PT759302E

PT759302E - Farmaco para o tratamento da artrite reumatoide

Info

Publication number: PT759302E
Application number: PT95913319T
Authority: PT
Inventors: Tadashi Nishida; Sachiko Miyake; Hideo Yagita; Ko Okumura
Original assignee: Akzo Nobel Nv
Priority date: 1994-04-26
Filing date: 1995-03-22
Publication date: 2001-01-31
Also published as: DK0759302T3; ES2151054T3; EP0759302A1; US5855888A; WO1995028961A1; EP0759302B1; GR3034200T3; DE69518415D1; EP0759302A4; ATE195428T1; DE69518415T2

Description

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DESCRIÇÃO “FÁRMACO PARA O TRATAMENTO DA ARTRITE REUMATÓIDE"

Campo Técnico O presente invento refere-se à utilização de um anticorpo monoclonal, que pode reconhecer especifícamente a região extracelular da cadeia α do VLA-2 humano, como ingrediente activo para a preparação de um fármaco para o tratamento da artrite reumatóide.

Antecedentes Técnicos A artrite reumatóide (a seguir abreviada como “AR”) é uma doença inflamatória crónica que apresenta um sintoma inflamatório principalmente na membrana sinovial articular, em que várias células inflamatórias penetram no fluído sinovial através dos hemangio-endoteliócitos da membrana sinovial. Supõe-se que os sintomas patológicos podem ser compartilhados por mecanismo imunológico e que os sintomas podem desencadear a resposta imune, sendo ainda difícil especificar o mecanismo. E também importante tomar clara a razão pela qual os sintomas inflamatórios são mantidos na membrana sinovial mesmo após remoção da causa da doença. Será profundamente compartilhada pelos linfócitos responsáveis pela imunização, uma série de processos destes sintomas de inflamação, particularmente a croni-cidade e a sua duração.

Panayi, G.S. et al. mencionaram que a “Sinovite (associada à AR) já não é entendida como um processo mediado por anticorpos que envolve factores reumatóides e complexos imunes, mas antes como um processo mediado por células que envolve as células T, as células que apresentam antigénio (CAA), macrófagos, sinoviócitos e citocinas” (cf. Arth. Rheum., 35, pgs. 729-735, 1992).

Kakimoto, K. et al. descreveram que quando um anticorpo anti-ICAM- -2- -1 ou um anticorpo anti-LFA-1 é administrado a um modelo de ratinho que sofre de artrite induzida por colagénio (a seguir abreviada como “AIC”) desde o estágio de primeira sensibilização com um antigénio, que é a fase de indução da artrite, a AIC é suprimida em todos os casos [Cell. Immunol., 142, pgs. 326-337 (1992)]. Foi adicionalmente descrito por Kakimoto et al. na 23a Reunião Geral da Japan Immunological Association que quando se administra uma combinação de um anticorpo anti-ICAM-1 e um anticorpo anti-LFA-1 desde o estágio de primeira sensibilização com um antigénio, a AIC é mais eficazmente suprimida nos ratos comparativamente à administração de apenas um destes anticorpos [Japan Immunological Association, Documentos das Reuniões Gerais, 23, p. 530,1-28 (1993)].

Além disso, Durie, F.H. et al. descreveram que num modelo de AIC de ratinho, a AIC é suprimida pela administração de anticorpo anti-ligando CD 40 (CD40L) desde o estágio da fase de indução da artrite [Science, 261, pgs. 1328-1330 (1993)].

Por outro lado, considerou-se que o colagénio, a fibronectina, a laminina e o proteoglicano, que são moléculas matrizes no tecido sinovial, participam na fixação e retenção de linfócitos e macrófagos no tecido ou na sua activação através da família VLA. Estes participam profundamente na lesão da membrana sinovial na AR, sendo, por conseguinte, importante a clarificação do seu mecanismo para a descoberta de um meio adequado para o tratamento da AR.

