PL198975B1 - Zastosowanie kompozycji zawierającej homolog przeciwciała, który jest antagonistą interakcji między integryną niosącą podjednostkę alfa 4 a jej ligandem - Google Patents

Abstract

Ujawniono sposób leczenia, znamienny tym, ze obejmuje podawanie pacjentowi cierpi acemu na stan fibrotyczny skutecznej ilo sci kompozycji zawieraj acej homolog przeciwcia la, który antagonizuje interakcje zarówno VLA-4 i alfa4 beta z odpowiednimi ligandami alfa-4 lub homologu przeciwcia la, który antagonizuje interakcj e VLA-4 ze swoim ligandem lub homolog przeciwcia la, który antagonizuje interakcj e alfa4 beta7 ze swoim ligandem. Ujawniono tak ze sposób zmniejszenia indukowanego sta- nem fibrotycznym przyrostu liczby leukocytów w próbce p lynu z p lukania oskrzelikowo-p echerzyko- wego, obejmuj acy etap podania pacjentowi maj acemu stan fibrotyczny skutecznej ilo sci homologu, który antagonizuje interakcje mi edzy integryn a nios ac a podjednostk e alfa4 i ligandem dla integryny nios acej podjednostk e alfa4. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji zawierającej homolog przeciwciała, który jest antagonistą interakcji między integryną niosącą podjednostkę alfa 4 a jej ligandem.

Fibronektyna i kolagen są białkami, które są niezbędne dla utrzymania integralności zewnątrzkomórkowej macierzy znalezionej w tkankach łącznych. Produkcja tych białek jest procesem w wysokim stopniu regulowanym i jego zaburzenie może doprowadzić do powstania zwłóknienia tkanek. Podczas gdy tworzenie tkanki fibrotycznej jest częścią normalnego korzystnego procesu gojenia po uszkodzeniu, w niektórych przypadkach występuje nienormalne nagromadzenie materiałów fibrotycznych takie, że może ostatecznie doprowadzić do niewydolności narządu (Border i wsp. (1994) New Engl. J. Med. 331:1286-1292). Uszkodzenie dowolnego narządu prowadzi do stereotypowej fizjologicznej odpowiedzi: hemostazy indukowanej przez płytki, a następnie napływu komórek zapalnych i aktywowanych fibroblastów. Cytokiny pochodzące z tych typów komórek pobudzają tworzenie nowej zewnątrz-komórkowej macierzy i naczyń krwionośnych (ziarnina). Generacja ziarniny jest starannie zaaranżowanym programem, w którym ekspresja inhibitorów proteazy i białek macierzy zewnątrzkomórkowej ulega podwyższeniu, a ekspresja proteaz jest zmniejszona, co prowadzi do nagromadzenia macierzy zewnątrzkomórkowej.

Centralna dla rozwoju tych stanów fibrotycznych, zarówno zaindukowanych jak i spontanicznych, jest stymulacja aktywności fibroblastów. Napływ komórek zapalnych i aktywowanych fibroblastów do uszkodzonego narządu zależy od zdolności tych typów komórek do interakcji z macierzą śródmiąższową złożoną przede wszystkim z fibronektyny i kolagenu. W interakcjach komórkakomórka i komórka-macierz zewnątrzkomórkowa bierze udział kilka rodzin cząsteczek adhezji komórkowej, jedna z tych rodzin obejmuje integryny. Integryny są strukturalnie i funkcjonalnie spokrewnionymi glikoproteinami złożonymi z różnych heterodimerycznych transmembranowych domen receptora (alfa 1, alfa 2, obecnie aż do alfa 11) i beta (beta 1 i beta 7) spotykanych w różnych kombinacjach na praktycznie każdym typie komórek ssaka, (do przeglądu patrz: E. C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox i wsp. The Pharmacology of the Integrins Medicinal Research Rev. Tom 195 (1994) i V.W. Engleman i wsp. Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets w Ann. Revs. Medicinal Chemistry, tom 31, J.A. Bristol, wyd/; Acad. Press, NY, 1996, str. 191). Opisano dwie integryny zawierające podjednostki alfa 4 i oznaczono je jako alfa4betal (VLA-4) i alfa4beta7.

Śródmiąższowe zwłóknienie płuc (IPF) jest końcowym szlakiem wielu chorób śródmiąższowych płuc, który prowadzi do zmniejszenia podatności płuc i upośledzenia życiowej funkcji wymiany gazów. Niezależnie od etiologii IPF charakteryzuje się zapalnymi i fibroproliferacyjnymi zmianami w płucu i nadmiernym nagromadzeniem kolagenu w miąższu. Pacjenci z IPF na ogół wykazują obecność zgromadzonych odpornościowych i zapalnych komórek w czasie aktywnego zwłóknienia płuc, co wskazuje, że zwłóknienie płuc jest wynikiem wadliwej naprawy po pierwotnym uszkodzeniu zapalnym. Prawdopodobnie w wielu przypadkach zgromadzone komórki zapalne mogą brać udział w pierwotnym uszkodzeniu. Dodatkowo, komórki te mogą odgrywać złożoną rolę w regulacji procesu naprawy. W każ dym razie napł yw komórek odpornoś ciowych i zapalnych do pł uca moż e odgrywać waż n ą rolę w okreś leniu odpowiedzi fibrotycznej. Nap ł yw komórek zapalnych i aktywowanych fibroblastów do uszkodzonego płuca zależy od zdolności tych typów komórek do interakcji ze składnikami ECM. Ruchy i stan aktywacji leukocytów są modulowane przez różne integryny. Zapobieganie napływowi komórek zapalnych do płuc może być krytyczne dla następnej odpowiedzi fibrotycznej.

Wiele chorób związanych z proliferacją tkanki fibrotycznej jest zarówno przewlekłych jak i często wyniszczających i obejmują, na przykład, takie choroby skórne jak twardzina. Niektóre, w tym zwłóknienie płuc, mogą być śmiertelne, co wynika częściowo z faktu, że obecnie dostępne środki dla terapii tej choroby mają znaczące efekty uboczne i na ogół nie są skuteczne w spowalnianiu lub zatrzymywaniu postępu zwłóknienia (Nagler i wsp., 1996, Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 154:1082-86). Tak więc istnieje stała potrzeba nowych czynników przeciwfibrotycznych.

Zbadaliśmy możliwą rolę antagonistów integryn zawierających podjednostki alfa 1 i alfa 4 w patogenezie zwłóknienia przez podanie antagonisty integryny zawierającej podjednostkę alfa 1 lub alfa 4 myszom ze zwłóknieniem płuc. Korzystny wpływ, jaki ci antagoniści mają zarówno na całkowitą akumulację kolagenu jak i zakres uszkodzeń fibrotycznych płuc, jak pokazano w tym doniesieniu sugeruje, że integryny zawierające podjednostkę alfa 1 i/lub alfa 4 mogą być rozsądnym celem dla terapii antyfibrotycznej.

PL 198 975 B1

Wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji zawierającej homolog przeciwciała, który jest antagonistą interakcji między integryną niosącą podjednostkę alfa 4 a ligandem dla integryny niosącej podjednostkę alfa 4, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia zwłóknienia u pacjenta, zwłaszcza zwłóknienia narządu wewnętrznego.

Kompozycję farmaceutyczną wytworzoną zgodnie z zastosowaniem według wynalazku szczególnie korzystnie stosuje się do leczenia zwłóknienia wątroby, płuca, nerki, naczyń krwionośnych serca lub przewodu żołądkowo-jelitowego.

Taka kompozycja farmaceutyczna jest szczególnie przeznaczona do podawania pacjentowi cierpiącemu z powodu zwłóknienia płuc, zwłóknienia szpiku, marskości wątroby, rozplemowego mezangialnego zapalenia kłębuszków nerkowych, zapalenia kłębuszków nerkowych z tworzeniem półksiężyców, nefropatii cukrzycowej, zwłóknienia środmiąższowego nerek lub nefropatii towarzyszącej HIV.

Kompozycja farmaceutyczna przeznaczona jest też do leczenia zwłóknienia skóry, zwłaszcza przeznaczona jest do podawania pacjentowi cierpiącemu z powodu twardziny skóry, ograniczonej twardziny skóry, bliznowca, hipertroficznej blizny, rodzinnej skórnej kolagenomy, lub znamienia z tkanki łącznej typu kolagenowego.

Kompozycja farmaceutyczna przeznaczona jest też do leczenia zwłóknienia oka, zwłaszcza do podawania pacjentowi cierpiącemu z powodu retinopatii cukrzycowej, bliznowacenia pooperacyjnego, rozrostowej witreoretinopatii.

Korzystnie kompozycja wykorzystana w zastosowaniu według wynalazku zawiera homolog przeciwciała anty-alfa4.

W korzystnym zastosowaniu wedł ug wynalazku homolog przeciwciał a jest przeciwciał em humanizowanym, ludzkim lub chimerowym.

W korzystnym zastosowaniu według wynalazku kompozycja farmaceutyczna jest sformułowana do podawania:

(a) w dawce od 0,1 mg/kg na dzień do 10 mg/kg na dzień;

(b) przez okres dawkowania od jednego do czternastu dni; i (c) w ilości wystarczającej do utrzymania w osoczu poziomu homologu przeciwciała 1 mg/ml lub większego.

W korzystnym zastosowaniu wedł ug wynalazku homolog przeciwciała jest humanizowanym mysim przeciwciałem 21-6.

W korzystnym zastosowaniu wedł ug wynalazku pacjentem jest człowiek.

Antagonista jest czynnikiem wiążącym integrynę alfa 4 lub czynnikiem wiążącym ligand integryny alfa 4. Korzystne czynniki wiążące integrynę alfa 4 są wybrane z grupy złożonej z a) homologu przeciwciała, który antagonizuje interakcje zarówno VLA-4 i alfa4 beta 7 z odpowiednimi ligandami alfa 4; b) homologu przeciwciała, który antagonizuje interakcję VLA-4 z jej ligandem alfa 4 i c) homologu przeciwciała, który antagonizuje interakcję alfa4beta7 z jej ligandem alfa 4.

W niektórych wykonaniach wynalazku czynnik wiążący integrynę alfa 4 jest kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w kilku warunkach ostrości do zdefiniowanych sekwencji kwasu nukleinowego wybranych z grupy sekwencji w Tabeli 6 Patentu US 5,840,299 lub do sekwencji komplementarnych do tych sekwencji kwasu nukleinowego. W innych wykonaniach, czynnik wiążący integrynę alfa 4 jest kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego zawierającą kwas nukleinowy, który hybrydyzuje w określonych warunkach ostrości z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą sekwencję peptydu wybraną z grupy złożonej z pewnych określonych polipeptydów podanych w patencie US 5,932,214 lub produkowanych przez linię komórkową ATCC CRL 11175.

I. Definicje

Poniżej przedstawiono szczegóły opisu wynalazku, w którym stosowane są następujące definicje:

Nadrodzina integryn bardzo późnego antygenu (VLA) jest złożona z glikoprotein spokrewnionych pod względem strukturalnym i funkcjonalnym złożonych z heterodimerycznych (alfa i beta) transmembranowych cząsteczek receptora spotykanych w różnych kombinacjach na nieomal każdym typie komórek, (przeglądy patrz: E. C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox i wsp. The Pharmacology of the Integrins Medicinal Research Rev. (1994) i V.W. Engleman i wsp. Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets w Ann. Revs. Medicinal Chemistry, tom 31, J.A. Bristol, red,; Acad. Press, NY, 1996, str. 191). Integryny rodziny VLA obejmują (obecnie) VLA-1, -2, -3, -4, -5, -6, -9 i -11, w których każda z cząsteczek zawiera łańcuch β1 związany niekowalencyjnie z łańcuchem alfa (α1, α2, α3, α4, α5, α6 i tym podobne), odpowiednio.

PL 198 975 B1

Integryna alfa 4 beta 1 (α4β1) jest receptorem powierzchni komórki dla VCAM-1, fibronektyny i być może innych ligandów (te ostatnie ligandy określa się indywidualnie i zbiorczo jako ligand(y) alfa4). Określenie integryna α4β1 (VLA-4 lub a4b1 lub alfa4beta1 integryna, stosowane zamiennie) dotyczy polipeptydów, które są zdolne do wiązania VCAM-1 i członków zewnątrzkomórkowych białek macierzy, bardziej konkretnie fibronektyny, lub jej homologów lub fragmentów, choć osoby o zwykłych umiejętnościach w tej dziedzinie, wiedzą że mogą istnieć inne ligandy dla VLA-4 i że można je analizować z zastosowaniem konwencjonalnych sposobów. Tym niemniej wiadomo, że podjednostka alfa4 będzie asocjować z innymi podjednostkami beta oprócz beta1, tak, że możemy zdefiniować określenie alfa (α)4 integryna lub integryna zawierająca podjednostkę alfa (α)4 jako te integryny, których podjednostka alfa4 asocjuje z jedną z podjednostek beta. Innym przykładem integryny alfa4 oprócz VLA4 jest alfa4beta7 (patrz Lobb i Adams, powyżej). Podobnie integryna alfa1 lub integryna zawierająca podjednostkę alfa1 są to te integryny, których podjednostka alfa1 asocjuje z jedną z podjednostek beta.

Antagonista integryn obejmuje dowolny związek, który hamuje wiązanie integryn zawierających podjednostkę alfa1 i/lub alfa4 z ligandem i/lub receptorem integryn. Przeciwciało przeciw integrynom lub białka zawierające homologi przeciwciał (omówione poniżej) jak i inne cząsteczki, takie jak rozpuszczalne postacie białek ligandów dla integryn są użyteczne. Rozpuszczalne postacie białek ligandów dla integryn zawierających podjednostkę alfa4 obejmują rozpuszczalny VCAM-1, białka fuzyjne VCAM-1 lub bifunkcyjne białka fuzyjne VCAM-1/Ig. Na przykład rozpuszczalna forma ligandu integryny lub jego fragment może być podany w celu wiązania się z integryną i korzystnie współzawodniczenia o miejsce wiązania integryny na komórkach, w ten sposób prowadząc do efektów podobnych do podawania antagonistów, takich jak przeciwciała przeciw integrynie (np. VLA-1, VLA-4). W szczególności antagonistą są mutanty rozpuszczalnych integryn, które wiążą ligand ale nie powodują zależnej od integryn sygnalizacji. Takie mutanty integryn mogą działać jako inhibitory kompetytywne białka integryny typu dzikiego i są uważane za antagonistów. Inni antagoniści stosowani w zastosowaniach według wynalazku są małymi cząsteczkami jak zdefiniowano poniż ej.

Jak to omówiono, pewni antagoniści integryn mogą być połączeni przez fuzję lub w inny sposób skoniugowani z, na przykład, homologiem przeciwciała, takim jak immunoglobulina lub jej fragment i nie są ograniczeni do konkretnego typu lub struktury integryny lub ligandu lub innej cz ą steczki. Tak więc dla celów wynalazku dowolny czynnik zdolny do tworzenia białka chimerowego (jak zdefiniowano poniżej) i zdolny do wiązania ligandów integryny, który skutecznie blokuje lub powleka integrynę zawierającą podjednostkę alfa 4, jest uważany za ekwiwalent antagonistów stosowanych w podanych tu przykładach.

Homolog przeciwciała obejmuje nienaruszone przeciwciała złożone z lekkich i ciężkich łańcuchów immunoglobuliny połączonych mostkami disiarczkowymi. Określenie homolog przeciwciała obejmuje białko zawierające jeden lub więcej polipeptydów wybranych z lekkich łańcuchów immunoglobuliny, ciężkich łańcuchów immunoglobuliny i ich fragmentów wiążących antygen, które są zdolne do wiązania jednego lub więcej antygenów (tj. integryny lub liganda integryny). Składowe polipeptydy homologu przeciwciała złożonego z więcej niż jednego polipeptydu mogą być ewentualnie połączone mostkiem disiarczkowym lub innym kowalencyjnym wiązaniem. Tak więc homologi przeciwciał obejmują nienaruszone immunoglobuliny typu IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (jak i ich podtypy), w których lekkie łańcuchy immunoglobuliny mogą być typu lambda lub kappa. Homologi przeciwciał także obejmują części nienaruszonych przeciwciał, które zachowują specyficzność wiązania antygenu, na przykład, fragmenty Fab, fragmenty Fab', fragmenty F(ab')2, fragmenty F(v), monomery lub dimery lub mieszaniny łańcuchów ciężkich i lekkich.

Humanizowany homolog przeciwciała jest homologiem przeciwciała wytworzonym za pomocą technologii rekombinowanego DNA, w którym pewne lub wszystkie aminokwasy lekkiego lub ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny, które nie są wymagane do wiązania antygenu, zostały podstawione odpowiadającymi aminokwasami z łańcucha ciężkiego lub lekkiego immunoglobuliny z organizmu innego niż człowieka. Homolog ludzkiego przeciwciała jest homologiem przeciwciała, w którym wszystkie aminokwasy łańcucha lekkiego lub ciężkiego immunoglobuliny (niezależnie od tego czy są, czy nie są wymagane do wiązania antygenu) pochodzą z ludzkiego źródła.

Homolog ludzkiego przeciwciała w znaczeniu tu stosowanym jest homologiem przeciwciała wytworzonym za pomocą technologii zrekombinowanego DNA, w którym wszystkie aminokwasy lekkiego lub ciężkiego łańcucha immunoglobuliny pochodzą z ludzkiego źródła.

Agonista integryny obejmuje dowolne związki, które aktywują ligand integryny.

Aminokwas jest monomeryczną jednostką peptydu, polipeptydu lub białka. Istnieje dwadzieścia aminokwasów, w naturalnie występujących peptydach, polipeptydach lub białkach, z których

PL 198 975 B1 wszystkie są izomerami L. Określenie to obejmuje także analogi aminokwasów i izomery D białkowych aminokwasów i ich analogów.

