NO330221B1

NO330221B1 - Anvendelse av en antagonist for integrin <alfa>-4-subenheten for fremstilling av et medikament til behandling av fibrose

Info

Publication number: NO330221B1
Application number: NO20015122A
Authority: NO
Inventors: Roy R Lobb; Philip Gotwals
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 2001-10-19
Publication date: 2011-03-07
Also published as: BG106118A; KR20070050979A; ATE298249T1; CN100360183C; GEP20063844B; IS6105A; IL145898A; US20040037827A1; YU74901A; EE200100549A; ES2243259T3; NO20015122D0; WO2000064474A1; JP2014065747A; EA200101116A1; CN1596979A; JP2002542300A; CN1356911A; KR20070102760A; CN1679935A

Description

Fibronektin og kollagen er proteiner som er essensielle for å holde i urørt tilstand den ekstracellulære matriks som fins i bindevev. Produksjonen of disse proteiner er en høyst regulert prosess, og forstyrrelse av den kan føre til utvikling av vevsfibrose. Mens dannelsen av fibrøst vev er en del av den normale gunstige helbredende prosess etter skade, er der i noen tilfeller en abnorm akkumulering av fibrøse materialer slik at det til slutt kan føre til organsvikt (Border et al. (1994) New Engl. J. Med. 331: 1286-1292). Skade på et organ fører til en stereotypisk fysiologisk respons: blodplateindusert hemostase, etterfulgt av en tilstrømming av inflammatoriske celler og aktiverte fibroblaster. Cytokiner avledet fra disse celletyper styrer dannelsen av ny ekstracellulær matriks og nye blod-kar (granulasjonsvev). Generering av granulasjonsvev er et nøyaktig organisert program hvori ekspresjonen av protease-inhibitorer og ekstracellulære matriksproteiner oppregule-res, og ekspresjonen av proteaser reduseres, hvilket fører til akkumulering av ekstracellulær matriks.

Sentralt i utviklingen av fibrotiske tilstander, enten de er indusert eller spontane, er stimulering av fibroblast-aktivitet. Tilstrømmingen av inflammatoriske celler og aktiverte fibroblaster til det skadede organ avhenger av disse celletypers evne til å samhandle med den interstitielle matriks hovedsakelig bestående av fibronektin og kollagen. Disse vekselvirkninger celle-celle eller celle-ekstracellulær matriks medieres ved hjelp av flere familier av celleadhesjonsmolekyler, og en slik familie omfatter integrinene. Integriner er strukturelt og funksjonelt beslektede glykoproteiner bestående av forskjellige alfa

(alfal, alfa 2, opp til alfall for tiden) og beta(beta 1 og beta 7)-heterodimere transmembranreseptordomener som fins i forskjellige kombinasjoner på praktisk talt alle pattedyrs-celletyper. (for overblikk se: E. C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox et al., "The Pharmacology of the Integrins." Medicinal Research Rev. Vol. 195 (1994) og V.

W. Engleman et al., "Cell Adhesion Integrins as Pharmaceu tical Targets" i Ann, Revs.Medicinal Chemistry, Vol. 31, J. A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, s. 191). To alfa4-subenhetinneholdende integriner er blitt beskrevet og er betegnet alfa4betal (VLA-4) og alfa4beta7.

Interstitiell pulmonar fibrose (IPF) er den endelige reaksjonsgang for mange interstitielle lungesykdommer som fører til en reduksjon i lungeelastisitet og svekkelse av den vitale gassutvekslingsfunksjon. Uten hensyn til etiolo-gien, karakteriseres IPF ved inflammatoriske og fibropro-liferative forandringer i lungene og altfor stor akkumulering av kollagen i interstitium. Pasienter med IPF oppviser vanligvis nærvær av aktiverte immune og inflammatoriske celler under aktiv pulmonar fibrose hvilket indikerer at pulmonar fibrose er resultatene av avvikende utbedring etter en initiell inflammatorisk skade. Aktiverte inflammatoriske celler er antakelig involvert i den initielle skade i mange tilfeller. Dessuten kan disse celler spille en kompleks rolle i reguleringen av helbredelsesprosessen. Uansett kan aktiveringen av immune og inflammatoriske celler i lungene spille en viktig rolle i bestemmelsen av den fibrotiske respons. Tilstrømmingen av inflammatoriske celler og aktiverte fibroblaster til den skadede lunge avhenger av disse celletypers evne til å samvirke med komponenter av ECM. Leukocyttenes ferdsel og aktiveringstilstand moduleres av forskjellige integriner. Forhindring av tilstrømmingen av inflammatoriske celler til lungene kan være kritisk når det gjelder å styre den påfølgende fibrotiske respons.

Mange av sykdommene forbundet med proliferasjon av fibrøst vev er både kronisk og ofte svekkende, inklusive for eksempel hudsykdommer så som skleroderma. Noen, inklusive pulmonar fibrose, kan være fatale, delvis på grunn av det fak-tum at de for øyeblikket tilgjengelige behandlinger for denne sykdom har signifikante bivirkninger og er vanligvis ikke virkningsfulle når det gjelder å utsette eller stanse utviklingen av fibrose [Nagler et al. 1996, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 154:1082-86]. Følgelig er der et kontinuerlig behov for nye anti-fibrotiske midler.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Vi har undersøkt den eventuelle rolle som antagonister av alfa 1- og alfa4-subenhet-inneholdende integriner har i fibrosens patogenese ved å administrere en antagonist av et alfal- eller alfa4-subenhetinneholdende integrin til mus med lungefibrose. Den gunstige virkning som disse antagonister har på både total kollagenakkumulering og graden av pulmonare fibrotiske lesjoner, som vist i foreliggende beskrivelse, antyder at de alfal- og/eller alfa4-subenhet-inneholdende integriner kan være et rimelig mål for antifibrotisk terapi. Ett aspekt av oppfinnelsen er anvendelse av en sammensetning omfattende antistoff og antistoffhomologer derav som er en antagonist av en vekselvirkning mellom et alfa4-subenhet-bærende integrin og en ligand for et alfa4-subenhet-bærende integrin for fremstilling av medikamenter til behandling av fibrose. Antagonisten er et alfa4-integrinbindende middel eller et alfa4-integrinligandbindende middel. Foretrukne alfa4-integrinbindende midler er valgt fra gruppen bestående av; a) en antistoffhomolog som antagoniserer vekselvirkningen av både VLA-4 og alfa4beta7 med deres respektive alfa4-ligander; b) en antistoffhomolog som antagoniserer vekselvirkningen av VLA-4 med dens alfa4-ligand; og c) en antistoffhomolog som antagoniserer vekselvirkningen av alfa4beta7 med dens alfa4-ligand. I andre utførelsesformer velges antistoffhomologen fra gruppen bestående av et humant antistoff, et chimert antistoff, et humanisert antistoff og fragmenter derav.

De aktuelle medikamenter kan minske økninger i leukocytter indusert av fibrotiske lidelser i en prøve av bronkoalveolar lavagevæske. Det alfa4-integrinbindende middel kan eventuelt kodes av en nukleinsyresekvens omfattende en nukleinsyre som hybridiserer under flere stringensbetingelser til definerte nukleinsyresekvenser valgt fra gruppen av sekvenser i tabell 6 i U.S. Patent 5,840,299 eller komplementet av nevnte nukleinsyresekvenser. I andre aspekter kodes det alfa4-integrinbindende middel av en nukleinsyresekvens omfattende en nukleinsyre som hybridiserer under definerte stringensbetingelser til en nukleinsyresekvens som koder en polypeptidsekvens valgt fra gruppen bestående av definerte polypeptider som fins i U.S. Patent 5,932,214 eller produseres av cellelinje ATCC CRL 11175.

Det er tidligere kjent fra US patent 5.840.299 og WO 9718838 Al humaniserte immunoglobuliner og fragmenter derav som spesifikt binder til alfa-4-integrin (VLA-4-integrin) og blokkerer bindingen til VCAM-1 liganden. Slike antistoff anvendes til behandling av inflammatoriske sykdommer.

Fra WO 9711718 Al er det kjent inhibering av minst en integrinreseptor, hvor substanser med slik virkning kan anvendes ved behandling av fibrotiske lidelser.

Fra artikkelen "Adhesion molecule interactions in human glomerulonephritis, importance of the tubulointerstitium" av Roy-Chaudhury, P. et al (Kidney International, 1996, vol 49, nr 1, s. 127-134) er det kjent at anvendelsen av antistoff mot VLA-4 fører til en reduksjon i proteinuria når pasienten har en fibrotisk lidelse.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

I. Definisjoner

For klarere og mer konsist å påpeke substansen i den krevede oppfinnelse, angis følgende definisjoner for spesifikke uttrykk anvendt i følgende beskrivelse og krav. Integrinet av den meget sene antigen(VLA)-superfamilie består av strukturelt og funksjonelt beslektede glykoproteiner bestående av (alfa- og beta-)heterodimere, trans-membran-reseptormolekyler som fins i forskjellige kombinasjoner på nesten hver pattedyrscelletype. (for oversikter se: E. C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox et al., "The Pharmacology of the Integrins." Medicinal Research Rev. (1994) og V. W. Engleman et al., 'Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets.' i Ann. Report i Medicinal Chemistry, Vol. 31, J. A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, p. 191). Integriner av VLA-familien omfatter (for tiden) VLA-1, -2, -3, -4, -5, -6, -9, og -11 hvori hvert molekyl omfatter en ($l-kjede ikke-kovalent bundet hrmholdsvis til en alfa-kjede, (al, a2, a3, a4, a5, a6 og lignende).

Alfa4betal(a4pl)-integrinet er en celleoverflatisk reseptor for VCAM-1, fibronektin og muligens andre ligander (sistnevnte ligander individuelt og kollektivt omtalt som "alfa4-ligander)"). Uttrykket a4pl-integrin ("VLA-4" eller "a4bl" eller "alfa4betal-integrin", anvendt om hverandre) refererer således til polypeptider som er i stand til å bindes til VCAM-1 og medlemmer av de ekstracellulære matriksproteiner, spesielt fibronektin, eller homologer eller fragmenter derav, skjønt det vil være forståelig for personer med ordinære kunnskaper i faget at andre ligander for VLA-4 kan forekomme og kan analyseres under anvendelse av konvensjonelle metoder. Ikke desto mindre er det kjent at alfa4-subenheten vil forbindes med andre beta-subenheter i tillegg til betal, slik at vi kan definere uttrykket "alfa(a)4-integrin" eller "alfa(a)4-subenhet-inneholdende integrin" som de integriner hvis alfa4-subenhet forbindes med en eller annen beta-subenhet. Et annet eksempel på et "alfa4"-integrin i tillegg til VLA4 er alfa4beta7 (Se Lobb og Adams, supra). På lignende måte er et "alfal-integrin" eller "alfal-subenhet-inneholdende integrin" de integriner hvis alfal-subenhet forbindes med en eller annen beta-subenhet .

En integrin-"antagonist" omfatter enhver forbindelse som hemmer alfal- og/eller alfa4-subenhet-inneholdende integriner fra binding med en integrinligand og/eller reseptor. Anti-integrin-antistoff eller antistoffhomolog-inneholdende proteiner (omtalt nedenfor) samt andre molekyler så som løselige former av ligandproteinene for integriner er nyttige. Løselige former av ligandproteinene for alfa4-subenhet-inneholdende integriner omfatter løselige VCAM-1, VCAM-l-fusjonsproteiner eller bifunksjonelle VCAM-l/Ig-fusjonsproteiner. For eksempel kan en løselig form av en integrinligand eller et fragment derav administreres for å bindes til integrin, og fortrinnsvis konkurrere om et integrinbindende sete på cellene og dermed føre til virkninger som ligner administrasjonen av antagonister så som anti-integrin-antistoffer (f.eks. VLA-1, VLA-4). Spesielt er løselige integrinmutanter som binder liganden, men fremkaller ikke integrin-avhengig signalisering inkludert innenfor omfanget av oppfinnelsen. Slike integrinmutanter kan virke som kompetitive inhibitorer av integrinprotein av villtypen og betraktes som "antagonister".

Som omtalt heri, kan visse integrinantagonister være fusert eller på annen måte konjugert til for eksempel en an-tistof fhomolog, så som et immunoglobulin eller fragment derav og er ikke begrenset til en spesiell type eller struktur av et integrin eller ligand eller et annet molekyl. Således, anses ethvert middel som er i stand til å danne et chimerisk protein (som definert nedenfor), og som er i stand til å bindes til integrinligander, og som effektivt blokkerer eller dekker alfa4- og/eller alfal-subenhet-inneholdende integrin, for å være en ekvivalent av antagonister anvendt i eksemplene heri.

"Antistoffhomolog" omfatter intakte antistoffer bestående av immunoglobuliniske lette og tunge kjeder bundet via di-sulfidbindinger. Uttrykket "antistoffhomolog" er også ment å skulle omfatte et protein omfattende et eller flere polypeptider valgt fra immunoglobulinske lettkjeder, immuno-

globulinske tungkjeder og antigen-bindende fragmenter derav som er i stand til å bindes til et eller flere antigener

(dvs. integrin eller integrinligand). Polypeptidkomponenten av en antistoffhomolog sammensatt av mer enn ett polypeptid kan eventuelt være disulfidbundet eller på annen måte kovalent fornettet. Følgelig omfatter derfor "antistoffhomologer" intakte immunoglobuliner av typene IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (samt undertyper derav), hvori de lette kjeder av immu-noglobulinet kan være av typene kappa eller lambda. "Antistoffhomologer" omfatter også deler av intakte antistoffer som beholder antigen-bindingsspesifisiteten, for eksempel Fab-fragmenter, Fab'-fragmenter, F(ab')2-fragmenter, F(v)-fragmenter, tung- og lettkjedede monomerer eller dimerer eller blandinger derav.

"Humanisert antistoffhomolog" er en antistoffhomolog, produsert ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi, hvori noen eller alle aminosyrene i en human immunoglobulinsk lett eller tung kjede som ikke er nødvendig for antigenbinding, er blitt satt i stedet for de tilsvarende aminosyrer fra et ikke-humant pattedyrs immunoglobulinske lette eller tunge kjede. En "human antistoffhomolog" er en antistoffhomolog hvori alle aminosyrene i en immunoglobulinsk lett eller tung kjede (uten hensyn til om de er nødvendige for antigenbinding eller ikke) er av menneskeopprinnelse.

Anvendt heri er en "human antistoffhomolog" en antistoffhomolog produsert ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi, hvori alle aminosyrene av en immunoglobulinsk lett eller tung kjede er av menneskeopprinnelse.

En integrin-"agonist" omfatter enhver forbindelse som aktiverer integrinliganden.

"Aminosyre" er en monomer enhet av et peptid, polypeptid, eller protein. Det fins tyve aminosyrer i naturlig forekommende peptider, polypeptider og proteiner, som alle er L-

isomerer. Uttrykket omfatter også analoger av aminosyrene og D-isomerer av proteinaminosyrene og deres analoger.

