SK285046B6

SK285046B6 - Chimérna protilátka, ktorá sa špecificky viaže na ľudský antigén, farmaceutický prostriedok s jej obsahom, spôsob jej výroby a použitie

Info

Publication number: SK285046B6
Application number: SK88-94A
Authority: SK
Inventors: Roland A. Newman; Nabil Hanna; Ronald W. Raab
Original assignee: Idec Pharmaceuticals Corporation
Priority date: 1991-07-25
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 2006-05-04
Also published as: PT100735B; DE69233011T2; JP3048640B2; ES2265005T3; EP1266965B1; EP1715045A2; DE69233011D1; NZ243706A; RO116404B1; AU2425592A; EP1266965A2; JPH06509708A; FI940336A; DK0605442T3; IL102640A0; ATE237638T1; ATE327331T1; EP0605442B1; NO940219L; FI940336A0

Abstract

Je opísaná chimérna protilátka, ktorá sa špecificky viaže na ľudský antigén, pričom nie je imunogénna u človeka, nie je rovnaká ako ľudská alebo šimpanzia protilátka a obsahuje celú variabilnú oblasť imunoglobulínu opice Starého sveta vybranej zo skupiny opíc rhesus, cynomolgus a paviána, a konštantné oblasti ľudského alebo šimpanzieho imunoglobulínu. Je tiež opísaný spôsob jej výroby, jej použitie a farmaceutický prostriedok s jej obsahom.

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka chimémej protilátky, ktorá sa špecificky viaže na ľudský antigén, vhodnej na humánnu terapiu, ďalej sa týka farmaceutického prostriedku s jej obsahom, spôsobu jej výroby a jej použitia. Tiež je opísaná rekombinantná nukleová kyselina obsahujúca DNA sekvenciu alebo sekvencie, ktoré kódujú chimému protilátku podľa vynálezu.

Doterajší stav techniky

Myšie monoklonálne protilátky sa používajú v diagnostike ľudských chorôb a v riešení základných problémov biologického výskumu. Tieto činidlá sú tiež užitočné v klinických skúškach ako terapeutiká na akútne a chronické ľudské choroby, vrátane leukémií, lymfómov, tuhých nádorov (napr. nádoru hrubého čreva, prsníka alebo pečene).

Boli vytvorené myšie/ľudské chiméme protilátky a ukázalo sa, že majú väzbové charakteristiky rodičovskej myšej protilátky a efektorové funkcie spojené s ľudskou konštantnou oblasťou. Pozri napr. Cabilly a kol., U. S. Patent 4 816 567; Shoemaker a kol., U. S. Patent 4 978 745; Beavers a kol., 4 975 369; a Boss a kol.: U. S. Patent 4 816 197, ktoré sú tu všetky zahrnuté ako odkaz. Vo všeobecnosti sa tieto chiméme protilátky konštruujú prípravou genómovej génovej knižnice z DNA extrahovanej z už existujúcich myších hybridómov Nishimura a kol., 47 Cancer Research 999, 1987. V knižnici sa potom vyhľadajú gény variabilných oblastí ťažkých a ľahkých reťazcov majúce správny typ preskupenia protilátkového fragmentu. Klonované gény variabilných oblastí sú potom ligované do expresného vektora obsahujúceho klonované kazety vhodných génov ľudskej konštantnej oblasti ťažkého a ľahkého reťazca. Tieto chiméme gény sú potom exprimované vo vybranej bunkovej línii, zvyčajne myšej myelómovej.

Takéto chiméme látky protilátky sa použili v humánnej terapii. Protilátky k týmto chimémym protilátkam však boli v rade prípadov vytvárané v ľudskom príjemcovi. Takéto protilátky proti chimémej protilátke znemožňujú pokračovanie terapie chimémymi protilátkami.

Erlich a kol., 34 Clinical Chemistry 1681, 1988. Erlich a kol., 7 Hybridoma 385, 1988. Erlich a kol., 6 Hybridoma 151, 1987. Erlich a kol., 1 Human Antibody Hybridomas 23, 1990 (neprípustné ako doterajší stav techniky k predloženej patentovej prihláške) tvrdia, že ľudské monoklonálne protilátky sú očakávaným zlepšením k myším monoklonálnym protilátkam v in vivo humánnej terapii. Tiež postulujú, že protilátky primátov, iné ako ľudské, napr. šimpanzie monoklonálne protilátky, budú tolerované v ľuďoch, pretože sú štruktúrne podobne ľudským protilátkam. Pretože ľudské protilátky sú neimunogénne v opiciach r. Rhesus (t. j. nevyvolávajú protilátkovu odpoveď), predpovedajú, že protilátky primátov budú neimunogénne v ľuďoch. Naznačujú, že testovanie protilátok v ľuďoch nebude potrebné, ak protilátka primáta má štruktúru konštantnej oblasti rovnakú ako ľudská alebo, prinajmenšom, ak štruktúra nie je odlišná viac ako sú ľudské protilátky odlišné medzi sebou navzájom. Teda navrhujú, že šimpanzie protilátky by mali byť užitočné v ľudskej terapii.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález sa týka chimémej protilátky, ktorá sa špecificky viaže k ľudskému antigénu, pričom nie je i munogénna u človeka, nie je taká istá ako ľudská alebo šimpanzia protilátka a obsahuje celú variabilnú oblasť imunoglobulinu opice Starého sveta vybranej zo skupiny opíc rhesus. cynomolgus a paviána, konštantné oblasti ľudského alebo šimpanzieho imunoglobulinu, pričom je získateľná spôsobom zahŕňajúcim kroky:

tvorbu protilátky opice Starého sveta proti ľudskému cieľu v opici Starého sveta vybranej zo skupiny opíc rhesus, cynomolgus a paviána, izoláciu nukleovej kyseliny opice Starého sveta kódujúcej celú variabilnú oblasť protilátky opice Starého sveta, poskytnutie ľudskej alebo šimpanzej nukleovej kyseliny kódujúcej ľudskú konštantnú oblasť ľudskej protilátky, ligáciu nukleovej kyseliny opice Starého sveta a ľudskej alebo šimpanzej nukleovej kyseliny za vzniku rekombinantnej nukleovej kyseliny, a expresiu rekombinantnej nukleovej kyseliny za tvorby chimémej protilátky.

Chiméma protilátka podľa vynálezu je terapeuticky účinná pri podávaní v dávke od 0,05 mg/kg do 100 mg/kg telesnej hmotnosti a obsahuje konštantné oblasti imunoglobulínových ťažkých a ľahkých reťazcov ľudskej protilátky a variabilné oblasti imunoglobulínových ťažkých a ľahkých reťazcov protilátky opice Starého sveta špecifickej na ľudský antigén.

Podľa výhodného uskutočnenia sa chiméma protilátka podľa vynálezu špecificky viaže k ľudskému antigénu vybranému z CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3. ELAM, LAM, CD25, CD4, CD 19. CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TN F a, TN F ,3, Tn antigénu. IL-1, IL-8, receptora ľudských T-buniek, CD3, CD28, CD8, CDlla, CDllb, CD11 c, CD18, CD5a, CD45, produktu neu onkogénu, MDR-1, TGFa, TGFa receptora. PDGF a CD71.

V ešte výhodnejšom uskutočnení chiméma protilátka špecificky viaže CD4 a obsahuje imunoglobulínové variabilné ľahké a ťažké reťazce obsahujúce peptidové sekvencie znázornené na obrázkoch 13 a 14. Takáto chiméma protilátka obsahuje ľudský imunoglobulínový ťažký reťazec gama-1 konštantnej oblasti a ľudský imunoglobulínový ľahký reťazec kapa alebo lambda konštantnej oblasti.

Navyše sa vynález týka použitia chimémej protilátky na výrobu liečiva na liečenie alebo prevenciu ochorenia, poruchy alebo podmienky vybranej zo skupiny pozostávajúcej z rakoviny, infekčného ochorenia, odmietnutia transplantovaného orgánu alebo tkaniva, autoimúnneho alebo zápalového ochorenia, poruchy alebo podmienky. Vynález je založený na objave, že vývojovo vzdialené opice (napr. pavián alebo makak, vrátane opíc cynomolgus a rodu Rhesus) na rozdiel od šimpanza, sú nielen dostatočne rozdielne od ľudí na to, aby sa v nich dali vytvoriť protilátky proti ľudským antigénom, dokonca k relatívne konzervovaným ľudským antigénom, napr. CD4 a CD54, ale sú aj dostatočne podobné ľuďom na to, aby mali protilátky podobné ľudským protilátkam tak, že nedôjde k žiadnej hostiteľskej imunitnej odpovedi, keď sa takéto opičie protilátky alebo od nich odvodené rekombinantné protilátky, zavedú do človeka.

Na rozdiel od protilátok skôr používaných na humánnu terapiu, protilátky podľa predkladaného vynálezu netrpia niektorými nedostatkami, napr. 1. imunogenicitou a vyvolávaním ľudskej antiprotilátkovej odpovede (human antíantibody, HAA) pri opakovanom podávaní potrebnom na liečenie chronických podmienok, 2. relatívne krátkym polčasom života v porovnaní s ľudskými protilátkami a 3. chýbajúcimi efektorovými funkciami k ľudským bunkám alebo komplentu. Neprítomnosť týchto nedostatkov predstavuje podstatný pokrok pre humánnu terapiu protilátkami vytvorenými podľa tohto vynálezu. Napríklad v prípade chronických ľudských chorôb, vrátane autoimúnnych alebo akýchkoľvek chorôb, kde je potrebné dlhšie podávanie protilátky, jednou z hlavných prekážok opakovanej protilátkovej terapie je hostiteľská odpoveď na terapeutickú protilátku HAA, odpovede sú často nepredvídateľné od pacienta k pacientovi. Takéto odpovede sú hlavne, aj keď nie výlučne, smerované proti konštantnej oblasti molekuly protilátky a sotva nastanú, často bránia ďalšej terapii danou protilátkou alebo inou protilátkou rovnakého izotypu, alebo zoslabujú účinnosť terapie.

Problémy HAA by sa potenciálne dali obísť použitím ľudských monoklonálnych protilátok. Tento prístup ale trpí etickými, klinickými a imunologickými obmedzeniami imunizácie ľudských subjektov mnohými antigénmi vybranými na tvorbu protilátok (napr. ľudskými antigénmi, kde tento výraz zahrnuje antigénne alebo imunogénne úseky ľubovoľného proteínu, polypeptidu alebo ich ekvivalentu, ktoré sa nachádzajú u ľudí). Prístup prihlasovateľa ako obísť tento problém, zahrnuje tvorbu protilátok potrebnej špecifickosti a žiadanej efektorovej funkcie a ich použitie na produkciu rekombinantných protilátok. Tieto rekombinantné protilátky vo všeobecnosti obsahujú príslušný úsek variabilnej oblasti protilátky odvodenej z imunizovanej opice a konštantnú oblasť protilátky z človeka alebo šimpanza. Takto sa zachovajú špecifiká a vysoké afinity monoklonálnych protilátok, a potrebné ľudské alebo šimpanzie konštantné oblasti majúce žiadané efektorové funkcie sa dajú ľahko vybrať.

Predkladaný vynález je ďalej založený na spôsobe amplifikácie opičích imunoglobulínových génov, napr. pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) z RNA extrahovanej z opičích lymfocytov s použitím syntetických oligonukleotidových primérov špecifických pre rodinu génov variabilných oblastí ťažkých a ľahkých reťazcov. Amplifikované gény alebo príslušné oblasti (napríklad oblasti, ktoré kódujú oblasti určujúce komplementaritu CDR, pozri Winter, GB2188638A, zahrnutá ako odkaz) sú klonovane do expresného vektora obsahujúceho ľudské alebo šimpanzie gény konštantnej oblasti na produkciu opičej/ľudskej rekombinantnej protilátky alebo vektora obsahujúceho opičí gén konštantnej oblasti na produkciu úplne opičej rekombinantnej protilátky žiadaného izotypu. Tieto protilátky predstavujú imunoterapeutické činidlá schopné lokalizovať a/alebo zabíjať príslušné cieľové bunky (napr. nádorové bunky) po in vivo podaní.

Takto vynález opisuje spôsob klonovania antigén-rozpoznávajúceho úseku variabilnej oblasti opičieho génu pre protilátku. Tento spôsob zahrnuje získanie nukleovej kyseliny, napr. RNA, z opice, tvorbu cDNA k RNA (s použitím reverznej transkriptázy), získanie priméru komplementárneho k sekvencií cDNA kódujúcej 5' vedúcu sekvenciu génu na protilátku, spojenie tejto cDNA a priméru na vytvorenie hybridného komplexu a amplifikáciu cDNA za tvorby nukleovej kyseliny kódujúcej variabilnú oblasť opičieho génu pre protilátku.

Pod „antigén-rozpoznávajúcim úsekom“ sa myslí jeden alebo viac úsekov variabilnej oblasti opičej protilátky, ktoré sú zodpovedné za väzbu protilátky a/alebo za rozpoznanie cieľového antigénu (alebo epitopu, alebo idiotopu) protilátkou. Toto napríklad zahrnuje CDR oblasti (pozri nižšie) alebo celé variabilné oblasti, alebo akúkoľvek kombináciu týchto dvoch oblastí vrátane akýchkoľvek zmien v kódujúcich oblastiach, ktoré môžu byť vyvolané na to, aby sa oblasti stali skôr „ľudskými“ ako „opičími“ bez zmeny špecifických väzbových vlastností protilátky. Ak sa použije len časť celej variabilnej oblasti, potom zostávajúce časti, t. j.

tzv. „základná štruktúra“, sú poskytnuté inou protilátkou, výhodne ľudskou alebo šimpanzou protilátkou (pozri nižšie) spôsobmi, na ktoré sa odkazuje a ktoré sú tu zahrnuté odkazmi.

Výrazy „variabilná oblasť“, „vedúca sekvencia“, „konštantná oblasť“ a „základná štruktúra“ sú tu používané spôsobom bežne uznávaným v odbore a príklady sú poskytnuté v citovaných spôsoboch a zahrnutých tu odkazmi.

Vo výhodných uskutočneniach je vedúcou sekvenciou ľudská, šimpanzia alebo opičia vedúca sekvencia s približne 60 bázami, príklady ktorých sú uvedené na obrázku 1.

Prihlasovateľ zistil, že opičia, šimpanzia a ľudská variabilná oblasť vedúcich sekvencií sú dostatočne podobné, aby priméry skonštruované na jeden boli vhodné na amplifikáciu druhého. V opísanom postupe je RNA dostatočne amplifikovaná na produkciu dostatočného množstva nukleovej kyseliny na umiestnenie tejto kyseliny do vnútra vektora na neskoršie klonovanie.

V druhom aspekte vynálezu sa opisuje spôsob výroby chimémej protilátky proti ľudskému cieľovému antigénu, ktorá je imunogénna u človeka, a ktorý zahŕňa kroky:

tvorbu protilátky opice Starého sveta proti uvedenému antigénu v opici Starého sveta vybranej zo skupiny opíc rhesus, cynomolgus a paviána, izoláciu nukleovej kyseliny opice Starého sveta kódujúcej antigén celú variabilnú oblasť protilátky opice Starého sveta, poskytnutie ľudskej alebo šimpanzej nukleovej kyseliny kódujúcej ľudskú konštantnú oblasť ľudskej protilátky, ligáciu nukleovej kyseliny opice Starého sveta a ľudskej nukleovej kyseliny za vzniku rekombinantnej nukleovej kyseliny a expresiu uvedenej rekombinantnej nukleovej kyseliny za tvorby chimémej protilátky.