Miyake, S. et al. investigaram a modificação do ARNm das citocinas em que os monócitos separados do fluído sinovial de doentes com AR foram cultivados, durante a noite, numa molécula de matriz imobilizada e o ARN extractado, tendo-se verificado em seguida que a sua mensagem era reduzida pelo anticorpo anti-integrina βΐ [J. Exp. Med., 177, pgs. 863-868 (1993)]. Por consequência, considera-se que a molécula matriz funciona como um factor co-estimulante de linfócitos. -3- A interacção entre a molécula matriz e as células será compartilhada principalmente pela molécula integrina e por outras moléculas variadas tais como CD26 e CD44. Haynes et al. descreveram que as moléculas adesivas da família VLA existem amplamente em células do tecido sinovial tais como as células sinoviais de tipo A, células endoteliais dos vasos, macrófagos [Springer Semin. Immunopathol., H, p. 163 (1989)].

Sabe-se que as moléculas de adesão da família VLA incluem VLA-1,-2, -3, -4, -5 e -6, em cada uma das quais a cadeia βΐ e a cadeia α (al, a2, a3, a4, a5 ou aó) estão não covalentemente ligadas uma à outra para formar heterodímeros, em que a4 se pode também associar a β7 e aó se pode também associar a β4, e, por conseguinte, será também compreensível que α4β7 e αόβ4 pertençam também à família VLA.

Descrição do Invento

Os presentes inventores estudaram o tratamento da AR utilizando um anticorpo monoclonal que pode reconhecer um certo factor de adesão e investigaram vários anticorpos monoclonais com um modelo de AIC de ratinho que é conhecido por ser próximo da AR humana e descobriram que um certo anticorpo monoclonal apresenta os efeitos desejados. Um objectivo do invento é o de proporcionar um fármaco para o tratamento da artrite reumatóide (a seguir referido como “fármaco para tratamento da AR”) que compreende como ingrediente activo um anticorpo monoclonal que pode reconhecer um certo factor de adesão.

Como resultado da investigação acima mencionada, os presentes inventores descobriram que um anticorpo monoclonal que pode reconhecer especifícamente a região extracelular do VLA-2 humano exibe efeitos curativos na AR e, por conseguinte, é adequado para o objectivo acima.

Isto é, o presente invento refere-se a um fármaco para o tratamento da artrite reumatóide que compreende como ingrediente activo um anticorpo mo- -4- noclonal que pode reconhecer especificamente a região extracelular do VLA-2 humano.

Melhor Forma para .Realizar o /nvento O presente invento é explicado com detalhe abaixo. O anticorpo utilizado no presente invento inclui um qualquer anticorpo monoclonal que pode reconhecer especificamente a região extracelular do VLA-2 humano, mas o anticorpo monoclonal preferido é aquele que pode reconhecer especificamente a região extracelular da cadeia α do VLA-2 humano.

Além disso, o anticorpo monoclonal acima utilizado no presente invento pode ser qualquer um dos anticorpos de origem em mamíferos, anticorpos quiméricos ou anticorpos humanizados.

Os anticorpos de mamíferos utilizados no presente invento foram conhecidos, por exemplo, em Ken D. Pischel et al., J. /mmunol., 138, pgs. 226-233 (1987) e William G. Cárter et al.. J. Cell Biol., 110, pgs. 1387-1404 (1990).

Jackson et_al. (Experientia, Supl. (Angiogenesis), 61 (1992), pgs. 198-204) investigaram a formação de tubo vascular induzida por colagénio tipo 1. São descritos anticorpos policlonais (anti-VLA-2) e monoclonais (AK7) para epítopos diferentes no receptor integrina α2β1 para o colagénio. Este documento refere que a proteína-quinase C pode desempenhar um papel na angiogénese e pode estar envolvida na transdução do sinal da formação do tubo induzida por colagénio. Os autores mostram que o receptor da integrina α2β1 participa quer na ligação às células endoteliais quer na formação do tubo induzida por colagénio.

