CZ301636B6

CZ301636B6 - Farmaceutický prípravek pro lécení fibrózy obsahující kompozici obsahující protilátkový homolog, který je antagonistou interakce integrinu nesoucího podjednotku alfa4 s ligandem tohoto integrinu

Info

Publication number: CZ301636B6
Application number: CZ20013754A
Authority: CZ
Inventors: Gotwals@Philip; R. Lobb@Roy
Original assignee: Biogen Idec Ma Inc.
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 2000-04-21
Publication date: 2010-05-12
Also published as: ATE298249T1; CN100360183C; IL206829A0; RS20080471A; CA2370814C; IL182908A0; CZ20013754A3; US6652856B2; EA006681B1; HUP0201015A2; HK1076379A1; CN1356911A; KR100837715B1; AU783054B2; KR20070102760A; CN1191860C; IL182908A; NO20015122D0; EP1173201A1; BG65578B1

Abstract

Rešení se týká použití kompozice obsahující protilátkový homolog, který je antagonistou interakce integrinu nesoucího podjednotku alfa4 s ligandem pro integrin nesoucí podjednotku alfa4, pro výrobu farmaceutického prípravku pro lécení fibrózy u subjektu, výhodne fibrózy vnitrních orgánu, jako jsou játra, plíce, ledviny, srdecní krevní cévy nebo gastrointestinální trakt. V jiném provedení je fibróza dermální fibróza, jako je napr. skleroderma, morfea, keloidy, hypertrofické jizvy, familiární kutánní kolagenom nebo névy v pojivové tkáni kolagenového typu. V dalším provedení fibróza je fibróza oka.

Description

Dosavadní stav techniky

Fibronektin a kolagen jsou proteiny, které jsou nezbytné k udržení integrity extracelulámí matrix v pojivové tkáni. Tvorba těchto proteinů je vysoce regulovaný proces ajeho narušení může vést k vývoji tkáňové fibrózy, I když vytváření fibrózní tkáně je součásti normálního prospěšného procesu hojení po poranění, za určitých okolností může abnormální akumulace fibrózního materiálu nakonec vést k selhání orgánu (Border et al. (1994) New Engí J. Med. 331:12861292). Poškození kteréhokoliv orgánu vede k stereotypní fyziologické reakci: destičkami indukovaná hemostáza, po které následuje přísun „zánětových“ buněk a aktivovaných fibroblastů. Cytokiny pocházející z buněk těchto typů řídí vytváření nové extracelulámí matrix a krevních cév (granulační tkáň). Vytváření granulační tkáně je velmi pečlivě hierarchicky uspořádaný program, ve kterém je stimulována exprese inhibitorů proteáz a proteinů extracelulámí matrix, a naopak exprese proteáz je redukována, což v důsledku vede k akumulací extracelulámí matrix, ²⁵

Ústředním bodem vývoje fibrotického onemocnění, ať již indukovaného nebo spontánního, je stimulace aktivity fibroblastů. Přísun „zánětových“ buněk a aktivovaných fibroblastů do poškozeného orgánu je závislý na schopnosti buněk těchto typů interagovat s intersticiální matrix složené především z fibronektinu a kolagenu. Tyto interakce typu buňka-buňka nebo buňka30 extracelulámí matrix jsou zprostředkovány molekulami buněčné adheze patřícími do několika rodin molekul, jedna z těchto rodin obsahuje integriny. Integriny jsou strukturně a funkčně příbuzné glykoproteiny složené z různých alfa (dosud známy alfal, alfa2 až alfal 1) a beta (betal a beta7) heterodimemích transmembránových receptorových domén, které se v různých kombinacích vyskytují u savců prakticky ve všech typech buněk (viz přehledné publikace E. C.

Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox et al., „The Pharmacology of Integrins“, Medicína! Research Rev. Vol. 195 (1994) and V. W. Engleman et al., „Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets“ in Ann, Revs. Medicinal Chemistry, Vol. 31, J. A. Bristol, Ed.; Acad, Press, NY, 1996, p.191). Byly popsány dva integriny obsahující dvě podjednotky alfa4 a byly pojmenovány alfa4betal (VLA-4) a alfa4beta7.

Fibróza plicního intersticia, IFP (Interstitial pulmonámí fibrosis) je důsledkem mnohých onemocnění plícního intersticia a vede ke snížení plicní kapacity a zhoršení vitální výměny plynů v plicích. Bez ohledu na etiologii jsou pro 1PF charakteristické zánětlivé a fibroproliferativní změny v plicích a nadměrná akumulace kolagenu v intersticiu. U pacientů s 1PF se obecně projevuje v průběhu aktivní fáze plicní fibrózy výskyt nově „rekrutovaných“ imunitních a „zánětových“ buněk, což ukazuje na to, že pulmonámí fibróza je výsledkem chybné reparace po počátečním zánětu tkáně. „Rekrutování“ zánětových buněk se v mnoha případech podílí na počátečním zánětu. Kromě tyto buňky hrají velmi složitou roli v regulaci reparačního procesu. V každém případě „rekrutování“ zánětových a imunitních buněk do plic hraje důležitou roli ve vyvolání fibrotické reakce. Přísun „zánětových“ buněk a aktivovaných fibroblastů do poškozených plic závisí na schopnosti těchto buněk interagovat se složkami ECM. Přesun a stav aktivace leukocytů jsou modulovány působením různých integrinů. Zahánění přísunu zánětových buněk do plic může být kritickým krokem v potlačení následné fibrotické reakce.

-1CZ 301636 B6

Mnohé z nemoci spojených s proliferaci ftbrózní tkáně jsou často jak chronické, tak i oslabující, jako např. kožní nemoci jako je skleroderma. Jiné, včetně např. pulmonámí fibrózy, mohou být i fatální v důsledku toho, že v současnosti dostupná léčba má významné vedlejší účinky, a obecně je neúčinná ke zpomalení nebo zastavení progrese fibrózy [Nagler et al. 1996, Am. J. Respir.

Crit. Care Med., 154:1082-86]. Existuje tudíž silná potřeba nových antifibrotických léků.

Podstata vynálezu io Předkládaný vynález se týká léčení fibróz. Původci vynálezu zkoumali možné účinky antagonistů integrinu obsahujících podjednotky alfa4 a alfal na patogenezi fibróz tak, že podávali integriny obsahující alfa4 nebo alfal podjednotku myším s plícní fibrózou. Prospěšný účinek těchto antagonistů jak na celkovou akumulaci kolagenu, tak i na rozsah fibrotických lézí v plicích vedl k předpokladu, že integriny obsahující podjednotku alfa4 a/nebo alfal jsou vhodným cílem pro antifibrotickou terapii.

Předmětem vynálezu je použití kompozice obsahující proti látkový homolog, který je antagonistou interakce integrinu nesoucího podjednotku alfa4 s ligandem pro integrin nesoucí podjednotku alfa4, pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení fibrózy u subjektu.

Jeden aspekt vynálezu se týká podávání účinného množství přípravku, který obsahuje antagonistů interakce mezi integrinem nesoucím podjednotku alfa4 a ligandem pro integrin nesoucí podjednotku alfa4, pacientovi, který trpí fibrotickým onemocněním. Antagonista je agens vázající integrin alfa4 nebo agens vázající ligand integrinů alfa4. Výhodné agens vázající integrin alfa4 je vybráno ze skupiny obsahující: a) proti látkový homolog antagonizující interakci jak VLA-4, tak alfa4beta7 s příslušnými alfa4 ligandy b) protilátkový homolog antagonizující interakci VLA-4 sjeho alfa4 ligandem, a c) protilátkový homolog antagonizující interakci alfa4beta7 sjeho alfa4 ligandem. V jiných provedeních vynálezu je protilátkový homolog vybrán ze skupiny obsahující humánní protilátku, chimérickou protilátku, humanizovanou protilátku ajejich fragmenty.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká snižování nárůstu leukocytů ve vzorku tekutiny z bronchoalveolámí laváže vyvolaného fibrotickým onemocněním, kdy se pacientovi trpícímu fibrotickým onemocněním podává účinné množství antagonisty interakce mezi integrinem nesoucím podjednotku alfa4 a ligandem integrinu nesoucího podjednotku alfa4. V některých provedeních vynálezu je agens vázající integrin alfa4 kódováno sekvencí nukleové kyseliny, která obsahuje nukleovou kyselinu hybridizující za stringentních podmínek s definovanými sekvencemi nukleových kyselin vybraných ze skupiny sekvencí uvedených v tabulce 6 Patentu US 5 840 299 nebo s komplementem těchto sekvencí nukleových kyselin. V jiném aspektu vynálezu je agens vázající integrin alfa4 kódováno sekvencí nukleové kyseliny, která obsahuje nukleovou kyselinu hybridizující za definovaných stringentních podmínek se sekvencí nukleové kyseliny kódující polypeptidovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující jisté polypeptidy definované v Patentu US 5 932 214 nebo tvořené v buňkách linie ATCC CRL 11175.

Všechny citované články včetně patentů jsou formou citace zahrnuty v předkládané přihlášce.

Definice

Pro jasnější a přesnější popis vynálezu jsou dále uvedeny definice některých pojmů a termínů, které jsou užívány v popisu vynálezu a v nárocích předkládané přihlášky.

V detailním popisu vynálezu jsou užívány následující termíny:

Superrodina integrinového velmi pozdního antigenu (VLA, very latě antigen) je tvořena strukturně a funkčně příbuznými glykoproteiny složenými z (alfa a beta) heterodimemích, trans55 membránových receptorových molekul, vyskytujících se v různých kombinacích téměř ve všech

-2 CZ 301636 B6 typech savčích buněk (viz přehledy: E. C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox et ak, „The PharmacoloQV of integrins.“ Medicinal Research Rev. (1994) and V. W. Engleman et ak, 'Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets.' in Ann. Report in Medicinal Chemistry,

Vol. 31, J. A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, p. 191). Rodina VLA integrinu obsahuje (tj. dosud jsou známy) integrin VLA-1, -2, -3, “4, -5, -6, -9 a -11, kde každá molekula obsahuje řetězec βΐ nekovalentně navázaný k řetězci alfa (al, a2, a3, a4, a5, a6 atd.),

Integrin alfa4betal (α4β1) se vyskytuje na buněčném povrchu jako receptor pro VCAM-1; fibronektin a možná i další ligandy (tyto ligandy jsou jednotlivě i souborně nazvány „alfa4 ligandy“). io Termín integrin α4β1 (zaměnitelně užívaný s označeními integrin „VLA-4“, „α4β1“ nebo „alfa4betal“) označuje polypeptidy, které jsou schopné vázat se na VCAM-1 a členy rodiny proteinů extracelulámí matrix, zejména fíbronektin, nebo jejich homology nebo fragmenty, ačkoliv odborníkům je jasné, že mohou existovat další ligandy pro VLA-4 a mohou být analyzovány obvyklými metodami. Avšak je známo, že podjednotka alfa4 může asociovat s dalšími is podjednotkami betal, takže „integrin alfa4“ (nebo integrin a4“ nebo „integrin obsahující podjednotku alfa4“ (případně „integrin obsahující podjednotku a4“) označuje takové integriny, kde je podjednotka aifa4 asociována s některou z podjednotek beta. Dalším příkladem je integrinu „alfa4“ kromě VLA-4 je také alfa4beta7 (viz Labb a Adams, cit. výše).

„Antagonista“ integrinů je jakákoliv sloučenina, která inhibuje vazbu integrinu obsahujících podjednotku alfa4 s integrinovým ligandem a/nebo receptorem. Anti-integrinová protilátka nebo protein obsahující homolog protilátky (jak budou diskutovány dále v textu) a další molekuly, jako jsou např. rozpustné formy ligandových proteinů pro integriny, jsou užitečné. K rozpustným formám ligandových proteinů pro integriny obsahující podjednotku alfa4 patří rozpustný

VCAM-1, fuzní protein obsahující VCAM-1, nebo bifunkční fúzní protein VCAM-l/Ig. Např. rozpustná forma integrinového ligandu nebo jeho fragmentu může být podávána, aby vázala integrin, a výhodné tak kompetovala o vazebná místa pro integrin na buňkách, takže toto podávání má podobný účinek jako podávání antagonisty jako je např. anti-integrinová protilátka (např. proti VLA-4). Zvláště pak rozpustné integrinové mutanty, které váží ligandy, ale nespouš30 téjí na integrinů závislou signalizační dráhu, spadají do předmětu předkládaného vynálezu. Takové mutanty integrinů působí jako kompetitivní inhibitory integrinových proteinů divokého typu a lze je proto považovat za „antagonisty“. Jinými typy antagonistů užitečných podle vynálezu jsou „malé molekuly“, jak budou definovány dále v textu.

Vynález se dále týká molekul, které antagonizují působení více než jednoho integrinů obsahujícího podjednotku alfa4, jako jsou např. malé molekuly nebo protilátkové homology, které antagonizují jak VLA-4, tak i alfa4beta7 nebo jiné kombinace integrinů obsahujících podjednotku alfa4. Vynález se také týká kombinace molekul, kdy kombinace antagonizuje působení více než jednoho integrinů, jako je např. kombinace několika malých mul nebo protilátkových homologů, které v kombinaci antagonizují jak VLA-4, tak alfa4beta7 nebo další kombinace integrinů obsahujících podjednotku alfa4.

Někteří antagonisté integrinů mohou být fúzováni nebo jinak spojeni např. s protilátkovými homology jako jsou imunoglobuliny nebo jejich fragmenty, bez omezení konkrétní strukturou integrinů nebo ligandu nebo další molekuly. Takže ve smyslu vynálezu jakékoliv agens schopné vytvářet chimérické proteiny (viz definice uvedená dále) a současně schopné vázat integrinové ligandy, které účinně blokuje nebo „obaluje“ (potahuje) integrin obsahující podjednotku alfa4, je považováno za ekvivalent antagonistů uvedených v příkladech vynálezu.

Termín „protilátkový homolog“ (zaměnitelně „homolog protilátky“) znamená intaktní protilátku složenou z lehkých a těžkých imunoglobulinových řetězců spojených disulfidickými vazbami. Termín „protilátkový homolog“ zahrnuje také protein obsahující jeden nebo více polypeptidů vybraných ze skupiny obsahující lehké řetězce imunoglobulinu, těžké řetězce imunoglobulinu ajejich fragmenty vázající antigen, kteréjsou schopné vázat jeden nebo více antigenu (tj. integrin nebo integrinový ligand). Polypeptidové složky homologů protilátky, který je složen z více než

-3CZ 301636 B6 jednoho polypeptidu, mohou být případně vázány disulfidickými můstky nebo jinak kovalentně zesítěny. Tudíž k homologům protilátek patří intaktní imunoglobuliny typů IgA, IgG, IgE, IgD,

IgM (včetně jejich subtypů), přičemž lehké řetězce těchto imunoglobulinu jsou typů kappa nebo lambda. K homologům protilátek patří také části intaktních imunoglobulinů, které si ponechávají vazebnou specifitu pro antigen, např. fragmenty Fab, Fab'a F(ab')2, fragmenty F(v), monomery nebo dimery těžkých řetězců, monomery nebo dimery lehkých řetězců nebo jejich kombinace.

Termín „homolog humanizované protilátky“ označuje homolog protilátky připravený s využitím technologie rekombinantní DNA (genového inženýrství), kde některé nebo všechny aminoio kyseliny těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinu savce jiného než člověka, které nejsou nutné pro vazbu antigenu, byly substituovány odpovídajícími aminokyselinami těžkého nebo lehkého humánního imunoglobulinu. Termín „homolog humánní protilátky“ označuje homolog protilátky, kde všechny aminokyseliny těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinu (bez ohledu na to, jestli jsou nutné pro vazbu antigenu) jsou získány z humánního zdroje.

Termín „homolog humánní protilátky“ označuje homolog protilátky připravený technologií rekombinantní DNA, kde všechny aminokyseliny těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinu jsou získány z humánního zdroje.

Termín „atomista“ integrinu označuje jakoukoliv sloučeninu, která aktivuje integrinový ligand.

„Aminokyselina“ je monomemí jednotka peptidu, polypeptidu nebo proteinu. V přirozeně se vyskytujících peptidech, polypeptidech a proteinech se vyskytuje 20 aminokyselin, které jsou všechny L-izomery. Termín aminokyselina zahrnuje také analogy aminokyselin a D-izomery aminokyselin vyskytujících se v proteinech ajejich analogy.

Termín „kovalentně navázaný“ užívaný v popisu znamená to, že specifické skupiny nebo části (např. PEGylovaný, fragment imunoglobulinu/antagonista integrinu alfa4) jsou buďto vzájemně přímo kovalentně vázány nebojsou spojeny kovalentně prostřednictvím vmezerené skupiny nebo části nebo skupin či částí jako je např. tzv. „spacer“. Tato vmezeřená skupina nebo skupiny se nazývají „spojovací skupina“. Termín „konjugovaný“ se v popisu vynálezu užívá zaměnitelně s termínem „kovalentně navázaný“. „Spacer“ pak označuje skupinu, která je vmezeřená mezi aminokyselinu nebo jinou složku integrinového antagonisty nebo jeho fragmentu a zbytek molekuly. „Spacer“ tedy odděluje aminokyselinu nebo jinou složku od zbytku molekuly, a zabra35 ňuje modifikaci plynoucí z interference funkci proteinů, a usnadňuje spojení aminokyseliny nebo j iné složky s další skupinou nebo částí.

„Expresní kontrolní sekvence“ je „sekvence kontrolující expresi“, tj. sekvence nukleotidů, která řídí a reguluje expresi genů, se kterými je operativně spojena.

„Expresní vektor“ je polynukleotid, jako je DNA plazmid nebo fág (nejobvyklejší případy), který dovoluje expresi alespoň jednoho genu, když je vektor vnesen do hostitelské buňky. Vektor může ale nemusí být schopen replikace v hostitelské buňce.

Termín „účinné množství“ činidla nebo přípravku označuje takové množství, které poskytuje požadovaný výsledek nebo projevuje požadovaný vliv na určité onemocnění, které je léčeno.

Termín „funkční ekvivalent“ aminokyselinového zbytku je I) aminokyselina mající stejné reakční vlastnosti jako aminokyselina, která je nahrazena funkčním ekvivalentem, II) aminokyselina antagonisty podle vynálezu, mající podobné vlastnosti jako aminokyselina, která je nahrazena funkčním ekvivalentem, a III) molekula jiná než aminokyselina mající podobné vlastnosti jako aminokyselinový zbytek, který je nahrazen funkčním ekvivalentem.