Spôsob zahŕňa vytvorenie opičej protilátky k ľudskému antigénu v opici, izoláciu opičej nukleovej kyseliny kódujúcej antigén-rozpoznávajúci úsek variabilnej oblasti opičej protilátky. Poskytne sa ľudská nukleová kyselina kódujúca ľudskú konštantnú oblasť protilátky aje ligátovaná k opičej nukleovej kyseline za vytvorenia rekombinantnej nukleovej kyseliny. Táto rekombinantná nukleová kyselina sa potom exprimuje za tvorby požadovanej protilátky. Alternatívne sa môže použiť šimpanzia alebo opičia konštantná oblasť kódujúca nukleovú kyselinu na tvorbu rekombinantnej protilátky. Nachádza sa tu niekoľko, ak nejaké, rozdielov v aminokyselinovej sekvencií ľudských a šimpanzích konštantných oblastí (t. j. sú homológne) a tieto rozdiely prítomné medzi človekom a opicou sa môžu ľahko zamieňať štandardnými technikami, ak nukleová kyselina kódujúca opičiu konštantnú oblasť sa používa na vytvorenie rekombinantnej protilátky. Podstatné je, že sa produkuje protilátka, ktorá je menej imunogénna ako opičia konštantná oblasť, takže nenastáva žiadna významná imunitná odpoveď, ak je rekombinantná protilátka zavedená do ľudského tela. (Takéto oblasti protilátok sa tu uvádzajú ako homológne oblasti.) Potom rekombinantná protilátka je vybavená tak, aby bola funkčná rovnako ako ľudská protilátka vo svojej aminokyselinovej sekvencií, t. j. má konštantnú oblasť homológnu s konštantnou oblasťou ľudskej alebo šimpanzej protilátky. V súhrne, protilátka je natoľko ľudská, nakoľko je potrebné znížiť možnosť nežiaducej imunitnej odpovede k protilátke a obsahuje antigén-viažuci úsek opičej protilátkyPod pojmom „neimunogénna“ sa myslí, že protilátka vo väčšine ľudí nevyvoláva protilátkovú odpoveď sily postačujúcej na zníženie účinnosti pokračujúceho podávania protilátky počas obdobia postačujúceho na dosiahnutie dostatočného terapeutického účinku, napr. v porovnaní s myšou alebo myšou/ľudskou chimémou protilátkou. Výhodne sa nepozoruje žiadna protilátková odpoveď.

Vo výhodných uskutočneniach spôsob zahrnuje usmrtenie opičej bunky zodpovednej za produkciu opičej protilátky napríklad hybridómovou fúziou, vírusovou transformáciou s Herpespapio, klonovaním jednotlivých B-buniek (nazývaným tiež „tranzientná imortalizácia“) a vytvorením knižnice rekombinantných imunoglobulínov. V iných výhodných uskutočneniach spôsob zahrnuje selekciu B-bunky z opice, čí už z leukocytov periferálnej krvi, sleziny, kostnej drene, alebo lymfatickej uzliny; selekciu klonu, ktorý produkuje vhodnú protilátku; získanie imunoglobulínového génu kódujúceho túto protilátku z imortalizovanej bunkovej línie a re-expresiu génov v produkčnej línii (t. j. v bunkovej línii, ktorá spôsobuje produkciu protilátky dostatočná na to, aby bola užitočná pre humánnu terapiu).

Tretím aspektom vynálezu je rekombinantné nukleová kyselina obsahujúca DNA sekvenciu alebo sekvencie, ktoré kódujú chimému protilátku podľa vynálezu a obsahuje aspoň jednu oblasť CDR z variabilnej oblasti v SEQ. ID. Č. 15 alebo 16, alebo obsahuje DNA sekvenciu zobrazenú v SEQ. ID Č. 15 alebo 16.

Vynález opisuje rekombinantnú protilátku tvorenú z buď ľudskej, alebo šimpanzej konštantnej oblasti a antigén-rozpoznávajúceho úseku opičej variabilnej oblasti alebo z konštantnej oblasti prvej opice a antigcn-rozpoznávajúceho úseku variabilnej oblasti druhej, rozdielnej opice.

Ďalej vynález opisuje monoklonálnu protilátku alebo Fab. (Fab)_2> dimér ľahkého reťazca alebo ťažkého reťazca, alebo akýkoľvek minimálny rekombinantný fragment z nich, ako sú Fv alebo jednoreťazcová protilátka (SCA) alebo iné ich imunologický aktívne fragmenty (napr. CDR oblasť) k ľudskému antigénu, vytvárané imortalizovanými opičími B-bunkami. Takéto fragmenty sú užitočné ako imunosupresívne činidlá. Alternatívne protilátka podľa vynálezu môže mať kovalentne pripojenú efektorovú alebo reportérovú molekulu. Napríklad protilátka podľa vynálezu môže mať makrocyklus na chelátovanie atómu ťažkého kovu, alebo toxín, ako je ricín, pripojené kovalentnou mostíkovou štruktúrou. Navyše: Fc fragment alebo CH3 doména v kompletnej molekule protilátky môžu byť nahradené molekulou enzýmu alebo toxínu a časť imunoglobulínového reťazca môže byť previazaná s polypeptidovou efektorovou alebo reportérovou molekulou. Bišpecifické protilátky sa tiež môžu konštruovať pomocou štandardných postupov.

Ďalším aspektom vynálezu sú farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú terapeuticky alebo profylaktický účinné množstvo protilátky podľa vynálezu vo farmaceutický prijateľnom nosiči. Takéto protilátky môžu byť tiež poskytnuté ako imunotoxíny, t. j. molekuly, ktoré sú charakterizované dvoma zložkami a sú osobitne užitočné na zabíjanie vybraných buniek in vitro a in vivo. Jedna zložka je cytotoxické činidlo, ktoré je obvykle fatálne pre bunku, ak je k nej pripojené alebo absorbované. Druhá zložka, známa ako „dodávacie vehikulum“, dáva prostriedok na prenos toxického činidla ku konkrétnemu typu buniek, ako sú nádorové bunky. Tieto dve zložky sú bežne prepojené chemickou väzbou alebo radom dobre známych chemických a genetických postupov. Ak je napríklad cytotoxické činidlo bielkovina a druhá zložka je intaktný imunoglobulín, spojenie sa dá dosiahnuť heterobifunkčnými činidlami, napr. karbodiimidom, glutaraldehydom a pod. Vytváranie rôznych imunotoxínov je v odbore dobre známe.

V inom podobnom aspekte vynález obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu ľudskú/opičiu rekombinantnú protilátku. Vo výhodných uskutočneniach nukleová kyselina kóduje ľudskú alebo opičiu konštantnú oblasť a antigén-rozpoznávajúci úsek opičej variabilnej oblasti a táto nukleová kyselina je purifikovaná, t. j. oddelená od biologických zložiek, s ktorými sa prirodzene vyskytuje alebo ešte výhodnejšie, je poskytovaná ako homogénny roztok.

V ešte ďalšom aspekte vynález opisuje CDR-očkovanú protilátku tvorenú najmenej jednou oblasti určujúcich komplementaritu (CDR), t. j. aminokyselinových zvyškov (s použitím štandardného Kabatovho systému označovania) 31-35 (CDR 1), 50 - 65 (CDR 2) a 95 - 102 (CDR 3) špecifického ťažkého reťazca a aminokyselinových zvyškov 24 - 34 (CDR 1), 50 - 56 (CDR 2) a 89 - 97 (CDR 3) určitej variabilnej oblasti ľahkého reťazca opice Starého sveta a základnú štruktúru imunoglobulinovej variabilnej oblasti z druhého druhu. CDR-očkovaná protilátka je schopná viazať ten istý antigén ako pôvodná opičia protilátka. Konštantná oblasť protilátky je odvodená z ľudského alebo šimpanzieho imunoglobulínu. Metodológia pre tento aspekt je všeobecne opísaná Jonesom a koľ, 321 Náture 522, 1986. Takéto očkovanie môže obmieňať CDR podľa potreby, aby sa zaistilo, že sa budú javiť podobnejšie ľudským a zmenšila sa pravdepodobnosť vyprovokovania škodlivej reakcie proti protilátke.

Vo výhodných uskutočneniach spôsob zahrnuje imortalizáciu alebo selekciu bunky z makaka, ktorá je zodpovedná za produkciu makakovej protilátky a získanie imunoglobulínových génov z tejto bunky; klonovanie a sekvencovanie protilátkových génov zodpovedajúcich za produkciu protilátky; výber ľudskej sekvencie základnej štruktúry variabilnej oblasti (prednostne s najtesnejšou homológiou k základnej štruktúre makakovej variabilnej oblasti); a náhradu ľudských CDR sekvencii makakovými CDR sekvenciami, menšie modifikácie v ľudskej oblasti základnej štruktúry môžu byť zahrnuté na udržanie afinity protilátky k j ej antigénu.

Výrazom „menšie modifikácie“ sa rozumie, že menej ako celkovo šesť aminokyselín v základnej štruktúre sa môže substituovať inými aminokyselinami. Zvyčajne sa takáto substitúcia alebo modifikácia uskutoční len keď tieto aminokyseliny sú zapojené do konformačnych interakcií, ktoré udržujú základnú štruktúru v príslušnom tvare tak, že požadovaný antigén je rozpoznávaný protilátkou. Také modifikácie budú vo všeobecnosti odrážať odlišné aminokyseliny prítomné v opičích protilátkach v porovnaní s ľudskými protilátkami. Napríklad aminokyselinová sekvencia ľudskej protilátky tesne pred CDR 3 ťažkého reťazca, 92 - 94, je vo všeobecnosti cysteín-alanín-arginín (o arginíne sa vie, že je v menšej časti protilátok nahradený serínom alebo treonínom); v niektorých protilátkach opice je sekvencia cysteín-alanín-serin; takto v tomto príklade môže byť daná prednosť použitiu serínu ako aminokyseliny 94 (pozri obr. 9D).

V ďalšom aspekte vynález opisuje použitie chimémej protilátky podľa vynálezu na výrobu liečiva na liečenie alebo prevenciu ochorenia, poruchy alebo podmienky vybranej zo skupiny pozostávajúcej z rakoviny, infekčného ochorenia, odmietnutia transplantovaného orgánu alebo tkaniva, autoimúnneho alebo zápalového ochorenia, poruchy alebo podmienky.

Vo výhodných uskutočneniach uvedeného aspektu je antigén nádorový antigén, antigén zapojený do poruchy imunity, antigén zapojený do autoimúnnej odozvy, receptor exprimovaný na hostiteľských bunkách alebo antigén vybraný z ľudských antigénov CD58, VLA4 (alfa4/31 integrál), CD2, LFA3, ELAM, L AM, CD25, CD4, CD 19, CD20, receptor ľudských T-buniek, CD3, CD8, CD23, CD41, CD44, CD45, CD71, TNFct, TNF/?, Tn antigén, IL-I, IL-8, C5a, molekúl adhézie, napr. VCAM, CD54, CD28,

CD 11 a, CD 11 c, CD 18 a CD 11 b, produktu neu onkogénu, MDR-1 (P-glykoproteínu), TGFa a jeho receptora, a PDGF; a rekombinantná protilátka je aktívna buď v depletácii (zabíjanie alebo eliminácia) nechcených buniek (napr. anti-CD4) pôsobením s komplementom, alebo je aktívna ako cytotoxické činidlo, alebo spôsobuje Fc-receptorovú väzbu s fagocytom. Alternatívne protilátka blokuje alebo stimuluje receptorové funkcie, alebo neutralizuje aktívne rozpustné produkty, ako sú jeden alebo viac interleukínov TNF a C5a.

V ďalšom aspekte vynález poskytuje farmaceutické prostriedky uvedených protilátok alebo ich fragmentov. Prostriedky alebo výrobky podľa vynálezu môžu byť pohodlne poskytnuté vo forme roztokov vhodných na parenterálne, nazálne alebo orálne podávanie. Vhodné prípravky protilátky môžu byť zmiešané s vhodnými prípravkami iných činidiel, za poskytnutia lepšieho klinického využitia.

Iné vlastnosti a výhody vynálezu budú zrejmé z nasledujúceho opisu výhodných uskutočnení a z nárokov.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 predstavuje tabuľkovú reprezentáciu dvadsiatich kodónov v deviatich rôznych vedúcich sekvenciách Ig ťažkých reťazcov a desiatich opičích sekvenciách Ig ťažkých reťazcov:

obr. 2 je diagramové znázornenie štruktúr rôznych Ig reťazcov ukazujúce relatívne polohy vedúcich, variabilných a konštantných oblasti vzhľadom na polohy reštrikčných miest a primérov používaných na amplifikáciu;

obr. 3 je diagramové znázornenie vektora s kazetou ťažkého reťazca na expresiu ľudských alebo chimémych protilátok;

obr. 4 je diagramové znázornenie vektora s kazetou ľahkého reťazca na expresiu ľudských alebo chimémych protilátok;

obr. 5 a 6 sú diagramové znázornenia vektorov navrhnutých na expresiu imunoglobulínov z cDNA kapa resp. lambda ľahkého reťazca. V týchto vektoroch sú imunoglobulínové gény usporiadané v tandemovej konfigurácii s použitím neomycín fosfotransferázy ako selekčného markeru;

obr. 7-1, 7-2 a 8 ukazujú sekvencie nukleových kyselín rôznych primérov vedúcej sekvencií podľa vynálezu (tieto priméry v obr. 8 zodpovedajú zoznamu ako SEKV. ID č. 1-12,);

obr. 9 A až 9H sú porovnania sekvencií ľudských a opičích VH1, VH2, VH3, VH4 a VH5 oblasti, resp. sekvencií VKI, VKIIm a VlambdalII;

obr. 10 je porovnanie ľudských a opičích VH3 sekvencií, s jedným porovnaním k ľudskej VH2 sekvencií;

obr. 11 je grafické znázornenie väzby protilátky podľa vynálezu k ľudskému CD4 antigénu;

obr. 12 je grafické znázornenie inhibície väzby IF3 protilátkou ukázanou v obr. 10;

obr. 13a 14 sú úseky nukleotidových sekvencií anti-CD4 VH a VL oblastí;

obr. 15 je graf ukazujúci anti-CD54 aktivitu a obr. 16 je histogram porovnávajúci vlastnosti plazmidov expresie.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Opičie protilátky

Opice Starého sveta zahrnujú paviány a makaky (vrátane opice Rhesus a opice cynomolgus). Tento vynález pos kytuje podrobnosti použitia nárokovaného vynálezu s rôznymi opičími génmi. Tieto príklady nie sú obmedzujúce a môžu sa ľahko aplikovať na iné opice Starého sveta.

Obr. 2 ukazuje diagramovou formou všeobecnú štruktúru génov kódujúcich imunoglobulínove ťažké a kapa ľahké a lambda ľahké reťazce. Každý z týchto reťazcov je tvorený ATG štartovacím kodónom nasledovaným vedúcou sekvenciou s približne 60 bázami, oblasťou kódujúcou variabilnú oblasť imunoglobulínu a konštantnou oblasťou tohto imunoglobulínu.

Príklady rôznych vedúcich sekvencií, čiže signálnych peptidov, ťažkých reťazcov sú ukázané v obr. 1. Tieto sekvencie a ich ekvivalenty v opiciach sa dajú stanoviť štandardnými technikami dobre známymi tým, čo majú bežné znalosti v odbore, ako je opísané.

Sekvencie ukázané v dolnej časti obr. 1 sú ľudské vedúce sekvencie. Žiadatelia zistili, že konštrukcia primérov komplementárnych k týmto vedúcim oblastiam umožňuje amplifikáciu Ig génov z opíc. Podobne primery homológne k opičím vedúcim sekvenciám (pozri napr. hornú časť obr. 1) sa dajú použiť na amplifikáciu opičích imunoglobulínových génov a tiež na amplifikáciu ľudských imunoglobulínových génov.