Kowalencyjnie połączone - oznacza, że określone reszty (np. PEGylowany antagonista integryny alfa4 i/lub alfa1, fragment immunoglobuliny/antagonista integryny alfa 4 lub alfa 1) są albo bezpośrednio kowalencyjne połączone ze sobą albo też są pośrednio kowalencyjnie połączone ze sobą przez pośrednią resztę lub reszty, takie jak reszta lub reszty odstępnika (ang. spacer). Pośrednia reszta lub reszty są nazywane grupą sprzęgającą. Określenie koniugowany jest stosowane wymiennie z kowalencyjnie połączony. W tym znaczeniu odstępnik dotyczy reszty, która może być wstawiona pomiędzy aminokwasem lub innym składnikiem antagonisty integryny lub fragmentem i resztą cząsteczki. „Odstępnik może oddzielać aminokwas lub inny składnik od reszty cząsteczki, tak by zapobiec modyfikacji wynikającej z zakłócenia działania białka i/lub ułatwić połączenie się aminokwasu lub innego składnika z inną resztą.

Sekwencja kontroli ekspresji- sekwencja polinukleotydów, która kontroluje i reguluje ekspresję genów, gdy jest funkcjonalnie połączona z tymi genami.

Wektor ekspresyjny - polinukleotyd, taki jak plazmid DNA lub fag (wśród innych częstych przykładów), który umożliwia ekspresję przynajmniej jednego genu, gdy wektor ekspresyjny jest wprowadzony do komórki gospodarza. Wektor może być zdolny lub niezdolny do replikacji w komórce.

Skuteczna ilość czynnika według wynalazku jest to taka ilość, która daje wynik lub ma wpływ na dany stan podlegający terapii.

Funkcjonalny ekwiwalent reszty aminokwasu jest to (i) aminokwas mający podobne właściwości oddziaływania jak reszta aminokwasu, która była zastąpiona przez funkcjonalny ekwiwalent; (ii) aminokwas antagonisty, który ma podobne właściwości jak reszta aminokwasu, która była zastąpiona przez funkcjonalny ekwiwalent; (iii) cząsteczka, która nie jest aminokwasem mająca podobne właściwości jak reszta aminokwasu, która była zastąpiona przez funkcjonalny ekwiwalent.

Pierwszy polinukleotyd kodujący antagonistę białkopodobnego jest funkcjonalnie ekwiwalentny w porównaniu z drugim polinukleotydem kodującym białko antagonisty, jeś li spełnia przynajmniej jeden z następujących warunków:

(a) funkcjonalny ekwiwalent jest pierwszym polinukleotydem, który hybrydyzuje z drugim polinukleotydem w standardowych warunkach hybrydyzacji i/lub zdegenerowaną formą pierwszej sekwencji polinukleotydowej. Najbardziej korzystnie koduje on zmutowane białko mające aktywność białka antagonisty integryny;

(b) funkcjonalny ekwiwalent jest pierwszym polinukleotydem, który koduje ekspresję sekwencji aminokwasów kodowanej przez drugi polinukleotyd.

Antagoniści integryny, których stosuje się zgodnie z wynalazkiem obejmują, ale nie wyłącznie, czynniki tu wymienione jak i ich funkcjonalne ekwiwalenty. Stosowane tu określenie funkcjonalny ekwiwalent dotyczy więc antagonisty integryny lub polinukleotydu kodującego antagonistę integryny, który ma takie same lub lepsze korzystne działania na biorcę jak antagonista integryny, za którego funkcjonalny ekwiwalent jest uważany. Jak rozumie to specjalista w dziedzinie, funkcjonalnie ekwiwalentne białko może być wytworzone technikami rekombinacji, np. przez ekspresję funkcjonalnie ekwiwalentnego DNA. Białka integryn kodowane są przez naturalnie występujące DNA, jak i przez DNA nie występujące naturalnie, które kodują takie samo białko jak naturalnie występujący DNA. Ze względu na degenerację nukleotydowych sekwencji kodujących mogą być stosowane inne polinukleotydy do kodowania białka integryny. Obejmują one wszystkie lub części powyższych sekwencji, które są zmienione przez podstawienie różnych kodonów, które kodują tę samą resztę aminokwasu w obrębie sekwencji, dając zatem niemą zmianę . Takie zmienione sekwencje są uważ ane za ekwiwalenty tych sekwencji. Na przykład Phe (F) jest kodowana przez dwa kodony, TTC lub TTT, Tyr (Y) jest kodowana przez TAC lub TAT, a His (H) jest kodowana przez CAC lub CAT. Z drugiej strony, Trp (W) jest kodowany przez pojedynczy kodon, TGG. Tak więc zrozumiałe jest, że dla danej sekwencji DNA kodującej daną integrynę będzie wiele zdegenerowanych sekwencji DNA ją kodujących. Uważa się te zdegenerowane sekwencje DNA wchodzą w zakres wynalazku.

Określenie chimerowy, gdy odnosi się do antagonisty, oznacza, że antagonista jest złożony z połączenia (chemiczne wiązanie poprzeczne lub kowalencyjne lub innego typu) dwóch lub więcej białek mających różne struktury i/lub mających różne źródła pochodzenia. Tak więc chimerowy antagonista integryny alfa 4 może zawierać jedną resztę, która jest antagonistą integryny alfa 4 lub fragment i inną resztę, która nie jest antagonistą integryny alfa 4. Chimerowy antagonista integryny alfa 1

PL 198 975 B1 może zawierać jedna resztę, która jest antagonistą integryny alfa 1 lub fragmentem i inną resztą, która nie jest antagonistą integryny alfa 1.

Rodzajem „chimerowego białka jest fuzja lub białko fuzyjne, które dotyczy kolinearnego, kowalencyjnego wiązania dwóch lub więcej białek lub ich fragmentów przez ich indywidualne szkielety peptydowe, najbardziej korzystnie przez genetyczną ekspresję polinukleotydowej cząsteczki kodującej te białka. Tak więc, korzystne białka fuzyjne są białkami chimerowymi, które zawierają antagonistę integryny alfa 4 (lub alfa 1) lub fragment kowalencyjnie połączony z drugą resztą, która nie jest antagonistą alfa 4 (lub alfa 1) integryny. Korzystnie białka fuzyjne mogą obejmować części nienaruszonych przeciwciał, które zachowują specyficzność wiązania antygenu, na przykład, fragmenty Fab, fragmenty Fab', fragmenty F(ab')2, fragmenty F(v), monomery lub dimery łańcucha ciężkiego, monomery lub dimery łańcucha lekkiego, dimery złożone z jednego łańcucha ciężkiego i jednego łańcucha lekkiego i tym podobne.

Najbardziej korzystne białka fuzyjne są chimerowe i zawierają resztę antagonisty integryny w formie fuzji lub inaczej połączoną z częścią lub całością regionów zawiasowego i stałego na lekkim łańcuchu immunoglobuliny, ciężkim łańcuchu lub obu. Tak więc cząsteczka, której zastosowanie jest przedmiotem wynalazku może zawierać: (1) resztę antagonisty integryny, (2) drugi peptyd, np. taki, który zwiększa rozpuszczalność lub czas życia in vivo reszty antagonisty integryny, np. członka nadrodziny immunoglobulin lub jego fragment lub część, np. część lub fragment IgG, np. region stały łańcucha ciężkiego IgG, np. CH2, CH3 i regiony zawiasowe. Konkretnie fuzja antagonista integryny/Ig jest białkiem zawierającym cząsteczkę biologicznie czynnego antagonisty integryny (np. rozpuszczalny ligand VLA-4, lub jego biologicznie czynny fragment) połączony z N-końcem łańcucha immunoglobuliny, gdzie część N-końca immunoglobuliny jest zastąpiona antagonistą integryny. Rodzajem fuzji antagonista integryny/Ig jest fuzja integryna/Fc, która jest białkiem zawierającym antagonistę integryny połączonego z przynajmniej częścią stałej domeny immunoglobuliny. Korzystna fuzja Fc obejmuje antagonistę integryny połączonego z fragmentem przeciwciała zawierającym C-końcową domenę ciężkich łańcuchów immunoglobuliny.

Określenie białko fuzyjne także oznacza antagonistę integryny chemicznie połączonego poprzez mono- lub heterofunkcjonalną cząsteczkę z drugą resztą, która nie jest antagonistą integryny (dając chimerową cząsteczkę) i jest uzyskana de novo z oczyszczonego białka, jak opisano poniżej. Tak więc jeden przykład chemicznie połączonej, w przeciwieństwie do połączonej rekombinacyjnie, cząsteczki chimerowej, która jest białkiem fuzyjnym, może obejmować (1) resztę kierującą podjednostkę integryny alfa 4, np. resztę VCAM-1 zdolną do wiązania VLA-4 na powierzchni komórek niosących VLA-4; (2) drugą cząsteczkę, która zwiększa rozpuszczalność lub czas życia in vivo reszty kierującej, np. polimer glikolu polialkilenu, taki jak glikol polietylenowy (PEG). Reszta kierująca alfa4 może być dowolnym naturalnie występującym ligandem alfa4 lub jego fragmentem np. peptydem VCAM-1 lub podobną konserwatywnie podstawioną sekwencją aminokwasów.

Stosowany tu heterologiczny promotor jest promotorem, który nie jest naturalnie związany z genem lub oczyszczonym kwasem nukleinowym.

Stosowany tu termin homologia jest synonimem określenia identyczność i dotyczy podobieństwa sekwencji miedzy dwoma polipeptydami, cząsteczkami lub między dwoma kwasami nukleinowymi. Gdy pozycja w obu tych porównywanych sekwencjach jest zajmowana przez tę samą zasadę lub podjednostkę monomeru aminokwasu (na przykład, gdy pozycja w każdej z dwóch cząsteczek DNA jest zajęta przez adeninę lub pozycja w każdym z dwóch polipeptydów jest zajęta przez lizynę), wówczas odpowiednie cząsteczki są homologiczne w tej pozycji. Procent homologii między dwoma sekwencjami jest funkcją liczby pasujących lub homologicznych pozycji wspólnych dla dwóch sekwencji podzieloną przez liczbę porównywanych pozycji x 100. Na przykład, jeśli 6 z 10 pozycji w dwóch sekwencjach jest dopasowanych lub jest homologicznych, wówczas dwie sekwencje są homologiczne w 60%. Przykł adowo sekwencje DNA CTGACT i CAGGTT mają 50% homologii (dopasowane są 3 z 6 pozycji). Na ogół porównanie przeprowadza się, gdy dwie sekwencje są dopasowywane w celu uzyskania maksymalnej homologii. Takie dopasowanie można uzyskać stosując, na przykład, metodę Karlina i Altschula opisaną bardziej szczegółowo poniżej.

Homologiczne sekwencje mają wspólne identyczne lub podobne reszty aminokwasów, gdzie podobne reszty są konserwatywnymi podstawieniami lub dozwolonymi mutacjami punktowymi odpowiadających reszt aminokwasów w dopasowanej sekwencji referencyjnej. Za tym konserwatywne podstawienie reszty w sekwencji referencyjnej stanowią te podstawienia, które są fizycznie lub funkcjonalnie podobne do odpowiadających reszt referencyjnych tzn. mają podobną wielkość, kształt, ładunek elektryczny, właściwości chemiczne, w tym zdolność do tworzenia wiązań kowalencyjnych lub

PL 198 975 B1 wodorowych, lub tym podobne. Szczególnie korzystnymi konserwatywnymi podstawieniami są te, które spełniają kryteria zdefiniowane dla dozwolonych mutacji punktowych w Dayhoff i wsp. 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Suppl. 3, rozdział 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978).

Homologia i identyczność są tu terminami wymiennymi i każdy dotyczy podobieństwa sekwencji między dwiema sekwencjami polipeptydowymi. Homologia i identyczność mogą być określone przez porównanie pozycji w każdej sekwencji, która może być dopasowana w celu porównania. Gdy pozycja w dopasowywanej sekwencji jest zajęta przez tę samą resztę aminokwasu wówczas polipeptydy można określić jako identyczne w tej pozycji; gdy ekwiwalentne miejsce jest zajęte przez ten sam aminokwas (np. identyczny) lub podobny aminokwas (np. podobny pod względem charakteru sterycznego i/lub elektronowego) wówczas cząsteczki można określić jako homologiczne w tej pozycji. Procent homologii lub identyczności między sekwencjami jest funkcją liczby pasujących lub homologicznych pozycji wspólnych dla obu sekwencji. Sekwencja niespokrewniona lub niehomologiczna ma mniej niż 40 procent identyczności, choć korzystnie mniej niż 25 procent identyczności, z sekwencją ujawnioną w niniejszym wynalazku.

Procent homologii dwóch sekwencji aminokwasowych określa się stosując algorytm dopasowania Karlina i Altschula (Proc. Natl. Acad. Sci. US 87:2264(1990) zmodyfikowany według Karlina i Altschula (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873(1993). Taki algorytm jest włączony do programów NBLAST lub XBLAST Altschul i wsp., J. Mol. Biol. 215:403(1990). Przeszukiwania BLAST wykonuje się programem NBLAST, wynik = 100, długość słowa = 12, aby uzyskać sekwencje nukleotydów homologiczne do kwasu nukleinowego ujawnionego w wynalazku. Poszukiwania białek BLAST są wykonywane za pomocą programu XBLAST, wynik = 50, długość słowa = 3, aby uzyskać sekwencje aminokwasów homologiczne do peptydu referencyjnego. Aby uzyskać dopasowania z przerwą, do porównań stosowany jest BLAST z przerwą, jak opisał Altschul i wsp., Nucleic Acids Res., 25: 3389 (1997). Gdy stosuje się BLAST i Gapped BLAST, stosuje się parametry domyślne odpowiednich programów (XBLAST i NBLAST). Patrz http://www/ncbi.nlm.nih.gov.

Wyizolowany (stosowany wymiennie z zasadniczo czysty) gdy jest stosowany w odniesieniu do kwasu nukleinowego tzn. sekwencji polinukleotydów, które kodują antagonistów integryny, oznacza polinukleotyd RNA lub DNA, część genomowego polinukleotydu, cDNA lub syntetyczny polinukleotyd, który ze względu na swoje pochodzenie lub manipulację: (i) nie jest związany z całością polinukleotydu, z którym jest związany w naturze (np. jest obecny w komórce gospodarza jako wektor ekspresyjny lub jego część); lub (ii) jest związany z kwasem nukleinowym lub inną resztą chemiczną inną niż ta, z którą jest związany w naturze; lub (iii) nie występuje w naturze. Przez izolowany dalej rozumie się sekwencję polinukleotydu, która jest: (i) zamplifikowana in vitro za pomocą na przykład reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR); (ii) zsyntetyzowana chemicznie; (iii) wytworzona technikami rekombinacji przez klonowanie; lub (iv) oczyszczona, jak przez cięcie i rozdział w żelu. Tak więc zasadniczo czysty kwas nukleinowy jest kwasem nukleinowym, który nie jest w bezpośredniej ciągłości z jedną lub obiema sekwencjami kodującymi, z którymi jest normalnie ciągły w naturalnie występującym genomie organizmu, z którego kwas nukleinowy pochodzi. Zasadniczo czysty DNA także obejmuje zrekombinowany DNA, który jest częścią hybrydowego genu kodującego dodatkowe sekwencje integryn.

Izolowany (stosowany wymiennie z zasadniczo czysty) w odniesieniu do polipeptydów oznacza polipeptyd lub jego część, które ze względu na swoje pochodzenie lub manipulację: (i) są obecne w komórce gospodarza jako produkt ekspresji lub części wektora ekspresyjnego; lub (ii) są połączone z białkiem lub innym ugrupowaniem chemicznym innym niż to, z którym są w naturze połączone; lub (iii) nie występują w naturze, na przykład białko, które jest poddane chemicznej manipulacji przez przyłączenie lub dodanie przynajmniej jednej reszty hydrofobowej do białka tak, że białko jest w postaci niespotykanej w naturze. Przez izolowane dalej określa się białko, które jest: (i) zsyntetyzowane chemicznie; lub (ii) wyrażane w komórce gospodarza i oczyszczane od zasocjowanych i zanieczyszczających je białek. Określenie ogólnie oznacza polipeptyd, który był oddzielony od innych białek i kwasów nukleinowych, z którymi wystę puje naturalnie. Korzystnie polipeptyd jest takż e oddzielany od substancji, takich jak przeciwciała lub matryce żelowe (poliakryloamidy), które są stosowane do jego oczyszczania.

Multiwalentny kompleks białkowy dotyczy wielu antagonistów integryny (np. jednego lub więcej). Homolog przeciwciała anty-integryny lub fragment może być połączony poprzecznie lub związany z innym homologiem przeciwcia ł a lub fragmentem. Każ de biał ko moż e być takie samo lub różne i każ dy homolog lub fragment przeciwciała mo ż e być taki sam lub róż ny.

PL 198 975 B1

Mutant - oznacza każdą zmianę w materiale genetycznym organizmu, w szczególności dowolną zmianę (tzn. delecję, substytucję, addycję lub zmianę) w sekwencji polinukleotydu typu dzikiego lub dowolną zmianę w białku typu dzikiego. Określenie muteina jest stosowane wymiennie z określeniem mutant.

Funkcjonalnie połączony - sekwencja polinukleotydowa (DNA, RNA) jest funkcjonalnie połączona z sekwencją kontrolującą ekspresję, gdy sekwencja kontrolująca ekspresję kontroluje i reguluje transkrypcję i translację tej sekwencji polinukleotydowej. Określenie funkcjonalnie połączony obejmuje (obecność) odpowiedniego sygnału start (np. ATG) z przodu sekwencji polinukleotydów, która ma ulec ekspresji, i utrzymanie prawidłowej ramki odczytu, co pozwoli na ekspresję sekwencji polinukleotydowej pod kontrolą sekwencji kontroli ekspresji i produkcję żądanego polipeptydu kodowanego przez sekwencję polinukleotydów.