-4CZ 301636 B6

První polynukleotid kódující proteinového antagonistů podle vynálezu je „funkčně ekvivalentní“ ve srovnání s druhým polynukleotidem kódujícím antagonistický protein, pokud splňuje alespoň jednu z následujících podmínek:

a) „funkčně ekvivalentní“ je první polynukleotid, který hybridizuje s druhým polynukleotidem za standardních hybridizačních podmínek a/nebo je degenerovaný vzhledem k sekvenci druhého polynukleotidu. Nejvýhodněji jde o polynukleotid, který kóduje proteinovou mutantu mající aktivitu proteinového antagonisty integrinů,

b) „funkčně ekvivalentní“ je první polynukleotid, který kóduje expresí aminokyselinové sekvence kódované druhým polynukleotidem.

Obecně „antagonista integrinů“ zahrnuje, avšak není omezen pouze na ně, všechna činidla zmíněná v popisu a také jejich funkční ekvivalenty. Termín „funkční ekvivalent“ se zde týká anta15 gonisty integrinů nebo polynukleotidu kódujícího antagonistů integrinů, které mají stejný nebo lepší prospěšný účinek na příjemce jako původní antagonista integrinů, k němuž se funkční ekvivalent vztahuje. Odborníkovi je jasné, že funkčně ekvivalentní protein může být připraven rekombinantní technikou, tj. expresí „funkčně ekvivalentní“ DNA. Tudíž předkládaný vynález zahrnuje proteiny kódované přirozeně se vyskytující DNA, a také kódované DNA, která se přirozeně nevyskytuje, ale kóduje stejný protein jako je kódován přirozeně se vyskytující DNA. V důsledku degenerace nukleotidových kódujících sekvencí se mohou užít jiné polynukleotidy pro kódování stejných integrinových proteinů. K nim patří celé nebo části uvedených sekvencí, které byly změněny substitucí různých kodonu, které kódují stejný aminokyselinový zbytek v sekvenci, jde tedy o tzv. umlčenou záměnu. Takové změněné sekvence se považují za ekviva25 lenty těchto sekvencí. Tak např. Phe (F) je kódován dvěma kodony, a sice TTC nebo TTT, Tyr (Y) je kódován TAC nebo TAT a His (H) je kódován CAC nebo CAT. Na druhé straně Trp (W) je kódován jediným kodonem TGG. Tudíž je jasné, že pro danou sekvenci DNA kódující konkrétní integrin existuje mnoho degenerovaných sekvencí, které ho kódují. Tyto degenerované sekvence spadají taktéž do rozsahu předkládaného vynálezu.

Termín „chimérický“, pokud se týká antagonisty podle vynálezu, znamená, že tento antagonista obsahuje spojení (chemickým zesítěním nebo kovalentní vazbou nebo vaznou jiného typu) dvou nebo více proteinů majících různorodou strukturu a/nebo pocházejících z různorodých zdrojů. Tak např. chimérický antagonista alfa4 integrinů může obsahovat jednu Část, kterou je antago35 nista alfa4 integrinů nebo jeho fragment a další část, která není antagonistou alfa4 integrinů. Druhem chimérického proteinu je „fúzní protein“ nebo zkráceně „fúze“, což je kolineámí kovalentní spojení dvou nebo více proteinů nebo jejich fragmentů prostřednictvím jejich peptidové kostry, a to nejvýhodněji prostřednictvím exprese polynukleotidové molekuly kódující tyto proteiny. Takže k výhodným ťuzním proteinům patří chimérické proteiny, které obsahují antago40 nistu integrinů alfa4 nebo jeho fragment kovalentně navázaný k druhé části, která není antagonistou integrinů alfa4. Výhodné fúzní proteiny podle vynálezu obsahují části íntaktních protilátek, které si uchovávají vazebnou specifitu pro antigen, jako jsou např. fragmenty Fab, Fab', F(ab')2 a F(v), monomery nebo dimery těžkých nebo lehkých řetězců, dimery sestávající z jednoho těžkého a jednoho lehkého řetězce apod.

Nej výhodnější fúzní proteiny jsou chimérické proteiny obsahující jednu část, kterou je antagonista integrinů, fúzovanou nebo jinak spojenou s celým nebo částí kloubového a konstantního úseku lehkého řetězce imunoglobulinu, těžkého řetězce imunoglobulinu nebo obou. Takže předkládaný vynález se týká molekuly, která obsahuje: (1) část představující antagonistů integrinů, (2) druhý peptid, např. takový, který zvyšuje rozpustnost nebo in vivo biologický poločas antagonisty integrinů, jakoje např. člen superrodiny imunoglobulinu nebo jeho fragment nebo část, tj. napr. fragment nebo část IgG, např. konstantní úsek těžkého řetězce humánního IgGl, např. úseky CH2, CH3 a kloubový úsek. Specificky „fúze antagonista integrinu/Ig“ je protein obsahující molekulu biologicky aktivního antagonisty integrinů podle vynálezu (např. rozpustný ligand

VLA^i) nebo jeho biologicky aktivní fragment navázaný na N-konec imunoglobulinového

-5CZ 301636 B6 řetězce, přičemž část N-konce imunoglobulinu je nahrazena antagonistou integrinu. Druhem „fúze antagonista integrinu/Ig“ je „fúze integrin/Fc“, což je protein obsahující molekulu biologicky aktivního antagonisty integrinu podle vynálezu navázanou na alespoň část konstantní domény imunoglobulinu. Výhodná Fc fúze obsahuje antagonistu integrinu podle vynálezu, který je navá5 zán k fragmentu protilátky obsahujícímu C-koncovou doménu těžkého řetězce imunoglobulinu.

Termín „fúzní protein“ také znamená antagonistu integrinu, který je chemicky spojen prostřednictvím mono- nebo heterofúnkění molekuly s druhou části, která není antagonistou integrinu (čímž vzniká chimérická molekula) a je vytvořen de novo z purifikovaných proteinů, jak bude popsáno dále. Jedním příkladem chemicky spojené (na rozdíl od rekombinantně spojené) chimérické molekuly je fúzní protein, který obsahuje: (1) část zaměřující podjednotku alfa4 integrinů, tj. část VCAM-1 schopnou vázat se na VLA—4 na povrchu buněk nesoucích VLA-4, (2) druhou molekulu, která zvyšuje rozpustnost nebo in vivo biologický poločas zaměřovači části, jako je např. polyalkylenglykolový polymer, např. polyethylenglykol (PEG). Část zaměřující podjed15 notku alfa4 je přirozeně se vyskytující alfa4 ligand nebo jeho fragment, např. VCAM-1 peptid nebo podobná sekvence s konzervativními substitucemi aminokyselin.

Termín „heterologní promotor“ označuje promotor, který není v přirozeném stavu spojen s genem nebo purifikovanou nukleovou kyselinou

Termín „homologie“ (a tedy i „homologii“) je zde užíván jako synonymum s termínem „identita“ („identický“) a týká se sekvenční podobnosti dvou polypeptidových molekul nebo molekul nukleové kyseliny. Když je jedna určitá pozice ve dvou srovnávaných sekvencích obsazena stejnou bází nebo aminokyselinou (např. pozice ve dvou molekulách DNA je obsazena adeninem nebo pozice ve dvou polypeptidech je obsazena lysinem), pak dvě srovnávané molekuly jsou v této pozici homologní. Procento homologie mezi dvěma sekvencemi je funkcí počtu shodných nebo homologních pozic sdílených dvěma sekvencemi dělený celkovým počtem pozic a vynásobený 100. Tak např. jestliže 6 z 10 pozic je shodných nebo-Ii homologních, pak tyto sekvence jsou z 60 % homologní. Nebo např. DNA sekvence CTGACT a CAGGTT sdílejí 50% homologii (3 pozice ze 6 se shodují). Obecně se srovnání provádí, když jsou sekvence vzájemně přiřazeny tak, aby bylo dosaženo maximální homologie. Takové přiřazení a srovnání lze provést metodou podle Karlin a Altschul, kteráje dále podrobněji popsána,

Homologní sekvence sdílejí shodné nebo podobné zbytky aminokyselin, kde podobné amino35 kyselinové zbytky jsou konzervativní substituce nebo „povolené bodové mutace“ odpovídajících aminokyselinových zbytků vzhledem k přiřazené referenční sekvenci. V tomto smyslu „konzervativní substituce“ aminokyselinového zbytku v referenční sekvenci znamená substituci aminokyselinou, která je fyzicky nebo funkčně podobná odpovídajícímu referenčnímu zbytku, tedy např. má podobnou velikost, tvar, elektrický náboj, chemické vlastnosti včetně schopnosti vytvá40 řet kovalentní nebo vodíkové vazby apod. Zvláště výhodné jsou kovalentní substituce, které splňují kritéria definovaná jako „přijatelné bodové mutace“ v publikaci Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 5, Suppl. 3, Chapter 22: 352-354, NAt. Biomed. Res. foundation, Washington D.C., 1978.

„Homologie“ i „identita“ jsou zaměnitelné pojmy a týkají se sekvenční podobnosti dvou polypeptidových sekvencí. Homologie i identita mohou být stanoveny srovnáním pozic v každé ze dvou sekvencí, které jsou pro účel srovnání navzájem přiřazeny. Pokud je pozice ve srovnávaných sekvencích obsazena shodným aminokyselinovým zbytkem, pak jsou polypeptidy v této pozici identické, pokud je ekvivalentní pozice obsazena stejnou aminokyselinou (tj. identickou) nebo podobnou aminokyselinou (např, podobnou z hlediska sférické a/nebo elektronové povahy), pak jsou polypeptidy v této pozici homologní. Procento homologie nebo identity je funkcí počtu shodných nebo homologních pozic sdílených oběma sekvencemi. „Nepříbuzné“ nebo „nehomologní“ sekvence sdílejí méně než 40% identitu, výhodně méně než 25% identitu se sekvenci podle vynálezu.

-6CZ 301636 B6 „Procento homologie“ dvou aminokyselinových sekvencí nebo dvou sekvenci nukleových kyselin se stanovuje užitím přiřazovacího algoritmu podle Karlin a Altschul (Proč. Nat Acad.

Sci. USA 87: 2264 (1990), v modifikaci podle Karlin a Altschul (Proč. Nat. Acad. Sci., USA 90:

5873 (1993). Tento algoritmus je inkorporován v programech NBLAST nebo XBLAST podle

Altschul et ai., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). Vyhledání homologní nukleotidové sekvence se sekvenci podle vynálezu se provádí programem NBLAST s nastavením parametrů skóre = 100, délka slova = 12. Vyhledávání proteinů homologních k referenčnímu peptidu se provádí programem XBLAST s nastavením parametrů skóre = 50, délka slova = 3. Pro získání přiřazení s mezerami se užívá program Gapped BLAST podle Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389 ío (1997). Při užití programů BLAST a GappedBLAST byly užity standardní parametry těchto programů (XBLAST a NBLAST, viz http.7/www/ncbi.nlm.nih.gov).

Termín „izolovaný“ (zaměnitelný s termínem „v podstatě čistý“), pokud se týká nukleových kyselin, tj. polynukleotidových sekvencí kódujících polypeptidy, znamená RNA nebo DNA polynukleotid, část genomového polynukleotidu, cDNA nebo syntetický polynukleotid, který v důsledku svého původu nebo zacházení s ním: I) není spojen se všemi polynukleotidy se kterými je spojen v přírodě (např. je přítomen v hostitelské buňce jako expresní vektor nebo jeho Část), nebo II) je spojen s jinou nukleovou kyselinou nebo chemickou skupinou, než se kterými je spojen v přírodě, nebo III) nevyskytuje se v přírodě. Jako „izolovaná“ se dále označuje poly20 nukleotidová sekvence, která je I) amplifikovaná in vitro např. metodou polymerázové řetězové reakce (PCR), II) chemicky syntetizovaná, III) rekombinantně připravená klonováním nebo IV) purifikovaná, např. štěpením a separací na gelu. Takže „v podstatě Čistá nukleová kyselina“ je nukleová kyselina, která není bezprostředně souvisle spojena s jednou nebo oběma sekvencemi, se kterými je normálně spojena v přirozeném stavu v genomu organismu, ze kterého je izolována.

V podstatě čistá DNA také zahrnuje rekombinantní DNA, která je součástí hybridního genu kódujícího dodatečné integrinové sekvence.

„Izolovaný“ (plně zaměnitelný s termínem „v podstatě čistý“), pokud se týká polypeptidů, znamená polypeptid nebo jeho část, který v důsledku svého původu nebo zacházení s ním: I) je přítomen v hostitelské buňce jako expresní produkt části expresního vektoru), nebo II) je spojen s proteinem nebo jinou chemickou skupinou, které se odlišují od těch, se kterými je spojen v přírodě, nebo III) nevyskytuje se v přírodě. Jako „izolovaný“ se dále označuje protein, který je I) chemicky syntetizovaný nebo II) exprimovaný v hostitelské buňce a purifikován od asociovaných proteinů. Termín obecně znamená polypeptid, který byl separován od ostatních proteinů a nukleových kyselin, se kteiými je v přírodním stavu asociován. Výhodně je polypeptid separován i od látek jako jsou např. protilátky nebo gelová matrice (např. polyakrylamid), které se užívají k purifikaci.

„Multivalentní proteinový komplex“ je několik integrinových antagonistů (jeden nebo více).

Anti-integrinový protilátkový homolog nebo jeho fragment může být zesítěn nebo navázán na další protilátkový homolog nebo fragment. Přitom se může jednat o stejné nebo různé proteiny a stejné nebo různé protilátkové homology nebo fragmenty.

„Mutanta“ („mutace“ apod.) se týká jakékoliv změny v genetickém materiálu organizmu, zejmé45 na jakékoliv změny (např. delece, substituce, adice nebo alterace) v polynukleotidové sekvenci proteinu divokého typu. Termín „mutein“ označuje mutovaný protein a užívá se zaměnitelně s termínem „mutace“.

Termín „operativně spojena“ znamená v případě polynukleotidové sekvence (DNA, RNA), že sekvence je „operativně spojena“ s expresní kontrolní sekvencí, když expresní kontrolní sekvence řídí a reguluje transkripci a translaci této polynukleotidové sekvence. Termín „operativně spojena“ také znamená, že před polynukleotidovou sekvencí, která má být exprimována, je vhodný počáteční signál (start-sígnál), např. kodon ATG, a že sekvence je ve shodném čtecím rámci, který umožňuje expresi polynukleotidové sekvence pod kontrolou expresní kontrolní sekvence, a tudíž vede k produkci požadovaného polypeptidů kódovaného polynukleotidovou sekvencí.

-7CZ 301636 B6 „Farmakologické agens“ je definováno jako jedna nebo více sloučenin nebo jiných chemických individuí, která se podávají pacientovi (navíc s antagonistou podle vynálezu) a která ovlivňují působení antagonisty. Termín „farmakologické agens“ tedy označuje takové agens, které se podává v průběhu „kombinované terapie“, kdy se antagonista podle vynálezu podává buďto před, po anebo současně sjedním nebo více farmakologickými agens.

„Protein“ je polymer složený v podstatě z kterýchkoliv z dvaceti proteinových aminokyselin.

I když termín „polypeptid“ se často užívá k označení relativně velkých polypeptidů a termín io „peptid“ se často užívá k označení relativně malých polypeptidů, použití těchto termínů v oboru se často překrývá a je odlišné. V tomto popisu se termín „protein“ užívá k označení jak peptídů, tak i proteinů a polypeptidů, pokud není výslovně uvedeno jinak.

Takže termíny „peptid(y)“, „protein(y)“ a „polypeptid(y)“ jsou v tomto popisu užívány zamění15 tělně. Také termíny „polynukleotidová sekvence“ a „nukleotidová sekvence“ jsou zde užívány zaměnitelně.

„Rekombinantní“ znamená, že protein pochází z rekombinantního savčího expresního systému. Jelikož integriny nejsou glykosylované ani neobsahují disulfidické vazby, mohou být exprimo20 váný ve většině prokaryotických a eukaryotických expresních systémů.

Termín „malá molekula“ byl definován v části A2.

Termín „povrchová aminokyselina“ znamená jakoukoliv aminokyselinu, kteráje vystavena roz25 pouštědlu, když je protein sestaven do své nativní formy.

„Hybridizační podmínky“ jsou podmínky určené koncentrací solí a teplotou v podstatě shodné s podmínkami 0,5xSSC až 5xSSC a 65 °C jak pro vlastní hybridizací tak promývání. Termín „standardní hybridizační podmínky“ zde užívaný je proto operační definice zahrnující řadu hybridizací. Nicméně podmínky s vysokou stringencí (přísností) zahrnují hybridizací v pufru pro sereening plaků (obsahuje 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% Fico11 400, 0,2% hovězí sérový albumin, 50mM Tris-HCl, pH 7,5, ÍM NaCl, 0,1% difosforeČnan sodný, 1% SDS) s 10% dextransulfátem a 100pg/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 65 °C po 12 až 20 hodin a promývání v 75mM NaCl/7,5mM citrát sodný (0,5xSSC)/l% SDS při 65 °C.

Podmínky s nízkou stringencí znamenají např, hybridizací v pufru pro sereening plaků s 10% dextransulfátem a 110pg/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 55 °C po 12 až 20 hodin a promývání v 300mM NaCl/30mM citrát sodný (2xSSC)/l% SDS při 55 °C (pro podrobnosti viz Ausubel et al„ Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, lne.,1989, kapitoly 6.3.1 až 6.3.6., 1989)

Termín „léčivý přípravek“ označuje přípravek obsahující antagonistu podle vynálezu a další biologicky kompatibilní přísady. Léčivý přípravek obsahuje dále také excipienty jako je voda, minerály a nosiče, jako jsou např. proteiny.

„Pacient s fibrotickým onemocněním“ se týká pacienta trpícího fibrózou vnitřních orgánů, kožním fibrózním onemocněním, dermální fibrózou a fibrotickým onemocněním oka (avšak tento výčet není omezující). K fibróze nítřních orgánů (např. jater, plic, ledvin, srdce, krevních cév, gastroíntestinálního traktu) dochází při nemocech jako je pulmonámí fibróza, myelofibróza, cirhóza jater, mesangiální proliferativní glomerulonefritida, srpkovitá glomerulonefritida, diabe50 tická nefropatie, fibróza renálního intersticia, renální fibróza pacientů na cyklosporinu, nefropatie asociovaná s HIV.