"Kovalent koblet" betyr at de spesifiserte grupper av oppfinnelsen (f.eks. PEGylert alfa4- og/eller alfal-integrinantagonist, immunoglobulinfragment/ alfa4- eller alfal-integrinantagonist) er enten direkte kovalent bundet til hverandre, eller indirekte kovalent forbundet til hverandre via en intervenerende gruppe eller grupper, så som en distanserende gruppe eller grupper. Den intervenerende gruppe eller grupper kalles en "koblende gruppe". Uttrykket "konjugert" er anvendt om hverandre med "kovalent bundet". I denne henseende refererer en "distansegruppe" til en gruppe som kan være innføyd mellom en aminosyre eller en annen komponent av en integrinantagonist eller fragment og resten av molekylet. En distansegruppe kan tilveiebringe separasjon mellom aminosyren eller en annen komponent og resten av molekylet for å forhindre modifika-sjonen i å interferere med proteinfunksjonen og/eller gjøre det lettere for aminosyren eller en annen komponent å bindes med en annen gruppe.

"Ekspresjonskontrollsekvens"- en sekvens av polynukleotider som kontrollerer og regulerer ekspresjonen av genene når de operativt er bundet til disse gener.

"Ekspresjonsvektor"- et polynukleotid, så som et DNA-plas-mid eller bakteriofag (blant andre vanlige eksempler) som muliggjør ekspresjon av minst ett gen når ekspresjonsvek-toren er innført i en vertscelle. Vektoren kan eventuelt være i stand til å reprodusere i en celle.

"Funksjonell ekvivalent" av en aminosyrerest er (i) en aminosyre med lignende reaktive egenskaper som aminosyreresten som ble erstattet med den funksjonelle ekvivalent; (ii) en aminosyre av en antagonist ifølge oppfinnelsen, hvor aminosyren har lignende egenskaper som aminosyreresten som ble erstattet med den funksjonelle ekvivalent; (iii) et ikke-aminosyremolekyl med lignende egenskaper som aminosyreresten som ble erstattet med den funksjonelle ekvivalent .

Et første polynykleotid som koder en proteinaktig antagonist er "funksjonelt ekvivalent" sammenlignet med et andre nukleotid som koder antagonistproteinet, hvis det tilfredsstiller minst én av følgende betingelser: (a) : den "funksjonelle ekvivalent" er et første polynykleotid som hybridiserer til det andre nukleotid under standard hybridiseringsbetingelser og/eller degenereres til den før-ste polynukleotidsekvens. Mest foretrukket koder det et mutant protein med aktivitet som et integrinantagonist-protein; (b) den "funksjonelle ekvivalent" er et første polynykleotid som koder på ekspresjon for en aminosyresekvens kodet av det andre nukleotid.

Integrinantagonistene anvendt i oppfinnelsen omfatter, midlene opplistet heri samt deres funksjonelle ekvivalenter. Anvendt heri refererer uttrykket "funksjonell ekvivalent" derfor til en integrinantagonist eller et polynukleotid som koder integrinantagonisten som har den samme, eller bedre, gunstige virkning på mottageren som integrinantagonisten som den anses å være en funksjonell ekvivalent av. Som en fagkyndig person vil forstå, kan et funksjonelt ekvivalent protein være produsert ved hjelp av rekombinante teknikker, f.eks. ved å uttrykke et "funksjonelt ekvivalent DNA". På grunn av degenerasjonen av de nukleotidkodende sekvenser, kan andre polynukleotider anvendes for å kode integrinprotein. Disse omfatter alle, eller deler av ovennevnte sekvenser som endres ved substitusjon av forskjellige kodoner som koder den samme aminosyrerest innenfor sekvensen, og således fremkaller en stille forandring. Slike endrede sekvenser anses som ekvivalenter av disse sekvenser. For eksempel kodes Phe (F) for av to kodoner, TTC eller TTT, Tyr (Y) kodes for av TAC eller TAT, og His (H) kodes for av CAC eller CAT. På den annen side kodes Trp (W) for av et enkelt kodon, TGG. Følgelig vil man kunne forstå at for en gitt DNA-sekvens som koder et spesielt integrin, vil det være mange DNA-degenererte sekvenser som vil kode for den.

Uttrykket "chimerisk" når det refereres til en antagonist, betyr at antagonisten inkluderer en binding (kjemisk kryssbinding eller kovalent eller en annen type) av to eller flere proteiner med ulike strukturer og/eller av ulik opprinnelse. Således kan en chimerisk alfa4-integrinantagonist omfatte en gruppe som er en alfa4-integrinantagonist eller et fragment og en annen gruppe som ikke er en alfa4-integrinantagonist. En chimerisk alfal-integrinantagonist kan omfatte en gruppe som er en alfal-integrinantagonist eller et fragment og en annen gruppe som ikke er en alfal-integrinantagonist.

En art av "chimerisk" protein er en "fusjon" eller "fusjonsprotein" som refererer til en ko-lineær, kovalent binding av to eller flere proteiner eller fragmenter derav via deres individuelle peptidryggrader, mest foretrukket via genetisk ekspresjon av et polynukleotidmolekyl som koder disse proteiner. Således er foretrukne fusjonsproteiner chimeriske proteiner som omfatter en alfa4- (eller alfal) integrinantagonist eller et fragment kovalent bundet til en andre gruppe som ikke er en alfa4-(eller alfal) integrinantagonist. Foretrukne fusjonsproteiner kan omfatte deler av intakte antistoffer som beholder antigen-bindende spesifisitet, for eksempel Fab-fragmenter, Fab'-fragmenter, F(ab')2-fragmenter, F(v)-fragmenter, tungkjedede monomerer eller dimerer, lettkjedede monomerer eller dimerer, dimerer bestående av en tung og en lett kjede og lignende.

De mest foretrukne fusjonsproteiner er chimeriske og omfatter en integrinantagonistgruppe fusert eller på annen måte bundet til alle eller en del av de hengslede og konstante regioner av en immunoglobulinsk lett kjede, tung kjede eller begge deler. Således kan det benyttes et molekyl som omfatter: (1) en integrinantagonistgruppe, (2) et andre peptid, f.eks. ett som øker oppløseligheten eller in vivo-levetiden av integrinantagonistgruppen, f.eks. et medlem av immunoglobulin-superfamilien eller et fragment eller en del derav, f.eks. en del eller et fragment av IgG, f.eks. det humane IgGl-tungkjedede konstante område, f.eks. CH2, CH3 og hengselområder. Spesifikt er en "integrinantagonist/Ig-fusjon" et protein omfattende et biologisk aktivt integrinantagonistmolekyl ifølge oppfinnelsen (f.eks. en løselig VLA-4 eller VLA-l-ligand, eller et biologisk aktivt fragment derav bundet til en N-terminus av en immunoglobulinkjede hvori en andel av N-terminusen i im-munoglobulinet er erstattet med integrinantagonisten. En art av integrinantagonist/Ig-fusjon er en "integrin/Fc-fusjon" som er et protein omfattende en integrinantagonist bundet til minst en del av det konstante domene i et immunoglobulin. En foretrukken Fc-fusjon omfatter en integrinantagonist bundet til et fragment av et antistoff inneholdende det C-terminale domene av de tunge immunoglobulinkj eder.

Uttrykket "fusjonsprotein" betyr også en integrinantagonist kjemisk bundet via et mono- eller hetero-funksjonelt molekyl til en andre gruppe som ikke er en integrinantagonist (resulterende i et "chimerisk" molekyl) og er fremstilt på nytt fra renset protein som beskrevet nedenfor. Således kan et eksempel på et kjemisk bundet, i motsetning til rekombinant bundet, chimerisk molekyl, som er et fusjonsprotein, omfatte: (1) en alfa4-integrin-subenhet-innsiktende gruppe, f.eks. en VCAM-l-gruppe som er i stand til å bindes til VLA-4 på overflaten av VLA-4-bærende celler; (2) et andre molekyl som øker oppløseligheten eller in vivo levetiden for den innsiktende gruppe, f.eks. en polyalkylenglykolpolymer så som polyetylenglykol (PEG). Den alfa4-innsiktende gruppe kan være enhver naturlig forekommende alfa4-ligand eller et fragment derav, f.eks. et VCAM-1 peptid eller en lignende konservativt substituert aminosyresekvens.

"Heterolog promoter"- anvendt heri er en promoter som er ikke naturlig forbundet med et gen eller en renset nukleinsyre .

"Homologi"- anvendt heri er entydig med uttrykket "identitet" og refererer til sekvenslikheten mellom to polypeptider, molekyler eller mellom to nukleinsyrer. Når en posisjon i begge de to sammenlignede sekvenser er opptatt av den samme base eller aminosyremonomersubenhet (for eksempel hvis en posisjon i hver av de to DNA-molekyler er opptatt av adenin, eller en posisjon i hver av to polypeptider er opptatt av et lysin) , da er de respektive molekyler homologe i den posisjonen. Den prosentuelle homologi mellom to sekvenser er en funksjon av antallet avstemte eller homologe posisjoner som deles av de to sekvenser dividert med antallet sammenlignede posisjoner x 100. For eksempel hvis 6 av 10 av posisjonene i to sekvenser er avstemt eller er homologe, da er de to sekvenser 60% homologe. Som et eksempel deler DNA-sekvensene CTGACT og CAGGTT 50% homologi (3 av de 6 totale posisjoner er tilpas-set hverandre). Generelt gjøres en sammenligning når to sekvenser er innregulert for å gi maksimal homologi. En slik innregulering kan tilveiebringes ved for eksempel å anvende metoden beskrevet av Karlin og Altschul angitt mer detaljert nedenfor.

Homologe sekvenser deler identiske eller lignende aminosyrerester, hvor lignende rester er konservative substitusjoner for, eller "tillatte punktmutasjoner" av, tilsvarende aminosyrerester i en innregulert referansesekvens. I denne henseende er en "konservativ substitusjon" av en rest i en referansesekvens de substitusjoner som er fysikalsk eller funksjonelt nesten lik de tilsvarende referanse-rester, f.eks. som har en likedan størrelse, form, elek- trisk ladning, kjemiske egenskaper, inklusive evnen til å danne kovalente bindinger eller hydrogenbindinger eller lignende. Spesielt foretrukne konservative substitusjoner er de som oppfyller kriteriene definert for en "akseptert punktmutasjon" i Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Strckture, 5: Suppl. 3, chapter 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978).

"Homologi" og "identitet" er brukt om hverandre heri, og hver refererer til sekvenslikhet mellom to polypeptidsek-venser. Homologi og identitet kan bestemmes ved å sammen-ligne en posisjon i hver sekvens som kan innreguleres for sammenligningens skyld. Når en posisjon i den sammenlignede sekvens er opptatt av den samme aminosyrerest, da kan poly-peptidene omtales som identiske i den posisjonen; når det ekvivalente sete er opptatt av den samme aminosyre (f.eks. identisk) eller en lignende aminosyre (f.eks. lignende i sterisk og/eller elektronisk natur), da kan molekylene omtales som homologe i den posisjonen. En prosentandel av homologi eller identitet mellom sekvenser er en funksjon av antallet avstemte eller homologe posisjoner som deles av sekvensene. En "urelatert" eller "ikke-homolog" sekvens deler mindre enn 40 prosent identitet, skjønt fortrinnsvis mindre enn 25 prosent identitet, med en sammenlignet sekvens.

"Prosent homologi" i to aminosyresekvenser eller to nukleinsyresekvenser bestemmes under anvendelse av linjestil-lingsalgoritmen beskrevet av Karlin og Altschul (Proe. Nat. Acad. Sei., USA 87: 2264 (1990) modifisert av Karlin og Altschul (Proe. Nat. Acad. Sei., USA 90: 5873 (1993). En slik algoritme er innlemmet i NBLAST- eller XBLAST-program-mene av Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). BLAST-søkinger utføres med NBLAST-programmet, poengtall = 100, ordlengde = 12, for å oppnå nukleotidsekvenser som er homologe med en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen. BLAST-proteinsøkinger utføres med XBLAST-programmet, poengtall = 50, ordlengde = 3, for å oppnå aminosyresekvenser som er

homologe med et referansepolypeptid. For å oppnå linje-stillinger med mellomrom for sammenligninger, anvendes BLAST med mellomrom som beskrevet i Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389 (1997). Når BLAST og BLAST med mellomrom er i bruk, anvendes de normale parametere i de respektive programmer (XBLAST og NBLAST). Se http://www/ncbi.nim.nih.gov.

"Isolert" (anvendt om hverandre med " hovedsakelig ren") vedrørende en nukleinsyre dvs. polynukleotidsekvenser som koder integrinantagonister betyr et RNA eller DNA-polynukleotid, en del av det genomiske polynukleotid, cDNA eller syntetiske polynukleotid som, på grunn av sin opprinnelse eller manipulasjon: (i) ikke er forbundet med et helt polynukleotid som det er forbundet med i naturen (f.eks. er nærværende i en vertscelle som en ekspresjonsvektor, eller en andel derav); eller (ii) er bundet til en nukleinsyre eller en annen kjemisk gruppe og ikke som det er bundet i naturen; eller (iii) opptrer ikke i naturen. Med "isolert" menes videre en polynukleotidsekvens som er: (i) amplifi-sert in vitro ved for eksempel polymerasekjedereaksjon (PCR); (ii) syntetisert kjemisk; (iii) produsert rekombinant ved kloning; eller (iv) renset, så som ved spalting og gelseparasjon. Således er en "hovedsakelig ren nukleinsyre" en nukleinsyre som ikke er umiddelbart sammenhengende med

en eller begge de kodende sekvenser som den normalt er sammenhengende med i det naturlig forekommende genom av organ-ismen som nukleinsyren er avledet fra. Hovedsakelig rent DNA omfatter også et rekombinant DNA som er en del av et hybridgen som koder ytterligere integrinsekvenser.

"Isolert" (anvendt om hverandre med "hovedsakelig ren")-vedrørende polypeptider betyr et polypeptid eller en andel derav som, på grunn av sin opprinnelse eller manipulasjon: (i) er nærværende i en vertscelle som ekspresjonsprodukt av en andel av en ekspresjonsvektor; eller (ii) er bundet til et protein eller en annen kjemisk gruppe som det ikke er bundet til i naturen; eller (iii) opptrer ikke i naturen, for eksempel et protein som er kjemisk manipulert ved å tilføye eller tilsette minst én hydrofob gruppe til proteinet slik at proteinet er i en form som ikke fins i naturen. Med "isolert" menes videre et protein som er: (i) syntetisert kjemisk; eller (ii) uttrykt i en vertscelle og renset vekk fra forbundne og kontaminerende proteiner. Uttrykket betyr generelt et polypeptid som er blitt separert fra andre proteiner og nukleinsyrer som det naturlig forekommer sammen med. Fortrinnsvis er polypeptidet også separert fra substanser så som antistoffer eller gelmatrik-ser (polyakrylamid) som anvendes for å rense det.

"Multivalent proteinkompleks"- refererer til et mangfold av integrinantagonister (dvs. en eller flere). En anti-integrin-antistof fhomolog eller fragment kan være fornettet eller bundet til en annen antistoffhomolog eller fragment. Hvert protein kan være likt eller forskjellig, og hver antistoffhomolog eller fragment kan være lik eller forskjellig.