Czynnik farmakologiczny jest definiowany jako jeden lub więcej związków lub cząsteczek lub innych jednostek chemicznych podawanych pacjentowi (oprócz antagonistów, których zastosowanie jest przedmiotem wynalazku), które wpływają na działanie antagonisty. Stosowane tu określenie czynnik farmakologiczny dotyczy takiego czynnika (czynników), które są podawane w czasie terapii skojarzonej gdy antagonista jest podawany albo przed, po lub równocześnie z podawaniem jednego lub więcej czynników farmakologicznych.

Białko - dowolny polimer składający się zasadniczo z dowolnych z 20 aminokwasów. Choć polipeptyd jest często stosowany w odniesieniu do stosunkowo dużych polipeptydów, a peptyd jest często stosowany w odniesieniu do małych polipeptydów, stosowanie tych określeń w technice zachodzi na siebie i jest zmienne. Stosowane tu określenie białko dotyczy peptydów, białek i polipeptydów o ile nie jest podane inaczej.

Określenia peptyd(y), białko (białka) i polipeptyd(y) są tu stosowane wymiennie. Określenia sekwencja nukleotydów i sekwencja polinukleotydów są tu też stosowane zamiennie.

Stosowane tu określenie zrekombinowany oznacza, że białko pochodzi ze zrekombinowanych układów ekspresyjnych ssaków. Ponieważ integryna nie jest glikozylowana ani nie zawiera mostków disiarczkowych, może być wyrażana w większości systemów ekspresyjnych prokariotycznych i eukariotycznych.

Mała cząsteczka ma definicję jak w sekcji A2.

Określenie powierzchniowy aminokwas oznacza dowolny aminokwas, który jest eksponowany na rozpuszczalnik, gdy białko jest złożone w postaci natywnej.

Warunki hybrydyzacji na ogół oznaczają warunki soli i temperatury zasadniczo równoważne z 0,5xSSC do około 5 x SSC w 65°C zarówno dla hybrydyzacji jak i pł ukania. Stosowane tu okreś lenie standardowe warunki hybrydyzacji jest więc definicją określającą warunki robocze i obejmuje zakres warunków hybrydyzacji. Tym niemniej warunki wysokiej ostrości obejmują hybrydyzację z buforem do badania łysinek (0,2% poliwinylopirolidon, 0,2% Ficoll 400; 0,2% bydlęca albumina surowicza, 50 mM Tris HCl (pH 7,5); 1 M NaCl; 0,1% pirofosforan sodu; 1% SDS); 10% siarczanu dekstranu i 100 μ g/ml zdenaturowanego, sonikowanego DNA ze spermy ł ososia w 65°C przez 12-20 godzin i pł ukanie 75 mM NaCl/7,5 mM cytrynian sodu (0,5xSSC)/1% SDS w 65°C. Warunki niskiej ostroś ci obejmują hybrydyzację z buforem do badania łysinek, 10% siarczanu dekstranu i 110 μg/ml zdenaturowanego, sonikowanego DNA ze spermy łososia w 55°C przez 12-20 godzin i płukanie 300 mM NaCl/30 mM cytrynian sodu (2,0xSSC)/1% SDS w 55°C. Patrz też Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, części 6.3.1-6.3.6 (1989).

Stosowany tu termin kompozycja terapeutyczna dotyczy kompozycji zawierającej antagonistów, których zastosowanie jest przedmiotem wynalazku i inne biologicznie kompatybilne składniki. Terapeutyczna kompozycja może zawierać zaróbki takie jak woda, substancje mineralne i nośniki, takie jak białko.

Określenie pacjent ze stanem fibrotycznym dotyczy, ale nie wyłącznie, osób cierpiących na zwłóknienie narządu wewnętrznego, osób cierpiących na chorobę zwłóknienia skóry i osób cierpiących na fibrotyczne stany oka. Zwłóknienie narządów wewnętrznych (np. wątroby, płuc, nerki, naczyń krwionośnych serca, przewodu pokarmowego) występuje w chorobach takich jak zwłóknienie płuc, mielofibroza, marskość wątroby, mezangialne proliferacyjne zapalenie kłębuszków nerkowych, półksiężycowe zapalenie kłębuszków nerkowych, nefropatia cukrzycowa, zwłóknienie śródmiąższu nerek, zwłóknienie nerek u pacjentów otrzymujących cyklosporynę i nefropatia związana z HIV. Choroby zwłóknienia skóry obejmują, ale nie wyłącznie twardzinę skóry, ograniczoną twardzinę skóry, bliznowce, blizny hipertroficzne, rodzinną kolagenomę skóry i znamiona tkanki łącznej typu kolagenowego. Fibrotyczne stany oka obejmują stany, takie jak retynopatia cukrzycowa, blizny pooperacyjne (na przykład po chirurgii filtrującej jaskry i po chirurgii zeza zbieżnego) i proliferacyjną witreoretynopatię.

PL 198 975 B1

Dodatkowe stany fibrotyczne, które mogą być leczone z zastosowaniem niniejszego wynalazku obejmują: reumatoidalne zapalenie stawów, choroby związane z długotrwałym bólem stawów i degenerację stawów; twardzinę uogólnioną, zapalenie wielomięśniowe, zapalenie skórno-mięśniowe, eozynofiłowe zapalenie powięzi, ograniczoną twardzinę skóry, zespół Raynauda i polipowatość nosa. Dodatkowo, stany fibrotyczne, które mogą być leczone z wykorzystaniem zastosowań według niniejszego wynalazku obejmują również hamowanie nadmiernego bliznowacenia u pacjentów, o których wiadomo, że tworzą bliznowce lub hipertroficzne blizny, hamowanie lub zapobieganie wytwarzaniu się blizn lub nadmiernemu wytwarzaniu blizn w czasie gojenia różnego typu ran w tym cięć chirurgicznych, brzusznych ran chirurgicznych i uszkodzeń urazowych, zapobieganie lub hamowanie tworzenia się blizn i ponownego zamykania tętnic po angioplastyce wieńcowej, zapobieganie lub hamowanie tworzenia się nadmiernej tkanki bliznowatej lub włóknistej towarzyszącej zwłóknieniu serca po zawale i w nadwrażliwej waskulopatii.

Skuteczna ilość jest ilością dostateczną, by uzyskać korzystne lub żądane wyniki. Skuteczną ilość można podawać w jednym lub więcej podaniu. Biorąc pod uwagę leczenie skuteczna ilość antagonisty stosowania w niniejszym wynalazku jest ilością wystarczającą do uśmierzenia, poprawy, stabilizowania, odwrócenia, spowolnienia lub opóźnienia postępu stanu fibrotycznego zgodnie z akceptowanymi standardami dla chorób, które mają być leczone. Wykrywanie i pomiar wskaźników skuteczności można mierzyć za pomocą szeregu dostępnych narzędzi diagnostycznych, w tym, na przykład, za pomocą badań fizycznych, w tym badań krwi, testów funkcji płuc i zdjęć rentgenowskich klatki piersiowej; tomografii komputerowej; bronchoskopii; płukania oskrzelowo-pęcherzykowego; biopsji płuc i tomografii komputerowej.

W praktyce niniejszego wynalazku będą stosowane, o ile nie jest wskazane inaczej, konwencjonalne techniki biologii komórkowej, hodowli komórek, biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinowanego DNA, chemii białek, farmakologii i immunologii, które są w zakresie umiejętności specjalisty w tej dziedzinie. Takie techniki są opisane w literaturze.

II. Opis korzystnych wykonań

A. Antagoniści integryny

Dla celów wynalazku antagonista integryny może być antagonistą dowolnej interakcji między integryną i jej pokrewnym ligandem lub receptorem tak, że zmieniona jest normalna funkcja indukowana przez interakcje ligand-receptor (tzn. zapobiega się jej lub zwalnia lub w inny sposób modyfikuje). W jednym korzystnym wykonaniu antagonistą integryny jest antagonista interakcji integryn alfa4 z ich ligandami, takiej jak interakcja VCAM-1/VLA-4. Jest to czynnik, np. polipeptyd lub inna cząsteczka, który może hamować lub blokować wiązanie z udziałem VCAM-1 i/lub VLA-4, lub który może w inny sposób modulować funkcję VCAM-1 i/lub VLA-4 np. przez hamowanie lub blokowanie transdukcji sygnału VLA-4 z udziałem ligandu VLA-4 lub transdukcji sygnału VCAM-1 z udziałem ligandu VCAM-1, i który jest skuteczny w leczeniu ostrych urazów mózgu, korzystnie w ten sam sposób jak przeciwciała anty-VLA-4.

Antagonista interakcji VCAM-1/VLA-4 jest czynnikiem, który ma jedną lub więcej z następujących właściwości: (1) powleka, lub wiąże się z VLA-4 na powierzchni komórki niosącej VLA-4 (np. komórki śródbłonka) z wystarczającą specyficznością do hamowania interakcji ligand VLA-4/VLA4, np. interakcji VCAM-1/VLA-4; (2) powleka, lub wiąże się z VLA-4 na powierzchni komórki niosącej VLA-4 (np. limfocytu) z wystarczającą specyficznością do zmodyfikowania, i korzystnie do hamowania, transdukcji sygnału z udziałem VLA-4 np. sygnału przekazywanego z udziałem VLA-4/VCAM-1; (3) powleka, lub wiąże się z ligandem VLA-4 (np. VCAM-1) na komórkach śródbłonka z wystarczającą specyficznością do hamowania interakcji VLA-4/VCAM-1; (4) powleka, lub wiąże się z ligandem VLA-4 (np. VCAM-1) z wystarczającą specyficznością do zmodyfikowania, i korzystnie do hamowania, transdukcji sygnału VLA-4 z udziałem ligandu VLA-4, np. sygnalizacji VLA-4 z udziałem VCAM-1. W korzystnych wykonaniach antagonista ma jedną lub obie właściwości 1 i 2. W innych korzystnych wykonaniach antagonista ma jedną lub obie właściwości 3 i 4. Ponadto, może być stosowany więcej niż jeden antagonista np. czynnik, który wiąże się z VLA-4 może być w kombinacji z czynnikiem, który wiąże się z VCAM-1.

Antagoniści stosowani w zastosowaniach według wynalazku nie są ograniczeni do konkretnego typu lub struktury cząsteczki tak, że dla celu wynalazku i tylko jako przykład dowolny czynnik zdolny do wiązania z integrynami alfa4 (np. VLA-4 na powierzchni komórek lub z ligandem alfa4, takim jak VCAM-1 na powierzchni komórek niosących ligand alfa4) i który skutecznie blokuje lub powleka integrynę alfa4 (np. VLA-4) lub ligand alfa4 (np. VCAM-1), zwany czynnikiem wiążącym integrynę alfa4

PL 198 975 B1 i czynnikiem wiążącym ligand integryny alfa4 uważ a się za równoważ nik antagonistów stosowanych w podanych tu przykł adach.

Na przykład, przydatne są przeciwciała lub homologi przeciwciał (omówione poniżej) jak i rozpuszczalne formy naturalnych białek wiążących VLA-4 i VCAM-1. Rozpuszczalne formy naturalnych białek wiążących dla VLA-4 obejmują rozpuszczalne peptydy VCAM-1, białka fuzyjne VCAM-1, bifunkcjonalne białka fuzyjne VCAM-1/Ig (np. cząsteczki chimerowe, omówione powyżej), fibronektynę, fibronektynę mającą alternatywnie złożony odcinek łączący, który nie jest typu III i peptydy fibronektynowe zawierające sekwencję aminokwasów EILDV lub podobną konserwatywnie podstawioną sekwencję aminokwasów. Rozpuszczalne formy naturalnych białek wiążących dla VCAM-1 obejmują rozpuszczalne peptydy VLA-4, białka fuzyjne VLA-4, bifunkcjonalne białka fuzyjne VLA-4/Ig i tym podobne. Jak jest tu stosowane rozpuszczalny peptyd VLA-4 lub rozpuszczalny peptyd VCAM-1 jest polipeptydem VLA-4 lub VCAM-1 niezdolnym do zakotwiczenia się w błonie. Takie rozpuszczalne polipeptydy obejmują na przykład polipeptydy VLA-4 i VCAM, którym brakuje wystarczającej do zakotwiczenia części ich domeny łączącej błonę, lub które są zmodyfikowane tak, że ich domena łącząca błonę jest niefunkcjonalna. Te czynniki wiążące mogą działać przez współzawodnictwo z białkiem na powierzchni komórki wiążącym VLA-4 albo inaczej zmieniając funkcję VLA-4. Na przykład, rozpuszczalna forma VCAM-1 (patrz np. Osborn i wsp. 1989, Cell, 59: 1203-1211) lub jego fragment mogą być podane do wiązania się z VLA-4, i korzystnie będą współzawodniczyć o miejsce wiązania VLA-4 na komórkach niosących VCAM-1 w ten sposób prowadząc do efektów podobnych do podawania antagonistów, takich jak drobne cząsteczki lub przeciwciała anty-VLA-4.

Homologi przeciwciał przeciw integrynie

W innych korzystnych wykonaniach antagoniś ci do wią zania się z, w tym blokowania lub powlekania z integryną alfa1 i/lub alfa4 na powierzchni komórki (taką jak VLA-1, VLA-4 lub alfa4beta7) i/lub ligandem powierzchni komórki dla integryn alfa1 i/lub alfa4 (takim jak kolagen i/lub anty-VCAM-1) są monoklonalnym przeciwciałem lub homologiem przeciwciała anty-VLA-1 lub anty-VLA-4 i/lub antykolagen i/lub anty-VCAM-1 jak opisano poprzednio. Korzystne przeciwciała i homologi do leczenia, w szczególności do leczenia ludzi, obejmują homologi ludzkich przeciwciał, humanizowane homologi przeciwciał, chimerowe homologi przeciwciał, fragmenty przeciwciał Fab, Fab', F(ab')2 i F(v) i monomery lub dimery ciężkich lub lekkich łańcuchów przeciwciał lub ich mieszaniny. Monoklonalne przeciwciała przeciwko VLA-4 są korzystnym czynnikiem wiążącym w zastosowaniu według wynalazku.

Sposoby wytwarzania homologów przeciwciał przeciw integrynie

Technologia wytwarzania przeciwciał monoklonalnych, obejmujących na przykład monoklonalne przeciwciała przeciw integrynie jest dobrze znane. Patrz na przykład, Mendrick i wsp. 1995, Lab.

Invest. 72:367-375 (mAb wobec mysiego anty-αΐβΐ i anty-a2ei); Sonnenberg i wsp. 1987 J. Biol. Chem. 262:10376-10383 (mAb wobec mysiego anty-a6e1); Yao i wsp. 1996, J. Cell Sci 1996 109:3139-50 (mAb wobec mysiego anty-a6e1); Hemler i wsp. 1984, J Immunol 132:3011-8 (mAb wobec ludzkiego α1 β1); Pischel i wsp. 1987 J. Immunol 138:226-33 (mAb wobec ludzkiego α2β1) ; Wayner i wsp. 1988, J. Cell Biol. 107:1881-85 (mAb wobec ludzkiego α3β1); Wayner i wsp. 1988 J Cell Biol 107:1881-91 (mAb wobec ludzkiego α5β1); Sonnenberg i wsp. 1987, J. Biol. Chem. 262:1037610383 (mAb wobec ludzkiego α6β1); A Wang i wsp. 1996 Am. J. Respir.Cell Mol. Biol. 15:664-672 (mAb wobec ludzkiego α9β1; Davies i wsp. 1989 J Cell Biol 109:1817-26 (mAb wobec ludzkiego aVe1); Sanchez-Madrid i wsp. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7489-93 (mAb wobec ludzkiego aLe2); Diamond i wsp. 1993, J Cell Biol 120:1031-43 (mAb wobec ludzkiego aMe2); Stacker i wsp. 1991 J Immunol 146:648-55 (mAb wobec ludzkiego aXe2); Van der Vieren i wsp 1995 Immunity 3:683-90 (mAb wobec ludzkiego aDe2); Bennett i wsp. 1983 Proc.Natl Acad Sci USA 80:2417-21 (mAb wobec ludzkiego allbe3); Hessle i wsp. 1984, Differentiation 26:49-54 (mAb wobec ludzkiego α6β4); Weinacker i wsp. 1994 J Biol Chem 269:6940-8 (mAb wobec ludzkiego aVe5); Weinacker i wsp. 1994 J Biol Chem 269:6940-8 (mAb wobec ludzkiego aVe6); Cerf-Bensussan i wsp. 1992 Eur J Immunol 22:273-7 (mAb wobec ludzkiego αΕβ7); Nishimura i wsp. 1994 J Biol Chem 269:28708-15 (mAb wobec ludzkiego aVe8); Bossy i wsp. 1991 EMBO J 10:2375-85 (poliklonalne surowice wobec ludzkiego α8β1); Camper i wsp. 1998 J. Biol. Chem. 273:20383-20389 (poliklonalne surowice wobec ludzkiego α10β1).

Korzystnie rozważani tu antagoniści integryny mogą być wyrażani z nienaruszonych lub obciętych genomowych lub cDNA lub z syntetycznych DNA w prokariotycznych lub eukariotycznych komórkach gospodarza. Białka dimeryczne mogą być izolowane z podłoża hodowlanego i/lub zwijane ponownie i dimeryzowane in vitro aby tworzyć biologicznie czynne kompozycje. Heterodimery mogą być

PL 198 975 B1 wytworzone in vitro przez połączenie oddzielnych odrębnych łańcuchów polipeptydowych. Alternatywnie heterodimery mogą być wyprodukowane w pojedynczej komórce przez koekspresję kwasów nukleinowych wyrażających oddzielne odrębne łańcuchy polipeptydowe. Patrz na przykład WO 93/09229 lub Pat US Nr 5,411,941 dla kilku przykładowych protokołów produkcji rekombinowanych białek heterodimerycznych. Obecnie korzystne komórki obejmują, ale nie wyłącznie, prokariota obejmujące E. coli lub eukariota obejmujące drożdże Saccharomyces lub komórki owadów lub komórki ssaków, takie jak CHO, COS lub BSC. Specjalistom w tej dziedzinie wiadomo, że mogą być korzystnie stosowane inne komórki gospodarza.