Goldman et al. (European Journal of /mmunology, vol. 22, 1992, pgs. 1109-1114) referem que o VLA-2 é utilizado como um receptor de colagénio pelos leucócitos. São identificados anticorpos monoclonais que reconhecem o -5- VLA-2. Os autores afirmam que a utilização selectiva de VLA-2 pelos leucócitos como receptor do colagénio proporciona um outro exemplo de especificidade de ligação ligando, associada ao tipo de célula. Eles estipulam também que devido ao facto do VLA-2 ser o único leucócito integrina significativo, que se liga ao colagénio, estas células podem também participar nas fases de cicatrização de feridas.

Os anticorpos seguintes estão rapidamente disponíveis e são úteis.

Anticorpo anti-VLA-2 humano [anticorpo monoclonal anti-a2 humano: Clone P1E6 (CP10: um produto de Oncogene Science, A042: um produto de Terios Co., MAB 1950: um produto de Chemicon Co.]; anticorpo monoclonal anti-a2pi humano: sem descrição do clone [MAB 1967: um produto de Chemicon Co.].

Para se produzir um anticorpo quimérico utilizado no presente invento, prepara-se em primeiro lugar um hibridoma capaz de produzir o anticorpo monoclonal de ratinho anti-humano acima mencionado pelo procedimento que se segue.

Isto é, as células reactivas ao anticorpo anti-VLA-2 humano acima são separadas dos linfócitos humanos seleccionados a partir do grupo constituído por células T de memória humana, monócitos humanos e linfoma de células B humanas por citometria de fluxo (considera-se que as células assim separadas podiam expressar um antigénio contra VLA-2 humano). As células separadas como acima mencionado são suspensas numa solução salina tamponada com fosfato, etc. e imuniza-se um ratinho com a referida suspensão pela sua administração intravenosa ou intra-peritoneal e, em seguida, isola-se o baço do animal imunizado para se prepararem esplenócitos que produzem anticorpo. Os esplenócitos que produzem anticorpo obtidos a partir do animal imunizado são submetidos a fusão celular com células de mieloma. As células de mieloma são, de preferência, células de origem em ratinhos. A fusão celular é realizada de uma forma similar à descrita por -6-

Milstein C. et al. [Nature, 256. p. 495 (1975)], isto é, por reacção a uma temperatura de 30°C a 40°C durante cerca de 1 a 3 minutos utilizando-se polietilenoglicol a 30% até 60% (peso molecular médio 1000-4000). O hibridoma desejado capaz de produzir um anticorpo monoclonal que pode reconhecer especificamente o (antigénio) VLA-2 humano é seleccionado, utilizando-se citometria de fluxo, por análise dos anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas assim preparados. A partir do hibridoma assim separado capaz de produzir um anticorpo monoclonal de ratinho anti-humano, preparam-se ARNm e, em seguida, uma biblioteca de ADNc, por um processo convencional. A partir da biblioteca, o ADNc que possui o tamanho desejado é clonado por uma reacção PCR convencional com um iniciador (“primer”) para uma porção de sequência nucleotídica comum a uma região de cadeia pesada e a uma região de cadeia leve de anticorpo de ratinho. O segmento de ADN da região de cadeia pesada ou o segmento de ADN da região de cadeia leve assim obtidos que codificam uma região variável do anticorpo de ratinho são conjugados precisamente com um segmento de ADN que codifica uma região constante do anticorpo humano com prevenção de qualquer substituição de aminoácidos e deslocamento da estrutura, para dar um ADN de anticorpo quimérico. O segmento de ADN de cadeia pesada ou o segmento de ADN de cadeia leve do anticorpo quimérico assim obtido é recombinado num vector de expressão de anticorpo conhecido respectivamente e transfectado, em simultâneo, numa célula hospedeira adequada tal como célula de mieloma de ratinho, para dar um clone que produz anticorpos quiméricos.