"Mutant" - enhver forandring i det genetiske materiale av en organisme, spesielt enhver forandring (dvs. delesjon, substitusjon, addisjon eller endring) i en "villtype"

(wild type) polynukleotidsekvens eller enhver forandring i et "villtype" (wild type) protein. Uttrykket "mutein" anvendes om hverandre med "mutant".

"Operativt bundet"- en polynukleotidsekvens (DNA, RNA) er operativt bundet til en ekspresjonskontrollsekvens når ekspresjonskontrollsekvensen kontrollerer og regulerer transkripsjonen og translasjonen av den polynukleotidsekvensen. Uttrykket "operativt bundet" omfatter å ha et passende startsignal (f.eks. ATG) foran polynukleotidsekvensen som skal uttrykkes, og opprettholde den korrekte leseramme for å muliggjøre ekspresjon av polynukleotidsekvensen under kontroll av ekspresjonskontrollsekvensen, og produksjon av det ønskede polypeptid kodet av polynukleotidsekvensen.

Et "farmakologisk middel", er definert som en eller flere forbindelser eller molekyler eller andre kjemiske substanser som administreres til et individ som påvirker virkningen av antagonisten. Uttrykket "farmakologisk middel" anvendt heri refererer til et slik middel(midler) som administreres under "kombinasjonsterapi" hvor antagonisten administreres enten før, etter eller simultant med administrasjon av et eller flere farmakologiske midler.

"Protein"- enhver polymer bestående hovedsakelig av en av de 20 aminosyrer. Skjønt "polypeptid" ofte er anvendt i

forbindelse med relativt store polypeptider, og "peptid" er ofte anvendt i forbindelse med små polypeptider, overlapper bruken av disse faguttrykk og varierer. Uttrykket "protein" anvendt heri refererer til peptider, proteiner og polypeptider, hvis intet annet er sagt.

Uttrykket "peptid(er)", "protein(er)" og "polypeptid(er)" anvendes om hverandre heri. Uttrykket "polynukleotidsekvens" og "nukleotidsekvens" er også anvendt om hverandre heri.

"Rekombinant", anvendt heri, betyr at et protein er avledet fra rekombinante, ekspresjonssystemer i pattedyr. Siden integrin ikke er glykosylert eller inneholder disulfidbind-inger, kan det uttrykkes i de fleste prokaryotiske og eukaryotiske ekspresjonssysterner.

Frasen "overflatisk aminosyre" betyr enhver aminosyre som utsettes for løsningsmiddel når et protein er foldet i sin native form.

"Hybridiseringsbetingelser" betyr generelt salt- og tem-peraturbetingelser hovedsakelig lik 0,5 X SSC til ca. 5 X SSC og 65^ for både hybridisering og vask. Uttrykket "standard hybridiseringsbetingelser" anvendt heri er derfor en operativ definisjon og omfatter en rekke hybridiseringsbetingelser. Ikke desto mindre omfatter "høystringens"-

betingelser hybridisering med plakkavskjermende buffer (0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll 400; 0,2% bovint serumalbumin, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 M NaCl; 0,1% natriumpyrofosfat; 1 % SDS); 10% dekstransulfat, og 100fig/ml denaturert, sonikert 1 akse sperma-DNA ved 65°C i 12-20 timer, og vasking med 75 mM NaCl/7,5 mM natriumcitrat (0,5 x SSC)/1% SDS ved 65°C. "Lav stringens"-betingelser omfatter hybridisering med plakkavskjermende buffer, 10% dekstransulfat og 110fig/ml denaturert, sonikert laksesperma-DNA ved 55°C i 12-20 timer, og vasking med 300 mM NaCl/30 mM natriumcitrat (2,0 X SSC)/1% SDS ved 55°C. Se også Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, Inc. New York, Sections 6,3,1-6,3,6, (1989).

En "terapeutisk sammensetning" anvendt heri er definert som omfattende antagonister og andre biologisk kompatible ingredienser. Den terapeutiske sammensetning kan inneholde eksipienser så som vann, mineraler og bærere så som protein.

"Et individ med en fibrotisk tilstand" refererer til, individer plaget av fibrose i et indre organ, individer plaget av en dermal fibroserende forstyrrelse, og individer plaget av fibrotiske tilstander i øynene. Fibrose av indre organer (f.eks. lever, lunger, nyrer, hjerteblodkar, det gastrointestinale system), opptrer i forstyrrelser så som pulmonar fibrose, myelofibrose, levercirrhose, mesangial proliferativ glomerulonefritt, "crescentic"

glomerulonefritt, diabetisk nefropati, renal interstitiell fibrose, renal fibrose i pasienter som får cyklosporin, og HIV-forbundet nefropati. Dermale fibroserende forstyrrelser omfatter skleroderma, morfea, keloider, hypertrofiske arr, kutan familiekollagenoma og bindevevsnevuser av kollagen-typen. Fibrotiske tilstander i øynene omfatter tilstander så som diabetisk retinopati, postkirurgisk arrdannelse (for eksempel etter glaukomfUtrerende kirurgi og etter skjeløyd-kirurgi) , og proliferativ vitreoretinopati. Ytterligere fibrotiske tilstander omfatter: rheumatoid

artritt, sykdommer forbundet med forlengede leddsmerter og forringede ledd; progressiv systemisk sklerose, polymyositis, dermatomyositis, eosinofil fasciitt, morfea, Raynauds syndrom og nasal polypose. Dessuten omfatter behandling av fibrotiske tilstander også å hemme overproduksjon av arrdannelse i pasienter som er kjent for å danne keloider eller hypertrofiske arr, å hemme eller forebygge arrdannelse eller overproduksjon av arrdannelse under helbredelsen av forskjellige typer av sår inklusive kirurgiske snitt, kirurgiske underlivssår og traumatiske sønderrivinger, å forebygge eller hemme arrdannelse og lukking på nytt av arterier etter koronar angioplasti, å forebygge eller hemme altfor stor arrdannelse eller dan-nelse av fibrøst vev forbundet med hjertefibrose etter in-farkt og i hypersensitiv vaskulopati.

En "effektiv mengde" er en mengde som er tilstrekkelig for å ha gunstige eller ønskede resultater. En effektiv mengde kan administreres i et eller flere administrasjoner. Når det gjelder behandling, er en "effektiv mengde" av en antagonist en mengde som er tilstrekkelig for å lindre, forbedre, stabilisere, reversere, sinke eller forhale progresjonen av en fibrotisk tilstand i henhold til akseptable standarder for forstyrrelsene som skal behandles. Påvisning og måling av indikatorer på effektivitet kan måles ved hjelp av et antall tilgjengelige diagnostiske verktøy, inklusive for eksempel ved fysikalsk bedømmelse som omfatter blodprøver, pulmonare funksjonstester og bryst-røntken; CT-avsøking; bronkoskopi; bronkoalveolar lavage; lungebiopsi og CT-avsøkning.

I fremstilling av de aktuelle forbindelser og sammensetninger vil man anvende, hvis intet annet er sagt, konvensjonelle teknikker innen cellebiologi, cellekultur, molekylbiologi, mikrobiologi, rekombinant DNA, proteinkjemi, farmakologi og immunologi, som er innenfor fagkunnskapen. Slike teknikker er beskrevet i litteraturen.

II. Beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer

Foreliggende søknad er rettet på oppdagelsen at antagonister til alfal- og/eller alfa4-subenhet-inneholdende integriner og fragmenter derav kan anvendes for fremstilling av medikamenter til behandling av pulmonar fibrose.

A. Integrinantagonister

For utførelsen av oppfinnelsen kan en integrinantagonist være en antagonist av enhver vekselvirkning mellom et integrin og dets kognate ligand eller reseptor slik at den normale funksjon indusert ved ligand-reseptorvekselvirkninger endres (dvs. forhindres eller forhales eller på annen måte modifiseres). En foretrukken utførelsesform av en integrinantagonist er en antagonist av vekselvirkninger av alfa4-integriner med deres ligander, så som VCAM-l/VLA-4-vekselvirkningen. Dette er et middel, f.eks. et polypeptid eller et annet molekyl, som kan hemme eller blokkere VCAM-1-og/eller VLA-4-mediert binding eller som kan på annen måte modulere VCAM-1- og/eller VLA-4-funksjonen, f.eks. ved å hemme eller blokkere VLA-4-ligand-mediert VLA-4-signal-transduksjon eller VCAM-l-ligand-mediert VCAM-l-signal-transduksjon, og som er effektiv i behandlingen av akutt hjerneskade, fortrinnsvis på samme måte som anti-VLA-4-antistoffer.

En antagonist av VCAM-1/VLA-4-vekselvirkningen er et middel som har et eller flere av følgende egenskaper: (1) det belegger, eller bindes til, VLA-4 på overflaten av en VLA-4-bærende celle (f.eks. en endotel celle) med tilstrekkelig spesifisitet til å hemme en VLA-4-ligand/VLA-4-vekselvirkning, f.eks. VCAM-1/VLA-4-vekselvirkningen; (2) det belegger, eller bindes til, VLA-4 på overflaten av en VLA-4-bærende celle (dvs. en lymfocytt) med tilstrekkelig spesifisitet til å modifisere, og fortrinnsvis til å hemme, transduksjon av et VLA-4-mediert signal f.eks. VLA-4/VCAM-1-mediert signalisering; (3) det belegger, eller bindes til, en VLA-4-ligand, (f.eks. VCAM-1) på endotele celler med tilstrekkelig spesifisitet til å hemme VLA-4/VCAM-1-vekselvirkningen; (4) det belegger, eller bindes til, en VLA-4-ligand (f.eks. VCAM-1) med tilstrekkelig spesifisitet til å modifisere, og fortrinnsvis til å hemme, transduksjon av VLA-4-ligandmediert VLA-4 signalisering, f.eks. VCAM-1-mediert VLA-4-signalisering. I foretrukne utførelsesformer har antagonisten en eller begge egenskaper 1 og 2. I andre foretrukne utførelsesformer har antagonisten en eller begge egenskaper 3 og 4. Dessuten kan mer enn én antagonist anvendes, f.eks. kan et middel som bindes til VLA-4, kombineres med et middel som bindes til VCAM-1.

Som omtalt heri, er antagonistene som anvendes ikke begrenset til en spesiell type eller struktur av molekyl, slik at, for utøvelse av oppfinnelsen og bare som eksempel, ethvert middel som er i stand til å bindes til alfa4-integriner (f.eks. VLA-4) på overflaten av celler eller til en alfa4-ligand så som VCAM-1 på overflaten av alfa4-ligand-bærende celler), og som effektivt blokkerer eller belegger et alfa4-integrin (f.eks. VLA-4) eller en alfa4-ligand (f.eks. VCAM-1), kalt et "alfa4-integrinbindende middel" og "alfa4-integrinligandbindende middel" respektive), anses å være en ekvivalent av antagonistene som anvendes i eksemplene heri.

For eksempel er antistoffer eller antistoffhomologer (omtalt nedenfor) samt løselige former av de naturlig bindende proteiner for VLA-4 og VCAM-1 nyttige. Løselige former av de naturlig bindende proteiner for VLA-4 omfatter løselige VCAM-l-peptider, VCAM-l-fusjonsproteiner, bifunksjonelle VCAM-l/Ig-fusjonsproteiner (f.eks. "chimeriske" molekyler, omtalt ovenfor), fibronektin, fibronektin med en alternativt spleisende ikke-type III-koblende segment, og fibronektinpeptider inneholdende aminosyresekvensen EILDV eller en lignende konservativt substituert

aminosyresekvens. Løselige former av de naturlig bindende proteiner for VCAM-1 omfatter løselige VLA-4-peptider, VLA-

4-fusjonsproteiner, bifunksjonelle VLA-4/Ig-fusjonsproteiner og lignende. Anvendt heri er et "løselig VLA-4-peptid" eller et "løselig VCAM-l-peptid" et VLA-4-eller VCAM-1-polypeptid som ikke er istand til å forankre seg i en membran. Slike løselige polypeptider omfatter, for eksempel VLA-4- og VCAM-polypeptider som mangler en tilstrekkelig andel av sitt membranomspennende domene for å forankre polypeptidet eller er modifisert slik at det membranomspennende domene er ikke-funksjonelt. Disse bindende midler kan virke ved å konkurrere med det celleoverflatisk bindende protein for VLA-4 eller ved på annen måte å endre VLA-4-funksjon. For eksempel kan en løselig form av VCAM-1 (se f.eks. Osborn et al. 1989, Cell, 59: 1203-1211) eller et fragment derav administreres for å bindes til VLA-4, og fortrinnsvis konkurrere om et VLA-4-bindende sete på VCAM-1-bærende celler, derved føre til virkninger som ligner administrasjonen av antagonister så som små molekyler eller anti-VLA-4-antistoffer.

1. Anti-integrin-antistoffhomologer

I andre foretrukne utførelsesformer er antagonistene som anvendes for å bindes til, inklusive blokkere eller belegge, celleoverflatisk alfal- og/eller alfa4-integrin (så som VLA-1, VLA-4 eller alfa4beta7) og/eller en celleoverflatisk ligand for alfal- og/eller alfa4-integrin (så som kollagen henholdsvis VCAM-1) et anti-VLA-1 eller anti-VLA-4 og/eller anti-kollagen- og/eller anti-VCAM-1-monoklonalt antistoff eller antistoffhomolog, som definert tidligere. Foretrukne antistoffer og homologer omfatter humane antistoffhomologer, humaniserte antistoffhomologer, chimeriske antistoffhomologer, Fab-, Fab'-, F(ab')2- og F(v)-antistofffragmenter, og monomerer eller dimerer av antistofflige tunge eller lette kjeder eller blandinger derav. Monoklonale antistoffer mot VLA-4 er et foretrukket bindende middel.

B. Metoder for fremstilling av anti-integrin-antistoffhomologer

Teknologien for å fremstille monoklonale antistoffer, inklusive for eksempel monoklonale anti-integrin-antistoffer er velkjent. Se for eksempel Mendrick et al. 1995, Lab. Invest. 72:367-375 (mAbs til murint anti-alfil og anti-a2pl) ; Sonnenberg et al. 1987 J. Biol. Chem. 262:10376-10383 (mAbs til murint anti-a6pl) ; Yao et al. 1996, J Cell Sei 1996

109:3139-50 (mAbs til murint antia7pl); Hemler et al. 1984, J Immunol 132:3011-8 (mAbs til humant aipi); Pischel et al. 1987 J Immunol 138:226-33 (mAbs til humant a5pi); Wayner et al. 1988, J Cell Biol 107:1881-91 (mAbs til humant a3<p>l); Hemler et al. 1987 J Biol Chem 262:11478-85 (mAbs til humant a4pl); Wayner et al. 1988 J Celle Biol 107:1881-91 (mAbs til humant a5pl) ; Sonnenberg et al. 1987, J. Biol. Chem. 262:10376-10383 (mAbs til humant a6pi); A Wang et al. 1996 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:664-672 (mAbs til humant (a9pl) ; Davies et al. 1989 J Celle Biol 109:1817-26 (mAbs til humant avpi); Sanchez-Madrid et al. 1982, Proe Nati Acad Sei USA 79:7489-93 (mAbs til humant aL<p>2); Diamond et al. 1993, J Cell Biol 120:1031-43 (mAbs til humant aMp2); Stacker et al. 1991 J Immunol 146:648-55 (mAbs til humant axp2); Van der Vieren et al 1995 Immunity 3:683-90 (mAbs til humant aDp2) ; Bennett et al. 1983 Proe Nati Acad Sei USA 80:2417-21 (mAbs til humant allbp3); Hessle et al. 1984, Differentiation 26:49-54 (mAbs til humant a6P4); Weinacker et al. 1994 J Biol Chem 269:6940-8 (mAbs til humant av<p>5); Weinacker et al. 1994 J Biol Chem 269:6940-8 (mAbs til humant av<p>6); Cerf-Bensussan et al 1992 Eur J Immunol 22:273-7 (mAbs til humant aEp7); Nishimura et al. 1994 J Biol Chem 269:28708-15 (mAbs til humant aVp8); Bossy et al. 1991 EMBO J 10:2375-85 (polyklonale antisera til humant a8pi); Camper et al. 1998 J. Biol. Chem. 273:20383-20389 (polyklonale antisera til humant alOpl) .