Na przykład, przeciwciała anty-VLA-4 mogą być zidentyfikowane przez immunoprecypitację znakowanych 125I lizatów komórek wyrażających VLA-4 (patrz Sanchez-Madrid i wsp. 1986, Eur. J. Immunol. 16:1343-1349 i Hemler i wsp. 1987, J. Biol. Chem., 262, 11478-11485). Przeciwciała anty-VLA-4 mogą być też identyfikowane cytometrią przepływową np. przez pomiar fluorescencyjnego barwienia komórek Ramos inkubowanych z przeciwciałem, który jak się sądzi rozpoznaje VLA-4 (patrz Elices i wsp. 1990 Cell 60: 577-584). Limfocyty stosowane w produkcji komórek hybrydoma typowo izoluje się od immunizowanych ssaków, których surowice były już dodatnie w teście na obecność przeciwciał anty-VLA4 przy użyciu takich badań przesiewowych.

Typowo nieśmiertelna linia komórkowa (np. linia komórek szpiczaka) pochodzi z tego samego gatunku ssaka jak limfocyty. Korzystne nieśmiertelne linie są to linie komórek szpiczaka myszy, które są wrażliwe na podłoże hodowlane zawierające hypoksantynę, arninopterynę i tymidynę (podłoże HAT). Typowo, komórki szpiczaka wrażliwe na HAT poddaje się fuzji ze splenocytami myszy stosując glikol polietylenowy o ciężarze cząsteczkowym 1500 (PEG 1500). Komórki hybrydoma będące wynikiem fuzji następnie selekcjonuje się stosując podłoże HAT, które zabija komórki, nie uległy fuzji i które uległy fuzji nieproduktywnej (splenocyty, które nie uległy fuzji, umierają po kilku dniach ponieważ nie są transformowane). Hybrydoma produkujące żądane przeciwciało wykrywa się przez badanie przesiewowe supernatantów hodowli hybrydoma. Na przykład, hybrydoma przygotowane do produkcji przeciwciała przeciwko VLA-4 można testować przez badanie przesiewowe supernatantu komórek hybrydoma na wydzielane przeciwciała mające zdolność wiązania się z linią komórkową wyrażającą zrekombinowaną podjednostkę alfa4 (patrz Elices i wsp., powyżej).

W celu wyprodukowania homologów przeciwciał przeciw VLA-4, które są nienaruszonymi immunoglobulinami, hodowano komórki hybrydoma, które okazały się dodatnie w badaniach przesiewowych, w podłożu odżywczym w warunkach i w czasie wystarczającym, aby komórki hybrydoma mogły wydzielić przeciwciała monoklonalne do podłoża hodowlanego. Techniki hodowli tkankowej i podłoża hodowlane odpowiednie dla komórek hybrydoma są dobrze znane. Kondycjonowany supernatant hodowli hybrydoma można zebrać i ewentualnie dalej oczyścić przeciwciała przeciwko VLA-4 za pomocą dobrze znanych sposobów.

Alternatywnie, żądane przeciwciało może być wyprodukowane przez wstrzyknięcie komórek hybrydoma do jamy otrzewnowej nieimmunizowanej myszy. Komórki hybrydoma proliferują w jamie otrzewnowej wydzielając przeciwciało, które kumuluje się jako płyn puchlinowy. Przeciwciało może być zebrane przez usunięcie płynu puchlinowego z jamy otrzewnowej za pomocą strzykawki.

Uprzednio opisano kilka mysich przeciwciał monoklonalnych przeciw VLA-4. Patrz np. SanchezMadrid i wsp., 1996, powyżej, Hemler i wsp., 1987, powyżej, Pulido i wsp., 1991, J. Biol. Chem. 266 (16), 10241-10245); Issekutz i Wykretowicz, 1991, J. Immunol. 147: 109 (TA-2 mAb). Te monoklonalne przeciwciała przeciw VLA-4 i inne przeciwciała przeciw VLA-4 (np. Patent US 5,888,507 - Biogen, Inc. i tam cytowane odnośniki) zdolne do rozpoznawania łańcucha alfa i/lub beta VLA-4 będą przydatne w zastosowaniu według niniejszego wynalazku. Przeciwciała anty-VLA-4, które będą rozpoznawać epitopy łańcucha alfa4 VLA-4, które biorą udział w wiązaniu VCAM-1 i ligandów fibronektyny (tzn. przeciwciała, które mogą wiązać się z VLA-4 w miejscu biorącym udział w rozpoznawaniu ligandu i blokują wią zanie VCAM-1 i fibronektyny) są korzystne. Takie przeciwciał a okreś lono jako przeciwciała specyficzne dla epitopu B (B1 lub B2) (Pulido i wsp., 1991, powyżej) i są to także przeciwciała anty VLA-4, których zastosowania dotyczy niniejszy wynalazek.

Homologi w pełni ludzkiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko VLA-4 są innym korzystnym czynnikiem wiążącym, który może blokować i lub pokrywać ligandy VLA-4, w zastosowaniu według wynalazku. W swojej nienaruszonej postaci mogą być wytworzone przy użyciu napiętnowanych in vitro ludzkich splenocytów, jak opisali Boerner i wsp., 1991, J. Immunol. 147, 86-95. Alternatywnie mogą one być wytworzone przez klonowanie repertuarowe, jak opisali Persson i wsp., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2432-2436 lub przez Huang i Stollar, 1991, J. Immunol. Methods, 141: 22712

PL 198 975 B1

236, patent US 5,798,230 (25 sierpnia, 1998 Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use), którzy opisują przygotowanie ludzkich przeciwciał monoklonalnych z ludzkich limfocytów B. Według tego procesu, ludzkie limfocyty B produkujące przeciwciała są unieśmiertelniane przez zakażenie wirusem Epsteina-Barra lub jego pochodną, która wyraża antygen jądrowy 2 wirusa Epsteina-Barra (EBNA2). Funkcja EBNA2, która jest wymagana do unieśmiertelnienia, jest następnie wyłączana, co powoduje wzrost produkcji przeciwciał.

W jeszcze innym sposobie produkcji w peł ni ludzkich przeciwciał , w patencie Stanów Zjednoczonych 5,789,650 (4 sierpnia, 1998 Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies) opisano transgeniczne zwierzęta nie będące człowiekiem zdolne do produkcji przeciwciał heterologicznych i transgeniczne zwierzęta nie będące człowiekiem mające inaktywowane endogenne geny immunoglobulin. Endogenne geny immunoglobulin są stłumione przez polinukleotydy antysensowne i/lub przez surowicę skierowaną przeciwko endogennym immunoglobulinom. Heterologiczne przeciwciała są kodowane przez geny immunoglobulin niespotykane normalnie w genomie tego zwierzęcia, które nie jest człowiekiem. Jeden lub więcej transgenów zawierających sekwencje nierearanżowanych łańcuchów ciężkich heterologicznych ludzkich immunoglobulin wprowadza się do zwierzęcia, które nie jest człowiekiem, tym samym tworząc zwierzę transgeniczne zdolne do funkcjonalnej rearanżacji transgenicznych sekwencji immunoglobulin i produkucji repertuaru przeciwciał różnych izotypów kodowanych przez ludzkie geny immunoglobulin. Takie heterologiczne ludzkie przeciwciała są produkowane w limfocytach B, które następnie są unieśmiertelniane, np. przez fuzję z nieśmiertelną linią komórkową, taką jak szpiczak lub przez manipulację takimi limfocytami B za pomocą innych technik, aby ustalić linię komórkową zdolną do produkcji monoklonalnego, heterologicznego w pełni ludzkiego homologu przeciwciała.

Duże nieimmunizowane bibilioteki ludzkie ekspozycji na fagu mogą być też stosowane do izolacji przeciwciał o wysokim powinowactwie, które mogą być opracowane jako terapeutyki dla ludzi, stosując standardową technologię fagów (Vaughan i wsp. 1996).

Jeszcze innym korzystnym czynnikiem wiążącym, który może blokować lub powlekać ligandy integryny, w zastosowaniu według wynalazku jest zrekombinowany homolog przeciwciała humanizowanego mający specyficzność przeciw integrynie. Według wczesnych metod preparatyki prawdziwych chimerowych przeciwciał (gdzie całe regiony stałe i całe regiony zmienne pochodzą z różnych źródeł) opisano nowe podejście w EP 0239400 (Winter i wsp.), w którym przeciwciała są zmienione przez zastępowanie (w obrębie danego regionu zmiennego) ich regionów określających komplementarność (CDR) z jednego gatunku odpowiednikami z innego. Ten proces może być stosowany, na przykład, do podstawienia CDR z ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego Ig domen regionów zmiennych z alternatywnymi CDR z mysich domen regionów zmiennych. Te zmienione regiony zmienne Ig mogą następnie być łączone z ludzkimi regionami stałymi Ig w celu wytworzenia przeciwciał, które są całkowicie ludzkie w składzie poza podstawionymi mysimi CDR. Przewiduje się, że takie przeciwciała z podstawionym CDR będą prawdopodobnie wywoływać mniejszą odpowiedź odpornościową u ludzi w porównaniu z prawdziwymi chimerowymi przeciwciałami, ponieważ przeciwciała z podstawionym CDR zawierają znacznie mniej składników, które nie są ludzkie. Ten proces humanizacji przeciwciał monoklonalnych przez przeszczepienie CDR określa się jako przekształcenie (ang,. reshaping) (Reichmann i wsp., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen i wsp., 1988, Science 239, 1534-1536).

Typowo, regiony określające komplementarność (CDR) mysiego przeciwciała przeszczepia się na odpowiednie regiony przeciwciała ludzkiego, ponieważ to CDR-y (trzy w ciężkim łańcuchu przeciwciała, trzy w łańcuchu lekkim) są regionami mysiego przeciwciała, które wiążą się ze specyficznym antygenem. Transplantację CDR uzyskuje się metodami inżynierii genetycznej, gdzie sekwencje DNA CDR określa się przez klonowanie odcinków genów regionów zmiennych (V) mysiego łańcucha ciężkiego i lekkiego, a następnie przenosi się do odpowiednich ludzkich regionów V za pomocą ukierunkowanej mutagenezy. W końcowym stadium procesu, dodaje się odcinki genów ludzkich regionów stałych żądanego izotypu (na ogół gamma I dla CH i kappa dla CL), a humanizowane ciężkie i lekkie łańcuchy wyraża się wspólnie w komórkach ssaków aby wytworzyć rozpuszczalne humanizowane przeciwciało.

Przeniesienie tych CDR na ludzkie przeciwciało nadaje temu przeciwciału właściwości wiązania antygenu oryginalnego przeciwciała mysiego. Sześć CDR w przeciwciele mysim jest strukturalnie zamontowanych na regionie „V regionu zrębowego. Przeszczepianie CDR jest udane, z takiego powodu, że regiony zrębowe przeciwciał myszy i człowieka mogą mieć bardzo podobne struktury 3-D z podobnymi punktami przyczepu dla CDR, tak ż e CDR moż na wymieniać . Takie humanizowane hoPL 198 975 B1 mologi przeciwciał mogą być przygotowane jak podano przykładowo w publikacjach Jones i wsp., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann, 1988, Nature 332, 323-327; Queen i wsp., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029; i Orlandi i wsp., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833.

Tym niemniej uważa się, że pewne aminokwasy w regionach zrębowych oddziałują z CDR i wpł ywają na ogólne powinowactwo wią zania antygenu. Bezpoś rednie przeniesienie CDR z mysiego przeciwciała w celu wyprodukowania zrekombinowanego humanizowanego przeciwciała bez jakichkolwiek modyfikacji ludzkich regionów zrębowych V często daje częściową lub całkowitą utratę powinowactwa wiązania. W pewnej ilości przypadków w celu uzyskania aktywności wiążącej krytyczne wydaje się być zmienienie reszt w regionach zrębowych przeciwciała akceptorowego.

Queen i wsp., 1989 (powyżej) i WO 90/07861 (Protein Design Labs) opisali przygotowanie humanizowanego przeciwciała, które zawiera zmodyfikowane reszty w regionach zrębowych przeciwciała akceptorowego przez połączenie CDR z mysiego mAb (anty-Tac) z regionami zrębowymi i regionami stałymi ludzkiej immunoglobuliny. Zademonstrowano jedno rozwiązanie dla problemu utraty powinowactwa wiązania, które jest częstym wynikiem przeniesienia CDR bez modyfikacji reszt ludzkiego regionu zrębowego V; to rozwiązanie obejmuje dwa kluczowe etapy. Po pierwsze, ludzkie regiony zrębowe V wybiera się na podstawie analizy komputerowej dla optymalnej homologii sekwencji białek do regionu zrębowego V oryginalnego przeciwciała mysiego, w tym przypadku Mab anty-Tac. W drugim etapie, modeluje się strukturę trzeciorzędową mysiego regionu V za pomocą komputera w celu uwidocznienia reszt aminokwasów zrębu, które prawdopodobnie oddziałują z mysimi CDR, a następnie nakłada się te reszty mysich aminokwasów na homologiczny ludzki zrąb. Patrz też patent US 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; i 5,530,101 (Protein Design Labs).

Można stosować inne podejście (Tempest i wsp., 1991, Biotechnology 9, 266-271) i stosować jako wzorzec, regiony zrębowe V pochodzące, z odpowiednio, NEWM i REI łańcuchów ciężkich i lekkich odpowiednio dla przeszczepiania CDR bez radykalnego wprowadzania mysich reszt. Zaletą stosowania podejścia Tempest i wsp. do konstrukcji humanizowanych przeciwciał opartych na NEWM i REI jest to, ż e 3-wymiarowe struktury regionów zmiennych NEWM i REI są znane z krystalografii rentgenowskiej, a zatem można modelować specyficzne interakcje między CDR i resztami regionu V.

Niezależnie od przyjętego podejścia przykłady początkowych homologów humanizowanych przeciwciał przygotowane dotychczas pokazują, że nie jest to prosty proces. Jednak nawet przyznając, że takie zmiany zrębowe mogą być konieczne, nie jest możliwe przewidzenie, na podstawie dostępnego stanu techniki, które, jeśli jakiekolwiek, reszty zrębowe będą musiały być zmienione, aby uzyskać funkcjonalne humanizowane zrekombinowane przeciwciała o żądanej specyficzności. Dotychczasowe wyniki wskazują, że zmiany konieczne do zachowania specyficzności i/lub powinowactwa są na ogół unikalne dla danego przeciwciała i nie mogą być przewidziane w oparciu o humanizację innego przeciwciała.

Pewni antagoniści integryny zawierającej podjednostkę alfa4 użyteczni w niniejszym wynalazku obejmują homologi chimerowych i humanizowanych rekombinowanych przeciwciał (tzn. nienaruszone immunoglobuliny i ich części) ze specyficznością epitopu B, które przygotowano jak opisano w Patencie USA 5,932,214 (mA b HP1/2). Materiałem wyjściowym do przygotowania homologów przeciwciał chimerowych (zmienny mysi - stały ludzki) i humanizowanych przeciw integrynie może być mysie monoklonalne przeciwciało przeciw integrynie jak opisano uprzednio, handlowo dostępne przeciwciało przeciw integrynie (np. HP2/1, Amae International, Inc. Westbrook, Maine) lub monoklonalne przeciwciało przeciw integrynie przygotowane zgodnie z tu podanymi wskazówkami. Inne korzystne homologi humanizowanego przeciwciała anty-VLA4 są opisane przez Athena Neurosciences, Inc. W PCT/US95/01219 (27 lipca 1995) i patencie US 5,840,299.

Te humanizowane przeciwciała przeciw VLA-4 zawierają humanizowany łańcuch lekki i humanizowany łańcuch ciężki. Humanizowany łańcuch lekki zawiera trzy regiony określające komplementarność (CDR1, CDR2 i CDR3) mające sekwencje aminokwasowe z odpowiednich regionów określających komplementarność mysiego łańcucha lekkiego immunoglobuliny 21-6 i region zrębowy regionu zmiennego z sekwencji zrębowej regionu zmiennego ludzkiego łańcucha lekkiego kappa, z tą różnicą, że w przynajmniej jednej pozycji aminokwas jest zastąpiony przez ten sam aminokwas obecny w równoważ nej pozycji regionu zrę bowego zmiennej części ł a ń cucha lekkiego mysiej immunoglobuliny 21.6. Humanizowany łańcuch ciężki zawiera trzy regiony określające komplementarność (CDR1, CDR2 i CDR3) mające sekwencje aminokwasów z odpowiednich regionów określających komplementarność łańcucha ciężkiego mysiej immunoglobuliny 21-6, i zrębowy region zmienny z sekwencji zrębowej regionu zmiennego ludzkiego łańcucha ciężkiego z wyjątkiem tego, że w przynajmniej jednej

PL 198 975 B1 pozycji, pozycja aminokwasu jest zajęta przez ten sam aminokwas obecny w równoważnej pozycji zrębu regionu zmiennego mysiego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny 21-6.