K dermálním fibrózním onemocněním patří (avšak výčet není omezující) skleroderma; morfea, keloídy, hypertrofické jizvy, familiární kutánní kolagenem, a névy v pojivové tkáni kolageno55 vého typu. K fibrotickým onemocněním oka patří např. diabetická retinopatie, jizvení po

-8CZ 301636 B6 chirurgickém zákroku (např. po filtrační operaci glaukomu nebo krizové operaci oka) a proliferativní vitreoretinopatie. Další fibrotická onemocnění, která lze léčit přípravky podle vynálezu, jsou: revmatoidní artritida, nemoci spojené s dlouhotrvající bolestí kloubů a chátráním kloubů, progresivní systémová skleróza, polymyositida, dermatomyositida, eosinofilní fascitida, morfea,

Raynaudův syndrom a nasální polypóza. Navíc k fibrotickým onemocněním, která lze léčit přípravky podle vynálezu, patří inhibice nadměrné tvorby jizev, u kterých je známa tvorba keloidů nebo hypertrofické jizvení; inhibice nebo prevence jizvení nebo nadměrného jizvení v průběhu hojení různých typů ran, včetně chirurgických řezů, chirurgických řezů břišní stěny a traumatických lacerací, prevence nebo inhibice jizvení nebo uzávěru arterií po provedení angioplastiky, prevence nebo inhibice nadměrných jizev nebo tvorby fibrózní tkáně spojené se srdeční fibrózou po infarktu a hypersensitivní vaskulopatie.

“Účinné množství“ je takové množství, které je dostatečné k navození prospěšného nebo požadovaného účinku. Účinné množství může být podáno v jedné dávce nebo ve více dávkách.

V terapeutickém smyslu „účinné množství“ antagonisty podle vynálezu je množství dostatečné ke zmírnění, potlačení, stabilizaci, zvrácení, zpomalení nebo zpoždění progrese onemocnění podle přijatých standardů pro dané onemocnění. Detekce a měření ukazatelů účinnosti terapie se provádí celou řadou různých diagnostických metod, např. fyzikálním vyšetřením včetně krevních testů, testů pulmonámí funkce, rentgen hrudníku, vyšetření CT; bronchoskopie, broncho20 alveolámí laváž, biopsie plic.

Praktické provedení předkládaného vynálezu vyžaduje, pokud není specificky uvedeno jinak, obvyklé techniky buněčné a molekulární biologie, buněčných kultur, mikrobiologie, rekombinantní DNA, proteinové chemie, farmakologie a imunologie, které jsou odborníkům známy a jsou dostatečně popsány v odborné literatuře. Pokud není uvedeno jinak, publikace citované v předkládané přihlášce jsou celé zahrnuty formou odkazu.

Popis výhodných provedení předkládaného vynálezu

Předkládaný vynález je založen na objevu, že antagonisté integrinů obsahujících podjednotku alfa4 a jejich fragmenty mohou být využity k léčení pulmonámí fibrózy.

A. Antagonisté integrinů

Pro účely předkládaného vynálezu je antagonista integrinů antagonista jakékoliv interakce mezi integrinem a jim rozpoznávaným ligandem nebo receptorem, který tak mění (tj. zcela ruší, zpomaluje nebo jinak modifikuje) normální funkce indukované interakcemi ligand-receptor). V jednom výhodném provedení je antagonistou integrinů antagonista interakcí alfa4 integrinů s jejich ligandy, např. interakce VCAM-l/VLA-4. Je to agens, např. polypeptid nebo jiná mole40 kula, která může inhibovat nebo blokovat vazbu zprostředkovanou VCAM-1 a/nebo VLA—4 nebo může jiným způsobem modulovat funkce VCAM-1 a/nebo VLA-4, např. tím, že inhibuje nebo blokuje signální transdukci VLA-4 zprostředkovanou ligandem VLA-4 nebo signální transdukci VCAM-1 zprostředkovanou ligandem VCAM-1, a které je účinné při léčení akutních poškození mozku, výhodně stejným způsobem jako anti-VLA-4 protilátky.

Antagonista interakce VCAM-l/VLA-4 je agens, které má alespoň jednu z následujících vlastností: (1) pokrývá VLA-4 nebo se váže na VLA-4 na povrchu buněk nesoucích VLA-4 (např. endotelových buněk) se specifickou dostatečnou pro inhíbici interakce VLA-4-ligand/VLA-4, např. interakce VCAM-l/VLA-4; (2) pokrývá nebo se váže na VLA-4 na povrchu buněk nesoucích VLA-4 (např. lymfocytů) se specifickou dostatečnou pro modifikaci, výhodně inhibicí, transdukce signálu zprostředkované VLA-4, např. signalizace zprostředkované VLA4/VCAM-l; (3) pokrývá nebo se váže na VLA-4 ligand (např. VCAM-1) na endotelových buňkách se specifickou dostatečnou pro inhíbici interakce VLA-4/VCAM-1; (4) pokrývá nebo se váže na VLA-4 ligand (např. VCAM-1) se specificitou dostatečnou pro modifikaci, výhodně inhibicí signální transdukce VLA-4 zprostředkované VLA-4 ligandem, např. signální transdukce

-9CZ 301636 B6

VLA-4 zprostředkované VCAM-1. Ve výhodném provedení vynálezu má antagonista jednu nebo obě z vlastnosti 1 a 2. V jiném výhodném provedení má antagonista jednu nebo obě z vlastnosti 3 a 4. Navíc může být užit více než jeden antagonista, např. agens vázající VLA-4 se může kombinovat s agens vázajícím VCAM-1.

Jak již bylo zmíněno, antagonista podle vynálezu není omezen konkrétním typem nebo strukturou molekuly, takže antagonistou podle vynálezu a ve shodě s příklady nebo ekvivalentem agens podle vynálezu je jakékoliv agens schopné vázat se na alfa4 integriny (např. VLA4) na povrchu buněk nebo na alfa4 ligand (jako je např. VCAM-1 na povrchu buněk nesoucích alfa4 ligand) io a které účinně blokuje nebo pokrývá alfa4 integrin (např. VLA-4) nebo alfa4 ligand (např.

VCAM-1), a nazývá se „agens vázající integrin alfa4“ a připadne „agens vázající ligand alfa4 integrinu“.

Tak např. protilátky a protilátkové homology (podrobněji ještě dále) a také rozpustné formy 15 přirozených vazebných proteinů pro VLA-4 a VCAM-1 jsou užitečné podle vynálezu. K rozpustným formám přirozených vazebných proteinů pro VLA-4 patří rozpustné VCAM-1 peptidy, fúzní protein VCAM-1, bifunkČní fúzní protein VCAM-l/Ig (např. „chimérická“ molekula popsaná výše), fíbronektin, fibronektin mající alternativně sestřižený spojovací segment odlišný od typu III, a fibronektinové peptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci EILDV nebo podob20 nou konzervativně substituovanou aminokyselinovou sekvenci. K rozpustným formám přírodních vazebných proteinů pro VCAM-1 patří rozpustné peptidy VLA-4, VLA-4 fúzní proteiny, bifunkční fúzní protein VLA-4/íg apod. Termín „rozpustný peptid VLA-4“ nebo „rozpustný peptid VCAM-1“ označuje polypeptid VLA-4 nebo VCAM-1, který není schopen zakotvení v membráně. K takovým rozpustným polypeptidům patří např. polypeptidy VLA-4 a VCAM, kterým chybí dostatečný úsek membránové domény pro ukotvení polypeptídu v membráně nebo jsou modifikovány tak, že membránová doména je nefunkční. Tato vazebná agens působí tak, že kompetují s vazebnými proteiny pro VLA-4 na buněčném povrchu nebo jiným způsobem mění funkci VLA-4. Např. rozpustná forma VCAM-1 (viz např. Osbom et al. 1989, Cell, 59: 12031211) nebo její fragment se mohou podávat, aby vázala VLA-4, a výhodně tak kompetovala o vazebná místa pro VLAX na buňkách nesoucích VCAM-1, což vede k účinku podobnému podání antagonistů jako jsou malé molekuly nebo anti-VLA-4 protilátky,

1. Homology anti-integrinových protilátek

V dalším výhodném provedení vynálezu je antagonistou podle vynálezu, který váže, a tudíž blokuje nebo potahuje, integriny alfa4 na buněčném povrchu (jako jsou např. VLA-4 nebo alfa4beta7) a/nebo ligandy na buněčném povrchu pro integrin alfa4 (jako je VCAM-1) anti-VLA-4 a/nebo anti-VCAM-1 monoklonální protilátka nebo homolog takové protilátky, jak byly definovány drive v textu. K výhodným protilátkám a proti látkovým homologům, zejména pro použití v humánní terapii, patří humánní protilátkové homology, humanizované protilátkové homology, chimérické protilátkové homology, protilátkové fragmenty Fab; Fab', F(ab')2 a F(v), monomery nebo dimery těžkého nebo lehkého řetězce protilátky nebo jejich kombinace. Výhodná vazebná agens podle vynálezu jsou monoklonální protilátky proti VLA-4.

2. Malé molekuly jako antagonisté integrinu

Termín „malá molekula“ antagonisty integrinu označuje chemické agens (tj. organickou molekulu) schopné narušit interakci integrin/ligand integrinu, např. tím, že blokuje interakce VLAX/VCAM vazbou na VLA-4 nebo vazbou na VCAM-1 na povrchu buněk. Tyto malé molekuly se mohou také vázat na příslušné receptory VLA-4 a VCAM-1. Malé molekuly inhibuj ící VLA-4 a VCAM-1 jsou samy peptidy, semipeptidové sloučeniny nebo sloučeniny nepeptidové povahy, jako např. malé organické molekuly, které antagonizují interakce VCAMl/VLA-4. „Malá molekula“ ve smyslu předkládaného vynálezu nezahrnuje protilátky ani protilátkové homology. Obecně je molekulová hmotnost malých molekul obvykle menší než 1000.

-10CZ 301636 B6

Např. mohou být užity malé molekuly jako jsou oligosacharidy napodobující vazebnou doménu

VLA-4 ligandu a „pasující“ do receptorové domény VLA-4 (viz JJ. Devlin et al.; 1990, Science

249: 400-406 (1990); J.K. Scott and G.P. Smith, 1990, Science 249: 386-390, a Patent

US 4 833 092 (Geysen), všechny tyto publikace jsou zahrnuty formou odkazu). Naopak se mohou použít malé molekuly napodobující vazebnou doménu VCAM-1 ligandu a „pasující“ do receptorové domény VCAM-1.

Další příklady malých molekul užitečných podle předkládaného vynálezu lze nalézt v publikaci Komoriya et al. {„The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-Specifíc Adhesion io Site (CS1) Within Altematively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronektin Is

Leucino-Aspartic Acid-Valine“, J. Biol. Chem., 266 (23), pp. 15075-79 (1991)). Tito autoři identifikovali minimální sekvence aminokyselin nezbytné pro vazbu VLA-4 a syntetizoval různé překrývající se peptidy založené na aminokyselinové sekvenci úseku CS-1 (vazebná doména VLA-4) konkrétních druhů fibronektinu. Identifikovali peptid z 8 aminokyselin, Glu-Ile-Leu15 Asp-Val-Pro-Ser-Thr, a také dva menší překrývající se pentapeptidy, Glu-Ile-Leu-Asp-Val a Leu-Asp-Val-Pro-Ser, které vykazují inhibiční aktivitu pro buněčnou adhezi závislou na fibronektinu. Určité větší peptidy obsahující sekvenci LDV byly identifikovány jako aktivní invivo (T. A. Ferguson et al., „Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-cell-Mediated Immune Reaction In Vivo“, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, pp. 8072-76 (1991); a S. M. Wahi et al., „Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis Ín Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment“, J. Clin. Invest., 94, pp. 655-62 (1994)). Byl také popsán cyklický pentapeptid, Arg-Cys-Asp-TPro-Cys (kde TPro je 4-thioprolin), který inhibuje jak VLA-4 tak VLA-5 adhezi na fibronektin (viz např. D.M. Nowlin et al. „A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits Alfa4Betal Integrin-medíated Cell Adhesion“, J. Biol. Chem., 268(27); pp. 20352-59 (1993); a PCT/US91/04862). Tento pentapeptid byl založen na tripeptidové sekvenci

Arg-Gly-Asp z fibronektinu, která byla známa jako společný motiv v rozpoznávacím místě pro několik proteinů extracelulámí matrix. Příklady dalších VLA-4 inhibitorů byly uvedeny např. v Adams et al. „Cell Adhesion Inhibitors“, PCT/US97/13013, kde jsou popsány lineární peptidylové sloučeniny obsahující beta-aminokyseliny s inhibiční aktivitou na buněčnou adhezi.

Mezinárodní patentové přihlášky WO 94/15958 a WO 92/00995 popsaly cyklické peptidy a peptidomimetické sloučeniny s inhibiční aktivitou na buněčnou adhezi. Mezinárodní patentové přihlášky WO 93/08823 a WO 92/08464 popisují sloučeniny ínhibující buněčnou adhezi obsahující guanidinyl, močovinu a thiomočovinu. Patent US 5 260 277 popisuje guanidinylovou sloučeninu modulující buněčnou adhezi. Další peptidylovi antagonisté VLA-4 byly popsáni v D. Y. Jackson et al., „Potent α4β1 peptide antagonists as potential anti-inflammatory agens', J. Med. Chem.. 40, 3359 (1997); H. Shroff et al., 'Smáli peptide inhibitors of α4β7 mediated MadCAM-1 adhesion to lymphocytes“. Bio. Med. Chem. Lett,, 1, 2495 (1996); Patent US 5 510 332, PCT Publikace WO 98/53814, WO 97/03094, WO 97/02289, WO 96/40781, WO 96/22966, WO 96/20216, WO 96/01644, WO 96/06108 a WO 95/15973.

Takové malé molekuly mohou být připraveny tak, že se syntetizuje množství peptidů (např. délky 5 až 20 aminokyselin), semi-peptididových sloučenin nebo organických sloučenin nepeptidové povahy, a pak se provede screening těchto sloučenin na schopnost inhibovat příslušnou interakci VLA-l/kolagen nebo VLA-4/VCAM-1 (viz Patent US 4 833 092, Scott and Smith, „Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library“, Science, 249, pp. 386-90 (1990), a Devlin et al., „Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules“, Science, 249, pp. 40407 (1990).

B. Metody přípravy homologů anti-integrinových protilátek

Metody přípravy monoklonálních protilátek (mAb), včetně např. antiíntegrinových monoklonálních protilátek, jsou dobře známy (viz např. Mendrick et al. 1995, Lab. Invest. 72:367-375 (mAb k myší anti-αΐβΐ and αηύ-α2β1); Sonnenberg et al. 1987 J. Biol. Chem.262:10376-10383 (mAb k myší anti-oc6pl); Yao et al. 1996, J Cell Sel 1996 109:3139-50 (mAb k myši αηΐί-α7β1); Hemler et al. 1984, J Immunol 132:3011-8 (mAb k humánnímu α 1 βΐ); Pischel et al.

-11 CZ 301636 B6

1987 J Immunol 138:226—33 (mAb k humánnímu <χ2β1); Wayner et al. 1988, J Cell Biol

107:1881-91 (mAb k humánnímu α3β!); Hemler et al. 1987 JBiol Chem 262:11478-85 (mAb k humánnímu α4β1); Wayner et al. 1988 J Cell Biol 107:1881-91 (mAb k humánnímu α5β1);

Sonnenberg et al. 1987, J. Biol, Chem. 262:10376-10383 (mAb k humánnímu α6β!); A Wang et al. 1996 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:664-672 (mAb k humánnímu α9β1); Davies et al. 1989 J Cell Biol 109:1817-26 (mAb k humánnímu αΫβ2); Sanchez-Madrid et al. 1982, Proč Nati Acad Sci USA 79:748993 (mAb k humánnímu αΙ,β2); Diamond et al. 1993, J Cell Biol 120:1031 -43 (mAb k humánnímu αΜβ2); Stacker et al. 1991 J Immunol 146:640-55 (mAb k humánnímu αΧβ2); Van der Vieren et al 1995 Immunity 3:683-90 (mAb k humánnímu αϋβ2); io Bennett et al. 1983 Proč NatkAcadSci USA 80:2417-21 (mAb k humánnímu allbp3); Hessle et al, 1984, Differentiation 26:49-54 (mAb k humánnímu α6β4); Weinacker et al. 1994 7Biol Chem 269:6940-8 (mAb k humánnímu aVp5); Weinacker et al. 1994 J Biol Chem 269:6940-8 (mAb k humánnímu aVp6); Cerf-Bensussan et al 1992 Eur J Immunol 22:273-7 (mAb k humánnímu αΕβ7); Nishimura et al. 1994 J Biol Chem 269:28708-15 (mAb k humánnímu aVp8); Bossy et al. 1991 EMBO J 10:2375-85 (polyklonální antisérum k humánnímu α8β1); Camper et al.1998 J. Biol. Chem. 273:20383-20389 (polyklonální antisérum k humánnímu αΙΟβΙ).

Výhodní antagonisté integrinu podle předkládaného vynálezu mohou být exprimováni z intaktní nebo zkrácené genomické nebo cDNA nebo ze syntetické DNA v prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buňkách. Dimemí proteiny se izolují z kultivačního média a/nebo sestaveny a dimenzovány in vitro, aby vytvořily biologicky aktivní molekulu. Heterodimery se mohou vytvářet in vitro kombinací samostatných odlišných polypeptidových řetězců. Alternativně se mohou heterodimery připravovat v jediné buňce koexpresí nukleových kyselin kódující jednotlivé odlišné polypeptidové řetězce (viz např. WO 93/09229 nebo Patent US 5 411 941, uvedeno několik postupů přípravy rekombinantních heterodimemích proteinů). K výhodným hostitelským buňkám patří, aniž by však byl výčet takto omezen, prokaryota jako E. coli, nebo eukaryota jako kvasinky, Saccharomyces, hmyzí buňky nebo savčí buňky jako CHO, COS nebo BSC. Odborníkovi je zřejmé, že mohou být užity i jiné buňky.