De foretrukne integrin-antagonister vurdert heri kan uttrykkes fra intakte eller avkortede genomiske eller cDNA eller fra syntetiske DNA'er i prokaryotiske eller eukaryotiske vertsceller. De dimere proteiner kan isoleres fra kulturmediene og/eller foldes på nytt og dimeriseres in vitro for å danne biologisk aktive sammensetninger. Heterodimerer kan dannes in vitro ved å kombinere separate, distinkte polypeptidkjeder. Alternativt kan heterodimerer dannes i en enkelt celle ved å ko-utrykke nukleinsyrer som koder separate, distinkte polypeptidkjeder. Se for eksempel W093/09229 eller U.S. Pat. No. 5,411,941 for flere eksempler på rekombinante heterodimere proteinproduksjonsproto-koller. For tiden omfatter foretrukne vertsceller, prokaryoter inklusive E. coli, eller eukaryoter inklusive gjær, Saccharomyces, insektceller eller pattedyrsceller, så som CHO-, COS- eller BSC-celler. En person med ordinære kunnskaper i faget vil kunne forstå at andre vertsceller med fordel kan anvendes.

For eksempel kan anti-VLA-4 antistoffer identifiseres ved immunopresipitering av<125>I-merkede cellelysater fra VLA-4-uttrykkende celler. (Se Sanchez-Madrid et al. 1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343-1349 og Hemler et al. 1987, J. Biol. Chem., 262, 11478-11485). Anti-VLA-4-antistoffer kan også identifiseres ved strømningscytometri, f.eks. ved å måle fluorescerende farving av Ramos-celler inkubert med et antistoff som antas å gjenkjenne VLA-4 (se Elices et al., 1990 Cell, 60: 577-584). Lymfocyttene anvendt i produksjonen av hybridomaceller isoleres vanligvis fra immuniserte pattedyr hvis serum allerede har testet positivt med hensyn til nærvær av anti-VLA-4-antistoffer under anvendelse av slike isolerende tester.

Vanligvis er den immortale cellelinje (f.eks. en myeloma-cellelinje) avledet fra den samme pattedyrart som lymfocyttene. Foretrukne immortale cellelinjer er murine myelo-macellelinjer som er følsomme overfor kulturmedium inneholdende hypoxantin, arninopterin og tymidin ("HAT-medium"). Vanligvis fuseres HAT-følsomme murine myelomaceller til murine splenocytter under anvendelse av polyetylenglykol med molekylvekten 1500 ("PEG 1500"). Hybridomaceller som er resultatet av fusjonen, velges deretter under anvendelse av HAT-medium, som dreper ufuserte og uproduktivt anvendte myelomaceller (uanvendte splenocytter dør etter flere dager, fordi de ikke transformeres). Hybridomaceller som produserer et ønsket antistoff, påvises ved å utsortere hybridomakultursupernatantene. For eksempel kan hybridomer fremstilt for å produsere anti-VLA-4-antistoffer utsorteres ved å teste hybridomakultursupernatanten med hensyn til ut-skilte antistoffer som har evne til å bindes til en rekombinant alfa4-subenhet-uttrykkende cellelinje (se Elices et al., supra).

For å produsere anti-VLA-4-antistoffhomologer som er intakte immunoglobuliner, ble hybridomaceller som testet positivt i slike isolerende tester dyrket i et næringsme-dium under betingelser og for tilstrekkelig lang tid til å få hybridomacellene til å utskille de monoklonale antistoffer i kulturmediet. Vevskulturteknikker og kulturmedier som er egnet for hybridomaceller, er velkjent. Den kondisjon-erte hybridomakultursupernatant kan oppsamles og anti-VLA4-antistoffene eventuelt videre renses ved hjelp av velkjente metoder.

Alternativt kan det ønskede antistoff produseres ved å injisere hybridomacellene i det peritoneale hulrom i en uimmunisert mus. Hybridomacellene prolifererer i det peritoneale hulrom og utskiller antistoffet som akkumulerer som ascitesvæske. Antistoffet kan høstes ved ta ut ascites-væsken fra det peritoneale hulrom med en sprøyte.

Flere murine anti-VLA-4-monoklonale antistoffer er blitt beskrevet tidligere. Se f.eks. Sanchez-Madrid et al., 1986, supra; Hemler et al., 1987, supra; Pulido et al., 1991, J. Biol. Chem., 266 (16), 10241-10245); Issekutz og Wykre-towicz, 1991, J. Immunol., 147: 109 (TA-2 mab). Disse anti- VLA-4-monoklonale antistoffer og andre anti-VLA-4-antistoffer (f.eks. U.S. Patent 5,888,507- Biogen, Inc. og referan-ser angitt der) som er i stand til å gjenkjenne alfa-og/eller betakjeden i VLA-4, vil være nyttige. AntiVLA-4-antistoffer som vil gjenkjenne VLA-4alfa4-kjede-epitopene involvert i bindingen til VCAM-1 og fibronektin-ligander (dvs. antistoffer som kan bindes til VLA-4 ved et sete involvert i ligandgjenkjennelse og blokkere VCAM-1 og fi-bronektinbinding) , er foretrukket. Slike antistoffer er blitt definert som B-epitop-spesifikke antistoffer (Bl eller B2) (Pulido et al., 1991, supra) og er også anti-VLA-4-antistoffer.

Fullstendig humane monoklonale antistoffhomologer mot VLA-4 er et annet foretrukket bindende middel som kan blokkere eller belegge VLA-4-ligander. I sin intakte form kan disse fremstilles under anvendelse av in vitro-primede humane splenocytter, som beskrevet av Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147, 86-95. Alternativt kan de fremstilles ved repertoarkloning som beskrevet av Persson et al., 1991, Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 88: 2432-2436 eller av Huang og Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236. U.S. Patent 5,798,230 (Aug. 25, 1998, "Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use") som beskriver fremstilling av humane monoklonale antistoffer fra humane B-celler. I henhold til denne prosess immortaliseres humane antistoff-produserende B-celler ved infeksjon med et Epstein-Barr-virus, eller et derivat derav, som uttrykker Epstein-Barr-virus nuklear-antigen 2 (EBNA2). EBNA2-funksjonen, som er nødvendig for immortalisering, stenges deretter, hvilket resulterer i en økning i antistoffproduksjonen.

I enda en annen fremgangsmåte for fremstilling av fullt ut humane antistoffer beskriver Amerikas forente staters

Patent 5,789,650 (4. august 1998, " Transgene ikke-humane dyr for fremstilling av heterologe antistoffer") transgene ikke-humane dyr som er i stand til å produserende hetero loge antistoffer og transgene ikke-humane dyr med uakti-verte endogene immunoglobulingener. Endogene immunoglobulingener undertrykkes av antisense-polynukleotider og/eller ved antiserum rettet mot endogene immunoglobuliner. Heterologe antistoffer kodes av immunoglobulingener som normalt ikke fins i genomet i den arten av ikke-humant dyr. Et eller flere transgener inneholdende sekvenser av urearrangerte heterologe humane immunoglobulinske tungkjeder innføres i et ikke-humant dyr og danner derved et transgent dyr som er i stand til å funksjonelt rearrangere transgene immunoglobulinsekvenser og produsere et repertoar av antistoffer av forskjellige isotyper kodet av humane immunoglobulingener. Slike heterologe humane antistoffer produseres i B-celler som deretter immortaliseres, f.eks. ved fusering med en immortaliserende cellelinje så som et myelom eller ved manipulering av slike B-celler ved hjelp av andre teknikker for å forevige en cellelinje som er i stand til å produsere en monoklonal heterolog, fullt ut human antistoffhomolog.

Store ikke-immuniserte humane bakteriofag-oppvisende sam-linger kan også anvendes for å isolere høyaffinitets-antistoffer som kan utvikles som terapeutika for mennesker under anvendelse av standard bakteriofagteknologi (Vaughan et al, 1996) .

Enda et annet foretrukket bindende middel som kan blokkere eller belegge integrinligander, er en humanisert rekombinant antistoffhomolog med anti-integrin-spesifisitet. Ved å følge de tidligere metoder for fremstilling av riktige "chimeriske antistoffer" (hvor alle konstante og alle variable regioner er avledet fra forskjellige kilder), ble en ny problemløsning beskrevet i EP 0239400 (Winter et al.) hvorved antistoffer endres ved substitusjon (innenfor et gitt variabelt område) av deres komplementaritsbestemmende regioner (CDR/er) for én art med de tilsvarende regioner fra en annen. Denne prosess kan anvendes for eksempel for å substituere CDR'ene fra humane tung- og lettkjedede Ig-variable regiondomener med alternative CDR'er fra murine variable regiondomener. Disse endrede Ig-variable regioner kan deretter kombineres med humane Ig-konstante regioner for å frembringe antistoffer som er fullstendig humane i sammensetning unntatt ved-rørende de substituerte murine CDR'er. Slike CDR-substituerte antistoffer vil sannsynligvis ikke fremkalle en immunrespons i mennesker sammenlignet med riktige chimeriske antistoffer fordi de CDR-substituerte antistoffer inneholder betraktelig færre ikke-humane komponenter. Prosessen for å humanisere monoklonale antistoffer via CDR-"transplantering" er blitt kalt "omforming". (Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536).

Vanligvis transplanteres komplimentaritetsbestemmende regioner (CDR'er) av et murint antistoff inn i de tilsvarende regioner i et humant antistoff, siden det er CDR'ene (tre i antistoff-tungkjeder, tre i lettkjeder) som er regionene av det murine antistoff som bindes til et spesifikt antigen. Transplantasjon av CDR'er oppnås ved genetisk teknikk hvorved CDR DNA-sekvenser bestemmes ved kloning av murine tung- og lettkjedede variable (V) regioniske gensegmenter, og er deretter overføres de til tilsvarende humane V-regioner ved seterettet mutagenese. I det avsluttende stadium av prosessen adderes humane konstantregioniske gensegmenter av den ønskede isotype (vanligvis gamma I for CH og kappa for CL) og de humaniserte tung- og lettkjedede gener ko-uttrykkes i pattedyrsceller for å produsere løselig humanisert antistoff.

Overføringen av disse CDR'er til et humant antistoff over-drar til dette antistoff de antigenbindende egenskaper fra det opprinnelige murine antistoff. De seks CDR'er i det murine antistoff er strukturelt anbragt på en V-regionisk "rammeverk"-region. Grunnen til at CDR-grafting er vellyk-ket er at rammeverkregioner mellom murine og humane antistoffer kan ha meget like 3-D-strukturer med lignende tilknytningspunkter for CDR'er, slik at CDR'ene kan ut-veksles. Slike humaniserte antistoffhomologer kan fremstilles som eksemplifisert i Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann, 1988, Nature 332, 323-327; Queen et al., 1989, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 86, 10029; og Orlandi et al., 1989, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 86, 3833.

Ikke desto mindre anses visse aminosyrer innenfor enkelte rammeverkregioner å samhandle med CDR'er og å influere den totale antigenbindende affinitet. Den direkte overføring av CDR'er fra et murint antistoff for å produsere et rekombinant humanisert antistoff uten noen modifikasjoner av de humane V-regioniske rammeverk resulterer ofte i et partielt eller fullstendig tap av bindingsaffinitet. I et antall tilfeller synes det å være kritisk å endre enkelte rester i rammeverkregionene i akseptorantistoffet for å oppnå bind-ingsaktivitet .

Queen et al., 1989 (supra) og WO 90/07861 (Protein Design Labs) har beskrevet fremstillingen av et humanisert antistoff, som inneholder modifiserte rester i rammeverkregionene av akseptor-antistoffet, ved å kombinere CDR'ene av et murint MAb (anti-Tac) med humane immunoglobulinske rammeverkregioner og konstante regioner. De har påvist én løs-ning på problemet tap av bindende affinitet som ofte er et resultat av direkte CDR-overføring uten noen modifikasjoner av restene av det humane V-regionrammeverk; deres løsning involverer to nøkkeltrinn. Først velges de humane V-rammeverkregioner av datanalytikere for optimal proteinsekvens-homologi med V-regionrammeverket av det opprinnelige murine antistoff, i dette tilfelle, anti-Tac MAb-stoffet. I det andre trinn modelleres den tertiære struktur av den murine V-region av en datamaskin for å synliggjøre ramme-verkaminosyrerester som mest sannsynlig vil samhandle med de murine CDR'er, og disse murine aminosyrerester plasseres deretter på det homologe humane rammeverk. Se også U.S.-patentene 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; og 5,530,101 (Protein Design Labs).

Man kan anvende en forskjellig mulighet (Tempest et al., 1991, Biotechnology 9, 266-271) og utnytte som standard V-regionrammeverk avledet fra NEWM og REI-tunge og lette kjeder respektive for CDR-transplantasjon uten radikal innføring av murine rester. En fordel ved å anvende Tempest et al.'s løsning for å konstruere NEWM- og REI-baserte humaniserte antistoffer er at de 3-dimensjonale strukturer av NEWM- og REI-variable regioner er kjent fra røntgenkry-stallografi, og således kan spesifikke vekselvirkninger mellom CDR'er og V-regionrammeverkrester modelleres.

Uten hensyn til den metode som velges, har eksemplene på de initielle humaniserte antistoffhomologer som er fremstilt hittil, vist at det ikke er en ukomplisert prosess. Til og med når man anerkjenner at slike rammeverkforandringer kan være nødvendige, er det imidlertid ikke mulig å forutsi, på basis av den tilgjengelige teknikkens stand, hvilke, hvis noen i det hele tatt, rammeverkrester vil trenge å bli endret for å oppnå funksjonelle humaniserte rekombinante antistoffer med den ønskede spesifisitet. Resultatene så langt indikerer at forandringer som er nødvendige for å bevare spesifisiteten og/eller affiniteten, for det meste er enestående for et gitt antistoff og kan ikke forutsis basert på humaniseringen av et annet forskjellig antistoff.

