JP2014065747A - インテグリンα−４サブユニットのアンタゴニストを使用する線維症の処置のための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】インテグリンα−４サブユニットのアンタゴニストを使用する線維症の処置のための方法の提供。
【解決手段】線維症状態を有する被験体に、有効量の組成物を投与する工程を包含する方法であって、該組成物は、ＶＬＡ−４およびα４β７の両方のそれらの各々のα−４リガンドとの相互作用をアンタゴナイズする抗体ホモログ、あるいはＶＬＡ−４のそのリガンドとの相互作用をアンタゴナイズする抗体ホモログ、またはα４β７のそのリガンドとの相互作用をアンタゴナイズする抗体ホモログを含む、方法。
【選択図】なし

Description

（関連出願）
本願は、米国仮出願第６０／１３０，８４７号（１９９９年４月２２日出願）
および米国特許出願第６０／１３７，２１４号（１９９９年６月１日出願）の出
願日の利益を主張する。

（発明の背景）
フィブロネクチンおよびコラーゲンは、結合組織に見出される細胞外マトリッ
クスの完全性を維持するために本質的なタンパク質である。これらのタンパク質
の産生は、高度に調節されたプロセスであり、そしてその妨害は、組織線維症の
進行に導き得る。線維性細胞の形成は、損傷後の治癒の通常の有益なプロセスの
一部であるが、いくつかの状況において、腺維性物質に異常な蓄積が存在し、そ
の結果、これは、最終的に、器官不全に導く（Ｂｏｒｄｅｒら（１９９４）Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：１２８６−１２９２）。任意の器官への損
傷は、型通りの生理学的応答に導く：血小板誘導止血、続いて、炎症性細胞およ
び活性化された線維芽細胞の流入。これらの細胞型由来のサイトカインは、新し
い細胞外マトリックスおよび血管（肉芽組織）の形成に導く。肉芽組織の生成は
、注意深く調整されたプログラムであり、ここで、プロテアーゼインヒビターお
よび細胞外マトリックスタンパク質の発現は、上方制御され、そしてプロテアー
ゼの発現が減少され、細胞外マトリックスの蓄積に導く。

線維症状態の進行（誘導されるか、または自発的であるか）の要となるのは、
線維芽細胞活性の刺激である。炎症性細胞および活性化された線維芽細胞の損傷
器官への流入は、主にフィブロフェクチンおよびコラーゲンからなる間隙性マト
リックスと相互作用するこれらの細胞型の能力に依存する。これらの細胞−細胞
相互作用または細胞−細胞外マトリックス相互作用は、細胞接着分子のいくつか
のファミリー（これらの１つのそのようなファミリーにはインテグリンが挙げら
れる）を介して媒介される。インテグリンは、種々のα（現在のところ、α１、
α２、α１１まで）およびβ（β１およびβ２）ヘテロダイマー膜貫通レセプタ
ードメイン（これらは、実質的に全ての哺乳動物細胞型に対して種々の組合せで
見出される）からなる構造的にかつ機能的に関連した糖タンパク質である。（総
説について、以下を参照のこと：Ｅ．Ｃ．Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｃｅｌｌ，６７，１
０３３（１９９１）；Ｄ．Ｃｏｘら、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ」Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｒｅ
ｖ．１９５巻（１９９４）およびＶ．Ｗ．Ｅｎｇｌｅｍａｎら、「Ｃｅｌｌ Ａ
ｄｈｅｓｉｏｎ Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｔａｒｇｅｔｓ」Ａｎｎ，Ｒｅｖｓ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，３1巻，Ｊ．Ａ．Ｂｒｉｓｔｏｌ，編；Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９
６，１９１頁）。インテグリンを含む２つのα４サブユニットが記載され、そし
てα４β１（ＶＬＡ−４）およびα４β７と表される。

間隙性肺線維症（ＩＰＦ）は、肺コンプライアンスの減少および生命維持に必
要な気体の交換機能の欠陥の減少に導く多くの間隙性肺疾患の最終経路である。
病因に関わらず、ＩＰＦは、肺の炎症性変化および腺維増殖性（ｆｉｂｒｏｐｒ
ｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）変化ならびに間隙におけるコラーゲンの過剰蓄積によ
って特徴付けられる。ＩＰＦを有する被験体は、一般に、活性な肺線維症（肺線
維症が初期炎症性傷害の後の異常修復の結果であることを示す）の間に、漸増免
疫（ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ）および炎症性細胞の存在を示す。漸増
炎症性細胞は、多くの場合に初期傷害に関連するようである。さらに、これらの
細胞は、修復プロセスを調節する際に、複雑な役割を果たし得る。いずれかの場
合において、免疫細胞および炎症性細胞の肺への漸増は、線維症性応答の決定に
おいて重要な役割を果たし得る。炎症性細胞および活性化された線維芽細胞の損
傷した肺への流入は、ＥＣＭの成分と相互作用するこれらの細胞型の能力に依存
する。白血球の活性化の経路および状態は、種々のインテグリンによって、調節
され得る。炎症性細胞の肺への流入の防止は、引き続く線維症性応答を含む際に
重要であり得る。

線維細胞の増殖と関連する疾患の多くは、慢性であり、かつしばしば消耗性
であり、例えば、強皮症のような皮膚疾患を含む。いくつか（肺線維症を含む）
は、この疾患についての現在利用可能な処置が、有意な副作用を有し、そして一
般に、線維症の進行を遅らせるか、または停止する際に有効でないという事実に
部分的に起因して致命的であり得る［Ｎａｇｌｅｒら，１９９６，Ａｍ．Ｊ．Ｒ
ｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１５４：１０８２−８６］。従っ
て、新規な抗線維症薬剤についての継続した必要性が存在する。

（発明の要旨）
本発明は、被験体における線維症を処置する方法を提供する。本発明者らは、
肺線維症を有するマウスにα１またはα４サブユニット保有インテグリンのアン
タゴニストを投与することによって、線維症の病因におけるα１およびα４サブ
ユニット保有インテグリンのアンタゴニストの可能な役割を調べた。本明細書に
示されるように、全コラーゲン蓄積および肺線維症性損傷の程度の両方に対する
これらのアンタゴニストを有する有利な効果は、α１および／またはα４保有イ
ンテグリンが、抗線維症治療のための適切な標的であり得ることを示唆する。本
発明の１つの局面は、線維症状態を有する被験体に、α４サブユニット保有イン
テグリンとα４サブユニット保有インテグリンに対するリガンドとの間の相互作
用のアンタゴニストを含む有効量の組成物を投与する工程を包含する方法である
。そのアンタゴニストは、α４インテグリン結合因子またはα４インテグリンリ
ガンド結合因子である。好ましいα４インテグリン結合因子は、ａ）ＶＬＡ−４
およびα４β７のそれらのそれぞれのα４リガンドとの相互作用をアンタゴナイ
ズする抗体ホモログ；ｂ）ＶＬＡ−４のそのα４リガンドとの相互作用をアンタ
ゴナイズする抗体ホモログ；およびｃ）α４β７のそのα４リガンドとの相互作
用をアンタゴナイズする抗体ホモログからなる群から選択される。他の実施形態
において、抗体ホモログは、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそれらの
フラグメントからなる群から選択される。

本発明の別の局面は、気管支肺胞洗浄流体のサンプル中の白血球の線維症状態
誘導性の増加を減少させる方法であり、この方法は、線維症状態を有する被験体
に、α４サブユニット保有インテグリンとα４サブユニット保有インテグリンに
対するリガンドとの間の相互作用のアンタゴニストの有効量を投与する工程を包
含する。本発明の特定の実施形態において、α４インテグリン結合因子は、米国
特許第５，８４０，２９９号の表６の配列の群またはそれらの核酸配列の相補体
から選択される規定された核酸配列に、いくつかのストリンジェンシー条件下で
ハイブリダイズする核酸を含む核酸配列によってコードされる。この方法の他の
局面において、α４インテグリン結合因子は、米国特許第５，９３２，２１４号
に見出されるかまたは細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１１７５によって産生される
特定の規定されたポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド配列をコ
ードする核酸配列に、規定されたストリンジェンシー条件下でハイブリダイズす
る核酸を含む核酸配列によってコードされる。

先のセクションの引用文献の全て、ならびに以下の開示に含まれる引用文献ま
たは発行された特許は、本明細書中で参考として援用される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１） 線維症状態を有する被験体に、有効量の組成物を投与する工程を包含する方法であって、該組成物は、ＶＬＡ−４およびα４β７の両方のそれらの各々のα−４リガンドとの相互作用をアンタゴナイズする抗体ホモログ、あるいはＶＬＡ−４のそのリガンドとの相互作用をアンタゴナイズする抗体ホモログ、またはα４β７のそのリガンドとの相互作用をアンタゴナイズする抗体ホモログを含む、方法。
（項目２） 前記抗体ホモログが、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそれらのフラグメントからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３） 前記組成物が、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重を提供するような投薬量で投与される、項目１に記載の方法。
（項目４） 気管支肺胞洗浄流体のサンプル中の、白血球の線維症状態誘導性の増加を減少させるための方法であって、該方法は、線維症状態を有する被験体に、α４サブユニット保有インテグリンとα４サブユニット保有インテグリンに対するリガンドとの間の相互作用をアンタゴナイズする有効量の抗体ホモログを投与する工程を包含する、方法。
（項目５） 項目４に記載の方法であって、前記抗体ホモログは、ＶＬＡ−４およびα４β７の両方のそれらの各々のリガンドとの相互作用をアンタゴナイズするか、あるいはＶＬＡ−４のそのリガンドとの相互作用をアンタゴナイズするか、またはα４β７のそのリガンドとの相互作用をアンタゴナイズする、方法。
（項目６） 前記抗体ホモログが、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびそれらのフラグメントからなる群から選択される、項目４に記載の方法。
（項目７） 前記抗体ホモログが、個体の重量に基づいて、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇを提供するような投薬量で投与される、項目４に記載の方法。
（項目８） 前記ホモログが、約０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の小分子の投薬量を提供するのに有効な量で投与される、項目７に記載の方法。
（項目９） 項目１または４に記載の方法であって、ここで、前記抗体ホモログが、米国特許第５，８４０，２９９号の表６の配列の群または該核酸配列の相補体から選択された核酸配列に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を含む核酸配列によってコードされるその一部分を有するヒト化抗体である、方法。
（項目１０） 項目１または４に記載の方法であって、ここで、前記抗体ホモログが、米国特許第５，８４０，２００号の表６の核酸配列の群または該核酸配列の相補体から選択された核酸配列に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を含む核酸配列によってコードされるその一部分を有するヒト化抗体である、方法。
（項目１１） 項目１または４に記載の方法であって、ここで、前記抗体ホモログが、ポリペプチド配列をコードする核酸配列に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を含む核酸配列によってコードされるその一部分を有するヒト化抗体であり、該ポリペプチド配列が、以下：ａ）米国特許第５，９３２，２１４号に見出される配列番号２；ｂ）米国特許第５，９３２，２１４号に見出される配列番号４；およびｃ）細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１１７５によって産生される抗体の可変ドメインからなる群から選択される、方法。
（項目１２） 項目１または４に記載の方法であって、ここで、前記抗体ホモログが、ポリペプチド配列をコードする核酸配列に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を含む核酸配列によってコードされるその一部分を有するヒト化抗体であり、該ポリペプチド配列が、以下：ａ）米国特許第５，９３２，２１４号に見出される配列番号２；ｂ）米国特許第５，９３２，２１４号に見出される配列番号４；およびｃ）細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１１７５によって産生される抗体の可変ドメインからなる群から選択される、方法。
（項目１３） 被験体における線維症を処置するための方法であって、該方法は、治
療的有効量のＶＬＡ−１アンタゴニストを該被験体に投与する工程を包含する、方法。