Např. anti-VLA^I protilátky mohou být identifikovány imunoprecipitací 1251-značených buněčných lyzátů z buněk exprimujících VLA-4 (viz Sanchez-Madrid et al. 1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343-1349 a Hemler et al. 1987, J. Biol. Chem., 262, 1147811485). Protilátky anti-VLA-4 mohou být také identifikovány průtokovou cytometrií, např. měřením flourescenčního barevného značení buněk Ramos inkubovaných protilátkou, o které se domníváme, že rozpoznává VLA-4 (viz Elices et al., 1990 Cell, 60: 577-584), Lymfocyty užívané k přípravě hybridomových buněk jsou typicky izolovány z imunizovaných savců, jejichž sérum již bylo v takovém screeningovém testu shledáno pozitivní na přítomnost anti-VLA-4 protilátek.

Typicky se nesmrtelné buněčné linie (např. linie myelomových buněk) získávají ze stejných savců jako lymfocyty. Výhodnou nesmrtelnou buněčnou linií je linie myších myelomových buněk, které jsou sensitivní na kultivační médium obsahující hypoxantin, aminopterin a thymidin („médium HAT“). Typicky jsou tyto HAT~sensitívní myši myelomové buňky fúzovány s myšími splenocyty užitím polyethylenglykolu s molekulovou hmotností 1500 („PEG 1500“). Hybridomové buňky vzniklé fúzi jsou selektovány užitím média HAT, které usmrtí nefúzované a neproduktivně fúzované myelomové buňky (nefúzované splenocyty odumírají po několika dnech, protože nejsou transformované). Hybridomy produkující požadovanou protilátku se detekují screeningem supematantu hybridomových kultur. Tak např. hybridomy připravené k produkci anti-VLA-4 protilátek se screenují tak, že se testuje supernatant buněčné kultury na secemované protilátky mající schopnost vázat na buněčnou linii exprimující rekombinantní pod50 jednotku alfa4 (viz Elices et al., cit. výše).

Pro produkci anti-VLA-4 protilátkových homologů, kterými jsou intaktní imunoglobuliny, se hybridomové buňky pozitivní v takových testech kultivovaly v takovém médiu, takových podmínkách a po takovou dobu, které byly dostatečné k tomu, aby hybridomové buňky secemovaly monoklonální protilátky do kultivačního média. Techniky tkáňových kultur a kultivační média

- 12CZ 301636 B6 vhodná pro hybridomové buňky jsou odborníkům známy. Upravený supematant z hybridomové kultury se odebere a anti-VLA-4 protilátky se mohou připadne dále purifikovat známými metodami.

Alternativně se požadované protilátky připravují injekcí hybridomových buněk do peritoneální dutiny neimunizované myši. Hybridomové buňky proliferují v peritoneální dutině a secemují protilátky se hromadí v ascitální tekutině. Protilátky se pak získají odsátím ascitální tekutiny z peritoneální dutiny injekční stříkačkou. Již dříve bylo popsáno několik myších monoklonálních anti-VLA-4 protilátek, viz např. Sanchez-Madrid et al., 1986, viz výše; Hemler et al., 1987, viz io výše; Pulido et al., 1991, J. Biol. Chem., 266 (16), 10241-10245); Issekutz and Wykretowicz, 1991, J. Immunol., 147: 109 (TA-2 mAb). Tyto anti-VLA-4 monokíonální protilátky a další anti-VLA-4 protilátky (viz např. Patent US 5 888 507 - Biogen, lne. Včetně odkazů tam citovaných) schopné rozpoznávat alfa a/nebo beta řetězec VLA-4 jsou užitečné také podle předkládaného vynálezu. Výhodné jsou protilátky anti-VLA-4, které rozpoznávají epitopy alfa4 řetězce VLA-4 podílející se na vazbě ligandu VCAM-1 a fíbronektinu (tj. protilátky, které jsou schopny se vázat na VLA-4 v místě, které se účastní rozpoznání ligandu a tím blokovat vazbu VCAM-1 a fíbronektinu). Takové protilátky byly definovány jako protilátky specifické pro epitop B (Bl nebo B2) (Pulido et al., 1991, viz výše) a jsou to také anti-VLA-4 protilátky podle předkládaného vynálezu.

Dalšími výhodným vazebnými agens podle předkládaného vynálezu, která blokují nebo pokiývají VLA-4 ligand, jsou plně humánní monokíonální protilátkové homology proti VLA-4. Pro jejich přípravu se užívají irt vitro instruované („primed“) humánní splenocyty, jak popsali Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147, 86-95. Alternativně mohou být připraveny repertoárovým klonováním, jak popsali Persson et al., 1991, Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432-2436 nebo Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236. Patent US 5 798 230 (25. srpen 1998, „Proces for the preparation of human monoclonal antibodies and their use“) popisuje přípravu humánních monoklonálních protilátek z humánních B lymfocytů. Při této metodě jsou humánní B lymfocyty produkující protilátku imortalizovány tím, že jsou infikovány virem

Epstein-Barrové, nebo jeho derivátem, který exprimuje jádrový antigen viru Epstein-Barrové 2 (EBNA2). Funkce EBNA2, nutná pro imortalizaci, je později vyřazena, což vede ke zvýšení tvorby protilátek.

V další metodě produkce plně humánních protilátek (Patent US 5 789 650 (4, srpen 1998, „Transgenic non-human animais for producing heterologous antibodies“) se popisují transgenní zvířata s výjimkou člověka schopná vytvářet heterologní protilátky mající inaktivované endogenní imunoglobulinové geny. Endogenní imunoglobulinové geny jsou suprimovány užitím antisense polynukleotidů a/nebo antisérem namířeným proti endogenním imunoglobulinům. Heterologní protilátky jsou kódovány imunoglobulinovými geny, které se normálně nevyskytují v genomu daného druhu transgenního zvířete. Jedna nebo více sekvencí obsahujících transgen nepřeorganizovaného genu těžkého řetězce heterologního humánního imunoglobulinu se vnese do zvířete, s výjimkou člověka, a tak se vytvoří transgenní zvíře schopné funkčního přeorganizování sekvencí transgenního imunoglobulinu a produkce repertoáru protilátek různých isotypů kódovaných humánními imunoglobulinovými geny. Takové heterologní humánní protilátky jsou produ45 kovány v B lymfocytech, které jsou pak imortalizovány, tj. fúzovány s imortalizovanou buněčnou linií jako jsou např. myelomové buňky, nebo manipulací B lymfocytů jinými technikami, kdy se vytvoří permanentní buněčná linie schopná produkovat monokíonální heterologní plně humánní protilátkové homology.

Velké neimunizované humánní „phage display“ knihovny se také mohou využít pro izolaci protilátek s vysokou afinitou, které lze připravit jakožto humánní terapeutika standardními metodami fágových knihoven a exprese ve fágu („phage display“) (viz Vaughan et al, 1996).

Ještě další výhodné vazebné agens podle vynálezu blokující nebo potahující ligandy integrinu je humanizovaný rekombinantní protilátkový homolog mající anti-integrinovou specifitu. Po

- 13 CZ 301636 B6 původních metodách přípravy pravých „chimérických protilátek“ (kde vždy celý konstantní a celý variabilní úsek pocházel z odlišného zdroje) byl v dokumentu EP 0239 400 (Winter et al.) popsán nový přístup, kdy jsou protilátky změněny substitucí (uvnitř daného variabilního úseku) úseku určujícího komplementaritu (CDR) jednoho druhu tímto úsekem z jiného druhu. Tento postup lze např. užít k substituci CDR z variabilních úseků domén těžkého a lehkého řetězce humánního Ig alternativními CDR z variabilních úseků příslušných domén myší protilátky. Tyto změněné variabilní úseky Ig se pak kombinují s konstantními úseky humánního Ig, a tak se připraví protilátky, které jsou z hlediska složení plně humánní, kromě substituovaného úseku myší CDR. Předpokládalo se, že tyto CDR-substituované protilátky budou s mnohem menší io pravděpodobností vyvolávat imunitní reakci u lidí ve srovnání se zmíněnými pravými chimérickými protilátkami, neboť CDR-substituované protilátky obsahují výrazně méně složek jiného než humánního původu. Způsob „humanizace“ monoklonálních protilátek prostřednictvím tzv. „roubování“ CDR byl nazván „přestavba“ (viz Riechmann et al., 1988, Nátuře 332, 323-327;

Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 15341536).

Typicky se úseky určující komplementaritu (CDR) myší protilátky transplantují do odpovídajících úseků humánní protilátky, jelikož právě CDR (tri v těžkém řetězci a tři v lehkém řetězci protilátky) jsou ty úseky myší protilátky, které se váží na specifický antigen. Transplantace CDR se provádí metodami genetického inženýrství, kdy se DNA sekvence pro CDR určí klonováním genových segmentů variabilních (V) úseků těžkých a lehkých řetězců myších protilátek a pak se přenesou do odpovídajících humánních V úseků místně cílenou mutagenezí. V závěrečné fázi tohoto postupu se přidají genové segmenty humánních konstantních úseků požadovaného isotypů (obvykle gama I pro CH a kapa pro CL) a geny humanizovaných těžkých a lehkých řetězců jsou koexprimovány v savčích buňkách, kde produkují rozpustné humanizované protilátky.

Přenos myších CDR do humánních protilátek poskytuje těmto protilátkám antigenně vazebné vlastnosti původních myších protilátek. Šest úseků CDR v myší protilátce je umístěno strukturně ve V úseku „rámcové“ oblasti. Důvodem, proč je roubování CDR úspěšné, je to, že rámcové oblasti myších a humánních protilátek mají velmi podobné 3-D struktury s podobnými body připojení CDR, takže CDR mohou být snadno zaměněny. Takové humanizované protilátkově homology lze připravit např. jak popsali Jones et al., 1986, Nátuře 321, 522-525; Riechmann, 1988, Nátuře 332, 323-327; Queen et al, 1989, Proč. Nat. Acad. Sci, USA 86, 10029; and Orlandi et al., 1989, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 86, 3833.

Nicméně se má za to, že určité aminokyseliny uvnitř rámcové oblasti interagují s CDR a tak ovlivňují celkovou vazebnou afinitu k antigenů. Přímý přenos CDR z myší protilátky s cílem připravit rekombinantní humanizovanou protilátku bez jakékoliv modifikace V úseků rámcové oblasti humánní protilátky Často vede k částečné nebo i úplné ztrátě vazebné afinity. V mnoha případech byla kritickým momentem záměna aminokyselinových zbytků v rámcové oblasti akceptorové protilátky, aby se získala protilátka s vazebnou afinitou.

Queen et al., 1989 (viz výše) a dokument WO 90/07861 (Protein Design Labs) popsali přípravu humanizované protilátky, která obsahuje modifikované zbytky v rámcové oblasti akceptorové protilátky, tím, že se kombinovaly úseky CDR z myši monoklonální protilátky (anti-Tac) s kons45 tantními úseky a rámcovou oblastí humánního imunoglobulinu. Bylo tak ukázáno jedno řešení problému ztráty vazebné afinity, ke které Často dochází při přímém přenosu CDR bez příslušné modifikace zbytků V úseku humánní rámcové oblasti, přičemž toto řešení obsahuje dva základní kroky. V prvním krou se pomocí počítačové analýzy vyberou V úseky humánní rámcové oblasti, které mají optimální homologii proteinové sekvence s V úsekem rámcové oblastí původní myší protilátky, v popisovaném případě monoklonální protilátky anti-Tac. V druhém kroku se pomocí počítače modeluje terciární struktura V úseků myší protilátky, aby se vizualizovaly aminokyselinové zbytky rámcové oblasti protilátky, které by mohly interagovat s myšími CDR, a tyto aminokyselinové zbytky z myší sekvence jsou přeneseny na homologní humánní rámcový úsek (viz patenty US 5 693 762; US 5 693 761; US 5 585 089 a US 5 530 101 (Protein Design Labs).

- 14CZ 301636 Bó

Může se také využít odlišný postup (Tempest et al., 1991, Biotechnology 9, 266-271) a využít jako standard V úseky z rámcové oblasti z těžkých a lehkých řetězců NEWM a REI pro roubování CDR bez radikálního vnášení aminokyselinových zbytků myších sekvencí. Výhodou postupu konstrukce humanizovaných protilátek založených na NEWM a REI, jak ho popsali

Tempest et al., je to, že trojrozměrné struktury variabilních úseků NEWM a REI jsou známy z rentgenové krystalografie a je tudíž možné modelovat specifické interakce mezi CDR a aminokyselinovými zbytky V úseku rámcové oblasti.

Bez ohledu na použitý přístup příklady počátečních homologů humanizovaných protilátek dosud io připravených ukázaly, že taková příprava není jednoduchý proces. Avšak ί když uznáme, že nějaké změny v rámci protilátky jsou nutné, není možné na základě dostupných znalosti a stavu techniky předpovědět, které aminokyselinové zbytky, pokud nějaké, z rámcového úseku protilátky mají být změněny, aby byla získána funkční humanizovaná rekombinantní protilátka s požadovanou specificitou. Dosavadní výsledky ukazují, že změny nutné k zachování specificity a afinity jsou většinou jedinečné pro danou protilátku a nelze je předvídat na základě humanizace jiné protilátky.

K antagonistům integrinu obsahujícího podjednotku alfa4 užitečným podle předkládaného vynálezu patří chimérické a humanizované rekombinantní protilátkové homology (tj. intaktní imuno20 globuliny ajejich části) se specifickou B epitopu, které byly připraveny a jsou popsány v Patentu US 5 932 214 (monoklonální HP 1/2). Výchozím materiálem pro přípravu chimérických (myší variabilní - humánní konstantní) a humanizovaných homologů anti-integrinových protilátek jsou myší monoklonální anti-integrinové protilátky jak byly dříve popsány, monoklonální antiintegrinové protilátky komerčně dostupné (např. HP2/1, Amae International; Inc,, Westbrook,

Maine), nebo monoklonální anti-integrinové protilátky připravené podle předkládaného vynálezu. Další výhodné humanizované anti-VLA4 protilátkové homology byly popsány v Mezinárodní patentové přihlášce PCT/US95/01219, Athéna Neurosciences, Inc. (27. červenec 1995) a Patentu US 5 840 299 (publikace vloženy formou odkazu). Tyto humanizované anti-VLA-4 protilátky obsahují humanizovaný lehký řetězec a humanizovaný těžká řetězec. Humanizovaný lehký řetězec obsahuje tři úseky určující komplementaritu (CDR1, CDR2 aCDR3) mající aminokyselinové sekvence z odpovídajících úseků určujících komplementaritu z myšího lehkého řetězce imunoglobulinu 21.6 a rámec variabilního úseku z rámce variabilního úseku humánního lehkého kapa řetězce, s výjimkou alespoň jedné pozice, která je obsazena stejnou aminokyselinou jako je přítomna v ekvivalentní pozici v rámcovém úseku variabilní oblasti lehkého řetězce imunoglobulinu 21.6. Humanizovaný těžký řetězec obsahuje tri úseky určující komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3) mající aminokyselinové sekvence zodpovídajících úseků určujících komplementaritu z myšího těžkého řetězce imunoglobulinu 21.6 a rámec variabilního úseku z rámce variabilního úseku humánního těžkého řetězce, s výjimkou alespoň jedné pozice, kde je pozice obsazena stejnou aminokyselinou jaká je přítomna v ekvivalentní pozici v rámcovém úse40 ku variabilní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu 21.6.

Ve způsobech podle předkládaného vynálezu se užívají antagonistické molekuly, kódované sekvencemi nukleových kyselin, které hybridizují za stringentních podmínek se sekvencemi nukleových kyselin kódujících protilátky namířené proti integrinům obsahujícím podjednotku alfa4. Např. antagonista podle předkládaného vynálezu je protein, jemuž odpovídající nukleová kyselina hybridizuje za podmínek vysoké stringence s jednou nebo více sekvencemi nukleových kyselin popsaných v tabulce 6 v Patentu US 5 840 299, nebo sekvencí komplementární s jednou nebo více z těchto sekvencí. Antagonista může být také protein, jehož nukleová kyselina hybridizuje za podmínek vysoké stringence s nukleovou kyselinou kódující sekvenci id. č. 2 nebo so sekvenci id. Č. 4 z Patentu US 5 932 214. Dále antagonista je i protein, jehož nukleová kyselina hybridizuje za podmínek vysoké stringence s nukleovou kyselinou kódující variabilní doménu protilátky produkované buněčnou linií ATCC CRL 11175.

Alternativně je antagonistou podle předkládaného vynálezu protein, jemuž odpovídající nukleová kyselina hybridizuje za podmínek nízké stringence s jednou nebo více sekvencemi nukleových

-15CZ 301636 B6 kyselin popsaných v tabulce 6 v Patentu US 5 840 299, nebo sekvenci komplementární s jednou nebo více z těchto sekvencí. Antagonista může být také protein Jehož nukleová kyselina hybridizuje za podmínek nízké stringence s nukleovou kyselinou kódující sekvenci id. č. 2 nebo sekvenci id. č. 4 z Patentu US 5 932 214. Dále antagonista je i protein Jehož nukleová kyselina hybridizuje za podmínek nízké stringence s nukleovou kyselinou kódující variabilní doménu protilátky produkované buněčnou linií ATCC CRL 11175.

C. Příprava fragmentů a analogů io Fragmenty izolovaných antagonistů alfa4 integrinu (tj. fragmenty protilátkových homologů zde popsaných) lze také účinně připravovat rekombinantními metodami, proteolytickým štěpením nebo chemickou syntézou, a sice užitím postupů, které jsou odborníkům známy. Při užití rekombinantních technik se vnitřní nebo koncové fragmenty polypeptidů připravují odstraněním jednoho nebo více nukleotidů z jednoho konce (v případě terminálního fragmentu) nebo obou konců (v případě vnitřního fragmentu) z DNA sekvence kódující izolovaný polypeptid. Exprese takto mutované DNA poskytuje polypeptidové fragmenty. Štěpení endonukleázami, které „okusují konce“, může také poskytnout DNA kódující spektrum různých fragmentů. DNA kódující fragmenty proteinu mohou být připraveny také náhodným (nespecifickým) „stříháním“ DNA nebo štěpením restriktázami nebo kombinací obou postupů. Proteinové fragmenty také mohou být připraveny přímo z intaktních proteinů. Peptidy mohou být specificky štěpeny proteolytickými enzymy, ke kterým patří (přičemž výčet není omezující) plasmin, trombin, trypsin, chymotrypsin a pepsin. Každý z těchto enzymů je specifický pro určitý typ peptidové vazby, kterou štěpí. Trypsin katalyzuje hydro lýzu peptidových vazeb, kde je karbonylová skupina z bazické aminokyseliny, obvykle argininu nebo lysinu. Pepsin a chymotrypsin katalýzu ji hydrolýzu peptidových vazeb z aromatických aminokyselin jako je tryptofan, tyrosin a fenylalanin. Alternativní sady naštěpených proteinových fragmentů se připraví tím, že se zabrání štěpení v místech, která jsou citlivá k proteolytickým enzymům. Tak např. reakce ε-aminoskupíny lysinu s ethyltrifluorothioacetátem v mírně bazickém roztoku vede k zablokování aminokyselinových zbytků, k nimž přilehlá peptidová vazba již dále není hydrolyticky štěpitelná trypsinem. Proteiny mohou být modifikovány, aby vytvářely peptidové vazby, které jsou citlivé k proteolytickým enzymům. Např. alkylace cysteinových zbytků β-haloethylaminy poskytuje peptidové vazby, které nejsou hydrolyzovány trypsinem (Lindley, (1956) Nátuře 178, 647). Navíc mohou být užita chemická činidla, která štěpí peptidové řetězce v místech specifických zbytků. Např. bromkyan štěpí peptidy v methioninovém zbytku (Gross and Witkip, (1961) J. Am.