W zastosowaniach według niniejszego wynalazku można stosować antagonistów kodowanych przez sekwencje kwasu nukleinowego, które hybrydyzują w warunkach ostrych do sekwencji kwasu nukleinowego kodujących przeciwciała skierowane przeciw integrynom zawierającym podjednostkę alfa4. Na przykład, antagonista może być białkiem, którego kwas nukleinowy hybrydyzuje w warunkach ostrych z jedną lub więcej sekwencjami kwasu nukleinowego podanych w Tabeli 6 patentu US 5,840,299 lub z sekwencją komplementarną do jednej lub więcej takich sekwencji. Antagonista może też być białkiem, którego kwas nukleinowy hybrydyzuje w warunkach ostrych z kwasem nukleinowym kodującym Sek. Id. Nr:2 lub Sek. Id. Nr 4 w patencie US 5,932,214. Dalej, antagonista może też być białkiem, którego kwas nukleinowy hybrydyzuje w warunkach ostrych z kwasem nukleinowym kodującym domenę zmienną przeciwciała produkowanego przez linię komórkową ATCC CRL 11175.

Alternatywnie, antagonista może być białkiem, którego kwas nukleinowy hybrydyzuje w warunkach łagodnych z jedną lub więcej sekwencjami kwasu nukleinowego podanymi w Tabeli 6 patentu US 5,840,299 lub z sekwencjami komplementarnymi do jednej lub więcej takich sekwencji. Antagonista może też być białkiem, którego kwas nukleinowy hybrydyzuje w warunkach łagodnych z kwasem nukleinowym kodującym Sek. Id. Nr: 2 lub Sek. Id. Nr 4 w patencie US 5,932,214. Dalej, antagoniści mogą być białkiem, którego kwas nukleinowy hybrydyzuje w warunkach łagodnych z kwasem nukleinowym kodującym domenę zmienną przeciwciała produkowanego przez linię komórkową ATCC CRL 11175.

Wytwarzanie fragmentów i analogów

Fragmenty wyizolowanych antagonistów integryny alfa4 (np. fragmenty opisanych tu homologów przeciwciał) mogą być także wytwarzane skutecznie za pomocą technik rekombinacji, przez trawienie proteolityczne, lub za pomocą syntezy chemicznej sposobami znanymi specjalistom. W metodach rekombinacji, wewnętrzne lub końcowe fragmenty polipeptydu mogą być wytwarzane przez usunięcie jednego lub więcej nukleotydów z jednego końca (dla fragmentu końcowego) lub z obu końców (dla fragmentu wewnętrznego) sekwencji DNA, która koduje izolowany polipeptyd hedgehog. W wyniku ekspresji mutagenizowanego DNA wytwarzane są fragmenty peptydowe. Trawienie endonukleazami gryzącymi końce może też wytwarzać DNA, które kodują zestawy fragmentów. DNA, które kodują fragmenty białka mogą też być generowane przez losową fragmentację, trawienie restryktazami, lub kombinację obu technik. Fragmenty białka można generować bezpośrednio z nienaruszonych białek. Peptydy mogą być cięte specyficznie przez enzymy proteolityczne, w tym, ale nie wyłącznie, plazminę, trombinę, trypsynę, chymotrypsynę lub pepsynę. Każdy z tych enzymów jest specyficzny dla typu wiązania peptydowego, który atakuje. Trypsyna katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych, w których grupa karbonylowa jest z aminokwasu zasadowego, na ogół argininy lub lizyny. Pepsyna i chymotrypsyna katalizują hydrolizę wiązań peptydowych z aminokwasów aromatycznych, takich jak tryptofan, tyrozyna i fenyloalanina. Alternatywne zestawy ciętych fragmentów białka są generowane przez zapobieganie cięciu w miejscu, które jest podatne na enzym proteolityczny. Na przykład reakcja grupy ε-aminowej lizyny z trifluorotiooctanem etylu w łagodnie zasadowym roztworze blokowała reszty aminokwasów, których przyległe wiązania peptydowe nie są już podatne na hydrolizę przez trypsynę. Białka mogą być modyfikowane, aby tworzyć wiązania peptydowe, które są podatne na enzymy proteolityczne. Na przykład, alkilacja reszt cysteinowych β-halogenoetyloaminami daje wiązania peptydowe, które są hydrolizowane przez trypsynę (Lindley, (1956) Nature 178, 647). Dodatkowo, mogą być stosowane odczynniki chemiczne, które tną łańcuchy peptydowe przy specyficznych resztach. Na przykład, bromocyjanogen tnie peptydy przy resztach metioniny (Gross i Witkip, (1961) J. Amer. Chem. Soc. 83, 1510). Tak więc przez działanie na białka różnymi kombinacjami modyfikatorów, enzymów proteolitycznych i/lub reagentów chemicznych, białka mogą być podzielone na fragmenty o żądanej długości bez zachodzenia fragmentów na siebie lub podzielone na zachodzące na siebie fragmenty o żądanej długości.

Fragmenty mogą być też syntetyzowane chemicznie technikami znanymi w dziedzinie takimi jak synteza na fazie stałej Merrifielda F moc lub t-Boc. Merrifield, Recent Progress in Hormone Research

23:451 (1967).

Przykłady sposobów ze stanu techniki, które pozwalają na wytwarzanie i testowanie fragmentów i analogów są omówione poniżej. Te lub analogiczne sposoby mogą być stosowane do przygotowania i można przetestować fragmenty lub analogi izolowanego antagonisty alfa4 integryny, dla którego można wykazać aktywność biologiczną. Przykładowy sposób testowania czy fragmenty lub analogi antagonisty alfa4 integryny, mają aktywność biologiczną jest podany w Części IV i Przykładach.

PL 198 975 B1

Wytwarzanie zmienionych sekwencji DNA i sekwencji peptydów: metody losowe

Warianty sekwencji aminokwasowej białka mogą być przygotowane za pomocą losowej mutagenezy DNA, który koduje białko lub jego poszczególną część. Użyteczne sposoby obejmują mutagenezę PCR i mutagenezę saturacyjną. Biblioteka losowych wariantów sekwencji aminokwasów może też być wygenerowana przez syntezę zestawu zdegenerowanych sekwencji oligonukleotydów. Sposoby generowania wariantów sekwencji aminokwasów danego białka z użyciem zmienionego DNA i peptydy są dobrze znane w dziedzinie. Następujące przykłady takich sposobów nie mają na celu ograniczania zakresu niniejszego wynalazku, ale po prostu służą tylko jako ilustracja reprezentatywnych technik. Dla specjalisty jest oczywiste, że przydatne są też inne sposoby.

Mutageneza PCR: Patrz na przykład Leung i wsp., (1989) Technique 1, 11-15.

Mutageneza saturacyjna: Jeden sposób jest opisany ogólnie w Mayers i wsp. (1989) Science 229, 242.

Mutageneza z wykorzystaniem zdegenerowanych oligonukleotydów: patrz na przykład Harang, S.A. (1983) Tetrahedron 39, 3; Itakura i wsp. (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 323 i Itakura i wsp., Recombinant DNA, Proc. 3^rd Cleveland Symposium on Macromolecules, str. 273-289 (A.G. Watson, red.), Elsevier, Amsterdam, 1981.

E. Wytwarzanie zmienionych sekwencji DNA i peptydów: metody ukierunkowane

Mutageneza nielosowa, inaczej ukierunkowana, daje specyficzne sekwencje lub mutacje w specyficznych częściach sekwencji polinukleotydu, który koduje wyizolowany polipeptyd, co dostarcza wariantów które obejmują delecje, insercje, lub substytucje reszt znanej sekwencji aminokwasów wyizolowanego polipeptydu. Miejsca mutacji mogą być modyfikowane indywidualnie lub seryjnie, na przykład przez: (1) podstawienie najpierw konserwatywnymi aminokwasami, a następnie bardziej radykalne podstawienia zależnie od uzyskanych wyników; (2) delecję reszty docelowej; lub (3) wstawienie reszt tej samej lub innej klasy przylegających do zlokalizowanego miejsca, lub kombinacje możliwości 1-3.

Jest jasne, że takie metody ukierunkowane są jednym sposobem, za pomocą którego można wprowadzić N-końcową cysteinę (lub funkcjonalny ekwiwalent) do danej sekwencji polipeptydu, aby dostarczyć miejsca do przyłączenia reszty hydrofobowej.

Mutageneza skanująca alaniny: Patrz Cunningham i Wells, (1989) Science 244, 1081-1085).

Mutageneza z udziałem oligonukleotydów: Patrz na przykład Adelman i wsp., (1983) DNA 2, 183.

Mutageneza kasetowa: Patrz Wells i wsp., (1985) Gene 34, 315.

Mutageneza kombinatoryjna: Patrz na przykład Ladner i wsp., WO 88/06630.

Strategie ekspozycji na fagach: Patrz na przykład przegląd Marks i wsp., J. Biol. Chemistry: 267 16007-16010 (1992) .

Inne warianty antagonistów integryny

Warianty mogą różnić się od opisanych tu antagonistów integryny pod względem sekwencji aminokwasów lub różnice mogą być inne, nieobejmujące sekwencji aminokwasów, lub mogą się różnić w dwojaki sposób. Najbardziej korzystne polipeptydy mają korzystnie modyfikacje niezwiązane z sekwencją, które obejmują derywatyzację chemiczną in vivo lub in vitro (np. N-końca) jak i możliwe zmiany w acetylacji, metylacji, fosforylacji, amidacji, karboksylacji lub glikozylacji.

Inne analogi obejmują białko lub jego aktywne biologicznie fragmenty, których sekwencje różnią się od podanych w patentach US 5,840,299 lub US 5,888,507; US 5,932,214) lub PCT US/94/00266 pod względem jednego lub więcej konserwatywnych podstawień aminokwasów lub jednego lub więcej niekonserwatywnych podstawień aminokwasów, lub pod względem delecji lub insercji, które nie znoszą aktywności wyizolowanego białka. Konserwatywne substytucje typowo obejmują zastąpienie jednego aminokwasu innym z podobnymi cechami, takie jak substytucje w obrębie następujących grup: walina, alanina i glicyna; leucyna i izoleucyna; kwas asparaginowy i kwas glutaminowy; asparagina i glutamina; seryna i treonina; lizyna i arginina; oraz fenyloalanina i tyrozyna. Niepolarne hydrofobowe aminokwasy obejmują alaninę, leucynę, izoleucynę, walinę, prolinę, fenyloalaninę, tryptofan i metioninę. Polarne obojętne aminokwasy obejmują glicynę, serynę, treoninę, cysteinę, tyrozynę, asparaginę i glutaminę. Dodatnio naładowane (zasadowe) aminokwasy obejmują argininę, lizynę i histydynę. Ujemnie naładowane (kwaśne) aminokwasy obejmują kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. Inne konserwatywne substytucje są dobrze znane specjalistom. Na przykład, konserwatywne podstawienie za aminokwas alaninę może być przeprowadzone z którymkolwiek z następujących aminokwasów z D-alaniną, glicyną, beta-alaniną, L-cysteiną i D-cysteiną. Dla lizyny zastąpieniem może być którakolwiek spośród reszt D-lizyny, argininy, D-argininy, homoargininy, metioniny, D-metioniny, orinityny lub D-ornityny.

PL 198 975 B1

Inne analogi zawierają modyfikacje, które zwiększają stabilność peptydów. Takie analogi mogą zawierać, na przykład, jedno lub więcej wiązań niepeptydowych (które zastępują wiązania peptydowe) w sekwencji peptydu. Także włączone są analogi, które obejmują reszty inne niż naturalnie występujące L-aminokwasy, takie jak D-aminokwasy lub niewystępujące naturalnie syntetyczne aminokwasy, takie jak beta lub gamma aminokwasy i analogi cykliczne. Włączanie D- zamiast L- aminokwasów do wyizolowanego polipeptydu hedgehog może zwiększyć jego oporność na proteazy. Patrz patent US 5,219,990 powyżej.

Korzystne homologi przeciwciał obejmują sekwencję aminokwasów homologiczną przynajmniej w 60%, 80%, 90%, 95%, 98% lub 99% z sekwencją aminokwasów przeciwciała PS/2 (patrz Przykład) lub zawierają sekwencję aminokwasów homologiczną przynajmniej w 60%, 80%, 90%, 95%, 98% lub 99% z sekwencją aminokwasów opisaną w patencie US 5,840,299 (Sek. Id. Nr: 15 - region zmienny łańcucha lekkiego lub Sek. Id. Nr: 17 - region zmienny łańcucha ciężkiego) lub w patencie US 5,932,214 (Sek. Id. Nr: 2 i 4); i opublikowanym zgłoszeniu patentowym WO94/16094 (sekwencje obecne w przeciwciele przeciw VLA4 zdeponowanej linii komórkowej ATCC CRL 11175).

G. Postacie koniugatów z polimerami

Do koniugacji z antagonistą alfa4 integryny może być stosowana pojedyncza cząsteczka polimeru, choć bierze się także pod uwagę możliwość przyłączenia więcej niż jednej cząsteczki. Kompozycje skoniugowanego antagonisty integryny alfa4 mogą znaleźć zastosowanie in vivo jak i in vitro. Ponadto uważa się, że koniugujący polimer może wykorzystywać dowolne inne grupy, reszty lub inne skoniugowane formy, dla końcowego zastosowania. Jako przykład, w pewnych zastosowaniach może być użyteczne kowalencyjne przyłączenie do polimeru reszty funkcjonalnej nadającej polimerowi odporność na degradację przez UV, lub na utlenianie, lub inne właściwości lub cechy. Jako dalszy przykład, korzystna może być w pewnych zastosowaniach funkcjonalizacja polimeru aby nadać mu reaktywność i pozwolić mu na połączenie poprzeczne z cząsteczką leku, i zwiększyć w ten sposób różne właściwości lub cechy całego skoniugowanego materiału. Tak więc polimer może zawierać dowolne funkcjonalne powtarzające się grupy, wiązania lub inne struktury, które nie wykluczają skuteczności kompozycji skoniugowanego antagonisty integryny alfa4, dla jej zamierzonego celu. Inne cele i korzyści niniejszego wynalazku staną się bardziej wyraźne z dalszego ujawnienia i załączonych zastrzeżeń.

Ilustrujące polimery, które mogą być użytecznie stosowane do uzyskania tych pożądanych cech, są opisane poniżej w przykładowych schematach reakcji. W kowalencyjnie połączonych koniugatach antagonista/polimer polimer może być funkcjonalizowany, a następnie sprzężony z wolnym (i) aminokwasem (aminokwasami) antagonisty tworząc labilne wiązania.

Antagoniści integryn zawierających podjednostkę alfa4 są najbardziej korzystnie skoniugowani przez końcową reaktywną grupę w polimerze, choć koniugacje mogą być też rozgałęzione od reaktywnych grup niepołożonych na końcach. Polimer z reaktywną grupą (grupami) jest tu określany jako aktywowany polimer. Reaktywna grupa selektywnie reaguje z wolną grupą aminową lub innymi grupami w cząsteczce antagonisty. Aktywowany polimer (polimery) jest poddawany reakcji tak, że przyłączenie może nastąpić z dowolną dostępną grupą aminową antagonisty integryny alfa4, taką jak grupy alfa aminowe lub grupy epsilon aminowe lizyn. Wolne grupy karboksylowe, odpowiednio aktywowane grupy karbonylowe, hydroksylowe, guanidylowe, utlenione reszty węglowodanowe i grupy merkapto antagonisty alfa4 integryny (o ile są dostępne) mogą także być stosowane jako miejsca przyłączenia.

Choć polimer może być przyłączony w dowolnym miejscu na cząsteczce antagonisty integryny, korzystnym miejscem do połączenia polimeru do antagonistów integryny jest N-koniec antagonisty integryny. Drugorzędowe miejsce (miejsca) są przy lub w pobliżu C-końca i przez reszty cukrów (jeśli są obecne). Tak więc w wynalazku bierze się pod uwagę; (1) N-końcowo sprzężone koniugaty polimerów i antagonistów integryny alfa4; (ii) C-końcowo sprzężone koniugaty polimerów i antagonistów integryny alfa4; (iii) koniugaty połączone przez cukier; (iv) jak i N-, C- i połączone przez cukier koniugaty polimerów antagonistów alfa4 integryny.

Na ogół stosuje się od około 1,0 do około 10 moli aktywowanego polimeru na mol antagonisty, w zależności od stężenia antagonisty. Koń cowa ilość jest wynikiem równowagi maksymalizacji zakresu reakcji i minimalizacji niespecyficznych modyfikacji produktu, z równoczesnym określeniem substancji chemicznych, które utrzymają optymalną aktywność, zarazem optymalizując, o ile jest to możliwe, okres półtrwania antagonisty. Korzystnie przynajmniej około 50% aktywności biologicznej antagonisty, utrzymane jest, a najbardziej korzystnie 100% jest utrzymane.

Reakcje można prowadzić dowolnym o uznanym w technice sposobem stosowanym dla reakcji biologicznie czynnych materiałów z obojętnymi polimerami. Na ogół proces obejmuje przygotowanie

PL 198 975 B1 aktywowanego polimeru (który może mieć przynajmniej jedną końcową grupę hydroksylową) i następnie przeprowadzenie reakcji antagonisty z aktywowanym polimerem z wytworzeniem rozpuszczalnego białka odpowiedniego dla preparatu. Powyższa reakcja modyfikacji może być przeprowadzona kilkoma sposobami, które mogą obejmować jeden lub więcej etapów.

Jak wspomniano powyżej, w niektórych wykonaniach wykorzystuje się N-koniec antagonisty integryny do wiązania z polimerem. Do uzyskania selektywnie zmodyfikowanego na N-końcu antagonisty integryny alfa4 dostępne są odpowiednie konwencjonalne sposoby. Przykładowo jako jeden sposób podany jest sposób alkilacji redukcyjnej, który wykorzystuje zróżnicowaną reaktywność różnych typów pierwszorzędowych grup aminowych (grupy aminowe epsilon na lizynie w stosunku do grup aminowych na N-końcowej metioninie) dostępnych dla derywatyzacji na odpowiednim antagoniście integryny. W odpowiednich warunkach selekcji, można uzyskać zasadniczo selektywną derywatyzację odpowiedniego antagonisty integryny na jego N-końcu przy użyciu polimeru zawierającego grupę karbonylową. Reakcję wykonuje się przy pH, które pozwala na wykorzystanie różnic w pKa między grupami epsilon aminowymi reszt lizyny i grupy alfa aminowej N-końcowej reszty antagonisty integryny. Ten typ substancji chemicznej jest dobrze znany specjalistom.