（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
特許請求された発明の主題をより明確にかつ簡潔に指摘するために、以下の定
義が、以下の説明および添付の特許請求の範囲に使用される特定の用語について
提供される。

ここで、本発明は、以下の定義を含む以下の詳細な説明を参照して記載される
：
インテグリンｖｅｒｙ ｌａｔｅ抗原（ＶＬＡ）スーパーファミリーは、構造
的にかつ機能的に関連した糖タンパク質から作製され、これらの糖タンパク質は
、ほぼ全ての哺乳動物細胞型に対する種々の組み合わせにおいて見出される、（
αおよびβ）ヘテロダイマーの膜貫通レセプター分子からなる。（総説について
、以下を参照のこと：Ｅ．Ｃ．Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｃｅｌｌ，６７，１０３３（１
９９１）；Ｄ．Ｃｏｘら，「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ
Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ」Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅａｓｅｒｃｈ Ｒｅｖ．（１
９９４）およびＶ．Ｗ．Ｅｎｇｌｅｍａｎら，「Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ
Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔａｒｇｅｔｓ」
，Ａｎｎ．Ｒｅｐｏｒｔ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３
１巻，Ｊ．Ａ．Ｂｒｉｓｔｏｌ，編；Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９６，
１９１頁）。ＶＬＡファミリーのインテグリンには、（現在のところ）ＶＬＡ−
１、−２、−３、−４、−５、−６、−９、および−１１が挙げられ、ここで、
これらの分子の各々は、それぞれ、α鎖（α１、α２、α３、α４、α５、α６
など）に非共有結合したβ１鎖を含む。

アルファ４ベータ１（α４β１）インテグリンは、ＶＣＡＭ−１、フィブロネ
クチンおよび可能な他のリガンド（後者のリガンドは、個々に、そして集団的に
「アルファ４リガンド」として参照される）に対する細胞表面レセプターである
。従って、用語α４β１インテグリン（「ＶＬＡ−４」または「ａ４ｂ１」また
はアルファ４ベータ１インテグリン」、相互転換可能に使用される）は、本明細
書中で、ＶＣＡＭ−１および細胞外マトリックスタンパク質、より具体的にフィ
ブロフェクチンのメンバー、あるいはそれらのホモログまたはフラグメントに結
合し得るポリペプチドをいうが、ＶＬＡ−４に対する他のリガンドが存在し得、
そして従来の方法を使用して分析され得ることが、当業者に理解される。それに
もかかわらず、α４サブユニットは、β１のそばの他のβサブユニットと会合し
、その結果、本発明者らは、用語「アルファ（α）４インテグリン」または「ア
ルファ（α）保有インテグリン」を、そのα４サブユニットが、βサブユニット
の一方またはもう一方と会合するインテグリンとして定義し得る。ＶＬＡ４のそ
ばの「α４」のインテグリンの別の例は、α４β７である（ＬｏｂｂおよびＡｄ
ａｍｓ、上記）。同様に、「α１インテグリン」または「α１サブユニット保有
インテグリン」は、そのα１サブユニットが、βサブユニットの一方またはもう
一方と会合するインテグリンである。

インテグリン「アンタゴニスト」は、α１および／またはα４保有インテグリ
ンを、インテグリンリガンドおよび／またはレセプターと結合することから阻害
する任意の化合物を含む。抗インテグリン抗体または抗体ホモログ保有タンパク
質（以下で議論する）、ならびに他の分子（例えば、インテグリンについてのリ
ガンドタンパク質の可溶性形態）が有用である。α４サブユニット保有インテグ
リンに対するリガンドタンパク質の可溶性形態には、可溶性ＶＣＡＭ−１、ＶＣ
ＭＡ−１融合タンパク質、または二官能性ＶＣＡＭ−１／Ｉｇ融合タンパク質が
挙げられる。例えば、インテグリンリガンドまたはそのフラグメントの可溶性形
態を投与して、インテグリンに結合させ得、そして好ましくは細胞上のインテグ
リン結合部位に対して競合し得、それによって、抗インテグリン（例えば、ＶＬ
Ａ−１、ＶＬＡ−４）抗体のようなアンタゴニストの投与に類似した効果に導く
。特に、リガンドを結合するが、インテグリン依存性シグナル伝達を誘発しない
可溶性インテグリン変異体は、本発明の範囲内に含まれる。このようなインテグ
リン変異体は、野生型インテグリンタンパク質の競合インヒビターとして作用し
得、そして「アンタゴニスト」と考えられる。本発明の方法において使用される
他のアンタゴニストは、「小分子」であり、以下に定義される。

ＶＬＡ−４およびα４β７の両方、またはα４サブユニット保有インテグリン
の他の組み合わせをアンタゴナイズする小分子または抗体ホモログのような、１
より多いα４サブユニット保有インテグリンの作用をアンタゴナイズする分子を
使用する方法もまた、本発明内に含まれる。１より多いα１サブユニット保有イ
ンテグリンの作用をアンタゴナイズする分子を使用する方法もまた、含まれる。
分子の組み合わせを使用し、その結果、この組み合わせが１以上のインテグリン
の作用をアンタゴナイズする方法もまた、本発明の範囲内であり、例えば、ＶＬ
Ａ−４およびα１β７の両方、またはα４サブユニット保有インテグリンの他の
組み合わせを組み合わせでアンタゴナイズするいくつかの小分子または抗体ホモ
ログを使用する方法である。

本明細書中に議論されるように、特定のインテグリンアンタゴニストは融合さ
れ得るか、またはそうでなければ、例えば、抗体ホモログ（例えば、免疫グリブ
リンまたはそのフラグメント）に結合体化され得、そしてインテグリンまたはリ
ガンドまたは他の分子の特定の型、または構造に限定されない。従って、本発明
の目的について、キメラタンパク質（以下に議論されるような）を形成し得、か
つイテグリンリガンドに結合し得、そしてα４および／またはα１サブユニット
保有インテグリンを効果的にブロックするかまたはコートする任意の因子が、本
発明の実施例において使用されるアンタゴニストの等価物であると考えられる。

「抗体ホモログ」には、ジスルヒド結合を介して連結された免疫グロブリン軽
鎖および重鎖からなるインタクトな抗体が挙げられる。用語「抗体ホモログ」は
また、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、およびその抗原結合フラグメ
ント（これらは、１以上の抗原（すなわち、インテグリンまたはインテグリンリ
ガンド）に結合し得る）からなる群から選択される１以上のポリペプチドを含む
タンパク質を包含することが意図される。１より多いポリペプチドからなる抗体
ホモログの成分ポリペプチドは、必要に応じて、ジスルヒド結合され得るか、ま
たはそうでなければ共有結合的に架橋され得る。従って、それによって、「抗体
ホモログ」は、型ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびに、それら
の亜類型）のインタクトな免疫グロブリンを含み、ここで、免疫グロブリンの軽
鎖は、型κまたはλであり得る。「抗体ホモログ」はまた、抗原結合特異性を保
持するインタクトな抗体の一部分（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラ
グメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フタグメント、重鎖および軽
鎖のモノマーまたはダイマーまたはそれらの混合物）を含む。

「ヒト化抗体ホモログ」は、抗体ホモログであり、組換えＤＮＡ技術によって
生成され、ここで、ヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸にいくつかま
たはすべて（抗原結合に対して必要とされない）は、非ヒト哺乳動物免疫グロブ
リン軽鎖または重鎖からの対応するアミノ酸に置換されている。「ヒト抗体ホモ
ログ」は、抗体ホモログであり、ここで、免疫グロブリン軽鎖または重鎖の全て
のアミノ酸（それらが抗原結合に必要とされているか否かに関わりなく）は、ヒ
ト供給源由来である。

本明細書中で使用される場合、「ヒト抗体ホモログ」は組換えＤＮＡ技術によ
って生成される抗体ホモログであり、ここで、免疫グロブリン軽鎖または重鎖の
アミノ酸の全ては、ヒト供給源由来である。

インテグリン「アゴニスト」は、インテグリンリガンドを活性化する任意の化
合物を含む。

「アミノ酸」は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のモノマー単位で
ある。天然のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質に見出される２０個の
アミノ酸が存在し、これらの全ては、Ｌ−異性体である。この用語はまた、アミ
ノ酸のアナログおよびタンパク質アミノ酸のＤ異性体およびそれらのアナログを
含む。

「共有結合的に結合した」は、本発明の特定部分（例えば、ＰＥＧ化α４およ
び／またはα１インテグリンアゴニスト、免疫グロブリンフラグメント／α４ま
たはα１インテグリンアンタゴニスト）は、互いに直接的に共有結合されている
か、またはさもなければ介在性部分（単数または複数）（例えば、スペーサー部
分（単数または複数））を介して互いに間接的に共有結合的に連結されているか
のいずれかである。介在性部分（単数または複数）は、「連結基」と呼ばれる。
用語「結合体化された」は、「共有結合的に連結された」と相互転換可能に使用
され得る。このことに関して、「スペーサー」は、アミノ酸あるいはインテグリ
ンアンタゴニストまたはフラグメントの他の成分と分子の残りとの間に挿入され
得る部分をいう。スペーサーは、アミノ酸または他の成分と分子の残りとの間の
分離を提供し得、その結果、改変がタンパク質機能を干渉することを防止し、そ
して／またはアミノ酸または他の成分が別の部分と連結することをより容易にさ
せる。