Visse alfa4-subenhet-inneholdende integrinantagonister som er nyttige i foreliggende oppfinnelse, omfatter chimeriske og humaniserte rekombinante antistoffhomologer (dvs. intakte immunoglobuliner og deler derav) med B-epitop spesifisitet som er blitt fremstilt og er beskrevet i U.S. Patent 5, 932,214( mab HP1/2) . Utgangsmaterialet for fremstillingen av chimeriske (murin Variabel - human Konstant) og humaniserte anti-integrin-antistoffhomologer kan være et murint monoklonalt anti-integrin-antistoff som tidligere beskrevet, et monoklonalt anti-integrin-antistoff kommer-sielt tilgjengelig (f.eks. HP2/1, Amae International, Inc., Westbrook, Maine), eller et monoklonalt anti-integrin-antistof f fremstilt i henhold til lærdommen heri. Andre foretrukne humaniserte anti-VLA4-antistoffhomologer er beskrevet av Athena Neurosciences, Inc. in PCTIUS95/01219 (27. juli 1995) og U.S. Patent 5,840,299.

Disse humaniserte anti-VLA-4-antistoffer omfatter en humanisert lettkjede og en humanisert tungkjede. Den humaniserte lettkjede omfatter tre komplimentaritetsbestemmende regioner (CDR1, CDR2 og CDR3) med aminosyresekvenser fra de tilsvarende komplimentaritetsbestemmende regioner av en murin 21-6 immunoglobulinsk lettkjede, og et variabelt regionrammeverk fra en human kappa-lettkjedet variabel regi-onrammeverksekvens unntatt at i minste én posisjon er aminosyreposisjonen okkupert av den samme aminosyre som er nærværende i den ekvivalente posisjon av det murine 21.6-immunoglobulinske lettkjedede variable regionrammeverk. Den humaniserte tungkjede omfatter tre komplimentaritetsbestemmende regioner (CDR1, CDR2 og CDR3) med aminosyresekvenser fra de tilsvarende komplimentaritetsbestemmende regioner av en murin 21-6 immunoglobulinsk tung kjede, og et variabelt regionrammeverk fra en human tungkjedet variabel regionram-meverksekvens unntatt at i minst én posisjon er aminosyreposisjonen opptatt av den samme aminosyre som er nærværende i den ekvivalente posisjon av det murine 21-6 immunoglobulinske tungkjedede variable regionrammeverk.

Det er også mulig å utnytte antagonister som er kodet av nukleinsyresekvenser som hybridiserer under stringente betingelser til nukleinsyresekvenser som koder antistoffer rettet mot alfa4-subenhet-inneholdende integriner. For eksempel kan en antagonist være et protein hvis nukleinsyre hybridiserer under høye stringensbetingelser til en eller flere av disse nukleinsyresekvenser som fins i tabell 6 i U.S. Patent 5,840,299 eller komplementet av slike sekvenser. Antagonistene kan også være et protein hvis nukleinsyre hybridiserer under høye stringensbetingelser til en nukleinsyre som koder SEQ ID NO: 2 eller SEQ ID NO: 4 som fins i U.S. Patent 5,932,214. Videre kan antagonistene også være et protein hvis nukleinsyre hybridiserer under høye stringensbetingelser til en nukleinsyre som koder et variabelt domene av antistoffet produsert av cellelinje ATCC CRL 11175.

Alternativt kan en antagonist være et protein hvis nukleinsyre hybridiserer under lave stringensbetingelser til en eller flere av disse nukleinsyresekvenser som fins i tabell 6 i U.S. Patent 5,840,299 eller komplementet av slike sekvenser. Antagonistene kan også være et protein hvis nukleinsyre hybridiserer under lave stringensbetingelser til en nukleinsyre som koder SEQ ID NO: 2 eller SEQ ID NO: 4 som fins i U.S. Patent 5,932,214. Videre kan antagonistene også være et protein hvis nukleinsyre hybridiserer under lave stringensbetingelser til en nukleinsyre som koder et variabelt domene av antistoffet produsert av cellelinje ATCC CRL 11175.

C. Produksjon av fragmenter og analoger

Fragmenter av isolerte alfa4-integrinantagonister (f.eks. fragmenter av antistoffhomologer beskrevet heri) kan også produseres effektivt ved hjelp av rekombinante metoder, ved proteolytisk spaltning, eller ved kjemisk syntese under anvendelse av metoder som er kjent for personer med kunnskaper i faget. I rekombinante metoder kan indre eller terminale fragmenter av et polypeptid genereres ved å fjerne et eller flere nukleotider fra en ende (for et terminalt fragment) eller begge ender (for et indre fragment) av en DNA-sekvens som koder for det isolerte pinnsvin-polypeptid. Ekspresjon av det mutageniserte DNA frembringer polypeptidfragmenter. Spaltning med "endeopp-løsende" endonukleaser kan også generere DNA'er som koder en rekke fragmenter. DNA'er som koder fragmenter av et protein, kan også genereres ved tilfeldig spalting, restriksjonsspaltning eller en kombinasjon eller begge deler. Proteinfragmenter kan genereres direkte fra intakte proteiner. Peptider kan spaltes spesifikt av proteolytiske enzymer, inklusive, trombin, trypsin, chymotrypsin, eller pepsin. Ethvert av disse enzymer er spesifikt for typen av peptidbinding det angriper. Trypsin katalyserer hydrolysen av peptidbindinger hvori karbonylgruppen er fra en basisk aminosyre, vanligvis arginin eller lysin. Pepsin og chymotrypsin katalyserer hydrolysen av peptidbindinger fra aromatiske aminosyrer, så som tryptofan, tyrosin og fenylalanin. Alternative sett av spaltede proteinfragmenter genereres ved å forhindre spalting ved et sete som er mottagelig for et proteolytisk enzym. For eksempel omsetning av E-aminosyregruppen i lysin med etyltrifluortioacetat i svakt basisk løsning gir blokkerte aminosyrerester hvis tilgrensende peptidbinding ikke lenger er mottagelig for hydrolyse med trypsin. Proteiner kan modifiseres for å frembringe peptidbindinger som er mottagelige for proteolytisk enzymer. For eksempel gir alkylering av cysteinrester med p-halogenetylaminer peptidbindinger som hydrolyseres av trypsin (Lindley, (1956) Nature 178, 647). Dessuten kan kjemiske reagenser som spalter peptidkjeder ved spesifikke posisjoner, anvendes. For eksempel spalter cyanogenbromid peptider ved metioninposisjoner (Gross og Witkip, (1961) 7. Am. Chem. Soc. 83, 1510). Således, ved å behandle proteiner med forskjellige kombinasjoner av modifiseringsmiddler, proteolytiske enzymer og/eller kjemiske reagenser, kan proteinene oppdeles i fragmenter med ønsket lengde uten overlapning av fragmentene, eller deles i overlappende fragmenter med ønsket lengde.

Fragmenter kan også syntetiseres kjemisk under anvendelse av teknikker kjent i faget, så som Merrifields fastfase F moe- eller t-Boc-kjemi. Merrifield, Recent Progress in Hormone Research 23: 451 (1967).

Eksempler på tidligere kjente metoder som muliggjør produksjon og testing av fragmenter og analoger, er omtalt nedenfor. Disse eller analoge metoder kan anvendes for å fremstille og sortere fragmenter og analoger av en isolert alfa4-integrinantagonist som kan påvises å ha biologisk aktivitet. Et eksempel på en metode for å teste om frag menter og analoger av alfa4-subenhet-inneholdende integrinantagonister har biologisk aktivitet fins i Kapittel IV og i eksemplene. D. Produksjon av endret DNA og peptidsekvenser: Tilfeldige metoder

Aminosyresekvensvarianter av et protein kan fremstilles ved tilfeldig mutagenese av DNA som koder proteinet eller et spesielt segment derav. Nyttige metoder omfatter PCR-mutagenese og metningsmutagenese. En samling av tilfeldige aminosyresekvensvarianter kan også genereres ved syntese av et sett av degenererte oligonukleotiderekvenser. Metoder for å generere aminosyresekvensvarianter av et gitt protein under anvendelse av endrede DNA og peptider er velkjent i faget. Følgende eksempler på slike metoder tjener til å illustrere representative teknikker. Personer med ordinære kunnskaper i faget vil forstå at andre metoder er også nyttige i dette henseende.

PCR- mutagenese: Se for eksempel Leung et al., (1989) Technique 1, 11-15.

Metningsmutagenese: En metode er beskrevet generelt i Mayers et al., (1989) Science 229, 242.

Degenerert oligonukleotid mutagensis: Se for eksempel Harang, S.A., (1983) Tetrahedron 39, 3; Itakura et al.,

(1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 323 og Itakura et al., Recombinant DNA, Proe. 3rd Cleveland Symposium on Macro-molecules, s. 273-289 (A.G. Walton, ed.), Elsevier, Amster-dam, 1981.

E. Produksjon av endrede DNA- og peptidsekvenser: Styrte metoder

Ikke-tilfeldig, eller styrt, mutagenese tilveiebringer spesifikke sekvenser eller mutasjoner i spesifikke deler av en polynukleotidsekvens som koder et isolert polypeptid, for å tilveiebringe varianter som omfatter slettinger, innsetninger eller substitusjoner av rester av den kjente aminosyresekvens i det isolerte polypeptid. Mutasjonssetene kan

modifiseres individuelt eller i serie, for eksempel ved:

(1) først å erstatte med beskyttede aminosyrer og deretter med mer radikale valg avhengig av de oppnådde resultater; (2) å slette målresten; eller (3) å innsette rester av den samme eller en forskjellig klasse tilstøtende det lokalis-erte sete, eller kombinasjoner av valgene 1-3.

Det er klart at slike sete-rettede metoder er en måte å innføre et N-terminalt cystein (eller en funksjonell ekvivalent) i en gitt polypeptidsekvens for å tilveiebringe tilknytningssetet for en hydrofob gruppe.

Alanin- separerede mutagenese: Se Cunningham og Wells,

(1989) Science 244, 1081-1085).

Oligonukleotid- mediert Mutagenese: Se for eksempel Adelman et al., (1983) DNA 2, 183.

Kassett- mutagenese: Se Wells et al., (1985) Gene 34, 315.

Kombinatorisk mutagenese: Se for eksempel Ladner et al., WO 88/06630

Bakteriofagfremvisende strategier: Se for eksempel oversik-ten av Marks et al., J. Biol. Chemistry: 267 16007-16010

(1992).

F. Andre varianter av integrinantagonister

Variantene kan adskille seg fra andre integrinantagonister beskrevet heri i aminosyresekvens eller måter som ikke involverer sekvens, eller begge deler. De mest foretrukne polypeptider har foretrukne ikke-sekvens-modifikasjoner som omfatter kjemisk derivatisering in vivo eller in vitro

(f.eks. av deres N-terminale ende), samt mulige forandringer i acetylering, metylering, fosforylering, amidering, karboksylering eller glykosylering.

Andre analoger omfatter et protein eller dets biologisk aktive fragmenter hvis sekvenser adskiller seg fra de som fins i U.S.-patentene 5,840,299 eller U.S. 5,888,507; U.S. 5,932,214 eller PCT US/94/00266, ved en eller flere bevarende aminosyresubstitusjoner eller ved en eller flere ikke-bevarende aminosyresubstitusjoner, eller ved slettinger eller innsetninger som ikke opphever det isolerte proteins biologiske aktivitet. Bevarende substitusjoner omfatter vanligvis erstaning av en aminosyre med en annen med lignende karakteristikker, så som substitusjoner innenfor følgende grupper: valin, alanin og glycin; leucin og isoleucin; asparaginsyre og glutaminsyre; asparagin og glutamin; serin og treonin; lysin og arginin; og fenylalanin og tyrosin. De ikke-polare hydrofobe aminosyrer omfatter alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan og metionin. De polare nøy-trale aminosyrer omfatter glycin, serin, treonin, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin. De positivt ladede (basiske) aminosyrer omfatter arginin, lysin og histidin. De negativt ladede (sure) aminosyrer omfatter asparaginsyre og glutaminsyre. Andre bevarende substitusjoner vil være kjent av personer med ordinære kunnskaper i faget. For eksempel for aminosyren alanin kan en bevarende substitusjon hentes fra D-alanin, glycin, beta-alanin, L-cystein eller D-cystein. For lysin kan en substitusjon være D-lysin, arginin, D-arginin, homo-arginin, metionin, D-metionin, ornitin eller D-ornitin

Andre analoger innenfor oppfinnelsen er de med modifikasjoner som øker peptidstabiliteten. Slike analoger kan inneholde for eksempel et eller flere ikke-peptidbindinger (som erstatter peptidbindingene) i peptidsekvensen. Også inkludert er: Analoger som omfatter rester som ikke er naturlig forekommende L-aminosyrer, så som D-aminosyrer eller ikke-naturlig forekommende eller syntetiske aminosyrer, så som beta- eller gamma-aminosyrer og cykliske analoger. Innlemmelse av D- istedenfor L-aminosyrer i det isolerte polypeptid kan øke dets motstand mot proteaser. Se U.S. Patent 5,219,990 supra.

Foretrukne antistoffhomologer omfatter en aminosyresekvens som er minst 60%, 80%, 90%, 95%, 98% eller 99% homolog med en aminosyresekvens av PS/2-antistoff (Se eksempel) eller omfatter en aminosyresekvens som er minst 60%, 80%, 90%, 95%, 98% eller 99% homolog med en aminosyresekvens beskrevet i U.S. Patent 5,840,299 (SEQ ID NO 15-lettkjedet variabelt område eller SEQ ID NO: 17-tungkjedet variabelt område) eller U.S. Patent 5,932,214 (SEQ ID NOS: 2 eller 4); og publisert patentsøknad W094/16094 (de sekvenser som fins i anti-VLA4-antistoffet av den deponerte cellelinje ATCC CRL 11175).

6. Polymere konjugatformer

Innenfor det brede omfang av foreliggende oppfinnelse kan et enkelt polymermolekyl anvendes for konjugering med en alfa4-integrinantagonist, skjønt det er også ment at mer enn ett polymermolekyl også kan være tilknyttet. Konjugerte alfa4-integrinantagonistsammensetninger kan utnyttes både in vivo og ikke-in vivo. Dessuten vil det være underforstått at den konjugerende polymer kan utnytte enhver annen gruppe, andel eller andre konjugerte typer, alt etter den tiltenkte bruk. Som et eksempel kan det være nyttig i noen applikasjoner å kovalent binde til polymeren en funksjonell gruppe som tilfører motstand mot UV-nedbrytning, eller antioksidasjon, eller andre egenskaper eller karakteristika til polymeren. Som et ytterligere eksempel kan det være fordelaktig i noen applikasjoner å funksjonalisere polymeren for å gjøre den reaktiv og i stand til å fornettes til et medisinmolekyl, for å høyne forskjellige egenskaper eller karakteristika hos det totale konjugerte material. Følgelig kan polymeren inneholde enhver funksjonalitet, repeterende grupper, bindinger eller andre konstituentstrukturer som ikke hindrer effektiviteten hos den konjugerte alfa4-integrinantagonistsammensetning i dens tiltenkte formål.

Illustrative polymerer som på nyttig måte kan anvendes til å oppnå disse ønskelige karakteristika, er beskrevet nedenfor i eksemplene på reaksjonsskjemaer. I kovalent bundne antagonist/polymerkonjugater kan polymeren være funksjon-alisert og deretter koblet til frie aminosyrer i antagonisten for å danne labile bindinger.