Pri použití takýchto primérov v štandardných amplifikačných postupoch môžu byť gény kódujúce rôzne opičie imunoglobulínové gény ľahko izolované a sekvencie kódujúce variabilné oblasti protilátok stanovené. Príklady takýchto postupov sú poskytnuté. Poskytnuté výsledky analýz sú prezentované v obr. 9A až 9H a v obr. 10. Žiadateľ prekvapujúco zistil, že napriek schopnosti tvorby protilátok k pomerne konzervovaným ľudským antigénom v opiciach, sekvencie základnej štruktúry [framework] variabilných oblastí takto vytváraných protilátok sú neodlíšiteľné od ľudských protilátok. To znamená: rozsah [amount] variability v imunoglobulínových sekvenciách pozorovaný pri opiciach bol podobný rozsahu pozorovanému u ľudí a nebolo možné určiť, ktorá protilátka pochádzala z človeka alebo z opice bez analýzy samotného zdroja.

Takto napríklad, s odkazom na obr. 10, aminokyselinová sekvencia VH3 oblasti človeka bola porovnaná s opičou. Ľudské protilátky mali rozsah [range] homológie medzi sebou od 83 - 98 %, zatiaľ čo opičie boli od 90 až 95 % homológne s ľudskou VH3 oblasťou. Naproti tomu ľudská VH2 oblasť bola homológna s ľudskou VH3 oblasťou zo 60 %. [V tomto obrázku, podobne ako v iných, je prítomnosť rovnakej aminokyseliny v ktorejkoľvek pozícii označená pomlčkou, zatiaľ čo prítomnosť odlišnej aminokyseliny je označená štandardným jednopísmenovým kódom. Pozície, ktorým sa nedá prisúdiť žiadna konsenzová {consensus} aminokyselina sú označené ako X.] Podobne homológie pre VH1, VH2, VH3, VH4 a VH5 a pre VKI, VKIIm a VlambdalII sú ukázané v obr. 9A - 9H. Opäť: pozorovala sa významná homológia medzi opičími a ľudskými imunoglobulínovými oblasťami v každej variabilnej oblasti vrátane sekvencie imunoglobulínovej J oblasti. Takáto vysoká homológia je podobná homológii pozorovanej medzi ľudskými protilátkami.

Metodológia, ktorou sa stanovovali sekvencie, je uvádzaná v príkladoch. Tí, čo majú bežné znalosti v odbore, rozpoznajú, že tieto príklady nie sú obmedzujúce pre tento vynález a že rovnocenné výsledky a monoklonálne a chiméme protilátky sa dajú získať podobnými postupmi dobre známymi tým, čo majú bežné znalosti v odbore. Pozri napr. U. S. patenty 4 816 567; 4 978 745; 4 975 369; 4 816 397. Napríklad po klonovaní génu kódujúceho opičiu variabilnú oblasť, takýto gén sa dá ľahko ligovať ku génu kódujúcemu opičiu alebo ľudskú konštantnú oblasť a fúzované gény ex primovať v produkčnej bunkovej línii na produkciu žiadanej protilátky. Sú poskytnuté príklady takýchto postupov.

V nasledujúcich príkladoch prvý krok postupu zahrnuje izoláciu celkovej RNA z opičích buniek periferálnej krvi alebo sleziny. B-bunky z imunizovaných opíc sa dajú získať z periferálnej krvi alebo lymfatických uzlín a použiť priamo alebo môžu byť výhodne expandované. Expanzia môže zahrnúť transformáciu vírusom Herpes papio, fúziou k heterológnym myelómovým bunkám alebo klonovanie jednotlivých B-buniek s limitujúcim zrieďovaním v prítomnosti stimulujúcich ľudských T-buniek.

Celková RNA sa prevedie na jednovláknová (ss) cDNA reverznou transkriptázou s použitím nešpecifických (oligo-dT alebo náhodných hexamérov) alebo špecifických (na imunoglobulínové CH I alebo CK alebo Clambda konštantné oblasti) oligonukleotidových primerov. Jednovláknová cDNA vytvorená touto reakciou sa amplifikuje s použitím polymerázovej reťazovej reakcie, v ktorej sa ss cDNA, spolu s dezoxynukleotid trifosfátmi, DNA polymerázou (napr. termostabilnou polymerázou) a špecifickými primermi použije na amplifikáciu variabilných oblastí ťažkých alebo ľahkých reťazcov imunoglobulínových génov. Použité primery sú jednovláknové syntetické oligonukleotidy medzi 20 až 40 bázami, ktoré obsahujú niektoré degenerované bázy a ktoré sa viažu na imunoglobulínové 5' vedúce sekvencie. Šesť rôznych primerov k 5' vedúcim sekvenciám (pozri obr. 7-1) zahrnujúcich reštrikčné enzýmové miesto (napr. Sali) bolo navrhnutých na amplifikáciu rodiny opičích variabilných oblastí ťažkého reťazca na základe ich podobnosti s rodinou ľudských variabilných oblastí ťažkého reťazca. S každým zo šiestich primerov k 5' vedúcim sekvenciám sa použil 3' primer špecifický pre doménu konštantnej oblasti relevantného izotypu (napr. IgG, IgM, IgA alebo IgE) tiež zahrnujúci reštrikčné enzýmové miesto (napr. Nhel). Podobne pre opičie kapa a lambda ľahké reťazce sa používajú iné páry primerov na amplifikáciu príslušných variabilných oblastí ľahkých reťazcov (obr. 7-2).

Iné súbory primerov sa dajú použiť, aby sa zaviedli rôzne unikátne reštrikčné miesta na umožnenie orientovaného klonovania PCR-amplifikovancj DNA do vhodných vektorov expresie obsahujúcich to isté miesto. Súbor primerov viažucich sa ku 3' koncu vedúcej sekvencie ťažkého reťazca protilátky so zavedeným Mlul miestom alebo súbor primerov viažucich sa k prvým 23 bázam sekvencie základnej štruktúry so zavedeným Xhol miestom sa dajú tiež použiť, ako je opísané v obr. 7-1. Variabilné oblasti ťažkých a ľahkých reťazcov opičích imunoglobulínových génov môžu byť klonované do prehadzovacieho [shuttle] vektora priamo po PCR amplifikácii na umožnenie ďalšej molekulárnej manipulácie ak je potrebná, alebo klonované priamo do vektora expresie, ktorý obsahuje konštantné oblasti ťažkých a ľahkých reťazcov ľudských génov. Molekulárna konfigurácia imunoglobulínových génov vo vektore expresie môže byť genómová, v ktorej sú prítomné promótor a zosilňovacia sekvencia [promoter/enhancer] a ďalšie regulačné oblasti ako aj zostrihové [splicing] donorové a akceptorové sekvencie na spojeniach intrón/exón. Alternatívne môžu byť chiméme imunglobulínové gény zavedené do cDNA konfigurácie s použitím heterológnych vírusových promótorov/zosilňovacích sekvencií.

Príklad 1

Sekvencia opičích protilátok

Obr. 7 a 8 ukazujú primery s alebo bez reštrikčných miest používané na PCR amplifikáciu imunoglobulínových génov z opičej alebo ľudskej cDNA. Podrobnosti používaných postupov sú poskytnuté. RNA sa izolovala z opičích slezinných buniek, buniek periferálnej krvi alebo buniek lymfatických uzlín pomocou štandardnej guanidínium izotiokyanátovej metódy. Frakcia celkovej RNA izolovaná podľa tejto metódy sa potom použila ako templát na nasledujúcu amplifikačnú reakciu. Alikvót RNA bol inkubovaný v prítomnosti reverznej transkriptázy z Moloney-ho vírusu myšacej leukémie a nešpecifických (oligo-dT alebo náhodných hexamérov) alebo špecifických (na imunoglobulínové IgG CH1 oblasti alebo kapa reťazcové konštantné oblasti CK) oligonukleotidových primerov (50 - 100 pikomólov) na vytvorenie nekódujúceho [non-eoding sense] vlákna jedno vláknovej cDNA. Jednovláknová cDNA vytvorená touto reakciou sa potom amplifíkovala s použitím polymerázovej reťazovej reakcie (polymerase chain reaction, PCR). Alikvót jednovláknovej cDNA bol inkubovaný spolu s dezoxynukleotid trifosfátmi (20 μΜ), termostabilnou DNA polymerázou (2 - 5 jednotiek) a od ľudských sekvencií odvodenými syntetickými oligonukleotidovými primermi (50 pikomólov) na amplifikáciu variabilných oblasti buď ťažkých, alebo ľahkých reťazcov imunoglobulínových génov.

S použitím párov primerov ukázaných v obr. 8 bolo amplifikovaných niekoľko reprezentantov cynomolgus imunoglobulínových sekvencií variabilných oblastí ťažkého a ľahkého reťazca z radu génových rodín. Tieto amplifikované sekvencie boli klonované do EcoRI·'miesta plazmidového vektora p-Bluescript (pBS, dostupného od Stratagene, CA) a použité na sekvenovanie. Sekvenovanie DNA sa vykonalo s použitím plazmidu obsahujúceho klonovaný inzert ako dvoj vláknového DNA templátu a štandardnej sekvenačnej metódy terminácie reťazca [chain termination].

Reprezentatívne sekvencie imunoglobulínov opice cynomolgus sú ukázané v obr. 9 A - 9H. Obsiahnuté v obr. 9A - 9H sú aj konsenzus sekvencie aminokyselín pre ľudské gény variabilných oblastí predstavujúce každú z väčších génových rodín variabilných oblastí. Vyznačené je percento homológie každej opičej sekvencie s ľudskou „konsenzus“ sekvenciou, s vylúčením domén konštantných oblastí a CDR oblastí. Úroveň homológie medzi ľudskými a opičími sekvenciami pre danú rodinu je taká vysoká ako medzi ľudskými sekvenciami v rámci tejto rodiny. Preto je nemožné rozlíšenie medzi variabilnými oblasťami imunoglobulínových sekvencií pochádzajúcich z opíc Starého sveta a pochádzajúcich z človeka len na základe samotného porovnania sekvencií.

Izolácia RNA

Opičie antigén-špecifické B-bunky boli získané niekoľkými spôsobmi: Fúziou buniek lymfatických uzlín imunizovaných opíc k partnerským bunkám myšacích/ľudských heteromyelómov línie K5H6/B5 a následným výberom [skríning] hybridómových línií, pomocou vírusovej transformácie B-buniek alebo technikou in vitro klonovania jednotlivých B-buniek. V poslednom prípade bol rast jednotlivých opičích B-buniek podporovaný in vitro ko-kultiváciou s ľudskými T-bunkami, ktoré boli stimulované protilátkou. Jednotlivé B-bunky sa dávali do jamiek 96-jamkovej platničky na tkanivové kultúry, každá spolu so 150 000 antiCD3-stimulovaných, mytomycínom C opracovaných ľudských T-buniek. Po dvojtýždňovom inkubačnom období jednotlivé B-bunky expandovali na najmenej 200 diferencovaných plazmatických buniek. V supematante kultúr z týchto jamiek sa zisťovala prítomnosť imunoglobulínov technikou ELISA s použitím zachycovacej [capture] protilátky, kozieho proti-opičieho imunoglobulínu.

Bunky buď z antigén špecifických vírusom transformovaných buniek alebo hybridómov sa nechali rásť do počtu postačujúceho na extrakciu RNA. Jamky z techniky in vitro klonovania jednotlivých B-buniek, ktoré boli pozitívne na imunoglobulíny boli prenesené [removed], dvakrát premyté studeným, fosfátom pufrovaným soľným roztokom pH 7,5 a centrifugované (1000 x g 10 min.). Premyté bunky boli suspendované v 100 μΐ lyzačného roztoku (4 M guanidínium izotiokyanát, 25 mM citrát sodný pH 7,0, 0,5 % nátrium sarkozín, 0,1 M 2-merkaptoetanol). Pridalo sa 10 μΙ 2 M octanu sodného, pH 4,0 a premiešalo. Bielkovina sa odstránila pridaním 100 μΐ vodu sýteného fenolu, miešaním a pridaním 20 μΐ chloroform/izoamylalkoholu (49 : 1). Po vortexovaní a inkubácii na ľade 15 min. boli vzorky centrifugované 10 000 x g 20 minút. Vodná fáza bola prenesená do novej skúmavky, zmiešaná s rovnakým objemom izopropanolu a inkubovaná 1 hod. pri -20 °C. Precipitát bol získaný centrifugáciou 10 000 x g 15 minút, premytý 70 % etanolom, recentrifugovaný a pcleta bola vysušená v prístroji Speedivac (Savant). Vysušená RNA bola znovu rozpustená druhý raz v 100 μΐ lyzačného pufra. Bol pridaný rovnaký objem izopropanolu a inkubované 1 hod. pri -20 °C. Precipitát bol získaný centrifugáciou 10 000 x g 15 minút a premytý 70 % etanolom. Peleta bola vysušená v prístroji Speedivac (Savant) a uschovávaná do použitia pri -20 °C v 70 % etanole.

Syntéza jedno vlákno vej cDNA

Celková RNA extrahovaná z buniek pochádzajúcich z jednej jamky bola rozpustená v 32 μΐ redestilovanej vody, ku ktorým sa pridá 1 μΐ (50 - 100 pikomólov) priméru (buď náhodného hexaméru, oligo dT alebo 3' imunoglobulín-špecifického priméru) a 10 μΐ 5X pufra pre reverznú transkriptázu (0,25 M Tris-HCl pH 8,3, 0,375 M KC1, 15 mM MgCh, 50 mM ditiotreitol). Zmes bola zahriata na 65 °C po 5 minút a potom daná do ľadu na 2 minúty. Pridalo sa 5 μΐ dezoxynukleotid trifosfátov a 1 μΐ (200 jednotiek) reverznej transkriptázy z Moloneyho vírusu myšacej leukémie (BRL) a zmes bola inkubovaná pri 1,5 hodiny pri 37 °C. Po dobehnutí reverzno-transkriptázovej reakcie sa zmes jednovláknovcj cDNA/RNA extrahovala fcnol/chloroformom a prehnala cez centrifugačnú [spin] kolónku 1 ml G-25 SEPHADEXu. Materiál, ktorý prešiel cez kolónku, sa použil ako templát ss cDNA na PCR amplifikáciu.

Amplifikácia ss cDNA

- 10 μΐ ss cDNA sa zmiešalo s 10 μΐ 10X PCR pufra (500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl pH 8,3, 15 mM MgCl₂)

1,6 μΐ 1,25 mM dezoxynukleotid trifosfátov, 50 pikomólov špecifického imunuglobulínového 5' priméru, 50 pikomólov špecifického imunuglobulínového 3' priméru a 2 - 5 jednotkami termostabilnej DNA polymerázy (Synthetic Genetics). Reakčný objem bol upravený na 100 μΐ vodu a prevrstvený 100 μΐ minerálneho oleja. Reakčná zmes bola inkubovaná pri nasledujúcich teplotách po uvedený čas. 94 °C 1 minútu °C 2 minúty °C 2 minúty

Tento cyklus bol opakovaný 30 - 35 krát. Amplifikované produkty boli prezerané pomocou elektroforézy v agarózovom géli s použitím 1,2 % agarózového gélu a štandardov molekulovej váhy. Produkty PCR amplifikovaných variabilných oblastí imunoglobulínových génov sa pohybovali približne medzi 350 - 500 bp štandardmi. PCR amplifikované produkty sa potom použili na klonovanie do vhodných plazmidových vektorov.