Verifíca-se se o clone pode produzir o anticorpo desejado analisando-se o sobrenadante de cultura do clone, por ELISA ou semelhante. Em seguida, o clone capaz de produzir eficazmente o anticorpo quimérico de ratinho--humano é cultivado sendo o anticorpo quimérico de ratinho-humano assim produzido isolado e purificado a partir do caldo de cultura com uma coluna de -7- proteína G. Finalmente, o anticorpo é submetido a filtração em gel ou diálise para preparar uma solução do anticorpo quimérico de ratinho-humano numa solução salina tamponada com fosfato. O anticorpo humanizado utilizado no presente invento pode ser preparado de uma forma similar à descrita por Cary Queen et al. [Proc. Natl. Acad. Sei., 86, pgs. 10029-10033 (1989)], i.e. por determinação da sequência de nucleótidos da região determinante da complementaridade (RDC) do anticorpo anti-humano de ratinho que produz fragmento de ADN de hibridoma, transplantando a referida região para uma região determinante da complementaridade de um anticorpo humano adequado, para dar um ADN de anticorpo humanizado. Quando se forma uma qualquer deformação na estrutura tridimensional da região determinante da complementaridade, durante o procedimento acima, esta pode ser corrigida por substituição adequada da base na região de estrutura. O segmento de ADN de cadeia pesada ou o segmento de ADN de cadeia leve do anticorpo humanizado assim obtido é recombinado num vector de expressão de anticorpos conhecido, respectivamente, e transfectado, em simultâneo, numa célula hospedeira adequada tal como célula de mieloma de ratinho, para dar um clone produtor de anticorpos humanizados. Verifica-se se o clone pode produzir o anticorpo desejado analisando-se o sobrenadante de cultura do clone, por ELISA ou semelhante. Em seguida, o clone capaz de produzir eficazmente o anticorpo humanizado é cultivado sendo o anticorpo humanizado assim produzido isolado e purificado a partir do caldo de cultura com uma coluna de proteína G, etc.. Finalmente, o anticorpo é submetido a filtração em gel ou diálise para preparar uma solução do anticorpo humanizado numa solução salina tamponada com fosfato. O fármaco para tratamento da AR do presente invento é normalmente utilizado na forma de uma injecção. A preparação para injecção pode ser preparada por um processo convencional. Isto é, pode-se preparar uma prepa- -8- ração para injecção por dissolução do anticorpo monoclonal obtido acima numa solução salina tamponada com fosfato e esterilização da solução por filtração. A solução contendo anticorpo assim esterilizada por filtração pode ser convertida num produto liofilizado, que é dissolvido aquando da utilização. O fármaco para tratamento da AR do presente invento pode ser administrado, por exemplo, por injecção subcutânea, injecção intra-muscular, injecção intravenosa ou injecção intra-articular, de preferência por injecção intravenosa ou intra-articular. A dose do fármaco para tratamento da AR do presente invento pode variar de acordo com o sintoma, idade, peso do doente com AR, tipo de anticorpo activo, processo de administração e semelhante, mas é normalmente administrado numa dose de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg como quantidade do anticorpo activo (um anticorpo monoclonal que reconhece especificamente a região extracelular do VLA-2 humano), uma vez por dia, com uma frequência de uma a duas vezes por semana. O anticorpo monoclonal utilizado no fármaco para tratamento da AR do presente invento pode inibir fortemente o inchaço devido à artrite na AR, apresentando o anticorpo uma actividade particularmente forte, a maior entre os anticorpos monoclonais que podem reconhecer especificamente a região extracelular da molécula de adesão da família de VLA humano (cf. Experiências 1 e 2). Além disso, o anticorpo monoclonal utilizado no presente fármaco para tratamento da AR pode inibir o inchaço devido à AR mais fortemente do que uma mistura de igual quantidade de anticorpo anti-ICAM-1 e anticorpo anti-LFA-1 e mais do que o anticorpo anti-CD40L (cf. Experiências 1 e 2). O anticorpo monoclonal utilizado no presente fármaco para tratamento da AR possui baixa toxicidade.