Antagonister til alfa4-subenhetsinneholdende integriner er fortrinnsvis konjugert via en terminal reaktiv gruppe på polymeren, skjønt konjugasjoner kan også være forgrenet fra ikke-terminale reaktive grupper. Polymeren med den/de reaktive gruppe/grupper er betegnet heri som "aktivert polymer". Den reaktive gruppe reagerer selektivt med frie aminogrupper eller andre reaktive grupper på anta-gonistmolekylet. Den/de aktiverte polymer(er) reagerer slik at binding kan opptre ved enhver tilgjengelig alfa4-inte-grinantagonistisk aminogruppe så som alfa-aminogruppene eller epsilon-aminogruppene i lysiner. Frie karboksylgrup-per, passende aktiverte karbonylgrupper, hydroksyl, gua-nidyl, oksiderte karbohydratgrupper og merkaptogrupper i alfa4-integrinantagonisten (hvis tilgjengelig) kan også anvendes som tilknytningssteder.

Skjønt polymeren kan være tilknyttet på et hvilket som helst sted på integrinantagonistmolekylet, er et foretrukket sted for polymer kobling til integrinantagonister (spesielt de som er proteiner) N-terminusen av integrinantagonisten. Sekundære steder er på eller nær C-terminusen og via sukkergrupper (hvis de forekommer). Således kan det benyttes: (i) N-terminalt koblede polymerkonjugater av alfa4-integrinantagonister; (ii) C-terminalt koblede polymerkonjugater av alfa4-integrinantagonister; (iii) sukkerkoblede konjugater; (iv) samt N-, C- og sukkerkoblede polymerkonjugater av alfa4-integrinantagonister.

Generelt anvendes fra ca. 1,0 til ca. 10 mol av aktivert polymer pr. mol av antagonist, avhengig av antagonistkon-sentrasjonen. Den endelige mengde er en avbalansering mellom å maksimere omfanget av reaksjonen og å minimere ikke-spesifikke modifikasjoner av produktet og samtidig bestemme kjemien som vil opprettholde optimal aktivitet, mens man samtidig optimerer, hvis mulig, antagonistens halverings-tid. Fortrinnsvis opprettholdes minst ca. 50% av den biologiske aktivitet hos antagonisten, fortrinnsvis 100%.

Reaksjonene kan finne sted ved hjelp av enhver passende faglig kjent metode som anvendes for å omsette biologisk aktive materialer med inerte polymerer. Generelt involverer prosessen å fremstille en aktivert polymer (som kan ha minst én terminal hydroksylgruppe) og deretter omsette antagonisten med den aktiverte polymer for å produsere det løselige protein som er egnet for formulering. Ovennevnte modifikasjonreaksjon kan utføres ved hjelp av flere metoder som kan involvere et eller flere trinn.

Som nevnt ovenfor, utnyttes alternativt den N-terminale ende av en integrinantagonist som binding til polymeren. Passende konvensjonelle metoder er tilgjengelige for selektivt å oppnå en N-terminalt modifisert alfal- eller alfa4-integrinantagonist. En metode er for eksempel en reduktiv alkyleringsmetode som utnytter differensiell reaktivitet av forskjellige typer av primære aminogrupper (epsilon-aminogruppene på lysin mot aminogruppene på et N-terminalt metionin) som er tilgjengelige for derivatisering på en passende integrinantagonist. Under passende utvelgelsesbetingelser kan hovedsakelig selektiv derivatisering av en passende integrinantagonist ved en N-terminus derav med en karbonylgruppe-inneholdende polymer oppnås. Reaksjonen utføres ved en pH som gjør det mulig å utnytte pKa-forskjeller mellom epsilon-aminogruppene i lysinrestene og alfa-aminogruppen i en N-terminal rest av integrinantagonisten. Denne type av kjemi er velkjent for personer med ordinære kunnskaper i faget.

En strategi for å sikte inn en polyalkylenglykolpolymer så som PEG til C-terminusen i en alfa4-integrinantagonist (f.eks. som et protein) ville være å kjemisk binde eller genetisk konstruere et sete som kan anvendes for å sikte inn polymergruppen. For eksempel innlemmelse av et Cys ved et sete som er på eller nær C-terminusen i et protein, ville muliggjøre spesifikk modifikasjon under anvendelse av i faget anerkjent maleimid, vinylsulfon eller halogenacetat-aktiverte derivater av polyalkylenglykol (f.eks. PEG). Disse derivater kan anvendes spesifikt for modifikasjon av de konstruerte cysteiner på grunn av den høye selektivitet hos disse reagenser for Cys. Andre strategier så som innlemmelse av en histidinmarkør som kan være målrettet (Fancy et al., (1996) Chem.&Biol. 3: 551) eller et ytterligere glykosyleringssete på et protein, rep-resenterer andre alternativer for å modifisere C-terminusen i en integrinantagonist ifølge oppfinnelsen.

Metoder for å benytte sukkere som seter for kjemisk modifikasjon er også velkjent, og derfor er det sannsynlig at en polyalkylenglykolpolymer kan adderes direkte og spesifikt til sukkere (hvis de forekommer) på en integrinantagonist som er blitt aktivert ved oksidasjon. For eksempel kan det genereres et polyetylenglykolhydrazid som danner relativt stabile hydrazonbindinger ved kondensasjon med aldehyder og ketoner. Denne egenskap er blitt anvendt for modifikasjon av proteiner via oksiderte oligosakkaridbindinger. Se Andresz, H. et al., (1978), Makromol. Chem. 179: 301. Spesielt behandling av PEG-karboksymetylhydrazid med ni-tritt produserer PEG-karboksymetylazid som er en elektro-filt aktiv gruppe som er reaktiv overfor aminogrupper. Denne reaksjon kan også anvendes for å fremstille polyalkylenglykol-modifiserte proteiner. Se U.S.-patentene 4,101,380 og 4,179,337.

Man kan anvende i faget godkjente tiollinker-mediert kjemi for videre underlette fornetningen av proteiner for å danne multivalente alfa4-integrinantagonistsammensetninger. Spesielt kan man generere reaktive aldehyder på karbohydratgrupper med natriumperjodat, og danne cystamin-konjugater gjennom aldehydene og indusere fornetning via tiolgruppene på cystaminene. Se Pepinsky, B. et al.,

(1991), J. Biol. Chem., 266: 18244-18249 og Chen, L.L. et al., (1991) J. Biol. Chem., 266: 18237-18243. Derfor ville denne type av kjemi også være passende for modifikasjon med polyalkylenglykolpolymerer hvor en linker er innlemmet i sukkeret, og polyalkylenglykolpolymeren er bundet til linkeren. Mens aminotiol eller hydrazin-inneholdende linkere vil tillate addisjon av en enkelt polymergruppe, kan strukturen av linkeren varieres slik at multiple polymerer adderes, og/eller at den romlige orientering av polymeren med hensyn til integrinantagonisten forandres.

Alternativt kan det innlemmes med fordel

polyalkylenglykolrester av Ci-C4alkylpolyalkylenglykoler, fortrinnsvis polyetylenglykol (PEG), eller

poly(oksy)alkylenglykolrester av slike glykoler i polymer-systemene av interesse. Således kan polymeren som proteinet er knyttet til, være en homopolymer av polyetylenglykol (PEG) eller en polyoksyetylert polyol, forutsatt i alle tilfeller at polymeren er løselig i vann ved romstempera-tur. Eksempler på slike polymerer omfatter

polyalkylenoksidhomopolymerer så som PEG eller polypropyl-englykoler, polyoksyetylenerte glykoler, kopolymerer derav og blokk-kopolymerer derav, forutsatt at vannoppløselig-heten av blokk-kopolymeren opprettholdes. Eksempler på polyoksyetylerte polyoler omfatter for eksempel polyoksyetylert glyserol, polyoksyetylert sorbitol, polyoksyetylert glukose eller lignende. Glyserolryggraden av polyoksyetylert glyserol er den samme ryggrad som opptrer naturlig i for eksempel dyr og mennesker i mono-, di- og triglyse-rider. Derfor ville denne forgrening ikke nødvendigvis anses å være et fremmedmateriale i kroppen.

Som et alternativ til polyalkylenoksider kan dekstran, polyvinylpyrrolidoner, polyakrylamider, polyvinylalkoholer, karbohydratbaserte polymerer og lignende anvendes. Personer med ordinære kunnskaper i faget vil forstå at ovenstående liste er rent illustrativ og at alle polymere materialer med egenskapene beskrevet heri kan vurderes.

Polymeren trenger ikke ha noen spesiell molekylvekt, men det er foretrukket at molekylvekten er mellom ca. 300 og 100000, mer foretrukket mellom 10000 og 40000. Særlig er størrelser på 20000 eller mer best når det gjelder å forhindre tap av produktet på grunn av filtrering i nyrene.

Polyalkylenglykolderivatisering har mange fordelaktige egenskaper i formuleringen av polymer-integrinantagonist-konjugater som forbundet med følgende egenskaper hos polyalkylenglykolderivatene: Forbedring av vannoppløseligheten, mens det samtidig ikke fremkalles antigene eller immunogene responser; en høy grad av biokompatibilitet; fravær av bionedbrytning in vivo av polyalkylenglykolderivatene; og lett utskillelse i levende organismer.

Dessuten kan man utnytte en alfa4-integrinantagonist kovalent bundet til polymerkomponenten hvori konjugasjonens natur involverer spaltbare kovalente kjemiske bindinger. Dette tillater kontroll vedrørende tidsforløpet under hvilket polymeren kan spaltes fra integrinantagonisten. Denne kovalente binding mellom integrinantagonisten og polymeren kan spaltes ved kjemisk eller enzymatisk reaksjon. Polymerintegrinantagonistproduktet bibeholder en akseptabel mengde av aktivitet. Samtidig er deler av polyetylenglykol nærværende i den konjugerende polymer for å gi polymerintegrinantagonistkonjugatet en høy vannoppløselighet og forlenget blodsirkulasjonsevne. Som et resultat av disse forbedrede karakteristika kan det benyttes parenteral, nasal og oral leveranse av både den aktive polymere alfa4-integrinantagonistart og, etter hydrolytisk spaltning, biotilgjengelighet for integrinantagonisten i seg selv, i applikasjoner in vivo.

III. Utnyttelser

Mengden av aktiv ingrediens som kan kombineres med bærer-materialene for å gi en enkelt doseringsform, vil variere

avhengig av individet som behandles og den spesielle admin-istrasjonsmåte. Det bør imidlertid være underforstått at en spesifikk dosering og behandlingskur for hvert enkelt individ vil avhenge av mange forskjellige faktorer, inklusive

aktiviteten av den spesifikke forbindelse som anvendes, alderen, kroppsvekten, den generelle helsetilstand, kjøn-net, dietten, administrasjonstiden, ekskresjonshastigheten, kombinasjon av medisiner, den behandlende leges skjønn og alvoret av den spesielle sykdom som behandles. Mengden av aktiv ingrediens kan også avhenge av det terapeutiske eller profylaktiske middel, hvis nærværende, som ingrediensen administreres sammen med.

Farmasøytiske preparater

De aktuelle antagonistene kan administreres parenteralt. Uttrykket "parenteral" anvendt heri omfatter subkutan, intravenøs, intramuskulær, intra-artikulær, intra-synovial, intrasternal, intratekal, intrahepatisk, intralesjonal og intrakranial injiserende eller infuserende teknikk. Den ønskede dose administreres til et individ en eller flere ganger daglig, intravenøst, oralt, rektalt, parenteralt, intranasalt, topikalt eller ved inhalering. Den ønskede dose kan også gis ved kontinuerlig intravenøs infusjon.

Antistoffhomologene administreres fortrinnsvis som en steril farmasøytisk sammensetning inneholdende en farmasøytisk akseptabel bærer, som kan være en av de tall-rike velkjente bærere, så som vann, saltløsning, fosfat-bufret saltløsning, dekstrose, glyserol, etanol og lignende, eller kombinasjoner derav. De aktuelle forbindelsene kan anvendes i form av farmasøytisk akseptable salter avledet fra uorganiske eller organiske syrer og baser. Inkludert blant slike syresalter er de følgende: Acetat, adipat, alginat, aspartat, benzoat, benzensulfonat, bisulfat, butyrat, citrat, kamferat, kam-fersulfonat, cyklopentanpropionat, diglukonat, dodecylsul-fat, etansulfonat, fumarat, glukoheptanoat, glycerofosfat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, hydroklorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroksyetansulfonat, laktat, maleat, metan-sulfonat, 2-naftalensulfonat, nikotinat, oksalat, pamoat, pektinat, persulfat, 3-fenyl-propionat, pikrat, pivalat, propionat, suksinat, tartrat, tiocyanat, tosylat og undeka-noat. Basesalter omfatter ammoniumsalter, alkalimetalsal-ter, så som natrium- og kaliumsalter, jordalkalimetallsalter, så som kalsium- og magnesiumsalter, salter med organiske baser, så som dicykloheksylaminsalter, N-metyl-D-glukamin, tris(hydroksymetyl)metylamin og salter med aminosyrer så som arginin, lysin og så videre. Dessuten kan de basiske nitrogenholdige grupper være kvaternisert med slike midler som lavere alkylhalogenider, så som metyl-, etyl-, propyl- og butylklorider, -bromider og -jodider; dialkyl-sulfater, så som dimetyl-, dietyl-, dibutyl- og diamylsul-fater, langkjedede halogenider så som decyl-, lauryl-, myristyl- og stearylklorider, bromider og jodider, aralkyl-halogenider, så som benzyl- og fenetylbromider og andre. Vann- eller oljeløselige eller dispergerbare produkter oppnås derved.

De aktuelle farmasøytiske sammensetninger omfatter enhver av de foreskrevne forbindelsene, eller farmasøytisk akseptable derivater derav, sammen med enhver farmasøytisk akseptabel bærer. Uttrykket "bærer" anvendt heri omfatter akseptable adjuvanter og vehikler. Farmasøytisk akseptable bærere som kan anvendes i de farmasøytiske sammensetninger omfatter ionebyttere, Al-oksid, aluminiumstearat, lecitin, serumproteiner, så som humant serumalbumin, buffersubstanser så som fosfater, glycin, sorbinsyre, kaliumsorbat, partielle glyceridblandinger av mettede vegetabilske fettsyrer, vann, salter eller elektrolytter, så som protaminsulfat, dinatriumhydrogenfosfat, kalium-hydrogenfosfat, natriumklorid, sinksalter, kolloidalt silisiumoksid, magnesiumtrisilikat, polyvinylpyrrolidon, cellulose-baserte substanser, polyetylenglykol, natriumkar-boksymetylcellulose, polyakrylater, vokser, polyetylenpoly-oksypropylen-blokkpolymerer, polyetylenglykol og ullfett.