Príklad 2

Klonovanie opičích protilátkových génov

Keďže sekvencie variabilných oblastí opičích génov, na cDNA úrovni, sú nerozoznateľné od ľudských členov rovnocennej génovej rodiny, imunitné odpovede na opičie/ľudské chiméme protilátky, ak budú vôbec nejaké, sa nebudú pravdepodobne líšiť od odpovedí, čo sa vytvoria proti molekulám ľudských protilátok.

PCR technológia sa dá využiť na zavedenie špecifických reštrikčných enzýmových miest, vrátane (ale bez obmedzenia) Sali, BgH, Kpnl a Nhel do sekvencií variabilných oblastí opíc Starého sveta počas PCR amplifikačnej reakcie s použitím primérov odvodených od tých, čo sú uvedené v obr. 6. Existujúce klonované gény boli amplifikované z ich špecifických vektorov s použitím týchto primerov na zavedenie špecifického reštrikčného miesta a následne použité na klonovanie do vektora expresie. Alternatívne boli tieto primery použité na amplifikáciu priamo z bunkovej RNA. Použité vektory expresie boli dvoch typov. Prvý (pozri obr. 3 a 4) umožňuje, aby klonovaná cDNA variabilných oblastí imunoglobulínových génov bola zavedená do kazetového vektora, s použitím unikátnych reštrikčných miest, v ktorom sú prvky imunoglobulínového génu usporiadané v genómovej konfigurácii. Tento typ vektora obsahuje imunoglobulínový promótor, dva exóny, ktoré vytvárajú imunoglobulinovú vedúcu sekvenciu, dve klonovacie miesta Spel a Nhel, poprúdové [downstream] zostrihové donorové sekvencie, oblasť imunoglobulínovej zosilňovacej sekvencie [enhancer], konštantnú oblasť ľudského génu (ťažkého alebo ľahkého reťazca) a poprúdový polyadenylačný signál. Navyše zahrnujú bakteriálny začiatok replikácie, |8-laktamázový gén na bakteriálnu selekciu a neomycín fosľotransferázový gén na G418 selekciu alebo xantín-guanín fosforibozyltransferázový (gpt) gén na selekciu s mykofenolovou kyselinou v cicavčích bunkách. Vektory expresie pre ťažké a ľahké reťazce používajú, v takomto poradí, neomycín fosfotransferázový gén (Neo) a xantín-guanín fosforibozyltransferázový (Gpt) gén ako selekčné markery.

Druhý typ systému expresie (pozri obr. 5 a 6) používa imunoglobulínové gény v cDNA konfigurácii. Teda: medzi 5' vedúcou sekvenciou a 3' sekvenciou konštantnej oblasti nie sú prítomné žiadne intróny alebo zostrihové miesta. Vektor tohto typu využíva heterológnu promótor/zosilňovaciu sekvenciu, ovládajúcu imunoglobulínové gény ťažkého a ľahkého reťazca usporiadané tandémovým spôsobom, polyadenylačnú sekvenciu a selekčný marker pre cicavčie bunky (Neo). Neo gén môže byť pozmenený k slabšej translácii, napr. zámenou kodónov povyše a v nadväznosti na štartovné miesto génu z ACC na TCT. Navyše je prítomný gén dihydrofolát reduktázy (dhfr) na následnú amplifikáciu génov metotrexátom. Opičie imunoglobulinové gény variabilných oblastí na klonovanie do vektorov expresie s cDNA konfiguráciou boli amplifikovaná buď z existujúcich klonovaných génov v prehadzovacom [shuttle] vektore, alebo priamo z RNA s primermi obsahujúcimi buď reštrikčné miesta Sali alebo Mlul a Nhel pre ťažký reťazec, alebo Bgllll a Kpnl alebo BsiNH pre kapa alebo lambda ľahký reťazec. Iné potenciálne unikátne reštrikčné miesta však nie sú vylúčené.

Chiméme imunoglobulínové gény ťažkého a ľahkého reťazca sú zavedené osobitne alebo postupne (pre konštrukty s genómovou konfiguráciou), alebo do toho istého vektora (pre konštrukty s cDNA konfiguráciou) pomocou elektroporácie do produkčnej bunkovej línie. Elektroporácia bola použitá na zavedenie linearizovaných DNA konštruktov do buniek buď vaječníkov čínskeho škrečka (Chinese hamster ovary, CHO) alebo myšacích myelómov s nasledujúcim klonovaním jednotlivých buniek transfektantov do 96-jamkovej platničky na tkanivové kultúry. Elektroporačné podmienky používajúce elektroporačné zariadenie BTX-100 (BTX, San Diego) a 1 ml jednorazové plastikové kyvety dávali optimálny počet transfektantov na dané množstvo vektorovej DNA. CHO bunky adaptované na rast v suspenzii v bezsérovom médiu (CHO-S SFM II mínus hypoxantín a tymidín, Gibco) boli použité s konštruktmi obsahujúcimi vírusové regulačné prvky.

Subklonovanie génov Iq variabilných oblastí

Produkty PCR reakcie sa extrahovali fenol/chloroformom a prehnali cez centrifugačnú [spin] kolónku 1 ml G-25 SEPHADEXu. Ak mal byť DNA fragment zaklonovaný do plazmidu tupými koncami, pridalo sa 1 pl 1 M MgClj, 0,5 ml 1,25 mM dezoxynukleotid trifosfátov a 1 μΐ Klenow DNA polymerázy (5 jednotiek) k celej PCR reakčnej zmesi a inkubovalo sa 15 minút pri 37 °C na zaplnenie všetkých 5' prečnievajúcich koncov. Pred klonovaním tupých koncov do plazmidu boli 5' konce fosforylované ako nasleduje: 5 μΐ 10 iM ATP a 1 μΐ T4 polynukleotid kinázy (10 jednotiek) bolo pridaných do celkovej reakčnej zmesi a inkubovaných 30 minút pri 37 °C. Amplifikované fragmenty, ktoré obsahovali vnútorné reštrikčné miesta, boli najprv štepené príslušným reštrikčným enzýmom a použité priamo na ligáciu bez fosforylácie. V obidvoch prípadoch bol fragment, čo sa mal klonovať, extrahovaný fenol/chloroformom pred ligáciou do príslušného vektora.

Na ligačnú reakciu bolo zmiešaných 10 % fosforylovaného alebo reštrikčným enzýmom štepeného PCR amplifikovaného fragmentu s približne 2 ng príslušného vektora (celkový objem 8 μΐ) vopred digerovančho reštrikčným enzýmom (enzýmami). Na klonovanie s tupými koncami sa použil pBluescrip digerovaný EcoRV. Na klonovanie s lepivými koncami sa použili vektory TCAE 5.2 alebo 6.0, alebo pGenex-H, alebo pGenexL štiepené príslušnými reštrikčnými enzýmami. Pridalo sa 1 μΐ 10X ligačného pufra (500 mM Tris-HCl pH 7,6, 100 mM MgCl₂, 10 mM ATP, 10 mM ditio- treitol), 1 μΐ T4 DNA ligázy (1 jednotka) a reakcia sa nechala prebiehať pri 14 °C cez noc. Ligovaný materiál sa použil na transformáciu kompetentných buniek E. coli HB 101 s použitím štandardnej kalciumchloridovej metódy transformácie. Transformované baktérie sa selektovali rastom na LB, ampicilín obsahujúcich agarových platniach. Individuálne kolónie boli vybrané a rozrastené cez noc v LB médiu obsahujúcom ampicilín a plazmidová DNA bola extrahovaná s použitím štandardnej metódy s alkalickou lýzou. Po reštrikčnej analýze na stanovenie klonov obsahujúcich imunoglobulínové inzerty sa pripravila DNA na sekvenovanie

Sekvenovanie klonovaných génov

Klonované variabilné oblasti imunoglobulínových génov boli sekvenované s použitím štandardnej metódy terminácie reťazca. Dvojvláknová plazmidová DNA obsahujúca klonovaný inzert bola použitá ako sekvenačný templát. Pred sekvenovanim bola dvojvláknová DNA chemicky denaturovaná. DNA bola sekvenovaná s použitím T7 DNA polymerázy SEQUENASE (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH), rádioaktívne značená dezoxyATP a s nasledujúcimi sekvenačnými primermi: (5' CAGAGCTGGGTACGTCCTCA 3') a (5' GCCCCCAGAGGTGCTCTTGG 3') pre variabilnú oblasť G imunoglobulínového ťažkého reťazca v orientáciách 5' ku 3' resp. 3' ku 5'; (5' CAGAGCTGGGTACGTGAACC 3') a (5' GGCTTGAAGCTCCTCAGAGG 3') pre variabilnú oblasť imunoglobulínového lambda ľahkého reťazca v o rientáciách 5' ku 3' resp. 3' ku 5'. Reakčné produkty boli separované na 6 %-ných polyakrylamidových géloch a čítané.

Výsledky sekvenovania radu imunoglobulínových génov opíc Starého sveta pre variabilné oblasti ťažkých a ľahkých reťazcov sú zhrnuté v obr. 9A 9H. Klonovanie a sekvenovanie imunoglobulínových génov opice rodu cynomolgus nebolo predtým v literatúre opísané. Preto sa ani nedá definovať stupeň homológie medzi V oblasťou génov človeka a cynomolga. Homológia medzi jedným šimpanzím variabilným lambda génom a jeho ľudským genómovým náprotivkom bola opísaná a ukázala len 2 % rozdielov v oblastiach základnej štruktúry [framework],

Transfekcia a selekcia

Klonované gény variabilných oblastí ťažkých a ľahkých reťazcov boli po sekvenovaní subklonované do príslušných vektorov na expresiu. Týmito môžu byť vektory konštruované s imunoglobulinovými regulačnými prvkami v genómovej konfigurácii (ako sú ukázané v obr. 3 a 4) alebo s vírusovými regulačnými prvkami v cDNA konfigurácii (ako sú ukázané v obr. 5 a 6). Príslušné reštrikčné miesta (Spel a Nhel) môžu byť navrhnuté v PCR amplifikačných priméroch počas iniciálneho amplifikačného kroku alebo sa naopak dajú použiť amplifikačné priméry obsahujúce reštrikčné miesta pri amplifikácii imunoglobulínových génov z prehadzovacích [shuttle] vektorov, do ktorých boli zaklonované. Alternatívne môžu byť imunoglobulínové gény variabilných oblastí priamo klonované do vektorov expresie po amplifikácii z RNA takže subklonovanie nie je potrebné.

Elektroporácia

Elektroporácia sa používala buď na kotransfekciu ťažkoreťazcových a ľahkoreťazcových genómových konštruktov alebo na postupnú transfekciu ťažkoreťazcových a ľahkoreťazcových genómových konštruktov do buniek Sp2/0. Pri postupných transfekciách bola elektroporácia chimémeho ľahkoreťazcového konštruktu nasledovaná selekciou v mykofenolovej kyseline. Testovanie supematantov bunkovej kultúry z klonov rozrastaných v 96-jamkovej platničke na produkciu ľahkého reťazca antisérom proti ľudskej konštantnej oblasti ľahkého reťazca pomocou techniky ELISA umožňovalo výber klonov s najvyššou expresiou ľahkého reťazca. Nasledujúca elektroporácia ľahkoreťazcových transfektantov vektorom obsahujúcim opičí/ľudský chimémy imunoglobulínový konštrukt ťažkého reťazca umožňovala výber transfektómov exprimujúcich chimému protilátku žiadanej špecifickosti a izotypu.

Konštrukt ľahkého reťazca pGENEX-L (obr. 3 a 4) bol transfekovaný do myšacej myelómovej bunkovej línie Sp2/0 elektroporáciou ako nasleduje: Bunky SP2/0 v koncentrácii 1 x lO'/ml v transfekčnom pufre (272 mM sacharóza, 7 mM fosfát sodný pH 7,4, 1 mM MgCL) boli zmiešané s 50 μg pGENEX-L obsahujúcim príslušný klonovaný gén ľahkého reťazca, ktorý bol vopred linearizovaný digesciou reštrikčným enzýmom PvmII. Bunky boli dané do 1 ml jednorazovej plastikovej spektrofotometrovej kyvety a do kyvety boli zavedené ploché elektródy vzdialené 3,5 mm. S požitím transfekčného aparátu BTX-100 (BTX, Inc.) bunky dostali pulz prúdu po 500 mikrosekúnd taký, že došlo k usmrteniu približne 50 % buniek. Táto hodnota bola stanovená pred transfekciou pulzovaním buniek, bez prítomnosti DNA, zvyšovaným napätím a meraním počtu buniek prežívajúcich po 24 hodinách neskôr. Napätie proti viabilite buniek bolo graficky vynesené a napätie zodpovedajúce 50 % usmrtenia buniek sa používalo vo všetkých nasledujúcich elektroporačných pokusoch. Pri použití aparátu BTX-100 bolo zistené, že optimálnu hodnotu má pulz s amplitúdou 200 počas 500 mikrosekúnd. Bunky boli po pulzovaní ponechané spamätať sa [recover] na ľade 15 minút predtým ako sa preniesli do 96-jamkovej platničky na tkanivové kultúry do Dulbeccovho modifikovaného Eaglovho média (DMEM) obsahujúceho 5 % fetálne teľacie sérum a 10 % Sp2/0 upravené [conditioned] médium. Bunky boli nanesené [plated] v koncentrácii, pri ktorej bol bunkový rast pozorovaný v približne jednej z troch jamiek po selekcii príslušnou zlúčeninou. Tento parameter bol stanovený pre každý elektroporačný pokus nanášaním rôzneho počtu elektroporovaných buniek na jamku (1000 - 10 000) a selekciou na bunky, ktoré inkorporovali plazmid. Počet jamiek, ktoré mali bunkový rast bol na každej platničke počítaný po 2 - 3 týždňoch selekcie. Takto bol vhodný počet buniek, ktoré dávali jednu pozitívnu jamku z troch pri danej koncentrácii konkrétneho plazmidu, stanovený na použitie v budúcich pokusoch.

Priamo po elektroporácii boli bunky dané do média bez selektujúcej zlúčeniny [drugj. Čerstvé médium obsahujúce buď G418, alebo mykofenolovú kyselinu pre bunky majúce neomycin fosfotransferázovú resp. guanozyl fosfotransferázovú aktivitu bolo pridané dva dni po elektroporácii. Bunkám bolo vymieňané médium každé dva dni počas prvého týždňa a potom dva razy za týždeň. Koncentrácia zlúčeniny použitej na selekciu bola stanovená inkubáciou buniek v prítomnosti jej zvyšovanej koncentrácie a sledovaním viability buniek. Použitá koncentrácia bola dva razy vyššia ako tá, čo dávala 100 % usmrtenia buniek. Pre Sp2/0 bolo približne treba 1 ug mykofenolovej kyseliny/ml a pre G418 800 gg/ml.