Strategia kierowania polimeru glikolu polialkilenowego, takiego jak PEG do C-końca antagonisty integryny alfa4 (np. białka) służyłaby do chemicznego przyłączenia lub uzyskania za pomocą inżynierii genetycznej miejsca, które może być użyte do kierowania reszty polimeru. Na przykład, włączenie Cys w miejscu, które jest na C-końcu lub blisko C-końca białka, pozwoliłoby na specyficzną modyfikację z zastosowaniem uznanego w dziedzinie maleimidu, winylosulfonu lub aktywowanych halogenooctanem pochodnych glikolu polialkilenowego (np. PEG). Ze względu na wysoką wybiórczość tych reagentów dla Cys pochodne te mogą być konkretnie stosowane do modyfikacji wprowadzonych cystein. Inne strategie, takie jak włączenie znacznika histydynowego, który może być kierowany (Fancy i wsp., (1996) Chem. & Biol. 3:551) lub dodatkowe miejsca glikozylacji na białku, stanowią inne alternatywy dla modyfikacji C-końca antagonisty integryny.

Sposoby kierowania cukrów jako miejsc modyfikacji chemicznej są także dobrze znane i dlatego jest prawdopodobne, że polimer, glikol polialkilenowy, może być dodany bezpośrednio i konkretnie do cukrów (o ile są obecne) na antagoniście integryny, który był aktywowany przez utlenianie. Na przykład, można uzyskać glikol polietylenowy-hydrazyd, który tworzy stosunkowo stabilne wiązania hydrazonowe przez kondensację z aldehydami i ketonami. Tę właściwość stosowano do modyfikacji białek przez utlenione wiązania oligosacharydowe. Patrz Andresz, H. i wsp. (1978). Makromol. Chem. 179:301. W szczególności, traktowanie PEG-karboksymetylohydrazydu azotynem daje PEG-karboksymetyloazydek, który jest elektrofilowo czynną grupą w stosunku do grup aminowych. Ta reakcja może być także stosowana do przygotowania białek modyfikowanych glikolem polialkilenowym. Patrz patenty US 4,101,380 i 4,179,337,

Można stosować uznaną w dziedzinie substancję chemiczną z udziałem linkerów tiolowych w celu dalszego ułatwienia sieciowania białek do wytworzenia multiwalentnych kompozycji antagonistów integryny alfa4. W szczególności można wytworzyć reaktywne aldehydy na resztach węglowodanów za pomocą nadjodanu sodu, tworząc koniugaty cystaminy przez aldehydy i indukując sieciowanie przez grupy tiolowe na cystaminach. Patrz Pepinsky B, i wsp. (1991) J. Biol. Chem. 226: 1824418249 i Chen, L. L. i wsp. (1991) J. Biol. Chem., 266: 18237-18243. Tak więc ten typ substancji chemicznej byłby także odpowiedni do modyfikacji polimerów glikolu polialkilenowego, gdzie łącznik włączony jest do cukru, a polimer, glikol polialkilenowy, jest przyłączony do łącznika. Podczas gdy łączniki zawierające aminotiol lub hydrazynę umożliwią dodanie pojedynczej grupy polimerowej, struktura łącznika może być tak zmieniona, że dodawanych jest wielepolimerów i/lub ulega zmianie orientacja przestrzenna polimeru względem antagonisty integryny.

W praktyce do układów polimerowych będących przedmiotem zainteresowania korzystnie wprowadza się reszty glikoli polialkilenowych pochodzące z glikoli polialiklenowych C1-C4, korzystnie glikolu polietylenowego (PEG) lub glikolu poli(oksy)alkilenowego. Zatem polimer, do którego jest przyłączone białko, może być homopolimerem glikolu polietylenowego (PEG) lub jest poliolem polioksyetylowanym, pod warunkiem, że we wszystkich przypadkach polimer jest rozpuszczalny w wodzie w temperaturze pokojowej. Nieograniczające przykłady takich polimerów obejmują homopolimery tlenku polialkilenu, takie jak PEG lub glikole polipropylenowe, glikole polioksyetylenowane, ich kopolimery i ich kopolimery blokowe, pod warunkiem, że utrzymana jest rozpuszczalność w wodzie kopolimeru blokowego. Przykłady polioksyetylowanych polioli obejmują, na przykład, polioksyetylowany glicerol, polioksyetylowany sorbitol, polioksyetylowaną glukozę lub tym podobne. Szkielet glicerolowy poliok18

PL 198 975 B1 syetylowanego glicerolu jest taki sam jak szkielet występujący naturalnie, na przykład, u zwierząt i ludzi w mono-, di- i triglicerydach. Tak więc, to rozgałęzienie nie byłoby koniecznie postrzegane jako obcy czynnik w organizmie.

Jako alternatywa dla tlenków polialkilenów mogą być stosowane dekstran, poli (winylopirolidony), poliakryloamidy, poli(alkohole winylowe), polimery oparte na węglowodanach i tym podobne. Dla specjalisty jest oczywiste, że powyższa lista jest jedynie ilustracją i że rozważane są wszystkie materiały polimerowe o opisanych tu właściwościach.

Polimer nie musi mieć żadnego konkretnego ciężaru cząsteczkowego, ale korzystnie ciężar cząsteczkowy jest w zakresie między około 300 - 100000, bardziej korzystnie miedzy 10000 - 40000. W szczególno ś ci najlepsze do zapobiegania utracie produktu z powodu filtracji w nerkach są wielkoś ci 20000 lub większe.

Derywatyzacje glikoli polialkilenowych ma szereg korzystnych właściwości w formułowaniu koniugatów polimer-antagonista integryny w praktyce niniejszego wynalazku, ponieważ jest związana z nastę pują cymi wł aś ciwoś ciami pochodnych glikoli polialkilenowych: popraw ą rozpuszczalnoś ci w wodzie; podczas gdy jednocześ nie nie wywoł uje odpowiedzi antygenowej i immunologicznej; wysokim stopniem biokompatybilności; brakiem biodegradacji in vivo pochodnych glikolu polialkilenowego; i łatwością wydalania przez żywe organizmy.

Ponadto, w innym wykonaniu można stosować antagonistę integryny alfa4 kowalencyjnie związanego ze składnikiem polimerowym, w którym natura koniugacji obejmuje mogące ulec przecięciu kowalencyjne wiązania chemiczne. To pozwala na kontrolę upływu czasu, w którym polimer może być odcięty od antagonisty integryny. To wiązanie kowalencyjne miedzy antagonistą integryny i polimerem może być przecięte za pomocą reakcji chemicznej lub enzymatycznej. Produkt polimer-antagonista integryny zachowuje dopuszczalną ilość aktywności. Równocześnie, części glikolu polietylenowego są obecne w koniugującym polimerze nadając koniugatowi polimer-antagonista integryny wysoką rozpuszczalność w wodzie i przedłużoną zdolność do krążenia w krwiobiegu. W wyniku tych poprawionych cech rozważa się podawanie pozajelitowe, donosowe i doustne zarówno aktywnego gatunku polimeru-antagonisty integryny alfa4, a następnie po cięciu hydrolitycznym biodostępność antagonisty integryny, jako takiego, w zastosowaniach in vivo.

Należy rozumieć, że opisane tu schematy reakcji są podane tylko w celu ilustracji i nie są ograniczeniem w odniesieniu do reakcji i struktur, które mogą być stosowane w modyfikacji antagonistów integryny alfa4 np. w celu uzyskania rozpuszczalności, stabilizacji i powinowactwa do błony komórkowej dla podawania pozajelitowego i doustnego. Aktywność i stabilność tych koniugatów antagonistów integryny można zmieniać kilkoma różnymi sposobami, przez stosowanie polimeru o różnych wielkościach cząsteczkowych. Rozpuszczalności koniugatów można zmieniać przez zmianę proporcji i wielkości fragmentu glikolu polietylenowego włączanego w skład polimeru.

Ilość aktywnego składnika, która może być połączona z materiałami nośnikowymi w celu wytworzenia pojedynczej dawki będzie się zmieniać w zależności od leczonego pacjenta i konkretnego sposobu podawania. Należy jednak rozumieć, że specyficzne dawkowanie i tryb leczenia danego pacjenta będzie zależał od szeregu czynników, w tym konkretnej aktywności stosowanego związku, wieku, masy ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, diety, czasu podawania, tempa wydalania, kombinacji leków i opinii lekarza prowadzącego i zaawansowania leczonej choroby. Ilość składnika czynnego może też zależeć od czynnika terapeutycznego lub profilaktycznego, o ile taki jest, z którym składnik jest współpodawany.

Preparaty farmaceutyczne

Leki wytwarzane zgodnie z wynalazkiem mogą być podawane pozajelitowo. Stosowane tu określenie pozajelitowo obejmuje techniki iniekcji lub infuzji podskórne, dożylne, domięśniowe, dostawowe, domaziówkowe, domostkowe, dooponowe, dowątrobowe, dourazowe i wewnątrzczaszkowe. Żądaną dawkę podaje się pacjentowi jeden lub więcej razy dziennie, dożylnie, doustnie, doodbytniczo, pozajelitowo, donosowo, miejscowo, lub drogą inhalacji. Żądaną dawkę można też podawać w ciągłym wlewie dożylnym.

Homologi przeciwciał korzystnie podaje się jako sterylne farmaceutyczne kompozycje zawierające farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, który może być dowolnym z licznych dobrze znanych nośników, takich jak woda, sól fizjologiczna, sól fizjologiczna buforowana fosforanem, dekstroza, glicerol, etanol i temu podobne lub ich kombinacje. Związki wykorzystywane w zastosowaniach według wynalazku mogą być stosowane w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych soli pochodzących od kwasów i zasad nieorganicznych lub organicznych. Wśród takich soli kwasów są następujące: octan, adypinian, alginian, asparaginian, benzoesan, benzenosulfonian, bisiarczan, maślan, cytrynian, kamforan,

PL 198 975 B1 kamforosiarczan, cyklopentanopropionian, diglukonian, dodecylosiarczan, etanosiarczan, fumaran, glukoheptanian, glicerofosforan, hemisiarczan, heptanian, heksanian, chlorowodorek, bromowodorek, jodowodorek, 2-hydroksyetanosulfonian, mleczan, maleinian, metanosulfonian, 2-naftalenosulfonian, nikotynian, szczawian, pamoesan, pektynian, nadsiarczan, 3-fenylopropionian, pikrynian, piwalanian, propionian, bursztynian, winian, tiocyjanian, tosylan i undekanian. Sole z zasadami obejmują sole amonowe, sole metali alkalicznych, takie jak sole sodu i potasu, sole metali ziem alkalicznych, takich jak sole wapnia i magnezu, sole z zasadami organicznymi, takie jak sole dicykloheksyloaminy, N-metylo-D-glukaminy, tris(hydroksymetylo)metyloaminy i sole z aminokwasami, takimi jak arginina, lizyna i tak dalej. Także grupy zawierające zasadowy azot mogą być czwartorzędowane, takimi czynnikami jak halogenki niższych alkili, takie jak chlorek, bromek i jodek metylu, etylu, propylu i butylu siarczany dialkilu, takie jak siarczany dimetylu, dietylu, dibutylu i diamylu, długołańcuchowe halogenki, takie jak chlorki, bromki i jodki decylu, laurylu, mirystylu i stearylu, halogenki aralkilowe, takie jak bromki benzylu i fenetylu i inne. W ten sposób uzyskuje się produkty rozpuszczalne lub dyspergowalne w wodzie lub oleju.

Kompozycje farmaceutyczne, uzyskane zgodnie z zastosowaniem według wynalazku obejmują dowolne ze związków ujawnionych w niniejszym wynalazku lub ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne, razem z dowolnym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Stosowane tu określenie nośnik obejmuje dopuszczalne adiuwanty i nośniki. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, które mogą być stosowane w niniejszych kompozycjach farmaceutycznych obejmują, ale nie wyłącznie, wymieniacze jonowe, tlenek glinu, stearynian glinu, lecytynę, białka surowicy, takie jak ludzka albumina surowicza, związki buforujące, takie jak fosforany, glicyna, kwas sorbinowy, sorbinian potasu, mieszaniny częściowych glicerydów nasyconych roślinnych kwasów tłuszczowych, wodę, sole lub elektrolity, takie jak siarczan protaminy, wodorofosforan disodu, wodorofosforan potasu, chlorek sodu, sole cynku, koloidalna krzemionka, trikrzemian magnezu, poli (winylopirolidon), substancje oparte na celulozie, glikol polietylenowy, sól sodowa karboksymetylocelulozy, poliakrylany, woski, polimery blokowe polietylen-polioksypropylen, glikol polietylenowy i tłuszcz z wełny.

Kompozycje farmaceutyczne mogą być w postaci sterylnego preparatu do iniekcji, na przykład sterylnej wstrzykiwalnej wodnej lub oleistej zawiesiny. Ta zawiesina może być formułowana według technik znanych w dziedzinie z użyciem odpowiednich środków dyspergujących lub zwilżających i czynników do zawieszania. Sterylny preparat do iniekcji może być też sterylnym roztworem lub zawiesiną do iniekcji w nietoksycznym, dopuszczalnym pozajelitowo rozcieńczalniku lub rozpuszczalniku, na przykład roztworze 1,3-butanodiolu. Wśród dopuszczalnych nośników i rozpuszczalników, które mogą być stosowane jest woda, płyn Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Dodatkowo, sterylne ciekłe oleje są konwencjonalnie stosowane jako rozpuszczalnik lub podłoże do zawieszania. W tym celu może być stosowany dowolny obojętny olej ciekły, w tym syntetyczne mono- i diglicerydy. Kwasy tłuszczowe, takie jak kwas olejowy i jego pochodne glicerydowe, są użyteczne w przygotowaniu iniekcji, jak i naturalne dopuszczalne farmaceutycznie oleje, takie jak oliwa lub olej rycynowy, zwłaszcza w wersjach polioksyetylowanych.

Kompozycje farmaceutyczne mogą być podawane doustnie. Jeśli są podawane doustnie, mogą być podawane w dowolnej dopuszczalnej doustnej postaci dawkowania w tym, ale nie wyłącznie, w kapsułkach, tabletkach, wodnych zawiesinach lub roztworach. W przypadku tabletek do stosowania doustnego powszechnie stosowane nośniki obejmują laktozę i skrobię kukurydzianą. Typowo dodaje się także środki poślizgowe, takie jak stearynian magnezu. Do podawania doustnego w postaci kapsułki przydatne rozcieńczalniki obejmują laktozę i wysuszoną skrobię kukurydzianą. Gdy do stosowania doustnego wymagane są zawiesiny wodne, składnik aktywny łączy się z czynnikami emulgującymi i zawieszającymi. Jeśli jest to konieczne, mogą być też dodawane pewne czynniki słodzące, smakowe lub barwiące.

Zgodnie z zastosowaniami według niniejszego wynalazku wytwarza się kompozycje, w których antagonistę formułuje się w pęcherzykach, takie jak kompozycje zawierające liposomy. Liposomy są pęcherzykami tworzonymi przez amfipatyczne cząsteczki, takie jak polarne lipidy, na przykład fosfatydylocholiny, etanolaminy i seryny, sfingomieliny, kardiolipiny, plazmalogeny, kwasy fosfatydowe i cerebrozydy. Liposomy tworzą się gdy odpowiednim amfipatycznym cząsteczkom umożliwi się pęcznienie w wodzie lub roztworach wodnych do utworzenia ciekłych kryształów, zwykle o wielowarstwowej strukturze złożonej z wielu dwuwarstw oddzielonych od siebie materiałem wodnym (określane także jako zgrubne liposomy). Inny typ liposomu, o którym wiadomo, że składa się z pojedynczej dwuwarstwy otaczającej materiał wodny, określany jest jako pęcherzyk monolamelarny. Jeśli materiały roz20

PL 198 975 B1 puszczalne w wodzie są zawarte w fazie wodnej w czasie pęcznienia lipidów, zostają uwięzione w warstwie wodnej mię dzy lipidowymi dwuwarstwami.

Szczególnie dogodnym sposobem przygotowania postaci niniejszych antagonistów formułowanych w liposomach jest sposób opisany w EP-A-253,619. W tym sposobie pojedyncze dwuwarstwowe liposomy zawierające zakapsułkowane składniki czynne przygotowuje się przez rozpuszczenie składników lipidowych w organiczonym podłożu, wstrzyknięcie roztworu organicznego składnika lipidowego pod ciśnieniem do składnika wodnego z równoczesnym mieszaniem składników organicznych i wodnych w homogenizatorze o wysokiej szybkości z użyciem innych środków mieszających, przez co spontanicznie tworzą się liposomy. Pojedyncze dwuwarstowe liposomy zawierające zakapsułkowany składnik czynny mogą być stosowane bezpośrednio lub mogą być użyte w odpowiednim dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku do podawania miejscowego. Lepkość liposomów można zwiększyć przez dodanie jednego lub więcej odpowiednich czynników zagęszczających, takich jak, na przykład, guma ksantanowa, hydroksypropyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza i ich mieszaniny. Wodny składnik może składać się z samej wody lub może zawierać elektrolity, układy buforowane i inne składniki, takie jak na przykład konserwanty. Odpowiednie elektrolity, które można zastosować, obejmują sole metali, takie jak sole metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych. Korzystnie sole metali to chlorek wapnia, chlorek sodu i chlorek potasu. Stężenie elektrolitu może zmieniać się od zera do 260 mM, korzystnie od 5 mM do 160 mM. Składnik wodny umieszcza się w odpowiednim naczyniu, które może być przystosowane do efektywnej homogenizacji przez wprowadzenie silnej turbulencji w czasie wstrzykiwania składnika organicznego. Homogenizacja dwóch składników może być uzyskana w naczyniu, lub alternatywnie, składniki wodne i organiczne mogą być wstrzyknięte oddzielnie do środka mieszającego, który umieszcza się poza naczyniem. W tym drugim przypadku liposomy są formowane w urządzeniu mieszającym, a następnie przenoszone do innego naczynia w celu zebrania.