De farmasøytiske sammensetninger kan være i form av et sterilt injiserbart preparat, for eksempel en steril injiserbar vandig eller oljeaktig suspensjon. Denne suspensjon kan formuleres i henhold til teknikker som er kjent i faget, under anvendelse av passende dispergerende eller fuktende midler og suspenderende midler. Det sterile injiserbare preparat kan også være en steril injiserbar løsning eller suspensjon i en ikke-toksisk parenteralt akseptabel diluent eller løsningsmiddel, for eksempel som en løsning i 1,3-butandiol. Blant de akseptable vehikler og løsningsmidler som kan anvendes, er vann, Ringers løsning og isotonisk natriumkloridløsning. Dessuten anvendes sterile fettoljer onvensjonelt som løsningsmiddel eller suspenderende medium. For dette formål kan enhver harmløs fettolje anvendes inklusive syntetiske mono- eller di-gly-serider. Fettsyrer, så som oljesyre og dens glyceridderi-vater er nyttige i fremstillingen av injiserbare stoffer, liksom naturlige farmasøytisk akseptable oljer, så som olivenolje eller ricinusolje, spesielt i deres polyoksyetylerte versjoner.

De farmasøytiske sammensetninger kan gis oralt. Hvis gitt oralt, kan de administreres i enhver oralt akseptabel doseringsform inklusive kapsler, tabletter, vandige suspensjoner eller oppløsninger. Vedrørende tabletter for oral anvendelse, omfatter normalt anvendte bærere laktose og maisstivelse. Smøremidler, så som magnesiumstearat, tilsettes også vanligvis. For oral administrasjon i kapselform omfatter nyttige diluenter laktose og tørket maisstivelse. Når vandige suspensjoner er nødvendige for oral anvendelse, kombineres den aktiv ingrediens med emulgerende og suspenderende midler. Hvis ønskelig, kan visse søtningsstoffer, aromastoffer eller farvestoffer også tilsettes.

Spesielle sammensetninger er de sammensetninger hvori antagonisten formuleres i vesikler så som liposomholdige sammensetninger. Liposomer er vesikler dannet av amfifatiske molekyler så som polare lipider, for eksempel fosfati-dylcholiner, etanolaminer og seriner, sfingomyeliner, kar-diolipiner, plasmalogener, fosfatidsyrer og cerebiosider. Liposomer dannes når passende amfifatiske molekyler får svelle i vann eller vandige oppløsninger for å danne flytende krystaller vanligvis av flerlagsstruktur bestående av mange dobbeltlag separert fra hverandre av vandig materiale (også omtalt som grove liposomer). En annen type av liposomer som er kjent for å bestå av et enkelt dobbeltlag som innkapsler vandig materiale, er omtalt som en unilamel-lar vesikkel. Hvis vannløselige materialer er innbefattet i den vandige fase under svellingen av lipidene blir de oppfanget i det vandige lag mellom de lipide dobbeltlag.

En spesielt bekvem metode for å fremstille liposomformu-lerte former av de nærværende antagonister er metoden beskrevet i EP-A-253,619. I denne metode fremstilles enkeltvise dobbeltlagsliposomer inneholdende innkapslede aktive ingredienser ved å oppløse lipidkomponenten i et organisk medium, injisere den organiske løsning av lipidkomponenten under trykk inn i en vandig komponent under samtidig blanding av de organiske og vandige komponenter med en høyhastighetshomogenisator eller et blandeapparat, hvoretter liposomene dannes spontant. De enkelte dobbeltlagsliposomer inneholdende den innkapslede aktive ingrediens kan anvendes direkte, eller de kan anvendes i en passende farmasøytisk akseptabel bærer for topisk administrasjon. Viskositeten for liposomene kan økes ved tilsetning av et eller flere passende fortykningsmidler så som for eksempel xantangummi, hydroksypropylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose og blandinger derav. Den vandige komponent kan bestå av vann alene, eller den kan inneholde elektrolytter, bufrede systemer og andre ingredienser, så som for eksempel konserveringsmidler. Passende elektrolytter som kan anvendes, omfatter metallsalter så som alkalimetall- og jordalkalimetallsalter. De foretrukne metallsalter er kalsiumklorid, natriumklorid og kaliumklo-rid. Konsentrasjonen av elektrolytten kan variere fra null til 260 mM, fortrinnsvis fra 5 mM til 160 mM. Den vandige komponent anbringes i et passende kar som kan være tilret-telagt slik at det utføres homogenisering ved å bevirke stor turbulens under injeksjonen av den organiske komponent. Homogenisering av de to komponenter kan oppnås innenfor karet, eller alternativt kan de vandige og organiske komponenter injiseres separat i et blandeapparat som befinner seg utenfor karet. I sistnevnte tilfelle dannes liposomene i blandeapparatet og overføres deretter til et annet kar for oppsamling.

Den organiske komponent består av et passende ikke-toksisk, farmasøytisk akseptabel løsningsmiddel så som for eksempel etanol, glyserol, propylenglykol og polyetylenglykol, og et passende fosfolipid som er løselig i løsningsmiddelet. Passende fosfolipider som kan anvendes, omfatter for eksempel lecitin, fosfatidylcholin, fosfatydylserin, fosfati-dyletanolamin, fosfatidylinositol, lysofosfatidylcholin og fosfatidylglyserol. Andre lipofile additiver kan anvendes for selektivt å modifisere liposomenes karakteristiske egenskaper. Eksempler på slike andre additiver omfatter stearylamin, fosfatidisk syre, tokoferol, kolesterol og lanolinekstrakter.

Dessuten kan andre ingredienser som kan forhindre oksidasjon av fosfolipidene adderes til den organiske komponent. Eksempler på slike andre ingredienser omfatter tokoferol, butylert hydroksyanisol, butylert hydroksytoluen, askorbyl-palmitat og askorbyloleat. Konserveringsmidler så som ben-zosyre, metylparaben og propylparaben kan også tilsettes.

I tillegg til de ovenfor beskrevne sammensetninger kan belegg benyttes, f.eks. plastere, bandasjer, forbindinger, gasbindputer og lignende, inneholdende en passende mengde av et anti-VLA-antistoffterapeutikum. I noen tilfeller kan det benyttes plastere, bandasjer, forbindinger, gasbindputer og lignende som er blitt impregnert med en topisk formulering inneholdende den terapeutiske formulering.

De farmasøytiske sammensetninger kan også administreres ved nasal aerosol eller inhalering ved anvendelse av en forstøver, en tørrpulverinhalator eller en oppmålende doseinhalator. Slike sammensetninger fremstilles i henhold til teknikker som er velkjent i faget farmasøytisk formulering, og de kan fremstilles som oppløsninger i saltløsning, under anvendelse av benzylalkohol eller andre passende konserveringsmidler, absorpsjonsaktivatorer for å høyne biotilgjengeligheten, fluorkarboner og/eller andre konvensjonelle oppløsnings- eller dispergeringsmidler.

I henhold til en annen utførelsesform kan sammensetninger inneholdende en aktuell forbindelse også omfatte et ytterligere middel valgt fra gruppen bestående av kortikosteroider, antiinflammatoriske midler, immuno-suppressanter, antimetabolitter og immunomodulatorer. Spesifikke forbindelser innenfor hver av disse klasser kan velges fra enhver av de som er opplistet under de passende gruppeoverskrifter i "Comprehensive Medicinal Chemistry", Pergamon Press, Oxford, England, s. 970-986 (1990). Også inkludert innenfor denne gruppe er forbindelser så som teofyllin, sulfasalazin og aminosalicylater (antiinflammatoriske midler); cyklosporin, FK-506 og rapamycin (immuno-suppressanter); cyklofosfamid og metotrexat (antimetabolitter) ; steroider (inhalerte, orale eller topiske) og interferoner (immunomodulatorer).

Doseringen og doseraten som er effektiv for å frembringe de ønskede virkninger, vil avhenge av mange forskjellige faktorer, så som antagonistens natur, individets størrelse, behandlingens mål, den behandlede patologis nature, den spesifikke farmasøytiske sammensetning som anvendes, og den behandlende lege. Doseringsnivåer på mellom ca. 0,001 og ca. 100 mg/kg kroppsvekt pr. dag, fortrinnsvis mellom ca. 0,1 og ca. 50 mg/kg kroppsvekt pr. dag av den aktive forbindelse er nyttige. Mest foretrukket vil det VLA-4-bindende middel, hvis det er et antistoff eller antistoff-derivat, administreres i en dose varierende mellom ca. 0,1 mg/kg kroppsvekt/dag og ca. 20 mg/kg kroppsvekt/dag, fortrinnsvis varierende mellom ca. 0,1 mg/kg kroppsvekt/dag og ca. 10 mg/kg kroppsvekt/dag og ved intervaller på hver 1-14 dager. For ikke-antistoff eller småmolekylbindende midler bør doseområdet fortrinnsvis være mellom molare ekvivalente mengder med mengdene av antistoff. Fortrinnsvis administreres en antistoffsammensetning i en mengde som er tilstrekkelig for å gi et plasmanivå av antistoff på minst 1 mg/ml. Optimering av doseringene kan bestemmes ved administrasjon av bindingsmidler, etterfulgt av vurdering av belegningen av integrin-positive celler ved hjelp av middelet over tid etter ha blitt administrert ved en gitt dose in vivo.

Nærvær av det administrerte middel kan påvises in vitro (eller ex vivo) ved den manglende eller reduserte evne hos individets celler til binde det samme middel som selv er blitt merket (f.eks. av en fluorochrome). Den foretrukne dosering bør fremkalle påviselig belegning av det omfattende flertall av integrin-positive celler. Fortrinnsvis opprettholdes belegningen når det gjelder en antistoffhomolog i en 1-14 dagers periode.

Personer med ordinære kunnskaper i faget kan lett teste om en antagonist har sin tiltenkte virkning. Standard tester for klinisk gjenfinning (f.eks. lavage og FACS-skanning med hensyn til antistoffbinding; forbedring i forsert vital lungekapasitet) vil kunne utnyttes av fagfolk for å bestemme effektiviteten. For eksempel testes celler som fins i en prøve av individets lungevev, med hensyn til nærvær av middelet in vitro (eller ex vivo) under anvendelse av et andre reagens for å påvise det administrerte middel. For eksempel kan dette være et fluorochrom-merket antistoff som er spesifikt for det administrerte middel som deretter måles ved standard FACS-analyse (fluorescensaktivert cellesorterer). Alternativt påvises nærvær av det administrerte middel in vitro (eller ex vivo) ved individets cellers manglende eller reduserte evne til å binde det samme middel som selv er blitt merket (f.eks. av en fluorochrome). Den foretrukne dosering bør fremkalle påviselig belegning av det store flertall av integrinpositive celler. Fortrinnsvis opprettholdes belegningen når det gjelder en antistoffhomolog i en 1-14 dagers periode.

EKSEMPEL 1: DYREMODELLER FOR PULMONAR FIBROSE

Meget bevismateriale har dokumentert at inflammatoriske celler og mediatorer er involvert i pulmonar fibrose i utbredt anvendte gnagermodeller med bleomycin (BL). Denne modell er tiltalende fordi den fremkaller et karakteristisk bilde av fibrose med mange av komponentene i menneskets sykdom, og fordi BL-indusert pulmonar fibrose er en velkjent uheldig virkning i human kjemoterapi. Intratrakeal (IT) inndrypping av BL i gnagere er blitt anvendt i stor utstrekning for å studere fibrogenesens mekanismer og for separering av potensielt ønskelige antifibrotiske forbindelser. Skjønt den initielle årsak til BL-indusert pulmonar toksisitet tilskrives genereringen av reaktivt oksygen (ROS) så snart det bindes til jern og DNA, involverer prosessen som fører til den endelige manifestasjon av pulmonar fibrose, frigivelse av forskjellige inflammatoriske mediatorer (Giri og Wang., Comments Toxicol., 3: 145-176 (1989)). Patogenesen av BL-indusert lungeskade er initielt ledsaget av ødem, blødning og et cellulær infil-trat dominert av neutrofiler og makrofager. En altfor stor akkumulering av de inflammatoriske leukocytter i vaskulære, interstitielle og alveolare rom i lungene vil kunne påføre vaskulær og parenkymal skade ved generering av ROS og proteolytiske enzymer. Neutrofiler inneholder vesentlige mengder av myeloperoksidase (MPO), som kan oksidere Cl<->til underklorsyre (H0C1) i en reaksjon med H2O2, og den neutro-filavledede H0C1 er kjent for å forårsake cellulær toksisitet. Makrofagisk og neutrofilt avledet ROS er i stand til å stimulere produksjonen av proinflammatoriske og fibro-geniske cytokiner som medierer utvidet fibroproliferativ respons (Phan og Kunkel., Exp. Lung Res., 18: 29-43

(1992)). I tillegg til en stor inflammatorisk celle-infiltrasjon karakteriseres videre den fibrotiske prosess ved en hyperproliferativ respons av aktiverte fibroblaster. De fibroblastlignende celler er primært ansvarlige for en absolutt økning i lungenes kollageninnhold og en abnormal-litet i den ultrastrukturelle opptreden og den romlige fordeling av kollagentypene.

Eksempel 2

Inhibisjon av fibrose med en antagonist til alfa4-subenhet-holdig integrin

Materialer og metoder

Et ikke-spesifikt kontrollantistoff (1E6) og antistoff mot alfa4-subenhetholdige integriner (PS2) ble anvendt. 1E6 er et murint anti-humant LFA3 (domene 1) IgGl-monoklonalt antistoff. Se Miller, Hochman, Meier, Tizard, Bixler, Rosa, og Wallner (1992) J. Exp. Med. 178: 211-222. PS/2 fremstilles ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet av Miyake et al., J. Exp. Med., 173: 599-607 (1991).

Kronisk respiratorisk sykdomfrie C57BL/6-hannmus som veide 25-30 g ble innkjøpt fra Charles River Laboratory. Bleomycinsulfat (med varemerket Blenoxane) var en gave fra Bristol Laboratories, (Syracuse, NY). L-[3,4-3H]prolinet for merking av prokollagensubstratet av prolylhydroksylase ble anskaffet fra NEN Life Science Products (Boston, MA). Z-fix, et vandig bufret sinkformalin, ble innkjøpt fra Anatech, LTD (Battle Creek, MI). Alle andre reagenser var reagensgradert eller av høyere renhet og anskaffet fra vanlige kommersielle kilder.

Behandling av dyrene.

Musene ble innhuset 4 stykker pr. bur og tatt hand om i henhold til "NIH's Guidelines for Animal Welfare". Musene fikk lov til å akklimatisere seg i anlegget i en uke før behandlingene. En 12 h/12 h lys/mørke-syklus ble opprett-holdt, og musene hadde tilgang til vann og føde (Rodent Laboratory Chow) etter behag.

Dyrene ble vilkårlig inndelt i 4 eksperimentgrupper: 1) SA + SA; 2) BL + 1E6; 3) BL + SA; og 4) BL + PS2. Musene ble intratrakealt (IT) injisert med en enkelt dose av salt-løsning eller BL i en konsentrasjon av 0,08 enheter/100 mikroliter/mus under xylazin- og ketaminanestesi. Etter IT-inndrypning fikk musene EP-injeksjon av 1E6, SA eller PS2 (100 mikrogram i 0,2ml/mus) tre ganger i uken. 21 dager etter BL-inndrypningen ble musene avlivet under pento-barbital anestesi for analyse av bronkoalveolar lavagevæske (BALF), biokjemiske og histopatologiske analyser.