Bunky boli elektroporované na niekoľko spôsobov: Buď boli ko-elektroporované ťažkoreťazcovými a ľahkoreťazcovými genómovými vektormi (pGenex-H a pGenex-L) alebo boli elektroporované ľahkoreťazcovými samotnými. V druhom prípade boli klony vyberané [screened] podľa vysokej expresie chimémeho imunoglobulínového ľahkého reťazca s použitím techniky ELISA. Tieto klony boli rozrastené a elektroporované vektorom obsahujúcim ťažký reťazec. Ak sa použili cDNA tandemové génové konštrukty, vektor expresie (TCAE5.2 alebo TCAE6) bol vopred linearizovaný digesciou s reštrikčným enzýmom Notl Jediná elektroporácia dostačovala na dosiahnutie integrácie obidvoch génov, pre ťažký aj pre ľahký reťazec. Po 2 - 3 týždňoch boli supematanty z jamiek, v ktorých pokračoval rast s príslušnou selektujúcou zlúčeninou skúšané [assayed] na sekréciu chimémych imunoglobulínových ľahkých reťazcov alebo celých imunoglobulínov s použitím techniky ELISA. Imunoglobulínové gény v cDNA konfigurácii boli elektroporované buď do Sp2/0 buniek, alebo do buniek vaječníkov čínskeho škrečka (CHO) adaptovaných na rast v suspenzii v bezsérovom médiu. CHO bunky boli elektroporované s použitím elektroporačného aparátu BTX 600 nastaveného na podmienky na dosiahnutie maximálneho počtu G418 rezistentných kolónií. Boli nimi 210 voltov, 400 pF a 13 ohmov. Po elektroporácii boli bunky počítané, premyté transfekčným pufiom, resuspendované v tom istom pufre a dané na ľad na 15 minút. Bunky boli nastavené na 1 x 10⁷ živých buniek/ml a 400 pl bunkovej suspenzie bolo daných do 0,4 ml sterilnej jednorazovej kyvety (BTX Inc.). 25 pl Not 1 linearizovaného DNA TCAE 5.2 alebo TCAE 6 vektora, obsahujúceho klonované gény variabilnej oblasti imunoglobulínov makaka bolo resuspendovaných v TE pufre (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) na 1 pg/ml a pridaných k bunkovej suspenzii. Elektroporácia sa vykonala vybitím aparátu s použitím tlačidla na automatické nabitie a pulz. Kyveta sa dala na ľad na 15 minút a bunky boli zriedené do 120 ml bezsérového média a dané do šiestich 96-jamkových doštičiek (200 pl na jamku, obsahujúcich približne 6 667 buniek alebo 3 333 živých buniek na jamku). Nezávislé elektroporačné parametre boli stanovené pre túto bunkovú líniu a selekcia G418 prebiehala pri 400 pg/ml.

Vyhľadávanie produkcie protilátok

Prítomnosť ľudských, opičích alebo chimémych protilátok secemovaných transfektantmi bola zisťovaná technikou ELISA ako nasleduje: 96-jamkové platničky s plochým dnom (Dynatech) boli pokryté [coated] kozím anti-ľudským IgG alebo kapa pri 200 ng/jamku v pokrývačom pufre (uhličitan sodný 0,8 mg/ml, kyslý uhličitan sodný 1,55 mg/ml, pH 9,6) a inkubované najmenej 16 hodín pri 4 °C. Pokrývači pufor bol odstránený a jamky blokované 120 pl blokovacieho pufra (1 % bovinný sérumalbumín vo fosfátom pufrovanom soľnom roztoku obsahujúcom 0,2 % azid sodný) a inkubované 1 hod. pri 37 °C. Supematant bunkovej kultúry v množstve až 125 pl bol pridaný do jamiek obsahujúcich blokovaci pufor a platnička bola inkubovaná 2 hod. pri 37 °C. Platničky boli potom päť razy premyté PBS. Pridalo sa 100 pl kozieho anti-ľudského IgG (lebo kapa) značeného chrenovou peroxidázou, riedeného 1 : 1000 - 1 : : 5000 v zrieďovacom pufre (1 % bovinný sérumalbumín, 0,05 % Tween-20, 0,02 % azid sodný v PBS). Platničky boli inkubované 1 hod. pri 37 °C a potom päť razy premyté PBS. Chiméma protilátka bola detegovaná so 100 pl peroxidu vodíka a substrátu, 3, 3', 5, 5'-tetrametylbenzidínu (1 : : 1 v/v) na jamku. Farebná reakcia bola zastavená po 2 až 5 min. so 100 pl 2 M kyseliny sírovej na jamku.

Tí, čo majú bežné znalosti v odbore, môžu ľahko vykonať metodológie rovnocenné tým, čo sú opísané. Príklady takejto technológie zahrnujú imortalizáciu selektovaných B-buniek hybridomovou fúziou, ako je opísané, s bunkovou líniou K5H6/B5 opísanou Carrollom et al. 164 J. Experimental Medicíne 1566, 1986, alebo ekvivalentnou bunkovou líniou, ako je SPAZ4 (dostupnou od Sandoz, pozri Ehrlich et al., 34 Clin. Chem. 1681,1988). Podobné bunkové línie sa dajú ľahko konštruovať štandardnými technikami verejne dostupnej metodológie. Alternatívne môžu byť imunoglobulínové gény klonované z: a) buniek imortalizovaných virálnou transformáciou Herpes papio, ako opisuje Markova et al., 30 Vopr. Virusol. 549, 1985, alebo ekvivalentným vírusom, b) klonovaním jednotlivých B-buniek na poskytnutie tranzientnej imortalizácie, ako opisuje Amaroso a Lipské 145 J. Immunoloqy 3155, 1990, alebo c) s použitím bakteriofágových knižníc rekombinantných imunoglobulinov, ako opisuje Huse et al., 246 Science 1275, 1989 a McCefferty et al., 348 Náture 552,1990. Výber [skríning] klonov obsahujúcich príslušnú protilátku sa dá vykonať opísanými technikami, alebo rovnocennými technikami dobre známymi tým, čo majú bežné znalosti v odbore, a žiadané imunoglobulínové gény sa dajú získať [rescued] z imortalizovaných bunkových línií. Navyše sa dá opičia protilátka produkovaná izolovanými opičími B-bunkami používať na humánnu terapiu, bez manipulácie na vytvorenie chimémej protilátky.

Ľudské konštantné oblasti sa dajú získať štandardnými technikami so všetkými žiadanými izotypmi dobre známymi tým, čo majú bežné znalosti v odbore, a variabilné oblasti opičích protilátok sa dajú ligovať s takouto ľudskou konštantnou oblasťou. Osobitne užitočné chiméme protilátky proti špecifickým ľudským povrchovým bunkovým receptorom, ktoré sa dajú použiť pri humánnej imunoterapii, zahrnujú CD4, ICAM, CD19, CD20, CD8, CDlla, CDllb, CD28, CD18, CD45, CD71 aTCR.

Príklad 3

Klonovanie a expresia opičej/ľudskej chimémej protilátky so špecifickosťou pre CD4

Nasleduje konkrétny príklad postupov a protilátok podľa vynálezu.

Vytváranie línií opičích imortalizovaných B-buniek

Dospelá opica cynomolgus (White Sand New Mexico Primáte Center) bola imunizovaná intramuskuláme, na viacerých miestach, so 150 - 300 pg rozpustného CD4 (sCD4) alebo bunkovými mebránami (1 x 10⁸ buniek) z CD4-pozitívnej bunkovej línie supTl s použitím štandardného adjuvans. Imunizácia bola opakovaná každé 2 - 3 týždne, celkovo 6 razy. Opica dostala zosilňovaciu dávku [was boosted] injekciou 100 pg sCD4 do inguinálnej oblasti jedného stehna a po jednom týždni bola chirurgicky odobratá lymfatická uzlina toho istého stehna. Lymfocyty sa získali z lymfatickej uzliny rozrezaním [slicing] tkaniva a premytím sterilným DMEM médiom. Bunková suspenzia bola prefiltrovaná cez nylonovú gázu a centrifugovaná pri 1000 x g po 10 minút.

Približne 1 x 10^s lymfocytov bolo suspendovaných v Tris -amóniumchloridovom pufre (16 mM, pH 7,5) a zohriatych na 37 °C, aby sa lýzovali erytrocyty. Lymfocyty sa odcentrifugovali a resuspendovali v L-leucín metylestere (LME) a inkubovali pri 37 °C 45 minút. LME-opracované bunky sa filtrovali cez nylonovú sieťku a centrifugovali. Pridal sa 1 ml fetálneho teľacieho séra, bunky sa suspendovali a premývali dva razy bezsérovým RPMI. Bunky sa spočítali a dali do jedinej 50 ml kónickej centrifugačnej skúmavky spolu s rovnakým počtom K6H6/B5 heteromyelómových buniek, vopred premytých dva razy bezsérovým médiom. Bunky boli jemne suspendované v 1 ml 50 % PEG (polyetylénglykol) pridaného pomaly s jemným miešaním [stirring] počas 1 minúty. Bunky boli potom resuspendované pridaním 20 ml bezsérového média počas 5 minút s jemným miešaním [mixing], aby sa vyriedil PEG. Po dvojnásobnom premytí bezsérovým médiom boli bunky resuspendované na koncentráciu 5 x 10⁵ buniek/0,1 ml v RPMI médiu obsahujúcom 20 % fetálne teľacie sérum a gentamycín a dané do 96-jamkových platničiek na tkanivové kultúry, 0,1 ml na jamku. Do každej jamky sa pridal rovnaký objem (0,1 ml) H AT média a bunky boli ponechané rásť pred testovaním [skríning] 14-17 dní.

Testovanie fúzovaných bunkových hybridov na produkciu anti-CD4

Test na určenie anti-CD4 špecifickosti bol ako nasledujúci: ELISA platničky boli pokryté rekombinantným sCD4 pri koncentrácii 100 ng na jamku a blokované 1 % bovinným sérumalbumínom v PBS. 50 μΙ alikvót hybridómového supematantu sa odobral z každej jamky a nechal inkubovať s platňou pokrytou sCD4 60 minút. Väzba sa detegovala pomocou inkubácie s ¹²⁵I-značeným kozím proti-ľudským alebo kozím proti-opičím IgG po 60 minút. Po štvornásobnom premytí destilovanou vodou sa jamky merali v gama počítači. Pozitívne jamky sa duplicitne znovu testovali a hybridómové bunky z týchto jamiek sa subklonovali tri razy, raz pri 5 bunkách na jamku a dva razy pri 1 bunke na jamku. V tomto štádiu boli anti-CD4 pozitívy testované na schopnosť viazať bunkový povrchový CD4. Toto sa vykonalo inhibíciou väzby myšacieho anti-CD4 monoklonálu, zvaného 1F3, k CD4 pozitívnej bunkovej línii supTl. V stručnosti sa to robilo ko-inkubáciou rôzneho množstva opičej anti-CD4 a 10 ng ¹²⁵l-značeného 1F3 s 3 x 10⁵ buniek na jamku v 96-jamkovej platničke. Po inkubácii po 1 hodinu pri izbovej teplote (asi 20 - 25 °C) boli bunky prenesené pomocou vákua na filtre zo sklených vlákien. Po extenzívnom premývaní PBS boli filtre merané v gama počítači na určenie inhibície väzby 1F3 k supTl bunkám opičími hybridómovými supematantmi.

Bol vybraný kandidátny kloň, ktorý produkoval protilátku, ktorá mala silnú inhibíciu proti 1F3. Kloň, čo sme vybrali, bol izotypovaný s použitím ľudských izotypovacích reagentov a určený ako IgG2 s lambda ľahkým reťazcom. Táto bunková línia bola rozrastaná do väčších počtov na klonovanie jej imunoglobulínových génov.

Klonovanie génov variabilných oblastí ťažkých a ľahkých reťazcov z opičích imortalizovaných B-buniek

Celková RNA bola izolovaná z 1 x 10⁷ opičích imortalizovanych B-buniek s použitím opísanej guanidínium izotiokyanátovej metódy. Jedna desatina celkovej RNA sa použila na vytvorenie jednovláknovej cDNA s použitím oligo-dT oligonukleotidového primeru a reverznej transkriptázy, tiež ako je opísané. Jedna desatina z množstva ss cDNA sa použila na nastavenie PCR reakcie. Zo šiestich PCR reakcií každá zahrnovala jeden zo šiestich oligonukleotidových primerov špecifických pre 5' V_H rodinu, obsahujúci Sali reštrikčné miesto spolu s oligonukleotidom pre IgG 3' konštantnú oblasť, obsahujúcim Nhel miesto, ako je obidvoje ukázané v obrázku 7-1. Podobne sa nechalo prebehnúť päť PCR reakcií s použitím jedného z piatich oligonukleotidových primerov pre 5' lambda vedúcu sekvenciu, obsahujúcich BglII miesto a primer pre IgG 3' lambda konštantnú oblasť, obsahujúci AvrlI miesto. Podmienky reakcie boli ako je opísané. Každá PCR reakcia prebehla v triplikátoch. Reakčné produkty každej amplifikácie ťažkého a ľahkého reťazca boli analyzované na 1,2 % agarózových géloch. Primer VH4 ťažkého reťazca (SEKV. ID. Č.: 13: 5' ACTAAGTC GACATGAAACACCTGTGGTTCTT 3’) a lambda primer (SEKV. ID. Č.: 14: 5’ ATCACAGATC TCTCACCATGACCTGCTCCCCTCTCCTCC 3') poskytovali silné pruhy pri agarózovej gélovej elektroforéze. Produkty týchto reakcií boli použité na klonovanie do vektoru TCAE 6, ktorý obsahuje sekvencie ľudského IgG 1 a ľudskej lambda konštantnej oblasti.

Klonovanie dvoch génov variabilných oblastí do vektoru expresie TCAE 6 sa vykonalo postupne. Napred boli ťažkoreťazcový PCR produkt a vektor TCAE 6 digerované reštrikčnými enzýmami Sali a Nhel, extrahovavané fenol/chloroformom a prehnané cez centrifugačnú [spin] kolónku 1 ml G-25 SEPHADEXu. PCR produkty boli ligované do rozštiepeného vektora cez noc pri 14 °C v prítomnosti T4 DNA ligázy. Približne celkovo 500 ng DNA sa ligovalo v objeme 10 μΐ pri molámom pomere inzert/vektor 10:1. Ligovaný materiál sa použil na transformáciu XL-1 Blue kompetentných buniek (Stratagene) a transformované bunky boli nanesené na LB agarové platne obsahujúce 50 gg/ml ampicilín. Kolónie ampicilín-rezistentných baktérií boli vzaté [picked] a rozrastené v 5 ml minikultúrach. Z každej tejto kultúry sa DNA extrahovala štandardným postupom alkalickej lýzy, štiepila reštrikčnými enzýmami Sali a Nhel a produkty sa delili na 1,2 % agarózovom géli. Plazmidy s inzertmi približne 450 bp sa použili ako templáty na následné klonovanie variabilných oblastí ľahkého reťazca. Produkt ľahkoreťazcovej PCR reakcie ako aj plazmid obsahujúci ťažkoreťazcový inzert boli digerované reštrikčnými enzýmami BglII a AvrlI a ligované dokopy. Plazmidové minikultúry boli testované so štiepením BgRI a dwll. Digesty dávajúce inzert s približne 400 - 450 bp sa počítali za pozitívne. Plazmidy obsahujúce obidva inzerty, SalUNhel a BgUI/AvrlI, boli narastané vo väčších množstvách na sekvenovanie DNA.

Vektory TCAE 5,2 a TCAE 6 na tandemovú expresiu chimémych protilátok sú odvodené z vektora CLDN, ktorý sám je derivátom vektora RLDNIOb (253 Science 77 - 79, 1991). RLDNIOb je pritom derivát vektora expresie TND (7 DNA 651 -661,1988).

RLDN10b sa líši od vektora TND nasledujúcimi spôsobmi: Transkripčná kazeta dihydrofolát reduktázy (DHFR) (promótor, cDNA a polyadenylačná oblasť) bola umiestnená medzi kazetu aktivátoru tkanivového plazminogénu (kazetu t-PA expresie) a kazetu neomycín fosfotransferázy (NEO) tak, že všetky tri kazety sú v tandeme a v rovnakej transkripčnej orientácii. Navyše, promótor génu DHFR v CLDN bol nahradený myšacím beta globínovým hlavným [major] promótorom (3 Mol. Celí Biol. 1246 - 54, 1983) a t-PA cDNA nahradená polylinkerom. Všetky tri eukaryotické transkripčné kazety (expresia, DHFR, NEO) môžu byť separované z plazmidovej DNA (derivátu pUC9) digesciou reštrikčnou endonukleázou Notl.