Organiczny składnik składa się z odpowiedniego nietoksycznego dopuszczalnego farmaceutycznie nośnika, takiego jak, na przykład, etanol, glicerol, glikol propylenowy i glikol polietylenowy i odpowiedniego fosfolipidu, który jest rozpuszczalny w rozpuszczalniku. Odpowiednie fosfolipidy, które mogą być stosowane, obejmują, na przykład, lecytynę, fosfatydylocholinę, fosfatydyloserynę, fosfatydyloetanolaminę, fosfatydyloinozytol, lizofosfatydylocholinę i fosfatydyloglicerol. W celu selektywnej modyfikacji właściwości liposomów mogą być stosowane inne lipofilowe dodatki. Przykłady takich dodatków obejmują stearyloaminę, kwas fosfatydowy, tokoferol, cholesterol i ekstrakty lanoliny.

Dodatkowo, do składnika organicznego można dodać inne składniki, które mogą zapobiegać utlenianiu fosfolipidów. Przykłady takich innych składników obejmują tokoferol, butylowany hydroksyanizol, butylowany hydroksytoluen, palmitynian askorbylu i oleinian askorbylu. Mogą być także dodane konserwanty, takie jak kwas benzoesowy, metyloparaben i propyloparaben.

Poza kompozycjami opisanymi powyżej, można też stosować opatrunki, np. plastry, bandaże, opatrunki, gazę i tym podobne, zawierające odpowiednią ilość terapeutyku przeciwciała przeciw VLA-4. W niektórych przypadkach można stosować plastry, bandaże, opatrunki, kompresy gazowe i tym podobne, które impregnowano preparatem do stosowania miejscowego zawierającym preparat leczniczy.

Kompozycje farmaceutyczne można też podawać w aerozolu do nosa lub inhalacji z użyciem nebulizatora, inhalatora do suchego proszku lub inhalatora odmierzającego dawkę. Takie kompozycje przygotowuje się według technik dobrze znanych w dziedzinie preparatyki farmaceutycznej i można je przygotować jako roztwory w soli fizjologicznej, stosując alkohol benzylowy lub inne odpowiednie konserwanty, promotory absorpcji w celu zwiększenia biodostępności, fluorowęglowodory i/lub inne konwencjonalne środki rozpuszczające lub dyspergujące.

Kompozycje zawierające homologi przeciwciała, który jest antagonistą interakcji między integryną niosącą podjednostkę alfa 4 a ligandem dla integryny niosącej podjednostkę alfa 4 mogą też zawierać dodatkowy czynnik wybrany z grupy złożonej z kortykosteroidów, leków przeciwzapalnych, immunosupresantów, antymetabolitów i immunomodulatorów. Specyficzne związki w każ dej z tych klas moż na wybrać z dowolnych wymienionych w ramach odpowiedniej grupy w Comprehensive Medicinal Chemistry, Pergamon Press, Oxford, Anglia, str. 970-986 (1990), której ujawnienia są tu włączone w postaci odniesienia. Zawarte w tej grupie są także związki, takie jak teofilina, sulfasalazyna i aminosalicylany (przeciwzapalne); cyklosporyna, FK-506 i rapamycyna (immunosupresanty); cyklofosfamid i metotreksat (antymetabolity); steroidy (wdychane, ustne lub miejscowe) i interferony (immunomodulatory).

PL 198 975 B1

Dawkowanie i wielkość dawki związków skutecznych w wytwarzaniu żądanych skutków będą zależały od wielu czynników, takich jak natura antagonisty, wielkość pacjenta, cel terapii, charakter leczonej patologii, stosowanej specyficznej kompozycji farmaceutycznej i opinii lekarza prowadzącego.

Użyteczne są poziomy dawek czynnego składnika w zakresie 0,001 - 100 mg/kg masy ciała, korzystnie 0,1 - około 50 mg/kg masy ciała na dzień. Najbardziej korzystnie, czynnik wiążący VLA-4 jeśli jest przeciwciałem lub pochodną przeciwciała, będzie podawany w dawce w zakresie około 0,1 mg/kg masy ciała/dzień - około 20 mg/kg masy ciała/dzień, korzystnie w zakresie około 0,1 mg/kg masy ciała/dzień około 10 mg/kg masy ciała/dzień w odstępach co 1-14 dni. Dla czynników wiążących nie będących przeciwciałami lub czynnikami wiążącymi małe cząsteczki, zakres dawki powinien być korzystnie w zakresie molarnie równoważnych ilości w stosunku do ilości przeciwciał. Korzystnie, kompozycja przeciwciała jest podawana w ilości skutecznej do dostarczenia poziomu przeciwciała w osoczu przynajmniej 1 mg/ml. Optymalizacja dawek może być ustalona przez podanie czynników wiążących, a następnie ocenę powlekania integryno-dodatnich komórek przez czynnik w czasie po podaniu danej dawki in vivo.

Obecność podanego czynnika może być wykryta in vitro (lub ex vivo) za pomocą niezdolności lub zmniejszonej zdolności komórek osobnika do wiązania tego samego czynnika, który był sam znakowany (np. za pomocą fluorochromu). Korzystna dawka powinna dawać wykrywalną powłokę ogromnej większości komórek integryno-dodatnich. Korzystnie, powlekanie utrzymuje się w przypadku homologu przeciwciała przez okres 1-14 dni.

Specjaliści w dziedzinie mogą łatwo przetestować, czy antagonista wywiera swoje zamierzone działanie. Do wykazania skuteczności stosuje się standardowe testy dla badania klinicznego powrotu do zdrowia (np. płukanie i badanie FACS dla wiązania przeciwciała; w wymuszonej życiowej pojemności płuc) będą stosowane przez specjalistów. Na przykład, komórki zawarte w próbce tkanki płuc osobnika są badane pod kątem obecności czynnika in vitro (lub ex vivo) z zastosowaniem drugiego odczynnika, w celu wykrycia podanego czynnika. Na przykład, może to być znakowane fluorochromem przeciwciało swoiste dla podawanego czynnika, który jest następnie mierzony za pomocą standardowej analizy FACS (sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją). Alternatywnie, obecność podawanego czynnika wykrywa się in vitro (lub ex vivo) przez niezdolność lub zmniejszenie zdolności komórek osobnika do wiązania tego samego czynnika, który sam był znakowany (np. fluorochromem). Korzystna dawka powinna wytwarzać wykrywalne powlekanie ogromnej większości komórek integryno-dodatnich. Korzystnie, powlekanie jest przedłużone w przypadku homologu przeciwciała przez okres 1-14 dni.

Następujące przykłady ilustrują wynalazek i nie powinny być traktowane jako jego ograniczenia.

P r z y k ł a d 1: Modele zwierzęce zwłóknienia płuc

Za pomocą wielu danych udokumentowano udział komórek zapalnych i mediatorów w zwłóknieniu płuc w szeroko stosowanych modelach i bleomycyna (BL) - gryzonie. Odwoływano się do tego modelu, ponieważ daje charakterystyczny obraz zwłóknienia z wieloma składnikami choroby ludzkiej i ponieważ indukowane przez BL zwł óknienie pł uc jest dobrze rozpoznanym niekorzystnym efektem chemioterapii u ludzi. Do badania mechanizmów fibrogenezy i do badania przesiewowego potencjalnie korzystnych związków antyfibrotycznych szeroko stosowano szczurom dotchawicze (IT) zakroplenie BL. Choć początkowa przyczyna indukowanego przez BL zatrucia płuc jest przypisywana tworzeniem się reaktywnych form tlenu (ROS) po związaniu się z żelazem i DNA, proces prowadzący do końcowych objawów zwłóknienia płuc obejmuje uwalnianie różnych mediatorów zapalnych (Giri i Wang, Comments Toxicol., 3: 145-176 (1989)). Patogeneza uszkodzenia pł uc powodowanego przez BL jest zapoczątkowana przez obrzęk, krwotok, i naciek komórek z przewagą neutrofili i makrofagów. Nadmierne nagromadzenie zapalnych leukocytów w przestrzeniach naczyniowych, śródmiąższowych i pę cherzykowych pł uc moż e powodować uszkodzenia naczyniowe i miąższowe przez generację ROS i enzymów proteolitycznych. Neutrofile zawierają znaczne ilości mieloperoksydazy (MPO), która moż e utleniać Cl- do kwasu podchlorawego (HOCl) w reakcji z H2O2 i wiadomo, że HOCl pochodzący z neutrofili powoduje toksyczność komórkową. ROS pochodzący z makrofagów i neutrofili jest zdolny do stymulacji produkcji cytokin prozapalnych i fibrogennych, które pośredniczą w zwiększonej odpowiedzi fibroproliferacyjnej (Phan i Kunkel, Exp. Lung Res. 18: 29-43 (1992). Poza dużym naciekaniem komórek zapalnych, proces zwłóknienia jest dalej scharakteryzowany odpowiedzią hiperproliferacyjną aktywowanych fibroblastów. Komórki podobne do fibroblastów są głównie odpowiedzialne za bezwzględny wzrost zawartości kolagenu w płucach i za zaburzenia wyglądu ultrastrukturalnego i rozmieszczenia przestrzennego typów kolagenu.

PL 198 975 B1

P r z y k ł a d 2: Hamowanie zwłóknienia za pomocą antagonistów integryny zawierającej podjednostkę alfa4

Materiały i metody

Stosowano niespecyficzne przeciwciało kontrolne (1E6) i przeciwciało przeciwko integrynom zawierającym podjednostkę alfa4 (PS2) 1E6 jest monoklonalnym przeciwciałem mysim przeciwko ludzkim LFA3 (domena 1) IgG1. Patrz Miller, Hochman, Meier, Tizard, Bixler, Rosa i Wallner (1992) J. Exp. Med. 178: 211-222. PS/2 jest wytwarzane sposobem Miyake i wsp., J. Exp. Med. 173: 599-607 (1991).

Samce myszy C57BL/6 wolne od przewlekłych chorób dróg oddechowych ważące 25-30 g nabyto od Charles River Laboratory. Siarczan bleomycyny (nazwa handlowa Blenoxane) otrzymano jako podarek od Bristol Laboratories, (Syracuse, NY). L-[3,4-3 H] prolinę do znakowania substratu prokolagenowego dla hydroksylazy prolilowej otrzymano z NEN Life Science Products (Boston, MA). Z-fix, wodną buforowaną formalinę cynkową, nabyto od Anatech, LTD (Battle Creek, MI). Wszystkie inne reagenty o jakości cz.d.a.reagentowej lub wyższej uzyskano ze standardowych źródeł handlowych.

Traktowanie zwierząt

Myszy hodowano po 4 w klatce i dbano o nie zgodnie z Guidelines for Animal Welfare NIH. Myszom umożliwiono aklimatyzację na tydzień przed wszystkimi traktowaniami. Utrzymywano cykl 12 godz./12 godz. światło/ciemność i myszy miały dostęp do wody i Rodent Laboratory Chow ad libitum. Zwierzęta losowo podzielono na 4 grupy eksperymentalne: 1) SA + SA; 2) BL + IE6; 3) BL + SA; i 4) BL + PS2. Myszom dotchawiczo (IT) zakropiono pojedynczą dawkę soli fizjologicznej lub BL w ilości 0,08 jednostki/100 mikrolitrów/mysz pod narkozą ksylazyną i ketaminą. Po zakropieniu IT myszy otrzymały trzy razy tygodniowo iniekcję IP z IE6, SA lub PS2 (100 mikrogramów w 0,2 ml/mysz). Dwadzieścia jeden dni po zakropieniu BL myszy uśmiercono pod narkozą pentobarbitalem w celu przeprowadzenia analiz biochemicznej i histopatologicznej popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (BALF).

Przygotowanie BALF i tkanki płucnej

Po znieczuleniu otwierano jamę brzuszną, a następnie skrwawiano z zstępującej aorty brzusznej. Płuca przygotowano do płukania przez kaniulowanie tchawicy tępą igłą połączoną ze strzykawką. Płukanie płuc przeprowadzono 3 ml zimnego izotonicznego roztworu soli fizjologicznej dostarczanej w porcjach 1 ml. Próbkę BALF podzielono do obliczenia całkowitej liczby komórek. Pozostały BALF odwirowano przy 1500 g przez 20 min w 4°C, uzyskany supernatant rozporcjowano i przechowywano w -70°C. Po BALF, płaty płuc wolne od tkanki niemiąższowej szybko wypreparowano, natychmiast zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w -70°C.

Później, zamrożone płuca rozmrożono i homogenizowano w 0,1 M KCl, 0,02 M Tris (pH 7,6) homogenizatorem Politron (Brinkmann Instruments Inc., Westbury, NY). Homogenat dokładnie wymieszano przez powtórzone odwracanie i zapisano ostateczne objętości homogenatu (4-5 ml). Homogenat podzielono na kilka porcji i przechowywano w -70°C do oznaczeń biochemicznych.

Oznaczenie ekwiwalentu dialdehydu malonowego płuc i zawartości hydroksyproliny

Oznaczono ekwiwalent dialdehydu malonowego płuc na podstawie całkowitej ilości produktów reagujących z kwasem tiobarbiturowym w niefrakcjonowanym homogenacie metodą Ohkawa i wsp., Anal. Biochem. 95:351 (1979). Dla oznaczenia płucnej hydroksyproliny strącono 1 ml homogenatu 0,25 ml schłodzonego lodem 50% (wag./obj.) kwasu trichloroooctowego, odwirowano i osad hydrolizowano w 2 ml 6N HCl przez 18 godzin w 110°C. Zawartość hydroksyproliny mierzono za pomocą techniki opisanej przez Woessner, J.F., Arch. Biochem. Biophys. 99:440 (1961).

Oznaczenie aktywności hydroksylazy prolilowej (EC 1.14.11.2)

Przygotowanie substratu hydroksylazy prolilowej (prokolagenu) i sposób oznaczenia aktywności hydroksylazy prolilowej są opisane w Giri, S.N. i wsp., Exp. Mol. Pathol. 39:317 (1983). Pokrótce, piszczele świeżo izolowane z dziesięciodniowych zarodków kurcząt znakowano [3H]-proliną w wolnym od proliny podłożu hodowlanym w 37°C przez 6 godzin. Po usunięciu niewbudowanego znacznika za pomocą płukania, tkankę homogenizowano i wirowano w 3000 g przez 20 minut w 4°C. Powstały supernatant dializowano ekstensywnie w celu usunięcia niewbudowanego znacznika. Znakowany substrat prokolagenowy rozporcjowano i przechowywano w -70°C. Mieszanina inkubacyjna do oznaczania aktywności enzymatycznej zawierała w całkowitej objętości 2 ml żelazawy siarczan amonu (0,1 mmol/l), kwas alfa-ketoglutarowy (0,1 mmol/l), prokolagen znakowany [3H] proliną (200000 dpm), homogenat płuc (0,2 ml), kwas askorbinowy (0,5 mmol/l) i bufor TRIS-kwas solny (0,1 mmol/l, pH 7,8). Do mieszaniny reakcyjnej dodano 0,2 ml 50% kwasu trichlorooctowego po 30 minutach w 37°C w wytrząsarce metabolicznej Dubnoffa. W czasie reakcji uwalniana jest woda zawierająca atom trytu w stosunku stechiometrycznym do hydroksylacji proliny i wykorzystuje się ją jako miarę aktywności

PL 198 975 B1 enzymu. Wodę z trytem z układu reakcyjnego oddzielono przez destylację pod próżnią całej mieszaniny reakcyjnej i zliczono radioaktywność. Aktywność enzymu wyrażono w dpm wody z trytem uwolnionej przez całe płuco w ciągu 30 min.

Określenie liczby komórek w BALF

Całkowitą liczbę komórek w BALF określono jak opisano w Wang, Q. i wsp., Lab. Invest. 67: 234-242 (1992). Całkowitą liczbę leukocytów w BALF oceniano za pomocą licznika Coultera (Model F, Coulter Electronics, Inc., Hialeah, FL) zgodnie z instrukcją dla użytkownika.

Oznaczanie białka w BALF

Zawartość białka w supernatancie BALF określono za pomocą testu na białko Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) i zastosowano bydlęcą albuminę surowiczą jako wzorzec.

Badania histopatologiczne i immunohistochemiczne

Na końcu eksperymentu wybrano losowo trzy lub cztery zwierzęta z każdej grupy eksperymentalnej do oceny histopatologicznej i immunohistochemicznej. Otworzono jamę brzuszną zwierzęcia, a nastę pnie skrwawiono z zstę pują cej aorty brzusznej. Natychmiast potem wypreparowano pł uca do badań histologicznych jak opisano w Wang i wsp. powyżej. Po kaniulowaniu tchawicy tępą igłą otworzono jamę klatki piersiowej, a następnie usunięto serce i płuca en bloc. Płuca utrwalono w roztworze

Z-fix przez tchawicę przy ciśnieniu 30 cm wody. Prawe płaty czołowe i ogonowe i lewy płat następnie blokowano, zatapiano w parafinie, cięto na skrawki 7 μm i barwiono hematoksyliną i eozyną. W celu barwienia immunohistochemicznego na alfaSMA, skrawki tkanki płuc odparafinowano i blokowano endogenną peroksydazą. Skrawki do barwienia traktowano następnie przez 30 minut blokującą surowicą kozy i inkubowano przez 16 godzin z pierwszorzędowym monoklonalnym przeciwciałem antyalfaSMA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

Analiza statystyczna danych

Dane dla zwierząt wyrażono jako wartości na całe płuco i określono jako średnią ± błąd standardowy (SE). Dane porównano dla czterech grup stosując dwukierunkową analizę wariancji (SIGMASTAT) i metodę Studenta-Newmana-Keulsa. Wartość P < 0,05 rozpatrywano jako istotną.