Chem: Soc. 83, 1510). Takže působením různých kombinací modifikujících proteolytických enzymů a/nebo chemických činidel na proteiny mohou být proteiny rozloženy na fragmenty požadovaných délek, které se nepřekrývají, nebo na překrývající se fragmenty požadovaných délek.

Fragmenty mohou být také syntetizovány chemicky užitím metod, které jsou odborníkům známy, jako je např. Merrifíeldova chemická syntéza na pevné fázi užívající Fmoc nebo t-Boc (viz Merrifield, Recent Progress in Hormone Research 23:451 (1967).

Příklady metod známých ze stavu techniky, které umožňují přípravu a testování fragmentů a analogů, budou diskutovány dále. Tyto nebo analogické metody lze užít pro přípravu a screening fragmentů a analogů izolovaných antagonistů integrinu alfa4, které máji biologickou aktivitu. Příklad metody pro testování toho, zda fragmenty a analogy antagonistů integrinu obsahujících podjednotku alfa4 mají biologickou aktivitu Je uveden v sekci IV a v příkladech.

D. Příprava změněných DNA sekvencí a Peptidových sekvencí: náhodné metody

Varianty aminokyselinových sekvencí proteinů mohou být připraveny náhodnou mutagenezí DNA, která kóduje protein nebo jeho určitou část. K užitečným metodám patří PCR mutageneze a saturační mutageneze. Knihovna náhodných variant aminokyselinových sekvencí může být také připravena užitím syntézy sady degenerovaných oligonukleotidových sekvencí. Metody přípravy

-16CZ 301636 B6 variant aminokyselinových sekvencí daného proteinu užitím změněných DNA sekvencí nebo peptidových sekvencí jsou odborníkům dobře známy. Následující příklady jsou uvedeny pro ilustraci těchto postupů a předkládaný vynález nijak neomezují. Odborníkovi je jasné, že pro tento účel lze užít i jiné metody.

PCR Mutageneze:

viz např. Leung et aL, (1989) Technique 1,11-15. i o Saturační mutageneze:

Jedna z metod je obecně popsána v Mayers et al., (1989) Science 229,242.

Mutageneze s degenerovanými olígonukleotidy:

Viz např. Harang, S.A., (1983) Tetrahedron 39, 3; Itakura et al., (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 323 and Itakura et al., Rekombinantní DNA, Proč. 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules, pp. 273-289 (A.G. Walton, ed.), Elsevier, Amsterdam, 1981.

E: Příprava změněných sekvenci DNA a peptidových sekvencí:

Přímé metody

Nenáhodná nebo-li cílená mutageneze poskytuje specifické sekvence nebo mutace ve specific25 kých částech polynukleotidových sekvencí, které kódující izolovaně polypeptidy, čímž vznikají varianty, které zahrnují delece inzerce nebo substituce aminokyselinových zbytků známé aminokyselinové sekvence izolovaného polypeptidu. Mutovaná místa mohou být modifikována individuálně nebo v sériích např. tím, že se (1) substituuje se nejdříve konzervativními aminokyselinami a pak se provádějí radikálnější změny v závislosti na získaných výsledcích, (2) provede delece cílového aminokyselinového zbytku, nebo (3) do sousedství vybraného místa se vloží aminokyselinové zbytky stejné nebo odlišné třídy, nebo se kombinují kroky 1 až 3.

Je jasné, že metody místně cílené mutageneze jsou jedním způsobem, jak vnést do dané polypeptidové sekvence N-koncový cystein (nebo jeho funkční ekvivalent), aby se připravilo místo pro připojení hydrofóbní skupiny.

Alanínová skenovací mutageneze:

viz Cunningham and Wells, (1989) Science 244,1081-1085.

Mutageneze zprostředkovaná olígonukleotidy:

Viz např. Adelman et ak, (1983) DNA 2, 183.

Kazetová mutageneze:

Viz Wells et ak, (1985) Gene 34, 315.

Kombinační mutageneze:

Viz např. Ladner et al., WO 88/06630 Strategie „Fág Display“

Viz např. přehledná publikace Marks et al., J. Biol. Chemistry: 267 16007-16010 (1992).

- 17CZ 301636 B6

F. další varianty antagonistů integrinu

Varianty se mohóu lišit od ostatních antagonistů integrinu zde opsaných v aminokyselinové sekvenci nebo způsobem, který se netýká sekvence, a nebo oběma způsoby. Nej výhodnější polypeptidy podle vynálezu obsahují modifikace jiné než sekvenční (nesekvenční) povahy, ke kterým patří in vivo nebo in vitro chemická derivatizace (např. jejich N-konce), a také případně změny acetylace, metylace, fosforylace, amidace, karboxylace nebo glykosylace.

K dalším analogům patří proteiny nebo jejích biologicky aktivní fragmenty, jejíchž sekvence se liší od sekvencí popsaných v patentech US 5 840 299, US 5 888 507 a US 5 932 214 (zahrnuty formou odkazu) nebo v mezinárodní přihlášce PCT US/94/00266 jednou nebo více substitucemi konzervativní nebo nekonzervativní aminokyseliny, nebo delecemi nebo inzercemi, které nenarušují biologickou aktivitu izolovaného proteinu. Ke konzervativním substitucím typicky patří sub15 stituce jedné aminokyseliny jinou aminokyselinou s podobnými vlastnostmi, jako např. substituce v rámci následujících skupin aminokyselin: valin, alanin a glycin; leucin a isoleucin; asparagová a glutamová kyselina; asparagin a glutamin; serin a threonin; lysin a arginin; a fenylalanin a tyrosin. Ke skupině nepolárních hydrofóbních aminokyselin patří alanin, leucin, isoleucin, valin, pro lín, fenylalanin, tryptofan, a methionin. Skupina polárních neutrálních aminokyselin obsahuje glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin, a glutamin. Ke skupině pozitivně nabitých (bazických) aminokyselin patří arginin, lysin, a histidin. Ke skupině negativně nabitých (kyselých) aminokyselin patří asparagová a glutamová kyselina. Další konzervativní záměny jsou odborníkovi ihned zřejmé. Tak např. aminokyselinu alanin lze konzervativně substituovat kteroukoliv aminokyselinou ze skupiny obsahující D-alanin, glycin, beta-alanin, L-cystein, a D25 cystein. Lysin lze nahradit kteroukoliv aminokyselinou ze skupiny obsahující D-lysin, arginin, D-arginin, homoarginin, methionin, D-methionin, omithin a D-omithin.

Dalšími analogy vhodnými pro předkládaný vynález jsou analogy modifikované tak, aby byla zvýšena stabilita peptidu. Takové analogy obsahují např, jednu nebo více nepeptidových vazeb (které nahrazují původní peptidové vazby) v peptidové sekvenci. Patří sem také: analogy obsahující aminokyselinové zbytky jiné než v přírodě se vyskytující L-aminokyseliny, jako jsou např. D-aminokyseliny nebo aminokyseliny nevyskytující se v přírodě nebo syntetické aminokyseliny jako jsou např. beta nebo gama aminokyseliny nebo cyklické analogy aminokyselin. Inkorporace D-aminokyseliny místo původní L-aminokyseliny v izolovaném polypeptidu může zvýšit jeho rezistenci k proteázám (viz Patent US 5 219 990).

K výhodným protilátkovým homologům patří aminokyselinové sekvence, které mají alespoň 60%, 80%, 90%, 95%, 98% nebo 99% homologii s aminokyselinovou sekvencí protilátky PS/2 (viz příklady) nebo obsahují aminokyselinovou sekvenci s alespoň 60%, 80%, 90%, 95%, 98% nebo 99% homologii s aminokyselinovými sekvencemi popsanými v Patentu US 5 840 299 (sekvence id. č. 15 - variabilní úsek lehkého řetězce, nebo sekvence id. č. 17 - variabilní úsek těžkého řetězce) nebo v Patentu US 5 932 214 (sekvence id. č. 2 nebo 4) a v mezinárodní patentové přihlášce WO 94/16 094 (sekvence vyskytující se v anti-VLA4 protilátce produkované uloženou buněčnou linií ATCC CRL 11175).

G. Formy polymerových konjugátu

Podle předkládaného vynálezu je možné užít jedinou molekulu polymeru pro konjugaci a antagonistou integrinu alfa4, avšak je možné připojit i více než jednu molekulu polymeru. Konjugované přípravky antagonisty integrinu alfa4 podle vynálezu jsou užitečné jak pro in vivo, tak i jiné než in vivo aplikace. Navíc je možné, aby konjugované polymery užívaly ještě další jakékoliv jiné další kupony, části nebo další konjugované molekuly podle finálního účelu zvolené aplikace. Tak např. v některých aplikacích může být užitečné kovalentně navázat na polymer funkční skupinu, která poskytuje polymeru rezistenci vůči degradaci UV-zářením, nebo antioxidační vlastnosti nebo jiné vlastnosti. Dalším příkladem aplikace může být výhodná funkcional izace polymeru,

-18CZ 301636 B6 aby byl reaktivní a mohl se zesítěním navázat na molekulu léčiva, čímž se mohou zlepšit různé vlastnosti celkového konjugovaného materiálu. Tudíž polymer může obsahovat jakékoliv funkční skupiny, opakující se skupiny, vazby nebo jiné základní struktury, které nevylučují jeho účinnou konjugaci s přípravkem antagonisty integrinu alfa4 pro zamýšlený účel. Další výhody předkládá5 ného vynálezu budou patmé z dalšího popisu a z patentových nároků.

Příklady polymerů, které lze výhodně užít v předkládaném vynálezu pro dosazení požadovaných vlastností přípravků jsou popsány dále na příkladu některých reakčních schémat. V kovalentně vázaných konjugátech antagonista/polymer může být polymer funkcionalizován a pak navázán na i o volné aminoskupiny antagonisty, čímž se vytvoří labilní vazby.

Antagonisté integrinů obsahujících podjednotku alfa4 nebo alfal jsou nevýhodněji konjugovánt prostřednictvím koncových reaktivních skupin na polymer, i když konjugace se může také „větvit“ z vnitrních, tedy nekoncových reaktivních skupin. Polymer s reaktivní skupinou (skupi15 námi) je označován jako „aktivovaný polymer“. Reaktivní skupina selektivně reaguje s volnou aminoskupinou nebo jinou reaktivní skupinou v molekule antagonisty. Aktivovaný polymer se nechá reagovat tak, že k napojení dojde na jakékoliv dostupné aminoskupině antagonisty integrinu jako je např. alfa aminoskupina nebo epsilon-aminoskupina lysinu. Volné karboxylové skupiny, vhodně aktivované karbonylové skupiny, guanidylová skupina, oxidované sacharidy a merkaptoskupiny antagonisty integrinu alfa4 (pokud jsou dostupné) mohou být také využity jako místa připojení.

I když polymer může být připojen kdekoliv na molekulu antagonisty integrinu, výhodné místo pro navázání polymeru na antagonistů integrinu (zejména pokud jde o protein) je N-konec antagonisty integrinu. Sekundární místo (místa) je na nebo v blízkosti C-konce a nebo prostřednictvím cukerných skupin (pokud nějaké v molekule jsou). Takže předkládaný vynález zahrnuje: (I) konjugáty antagonistů integrinu alfa4 s N-koncově navázaným polymerem, (ii) konjugáty antagonistů integrinu alfa4 s C-koncově navázaným polymerem, (III) konjugáty spojené prostřednictvím sacharidu, a také (IV) konjugáty antagonistů integrinu alfa4 s C-koncově,

N-koncově i přes cukr navázaným polymerem.

Obecně se užívá 1,0 až 10 mol aktivovaného polymeru na 1 mol antagonisty, v závislosti na koncentraci antagonisty. Konečné množství je rovnováhou mezi maximalizací rozsahu reakce a minimalizací nespecifických modifikací produktu, a současně určením reakce, která udrží optimální aktivitu, a přitom bude podle možností optimální poločas antagonisty. Výhodně je zachováno alespoň 50 % biologické aktivity antagonisty, nej výhodněji je zachováno 100 %.

Reakce se může provádět jakýmkoliv odborníkovi známým způsobem vhodným pro reakci biologicky aktivního materiálu s inertními polymery. Obecně takový způsob zahrnuje přípravu aktivovaného polymeru (který má alespoň jednu koncovou hydroxylovou skupinu) a pak reakci antagonisty s aktivovaným polymerem, čímž vznikne rozpustný protein vhodný pro formulaci do přípravku. Tato modifikační reakce se provádějí různými metodami v jednom nebo více krocích.

Jak bylo již zmíněno výše, v některých provedeních vynálezu se užívá N-konec antagonisty integrinu pro připojení k polymeru. Vhodné konvenční metody jsou k dispozici pro selektivní přípravu N-koncově modifikovaných antagonistů integrinu alfa4. Příkladem jedné takové metody je metoda redukční alkylace, kdy se využívá odlišné reaktivity různých typů primárních aminoskupin (epsilon aminoskupiny na lysinu oproti aminoskupinám na N-konci methioninu) přístupných pro derivatizací na vhodných antagonistech integrinu. Za vhodných selekčních podmínek lze dosáhnout v podstatě selektivní derivatizace vhodného antagonisty integrinu na jeho N-konci polymerem obsahujícím karbonylovou skupinu. Reakce se provádí při pH, které dovoluje využít výhodu rozdílných pKa pro epsilon-aminoskupiny lysinových zbytků a alfaaminoskupinu N-koncového zbytku v molekule antagonisty integrinu. Tento způsob chemické modifikace je odborníkům dobře znám.

-19CZ 301636 Bó

Strategie navázání polyalkylenglykolových polymerů jako je např PEG na C-konec antagonistů integrinu alfa4 (např. proteinů) může být buďto chemické navázání, nebo genetická manipulace místa, které může být využito k napojení polymerové části. Tak např. inkorporace Cys do místa v blízkosti nebo na C-konci proteinu umožní specifickou modifikaci užitím maleimidem, vinyl5 sulfonem nebo haloacetátem aktivovaných derivátů polyalkylenglykolu (např, PEG), které jsou odborníkům známy. Tyto deriváty se mohou užít pro specifickou modifikaci geneticky vnesených cysteinových zbytků díky vysoké selektivitě těchto reagens pro Cys. K dalším strategiím, představujícím alternativy pro modifikaci C-konce antagonisty integrinu podle vynálezu patří inkorporace histidové značky („tag“), která pak může být zacílena (Fancy et aL, (1996) Chem.

io & Biol. 3; 551) nebo dalších glykosylačních míst v proteinu.

Metody zaměřování cukrů jakožto míst chemické modifikace jsou také dobře známy a je tedy pravděpodobné, že polyalkylenglykolové polymery mohou být přímo a specificky přidány k cukrům (pokud takové jsou) na molekule antagonisty integrinu, které byly aktivovány oxidací,

Např. polyethylenglykol-hydrazid může být připraven ve formě relativně stabilních hydrazonových řetězců kondenzací s aldehydy a ketony. Tato vlastnost byla využita pro modifikaci proteinů prostřednictvím oxidovaných oligo-sacharidových řetězců (viz Andresz, H. et al,, (1978), Macromol. Chem, 179: 301). Konkrétně působením nitritu na PEG-karboxy methy Ihydrazid se připraví PEG-karboxymethylazid, což je elektrofilně aktivní skupina reagující s amínoskupina20 mi. Tato reakce může být využita pro přípravu polyalkylenglykolem modifikovaných proteinů (viz Patent US 4 101 380 a US 4 179 337).

Pro vytvoření přípravků obsahujících multivalentní antagonisty integrinu aífa4 lze také užít odborníkům známého postupu zprostředkovaného thiolovým linkerem (spojkou) pro zesítění proteinů. Konkrétně reaktivní aldehydové skupiny na sacharidových částech molekuly se vytvoří pomocí jodistanu sodného, vytvoří se cystaminové konjugáty prostřednictvím těchto aldehydů a indukuje se zesítění prostřednictvím thiolových skupin na cystaminech (viz Pepinsky, B. et al., (1991), J, Biol. Chem., 266: 18244-18249 and Chen, L.L: et al., (1991) J, Biol. Chem., 266: 18237-18243). Tudíž je tento chemický postup také vhodný pro modifikace polyalkylenglykolo30 vými polymery, kdy linker je inkorporován do sacharidu a polyalkylenglykolový polymer je připojen k linkerů. I když linkery obsahující aminothiol nebo hydrazin umožňují připojení jedné polymerové skupiny, struktura linkerů může být měněna tak, aby bylo možné připojit více polymerů a/nebo byla změněna prostorová orientace polymeru vzhledem k molekule antagonisty integrinu.

V praktickém provedení vynálezu se výhodně do požadovaných polymemích systémů inkorporují polyalkylenglykolové zbytky alkyl polyalkylenglykolu s alkylovou skupinou obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, výhodně polyethylenglykol (PEG), nebo poly(oxy)alkylenglykolové zbytky z takových glykolů. Takže polymer, ke kterému je protein připojen, může být homopolymer polyethylenlykolu (PEG) nebo je to polyoxyethylovaný polyol, v každém případě za předpokladu, že jde o polymer rozpustný ve vodě při teplotě místnosti. K příkladům takových polymerů, které však nejsou omezující, patří homopolymery polyalkylenoxidu jako je PEG nebo polypropylenglykoly, polyoxyethylenované glykoly, jejich kopolymery a blokové kopolymery, za předpokladu, že blokové kopolymery si uchovávají rozpustnost ve vodě, K příkladům polyoxy45 ethylovaných polyolu patří polyoxyethylovaný glycerol, polyoxyethylovaný sorbitol, polyoxyethylovaná glukóza apod. Glycerolová kostra polyoxy ethy lovaného glycerolu je shodná s kostrou vyskytující se v přírodě, např. v mono-, di- a triglyceridech živočichů a člověka. Tudíž takto rozvětvená kostra by neměla být v těle rozpoznávána jako cizorodé činidlo.