CLDN sa líši od RLDNIOb pretože Rous LTR pred polylinkerom bol nahradený zosilňovacou sekvenciou [enhancer] promótora ľudského cytomegalovírusového okamžitého včasného [immediate early] génu (41 Celí, 521, 1985).

Vektory expresie TCAE 5.2 a TCAE 6 sa líšia od CLDN tak, že:

1. Obsahujú štyri transkripčné kazety (miesto troch), v tandemovom poradí:

a) Konštantnú oblasť ľahkého reťazca ľudského imunoglobulínu odvodenú z amplifikácie cDNA polymerázovou reťazovou reakciou. V TCAE 5.2 je to kapa konštantná oblasť ľahkého reťazca ľudského imunoglobulínu (aminokyseliny 108 - 214 v Kabátovom číslovaní, alotyp Km3) a v TCAE 6 lambda konštantná oblasť ľahkého reťazca ľudského imunoglobulínu (aminokyseliny 108 - 215 v Kabátovom číslovaní, genotyp Oz mínus, Mcg mínus, Ke mínus alotyp).

b) Konštantnú oblasť ťažkého reťazca ľudského imunoglobulínu; v obidvoch konštruktoch ťažkého reťazca ľudského imunoglobulínu je to bola gama 1 konštantná oblasť (aminokyseliny 114 - 478 Kabátovom číslovaní alotyp Gmla, Gmlz), ktorá bola odvodená amplifikáciou cDNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie.

c) DHFR; obsahujúcu vlastný eukaryotický promótor a polyadenylačnú oblasť.

d) NEO; tiež obsahujúcu vlastný eukaryotický promótor a polyadenylačnú oblasť.

3. Kazety ľahkého a ťažkého reťazca ľudských imunoglobulínov obsahujú syntetické signálne sekvencie pre sekréciu imunoglobulínových reťazcov.

4. Kazety ľahkého a ťažkého reťazca ľudských imunoglobulínov obsahujú špecifické DNA spojky [linkers], ktoré umožňujú inzerciu variabilných oblastí ľahkého a ťažkého reťazca ľudských imunoglobulínov so zachovaním translačného čítacieho rámca a nemenia aminokyseliny normálne nachádzané v imunoglobulínových reťazcoch. Zavedenie opísaných zmien viedlo ku konštrukcii vektorov TCAE 5.2 a TCAE 6. Klonovanie génov variabilných oblastí ľahkého a ťažkého reťazca ľudských imunoglobulínov z anti-CD4 heterohybridómovej bunkovej línie E9.1 do TCAE 6 viedlo ku konštruktu, ktorý je uložený v ATCC. Konštrukt, ktorý bol uložený, obsahuje variabilnú oblasť ťažkého reťazca imunoglobulínu opice cynomolgus a variabilnú oblasť ľahkého reťazca imunoglobulínu opice cynomolgus, ktorých sekvencie sú v obrázkoch 13, resp. 14, klonované z anti-CD4 hybridómovej bunkovej línie E9.1. Konštantná oblasť ťažkého reťazca je ľudského pôvodu, gama 1 izotypu a Gmla, Gmlz alotypu. Konštantná oblasť lambda ľahkého reťazca je tiež ľudského pôvodu, Oz mínus, mcg mínus izotypu a Ke mínus alotypu. Imunoglobulínové gény sú klonované do vektora expresie TCAE 6, ukázaného v obrázku 6, ktorý, keď bol elektroporovaný do cicavčej bunkovej línie CHO, produkoval opičiu/ľudskú chimému anti-CD4 protilátku. Tu opísaný DNA konštrukt bol použitý na transformáciu bakteriálneho kmeňa XL-1 Blue, selektovaný antibiotikom ampicilinom a uložený ako suspenzia bakteriálnych buniek v sterilnom LB médiu obsahujúcom 15 % glycerolu.

Iný užitočný systém expresie je taký, v ktorom je gén kódujúci selekčný marker pozmenený na zvyšovanie výťažku rekombinantného systému kódujúceho žiadanú sekvenciu. Napríklad narušenie translačnej iniciácie dominantného selekčného markeru vedie ku zníženiu počtu rezistentných kolónií, ale každá individuálna kolónia exprimuje význačne vyššie hladiny pripojeného [colinked] génového produktu ako v nenarušenom vektore. Napríklad translačná iniciácia je prvým krokom v proteosyntéze. Miesto translačnej iniciácie neomycín fosfotransferázového génu (génu G418 rezistencie) bolo zmenené z Kozákovej konsenzu (sekvencia ccAccATGG) na slabšie Kozákovej miesto [a poor Kozák] (sekvencia ccTccATGC). Narušenie translačnej iniciácie génu G418 rezistencie malo za následok: L významné (päťnásobné) zníženie počtu G418 rezistentných kolónií získaných z rovnakého množstva plazmidovej DNA transfekovanej na bunku a 2. významné zvýšenie množstva exprimovaného produktu pripojeného génu v každom klone. V klonoch obsahujúcich Kozákovej konsenzus 73 % testovaných kolónií produkovalo menej ako 25 ng/ml, s len 3 % produkujúcimi viac ako 100 ng/ml. Pre klony s pozmeneným, slabším Kozákovej miestom 8 % testovaných kolónii produkovalo menej ako 25 ng/ml v porovnaní s 63 % kolónií produkujúcich viac ako 100 ng/ml. Konkrétne, s odkazom na obr. 16 (kde TCAE 5.2 má Kozákovej konsenzus a TCAE 12 má slabšie Kozákovej miesto), 258 kolónií bolo odvodených z dvoch elektroporácií 25 pg DNA, ktorá obsahuje neomycín fosfotransferázový gén z konsenzus (nezmeneným) miestom štartu translácie. 201 z týchto kolónií (78 %) neexprimuje žiadny detegovateľný génový produkt (t. j. < 25 ng/ml chimémeho imunoglobulínu) a len 8 kolónií (3 %) exprimovalo viac ako 100 ng/ml. 98 kolónií bolo odvodených zo šiestich elektroporácií 25 pg DNA, ktorá obsahuje neomycín fosfotransferázový gén s pozmeneným miestom štartu translácie. 63 % týchto kolónií exprimovalo viac ako 100 ng/ml a len 8 % z týchto kolónií exprimovalo menej ako 25 ng/ml.

Sekvenovanie DNA

Plazmidová DNA sa pripravovala zo 100 ml kultúr. Bola ďalej čistená zrážaním (1 objem) zmesou 2,5 M chloridu sodného a 20 % polyetylcnglykolu (6 objemov) na ľade 15 minút. Po centrifugácii 10 000 x g 15 minút bola peleta premytá 70 % etanolom, recentrifugovaná a vysušená v prístroji Speedivac (Savant). Peleta bola resuspendovaná v deionizovanej vode na koncentráciu 150 - 250 pg/ml. Sekvenovanie sa vykonalo na 5 pg dvojvláknovej DNA s použitím Sangerovej metódy. Použili sa sekvenačné priméry, ktoré boli homológne k sekvenciám vektora expresie nad a pod inzertom buď ľahkého, alebo ťažkého reťazca. Inzerty boli sekvenované v obidvoch smeroch, 5' ku 3' a 3' ku 5'. Dva klony anti-CD4 ľahkého reťazca a dva klony anti-CD4 ťažkého reťazca, každý generovaný v osobitej PCR reakcii, boli sekvenované paralelne, aby sa stanovilo, či sa počas PCR reakcie zavádzajú nejaké zmeny nukleotidov. Pre obidva vybrané klony ťažkého reťazca a pre obidva vybrané klony ľahkého reťazca sa zistila identita po celej dĺžke, potvrdzujúca, že sa počas amplifikačného procesu nezavádzali žiadne chyby. Sekvencia anti-CD4 ťažkých a ľahkých reťazcov je ukázaná v obrázkoch 13 a 14 a zozname sekvencií, čís.: 15 a 16.

Expresia opičej/ľudskej chimémej anti-CD4

Vektor expresie TCAE 5.2 a TCAE 6 sa dá používať nielen na stabilne integrovanú expresiu v bunkových líniách Sp2/0 a CHO, ale, pretože obsahuje SV40 počiatok, môže tiež byť exprimovaný tranzientne v bunkovej línii COS. Expresia v COS bunkách sa vykonala ako nasleduje: COS bunky boli očkované jeden deň pred transfekciou tak, aby boli 50 - 70 % konfluentné nasledujúci deň. Kultivačné médium bolo odstránené a bunky premyté dva razy transfekčným pufrom (Transfection Buffer, TB - 140 mM NaCl, 25 mM Tris, 5 mM KC1, 0,5 mM Na₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaClj). 30 pg cézium chloridom purifikovaného plazmidu TCAE 6 obsahujúceho anti-CD4 opičie/ľudské chiméme ťažké a ľahké imunoglobulínové reťazce bolo zmiešaných s 3 ml DEAE dextránu na misku (1 mg/ml v TB). DNA sa nechala inkubovať s bunkami 1 hodinu pri 37 °C. Roztok DNA bol odstránený a nahradený 3 ml 20 % glycerolu na 1,5 - 2,5 minút, po ktorom sa bunky dvakrát premyli TB. Bunky boli inkubované v 5 ml čerstvého média obsahujúceho 100 μΜ chlórochín [chloroquine] 3 - 5 hodín pri 37 °C, po ktorom boli dvakrát premyté médiom a inkubované s normálnym DMEM 72 hodín. Supematant (100 μΐ) transfekovaných COS buniek bol v rôznych riedeniach analyzovaný na prítomnosť protilátky technikou založenou na ELISA. Kozie protiľudské lambda sa použili na pokrytie 96-jamkovej testovacej platničky a peroxidázou značené kozie protiľudské IgG ako detekčná protilátka, pri štandardných ELISA podmienkach. S COS bunkami bola stanovená produkcia medzi 10 a 40 ng/ml opičej/ľudskej chimémej protilátky. Väčšie objemy supematantu boli zakoncentrované 10 razy a použité v priamej väzbe RIA k CD4 pozitívnym supTl bunkám. Rodičovská celá opičia protilátka a irelevantný ľudský imunoglobulín boli použité ako pozitívne resp. negatívne kontroly (obr. 11). Ďalej: Opičie anti-CD4 a opičie/ľudské chiméme anti-CD4 boli použité na inhibíciu väzby vysokoafinitnej myšacej anti-CD4 (1F3) protilátky (obr. 12). Je vidno, že opičia/ľudská rekombinantná protilátka (ATCC No. __________) sa nielen viaže k CD4 pozitívnym bunkám, ale je aj schopná inhibovať väzbu 1F3 k CD4 pozitívnym bunkám v približne rovnakých koncentráciách ako plne opičia protilátka alebo samotná 1F3.

Nasleduje príklad postupov a protilátok podľa vynálezu.

Príklad 4

Generovanie opičích protilátok proti ľudským leukocytovým antigénom

Dospelá opica cynomolgus (White Sand New Mcxico Primáte Center) bola imunizovaná intramuskuláme, na viac miestach, s 5 x 10⁸ celých CD54-pozitívnych ľudských leukocytov. Alternatívne boli použité SB bunky (ľudská B lymfoidná línia) a aktivované periferálne ľudské lymfocyty, aktivované preinkubáciou so zmesou Phytolacca mitogénu (2,5 mg/ml), forból monoacetátu (40 nM) a fytohemaglutinínu so zahrnutím štandardného adjuvans. Imunizácia bola opakovaná každé 2-3 týždne po obdobie ôsmich mesiacov. Séra z imunizovaných zvierat boli testované v rôznych časoch inhibíciou väzby myšacej protilátky, 84H10, o ktorej je známe, že sa viaže k ICAM-1. Saturačné množstvo 84H10 bolo naviazané k bunkám vaječníkov čínskeho škrečka (CHO), vopred transfekovaných vektorom expresie obsahujúcim ľudskú CD54 c-DNA a selektovaných na vysokú expresiu bunkového povrchového CD54, spolu so zvyšujúcim sa riedením opičieho séra. Inhibícia väzby 84H10je ukázaná v obr. 15.

Iné myšacie monoklonálne protilátky, ktoré rozoznávajú iné ľudské leukocytové antigény, boli testované inhibíciou s použitím opičích sér získaných tou istou imunizačnou metódou.

Použitie

Protilátky vytvorené opísaným spôsobom, alebo rovnocennými technikami, sa dajú purifikovať afinitnou chromatografiou alebo chromatografiou podľa molekulovej veľkosti [size exclusion] na charakterizáciu vo funkčných biologických analýzach. Tieto analýzy zahrnujú stanovenia špecifickosti a väzobnej afinity ako aj efektorových funkcii spojených s exprimovaným izotypom, napr. ADCC alebo fixáciou komplementu. Takéto protilátky môžu byť použité ako pasívne alebo aktívne terapeutické činidlá proti radu ľudských chorôb, vrátane B-bunkových lymfómov, infekčných chorôb vrátane AIDS, autoimúnnych a zápalových chorôb a transplantácií. Protilátky môžu byť použité buď vo svojich natívnych formách alebo ako časť komplexov protilátka/chelát, protilátka/liečivo alebo protilátka/toxín. Navyše môžu byť celé protilátky alebo fragmenty protilátok (Fab₂, Fab, Fv) použité ako zobrazovacie činidlá alebo ako potenciálne vakcíny alebo imunogény v aktívnej imunoterapii na generovanie anti-idiotypových odpovedí.

Množstvo protilátky užitočné na preukázanie terapeutického účinku sa dá stanoviť štandardnými technikami dobre známymi tým, čo majú bežné znalosti v odbore. Protilátky budú všeobecne poskytované štandardnými technikami vo farmaceutický prijateľnom pufre, a môžu byť podávané akoukoľvek žiaducou cestou. Z dôvodov účinnosti tu nárokovaných protilátok a ich tolerovania ľuďmi je možné tieto protilátky podávať opakovane, aby sa bojovalo s rôznymi chorobami alebo chorobnými stavmi u človeka.

Anti-CD4 rekombinantné protilátky (alebo ich fragmenty) podľa vynálezu sú tiež užitočné na navodenie imunosupresie, t. j. navodenie supresie ľudského alebo zvieracieho imunitného systému. Tento vynález sa preto týka spôsobu profylaktického alebo terapeutického navodenia imunosupresie u človeka alebo iného živočícha, u ktorého je to potrebné, podávaním účinného, netoxického množstva takejto protilátky podľa vynálezu takémuto človeku alebo inému živočíchovi.

Schopnosť látok podľa tohto vynálezu vyvolávať imunosupresiu sa dá ukázať v štandardných testoch používaných na tento účel, napríklad zmesovým lymfocytovým reakčným testom alebo testom merajúcim inhibíciu proliferácie T-buniek meranú spotrebou [uptake] tymidínu.