Tilberedning av BALF og lungevev

Etter anestesi ble bukhulrommet åpnet etterfulgt av ekssan-kvinasjon av den nedadgående abdominale aorta. Lungene ble preparert for lavage ved å kanylere trakea med en butt nål tilknyttet en sprøyte. Lungelavagen ble utført med 3 ml kald isotonisk saltløsning gitt i 1 ml alikvoter. En alikvot av BALF ble tatt for total celletelling. Den gjenværende BALF ble sentrifugert ved 1500g i 20 min ved 4 grader C, den resulterende supernatant ble alikvotert og deretter lagret ved -70 grader C. Etter BALF ble lungelappene hurtig dis-sekert og frigjort for ikke-parenkymalt vev, umiddelbart frosset i flytende nitrogen og lagret ved -70 grader C. Senere ble de frosne lunger tint og homogenisert i 0,1 M KC1, 0,02 M Tris (pH 7,6) med en Polytron homogenisator (Brinkmann Instruments Inc., Westbury, NY). Homogenatet ble grundig blandet ved gjentatte inversjoner, og de endelige homogenatvolumer (4-5 ml) ble notert. Homogenatet ble opp-delt i flere alikvoter og lagret ved -70 grader C for biokjemiske målinger.

Bestemmelse av lungemalondialdehydekvivalent og hydroksyprolininnhold.

Lungemalondialdehydekvivalenten ble beregnet fra den totale mengde av tiobarbitursyrereagerende produkter i det ufrak-sjonerte homogenat ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet av Ohkawa et al., Anal. Biochem., 95: 351 (1979). For under-søkelse av lungehydroksyprolin ble 1 ml av homogenatet ut-felt med 0,25 ml iskald 50% (w/v) trikloreddiksyre og sentrifugert, og utfellingen ble hydrolysert i 2 ml 6 N HC1 i 18 timer ved 110 grader C. Hydroksyprolininnholdet ble målt ved hjelp av teknikken beskrevet av Woessner, J.F., Arch. Biochem. Biophys., 93: 440 (1961).

Bestemmelse av prolylhydroksylaseaktivitet ( EC 1. 14. 11. 2).

Fremstillingen av prolylhydroksylasesubstrat (prokollagen) og metoden for prolylhydroksylaseundersøkelsen er beskrevet i Giri, S.N. et al., Exp. Mol. Pathol. 39: 317 (1983). I korthet går den ut på at nyisolert tibia fra ti dager gamle kyllingembryoer ble merket med [3H]-prolin i prolinfritt kulturmedium ved 37 grader C i 6 h. Etter fjerning av uinn-lemmet tracer ved vasking, ble vevet homogenisert og sentrifugert ved 3000 g i 20 min ved 4 grader C. Den resulterende supernatant ble dialysert inngående for å fjerne den uinnlemmede tracer. Det merkede prokollagen-substrat ble alikvotert og lagret ved -70 grader C. Inkubasjonsblandingen for enzymundersøkelsen i et totalt volum på 2 ml bestod av ferroammoniumsulfat (0,1 mmol/1), alfa-ketoglutarsyre (0,1 mmol/1), [3H]-prolinprokollagen

(200000 dpm), lungehomogenat (0,2 ml), askorbinsyre (0,5 mmol/1), og TRIS-saltsyrebuffer (0,1 mol/l, pH 7,8). Reaksjonen fant sted ved å tilsette 0,2 ml 50% trikloreddiksyre etter 30 min ved 37 grader C i et Dubnoff meta-bolisk rysteapparat. Under reaksjonen frigis tritiert vann i støkiometrisk mengde for prolylhydroksylering, og dette anvendes som mål på enzymaktiviteten. Det tritierte vann i reaksjonssystemet ble separert ved vakuumdistillasjon av hele reaksjonsblandingen og talt med hensyn til radio-aktivitet. Enzymaktiviteten ble uttrykt som dpm tritiert vann frigitt pr. totale lunge pr. 30 min.

Bestemmelse av celletellinger i BALF.

Det totale celletall i BALF ble bestemt som beskrevet i Wang, Q. et al., Lab. Invest., 67: 234-242 (1992). Totalt leukocyttall i BALF ble beregnet ved Coulter counter (Modell F, Coulter Electronics, Inc., Hialeah, FL), i henhold til brukerhåndboken.

BALF- proteinundersøkelse

Proteininnhold i BALF-supernatanten ble bestemt under anvendelse av Bio-Rad-proteinundersøkelsen (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), og bovint serumalbumin ble anvendt som standard.

Histopatologisk og immunohistokjemisk analyse.

Tre til fire dyr fra hver behandlingsgruppe ble vilkårlig valgt for histopatologisk og immunohistokjemisk evaluering ved slutten av eksperimentet. Bukhulrommet på dyret ble åpnet etterfulgt av ekssankvinering av den nedadgående abdominale aorta. Umiddelbart deretter ble lungevevet fremstilt for histologisk analyse som beskrevet i Wang et al, ovenfor. Etter kanylering av trakea med en butt nål ble torakalhulrommet åpnet, og deretter ble både hjerte og lunger fjernet under ett. Lungene ble fiksert med Z-fikse- ringsløsning via trakea ved et trykk på 30 cm vann. Den høyre kranie- og kaudallapp og den venstre lapp ble senere blokkert, innkapslet i parafin, skåret i 7-mikroners snitt og farvet med hematoksylin og eosin. For immunohistokjemisk farving med hensyn til alfaSMA ble lungevev-snitt avparafinert, og endogen peroksidase ble blokkert. Snitt som skulle farves, ble deretter behandlet med blokkerende gjeteserum i 30 min og ble inkubert i 16 h med det primære monoklonale anti-alfaSMA-antistoff (Sigma Chemical Co., St Louis, MO).

Statistisk analyse av dataene.

Dataene fra dyreforsøkene ble uttrykt på grunnlag av den totale lunge og ble reported som middelverdien + standard avvik (SE). Dataene ble sammenlignet innenfor de fire grupper under anvendelse av to-veisvarianseanalyse (SIGMASTAT) og Student-Newman-Keuls meode. En verdi på P<0,05 ble betraktet som signifikant.

RESULTATER

Lipidperoksidasjon i muselunge.

Ekvivalent innhold av malondialdehyd i lungene som indeks for lipidperoksidasjon ble evaluert i forskjellige grupper av mus. BL-inndrypning økte significant det ekvivalente malondialdehydinnhold i muselunger i både BL+IE6- og BL+SA-gruppene sammenlignet med SA+SA- og BL+PS2-gruppene (data ikke angitt). Behandlingen med PS2 blokkerte effektivt den BL-induserte lipidperoksidasjon i lungene, siden det ekvivalente nivå av malondialdehyd i lungene i BL+PS2-gruppen ikke er forskjellig fra nivået i SA+SA-gruppen.

Hydroksyprolininnhold i muselunge.

Hydroksyprolin i lungene, nøkkelindeksen for kollagennivået i lungene ble bestemt for de 4 grupper av mus. IT-inndryp ningen av BL hevet signifikant lungenes hydroksyprolinnivå i BL+IE6- og BL+SA-gruppene med 185% henholdsvis 205% i SA+SA-kontrollgruppen. Den BL-induserte økning i lungenes hydroksyprolinnivå i BL+PS2-gruppen ble minsket signifikant med 35% ved behandlingen med PS2 sammenlignet med BL+SA-gruppen. Lungenes hydroksyprolin-nivå i BL+TR-gruppen var ikke signifikant høyere enn nivået i IT SA-kontrollgruppen

(SA+SA).

Prolylhydroksylaseaktivitet i muselunge.

Prolylhydroksylaseaktivitetene i lungene hos forskjellige grupper viste at BL alene signifikant økte lungenes prolylhydroksylaseaktivitet i BL+SA-gruppen med 207% i SA+SA-kontrollgruppen. PS2 minsket signifikant prolyl-hydroksylaseaktiviteten som var hevet ved BL-behandlingen i BL+SA-gruppen.

Totale BALF- celletellinger i muselunge.

Antallet av totale celler i BALF i forskjellige grupper 21 dager etter IT-inndrypning av saltløsning eller BL viste at BL-behandling økte de totale celletellinger i BALF fra BL+IE6- og BL+SA-gruppene sammenlignet med kontrollgruppe med saltløsning (SA+SA), skjønt bare BL+IE6-gruppen hadde signifikant høyere nivåer enn SA+SA-gruppen. BALF-celletallet i BL+PS2 gruppe var ikke forskjellig fra celletallet i SA+SA-gruppe.

Proteininnhold i BALF.

Proteininnholdet i BALF-supernatanten for de 4 eksperi-mentelle grupper viste at IT-inndrypning av BL signifikant økte BALF-proteinet i alle de BL-behandlede grupper sammenlignet med SA+SA-gruppen. Imidlertid minsket behandling med PS2 i BL+PS2-gruppen den BL-induserte økning i BALF-super-natantens protein, skjønt forskjellen ikke var statistisk signifikant.

Histopatologi av muselunge.

Histologisk undersøkelse av muselungene viste normalt pulmonart parenkymalt vev i SA+SA-gruppen. Imidlertid viste lungene fra BL+IE6- og BL+SA-gruppen en flekkvis alveolit-tisk og multifokal interstitiell fibrose inneholdende en akkumulering av ekstracellulære fibere. Lungene hos mus i disse grupper hadde fortykkede interalveolare septa og inflammatoriske celler i tilgrensende luftrom. Sammenlignet med BL+IE6- og BL+SA-gruppene hadde lungene fra BL+PS2-gruppen mange færre fibrotiske lesjoner, skjønt noen lapper likevel viste en mild grad av interstitiell fibrose.

Immunohistokjemisk farving for alfaSMA i muselunge.

For å bestemme akkumuleringen av fibroblaster og fibroblast-lignende celler i mus etter BL-behandling, undersøkte vi ekspresjonen av aSMA i lungevev under anvendelse av et monoklonalt antistoff mot aSMA. I kontrollungene opptrådte immunopositiviteten i de vaskulære og bronkiale glattmuskel-lag. I lunger behandlet med BL og kontrollantistoff eller saltløsning var der omfattende og intens immunofarving innenfor fibrotiske områder, både i interstitium og pleura. Imidlertid viste BL- og PS2-behandlede lunger meget redusert immunofarving av alfaSMA, sammenlignet med BL+IE6- og BL+SA-gruppene .

Diskusjon

IPF er en lammende sykdom og reagerer dårlig på nåværende terapi. I foreliggende studium tilveiebringer vi bevis på at alfa4-subenhetholdig integrin er et annet mulig mål når det gjelder å behandle IPF. Det er generelt antatt at leukocyttene i lungene er involvert i evolusjonen av pulmonar fibrose ved sekresjon av ROS, fibrogene cytokiner og vekstfaktorer. Ferdselen og aktiveringstilstanden av leukocyttene moduleres av forskjellige overflateproteiner så som integrinene. Det er klart at celle-celle-vekselvirkninger samt celle-ECM-vekselvirkninger er kritiske for patogenesen av pulmonar fibrose. Et konsekvent funn hos pasienter med aktiv pulmonar fibrose og i dyremodeller for fibrotiske lungesykdommer er akkumuleringen av økte tall av immune og inflammatoriske celler i områder som gjennomgår fibrose.

VLA-4 uttrykkes på alle sirkulerende leukocytter og bindes til det vaskulære celleadhesjonsmolekyl (VCAM-1), et medlem av Ig-gensuperfamilien som uttrykkes på cytokinaktiverte endotele celler, og til matriksproteinsk fibronektin. Alfa4beta7 uttrykkes på en undermengde av T- og B-celler, naturlige dreperceller og eosinofiler. Det bindes til det mukosale vaskulære addressin (MAdCAM-1), et medlem av Ig-familien og den mucin-lignende familie av adhesjonsmole-kyler, samt til VCAM-1 og fibronektin. Studier in vitro har vist at VLA-4-vekselvirkning med VCAM-1 er involvert i mono-nuklear leukocyttisk og eosinofil fastholdelse til endo-telet, og transendotel migrasjon og alfa4beta7 antas å være involvert primært i leukocyttrekruteringen til tarmforbundet lymphoid vev.

I foreliggende studie minsket behandling med PS2 BL-induserte økninger summen av leukocytter i BALF. De minskede leukocytter i lungene av BL+PS2-mus kan være ansarlige for den forminskede inflammatoriske skade og fibrose i lungene av BL-behandlede dyr. Den BL-induserte lungeskade ble signifikant redusert ved behandling av PS2 som indikert ved å måle lungenes lipidperoksidasjon. Det økte kollagen i lungene er blitt forbundet med økt antall fibroblaster i interstitium og i det alveolare rom i seg selv. Mange av disse fibroblast-lignende celler er myofibroblaster som har en distinkt fenotype som omfatter ekspresjon av alfaSMA, et kontraktilt protein som vanligvis fins i glattmuskelceller og antas å være viktige i fibrogenese og sårhelbredelse. Et signifikant funn i foreliggende studie var at PS2-behandling svekket den BL-induserte myofibroblastproliferasjon. Uten ønske om å være bundet av noen spesiell teori, kan administrasjon av antistoff mot alfa-integrin ha redusert nivået av vekstfaktorer i lungene frigitt ved infiltrerende leukocytter eller direkte ha påvirket myofibroblastenes opptreden. I ethvert tilfelle vil de reduserte prolifererende myofibroblaster føre til en minskning i lungenes kollagenakkumulering i de BL-behandlede dyr i BL+PS2-gruppen.

Claims

1. Anvendelse av en sammensetning omfattende antistoff og antistoffhomologer derav som er en antagonist for en interaksjon mellom et alfa4 subenhetbærende integrin og en ligand for et alfa4 subenhetbærende integrin for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til behandling av fibrose hos et individ.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor fibrosen er fibrose hos et innvendig organ.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvor det innvendige organ er lever, lunge, nyre, blokar i hjertet eller den gastroentestinale kanal.

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvor individet lider av pulmonar fibrose, myelofibrasis, leverchirrose, mesangial proliferativ glomerulonefritt, crescentisk glomerulonefritt, diabetisk neuropati, renal intestinal fibrose eller HIV-assosiert neuropati.

5. Anvendelse ifølge krav 1, hvor fibrosen er dermal fibrose.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor individet lider av skleroderma, morfea, keloider, hypertropiske arr, familial kutan kollagenoma eller bindevevsnevi av kollagentype.

7. Anvendelse ifølge krav 1, hvor fibrosen er fibrose i øyet.

8. Anvendelse ifølge krav 7, hvor individet lider av diabetisk retinopati, postkirurgisk arrdannelse eller proliferativ vitreoretinopati.

9. Anvendelse ifølge ethvert av de foregåene krav 1 til 8, hvor sammensetningen omfatter en anti-alfa4 antistoffhomolog.

10. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, hvor antistoffhomologen er en humanisert, human eller chimerisk antistoffhomolog.

11. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav 1 til 10, hvor den farmasøytiske sammensetning er utformet til å bli administrert: (a) ved en dose fra 0,1 mg/kg per dag til 10 mg/kg per dag; (b) over en doseringsperiode på fra en til fjorten dager; og (c) i en mengde som er tilstrekkelig ti å opprettholde et plasmanivå av antistoffhomologen på 1 mg/ml eller høyere.

12. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav 1 til 11, hvor antistoffhomologen er et humanisert muse-21-6 antistoff.

13. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav 1 til 12, hvor individet er et menneske.