Jako alternativa k polyalkylenoxidům se může užít dextran, polyvinylpyrrolidony, polyakrylamidy, polyvinylalkoholy, polymery založené na sacharidech a další. Odborníkovi je zřejmé, že výše uvedené výčty jsou pouze ilustrativní a že vynález zahrnuje jakékoliv další polymemí materiály popsaných vlastností.

-20CZ 301636 B6

Polymer nemusí mít nějakou konkrétní molekulovou hmotnost, aleje výhodné, když molekulová hmotnost leží v rozmezí 300 až 100 000, výhodněji 10 000 až 40 000. Zejména velikosti 20 000 a více jsou výhodné pro zabránění ztrát proteinů při Filtraci v ledvinách.

Derivatizace polyalkylenglykolu má řadu výhodných vlastností pro formulaci konjugátů antagonisty integrinu s polymerem podle vynálezu, které jsou spojeny s následujícími vlastnostmi polyalkylenglykolových derivátů: mají lepší rozpustnost ve vodě, a současně nevyvolávají antigenní nebo imunogenní reakci, vysoký stupeň biologické kompatibility, absence biologické degradace polyalkylenglykolových derivátů in vivo a snadné vylučování z živých organismů.

Navíc v jiném aspektu předkládaného vynálezu může být použit antagonista integrinu alfa4 kovalentně navázaný na polymerovou složku, kde povaha konjugátů je taková, že obsahuje štěpitelné kovalentní chemické vazby. To pak umožňuje řídit časový průběh odštěpení polymeru od antagonisty integrinu. Kovalentní vazba mezi léčivem, tj. antagonistou integrinu, a polymerem může být Štěpena chemickou nebo enzymatickou reakcí. Produkt „polymer-antagonista integritu“ si přitom uchovává přijatelnou hladinu aktivity. Současně jsou přítomny v konjugovaném polymeru části polyethylenglykolu, které poskytnou produktu polymer-antagonista integrinu vysokou rozpustnost ve vodě a prodlouženou dobu cirkulace v krevním oběhu. V důsledku těchto zlepšených vlastností lze podle vynálezu uvažovat při in vivo aplikacích o parenterálním, nazálním nebo perorální podávání obou druhů aktivních molekul polymer-antagonista integrinu, a po hydrolytickém štěpení lze očekávat dobrou biologickou dostupnost antagonisty integrinu samotného.

Odborníkovi je jasné, že zde popsaná reakční schémata jsou jen pro ilustrativní účely a nejsou nijak omezující vzhledem k reakcím a strukturám, které se mohou použít pro modifikace antagonistů integrinu alfa4, aby bylo dosaženo dobré rozpustnosti, stability a afinity k buněčné membráně při parenterálním a perorálním podávání. Aktivita a stabilita těchto konjugátů antagonistů integrinu podle předkládaného vynálezu může do jisté míry kolísat, když se použijí polymery s různou velikosti molekuly. Rozpustnost konjugátů se může měnit v závislosti na podílu a velikosti polyethylen-glykolového fragmentu vloženého do polymerního přípravku.

III. Využití vynálezu

Množství účinné látky, které se kombinuje s nosičovým materiálem do jednotkové lékové formy závisí na tom, jaký pacient má být léčen a jaký je zvolen způsob podávání. Je třeba však rozumět, že konkrétní dávky a léčebný režim určitého pacienta jsou závislé na mnoha faktorech, jako je např. aktivita konkrétní použité účinné látky, věk, hmotnost, pohlaví a aktuální stav pacienta, dieta, doba podávání, rychlost vylučování, kombinace s léčivy, závažnost léčeného onemocnění a názor ošetřujícího lékaře. Množství účinné látky bude také záviset na profylaktických nebo léčivých přípravcích, které jsou podávány současně.

Léčení přípravkem podle vynálezu spočívá v tom, že se pacientovi podává účinné množství antagonisty podle vynálezu. Užívají se takové dávky, které představují účinné, netoxické množství. Odborník je schopen užitím rutinních postupů určit optimální dávky pro léčení konkrétní nemoci.

Farmaceutické přípravky

Přípravky obsahující antagonistů podle vynálezu se podávají výhodně parenterálně. Termín „parenterální“ podávání zahrnuje podávání subkutánní, intravenózní, intramuskulámí, infraartikulámí, intrasynoviální, intrastemální, intrathekální, intrahepatickou a intrakraniální injekcí nebo injekcí přímo do leze nebo infuzní podávání. Požadovaná dávka je podána pacientovi jedenkrát nebo vícekrát za den intravenózně, perorálně, rektálně, parenterálně, intranazálně, topicky nebo inhalací. Požadovaná dávka může být také podána kontinuální intravenózní infuzí.

-21 CZ 301636 B6

Protilátkové homology se výhodně podávají jakožto sterilní farmaceutické přípravky obsahující farmaceuticky přijatelný nosič, což je kterýkoliv ze známých nosičů jako je voda, solný roztok, fosfátem pufrovaný solný roztok, dextróza, glycerol, ethanol a další, nebo jejich kombinace.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu se mohou užít ve formě farmaceuticky přijatelných solí odvozených z anorganických nebo organických kyselin a bází. K příkladům takových kyselých soli patří acetát, adipát, alginát, aspartát, benzoát, benzenesulfonát, bísulfát, butyrát, citrát, kamforát, kamforsulfonát, cyklopentanpropionát, díglukonát, dodecylsulfát, ethansulfonát, fumarát, glukoheptanoát, glycerofosfát, hemisulfát, heptanoát, hexanoát, hydrochlorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroxyethansulfonát, laktát, maleát, methansulfonát, 2-naftalensulfonát, nikotinát, oxalát, pamoát, pektinát, persulfát, 3-fenylpropionát, pikrát, pivalát, propionát, sukcinát, tartrát, thiokyanát, tosylát a undekanoát. K bazickým solím patří amoniové soli, soli alkalických kovů, jak jsou sodné a draselné soli, soli kovů alkalických zemin, jako jsou vápenaté a horečnaté soli, soli s organickými bázemi jako jsou např. dicyklohexylaminové soli, N-methylD-glukamin, tris(hydroxymethyl)methylamin a soli a aminokyselinami jako je arginin, lysin atd,

Také bazické skupiny obsahující dusík mohou být kvarterizovány činidly jako jsou halogenidy nižších alkylů, jako jsou methyl-, ethyl- propyl- a butylchlorid, -bromid a -jodid; dialkylsulfáty jako je dimethyl-, diethyl, dibutyl a diamylsulfát, halogenidy s delším řetězcem jako jsou decyllauryl- myristyl- a stearyl chlorid, -bromid a jodid, aralkylhalogenidy jako jsou benzyla fenylethylbromid a další. Tak se získají přípravky rozpustné nebo dispergovatelné ve vodě nebo v oleji.

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu obsahují kteroukoliv ze sloučenin podle vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelný derivát, společně s jakýmkoliv farmaceuticky přijatelným nosičem. Termín „nosič“ v popisu vynálezu označuje farmaceuticky přijatelná adjuvans a vehikula. K farmaceuticky přijatelným nosičům vhodným pro provedení předkládaného vynálezu patří (avšak výčet není omezující) iontoměniče, oxid hlinitý, stearát hlinitý, lecitin, sérové proteiny, jako je např. humánní sérový albumin, pufrovací látky jak jsou např. fosfáty; glycin, kyselina sorbová, sorbát draselný, částečné glyceridové směsi rostlinných nasycených mastných kyselin, vody, soli nebo elektrolytů jak je např. protaminsulfát, hydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan draselný, chlorid sodný, zinečnaté soli, koloidní oxid křemičitý, křemiČitan horečnatý, polyvinylpyrrolidon, látky založené na celulóze, polyethylenglykol, sodná sůl karboxymethylcelulózy, polyakiyláty, vosky, blokové polymery polyethylenpolyoxypropylen, polyethylenglykol a tuk z ovčí vlny.

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu mohou být také ve formě sterilních injekčních přípravků, jako je např. sterilní injikovatelná vodná nebo olejová suspenze. Taková suspenze se formuluje odborníkovi známým postupem za pomoci vhodných disperguj ících, zvlhčovačích nebo suspendujících činidel. Sterilní injikovatelné přípravky mohou být také sterilní injikovatelné roztoky nebo suspenze v netoxickém parenterálně přijatelném rozpouštědle nebo ředidle, jako je např. roztok v 1,3-butandiolu. K vhodným farmaceuticky přijatelným vehikulům a rozpouštědlům, která se mohou užít, patří voda, Ringerův roztok a isotonický roztok chloridu sodného. Kromě toho sterilní, stálé oleje jsou užívány jako obvykle jako rozpouštědla nebo suspendační média. Pro tento účel se může užít jakýkoliv nedráždivý stálý olej, včetně syntetických mono- nebo diglyceridů. Mastné kyseliny, jako je kyselina olejová, a její glyceri45 dové deriváty jsou užitečné pro přípravu injikovatelných přípravků, stejně tak jako přírodní farmaceuticky přijatelné oleje jako je olivový olej, ricínový olej, obzvláště jejich polyoxyethylované verze.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu, mohou být podávány perorálně. Jestliže jsou podávány perorálně, mohou být podávány v každé perorálně přijatelné dávkové formě včetně (výčet není limitující) tobolek, tablet, vodných suspenzí nebo roztoků. V případě tablet pro perorální použití obvykle používané nosiče zahrnují laktózu a kukuřičný škrob. Jsou také typicky přidávány lubrikanty, jako například stearát horečnatý. Pro perorální podávání ve formě tobolek zahrnují použitelná ředidla laktózu a usušený kukuřičný škrob. Když je pro perorální použití vyžadována

-22CZ 301636 B6 vodná suspenze, aktivní složka je spojena s emulgátory a suspendujícími Činidly, Je-li žádoucí, mohou být také přidány určitá sladidla, příchutě nebo barviva.

Zvláštní přípravky podle vynálezu jsou přípravky, kdy antagonista podle vynálezu je formulován do vezikulů jako jsou např. přípravky obsahující lipozómy. Lipozómy jsou vezikuly (měchýřky) vytvořené amfipatickými molekulami jako jsou např, polární lipidy, např. fosfatidylcholiny, ethanolaminy a -šeřiny, sfingomyeliny, kardiolipiny, plasmalogeny, fosfatidové kyseliny a cerebrosidy. Lipozómy se vytvoří, když se vhodné amfipatickými molekuly ponechají bobtnat ve vodě nebo vodném roztoku, aby vytvořily tekuté krystaly s obvykle vícevrstevnou strukturou io obsahující několik dvoj vrstev vzájemně separovaných vodou (označované jako surové lipozómy), Jiným známým typem jsou lipozómy tvořené jedinou dvojvrstvou obalující vodnou fázi, které se nazývají jednovrstevné vezikuly. Pokud je ve vodné fázi v průběhu bobtnání lipidů přítomen ve vodě rozpustný materiál, je zachycen ve vodné vrstvě mezi lipidovými dvoj vrstvami.

Zvláště vhodnou metodou pro formulaci antagonistu podle vynálezu do lipozómových přípravků je metoda popsaná v Evropském patentu EP-A 253 619, který je zahrnut formou odkazu. Při této metodě se lipozómy s jedinou dvojvrstvou obalující účinnou látku připraví tím, že se lipidová složka rozpustí v organickém médiu, a organický roztok lipidové složky se pod tlakem vstřikuje do vodné složky za současného promíchávání organické a vodné složky vysokorychlostním hornogenizátorem nebo jiným míchacím zařízením, přičemž se spontánně vytvářejí lipozómy. Lipozómy s jednou dvojvrstvou obalující účinnou složku se mohou užít pro topickou aplikaci buďto přímo, nebo ve vhodném farmaceuticky přijatelném nosiči, Viskozita lipozómů může být zvýšena přidáním jednoho nebo více zahušťovacích činidel jako je např. xanthanová guma, hydroxypropylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza nebo jejich směsi.

Vodná složka je buďto samotná voda, nebo může obsahovat elektrolyty, pufrovací systémy a další složky jako např. konzervační látky. K vhodným elektrolytům patří soli kovů jako např. soli alkalických kovů nebo soli kovů alkalických zemin. Výhodné soli jsou chlorid vápenatý, chlorid sodný a chlorid draselný. Koncentrace elektrolytů může být různá, od 0 do 260 mM, výhodně 5 až 160 mM. Vodná složka je umístěna do vhodné nádoby, které umožňuje provádět homogenizaci, která se realizuje silnou turbulenci, v průběhu vstřikování organické složky. Homogenizace dvou složek se provádí v nádobě, alternativně se vodná a organická složka vstřikují odděleně do míchacího zařízení, které je umístěno mimo nádobu. V takovém případě se lipozómy tvoří v tomto míchacím zařízení a v nádobě se jen shromažďují.

Organickou složkou tvoří vhodné netoxické farmaceuticky přijatelné rozpouštědlo jako je např. ethanol, glycerol, propylenglykol a polyethylenglykol, a vhodný fosfolipid, který je rozpustný v rozpouštědle. K vhodným fosfolipidům patří např. lecitin, fosfatidylcholin, fosfatydylserin, fosfatidylethanolamín, fosfatidylinositol, lysofosfatidyl-cholin a fosfatidylglycerol. Další lipofil40 ní přísady mohou být užity pro selektivní modifikaci vlastností lipozómů. K příkladům takových přísad patří např. stearylamin, kyselina fosfatidová, tokoferol, cholesterol a lanolinové extrakty.

Navíc se do organické složky mohou přidávat další přísady, např. zabraňující oxidaci fosfolipidů. K takovým přísadám patří např. tokoferol, butylovaný hydroxyanisol, butylovaný hydroxytoluen, askorbylpalmitát a askorbyloleát. Také se mohou přidat konzervační činidla jako kyselina benzoová, methylparaben nebo propylparaben.

Kromě výše popsaných přípravků se pro vynález mohou využít i obvazové formy, jako např. náplasti, obinadla, obvazy, gázové polštářky apod., obsahující vhodné množství léčiva, tj. anti50 VLA protilátky. V některých případech mohou být užity náplasti, obinadla, obvazy, gázové polštářky apod., které byly impregnovány topickým přípravkem obsahujícím léčivý přípravek.

Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu mohou být také podávány jako nazální aerosol nebo inhalováním s použitím nebulizéru, inhalátoru suchého prášku nebo inhalátoru s odměře55 nými dávkami. Takové přípravky se připravují postupy dobře známých v oboru formulace farma-23CZ 301636 B6 ceutických přípravků a mohou být připraveny obvykle jako roztoky ve fyziologickém roztoku, s využitím benzylalkoholu nebo dalších vhodných konzervačních prostředků, Činidel podporujících absorpci pro zvýšení biologické dostupnosti přípravku, fluorovaných uhlovodíků a/nebo dalších obvyklých solubilizačních nebo disperguj ícich činidel.

V jiných provedeních přípravky obsahující sloučeninu podle vynálezu mohou dále obsahovat další činidlo vybrané ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, protizánětlivá činidla, imunosupresiva, antimetabolity a imunomodulátory. Specifické sloučeniny v každé z těchto skupin mohu být vybrány z jakýchkoliv sloučenin uvedených v příslušné skupině v publikaci „Comprehensive io Medicinal Chemistry“ (Pergamen Press, Oxford, England, ss. 970-986, 1990), přičemž tento popis uvedených látek je zahrnut formou odkazu. Patří sem také sloučeniny, jako například theofylin, sulfasalazin a aminosalicyláty (protizánětlivé látky); cyklosporin, FK-506, a rapamycin (imunosupresiva); cyklofosfamid a metotrexát (antimetabolity); steroidy (inhalační, perorální nebo topické) a interferony (imunomodulátory).

Dávkování sloučenin podle vynálezu a léčebný režim nutné pro dosažení požadovaného léčebného účinku závisí na celé řadě faktorů, jako je např. povaha použité sloučeniny, věk, tělesná hmotnost, pohlaví a obecný zdravotní stav pacienta, dieta, čas podávání, rychlosti vylučování, vážnost konkrétní léčené nemoci, požadovaný léčebný cíl a úsudek ošetřujícího lékaře.

Hladina dávek aktivní složky mezi přibližně 0,001 a přibližně 100 mg/kg tělesné hmotnosti denně, výhodně mezi přibližně 0,1 a přibližně 50 mg/kg tělesné hmotnosti denně je užitečná. Nej výhodněji, VLA-4 vázající činidlo, když jde o protilátku nebo její derivát, je podáváno v dávce 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti/den až 20 mg/kg tělesné hmotnosti/den, výhodně 0,1 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti/den v režimu jedenkrát za 1 až 14 dnů. V případě malých molekul nebo vazebných činidel jiných než protilátek jsou vhodné dávky molámí ekvivalenty dávek určených pro protilátky. Výhodně je proti látkový přípravek podáván v množství, které poskytuje účinnou hladinu protilátky v plazmě alespoň 1 mg/ml. Optimalizaci dávek lze určit na základě podávání vazebného činidla a následného vyhodnocení potažení buněk pozitivních na integrin činidlem v průběhu času po podání dané dávky in vivo.

Přítomnost podávaného agens může být detekována in vitro (nebo také ex vivo) pomocí neschopnosti nebo snížené schopnosti buněk pacienta vázat stejné Činidlo, které bylo samo označeno (např. fluorochromem). Výhodné dávkování by mělo vést k detekovatelnému potažení převážné většiny buněk pozitivních na integrin. Výhodně by toto potažení buněk mělo přetrvávat v případě protilátkového homologu po dobu l až 14 dnů.