「発現制御配列」−遺伝子に操作可能に連結される場合にこれらの遺伝子の発
現を制御し、そして調節するポリヌクレオチドの配列。

「発現ベクター」−発現ベクターが宿主細胞に導入された場合に、少なくとも
１の遺伝子の発現を可能にするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡプラスミドま
たはファージ（他の一般的な例の中の））。

本発明の薬剤の「有効量」は、処置される特定の状態に対して結果を生じるか
、または影響を及ぼす量である。

アミノ酸残基の「機能的等価物」は、（ｉ）機能性等価物によって置きかえら
れたアミノ酸残基と類似の反応特性を有するアミノ酸；（ｉｉ）本発明のアンタ
ゴニストのアミノ酸（機能的等価物によって置きかえられたアミノ酸残基と類似
の特性を有するアミノ酸）；（ｉｉｉ）機能性等価物によって置きかえられたア
ミノ酸残基と類似の特性を有する非アミノ酸分子である。

本発明のタンパク様のアンタゴニストをコードする第一のポリヌクレオチドは
、それが少なくとも１つの以下の条件を満たす場合、アンタゴニストタンパク質
をコードする第二のポリヌクレオチドと比較して「機能的に等価物」である：
（ａ）：「機能的等価物」は、標準的なハイブリタイゼイション条件下で第二
のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第一のポリヌクレオチドであり、そし
て／または第一のポリヌクレオチド配列に変質させる。最も好ましくは、それは
、インテグリンアンタゴニストタンパク質の活性を有する変異体タンパク質をコ
ードする；
（ｂ）「機能的等価物」は、発現の際に、第二のポリペプチドによってコード
されるアミノ酸配列をコードする第一のポリペプチドである。

本発明において使用されるインテグリンアンタゴニストには、本明細書中に列
挙された薬剤ならびにそれらの機能的等価物が挙げられるが、それらに限定され
ない。従って、本明細書中で使用される場合、用語「機能的等価物」は、インテ
グリンアンタゴニストまたはインテグリンアンタゴニストをコードするポリヌク
レオチドをいい、このポリヌクレオチドは、インテグリンアンタゴニストとして
レシピエントに対する同じまたは改善された有利な効果を有する。このポリヌク
レオチドは、インテグリンアンタゴニストの機能的等価物であると見なされる。
当業者によって理解されるように、機能的に等価なタンパク質は、例えば「機能
的に等価なＤＮＡ」を発現することによって組換え体技術により産生され得る。
従って、本発明は、天然のＤＮＡによって、および天然のＤＮＡによってコード
されるものと同じタンパク質をコードする非天然のＤＮＡによって、コードされ
るインテグリンタンパク質を包含する。ヌクレオチドコード配列の縮重に起因し
て、他のヌクレオチドを使用して、インテグリンタンパク質をコードし得る。こ
れらは、上記の配列の全て、または一部分を含み、これらの配列は、配列内の同
じアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変更され得、従って、
サイレントな変化を生じる。このような改変された配列は、これらの配列の等価
物として見なされる。例えば、Ｐｈｅ（Ｆ）は、２つのコドン（ＴＴＣまたはＴ
ＴＴ）によってコードされ、Ｔｙｒ（Ｙ）は、ＴＡＣまたはＴＡＴによってコー
ドされ、そしてＨｉｓ（Ｈ）は、ＣＡＣまたはＣＡＴによってコードされる。一
方で、Ｔｒｐ（Ｗ）は、単一コドン（ＴＧＧ）によってコードされる。従って、
特定のインテグリンをコードする所定のＤＮＡ配列について、それをコードする
多くのＤＮＡ縮重配列が存在する。これらの縮重ＤＮＡ配列は、本発明の範囲内
であると考えられる。

本発明のアンタゴニストを参照する場合、用語「キメラ（の）」は、アンタゴ
ニストが、非対応構造有し、そして／または起点の非対応の供給源を有する２以
上のタンパク質の連結（化学架橋または共有結合または他のタイプ）からなる。
従って、キメラα４インテグリンアンタゴニストは、α４インテグリンアンタゴ
ニストまたはフラグメントおよび他の部分（α４インテグリンアンタゴニストで
はない）である１つの部分を含み得る。

「キメラ」タンパク質の種は、「融合物」または「融合タンパク質」であり、
それらの個々のペプチド骨格を介して、最も好ましくは、これらのタンパク質を
コードするポリヌクレオチド分子の遺伝的発現を介して、２以上のタンパク質ま
たはそれらのフラグメントの共線状で共有結合的な連結をいう。従って、好まし
い融合タンパク質は、キメラタンパク質であり、これらのキメラタンパク質は、
α４（またはα１）インテグリンアンタゴニストではない第二の部分に共有結合
的に連結されたα４（またはα１）インテグリンアンタゴニストまたはフラグメ
ントを含む。本発明の好ましい融合タンパク質は、抗原結合特異性を保持するイ
ンタクトな抗体の一部分（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント
、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、重鎖モノマーまたはダ
イマー、軽鎖モノマーまたはダイマー、１の重鎖および１の軽鎖からなるダイマ
ーなど）を含み得る。

最も好ましい融合タンパク質はキメラであり、そして免疫グロブリン軽鎖、重
鎖、またはその両方のちょうつがい部位および定常領域の全てまたは一部分に融
合したか、またはそうでなければ連結したインテグリンアンタゴニスト部分を含
む。従って、本発明は、以下を含む分子を特徴とする：（１）インテグリンアン
タゴニスト部分、（２）第二のペプチド（例えば、インテグリンアンタゴニスト
部分（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーあるいはそのフラ
グメントまたは部分（例えば、ＩｇＧのフラグメントまたは部分（例えば、ヒト
ＩｇＧ重鎖定常領域（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、およびちょうつがい部位）））
）の溶解度またはインビボ寿命を増加させるペプチド）。具体的に、「インテグ
リンアンタゴニスト／Ｉｇ融合」は、本発明の生物学的に活性なインテグリンア
ンタゴニスト分子を含むタンパク質（例えば、可溶性ＶＬＡ−４またはＶＬＡ−
４リガンド、あるいは免疫グロブリン鎖のＮ末端に連結したその生物学的に活性
なフラグメント、ここで、免疫グロブリンのＮ末端がインテグリンアンタゴニス
トで置きかえられている）である。インテグリンアンタゴニスト／Ｉｇ融合の種
は、「インテグリン／Ｆｃ融合」であり、これは、免疫グロブリンの定常領域の
少なくとも一部分に連結した本発明のインテグリンアンタゴニストを含むタンパ
ク質である。好ましいＦｃ融合は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ドメインを含む
抗体のフラグメントに連結した本発明のインテグリンアンタゴニストを含む。

用語「融合タンパク質」はまた、第二の部分（これは、インテグリンアンなゴ
ニストではなく（「キメラ」分子を生じる）、そして以下に記載されるように精
製されたタンパク質から新規に作製される）に一機能的分子または異種機能的分
子を介して化学的に連結されたインテグリンアンタゴニストを意味する。従って
、組換え的に連結されたキメラ分子に対して、化学的に連結されたキメラ分子（
これは、融合タンパク質である）の１つの例は、以下を含み得る：ＶＬＡ−４保
有細胞の表面上のα４インテグリンサブユニット標的化部分（例えば、ＶＬＡ−
４に結合し得るＶＣＡＭ−１部分）；（２）標的化部分の溶解度またはインビボ
での寿命を増加させる第二の分子（例えば、ポリアルキレングリコールポリマー
（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）））。α４標的化部分は、任意の
天然のα４リガンドまたはそのフラグメントであり得る（例えば、ＶＣＭＡ−１
ペプチドまたは類似の保存的に置換されたアミノ酸配列）。

本明細書中で使用される場合、「異種プロモーター」は、遺伝子または精製さ
れた核酸と天然に会合してないプロモーターである。

本明細書中で使用される場合、「相同性」は、用語「同一性」と同義であり、
そして２つのポリペプチド、分子、または２つの核酸の間の配列類似性をいう。
２つの比較された配列の両方における位置が、同じ塩基またはアミノ酸モノマー
サブユニットによって占有される場合（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々におけ
る位置がアデニンによって占有される場合、または２つのポリペプチドの各々に
おける位置が、リジンによって占有される場合）、それぞれの分子はその位置で
相同性である。２つの配列の間の％相同性は、比較された位置の数により割られ
た、２つの配列によって共有された一致位置または相同性位置の数×１００の関
数である。例えば、２つの配列における位置の１０個のうちの６個が一致するか
、または相同性である場合、２つの配列は、６０％相同性である。例として、Ｄ
ＮＡ配列のＣＴＧＡＣＴおよびＣＡＧＧＴＴは、５０％相同性を共有する（６個
の全位置の３つが一致する）。一般に、２つの配列が、最大の相同性を与えるよ
うに整列される場合に、比較が行われる。このような整列は、例えば、以下によ
り詳細に記載されるＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌの方法を使用して提供
され得る。

相同性配列は、同一または類似のアミノ酸残基を共有し、ここで、類似の残基
は、整列した参照配列における対応するアミノ酸残基、または対応するアミノ酸
残基の「可能な点変異」についての保存的置換である。このことに関して、参照
配列における残基の「保存的な置換」は、対応する参照配列に物理的にまたは機
能的に類似する置換（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、化学特性を有し、共
有結合または水素結合などを形成する能力を含む）である。特に好ましい保存的
置換は、「受容された点変異」に対して規定される基準を満たすものである（Ｄ
ａｙｈｏｆｆら、５：Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：補遺３，２２章：３５４−３５２，Ｎａｔ．
Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ
（１９７８））。

「相同性」および「同一性」は本明細書中では互換し得、それぞれが２つのポ
リペプチド配列間の配列類似性のことをいう。相同性および同一性は、それぞれ
の配列（比較のために整列され得る）の位置を比較することにより決定され得る
。比較される配列中のある位置が、同じアミノ酸残基で占められる場合、それら
のポリペプチドはその位置で同一であると呼ばれ得る。等しい部位が同じアミノ
酸（例えば同一）または類似のアミノ酸（例えば、立体構造上および／または電
気的性質が類似）により占められている場合、その分子はその位置で相同である
と呼ばれる。配列間の相同性および同一性の割合は、それらの配列により共有さ
れる適合位置または相同位置の数の関数である。「無関係な」または「非相同な
」配列は、本発明の配列と、４０％未満の同一性を、好ましくは２５％未満の同
一性である。