Skutočnosť, že protilátky podľa vynálezu majú použitie vo vyvolaní imunosupresie znamená, že môžu byť užitočné pri liečení alebo prevencii odporu ku - alebo odmietnutia transplantovaných orgánov alebo tkanív (napr. obličiek, srdca, pľúc, kostnej drene, kože, nechtov atď.); liečení alebo prevencii autoimúnnych, zápalových, proliferačných a hyperproliferačných ochorení, a kožných prejavov imunologický medikovaných chorôb (ako napr. reumatoidná artritída, lupus erythematosus, systémový lupus erythematosus, Hashimotova thyroitída, skleróza multiplex, myasthenia gravis, diabetes typu 1, uveitis, nefrotický syndróm, atopické dermatitídy, kontaktné dermatitídy a iné ekzémové dermatitídy, seborrheieké dermatitídy, Lichcn planus, Pemplugus, bulózny pemphigus, Epidermolysis bullosa, urticaria, angioedémy, vaskulitídy, erytémy, kožná eozinofiliáza, Alopecia areata atď.); liečenie reverzibilných obštrukčných dýchacích ochorení, črevných zápalov a alergií (napr. Coeliacova choroba, proctitis, eosinophilia gastroentritis, mastocytóza, Crohnova choroba a ulceratívna kolitída) a alimentámych alergií (napr. migréna, rhinitis a ekzémy).

Kto je zbehlý v odbore, bude schopný, rutinným experimentovaním, stanoviť, čo je účinné, netoxické množstvo protilátky na účel navodenia imunosupresie. Všeobecne však účinné dávkovanie bude v rozmedzí asi 0,05 až 100 miligramov na kilogram telesnej váhy na deň.

Protilátky (alebo ich fragmenty) podľa vynálezu by mali byť užitočné aj na liečbu nádorov u cicavcov. Konkrétnejšie: Mali by byť užitočné na zmenšenie veľkosti nádoru, inhibíciu rastu nádoru alebo predĺženie času prežitia živočícha s nádorom. Takto sa tento vynález týka spôsobov liečby nádorov u človeka alebo iného živočícha podávaním účinného, netoxického množstva protilátky takémuto človeku alebo zvieraťu. Kto je zbehlý v odbore, bude schopný, rutinným experimentovaním, stanoviť, čo je účinné, netoxické množstvo protilátky na účel liečby karcinogénnych nádorov. Všeobecne sa však účinné dávkovanie očakáva v rozmedzí asi 0,05 až 100 miligramov na kilogram telesnej váhy na deň.

Protilátky podľa vynálezu môžu byť podávané človeku alebo inému živočíchovi v súlade so skôr spomínanými spôsobmi liečby v množstve postačujúcom mať taký účinok do terapeutického alebo profylaktického stupňa. Takéto protilátky podľa vynálezu môžu byť podávané takémuto človeku alebo inému živočíchovi v konvenčnej dávkovacej forme, spojením protilátky podľa vynálezu s konvenčným farmaceutický prijateľným nosičom podľa známych technik. Kto je zbehlý v odbore, rozpozná, že forma a charakter farmaceutický prijateľného nosiča alebo riedidla je diktovaná množstvom aktívnej ingrediencie, s ktorou sa má spájať, cestou podávania a inými dobre známymi variabilnými veličinami.

Cesta podávania protilátky (alebo jej fragmentu) podľa vynálezu môže byť orálna, parenterálna, inhalačná alebo miestna. Výraz „perenterálny“ ako je tu používaný znamená vnútrožilové, vnútrosvalové, podkožné, rektálne, vaginálne a intraperitoneálne podávanie. Všeobecne sa preferujú podkožné a vnútrosvalové formy parentrálneho podávania.

Denný režim parentrálnych alebo orálnych dávok na použitie látok podľa vynálezu na profylaktické alebo terapeutické navodenie imunosupresie, alebo na terapeutické pôsobenie na karcinogénne nádory bude všeobecne v rozmedzí asi 0,05 až 100, ale výhodne asi 0,5 až 10 miligramov na kilogram telesnej váhy na deň.

Protilátka podľa vynálezu môže byť podávaná inhalačné. „Inhaláciou“ sa rozumie intranazálne alebo orálne inhalačné podávanie. Vhodné dávkovacie formy pre takéto podávanie, ako sú aerosólové prípravky alebo inhalátory s odmeranou dávkou, sa dajú pripravovať konvenčnými technikami. Výhodné dávkové množstvo látok podľa vynálezu na používanie bude všeobecne vnútri rozmedzia asi 10 až 100 miligramov.

Protilátka podľa vynálezu môže byť podávaná aj miestne. Miestnym podávaním sa myslí nesystémové podávanie a zahrnuje aplikáciu protilátky (alebo jej fragmentu), látky podľa vynálezu, externe na epidermis, do dutiny, alebo nakvapkaním takejto protilátky do ucha, oka a nosa, a kde nedôjde k významnému vstupu do krvného riečiska. Systémovým podávaním sa myslí orálne, vnútrožilové, intraperitoneálne a vnútrosvalové podávanie. Množstvo protilátky potrebné na terapeutické alebo profylaktické účinky sa bude samozrejme meniť s vybranou protilátkou a povahou a závažnosťou stavu, ktorý sa má liečiť a bude nakoniec na voľnom rozhodnutí lekára. Vhodná miestna dávka protilátky podľa vynálezu bude všeobecne vnútri rozmedzia asi 1 až 100 miligramov na kilogram telesnej váhy denne.

Prípravky

Aj keď je možné protilátku alebo jej fragment podávať samotné, výhodné je prezentovať ju ako farmakologický prípravok. Aktívna zložka môže predstavovať, pre miestne podávanie, od 0,001 % do 10 % (váha/váha), napr. od 1 % do 2 % prípravku podľa váhy, aj keď môže predstavovať taký vysoký obsah ako 10 % (váha/váha), ale výhodne nie viac ako 5 % (váha/váha), a ešte výhodnejšie od 0,1 % do 1 % (váha/váha).

Miestne prípravky podľa vynálezu obsahujú aktívnu zložku spolu s jedným alebo viac prijateľnými nosičmi pre ňu a prípadne [optionally] akýmikoľvek inými terapeutickými ingredientmi. Nosič musí byť „prijateľný“ v takom zmysle, aby bol kompatibilný s inými ingredientmi prípravku a nepoškodzoval zdravie príjemcu.

Prostriedky vhodné na miestne podávanie obsahujú tekuté alebo polotekuté prípravky vhodné na prienik kožou na miesto, kde je liečba potrebná, napr. emulzie, krémy, masti alebo pasty, a kvapky vhodné na podávanie do oka, ucha alebo nosa.

Kvapky podľa tohto vynálezu môžu obsahovať vodné alebo olejové roztoky alebo suspenzie a môžu byť pripravované rozpustením aktívnej zložky vo vhodnom bakteriálnom roztoku baktericidneho alebo fungicídneho činidla a/alebo akéhokoľvek iného vhodného konzervačného činidla a výhodne zahrnujú povrchovo aktívne činidlo. Výsledný roztok potom môže byť vyčírený filtráciou, prenesený do vhodnej nádobky, ktorá je potom uzvretá a sterilizovaná autoklávovaním alebo držaním pri 95° - 100 °C po pol hodine. Alternatívne môže byť roztok sterilizovaný filtráciou a prenesený do nádobky aseptickou technikou. Príkladmi baktericidneho alebo fungicídneho činidla vhodného na zahrnutie do kvapiek sú fenylmerkurinitrát alebo -acetát (0,002 %), benzalkóniumchlorid (0,01 %) a clorhexidínacetát (0,01 %). Vhodné rozpúšťadlá pre prípravky olejovitých roztokov zahrnujú glycerol, zriedený alkohol a propylénglykol.

Emulzie podľa tohto vynálezu zahrnujú také, čo sú vhodné na aplikáciu na kožu alebo do očí. Očná emulzia môže obsahovať sterilný vodný roztok, prípadne obsahujúci baktericíd a môže byť pripravovaná spôsobmi podobnými ako na prípravu kvapiek. Emulzie a mazania [liniments] na aplikáciu na kožu môžu tiež obsahovať činidlo pôsobiace rýchle schnutie a chladenie kože, ako alkohol alebo acetón, alebo zvlhčovač ako glycerol, alebo olej ako pižmový a arašidový olej.

Krémy, masti a pasty podľa tohto vynálezu sú tekuté alebo polotekuté prípravky aktívnej zložky na vonkajšie použitie. Môžu sa pripravovať miešaním aktívnej zložky v jemne delenej alebo práškovanej forme, samotnej alebo v roztoku, alebo suspenzii vo vodnej alebo nevodnej kvapaline, pomocou vhodnej inštrumentácie, na mastnom alebo nemastnom základe. Základ môže obsahovať uhľovodíky, ako tuhé, mäkké alebo tekuté parafíny, glycerol, včelí vosk, kovové mydlá, rastlinný kaučuk, oleje prírodného pôvodu, ako mandľový, kukuričný, arašidový pižmový alebo olivový olej, tuk z vlny alebo jeho deriváty, alebo mastné kyseliny, ako steárovú alebo olejovú kyselinu, spolu s alkoholom, ako je propylénglykol alebo makrogoly. Prípravok môže zahrnovať akékoľvek povrchovo aktívne činidlo, ako aniónové, katiónové alebo neiónové povrchovo aktívne, ako sorbitánové estery a ich polyoxyetylénové deriváty. Suspendujúce činidlá, ako prírodné gumy, celulózové deri váty alebo anorganické materiály, ako kremičitá silika, a iné ingrediencie, ako lanolin, môžu byť tiež zahrnuté.

Kto je zbehlý v odbore rozpozná, že optimálne množstvo a rozšírenie [spacing] jednotlivých dávkovaní protilátky podľa vynálezu alebo jej fragmentu budú určené povahou a rozsahom stavu, ktorý sa má liečiť, formou, cestou a miestom podávania, a konkrétnym živočíchom, čo sa má liečiť, a že takéto optimá sa dajú určiť konvenčnými technikami. Bude tiež prijaté tým, kto je zbehlý v odbore, že optimálny priebeh liečby, t. j. počet dávok protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu podaný denne po určitý počet dní sa dá zistiť tými, čo sú zbehlí v odbore, s použitím konvenčného behu testov určenia liečby.

Bez ďalšieho rozvádzania sa verí, že kto je zbehlý v odbore môže, s použitím predošlého opisu, použiť predkladaný vynález v najplnšom rozsahu. Nasledujúce je preto treba si vykladať ako jednoduché ilustratívne príklady a žiadnym spôsobom nie ako akékoľvek obmedzenie rozsahu predkladaného vynálezu.

Kapsulový prostriedok

Farmaceutický prostriedok podľa tohto vynálezu vo forme kapsúl je pripravovaný plnením štandardnej dvojdielnej kapsuly z tvrdej želatíny 50 miligramami protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu, v práškovej forme, 100 mg laktózy, 32 mg mastku a 8 mg stearátu horečnatého.

Injekčný parenterálny prostriedok

Farmaceutický prostriedok podľa tohto vynálezu vo forme vhodnej na injekčné podávanie je pripravovaný miešaním 1,5 %-nej protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu v 10 %-nom (podľa objemov) propylénglykolu a vode. Roztok je sterilizovaný filtráciou.

Masťový prostriedok

Protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu 1,0 g. Biely mäkký parafín 100,0 g.

Protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu sú dispergované v malom objeme vehikula, aby sa vytvoril hladký homogénny produkt. Deformovateľné kovové tuby sa potom plnia disperziou.

Miestne krémový prostriedok Protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu 1,0 g. Polawax GP 200 20,0 g.

Biely včelí vosk 2,5 g. Metylhydroxybenzoát 0,1 g. Destilovaná voda do 100,0 g.

Polawax, včelí vosk a lanolin sa spolu zahrievajú pri 60 °C. Pridá sa roztok metylhydroxybenzoátu a homogenizácia sa dosiahne miešaním pri vysokých obrátkach. Teplota sa potom nechá klesnúť na 50 °C. Potom sa pridá protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu a rozdisperguje, a prostriedok sa nechá vychladnúť pri pomalom miešaní.

Miestne emulzný prostriedok Protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu 1,0 g. Sorbitan monolaurát 0,6 g.

Polysorbate 20 0,6 g. Cetostearyl alkohol 1,2 g. Glycerín 6,0 g.

Metylhydroxybenzoát 0,2 g.

Čistená voda B. P. do 100,0 ml. (B. P. = British Pharmacopeia).

Metylhydroxybenzoát a glycerín sa rozpustia v 70 ml vody pri 75 °C. Sorbitan monolaurát, Polysorbate 20 a ce tostearyl alkohol sa roztavia spolu pri 75 °C a pridajú do vodného roztoku. Výsledná emulzia sa homogenizuje, nechá chladnúť s trvalým miešaním a protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu sa pridajú ako suspenzia vo zvyšujúcej vode. Celá suspenzia sa mieša, dokiaľ nie je homogenizovaná.

Prostriedok očných kvapiek Protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu 0,5 g. Metylhydroxybenzoát 0,01 g.

Propylhydroxybenzoát 0,04 g. Čistená voda B. P. do 100,0 ml.

Metyl- a propylhydroxybenzoát sa rozpustia v 70 ml čistenej vody pri 75 °C a výsledný roztok sa nechá vychladnúť. Protilátka alebo jej fragment podľa vynálezu sa potom pridajú, roztok sa sterilizuje filtráciou cez membránový filter (0,022 pm rozmer pórov) a balí aseptický do vhodných sterilných nádobiek [containers].

Prostriedok na inhalačné podávanie

Na aerosólovú nádobku s obsahom 15-20 ml: Zmiešaj 10 mg protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu s 0,2 - 0,5 % lubrikačným činidlom, ako je polysorbát 85 alebo olejová kyselina, a disperguj takúto zmes s propelantom, ako je freón, výhodne v kombinácii s (1,2 dichlórtetrafluóroetánom) a difluórochlorometánom a daj do vhodnej aerosólovej nádobky uspôsobenej na intranazálne alebo ústne inhalačné podávanie.

Prostriedok na inhalačné podávanie

Na aerosólovú nádobku s obsahom 15 - 20 ml: Rozpusti 10 mg protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu v etanole (6 - 8 ml), pridaj 0,1 - 0,2 % lubrikačného činidla, ako je polysorbát 85 alebo olejová kyselina, a disperguj toto v propelante, ako je freón, výhodne v kombinácii s (1,2 dichlórtetrafluoroetánom) a difluorochlorometánom a daj do vhodnej aerosólovej nádobky uspôsobenej na intranazálne alebo ústne inhalačné podávanie, parenterálna, inhalačná alebo miestna.

Protilátky alebo ich fragmenty podľa vynálezu sú osobitne užitočné na parenterálne podávanie, t. j. podkožné, vnútrosvalové a vnútrožilové. Prostriedky na parenterálne podávanie budú bežne obsahovať roztok protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu alebo ich kokteil v prijateľnom nosiči, výhodne vo vodnom nosiči. Dá sa použiť rad vodných nosičov, napr. voda, pufŕovaná voda, 0,4 % soľný roztok, 0,3 % glycín a podobne. Tieto roztoky sú sterilné a v podstate bez časticového materiálu. Tieto roztoky môžu byť sterilizované konvenčnými, dobre známymi technikami. Prostriedky môžu obsahovať farmaceutický prijateľné dodatočné substancie ako je potrebné na priblíženie sa k fyziologickým pomerom, ako sú činidlá na nastavenie pH, pufrovanie atď. Koncentrácia protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu v takýchto farmakologických prípravkoch sa môže meniť v širokom rozmedzí, napr. od menšej ako 0,5 %, obyčajne alebo prinajmenšom 1 %, do tak vysokej ako je 15 % alebo 20 % podľa váhy, a bude vybraná primáme na základe objemu tekutiny, viskozít atď., podľa konkrétneho spôsobu vybraného podávania.