Por conseguinte, o fármaco para tratamento da AR do presente invento é útil no tratamento da AR. O invento é ilustrado pelas Experiências seguintes. -9-

Experiência 1

Efeitos de cura no modelo de AIC de ratinho (1) Anticorpos a serem testados

Anticorpo anti-VLA-2 [anticorpo monoclonal de hamster anti-VLA-2 de ratinho, clone: HMa2, preparado por Sumitomo Electric Industries, Ltd. (SE-A1014)]

Anticorpo anti-VLA-1 [anticorpo monoclonal de hamster anti-VLA-1 de ratinho, clone: HMal, preparado por Sumitomo Electric Industries, Ltd. (SE-A1013)] (anticorpo de referência)

Anticorpo anti-VLA-6 [anticorpo monoclonal de hamster anti-VLA-6 de ratinho, clone: HMa6, preparado por Sumitomo Electric Industries, Ltd. (SE-A1015)] (anticorpo de referência)

Uma mistura equiquantitativa de anticorpo anti-ICAM-1 [anticorpo monoclonal de rato anti-ICAM-1 de ratinho, clone: KAT-1, preparado por British Biotechnology (BSA2)] e anticorpo anti-LFA-1 [anticorpo de rato anti—LFA-1 de ratinho, clone: KBA, preparado por British Biotechnology (BSA5)] (anticorpo de referência) (2) Processo de teste

Uma solução de um colagénio tipo II de origem em bovino (4 mg/ml) em ácido acético 0,05N foi misturada com uma quantidade equivalente de adjuvante completo de Freund (DIFCO, FCA) e a mistura foi emulsionada. Sensibilizou-se um ratinho com a emulsão, por injecção desta na cauda de um ratinho DBA/1J macho (8 semanas de idade, 5-10 ratinhos por grupo) numa quantidade de 200 pg/ratinho (como colagénio). Após três semanas, os animais foram adicionalmente imunizados com uma emulsão preparada por mistura da mesma solução de colagénio que acima com uma quantidade equivalente de adjuvante incompleto de Freund (DIFCO, FIA). Um dia antes da imunização adicional, iniciou-se a administração intraperitoneal do anticorpo de teste no ratinho (dose por dia, 250 pg/ratinho, duas vezes por semana). -10- Νο 20° dia após a sensibilização, avaliou-se o grau de artrite pelos índices seguintes (0-4 pontos por cada perna, total nas quatro pernas, 16 pontos no máximo) (índice para artrite) 0 pontos: Sem alteração 1 ponto: Inchaço total fraco ou inchaço nos dedos 2 pontos: Inchaço total ligeiro 3 pontos: Inchaço total nítido 4 pontos: Inchaço total significativo (3) Resultados de Teste

Os resultados de teste são apresentados na Tabela 1 seguinte. Como se observa a partir da Tabela 1, o grupo ao qual se administrou o anticorpo anti--VLA-2 apresentou uma supressão mais significativa do inchaço devido à artrite em comparação com o grupo ao qual se administrou o anticorpo anti--VLA-1, o grupo ao qual se administrou o anticorpo anti-VLA-6 e o grupo ao qual se administrou uma mistura de uma quantidade equivalente de anticorpo anti-ICAM-1 e anticorpo anti-LFA-1.

Além disso, durante esta experiência, não se observou qualquer sintoma tóxico (efeito secundário específico, morte, etc.) em todos os animais aos quais se administraram os anticorpos de teste. - 11 -

Tabela 1

Anticorpo Alteração no índice de artrite de teste 201 23 27 30 34 37 41 44 48 Anticorpo 0,0 0,0 0,4 U 3,1 4,2 6,7 7,4 8,5 anti-VLA-1 Anticorpo 0,0 0,0 0,8 1,5 2,2 2,7 4,5 5,0 4,8 anti-VLA-2 Anticorpo 0,0 0,0 1,2 4,3 4,9 5,9 6,9 6,1 7,1 anti-VLA-6 Anticorpo anti-ICAM-1 + 0,0 0,0 0,5 1,8 6,9 8,5 10,0 8,8 9,3 Anticorpo anti-LFA-1 Controlo 0,0 0,0 1,0 2,8 5,0 7,6 8,6 10,4 11,0 1

Dias após a primeira sensibilização com colagénio.