２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の「％相同性」は、Ｋａｒｌｉｎお
よびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ９０
：５８７３（１９９３））において改変されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈ
ｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８７：２２６４（１９
９０））の整列アルゴリズムを使用して決定され得る。このようなアルゴリズム
は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）
）のＮＢＬＡＳＴまたはＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴ検
索は、本発明の核酸に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプロ
グラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施される。ＢＬＡＳＴタン
パク質検索は、参照ポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡ
ＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施される。比較用にギ
ャップを有する整列を得るために、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈ
ｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９（１９９７）
）に記載されるように使用されるＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを
使用する場合、個々のプログラム（ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設
定パラメータが使用される。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ
．ｇｏｖを参照。

「単離された」（「実質的に純粋な」と互換可能に使用される）は、核酸（す
なわち、インテグリンアンタゴニストをコードするポリヌクレオチド配列）に適
用される場合、ＲＮＡまたはＤＮＡポリヌクレオチド、ゲノムポリヌクレオチド
の部分、ｃＤＮＡ、または、その起源または操作により、（ｉ）天然では結合し
ているポリヌクレオチドのすべてと結合していない（例えば、発現ベクターまた
はその部分として宿主細胞中に存在する）合成ポリヌクレオチド；または（ｉｉ
）天然では連結している核酸または他の化学的部分以外の核酸または他の化学的
部分と連結している合成ポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）天然には生じない
合成ポリヌクレオチドを意味する。

「単離された」はさらに、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
りインビトロで増幅されたポリヌクレオチド配列か；（ｉｉ）化学的に合成され
たか；（ｉｉｉ）クローニングにより組換え的に産生されたポリヌクレオチド配
列か；または（ｉｖ）例えば切断およびゲル分離により精製されたポリヌクレオ
チド配列を意味する。したがって、「実質的に純粋な核酸」は、その核酸が由来
する生物の天然に存在するゲノムにおいて通常は連続しているコード配列の一方
または両方と直接連続していない核酸である。実質的に純粋なＤＮＡはまた、さ
らなるインテグリン配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えＤ
ＮＡを含む。

「単離された」（「実質的に純粋な」と互換可能に使用される）は、ポリペプ
チドに適用される場合、その起源または操作により、（ｉ）発現ベクターの部分
の発現産物として宿主細胞中に存在するポリペプチドまたはその部分か；または
（ｉｉ）天然では連結しているタンパク質または他の化学的部分以外のタンパク
質または他の化学的部分に連結しているポリペプチドまたはその部分か；または
（ｉｉｉ）天然には生じないポリペプチド（例えば、少なくとも１つの疎水性部
分をタンパク質に付加または追加することにより、そのタンパク質が天然では見
出されない形態であるように化学的に操作されているタンパク質）またはその部
分を意味する。「単離された」はさらに、（ｉ）化学的に合成されたタンパク質
か；または（ｉｉ）宿主細胞において発現し、そして結合したタンパク質および
混入しているタンパク質から精製されたタンパク質を意味する。この用語は一般
に、他のタンパク質および核酸（天然ではこれらと共にそのペプチドは生じる）
から分離されているポリペプチドを意味する。好ましくは、ポリペプチドはまた
、そのポリペプチドを単離するために使用される、抗体またはゲルマトリクス（
ポリアクリルアミド）のような物質から分離される。

「多価タンパク質複合体」−複数（すなわち、１以上）のインテグリンアンタ
ゴニストをいう。抗インテグリン抗体ホモログまたはフラグメントは別の抗体ホ
モログまたはフラグメントに架橋または結合されていてもよい。各タンパク質は
同じであっても異なってもよいし、各抗体ホモログまたはフラグメントは同じで
あっても異なってもよい。

「変異体」−生物の遺伝物質中の任意の変化。特に、野生型ポリヌクレオチド
配列中の任意の変化（すなわち、欠失、置換、付加、または変更）または野生型
タンパク質中の任意の変化。用語「ムテイン」は「変異体」と互換的に使用され
る。

「作動可能に連結した」−ポリヌクレオチド配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ）は、発現
制御配列がそのポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御し、そして調節し
ている場合、その発現制御配列に作動可能に連結している。用語「作動可能に連
結した」は、発現されるべきポリヌクレオチド配列の前に適切な開始シグナル（
例えば、ＡＴＧ）を有していること、および正確なリーディングフレームを維持
して、発現制御配列の制御下にポリヌクレオチド配列の発現を可能にすること、
およびポリヌクレオチド配列によりコードされる所望のポリペプチドの産生を包
含する。

「薬理学的薬剤」は、（本発明のアンタゴニストに加えて）被験体に投与され
る、そのアンタゴニストの作用に影響する１以上の化合物もしくは分子または他
の化学的実体として定義される。用語「薬理学的薬剤」は、本明細書中で使用さ
れる場合、本発明のアンタゴニストが、１以上の薬理学的薬剤の投与前、投与後
、投与と同時のいずれかで投与される「併合治療」の間に投与される薬剤をいう
。

「タンパク質」−２０種のアミノ酸の任意のものから本質的になる任意のポリ
マー。「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドを言うときにしばしば使
用され、「ペプチド」は、小さなポリペプチドを言うときにしばしば使用される
。当該分野におけるこれらの用語の用法は重なり、そして変わる。用語「タンパ
ク質」は、本明細書中で使用される場合、別の言及がなければ、ペプチド、タン
パク質、およびポリペプチドをいう。

用語「ペプチド」、「タンパク質」、および「ポリペプチド」は、本明細書中
で互換的に使用される。用語「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配
列」もまた本明細書中で互換的に使用される。

「組換え体」は、本明細書中で使用される場合、組換え体の哺乳動物発現系に
由来するタンパク質を意味する。インテグリンはグリコシル化されず、ジスルフ
ィド結合も含まないので、ほとんどの原核生物発現系および真核生物発現系にお
いて発現され得る。

「小分子」−Ａ２節で定義されたような定義を有する。

句「表面アミノ酸」は、タンパク質がネイティブな形態に折り畳まれている場
合、溶媒に曝される任意のアミノ酸を意味する。

「ハイブリダイゼーション条件」は一般に、ハイブリダイゼーションおよび洗
浄の両方について、０．５×ＳＳＣ〜５×ＳＳＣで６５℃に実質的に等価な塩条
件および温度条件を意味する。したがって、用語「標準的なハイブリダイゼーシ
ョン条件」は、本明細書中で使用する場合、操作上の定義であり、ある範囲のハ
イブリダイゼーション条件を包含する。にもかかわらず、「高ストリンジェンシ
ー」条件は、プラークスクリーニング緩衝液（０．２％ポリビニルピロリドン、
０．２％ Ｆｉｃｏｌｌ ４００；０．２％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１Ｍ ＮａＣｌ；０．１％ピロリン酸ナトリウ
ム；１％ＳＤＳ）；１０％デキストラン硫酸、および１００μｇ／ｍｌ変性超音
波処理サケ精液ＤＮＡと６５℃にて１２〜２０時間ハイブリダイズすること、お
よび７５ｍＭ ＮａＣｌ／７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（０．５×ＳＳＣ）／
１％ ＳＤＳで６５℃にての洗浄を包含する。「低ストリンジェンシー」条件は
、プラークスクリーニング緩衝液、１０％デキストラン硫酸、および１１０μｇ
／ｍｌ変性超音波処理サケ精液ＤＮＡと５５℃にて１２〜２０時間ハイブリダイ
ズすること、および３００ｍＭ ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム（２．
０×ＳＳＣ）／１％ ＳＤＳで５５℃にての洗浄を包含する。Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、６．３．１節〜６．３．３
節（１９８９）もまた参照。

「治療組成物」は、本明細書中で使用する場合、本発明のアンタゴニストおよ
び他の生物学的に適合可能な成分を含むと定義される。治療組成物は賦型剤（例
えば、水、鉱物およびキャリア（例えば、タンパク質））を含み得る。

「線維症状態の被験体」とは、内部器官の線維症を患う被験体、皮膚線維化疾
患を患う被験体、および眼の線維症状態を患う被験体をいうが、こららに限定さ
れない。内部器官（例えば、肝臓、肺、腎臓、心臓血管、胃腸管）の線維症が疾
患において生じる（たとえば、肺線維症、骨髄線維症、肝硬変、メサンギウム増
殖性糸球体腎炎、半月形糸球体腎炎、糖尿病性ネフロパシー、腎間質性線維症、
シクロスポリンを投与されている患者における腎線維症、およびＨＩＶ関連ネフ
ロパシー）。皮膚線維化疾患には、強皮症、限局性強皮症、ケロイド、過形成性
瘢痕、家族性皮膚コラゲノーマ（ｃｏｌｌａｇｅｎｏｍａ）およびコラーゲン型
の結合組織母斑が含まれるが、それらに限定されない。眼の線維症状態には、糖
尿病性網膜症、術後瘢痕（例えば、緑内障濾過手術の後および内斜視手術の後）
、増殖性硝子体網膜症のような状態が含まれる。本発明の方法により処理され得
るさらなる線維症状態には、慢性関節リウマチ、長時間の関節痛および変質関節
に関連する疾患；進行性全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、好酸球性筋膜炎
、限局性強皮症、レーノー症候群、および鼻ポリポーシスが含まれる。さらに、
本発明の方法により処置され得る線維症状態には、ケロイドまたは過形成性瘢痕
を形成することが知られている患者において瘢痕の過剰生成を阻害すること、種
々の型の創傷（外科的切開、外科的な腹の創傷および外傷性裂傷）の治癒の間に
瘢痕または瘢痕の過剰生成を阻害もしくは予防すること、冠血管形成後の動脈の
瘢痕および再閉鎖を予防または阻害すること、梗塞後および高血圧性血管症にお
ける心臓線維症に関連する過剰な瘢痕または線維性組織形成を予防または阻害す
ることもまた含まれる。

「有効量」は、有益な結果または所望の結果を達成するに必要な量である。有
効量は１回以上の投与で投与され得る。処置に関して、本発明における使用のた
めのアンタゴニストの「有効量」は、処置されるべき障害について受容される標
準に従って、線維症状態を緩和し、軽減し、安定化し、逆転し、遅くしまたは遅
延させるに必要な量である。効力の指標の検出および測定は、例えば、物理学的
検査（血液検査、肺機能検査、および胸部Ｘ腺を含む）、ＣＴスキャン；気管支
鏡検査；気管支肺胞洗浄；肺生検およびＣＴスキャンを含む、多くの利用可能な
診断ツールにより測定され得る。

本発明の実施は、他に示されなければ、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、
微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学、薬理学および免疫学の従来の技術（
これらは当業者の知識の範囲内である）を使用する。このような技術は文献に記
載されている。他に記載がなければ、発明の詳細な説明で引用するすべての参考
文献は、本明細書中に参考として援用する。