Odborník může snadno testovat antagonistu podle vynálezu, zda má požadovaný účinek. Odborník k tomu užije např, standardní testy pro vyhodnocení klinického zotavování (např. laváž a užití

FACS skenování na vazbu protilátek, zlepšení nucené vitální plicní kapacity). Tak např. buňky obsažené ve vzorku pacientovy plicní tkáně se mohou testovat na přítomnost agens in vitro (nebo ex vivo) užitím druhého činidla pro detekci podávaného agens. Může to být např. fluorochromem značená protilátka specifická k podávanému agens, která se pak měří standardní FACS analýzou (třídění fluorescencí aktivovaných buněk). Alternativně přítomnost podávaného agens může být detekována in vitro (nebo také ex vivo) pomocí neschopnosti nebo snížené schopnosti buněk pacienta vázat stejné činidlo, které bylo samo označeno (např. fluorochromem). Výhodné dávkování by mělo vést k detekovatelnému potažení převážné většiny buněk pozitivních na integrin. Výhodně by toto potažení buněk mělo přetrvávat v případě protilátkového homologu po dobu 1 až 14 dnů.

Následující příklady slouží pro ilustraci předkládaného vynálezu a v žádném případě ho nijak neomezují.

-24CZ 301636 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Zvířecí modely plicní fibrózy

Existuje mnoho důkazů účasti zánětových buněk a mediátorů v pulmonámí fibróze na modelu hlodavců s bleomycinem (BL). Tento model fibrózy je přitažlivý zejména proto, že vytváří io charakteristický obraz fibrózy s mnoha složkami jako u humánní fibrózy, a také proto, že

BL-indukovaná pulmonámí fibróza je dobře známým nežádoucím účinkem v humánní chemoterapii Intratracheální (IT) instilace (nakapání) BL u hlodavců se často užívá pro výzkum mechanismů fibrogeneze a pro screening potenciálních antifbrotických sloučenin. Přestože původní příčinou BL-indukované plicní toxicity je vytváření kyslíkových radikálů (ROS), jak15 mile se naváží na železo a DNA, proces vedoucí ke konečné manifestaci pulmonámí fibrózy zahrnuje uvolnění různých zánětových mediátorů (Girl and Wang., Comments Toxicol., 3: 145-176 (1989)), Pathogeneze BL-indukovaného poškození plic začíná edémem, hemoragií a buněčným infiltrátem s převládajícími neutrofily a makrofágy. Nadměrná akumulace zánětových leukocytů v cévních, intersticiálních a alveolámích prostorech plic pak způsobuje poškození cév a parenchymu tvorbou ROS a proteolytických enzymů. Neutrofily obsahují značná množství myeloperoxidázy (MPO), která oxiduje CT na kyselinu chlomou (HOC1) v reakci s H₂O₂ a je známo, že právě HOC1 pocházejíc z neutrofilů způsobuje buněčnou toxicitu. ROS pocházející z makrofágů a neutrofilů jsou schopny stimulovat produkci prozánětových fibrogenních cytokinů, které zprostředkovávají zesílenou fibroproliferativní reakci (Phan and Kunket, Exp. Lung

Res., 18: 29-43 (1992)). Kromě rozsáhlé infiltrace zánětových buněk je fibrotický proces dále charakterizován hyperprolíferativní reakcí aktivovaných fibroblastů. Fibroblastům podobné buňky jsou primárně zodpovědné za absolutní zvýšení obsahu kolagenu v plicích a abnormality v ultrastruktuře a prostorové distribuci různých typů kolagenu.

Příklad 2

Inhíbice fibrózy užitím antagonisty integrinu obsahujícího podjednotku alfa4

Materiály a metody

Nespecifická kontrolní protilátka (1E6) a protilátka proti integrinu obsahujícímu podjednotku alfa4 (PS2) byly použity v tomto experimentu. 1E6 je myší anti-humánní LFA3 (doména 1) monoklonální IgGl protilátka (viz Miller, Hochman, Meier, Tizard, Bixler, Rosa, and Wallner (1992) J. Exp. Med. 178: 211-222. PS/2 byla připravena metodou podle Miyake et al., J. Exp.

Med., 173: 599-607(1991).

Samci myší C57BL/6 bez chronické respirační nemoci o hmotností 25 až 30 g byly zakoupeni od firmy Charles River Laboratory. Sulfát bleomycinu (prodáván pod chráněným označením Bleno45 xane) byl dar od firmy Bristol Laboratories, (Syracuse, NY). The L-[3,4-3 H] prolin sloužící ke značení prokolagenového substrátu prolylhydroxylázy byl opatřen od firmy NEN Life Science Products (Boston, MA). Z-fix, pufrovaný vodný roztok zinkformalinu byl opatřen od firmy Anatech, LTD (Battle Creek, MI). Všechny ostatní reagencie byly ve standardní čistotě chemických reagencií nebo lepší a byly získány ze standardních komerčních zdrojů.

Ošetřování experimentálních zvířat

Myši byly umístěny v klecích po 4 zvířatech a zacházelo se s nimi v souladu s příslušnými pokyny (NIEI Guidelines for Animal Welfare). Myši byly před ošetřením ponechány 1 týden, aby se aklimatizovaly. Byl udržován cyklus 12 hodin světlo/12 hodin tma a zvířata měla neome-25CZ 301636 B6 zený přístup k vodě ί k potravě (Rodent Laboratory Chow). Zvířata byla náhodně rozdělena do 4 experimentálních skupin: 1) SA + SA; 2) BL + IE6; 3) BL + SA; and 4) BL + PS2. Myši byly intratracheálně (IT) injikovány jednou dávkou fyziologického roztoku nebo BL dávkou 0,08 jednotek/100 μΙ/myš pri anestezi xylazinem a ketamínem. Po IT instilaci myši dostaly IP injekci

IE6, SA nebo PS2 (100 pq/0,2 ml/myš) třikrát týdně. Dvacet dnů po IT instilaci BL byly myši utraceny v anestezi pentobarbitalem a tekutina z bronchoalveolámí laváže (BALF) byla podrobena biochemické a histopatologické analýze.

Příprava BALF a plicní tkáně io

Po anestezi byla otevřena břišní dutina a pak byla provedena exsangvinace sestupné abdominální aorty. Plíce byly připraveny pro laváž kaný lácí trachey tupou jehlou nasazenou na injekční stříkačku. Plicní laváž byla provedena 3 ml chladného isotonického roztoku soli podaného v lml alikvotech. Alikvot BALF byl rozdělen pro odečet celkového počtu buněk. Zbývající BALF byla centrifugována při 1500 g po 20 minut ve 4 °C, a výsledný supematant byl rozdělen na alikvoty a uložen do -70 °C. Po laváži byly plicní laloky rychle zbaveny neparenchymatické tkáně a okamžitě zmrazený v tekutém dusíku a uloženy do -70 °C.

Později byly zamrazené plíce roztátý a homogenizovány v 0,lM KCI, 0,02M Tris (pH 7,6) v homogenizátoru Polytrop (Brinkmann Instruments lne., Westbury, NY). Homogenát byl důkladně promíchán opakovaným obracením a výsledné objemy homogenátu (4 až 5 ml) byly zaznamenány. Homogenát byl rozdělen na několik alikvotů a uložen do -70 °C pro pozdější biochemické analýzy.

Stanovení obsahu malondialdehydových ekvivalentů a hydroxyprolinu v plicích

Malondialdehydové ekvivalenty v plicích byly stanoveny z celkového množství produktů reagujících s thiobarbíturovou kyselinou v nefrakcionovaném homogenátu postupem podle Ohkawa et al., Anal. Biochem., 95; 351 (1979). Pro test hydroxyprolinu v plicích byl 1 ml homo30 genátu precipitován s 0,25 ml ledově vychlazené 50% (hmot./objem) trichloroctové kyseliny, centrífugován a precípitát byl hydrolyzován ve 2 ml 6 N HCI po dobu 18 hodin ve 110 °C. Obsah hydroxyprolinu by pak měřen postupem podle Woessner, J.F., Arch. Biochem. Biophys., 93: 440 (1961).

Stanovení aktivit prolylhydroxylázy (EC 1.14.11.2).

Příprava substrátu (prokolagen) prolylhydroxylázy a způsob testování prolylhydroxylázy byly popsány v Giri, S.N. et al.. Exp. Mol, PathoL 39: 317 (1983). Stručně shrnuto, tibie čerstvě vyjmuté z lOdenních kuřecích embryí byly značeny [3H]prolinem v kultivačním médiu bez prolinu při 37 °C po 6 hodin. Po odstranění neinkorporované značky opláchnutím byla tkáň homogenízována a centrifugována při 3000 g po 20 minut ve 4 °C. Výsledný supematant byl extenzivně dialyzován, aby se odstranila neinkorporovaná značka. Značený prokolagenový substrát byl rozdělen na alikvoty a uložen v -70 °C. Inkubační směs pro enzymový test v celkovém objemu 2 ml stranu železnatoamonného (0,1 mmol/1), alfa-ketoglutarovou kyselinu (0,1 mmol/1), [3H]proIin-prokolagen (200 000 dpm), homogenit plicní tkáně (0,2 ml), kyselinu askorbovou (0,5 mmot/1), a TRIS-HCI pufr (0,1 mol/1, pH 7,8). Reakce byla zastavena přidáním 0,2 ml 50% trichloroctové kyseliny po 30 minutách ve 37 °C v metabolické třepačce podle DubnofFa. V průběhu reakce se uvolňovala triciovaná voda ve stechiometrickém poměru k prolylhydroxylaci a byla užita jako měřítko enzymatické aktivity. Triciovaná voda v reakčním systému byla separována vakuovou destilací celé reakční směsi a byla změřena její radioaktivita. Enzymatická aktivita byla vyjádřena v dpm triciované vody uvolněné z celkového objemu plic za 30 minut.

-26CZ 301636 B6

Stanovení počtů buněk v BALF

Celkový počet buněk v BALF byl stanoven postupem, který popsali Wang, Q. et al·, Lab. Invest., 67: 234-242 (1992). Celkový počet leukocytů v BALF byl určen pomocí počítače Coulter (Model F, Coulter Electronics; lne., Hialeah, FL) podle instrukcí výrobce.

Test na protein v BALF

Obsah proteinu v BALF supematantu byl určen užitím proteinového testu Bio-Rad (Bio-Rad io Laboratories, Richmond, CA), přičemž jako standard byl užit hovězí sérový albumin.

Histopatologická a imunohistochemická analýza

Tři až čtyři zvířata z každé skupiny byla náhodně vybrána pro histopatologické a imuno15 histochemické vyšetření na konci experimentu. Byla otevřena břišní dutina a pak byla provedena exsangvinace sestupné abdominální aorty. Ihned potom byly plíce připraveny pro histologickou analýzu podle Wang et al. (viz výše). Po kanylaci trachey tupou jehlou byla otevřena plicní dutina a plíce se srdcem byly vyjmuty en bloc. Plíce byly fixovány roztokem Z-fix tracheou při tlaku 30 cm H₂O. Pravý kraniální a kaudální lalok a levý lalok plic byly později blokovány, zality do parafínu a nařezány na 7 pm řezy a obarveny hematoxylinem a cosinem. Pro imunohistochemické barvení na alfaSMA, byly řezy plicní tkáně deparafmovány a byla blokována endogenní peroxidáza. Řezy určené k barvení pak byly ošetřeny blokujícím kozím sérem po 30 minut a byly inkubovány 16 hodin primární monoklonální anti-alfaSMA protilátkou (Sigma Chemical Co., St Louis, MO).

Statistická analýza dat

Data byla vyjádřena v přepočtu na celé plíce a jsou uvedena jako průměrné hodnoty ± střední chyba (SE). Data ze čtyř skupin zvířat byla porovnána užitím dvoufaktorové analýzy variance (SIGMASTAT) metodou podle Student-Newman-Keulse. Hodnota P < 0,05 byla považována za statisticky významnou.

Výsledky

Peroxidace lipidů v plicích myší

Obsah malondialdehydových ekvivalentů v plicích byl jakožto index peroxidace lipidů testován u různých skupin myší. BL instilace významně zvýšila obsah malondialdehydových ekvivalentů v plicích myší jak ve skupině BL+IE6 tak i BL+SA na rozdíl od skupin SA+SA a BL+PS2 (data neuvedena). Ošetření PS2 účinně blokovalo BL-indukovanou peroxidaci lipidů, jelikož hladina malondialdehydových ekvivalentů v plicích u skupiny BL+PS2 nebyla odlišná od skupiny SA+SA.

Obsah hydroxyprolinu v plicích myší

Obsah hydroxyprolinu v plicích, klíčový index hladiny kolagenu v plicích byl stanoven pro 4 skupiny myší. IT instilace BL významně zvýšila hladinu hydroxyprolinu v plicích ve skupině BL+IE6 a BL+SA na 185 % a 205 % kontrolní skupiny SA+SA, v uvedeném poradí. BL-indukované zvýšení hydroxyprolinu v plicích u skupiny BL+PS2 bylo významně sníženo o 35 % podáváním PS2 ve srovnání se skupinou BL+SA. Hladina hydroxyprolinu v plicích skupiny BL+TR nebyla významně vyšší než kontrolní skupina IT SA (SA+SA),

-27CZ 301636 B6

Aktivita proiylhydroxylázy v plicích myší

Aktivita proiylhydroxylázy v plicích myší různých skupin ukazuje, že BL samotný významně zvyšuje aktivitu proiylhydroxylázy ve skupině BL+SA na 207 % kontrolní skupiny SA+SA. PS2 významně snížila zvýšení prolylhydroxylázové aktivity vyvolané podáním BL u skupiny BL+SA. Celkový počet buněk v BALF

Celkové počty buněk v BALF u různých skupin myší 21 dnů po IT instilací solného roztoku nebo io BL ukázaly, že podáni BL zvýšilo celkové počty buněk v BALF skupin BL+IE6 a BL+SA ve srovnání s kontrolní skupinou (SA+SA), ačkoliv jen skupina BL+IE6 měla počty statisticky významně vyšší než skupina SA+SA. Počet buněk v BALF ve skupině BL+PS2 se nelišil od skupiny SA+SA.

Obsah proteinů v BALF

Obsah proteinů v supematantu BALF měřený u 4 experimentálních skupin myší odhalil, IT ínstilace BL statisticky významně zvýšila obsah proteinů v BALF u všech ošetřených skupin ve srovnání s kontrolní skupinou SA+SA. Avšak podání PS2 ve skupině BL+PS2 snížilo

BL-indukované zvýšení proteinu v supematantu BALF, i když tento rozdíl nebyl statisticky významný.

Histopatologie plic myší

Histologické vyšetření myších plic ukázalo normální plicní parenchymatickou tkáň u skupiny SA+SA. Avšak plíce myší ze skupin BL+IE6 a BL+SA projevovaly difuzní alveolitidu a multiíokální intersticiální fíbrózu obsahující akumulovanou extracelulámí fibrózní hmotu. Plíce myší z těchto skupin měly zesílené interalveolámí stěny a zánětové buňky v sousedních vzdušných prostorech. Ve srovnání se skupinami BL+IE6 a BL+SA, plíce myší skupiny BL+PS2 měly mnohem méně fibrotických leží, ačkoliv některé laloky vykazovaly mírný stupeň intersticiální fibrózy.

Imunohistochemické barvení na alfaSMA v plicích myší

Pro stanovení akumulace fíbroblastů a fibroblastům podobných buněk u myší po ošetření byla zkoumána exprese alfaSMA v plicní tkáni užitím monoklonální protilátky proti alfaSMA. V plicích kontrolních zvířat se imunopozitivita objevila ve vrstvách vaskulámího a bronchiálního hladkého svalstva. V plících ošetřených BL a kontrolní protilátkou nebo solným roztokem byly extenzivní a intenzivní imunopozitivní oblasti ve fibrotických oblastech jak intersticia tak i pleury. Avšak plíce ošetřené BL a PS2 jevily výrazně snížené imunobarvení alfaSMA, ve srovnání se skupinami BL+IE6 a BL+SA.

Diskuse

IPF je invalidizující nemoc a špatně odpovídá na současnou terapii. V předkládané studii jsou poskytnuty důkazy, že integrin obsahující podjednotku alfa4 je dalším možným cílem v terapii IPF. Obecně se předpokládá, že leukocyty v plicích se podílejí na rozvoji pulmonámí fibrózy tím, že secemují ROS, fibrogenní cytokiny a růstové faktory. Přenos a stav aktivace leukocytů jsou modulovány různými povrchovými proteiny jako jsou např. integriny. Je jasné, že interakce buňka-buňka a také interakce buňka-ECM jsou kritické pro patogenezi pulmonámí fibrózy. Konzistentním nálezem u pacientů s aktivní pulmonámí fibrózou a u zvířecích modelů fibrotických plicních onemocnění je akumulace zvýšeného počtu imunitních a zánětových buněk v oblastech s probíhající fibrózou.

-28CZ 301636 B6

VLA-4 je exprimován na všech cirkulujících leukocytech a váže se na adhezivní molekulu vaskulámích buněk (VCAM-1), což je člen genové superrodiny Ig exprimovaný na endotelových buňkách aktivovaných cytokinem, a na matrixový protein fibronektin. Alfa4beta7 je exprimován na podmnožině T a B lymfocytů, „zabíjeěských“ lymfocytech („natural killer*⁴) a eosinofilech.

Váze se na adresin vaskulámí mukózy (MAdCAM-l), což je Člen rodiny adhezivních molekul podobných mucinu, a také na VCAM-1 a fibronektin. Studie in vitro ukázaly, že interakce VLA-4 s VCAM-1 se podílí na adherenci mononukleámích leukocytů a eosinofilů k endoteliu a na transendoteliální migraci, a že alfa4beta7 se primárně podílí na „rekrutování“ leukocytů do lymfoidní tkáně pojeno se střevem.

V předložené studii léčebné podávání PS2 vedlo ke snížení BL-indukovaného zvýšení celkových leukocytů v BALF. Snížení leukocytů v plicích myší skupiny BL+PS2 by mohlo být zodpovědné za zmenšení zánětlivého poškození a fibrózy plic u myší po podání BL. BL-indukované poškození plic bylo významně sníženo po podání PS2, jak ukazují výsledky měření peroxidace is lipidů v plicích. Zvýšení kolagenu v plicích bylo spojeno se zvýšením počtu fibroblastů v intersticiu a samotných alveolámích prostorech. Mnohé z těchto buněk podobných fíbroblastům jsou myofibroblasty, které mají odlišný fenotyp, ke kterému patří exprese alfaSMA, kontraktilního proteinu, který se vyskytuje normálně v buňkách hladkého svalstva a je zřejmě významný pro fíbrogenezi a hojení ran.