Experiência 2

Efeitos de cura no modelo de AIC de ratinho (1) Anticorpos a serem testados

Anticorpo anti-VLA-4 [anticorpo monoclonal de rato anti-VLA-4 de ratinho, descrito no Text Book of Immunology in Juntendo University, Faculdade de Medicina] (anticorpo de referência)

Anticorpo anti-VLA-5 [anticorpo monoclonal de hamster anti-VLA-5 de ratinho, clone: HMa5-l, preparado por Sumitomo Electric Industries, Ltd. (SE-A1002)] (anticorpo de referência) - 12-

Anticorpo anti-CD40L [anticorpo monoclonal de hamster anti-CD40L de ratinho, clone: HM40L-1, preparado por Sumitomo Electric Industries, Ltd. (SE-A1020)] (anticorpo de referência) (2) Processo de teste O mesmo da Experiência 1. (3) Resultados de Teste

Os resultados de teste são apresentados na Tabela 2 seguinte. Como se observa a partir da Tabela 2, o grupo ao qual se administrou o anticorpo anti--VLA-2 apresentou uma supressão mais significativa do inchaço devido à artrite em comparação com o grupo ao qual se administrou o anticorpo anti--VLA-4, o grupo ao qual se administrou o anticorpo anti-VLA-5 e o grupo ao qual se administrou o anticorpo anti-CD40L.

Além disso, durante esta experiência, não se observou qualquer sintoma tóxico (efeito secundário específico, morte, etc.) em todos os animais aos quais se administraram os anticorpos de teste.

Tabela 2

Anticorpo Alteração no índice de artrite de teste 20* 23 27 30 34 37 41 44 48 Anticorpo anti-VLA-2 0,0 0,6 0,5 1,0 1,8 1,8 2,2 2,1 2,2 Anticorpo anti-VLA-4 0,0 0,0 0,4 1,0 1,9 2,9 4,2 4,7 6,8 Anticorpo anti-VLA-5 0,0 0,1 0,1 0,3 2,1 2,6 3,5 3,0 3,6 Anticorpo anti-CD40L 0,0 0,1 0,3 0,5 1,4 2,9 4,8 4,6 5,4 Controlo 0,0 0,0 1,2 1,4 2,6 2,8 2,9 4,3 6,2 *) Dias após a primeira sensibilização com colagénio. - 13- O presente invento é ilustrado pelos Exemplos seguintes.

Exemplo 1

Injecção:

Uma solução de um anticorpo monoclonal que reconhece especi-ficamente a região extracelular do VLA-2 humano numa solução salina tamponada com fosfato (1 mg/ml) é esterilizada por filtração e vertida em ampolas numa quantidade de 5 ml por cada ampola para dar injecções contendo o anticorpo monoclonal que reconhece especificamente a região extracelular do VLA-2 humano (5 mg/ampola).

Exemplo 2

Injecção:

Uma solução de um anticorpo monoclonal que reconhece especificamente a região extracelular da cadeia oc do VLA-2 humano numa solu-ção salina tamponada com fosfato (1 mg/ml) é esterilizada por filtração e vertida em ampolas numa quantidade de 5 ml por cada ampola para dar injecções contendo o anticorpo monoclonal que reconhece especificamente a região extracelular da cadeia α do VLA-2 humano (5 mg/ampola).

Lisboa, 31 de Outubro de 2000

ENGENHEIRO

Agente Oficial da Propriedade industriei Av Ant. Aug. de Aguiar, 80 - r/c Esq. 1Q50-018 USBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um anticorpo monoclonal, que reconhece especifícamente a região extracelular da cadeia α do VLA-2 humano, como ingrediente activo para a preparação de um fármaco para o tratamento da artrite reumatóide.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o anticorpo monoclonal ser seleccionado a partir de um anticorpo de origem em mamíferos, anticorpo quimérico e anticorpo humanizado. Lisboa, 31 de Outubro de 2000

ENGENHEIRO Agente Oficia! da Propriedade Industriai Av. Ant. Aug. de Aguiar, 80 - r/c Ejq. 1050-018 LISBOA