（ＩＩ．好ましい実施形態の説明）
本願は、インテグリンおよびそのフラグメントを含むα１サブユニットおよび
／またはα４サブユニットに対するアンタゴニストが肺線維症の処置に使用され
得ること
（Ａ．インテグリンアンタゴニスト）
本発明の目的のためには、インテグリンアンタゴニストは、リガンド−レセプ
ター相互作用により誘導される正常機能が改変される（すなわち、妨げられるか
、遅くなるか、またはその他の改変）ような、インテグリンとその同族のリガン
ドまたはレセプターとの間の任意の相互作用のアンタゴニストであり得る。イン
テグリンアンタゴニストの１つの好ましい実施形態は、α４インテグリンとその
リガンドとの相互作用（例えば、ＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４相互作用）のアンタ
ゴニストである。これは、ＶＣＡＭ−１および／またはＶＬＡ−４媒介結合を阻
害またはブロックし得るか、または例えば、ＶＬＡ−４−リガンド媒介ＶＬＡ−
４シグナル伝達またはＶＣＡＭ−１−リガンド媒介ＶＣＡＭ−１シグナル伝達を
阻害またはブロックすることにより、ＶＣＡＭ−１および／またはＶＬＡ−４の
機能をその他調節し得る薬剤（例えば、ポリペプチドまたは他の分子）であり、
そして急性脳傷害の処置において、好ましくは抗ＶＬＡ−１抗体と同じ様式で有
効である。

ＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４相互作用のアンタゴニストは以下の特性のうちの１
つ以上を有する因子である：（１）ＶＬＡ−４を有する細胞（例えば、上皮細胞
）の表面上のＶＬＡ−４に十分な特異性でコートするかまたは結合して、ＶＬＡ
−４−リガンド／ＶＬＡ−４相互作用（例えば、ＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４相互
作用）を阻害する；（２）ＶＬＡ−４を有する細胞（例えば、リンパ球）の表面
上のＶＬＡ−４に十分な特異性でコートするかまたは結合して、ＶＬＡ−４媒介
シグナルの伝達（例えば、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１媒介シグナル伝達）を改変
および好ましくは阻害する；（３）上皮細胞上のＶＬＡ−４−リガンド（例えば
、ＶＣＡＭ−１）に十分な特異性でコートするかまたは結合して、ＶＬＡ−４／
ＶＣＡＭ−１相互作用を阻害する；（４）ＶＬＡ−４−リガンド（例えば、ＶＣ
ＡＭ−１）に十分な特異性でコートするかまたは結合して、ＶＬＡ−４−リガン
ド媒介ＶＬＡ−４シグナルの伝達（例えば、ＶＣＡＭ−１媒介ＶＬＡ−４シグナ
ル伝達）を改変および好ましくは阻害する。好ましい実施形態において、アンタ
ゴニストは、特性１および２の一方または両方を有する。他の好ましい実施形態
では、アンタゴニストは、特性３および４の一方または両方を有する。さらに、
１より多いアンタゴニストが使用され得る。例えば、ＶＬＡ−４に結合する因子
は、ＶＣＡＭ−１に結合する因子と組み合わされ得る。

インテグリンアンタゴニストの別の実施形態は、α１インテグリンとそのリガ
ンドとの相互作用（例えば、コラーゲン／ＶＬＡ−１相互作用）のアンタゴニス
トである。これは、コラーゲンおよび／またはＶＬＡ−１媒介結合を阻害または
ブロックし得るか、または例えば、ＶＬＡ−１−リガンド媒介ＶＬＡ−１シグナ
ル伝達またはコラーゲン媒介コラーゲンシグナル伝達を阻害またはブロックする
ことにより、コラーゲンおよび／またはＶＬＡ−１の機能をその他調節し得る因
子（例えば、ポリペプチドまたは他の分子）である。コラーゲン／ＶＬＡ−１相
互作用のアンタゴニストは以下の特性のうちの１つ以上を有する因子である：（
１）ＶＬＡ−１を有する細胞（例えば、コラーゲン）の表面上のＶＬＡ−１に十
分な特異性でコートするかまたは結合して、ＶＬＡ−１−リガンド／ＶＬＡ−１
相互作用（例えば、コラーゲン／ＶＬＡ−１相互作用）を阻害する；（２）ＶＬ
Ａ−１を有する細胞の表面上のＶＬＡ−１に十分な特異性でコートするかまたは
結合して、ＶＬＡ−１媒介シグナルの伝達（例えば、ＶＬＡ−１／コラーゲン媒
介シグナル伝達）を改変および好ましくは阻害する；（３）ＶＬＡ−１−リガン
ド（例えば、コラーゲン）に十分な特異性でコートするかまたは結合して、ＶＬ
Ａ−１／コラーゲン相互作用を阻害する；（４）ＶＬＡ−１−リガンドに十分な
特異性でコートするかまたは結合して、ＶＬＡ−１−リガンド媒介ＶＬＡ−１シ
グナルの伝達（例えば、コラーゲン媒介ＶＬＡ−１シグナル伝達）を改変および
好ましくは阻害する。好ましい実施形態において、α１アンタゴニストは、特性
１および２の一方または両方を有する。他の好ましい実施形態では、アンタゴニ
ストは、特性３および４の一方または両方を有する。さらに、１より多いアンタ
ゴニストが患者に投与され得る。例えば、ＶＬＡ−１に結合する因子は、コラー
ゲンに結合する因子と組み合わされ得る。

本明細書中で議論されるように、本発明の方法において使用されるアンタゴニ
ストは、分子の特定の型にも構造にも限定されず、その結果、本発明の目的およ
び例示のためだけに、細胞表面のα４インテグリン（例えば、ＶＬＡ−４）に、
またはα４リガンド（例えば、α４リガンドを有する細胞の表面のＶＣＡＭ−１
）結合し得る任意の因子（それぞれ「α４インテグリン結合因子」および「α４
インテグリンリガンド結合因子」と呼ぶ）が、本明細書中で使用されるアンタゴ
ニストの等価物であると考えられる。

例えば、抗体または抗体ホモログ（下記で議論する）ならびにＶＬＡ−４およ
びＶＣＡＭ−１に対する天然の結合タンパク質の可溶形態が有用である。ＶＬＡ
−４に対する天然の結合タンパク質の可溶形態には、可溶性ＶＣＡＭ−１ペプチ
ド、ＶＣＡＭ−１融合タンパク質、二官能性ＶＣＡＭ−１／Ｉｇ融合タンパク質
（例えば、上記の「キメラ」分子）、フィブロネクチン、交互にスプライスされ
た非タイプＩＩＩ結合セグメントを有するフィブロネクチン、およびアミノ酸配
列ＥＩＬＤＶかまたは同様な保存的に置換されたアミノ酸配列を含むフィブロネ
クチンペプチドが含まれる。ＶＣＡＭ−１に対する天然の結合タンパク質の可溶
形態には、可溶性ＶＬＡ−４ペプチド、ＶＬＡ−４融合タンパク質、二官能性Ｖ
ＬＡ−４／Ｉｇ融合タンパク質などが含まれる。本明細書中で使用する場合、「
可溶性ＶＬＡ−４ペプチド」または「可溶性ＶＣＡＭ−１ペプチド」は、自らを
膜に固定し得ないＶＬＡ−４またはＶＣＡＭ−１ポリペプチドである。このよう
な可溶性ポリペプチドには、例えば、そのポリペプチドを固定するに十分な膜貫
通領域の部分を欠くか、または膜貫通領域が非機能的に改変されている、ＶＬＡ
−４およびＶＣＡＭポリペプチドが含まれる。これらの結合性因子は、ＶＬＡ−
４に対する細胞−表面結合タンパク質と競合することにより、またはＶＬＡ−４
機能をその他変更することにより作用し得る。例えば、可溶形態のＶＣＡＭ−１
（例えば、Ｏｓｂｏｒｎら、１９８９、Ｃｅｌｌ，５９：１２０３−１２１１）
またはそのフラグメントは、ＶＬＡ−４に結合し、好ましくはＶＣＡＭ−１を有
する細胞上のＶＬＡ−４結合部位について競合し、それによりアンタゴニスト（
例えば、小分子または抗ＶＬＡ−４抗体）の投与と同様な効果を導くように投与
され得る。

（１．抗インテグリン抗体ホモログ）
他の好ましい実施形態では、細胞表面α１および／またはα４インテグリン（
例えば、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４またはα４β７）ならびに／あるいはα１およ
び／またはα４インテグリンの細胞表面リガンド（例えば、それぞれ、コラーゲ
ンまたはＶＣＡＭ−１）に結合する（ブロックすることまたはコートすることを
含む）ために本発明の方法において使用されるアンタゴニストは、抗ＶＬＡ−１
または抗ＶＬＡ−４および／または抗コラーゲンおよび／または抗ＶＣＡＭ−１
のモノクローナル抗体または抗体ホモログ（前述の定義のような）である。処置
、特にヒトの処置に好ましい抗体およびホモログには、ヒト抗体ホモログ、ヒト
化抗体ホモログ、キメラ抗体ホモログ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂おお
よびＦ（ｖ）抗体フラグメント、ならびに抗体重鎖または軽鎖のモノマーまたは
ダイマーあるいはそれらの混合物が含まれる。ＶＬＡ−４に対するモノクローナ
ル抗体は、本発明の方法における好ましい結合因子である。

（２．小分子インテグリンアンタゴニスト）
用語「小分子」インテグリンアンタゴニストは、例えば、細胞の表面上のＶＬ
Ａ−４に結合するか、または細胞の表面上のＶＣＡＭ−１に結合することにより
ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ相互作用をブロックすることによってインテグリン／イン
テグリンリガンド相互作用を乱し得る化学的因子（すなわち、有機分子）をいう
。このような小分子はまた、それぞれのＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ−１レセプタ
ーに結合し得る。ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ−１小分子インヒビターは、それ自
体ペプチド、半ペプチド性化合物または非ペプチド性化合物（例えば、ＶＣＡＭ
−１／ＶＬＡ−４相互作用のアンタゴニストである小有機分子）であり得る。本
明細書中で定義される「小分子」は、抗体または甲体ホモログを包含することを
意図しない。例示的な小分子の分子量は一般に１０００未満である。

例えば、ＶＬＡ−４リガンドの結合ドメインを模倣し、そしてＶＬＡ−４のレ
セプタードメインに適合する小分子（オリゴ糖）が使用され得る（Ｊ．Ｊ．Ｄｅ
ｖｌｉｎら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４００−４０６（１９９０）
、Ｊ．Ｋ．ＳｃｏｔｔおよびＧ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９：３８６−３９０、および米国特許第４，８３３，０９２号（Ｇｅｙｓｅ
ｎ）を参照（すべて本明細書中で参考として援用する））。逆に、ＶＣＡＭ−１
リガンドの結合ドメインを模倣し、そしてＶＣＡＭ−１のレセプタードメインに
適合する小分子が用いられ得る。