Takto farmaceutický prostriedok podľa vynálezu na vnútrosvalovú injekciu sa dá pripraviť tak, aby obsahoval 1 ml sterilnej vody a 50 mg protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu. Podobne farmaceutický prostriedok podľa vynálezu na vnútrosvalovú injekciu sa dá pripraviť tak, aby obsahoval 250 ml sterilného Ringerovho roztoku a 150 mg protilátky alebo jej fragmentu podľa vynálezu. Praktické spôsoby na prípravu parenterálne podávateľných prostried kov sú dobre známe alebo budú jasné tým, čo sú zbehlí v odbore, a sú opísané podrobnejšie napríklad v Remington's Pharmaceutical Science, 15-te vydanie, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, zahrnutom tu takto odkazom.

Protilátky (alebo ich fragmenty) podľa vynálezu môžu byť lyofilizované na skladovanie a rekonštituované vo vhodnom nosiči pred použitím. Táto technika sa ukázala ako účinná s konvenčnými imunoglobulínmi a lyofilizačné a rekonštitučné techniky v odbore známe sa dajú používať.

V závislosti od požadovaných výsledkov, farmaceutický prostriedok podľa vynálezu môže byť podávaný na profylaktické alebo terapeutické pôsobenie. V terapeutických aplikáciách je prostriedok podávaný pacientovi už trpiacemu chorobou, v množstve postačujúcom na vyliečenie alebo prinajmenšom na čiastočné obmedzenie choroby a jej komplikácií. Pri profylaktickej aplikácii prostriedky obsahujúce predkladané protilátky alebo ich kokteil sú podávané pacientovi, ktorý ešte nie je v chorobnom stave na posilnenie pacientovej odolnosti.

Malo by sa tiež pripomenúť, že protilátky podľa tohto vynálezu sa môžu použiť tiež na návrh [design] a syntézu buď peptidových, alebo nepeptidových zlúčenín (mimetík), čo by boli užitočné v rovnakej terapii ako protilátky. Pozri napr. Saragovi et al., Science, 253, 792 - 795 (1991).

Uloženie

Kmeň_______________je uložený s ATCC a má pridelené číslo____________________. Toto uloženie sa vykonalo 9. júla 1992.

Žiadateľ a jeho spoločníci [asignees] oznamujú svoju zodpovednosť za náhradu týchto kultúr, ak vyhynú pred koncom obdobia patentu na ne vydaného, 5 rokov po poslednej žiadosti o kultúru alebo 30 rokov, čokoľvek potrvá dlhšie, a zodpovednosť upozorniť depozitár na vydanie takéhoto patentu, pričom v tomto čase sa depozit stane neodvolateľné prístupný verejnosti. Do tohto času sa stane dostupným pre Commisioner of Pattents podľa podmienok 37 C. F. R článkov 1 -14 a 35 U. S. C. článku 112.

Ďalšie prevedenia sú v rámci nasledujúcich nárokov.

(1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:

(i) ŽIADATELIA: ROLAND A. NEWMAN NABIL HANNA

RONALD W. RAAB (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: REKOMBINANTNÉ PROTILÁTKY NA HUMÁNNU TERAPIU (iii) POČET SEKVENCIÍ: 16 (iv) KOREŠPONDENČNÁ ADRESA:

(A) ADRESÁT: Lyon & Lyon (B) ULICA: 611 West Sixth Street (C) MESTO: Los Angeles (D) ŠTÁT: Califomia (E) ZEM: USA (F) POŠTOVNÉ SMEROVACIE ČÍSLO: 021112658 (v) POČÍTAČOVÁ ČÍTACIA FORMA:

(A) TYP MÉDIA: DISKETA 3,5, 1,44 Mb (B) POČÍTAČ: IBM kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: IBM P. C. DOS (Verzia 5.0) (D) POČÍTAČOVÝ PROGRAM (SOFTWARE): WordPerfect (Verzia 5.0) (vi) ÚDAJE O SÚČASNEJ PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY:

(B) DÁTUM PODANIA:

(C) KLASIFIKÁCIA:

(vii) ÚDAJE O PREDCHÁDZAJÚCEJ PRIHLÁŠKE: Celkový počet prihlášok vrátane opísanej prihlášky: 2 (A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: 07/856 281 (B) DÁTUM PODANIA: 23. MARCA 1992 (A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: 07/735 064 (B) DÁTUM PODANIA: 23. JÚLA 1991 (vin) INFORMÁCIA O ZÁSTUPCOVI:

(A) MENO: Warburg, Richard J.

(B) ČÍSLO REGISTRÁCIE: 32 327 (C) ODKAZ/ČÍSLO SPISU: 198/158 (ix) INFORMÁCIA O SPOJENÍ:

(A) TELEFÓN: (213)489-1600 (B) FAX: (213)955-0440 (C) TELEX: 67-3510 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 1:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi)OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 1:

CCATGGACTG GACCTGG 17 (3) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 2:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi)OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 2:

ATGGACATAC TTTGTTCCAC 20 (4) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 3:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi)OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 3:

CCATGGAGTT TGGGCTGAGC 20 (5) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 4:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20

SK 285046 Β6 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xí)OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 4:

ATGAAACACC TGTGGTTCTT 20 (6) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 5:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi)OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 5:

ATGGGGTCAA CCGCCATCCT 20 (7) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 6:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 2:

ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT 20 (8) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 7:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 16 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 7:

TTGGGGCGGA TGCACT 16 (9) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 8:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE;

(A) DĹŽKA: 17 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi)OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 8:

GATGGGCCCTTGGTGGA 17 (10) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 9:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi)OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 9:

(B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová

GATGACCCAG TCTCCAGCCTC 21

K (11) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 10:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi)OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 10

CTCACTTGCT GCACAGGTCC 21

Y VR M (12) INFORMÁC1A O SEKV ID Č: 11:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 11:

AAGACAGATG GTGCAGCCA 19 (13) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 12:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi)OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 12:

GGAACAGAGT GACCGAGGGG 20 (14) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 13:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 31 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi)OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 13:

ACTAAGTCGA CATGAAACAC CTGTGGTTCT T 31 (15) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 14:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 39 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi)OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 14:

ATCACAGATC TCTCACCATG ACCIGCTCCC CTCTCCTCC 39 (ló)INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 15:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 423 (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 15:

GAC

ATG

AAA

CAC

CIG

TGG

TIC

CIC

CFG

GTG

GCA

GCC

CCC

AGA

48

TGG

GTC

TTG

TCC

CAG

GTG

CAG

CIG

CAG

GAG

GCG

GGC

OCA

GGA

CIG

CTG

96

AAG

CCT

TCG

GAG

ACC

CIG

TCC

CIC

ACC

TGC

AGT

GIC

TCT

GGT

GGC

TCC

144

ATC

AGC

GGT

GAC

TAT

TGG

TIC

TGG

ATC

CGC

CAG

TCC

CCA

GGG

AAG

192

GGA

CIG

GAG

TGG

ATC

GGC

TAC

ATC

TAT

GGC

AGT

GGT

GGG

GGC

ACC

AAT

240

TAC

AAT

CCC

TCC

CIC

AAC

AAT

CGA

GTC

TCC

ATT

TCA

ATA

GAC

ACG

TCC

288

AAG

AAC

CIC

TTC

TCC

CIG

AAA

CIG

AGG

TCT

GTG

ACC

GGC

GCG

GAC

ACG

336

GCC

GIC

TAT

TAC

TGT

GCG

AGT

AAT

ATA

TTG

AAA

TAT

CIT

CAC

TGG

TTA

384

TTA

TAC

TGG

GGC

CAG

GGA

GIC

CIG

GIC

ACC

GTC

TCC

TCA

423

(17)INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 16:

(i) VLASTNOSTI SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 387 (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) TYP VLÁKNA: Jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: Lineárna (xi)OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 16:

ACC

ATG

GCC

TGG

GCT

CTG

CTC

CIC

GGC

CIC

CTT

GCT

GAC

TCT

GCG

GCC

TCC

TAT

GAG

TTG

AGT

CAG

CCT

CGC

TCA

TCC

CCA

GGA

CAG

ACG

GCC

GGG

TTC

ACC

TGT

GGG

GGA

GAC

AGG

AAA

AGT

GTA

CAG

TGG

TAC

CAG

AAG

CCA

CCG

CAG

CTG

GTC

ATC

TAT

GCT

GAC

AGC

GAA

CGG

CCC

TCA

GGG

ATC

TIC

TCT

GGC

TCC

AAC

TCA

GGG

AAC

ACC

GCC

ACC

CTG

ACC

GTC

GAG

GCC

GGG

GAT

GAG

GCT

GAC

TAT

TAC

TGT

CAG

GTG

ACT

GCT

GAT

CAT

TGG

GTC

TIC

GGC

GGA

GGG

ACC

CGG

CTG

GGT

CAC	τη-	ACA	48
GTG	TCC	GTG	96
AAC	GTT	GGA	144
GCC	CCT	GTG	192
CCT	GCG	CGA	240
ATC	AGC	GGG	288
TGG	GAC	AGT	336
ACC	GTC	CTA	384

387

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Chiméma protilátka, ktorá sa špecificky viaže k ľudskému antigénu, pričom nie je imunogénna u človeka, nie je rovnaká ako ľudská alebo šimpanzia protilátka a obsahuje celú variabilnú oblasť imunoglobulínu opice Starého sveta vybranej zo skupiny opíc rhesus, cynomolgus a paviána, konštantné oblasti ľudského alebo šimpanzieho imunoglobulínu, pričom je získateľná spôsobom zahrnujúcim kroky:

tvorbu protilátky opice Starého sveta proti ľudskému cieľu v opici Starého sveta vybranej zo skupiny opíc rhesus, cynomolgus a paviána, izoláciu nukleovej kyseliny opice Starého sveta kódujúcej celú variabilnú oblasť protilátky opice Starého sveta, poskytnutie ľudskej alebo šimpanzej nukleovej kyseliny kódujúcej ľudskú konštantnú oblasť ľudskej protilátky, ligáciu nukleovej kyseliny opice Starého sveta a ľudskej alebo šimpanzej nukleovej kyseliny za vzniku rekombinantnej nukleovej kyseliny a expresiu rekombinantnej nukleovej kyseliny za tvorby chimémej protilátky.
2. Chiméma protilátka podľa nároku 1, ktorá je terapeuticky účinná v dávke od 0,05 mg/kg do 100 mg/kg telesnej hmotnosti.
3. Chiméma protilátka podľa nároku 1 alebo 2, ktorá obsahuje konštantné oblasti imunoglobulínových ťažkých a ľahkých reťazcov ľudskej protilátky a variabilné oblasti imunoglobulínových ťažkých a ľahkých reťazcov protilátky opice Starého sveta špecifickej na ľudský antigén.
4. Chiméma protilátka podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorá sa špecificky viaže k ľudskému antigénu vybranému z CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41,

CD44, CD54, TNFa, TNF/3, Tn antigénu, IL-1, IL-8, receptora ľudských T-buniek, CD3, CD28, CD8, CDlla, CDllb, CDllc, CD18, CD5a, CD45, produktu neu onkogénu, MDR-1, TGFct, TGFa receptora, PDGF a CD71.
5. Chiméma protilátka podľa nároku 4, ktorá špecificky viaže CD4 a obsahuje imunoglobulínové variabilné ľahké a ťažké reťazce obsahujúce peptidové sekvencie znázornené na obrázkoch 13 a 14.
6. Chiméma protilátka podľa nároku 5, ktorá obsahuje ľudský imunoglobulínový ťažký reťazec gama-1 konštantnej oblasti a ľudský imunoglobulínový ľahký reťazec kapa alebo lambda konštantnej oblasti.
7. Chiméma protilátka podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorá špecificky viaže ľudský antigén zahrnutý v autoimúnnej poruche alebo ľudský nádorový antigén.
8. Chiméma protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 na použitie ako terapeutické činidlo pre ľudí.
9. Chiméma protilátka podľa nároku 8, ktorá má väzbovú špecifickosť pre ľudský tumorový antigén na použitie pri liečbe rakoviny.
10. Chiméma protilátka podľa nároku 8, ktorá má väzbovú špecifickosť pre ľudský antigén zahrnutý v autoimúnnej poruche na použitie na liečenie tejto poruchy.
11. Chiméma protilátka podľa nároku 10 na použitie na liečenie ochorenia, poruchy alebo podmienky vyvolaním imunosupresie.
12. Chiméma protilátka podľa nároku 11, v ktorej ochorenie, porucha alebo podmienka je reumatoidná artritída, psoriáza, transplantácia, atopická dermatitída, kontaktná dermatitída alebo seboroická dermatitída.
13. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky alebo profylaktický účinné množstvo protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 vo farmaceutický prijateľnom nosiči.
14. Rekombinantná nukleová kyselina obsahujúca DNA sekvenciu alebo sekvencie, ktoré kódujú chimému protilátku podľa nároku 1.
15. Rekombinantná nukleová kyselina obsahujúca aspoň jednu oblasť CDR z variabilnej oblasti v SEQ. ID. Č. 15 alebo 16.
16. Rekombinantná nukleová kyselina obsahujúca DNA sekvenciu zobrazenú v SEQ. ID. Č. 15 alebo 16.
17. Spôsob výroby chimémej protilátky proti ľudskému cieľovému antigénu, ktorá je imunogénna u človeka, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky:

tvorbu protilátky opice Starého sveta proti uvedenému antigénu v opici Starého sveta vybranej zo skupiny opíc rhesus, cynontolgus a paviána, izoláciu nukleovej kyseliny opice Starého sveta kódujúcej antigén celú variabilnú oblasť protilátky opice Starého sveta, poskytnutie ľudskej alebo šimpanzej nukleovej kyseliny kódujúcej ľudskú konštantnú oblasť ľudskej protilátky, ligáciu nukleovej kyseliny opice Starého sveta a ľudskej nukleovej kyseliny za vzniku rekombinantnej nukleovej kyseliny a expresiu uvedenej rekombinantnej nukleovej kyseliny za tvorby chimémej protilátky.
18. Použitie chimémej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 na výrobu liečiva na liečenie alebo prevenciu ochorenia, poruchy alebo podmienky vybranej zo skupiny pozostávajúcej z rakoviny, infekčného ochorenia, odmietnutia transplantovancho orgánu alebo tkaniva, autoimúnneho alebo zápalového ochorenia, poruchy alebo podmienky.
19. Použitie chimémej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 na výrobu liečiva na liečenie alebo prevenciu autoimúnneho ochorenia.
20. Použitie chimémej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 na výrobu liečiva na liečenie rakoviny.
21. Použitie chimémej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 na výrobu liečiva na liečenie ochorenia, poruchy alebo podmienky vybranej zo skupiny pozostávajúcej z reumatoidnej artritídy, psoriázy, transplantácie, atopickej dermatitídy, kontaktnej dermatitídy alebo seboroickej dermatitídy.
22. Použitie chimémej protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 na výrobu liečiva na liečenie ochorenia, poruchy alebo podmienky vybranej zo skupiny zahrnujúcej reumatoidnú artritídu, lupus erythematosus, Hashimotovu tyreoditídu, sklerózu multiplex, ťažkú myastémiu, diabetes typu 1, uveitídu, nefrotický syndróm, psoriázu, atopickú dermatitídu, kontaktnú dermatitídu, seboroickú dermatitídu, ekzematickú dermatitídu, plochý červený lišaj, pemfigus, bulózny pemfigus, pľuzgierikovitú epidermolýzu, urtikáriu, angiogedémy, vaskulitídu, erytém, kutánnu eozinofiliu, ohraničenú alopéciu, reverzibilne obštruktívne ochorenie dýchacích ciest, migrénu, ekzém, rhinitídu, iné alergické podmienky a ochorenia spojené s intestinálnym zápalom, vrátane celiakálneho ochorenia, proktitídy, eozinofílie gastroenteritis, mastocytózy, Crohnovej choroby a ulceratívnej kolitídy.