Wyniki

Peroksydacja lipidów w płucu myszy

Oznaczono zawartość ekwiwalentu dialdehydu malonowego płuc jako wskaźnik peroksydacji lipidów u różnych grup myszy. Zakropienie BL znacząco zwiększało zawartość ekwiwalentu dialdehydu malonowego w płucach myszy w obu grupach BL+IE6 i BL+SA w porównaniu z grupami SA+SA Sa+SA i BL+PS2 (dane nie przedstawione). Działanie PS2 skutecznie blokowało indukowaną przez BL peroksydację lipidów w płucach ponieważ poziom ekwiwalentu dialdehydu malonowego w płucach w grupie BL+PS2 nie różnił się od grupy SA+SAA.

Zawartość hydroksyproliny płucnej w płucu myszy

Oznaczono hydroksyprolinę płucną, kluczowy wskaźnik poziomu kolagenu w płucach dla 4 grup myszy. Zakropienie IT BL znacząco podniosło poziom hydroksyproliny w płucach w grupach BL+IE6 i BL+SA do 185% i 205% grupy kontrolnej SA+SA, odpowiednio. Zaindukowany przez BL wzrost poziomu hydroksy proliny płucnej w grupie BL+PS2 był istotnie zmniejszony do 35% przez traktowanie PS2 w porównaniu z grupą BL+SA. Poziom hydroksyproliny płucnej w grupie BL+TR nie był istotnie wyższy niż kontroli IT SA (grupa SA+SA).

Aktywność hydroksylazy prolilowej w płucu myszy

Aktywności hydroksylazy prolilowej w płucach różnych grup wykazały, że sama BL istotnie zwiększała aktywność hydroksylazy prolilowej płuca w grupie BL+SA do 207% aktywności grupy kontrolnej SA+SA. PS2 istotnie zmniejszało aktywność hydroksylazy prolilowej podwyższonej przez traktowanie BL w grupie BL+SA.

Całkowita liczba komórek BALF w płucu myszy

Liczby wszystkich komórek w BALF różnych grup w 21 dni po zakropleniu IT soli fizjologicznej lub BL wykazały, że traktowanie BL zwiększało całkowitą liczbę komórek w BALF z grup BL+IE6 i BL+SA w porównaniu z kontrolną grupą z solą fizjologiczną (SA+SA), choć tylko grupa BL+IE miała istotnie wyższe poziomy niż grupa SA+SA. Liczba komórek BALF w grupie BL+PS2 nie różniła się od liczby z grupy SA+SA.

Zawartość białka w BALF

Zawartość białka w supernatancie BALF dla 4 grup eksperymentalnych ujawniła, że IT zakroplenie BL istotnie podwyższyło białko w BALF we wszystkich grupach traktowanych BL w porównaniu

PL 198 975 B1 z grupą SA+SA. Jednak traktowanie PS2 w grupie BL+PS2 zmniejszyło indukowany przez BL wzrost białka w supernatancie BALF, choć różnica nie była statystycznie istotna.

Histopatologia płuca myszy

Histologiczne badanie płuc myszy wykazało normalną miąższową tkankę w grupie SA+SA. Jednak płuca z grup BL+IE6 i BL+SA wykazały plamkowe zapalenie oskrzelików i wieloogniskowe śródmiąższowe zwłóknienie zawierające nagromadzenie zewnątrzkomórkowych włókien. Płuca myszy w tych grupach miały zgrubiałe przegrody międzypęcherzykowe i komórki zapalne w przylegających przestrzeniach powietrznych. W porównaniu z grupami BL+IE6 i BL+SA, płuca z grupy BL+PS2 miały znacznie mniej uszkodzeń fibrotycznych, choć niektóre płaty nadal wykazywały umiarkowany stopień śródmiąższowego zwłóknienia.

Immunohistochemiczne barwienie dla alfaSMA w płucu myszy

Aby określić akumulację fibroblastów i komórek podobnych do fibroblastów u myszy po traktowaniu BL, badano ekspresję XSMA w tkance płucnej stosując monoklonalne przeciwciało przeciwko XSMA. W płucach kontrolnych immunopozytywność wystąpiła w warstwach naczyniowych i mięśni gładkich oskrzeli. W płucach, które poddano traktowaniu BL i kontrolnym przeciwciałem lub solą fizjologiczną było rozległe i intensywne immunobarwienie w obszarach dotyczących zwłóknienia, zarówno w śródmiąższu jak i opłucnej. Jednak płuca traktowane BL i PS2 wykazały znacznie obniżone immunobarwienie alfaSMA w porównaniu z grupami BL+IE6 i BL+SA.

Dyskusja

IPF jest ciężką chorobą słabo reagującą na obecnie dostępną terapię. W prezentowanych badaniach dostarczamy dowodu, że integryna zawierająca podjednostkę alfa4 jest innym możliwym celem w leczeniu IPF. Na ogół zakłada się, że leukocyty płuc biorą udział w rozwoju zwłóknienia płuc przez wydzielanie ROS, fibrogennych cytokin i czynników wzrostowych. Ruch i stan aktywacji leukocytów jest modulowany przez różne białka powierzchniowe, takie jak integryny. Jest oczywiste, że interakcje komórka-komórka jak również interakcje komórka-ECM są istotne dla patogenezy zwłóknienia płuc. Konsekwentnie stwierdza się, że u pacjentów z czynnym zwłóknieniem płuc i w modelach zwierzęcych chorób płuc ze zwłóknieniem występuje akumulacja zwiększonej ilości komórek odpornościowych i zapalnych w obszarach, w których zachodzi zwłóknienie.

VLA-4 jest wyrażany na wszystkich krążących leukocytach, i wiąże się z cząsteczką adhezji komórkowej naczyń (VCAM-1), członkiem nadrodziny genów Ig, który jest wyrażany na aktywowanych cytokinami komórkach śródbłonka, i z białkiem macierzy, fibronektyną. ALfa4beta7 jest wyrażana na podzbiorze limfocytów T i B, naturalnych komórkach zabójcach i eozynofilach. Wiąże się z adresyną naczyniową naczyń błon śluzowych (MAdCAM-1), członkiem rodziny Ig i mucynopodobnych rodzin cząsteczek adhezyjnych, jak i z VCAM-1 i fibronektyną. Badania in vitro wykazały, że interakcja VLA-4 z VCAM-1 bierze udział w przyleganiu leukocytów jednojądrzastych i eozynofili do śródbłonka i w migracji transśródbłonowej i uważa się że alfa4beta7 bierze przede wszystkim udział w rekrutacji leukocytów do tkanki limfoidalnej związanej z jelitem.

W obecnym badaniu traktowanie PS2 obniżało indukowany BL wzrost całkowitej liczby leukocytów w BALF. Zmniejszona liczba leukocytów w płucach myszy BL+PS2 może być odpowiedzialna za zmniejszone uszkodzenie zapalne i zwłóknienie w płucach zwierząt traktowanych BL. Indukowane przez BL uszkodzenie płuc znacząco zmniejszono przez traktowanie PS2, jak wykazano przez pomiar peroksydacji lipidów płuca. Zwiększony poziom kolagenu w płucu był związany ze zwiększoną liczbą fibroblastów w śródmiąższu i samej przestrzeni pęcherzykowej. Wiele z tych podobnych do fibroblastów komórek jest miofibroblastami, które mają charakterystyczny fenotyp, który obejmuje ekspresję alfaSMA, kurczliwego białka często spotykanego w komórkach mięśni gładkich i uważanego za ważne w fibrogenezie i gojeniu się ran. Znaczącym wynikiem niniejszych badań był wniosek, że traktowanie PS2 osłabiało indukowaną przez BL proliferację miofibroblastów. Bez chęci wiązania się z jakąkolwiek teorią podawanie przeciwciała przeciwko integrynie alfa mogło obniżyć poziom czynników wzrostowych w płucach uwalnianych przez infiltrujące leukocyty lub też bezpośrednio wpływa na zachowanie miofibroblastów. W obu przypadkach obniżenie liczby proliferujących miofibroblastów mogło doprowadzić do zmniejszenia akumulacji kolagenu w płucach zwierząt traktowanych BL w grupie BL+PS2.

P r z y k ł a d 3: Hamowanie zwłóknienia antagonistą integryny zawierającej podjednostkę alfa1.

Traktowanie zwierząt

Samce myszy C57/BL6 ważące 28-30 g hodowano w szklanych klatkach w grupach po 4 w odpowiednich warunkach zatwierdzonych przez Amerykańskie Stowarzyszenie do Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi. Przed rozpoczęciem eksperymentu zwierzęta pozostawiono przez

PL 198 975 B1 jeden tydzień w warunkach laboratoryjnych. Miały one dostęp do Rodent Laboratory Chow 5001 (Purina Mills, Inc., St. Louis, MO) i wody ad libitum i były umieszczone w pokoju z filtrowanym powietrzem i cyklem świetlnym 12 godz. światło/12 godz. ciemność. Myszy przypisano do następujących grup:

GRUPA	TRAKTOWANIE
A	Sól fizjologiczna + sól fizjologiczna buforowana fosforanem
B	Sól fizjologiczna + kontrolne przeciwciało IgG
C	Bleomycyna + kontrolne przeciwciało IgG
D	Bleomycyna + przeciwciało anty-integryna α1β1

Siarczan bleomycyny rozpuszczano w wolnym od pirogenu sterylnym izotonicznym roztworze soli fizjologicznej tuż przez zakropieniem do tchawicy (IT). Pod znieczuleniem metoksyfluranem myszy w odpowiednich grupach otrzymywały przez podanie dotchawicze albo 100 μl sterylnego roztworu izotonicznego albo 0,08 jednostek roztworu bleomycyny w 100 pl. Przeciwciała (4 mg/kg) podawano myszom z odpowiednich grup w iniekcji dootrzewnowej trzy razy w tygodniu przez 21 dni po zakropleniu. Następnie zwierzęta w każdej grupie zabijano przez przedawkowanie pentobarbitalu sodu (100-125 mg/kg ip), a ich płuca konserwowano do płukania oskrzelikowo-pęcherzykowego, badań biochemicznych i histopatologicznych.

Określenie całkowitej liczby komórek i poziomu białek w popłuczynach oskrzelikowo-pęcherzykowych

Po kaniulacji tchawicy płuca płukano 5 ml izotonicznej soli fizjologicznej podanej w pięciu próbkach po 1 ml. Sól fizjologiczną podano strzykawką przez kaniulę, masowano delikatnie ścianę klatki piersiowej i pobierano płyn. Płyn wirowano przy 1500 g przez 20 minut w 4°C i ponownie zawieszano w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej. Zawartość białka w supernatancie z płynu po płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym oznaczano metodą Lowry'ego i wsp., J. Biol. Chem. 1193: 265-275 (1951) z bydlęcą albuminą surowiczą jako wzorcem. Całkowitą liczbę leukocytów z komórek w zawiesinie określano w liczniku Coultera (Coulter Electronics, Hialeah, FL).

Oznaczenie hydroksyproliny

Płuca zwierząt stosowanych do badań biochemicznych poddawano perfuzji in situ przez prawą komorę lodowato zimnym izotonicznym roztworem soli fizjologicznej, aby wypłukać krew z naczyń płucnych przez otwór w lewym przedsionku. Płaty płuc szybko wypreparowano z tkanki niemiąższowej, wrzucano do ciekłego azotu w celu szybkiego zamrożenia i przechowywano w -80°C. Zamrożone płuca później rozmrażano i homogenizowano w 0,1 M KCl, 0,02 M buforze Tris (pH 7,6) homogenizatorem Polytron. Zawartość hydroksyproliny w homogenacie płuc jako miarę zawartości kolagenu określono ilościowo za pomocą techniki Woessner, Arch. Biochem. Biophys. 93:440-447 (1961).

Badania histopatologiczne

Po płukaniu płuc otwierano klatkę piersiową i usuwano razem serce i płuca. Do płuc zakraplano utrwalacz 1% glutaraldehyd-paraformaldehyd w 0,12 M buforze kakodylowym, przy 400 mOsm przy ciśnieniu 30 cm słupa H2O. Płuca utrwalano przy tym ciśnieniu przez około 2 godziny, a następnie przechowywano w tym utrwalaczu z zamkniętymi tchawicami. Przed zatopieniem płuco izolowano od serca i całej niepłucnej tkanki przez tępe odcięcie i usuwano. Bloki tkanki wycinano z przynajmniej dwóch strzałkowych skrawków (grubość 2-3 mm) z prawego czaszkowego, prawego ogonowego, i lewych płatów każdego płuca. Każdy blok cięto na powierzchnię około 1 cm². Bloki odwadniano w serii roztworów etanolu o stopniowanych stężeniach i zatapiano w parafinie. Z bloków parafiny cięto krawki (grubość 5 mM) i barwiono hematoksyliną i eozyną dla oceny histologicznej.

Analiza danych i interpretacja

Dane są analizowane jako wartości średnie z odchyleniami standardowymi median. Do oceny istotności różnic między grupami kontrolnymi i badanymi stosuje się test t-Studenta, rozkład chikwadrat, współczynniki korelacji, analiza wariancji (ANOVA) i test wielokrotnego porównania przy użyciu komputerowego pakietu statystycznego (SAS/STAT Guide, wyd.6, Cary, N.C. str. 183-260 (1985)).

Wyniki

W tym badaniu testowano hipotezę, że neutralizujące przeciwciało dla integryny α1β1 (antya1e1) obniża indukowane przez bleomycynę (BL) zwłóknienie płuc in vivo. Myszy samce C57/BL6 otrzymują dotchawiczo (IT) sól fizjologiczną (SA) lub BL w ilości 0,08 U w 0,1 ml, a następnie śródotrzewnową

PL 198 975 B1 iniekcję przeciwciała (100 μg w 0,2 ml) trzy razy w tygodniu. Dwadzieścia jeden dni po zakropleniu IT myszy zabijano w celu badania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL), analizy biochemicznej i histopatologicznej.

Histopatologiczne badanie płuc

Oczekiwano, że myszy traktowane solą fizjologiczną i kontrolnym IgG nie będą miały widocznych uszkodzeń i będą wykazywały przegrody z normalnym cienkim wyglądem. Przeciwnie, myszy traktowane bleomycyną i kontrolnym IgG będą miały uszkodzenia od wieloogniskowych położonych w proksymalnych gronkach do rozmieszczenia rozproszonego, które czasem obejmowało opłucną. Oczekiwano, że płuca myszy traktowanych bleomycyną i przeciwciałami przeciw integrynie alfa1 będą wyglądały bardziej podobnie do Grupy B (powyżej). Oczekiwano, że zwierzęta grupy D będą wykazywały tylko ograniczoną liczbę włóknistych uszkodzeń, z umiarkowanym zgrubieniem błon i niewielkimi agregatami komórek jednojądrzastych.

Choć powyższy wynalazek opisano dość szczegółowo w celu ilustracji i przykładu dla jasności zrozumienia, oczywiste jest dla specjalistów w dziedzinie, że można wykonać pewne zmiany i modyfikacje. Zatem opis i przykłady nie powinny być rozumiane jako ograniczenie zakresu wynalazku, który jest określony w załączonych zastrzeżeniach.

Claims (13)

1. Zastosowanie kompozycji zawierającej homolog przeciwciała, który jest antagonistą interakcji między integryną niosącą podjednostkę alfa4 a ligandem dla integryny niosącej podjednostkę alfa4, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia zwłóknienia u pacjenta.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że zwłóknienie jest zwłóknieniem narządu wewnętrznego.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że narządem wewnętrznym jest wątroba, płuco, nerka, naczynia krwionośne serca lub przewód żołądkowo-jelitowy.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest przeznaczona do podawania pacjentowi cierpiącemu z powodu zwłóknienia płuc, zwłóknienia szpiku, marskości wątroby, rozplemowego mezangialnego zapalenia kłębuszków nerkowych, zapalenia kłębuszków nerkowych z tworzeniem półksiężyców, nefropatii cukrzycowej, zwłóknienia środmiąższowego nerek lub nefropatii towarzyszącej HIV.

5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że zwłóknienie jest zwłóknieniem skóry.

6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest przeznaczona do podawania pacjentowi cierpiącemu z powodu twardziny skóry, ograniczonej twardziny skóry, bliznowca, hipertroficznej blizny, rodzinnej skórnej kolagenomy, lub znamienia z tkanki łącznej typu kolagenowego.

7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że zwłóknienie jest zwłóknieniem oka.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest przeznaczona do podawania pacjentowi cierpiącemu z powodu retinopatii cukrzycowej, bliznowacenia pooperacyjnego, rozrostowej witreoretinopatii.

9. Zastosowanie według zastrz. 1-8, znamienne tym, że kompozycja zawiera homolog przeciwciała anty-alfa4.

10. Zastosowanie według zastrz. 1-9, znamienne tym, że homolog przeciwciała jest przeciwciałem humanizowanym, ludzkim lub chimerowym.

11. Zastosowanie według zastrz. 1-10, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna jest sformułowana do podawania:

(a) w dawce od 0,1 mg/kg na dzień do 10 mg/kg na dzień;

(b) przez okres dawkowania od jednego do czternastu dni; i (c) w ilości wystarczającej do utrzymania w osoczu poziomu homologu przeciwciała 1 mg/ml lub większego.

12. Zastosowanie według zastrz. 1-11, znamienne tym, że homolog przeciwciała jest humanizowanym mysim przeciwciałem 21-6.

13. Zastosowanie według zastrz. 1-12, znamienne tym, że pacjentem jest człowiek.