本発明において有用な他の小分子の例は、Ｋｏｍｏｒｉｙａら（「Ｔｈｅ Ｅ
ｓｓｅｎｔｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ Ｍａｊｏｒ Ｃｅｌｌ Ｔ
ｙｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｓｉｔｅ（ＣＳ１） Ｗｉｔｈ
ｉｎ ｔｈｅ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ Ｓｐｌｉｃｅｄ Ｔｙｐｅ ＩＩ
Ｉ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｆｉｂｒｏ
ｎｅｃｔｉｎ Ｉｓ Ｌｅｕｃｉｎｅ−Ａｓｐａｒｔｉｃ Ａｃｉｄ−Ｖａｌｉ
ｎｅ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６（２３）ｐｐ．１５０７５−７９（１
９９１））に見出し得る。彼らは、ＶＬＡ−４に結合するに必要な最小の活性ア
ミノ酸配列を同定し、そして特定種のフィブロネクチンのＣＳ−１領域（ＶＬＡ
−４結合ドメイン）のアミノ酸配列に基づいて種々の重複するペプチドを合成し
た。彼らは、フィブロネクチン依存性細胞接着に対する阻害活性を有する、８−
アミノ酸ペプチドＧｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−
Ｔｈｒならびに２つのより小さな重複ペンタペプチドＧｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−
ＡｓｐおよびＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒを同定した。ＬＤＶ配列
を含む特定のより長いペプチドが、インビボで活性であることがその後示された
（Ｔ．Ａ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎら「Ｔｗｏ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ａｂｒｏｇａｔｅ Ｔ−ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｍ
ｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，ｐｐ．８０７２−７６（１９９１）；およびＳ．Ｍ
．Ｗａｈｌら、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ Ｓｕｐｐｒｅｓｓ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎ Ｒａｔｓ ｂｙ Ｉｎｔ
ｅｒｒｕｐｔｉｎｇ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃ
ｒｕｉｔｍｅｎｔ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９４，ｐｐ．６５５−６２
（１９９４））。フィブロネクチンへのＶＬＡ−４の接着およびＶＬＡ−５の接
着の両方を阻害し得る、環状ペンタペプチドＡｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−ＴＰｒｏ
−Ｃｙｓ（ここで、Ｔｐｒｏは４−チオプロリンを示す）もまた記載されている
（例えば、Ｄ．Ｍ．Ｎｏｗｌｉｎら「Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃｙｃｌｉｃ Ｐｅｎｔ
ａｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ａｌｐｈａ４Ｂｅｔａ１ Ｉｎｔｅｇｒ
ｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６８（２７），ｐｐ．２０３５２−５９（１９９３）；およびＰＣＴ公
開公報ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４８６２を参照）。このペンタペプチドは、いくつ
かの細胞外マトリクスタンパク質のための認識部位における共通モチーフとして
公知である、フィブロネクチン由来のトリペプチド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
に基づいていた。他のＶＬＡ−４インヒビターの例は、例えばＡｄａｍｓら「Ｃ
ｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」、ＰＣＴ ＵＳ９７／１３０
１３に報告された。これは、細胞接着阻害活性を有するβ−アミノ酸を含む直鎖
ペプチジル化合物を記載する。国際特許出願ＷＯ９４／１５９５８およびＷＯ９
２／００９９５は、細胞接着阻害活性を有する環状ペプチドおよびペプチド模倣
化合物を記載する。国際特許出願ＷＯ９３／０８８２３およびＷＯ９２／０８４
６４は、グアニジニル含有、尿素含有、チオウレア含有細胞接着阻害化合物を記
載する。米国特許第５，２６０，２７７号はグアニジニル細胞接着調節化合物を
記載する。ＶＬＡ−４の他のペプチジルアンタゴニストはＤ．Ｙ．Ｊａｃｋｓｏ
ｎら「Ｐｏｔｅｎｔ α４β１ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ａ
ｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ
」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，４０，３３５９（１９９７）；Ｈ．Ｓｈｒｏｆｆら、
「Ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ α４β７ ｍｅ
ｄｉａｔｅｄ ＭａｄＣＡＭ−１ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｌｙｍｐｈｏｃｙ
ｔｅｓ」Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１ ２４９５（１９９６）；
米国特許第５，５１０，３３２号、ＰＣＴ公報ＷＯ９８／５３８１４、ＷＯ９７
／０３０９４、ＷＯ９７／０２２８９、ＷＯ９６／４０７８１、ＷＯ９６／２２
９６６、ＷＯ９６／２０２１６、ＷＯ９６／０１６４４、ＷＯ９６１０６１０８
、およびＷＯ９５／１５９７３ならびにその他に記載されている。

このような小分子因子は、複数のペプチド（例えば、５〜２０アミノ酸長）、
半ペプチド性化合物または非ペプチド性有機化合物、を合成し、次いでこれらの
化合物を適切なＶＬＡ−１／コラーゲン相互作用またはＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−
１相互作用を阻害する能力についてスクリーニングすることにより作製され得る
（一般には、米国特許第４，８３３，０９２号、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ「
Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｇａｎｄｓ ｗｉｔｈ ａ
ｎ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｌｉｂｒａｒｙ」Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，ｐｐ．３８６
−９０（１９９０）、およびＤｅｖｌｉｎら「Ｒａｎｄｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，ｐｐ．
４０４０７（１９９０）を参照）。

（Ｂ．抗インテグリン抗体ホモログを製造する方法）
モノクローナル抗体（例えば、抗インテグリンモノクローナル抗体を含む）を
作製するための技術は周知である（例えば、Ｍｅｎｄｒｉｃｋら、１９９５、Ｌ
ａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７２：３６７−３７５（マウス抗−α１β１および抗−α
２β１に対するｍＡｂ）；Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６２：１０３７６−１０３８３（マウス抗−α６β１に対するｍＡ
ｂ）；Ｙａｏら、１９９６、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １９９６ １０９：３１３
９−５０（マウス抗−α７β１に対するｍＡｂ）；Ｈｅｍｌｅｒら、１９８４、
Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３２：３０１１−８（ヒトα１β１に対するｍＡｂ）；
Ｐｉｓｃｈｅｌら、１９８７、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３８：２２６−３３（ヒ
トα２β１に対するｍＡｂ）；Ｗａｙｎｅｒら、１９８８、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ １０７：１８８１−９１（ヒトα３β１に対するｍＡｂ）；Ｈｅｍｌｅｒ
ら、１９８７、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：１１４７８−８５（ヒトα４
β１に対するｍＡｂ）；Ｗａｙｎｅｒら、１９８８、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
１０７：１８８１−９１（ヒトα５β１に対するｍＡｂ）；Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒ
ｇら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１０３７６−１０３８３（
ヒトα６β１に対するｍＡｂ）；Ａ Ｗａｎｇら、１９９６、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓ
ｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：６６４−６７２（ヒトα９β１に
対するｍＡｂ）；Ｄａｖｉｅｓら、１９８９、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０９
：１８１７−２６（ヒトαＶβ１に対するｍＡｂ）；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｒｄ
ｒｉｄら、１９８２、Ｐｒｏ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９：７
４８９−９３（ヒトαＬβ２に対するｍＡｂ）；Ｄｉａｍｏｎｄら、１９９３、
Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２０：１０３１−４３（ヒトαＭβ２に対するｍＡ
ｂ）；Ｓｔａｃｋｅｒら、１９９１、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４６：６４８−５
５（ヒトαＸβ２に対するｍＡｂ）；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｉｅｒｅｎら、１９９
５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：６８３−９０（ヒトαＤβ２に対するｍＡｂ）；Ｂ
ｅｎｎｅｔｔら、１９８３、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
８０：２４１７−２１（ヒトαＩＩｂβ３に対するｍＡｂ）；Ｈｅｓｓｌｅら、
１９８４、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２６：４９−５４（ヒトα６β４
に対するｍＡｂ）；Ｗｅｉｎａｃｋｅｒら、１９９４、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ
２６９：６９４０−８（ヒトαＶβ５に対するｍＡｂ）；Ｗｅｉｎａｃｋｅｒ
ら、１９９４、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：６９４０−８（ヒトαＶβ６
に対するｍＡｂ）；Ｃｅｒｆ−Ｂｅｎｓｕｓｓａｎら、１９９２、Ｅｕｒ Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２：２７３−７（ヒトαＥβ７に対するｍＡｂ）；Ｎｉｓｈ
ｉｍｕｒａら、１９９４、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：２８７０８−１５
（ヒトαＶβ８に対するｍＡｂ）；Ｂｏｓｓｙら、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ １
０：２３７５−８５（ヒトα８β１に対するポリクローナル抗血清）；Ｃａｍｐ
ｅｒら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２０３８３−２０３８９
（ヒトα１０β１に対するポリクローナル抗血清）を参照）。

本明細書中で意図される好ましいインテグリンアンタゴニストは、原核生物宿
主細胞もしくは真核生物宿主細胞において、インタクトもしくは短縮化された（
ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ゲノムもしくはｃＤＮＡから発現され得るか、または合成
ＤＮＡから発現され得る。ダイマータンパク質は、培養培地から単離され得、お
よび／またはインビトロで再折り畳みおよび二量体化されて、生物学的に活性な
組成物を形成し得る。ヘテロダイマーは、別個の異なるポリペプチド鎖を結合さ
せることによって、インビトロで形成され得る。あるいは、ヘテロダイマーは、
別個の異なるポリペプチド鎖をコードする核酸を同時発現させることによって、
単一細胞中で形成され得る。いくつかの例示的な組換えヘテロダイマータンパク
質産生プロトコールについては、例えば、ＷＯ９３／０９２２９、または米国特
許第５，４１１，９４１号を参照のこと。現在好ましい宿主細胞としては、Ｅ．
ｃｏｌｉを含む原核生物、または酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、昆虫細胞
、または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＢＳＣ細胞）を含む真
核生物細胞が挙げられるが、限定されない。当業者は、他の宿主細胞が有利に使
用され得ることを認識する。