Významným zjištěním této studie také bylo to, že podávání PS2 zeslabilo BL-indukovanou proliferaci myofibroblastů. Bez ohledu na konkrétní teorii, podávání protilátky proti alfaintegrinu snižuje hladinu růstových faktorů v plicích, které jsou uvolňovány infiltruj ící mi leukocyty nebo přímo ovlivňuje chování myofibroblastů. V každém případě redukovaná proliferace myofibro25 blastů vedla ke snížení akumulace kolagenu v plicích u zvířat indukovaných podáním BL vc skupině BL+PS2.

Příklad 3 - srovnávací příklad

Inhibice fibrózy podáváním antagonisty integrinu obsahujícího podjednotku alfal

Ošetřování zvířat

Samci myší C57/BL6 o hmotnosti 28 až 30 g byli umístěni po 4 zvířatech v plastových klecích v zařízení schváleném pro tento účel příslušnými úřady (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care). Myši byly před ošetřením ponechány 1 týden, aby se aklimatizovaly. Byl udržován cyklus 12 h/12 h světlo/tma a zvířata měla neomezený přístup kvodě i k potravě (Rodent Laboratory Chow 5001, Purina Mills, lne., St. Louis, MO). V místnosti skle40 cemi byl filtrovaný vzduch a světelný režim 12 hodin světlo/12 hodin tma. Zvířata byla náhodně rozdělena do 4 experimentálních skupin:

SKUPINA	OŠETŘENÍ
A	Solný roztok + pufrovaný solný roztok
B	Solný roztok + kontrolní protilátka IgG
C	Bleomycin + kontrolní protilátka IgG
D	Bleomycin + protilátka anti-alfalbetal~integrin

Sulfát bleomycinu byl rozpuštěn v apyrogenním sterilním isotonickém solném roztoku těsně před intratracheální (IT) instilací. Myším z příslušných skupin bylo při anestezi methoxyfluranem podáno intratracheálně buďto 100 pl sterilního isotonického roztoku, nebo 0,08 bleomycinu ve 100 pl roztoku. Protilátky (4 mg/kg) byly podávány intraperitoneální injekcí myším z příslušných

-29CZ 301636 B6 skupin třikrát týdně v průběhu 21 dnů po instilaci. Pak byla zvířata všech skupin utracena předávkováním pentobarbitalu sodného (100 až 125 mg/kg i.p.) a plíce byly zpracovány pro bronchoalveolámí laváž a biochemické a histopatologické studie.

Stanovení celkového počtu buněk a hladiny proteinu b tekutině z bronchoalveolámí laváže

Po kaný láci trachey byly plíce vypláchnuty 5 ml isotonického roztoku soli podaného v pěti 1 ml alikvotech. Roztok byl aplikován injekční stříkačkou kanylou, přitom byla jemně masírována hrudní stěna a tekutina byla odsáta. Odsátá tekutina byla centrifugována při 1500 g po 20 minut io ve 4 °C, a resuspendována v ísotonickém solném roztoku. Obsah proteinu v ve vzorku tekutiny z bronchoalveolámí laváže byl určen metodou podle Lowry et al., J Biol. Chem. 1193: 265-275 (1951), přičemž jako standard byl užit hovězí sérový albumin. Celkový počet leukocytů v suspenzí byl stanoven pomocí počítače Coulter (Model F, Coulter Electronics; lne., Hialeah, FL).

Stanovení hydoxyprolinu

Plíce zvířat použité pro biochemické studie byly perfundovány in šitu přes pravou komoru ledově chladným isotonickým solným roztokem, aby se odstranila krev z plicních cév otvorem v levém srdečním oušku. Plicní laloky pak byly rychle zbaveny neparenchymatické tkáně a okamžitě zmrazený v tekutém dusíku a uloženy do -80 °C. Později byly zamrazené plíce roztátý a homogenizovány v 0,1 M KC1, 0,02M Tris (pH 7,6) v homogenizátoru Polytron. Obsah hydroxy prolinu v homogenátu z plic jakožto měřítko obsahu kolagenu byl kvantifikován metodou podle Woessner, Arch. Biochem. Biophys. 93: 440-447 (1961).

Histopatologická studie

Po laváži plic byla otevřena hrudní dutina a plíce byly en bloc společně se srdcem vyjmuty. Plíce byly perfundovány fixáží 1% glutaraldehyd-paraformaldehyd v0,12M kakodylátovém pufru se 400 mOsm při tlaku 30 cm H₂O. Plíce byly fixovány za tohoto tlaku 2 hodiny a pak uloženy v této fixáži s uzavřenou tracheou. Před zalitím byly plíce odděleny od srdce a jakákoliv jiná než plicní tkáň byla odstraněna tupou preparací. Tkáňové bločky byly odříznuty alespoň ve dvou sagitálních řezech (2 až 3 mm tlustých) z pravého kraniálního, pravého kaudálního a levého plicního laloku z každého zvířete. Každý bloček měl čelní plochu asi 1 cm². Bločky byly dehydratovány v ethanolové řadě a pak zality do parafínu. Z parafínových bločků pak byly připraveny řezy (o síle 5 pm) a obarveny hematoxylinem a cosinem pro histologícké vyšetření.

Analýza dat a jejich interpretace

Data byla analyzována v podobě průměrných hodnot se směrodatnou odchylkou a střední chybou průměru. Pro posouzení statistické významnosti rozdílů mezi skupinami byl užit Studentův t-test, rozložení chi-kvadrát, korelační koeficient, analýza variance (ANOVA) a vícerozměrné testy v počítačové statistickém softwaru SAS/STAT (SAS/STAT Guide, 6th Ed. Cary, N.C. pp. 183-260(1985)).

Výsledky

V této studii se testovala hypotéza, že neutralizační protilátky k integrinu αϊβΐ (antialpl) redukují bleomycinem indukovanou (BL-indukovanou) plicní fibrózu in vivo. Samcům C57/BL6 myší byl intratracheálně (IT) injikován solný roztok (SA) nebo BL v dávce 0,08 U/0,1 ml a pak následovala intraperitoneální (IP) injekce protilátky (100 pg ve 0,2 ml) třikrát týdně. 21 dnů po IT instilaci byly myši utraceny a byla provedena bronchoalveolámí laváž (BAL) a biochemické a histopatologické analýzy.

-30CZ 301636 B6

Histopatologické vyšetření plic

Očekávalo se, že u myší po podání solného roztoku nebo kontrolní protilátky IgG nebudou patrný žádné leze a interalveolámí stěny budou normálního vzhledu. Naproti tomu po podání bleo5 mycinu a kontrolního IgG budou mít leze různého druhu od multifokální lokalizace v proximálním laloku až po difúzní distribuci, ke které dochází někdy v pleuře. Podle očekávání plíce myší po podání bleomycinu a protilátky proti alfal integrinu měly být více či méně podobné jako ve skupině B (viz výše). U skupiny D se očekával jen omezený počet fibrotických lézí s mírným multifokálním ztluštěním stěn a malými agregáty mononukleárů.

ío

Přestože byl předkládaný vynález z důvodu důkladného vysvětlení a dobrého porozumění popsán velmi podrobně a také popsán formou ilustrativních příkladů, odborníkovi je jasné, že lze provést různé změny a modifikace v rámci rozsahu vynálezu. Tudíž zde uvedené příklady nijak neomezují rozsah vynálezu, který je vymezen připojenými patentovými nároky.

Tabulka 6 (uvedena v patentu US 5 840 299 a v přihlášce PCT/US96/I8807 publikované jako WO 97/18838)

PCR primery pro konstrukci „přestavěných“ 21.6 variabilních úseků

A. Variabilní úsek lehkého řetězce

1, Primery pro syntézu verze „a“

21.6VLal (39m«r) (sekvence	id.	č.	22)
S’ CAT CCT CAC TCT ATC TCC	TAC	ÁGA	TCC	AGA	CAG	TGA	GCA	3’
21.6VI.a2 (32merj (sekvence	id.	Č.	23)
5* CTG TAG GAC ATA CAC TCA	CCA	TCA	CTT	CCA	AC	3*
21.6VLA3 (39mar) (sekvence	id.	č.	24)
5⁴ ACC ACC TTT TCC ACC TCT	CTC	TTG	GTA	CCA	ACC	CAT	ATA	3'
21.6VLA4 (4lmer) (sekvence	id.	č.	25)
5’ ACC AAC ACA CAC CTC CAA	AAG	CTC	CTA	CCC	TCC	TCA	TAC	AT 3’
21.6VLa5 (4Cmer}(sekvence	id.	č.	26)
5' CCA CCC TCC TCA TGG TCA	AAC	TAT	AAT	CTC	TCC	CAG	ACC	C 3’
21.&VU6 (42mer) (sekvence	id.	č.	27)
5’ ACT TTC ACC ATC ACC AGC	CTG	CAG	CCT	GAA	GAT	ATT	CCA	ACT 3'
2l.6VLi7 (59mer) (sekvence	id.	Č.	28)
5’ CCC ACG ATC CAC TCA CCT	TTG	ATT	TCC	ACC	TTG	GTG	CCT	TCA CCG AAC GTC

CAC AGA TT 3*

2. Primery pro syntézu verze „b“

21.6VLbl (33mer) (sekvence id. č. 29, změna H-49 na Y-49)

5- GGA AAA CCT CCT AGG CTG CTC ATA TAT TAC ACA 3'

2i.6vtb2 (38mer (sekvence id. č. 30, změna ACC-101 na ACA-101 pro odstranění místa Styl)

5* CCG AGG ATC CAC TCA CGT TTG ATT TCC ACC TTT GTG CC 3*

B. Variabilní úsek těžkého řetězce

1. Primery pro syntézu verze „a“

-31CZ 301636 B6

21.£VH»l (Slmec) (sekvence id. £, 31)

5* AAC CCA GTG TAT ATA GGT CTC TTT AAT GTT GAA ACC GCT AGC TTT ACA GCT

3*

21.6VHa2 (67mer) (sekvence id. Č. 32} * AAA CAC ACC TAT ATA CAC TGC CTT AGA CAG CCC CCT CCC CAA ACC CTC CAG TCC ATG GCA AGC ATT G V

21.6VH13 (26(ner) (sekvence id. č. 33)

5' GAC CCG GCC CTG CAA CTT CGG GTC AT 2’

21.6VHa4 (66mer) (sekvence id. č. 34)

5’ GAC CCC AAG TTC CAC CCC CCC CTC ACC ATC ACC CCA CAC ACC TCT GCC ACC ACC CCC TAC ATC GAA 3’

2l.6VHas ($4m«| (sekvence id. č. 35)

5‘ CCA TAG CAT ACA CCC CGT ACT TAC CAT AAT ATC CCT CTC TGG CCC AGT AGT ACA CTG CAC TCT C 2'

21-fiVHaó (63»er) (sekvence id. č. 36)

5* GGT AAC TAC CCC GTC TAT CCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC CTT CTC ACC CTC TCC TCA 3’

2. Primery pro syntézu verze „b“

21.6VHb (37mer)(sekvence id. č. 37, změna R-44 na G-44)

5’ CCA GGG CCG GGT CAC CAT CAC CAG AGÁ CAC CTC TCC C 3 ‘

3. Primery pro syntézu verze „c“

21.6VHc (27mer) (sekvence id. č. 38, změna Y-93 na F-98)

5' CAG CCC CCT GGC CAA GCG CTG GAG TCG 3’

C. Variabilní úseky jak lehkého tak těžkého řetězce

Primery hybrid i zuj ící se sousedící pUC19 vektorovou DNA

APCRl (I7mer (sekvence id. Č. 39, sense primer)

5* TAC GCA AAC CGC CTC TC 3'

APCR4 (JSmer (sekvence id. č. 40, anti-sense primer)

5* GAG TGC ACC ATA TGC GGT 3*

Seznam sekvencí

Následující sekvence id. č. 2 a 4 byly popsány v patentu US 5 932 214 a v přihlášce PCT/US93/00030 publikované jako WO 93/13798.

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 2:

-32CZ 301636 B6

Val

Lys

Leu

Gin

í Gin

Ser

Gly

Ala

Glu Leu Val

Lys

Pro Gly

Ala

Ser

1

5

10

15

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly Phe Asn

Ile

Lys Asp

Thr

Tyr

20

25

30

Hec

His

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Pro

Glu Gin Gly

Leu

Glu Trp

Ile

Gly

35

40

45

Arg

Ile

Asp

Pro

Ala

Ser

Gly

Asp

Thr Lya Tyr

Asp

Pro Lys

Phe

Gin

50

55

60

Val

Lys

Ala

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Thr Ser Ser

Asn

Thr Ala

Trp

Leu

65

70

75

80

Gin

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp Thr Ala

Val

Tyr Tyr

Cys

Ala

85

90

95

Asp

Gly

Met

Trp

Val

Ser

Thr

Gly

Tyr Ala Leu <

šsp

Phe Trp ⁽

Gly

Gin

100

105

110

Gly ¹

Thr

Val

Thr

Val

Ser

115 120 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 106 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (D) TOPOLOGIE: lineární to (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 4:

Ser Ile

Val

Het

Thr

Gin

Thr

Pro

Lys

Phe

Leu

Val

Ser

Ala

Gly

1

5

10

15

Asp Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

LyS

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Thr

Asn

Asp

20

25

30

Val Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr Tyr

Ala

Ser

Asn

Arg

Tyr

Thr

Gly

Val

Pro

Asp

^AjcS

Phe

Thr

Gly

50

55

60

Ser Gly

Tyr

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Thr

Val

Gin

Ala

65

70

75

80

Glu Asp

Leu

Ala

Val

Tyr

Phe

cys

Gin

Asp

Tyr

Ser

Pro

Tyr

85

90

95

Thr Phe

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

100

105

-33CZ 301636 B6

Následující sekvence id. ě. 22 až 40 byly popsány v tabulce 6 a v seznamu sekvencí v patentu

US 5 840 299 a v přihlášce PCT/US96/18807 publikované jako WO 97/18838.

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 bp (B) TYP: nukleová kyselina io (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 22:

CATGCTGACT CTATCTCCTA CAGATCCAGA CACTGAGCA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární 25 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 23:

CTGTACGACA TAGACTCACC ATCACTTGCA AG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 24:

AGGAGCTTTT CCAGGTCTCT CTTCGTACCA AGCCATATA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25: 45 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 41 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární

-34CZ 30163« B6 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 25:

ACCXACXCAC ACCTCOAAAA GCTCCTAGGC TGCTCATACA T (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: io (A) DÉLKA: 40 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární is (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 26:

CCACGCTCCT GATGGTGAAA GTATAA7CTC TCCCAGACCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 27:

ACTTTCACCA TCAGCACCCT CCAGCCTGAA GATATTCCAA CT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 59 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární 40 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 28:

CCGAGGATCC ACTCACGTTT GATTTCCACC TTCGTCCCTT GACCGAACGT CCACAGATT

-35cz 301636 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednoretězcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) o

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 29:

GGAAAAGCTC CTAGGCTGCT CATATATTAC ACA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednoretězcové (D) TOPOLOGIE: lineami (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 30:

CCGACGATCC ACTCACGTTT CATTTCCACC TTTGTCCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 51 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednoretězcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 31

AACCCAGTCT ATATACGTGT CTTTAATGTT CAAACCCCTA CCTTTACACC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 67 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 32:

-36CZ 301636 B6

AAAGACACCT ATATACACTG GGŤTAGACAG GCCCCTCGCC AAAGGCTGCA CTGGATGGGA AGCATTG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězeové (D) TOPOLOGIE: lineární o (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 33:

GACCCGGCCC TGGAACTŤCG GGTCAT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 66 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězeové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 34:

CACCCCAAGT TCCACCCCAG GGTCACCATC ACCGCKGACA CCTCTGCCAG CACCGCCTAC

ATGGAA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 64 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězeové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 35:

CCATAGCATA GACCCCGTAG TTACCATAAT ATCCCŤCTCT GGCGCAGTAC TACACTGCAG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 63 bp

-37CZ 301636 B6 (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 36:

CGTAACTACG GGGTCTATGC TATCCACTAC TGCCGTCAAG CAACCCTTC? CACCGTCTCC TCA io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 37 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 37:

CCAGGGCCGG GTCACCATCA CCAGAGACAC CTCTGCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární 30 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 38:

CAGCCCCCTG GCCAAGCGCT GGAGTGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 39:

TACCCAAACC GCCTC7C

-38CZ 301636 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) o

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 40:

GAGTGCACCA TATGCGGT

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

20 1. Použití kompozice obsahující protilátkový homolog, který je antagonistou interakce integrinu nesoucího podjednotku aífa4 s ligandem pro integrin nesoucí podjednotku alfa4, pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení fibrózy u subjektu.
2. Použití podle nároku 1, kdy fibróza je fibróza vnitřních orgánů.
3. Použití podle nároku 2, kdy vnitřní orgány jsou játra, plíce, ledviny, srdeční krevní cévy nebo gastrointestinální trakt.
4. Použití podle nároku 1, kdy fibróza u subjektu je pulmonámí fibróza, myelofibróza, cirhóza

30 jater, mesangiální prolíferativní glomerulonefntida, srpkovitá glomerulonefritida, diabetická nefropatie, fibróza renálního intersticia nebo nefropatie asociovaná s HIV.
5. Použití podle nároku 1, kdy fibróza je dermální fibróza.

35
6. Použití podle nároku 5, kdy dermální fibróza je skleroderma, morfea, keloidy, hypertrofické jizvy, familiární kutánní kolagenom nebo névy v pojivové tkáni kolagenového typu.
7. Použití podle nároku 1, kdy fibróza u subjektu je fibróza oka.

40
8. Použití podle nároku 7, kdy fibróza oka je diabetická retinopatie, jizvení po chirurgickém zákroku nebo prolíferativní vitreoretinopatie.
9. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 8, kdy kompozice obsahuje homolog protilátky anti-alfa4.
10. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kdy protilátkový homolog je homolog humanizované, humánní nebo chimérické protilátky.
11. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 10, kdy farmaceutický přípravek je ve so formě pro podávání

a) v dávce OJ až 10 mg/kg za den,

-39CZ 301636 B6

b) po dávkovači období od jednoho do 14 dnů, a

c) v množství dostatečném k udržení plazmatické hladiny homologu protilátky 1 mg/ml nebo vyšší.
12. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 11, kdy homolog protilátky je humanizovaná myší protilátka 21-6.
13. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 12, kdy subjektem je člověk.