエチレングリコールとイムノグロブリンとを１：５から１：１０００までのモル比で反応させることにより形成することを特徴とする請求の範囲第１項から第６項、または第９項いずれか１項記載の経口薬剤組成物。
１１．分泌免疫の再構成のための請求の範囲第１項から第１０項記載の経口薬剤組成物の使用方法。