例えば、抗ＶＬＡ−４抗体は、ＶＬＡ−４発現細胞からの１２５Ｉ標識化細胞
溶解産物の免疫沈降によって同定され得る（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄら、
１９８６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：１３４３−１３４９、およびＨ
ｅｍｌｅｒら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１１４７８−１１
４８５を参照のこと）。抗ＶＬＡ−４抗体はまた、フローサイトメトリによって
（例えば、ＶＬＡ−４を認識すると考えられる抗体と共にインキュベートされた
Ｒａｍｏｓ細胞の蛍光染色を測定することによって）同定され得る（Ｅｌｉｃｅ
ｓら、１９９０、Ｃｅｌｌ ６０：５７７−５８４）。ハイブリドーマ細胞の産
生に使用されるリンパ球は、代表的に、免疫された哺乳動物（この血清は、この
ようなスクリーニングアッセイを使用して、抗ＶＬＡ−４抗体の存在について陽
性であることが既に試験されている）から単離される。

代表的に、不死化細胞株（例えば、骨髄細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳動物
種由来である。好ましい不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アルニノプテリン（
ａｒｎｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）およびチミジンを含む培養培地（「ＨＡＴ培地」）
に対して感受性であるマウス骨髄細胞株である。代表的に、ＨＡＴ感受性マウス
骨髄細胞は、１５００分子量ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ１５００」）を
使用して、マウス脾細胞に融合される。次いで、この融合から生じるハイブリド
ーマ細胞を、ＨＡＴ培地（これは、非融合骨髄細胞および非生産的に融合された
骨髄細胞を殺傷する）を使用して選択する（非融合脾細胞は、形質転換されてい
ないので、数日後に死滅する）。所望の抗体を産生するハイブリドーマは、ハイ
ブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出される。例えば、抗
ＶＬＡ−４抗体を産生するために調製されたハイブリドーマは、組換えα４サブ
ユニット発現細胞株に結合する能力を有する分泌抗体について、ハイブリドーマ
培養上清を試験することによって、スクリーニングされ得る（Ｅｌｉｃｅｓら（
前出）を参照のこと）。

インタクトな免疫グロブリンである抗ＶＬＡ−４抗体ホモログを産生するため
に、このようなスクリーニングアッセイにおいて陽性であると試験されたハイブ
リドーマ細胞を、このハイブリドーマ細胞が培養培地にモノクローナル抗体を分
泌するのを可能にするに十分な条件下および十分な時間にわたって、栄養培地に
おいて培養した。ハイブリドーマ細胞に適切な組織培養技術および培養培地は、
周知である。馴化されたハイブリドーマ培養上清が収集され得、そして抗ＶＬＡ
−４抗体は、必要に応じて、周知の方法によってさらに精製され得る。

あるいは、所望される抗体は、非免疫マウスの腹腔中にハイブリドーマ細胞を
注射することによって産生され得る。このハイブリドーマ細胞は、腹腔中で増殖
し、腹水として蓄積する抗体を分泌する。抗体は、シリンジを用いて腹腔からこ
の腹水を回収することによって収集され得る。

いくつかのマウス抗ＶＬＡ−４モノクローナル抗体が、以前に記載されている
。例えば、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄら、１９８６（前出）；Ｈｅｍｌｅｒ
ら、１９８７（前出）；Ｐｕｌｉｄｏら、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６６（１６）、１０２４１−１０２４５）；ＩｓｓｅｋｕｔｚおよびＷｙｋｒ
ｅｔｏｗｉｃｚ、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１０９（ＴＡ−２
ｍａｂ）を参照のこと。これらの抗ＶＬＡ−４モノクローナル抗体およびＶＬＡ
−４のα鎖および／またはβ鎖を認識し得る他の抗ＶＬＡ−４抗体（例えば、米
国特許第５，８８８，５０７号、Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．およびその中で引用さ
れた参考文献）が、本発明に従う処置方法において有用である。ＶＣＡＭ−１お
よびフィブロネクチンリガンドの結合に関与するＶＬＡ−４α４鎖エピトープを
認識する抗ＶＬＡ−４抗体（すなわち、リガンド認識に関与する部位でＶＬＡ−
４に結合し得、そしてＶＣＡＭ−１およびフィブロネクチン結合をブロックし得
る抗体）が好ましい。このような抗体は、Ｂエピトープ特異的抗体（Ｂ１または
Ｂ２）（Ｐｕｌｉｄｏら、１９９１（前出））として定義付けられており、そし
てまた、本発明に従う抗ＶＬＡ−４抗体である。

ＶＬＡ−４に対する完全なヒトモノクローナル抗体ホモログは、本発明の方法
においてＶＬＡ−４リガンドをブロックまたは被膜し得る別の好ましい結合因子
である。それらのインタクトな形態において、これらは、Ｂｏｅｒｎｅｒら、１
９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５に記載されるように、インビ
トロ初回刺激されたヒト脾細胞を使用して調製され得る。あるいは、これらは、
Ｐｅｒｓｓｏｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８８：２４３２−２４３６またはＨｕａｎｇおよびＳｔｏｌｌａｒ、１９９１
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４１、２２７−２３６に記載される
ような、レパートリークローニング（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｃｌｏｎｉｎｇ）
によって調製され得る。米国特許第５，７９８，２３０号（１９９８年８月２５
日、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕ
ｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ
ｕｓｅ」）は、ヒトＢ細胞からのヒトモノクローナル抗体の調製を記載する。こ
のプロセスに従って、ヒト抗体産生Ｂ細胞は、エプスタイン−バーウイルス核抗
原２（ＥＢＮＡ２）を発現する、エプスタイン−バーウイルスまたはその誘導体
による感染によって不死化される。不死化に必要とされるＥＢＮＡ２感染は、そ
の後停止され、これが抗体産生の増加を生じる。

完全なヒト抗体を産生するためのさらに別の方法において、米国特許第５，７
８９，６５０号（１９９８年８月４日、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｎｏｎ−ｈｕ
ｍａｎ ａｎｉｍａｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏ
ｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」）は、異種抗体を産生し得るトランスジェニック
非ヒト動物、および不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子を有するトラン
スジェニック非ヒト動物を記載する。内因性免疫グロブリン遺伝子は、抗血清ポ
リヌクレオチドおよび／または内因性免疫グロブリンに対する抗血清によって抑
制される。異種抗体は、その非ヒト動物種のゲノム中に通常見出されない免疫グ
ロブリン遺伝子によってコードされる。整列されていない異種ヒト免疫グロブリ
ン重鎖の配列を含む１以上の導入遺伝子が、非ヒト動物中に導入され、それによ
って、トランスジェニック免疫グロブリン配列を機能的に再配置し得、そしてヒ
ト免疫グロブリン遺伝子によってコードされる種々の同位体の抗体のレパートリ
ーを産生し得るトランスジェニック動物を形成する。このような異種ヒト抗体は
、Ｂ細胞において産生され、これはその後、例えば、不死化細胞株（例えば、骨
髄腫）と融合することによって、または完全なヒトモノクローナル異種抗体ホモ
ログを産生し得る細胞株を永続化するための他の技術によってこのようなＢ細胞
を操作することにより不死化される。

大きな非不死化ヒトファージディスプレイライブラリーもまた、標準的ファー
ジ技術（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６）を使用して、ヒト治療として開発され得
る高親和性抗体を単離するために使用され得る。

本発明の方法において、インテグリンリガンドをブロックまたは被膜し得るさ
らに別の好ましい結合因子は、抗インテグリン特異性を有するヒト化組換え抗体
ホモログである。真の「キメラ抗体」の調製のための初期の方法（ここでは、定
常領域全体および可変領域全体が、異なる供給源に由来する）の後に、新たなア
プローチが、ＥＰ０２３９４００（Ｗｉｎｔｅｒら）において記載されており、
ここでは、１つの種についてのその相補性決定領域（ＣＤＲ）を別の種由来のＣ
ＤＲで置換すること（所定の可変領域において）によって、抗体が変更される。
このプロセスは、例えば、ヒト重鎖および軽鎖Ｉｇ可変領域ドメイン由来のＣＤ
Ｒを、マウス可変領域ドメイン由来の代替的なＣＤＲで置換するために使用され
得る。これらの変更されたＩｇ可変領域は、引き続いて、ヒトＩｇ定常領域と組
合せられて、置換されたマウスＣＤＲ以外は組成が完全にヒトである抗体を作製
し得る。このようなＣＤＲ置換抗体は、真のキメラ抗体と比較して、ヒトにおけ
る免疫応答を誘発する可能性が低いと推定される。なぜなら、ＣＤＲ置換抗体は
、非ヒト成分をほとんど含まないからである。ＣＤＲ「グラフティング（ｇｒａ
ｆｔｉｎｇ）」を介してモノクローナル抗体をヒト化するこのプロセスは、「新
形態化（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）」と称されている（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９
８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２、３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８
８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、１５３４−１５３６）。

代表的に、マウス抗体の相補正決定領域（ＣＤＲ）は、ヒト抗体において対応
する領域に移植される。なぜなら、これが、特異的抗原に結合するマウス抗体の
領域であるＣＤＲ（抗体重鎖中に３つ、軽鎖中に３つ）であるからである。ＣＤ
Ｒの移植は、遺伝子操作によって達成され、ここではＣＤＲ ＤＮＡ配列は、マ
ウス重鎖および軽鎖の可変（Ｖ）領域遺伝子セグメントのクローニングによって
決定され、次いで、部位特異的変異誘発によって、対応するヒトＶ領域に移植さ
れる。このプロセスの最後の段階において、所望される同位体（通常は、ＣＨに
ついてはγＩ、そしてＣＬについてはκ）のヒト定常領域遺伝子セグメントを付
加し、そしてヒト化重鎖および軽鎖遺伝子を、哺乳動物細胞において同時発現さ
せて、可溶性ヒト化抗体を産生する。

ヒト抗体へのこれらのＣＤＲの移入は、この抗体に、本来のマウス抗体の抗原
結合特性を付与する。マウス抗体中の６つのＣＤＲが、Ｖ領域の「フレームワー
ク」領域に構造的に埋めこまれる。ＣＤＲグラフティングが首尾良いことの理由
は、マウス抗体とヒト抗体との間のフレームワーク領域が、ＣＤＲについて類似
したた付着点を有する非常に類似した３−Ｄ構造を有し得、その結果ＣＤＲが交
換可能であり得るという点である。このようなヒト化抗体ホモログは、Ｊｏｎｅ
ｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１、５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ
、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２、３２３−３２７；Ｑｕｅｅｎら、１９８９
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６、１００２９；および
Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：３８３３において例示されるように調製され得る。

それにも関わらず、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸は、ＣＤＲと相互
作用し、そして全体的な抗原結合親和性に影響を与えると考えられている。ヒト
Ｖ領域フレームワークのいかなる改変をも伴なわずに組換えヒト化抗体を産生す
るためのマウス抗体由来のＣＤＲの直接的な移入は、しばしば、結合親和性の部
分的または完全な喪失を生じる。多くの場合において、結合活性を得るために、
アクセプター抗体のフレームワーク領域中の残基を変更することが重要であるよ
うに思われる。

Ｑｕｅｅｎら、１９８９（前出）およびＷＯ９０／０７８６１（Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｄｉｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）は、マウスＭＡｂ（抗Ｔａｃ）のＣＤＲとヒト免
疫グロブリンフレームワーク領域および定常領域とを結合させることによる、ア
クセプター抗体のフレームワーク領域中に改変残基を含むヒト化抗体の調製を記
載している。この研究者らは、ヒトＶ領域フレームワーク残基のいかなる変更も
伴なわずに、しばしば直接的なＣＤＲ移入から生じる結合親和性の喪失の問題に
１つの解決策を実証した；この研究者らの解決策は、２つの重要な工程を包含す
る。第１に、ヒトＶフレームワーク領域を、本来のマウス抗体のＶ領域フレーム
ワークに相同な最適のタンパク質配列（この場合、抗Ｔａｃ ＭＡｂ）について
、コンピューター分析によって選択する。第２工程において、マウスＶ領域の三
次元構造を、コンピューターによってモデル化して、マウスＣＤＲと相互作用す
る可能性が高いフレームワークアミノ酸残基を可視化し、次いで、これらのマウ
スアミノ酸残基を、相同なヒトフレームワーク上に配置する。米国特許第５，６
９３，７６２号；同第５、６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号；およ
び同第５，５３０，１０１号（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）もま
た参照のこと。

異なるアプローチ（Ｔｅｍｐｅｓｔら、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ ９、２６６−２７１）が使用され得、そして標準として、マウス残基の根本
的な導入を伴なわずに、ＣＤＲグラフティングについて、それぞれＮＥＷＭおよ
びＲＥＩの重鎖および軽鎖に由来するＶ領域フレームワークが使用され得る。Ｔ
ｅｍｅｓｔらのＮＥＷＭおよびＲＥＩに基づいたヒト化抗体を構築するアプロー
チを使用する利点は、ＮＥＷＭおよびＲＥＩの可変領域の三次元構造が、Ｘ線結
晶学から公知であり、従って、ＣＤＲとＶ領域フレームワーク残基との間の特異
的相互作用がモデル化され得るという点である。

採択されるアプローチに関わらず、現在までに調製された初期のヒト化抗体ホ
モログの例は、これが簡単なプロセスではないことを示している。しかし、この
ようなフレームワークの変化が必須とされ得るということを認知してなお、利用
可能な先行技術に基づいて、たとえ存在するにしろ、どのフレームワーク残基が
、所望される特異性の機能的ヒト化組換え抗体を得るために変更される必要があ
るかを推測することは不可能である。従って、これまでの結果は、特異性および
／または親和性を保存するために必要とされる変化は、大部分において、所定の
抗体に固有であり、そして異なる抗体のヒト化に基づいて推定され得ないことを
示す。

本発明において有用な特定のα４サブユニット保有インテグリンアンタゴニス
トは、米国特許第５，９３１，２１４（ｍａｂ ＨＰ１／２）において調製され
ており、そして記載されている、Ｂエピトープ特異性を有するキメラおよびヒト
化組換え抗体ホモログ（すなわち、インタクトな免疫グロブリンおよびその部分
）を含む。キメラ（マウス可変−ヒト定常）およびヒト化抗インテグリン抗体ホ
モログの調製のための出発材料は、以前に記載されたようなマウスモノクローナ
ル抗インテグリン抗体、市販のモノクローナル抗インテグリン抗体（例えば、Ｈ
Ｐ１／２、Ａｍａｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｒｏ
ｏｋ、Ｍａｉｎｅ）、または本明細書中の教示に従って調製されるモノクローナ
ル抗インテグリン抗体であり得る。他の好ましいヒト化抗ＶＬＡ−４抗体ホモロ
グは、Ａｔｈｅｎａ Ｎｅｕｔｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．によって、ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９５／０１２１９（１９９５年７月２７日）および米国特許第５，８４
０，２９９号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。

これらのヒト化抗ＶＬＡ−４抗体は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖を含む。ヒ
ト化軽鎖は、マウスの２１−６免疫グロブリン軽鎖の対応する相補性決定領域由
来のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および
ＣＤＲ３）、およびヒトκ軽鎖可変領域フレームワーク配列由来の可変領域フレ
ームワーク（少なくとも位置においては、アミノ酸位置が、マウス２１．６免疫グロブリン軽鎖可変領域フレームワークの等しい位置に存在する同じアミノ酸に
よって占められることを除く）を含む。ヒト化重鎖は、マウスの２１−６免疫グ
ロブリン重鎖の対応する相補性決定領域由来のアミノ酸配列を有する３つの相補
性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、およびヒト重鎖可変領域
フレームワーク配列由来の可変領域フレームワーク（少なくとも１つの位置にお
いては、アミノ酸位置が、マウス２１−６免疫グロブリン重鎖可変領域フレーム
ワークの等しい位置に存在する同じアミノ酸によって占められることを除く）を
含む。

本発明の方法は、α４サブユニット保有インテグリンに対する抗体をコードす
る核酸配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列に
よってコードされるアンタゴニストを利用し得る。例えば、本発明のアンタゴニ
ストは、米国特許第５，８４０，２９９号の表６に見出されるような核酸配列ま
たはこのような１以上の配列の相補体のうちの１つ以上に対して、高ストリンジ
ェンシー条件下でその核酸がハイブリダイズするタンパク質であり得る。アンタ
ゴニストはまた、米国特許第５，９３２，２１４号において見出される配列番号
２または配列番号４をコードする核酸に対して、高ストリンジェンシー条件下で
その核酸がハイブリダイズするタンパク質であり得る。さらに、アンタゴニスト
はまた、細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１１７５によって産生される抗体の可変ド
メインをコードする核酸に対して、高ストリンジェンシー条件下でその核酸がハ
イブリダイズするタンパク質であり得る。

あるいは、本発明のアンタゴニストは米国特許第５，８４０，２９９号の表６
に見出されるような核酸配列またはこのような１以上の配列の相補体のうちの１
つ以上に対して、低ストリンジェンシー条件下でその核酸がハイブリダイズする
タンパク質であり得る。アンタゴニストはまた、米国特許第５，９３２，２１４
号において見出される配列番号２または配列番号４をコードする核酸に対して、
低ストリンジェンシー条件下でその核酸がハイブリダイズするタンパク質であり
得る。さらに、アンタゴニストはまた、細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１１７５に
よって産生される抗体の可変ドメインをコードする核酸に対して、低ストリンジ
ェンシー条件下でその核酸がハイブリダイズするタンパク質であり得る。

（Ｃ．フラグメントおよびアナログの産生）
単離されたα４インテグリンアンタゴニストのフラグメント（例えば、本明細
書中に記載される抗体ホモログのフラグメント）はまた、当業者に公知の方法を
使用して、組換え方法によってか、タンパク質分解性消化によってか、または化
学合成によって、効率的に産生され得る。組換え方法では、ポリペプチドの内部
または末端フラグメントは、単離されたハリネズミポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列の一端（末端フラグメントについて）または両端（内部フラグメントに
ついて）から１以上のヌクレオチドを除去することによって生成され得る。変異
誘発されたＤＮＡの発現が、ポリペプチドフラグメントを産生する。「末端をか
じる（ｅｎｄ ｎｉｂｂｌｉｎｇ）」エンドヌクレアーゼでの消化もまた、一連
のフラグメントをコードするＤＮＡを生成し得る。タンパク質のフラグメントを
コードするＤＮＡはまた、無作為剪断、制限消化、または両方の組み合わせによ
って生成され得る。タンパク質フラグメントは、インタクトなタンパク質から直
接的に生成され得る。ペプチドは、タンパク質分解酵素（プラスミン、トロンビ
ン、トリプシン、キモトリプシン、またはペプシンを含むが、これらに限定され
ない）によって、特異的に切断され得る。これらの酵素の各々は、攻撃するペプ
チド結合の型に対して特異的である。トリプシンは、ペプチド結合の加水分解を
触媒し、ここでカルボニル基は、塩基性アミノ酸（通常、アルギニンまたはリシ
ン）由来である。ペプシンおよびキモトリプシンは、芳香族アミノ酸（例えば、
トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニン）からのペプチド結合の加
水分解を触媒する。切断されたタンパク質フラグメントの代替的なセットは、タ
ンパク質分解酵素に対して感受性である部位での切断を避けることによって生成
され得る。例えば、弱塩基性溶液中におけるエチルトリフルオロ酢酸でのリシン
のε−アミノ酸基の反応は、ブロックされたアミノ酸残基を生じ、この隣接した
ペプチド結合は、もはやトリプシンによる加水分解に対して感受性ではない。タ
ンパク質は、タンパク質分解酵素に対して感受性であるペプチド結合を作製する
ように改変され得る。例えば、β−ハロエチルアミンでのシステイン残基のアル
キル化は、トリプシンによって加水分解されるペプチド結合を生じる（Ｌｉｎｄ
ｌｅｙ（１９５６）、Ｎａｔｕｒｅ １７８：６４７）。さらに、特定の残基で
ペプチド鎖を切断する化学試薬が使用され得る。例えば、臭化シアンは、メチオ
ニン残基でペプチドを切断する（ＧｒｏｓｓおよびＷｉｔｋｉｐ（１９６１）、
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８３、１５１０）。従って、変更因子、タンパク
質分解酵素、および／または化学試薬の種々の組み合わせでタンパク質を処理す
ることによって、タンパク質は、フラグメントの重複のない所望される長さのフ
ラグメントに分割され得るか、または所望される長さの重複フラグメントに分割
され得る。

フラグメントはまた、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相Ｆ ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ
化学のような、当該分野において公知の技術を使用して、化学合成され得る。Ｍ
ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３：４５１（１９６７）。

フラグメントおよびアナログの生成および試験を可能にする先行技術の方法の
例を、以下で考察する。これらまたは類似の方法を使用して、生物学的活性を有
すると示され得る、単離されたα４インテグリンアンタゴニストのフラグメント
およびアナログを作製およびスクリーニングし得る。インテグリンアンタゴニス
トを含むα４サブユニットのフラグメントおよびアナログが、生物学的活性を有
するか否かを試験するための例示的方法は、第ＩＶ節および実施例において見出
される。

（Ｄ．改変されたＤＮＡおよびペプチド配列の生成：無作為方法）
タンパク質のアミノ酸配列改変体は、タンパク質またはその特定の部分をコー
ドするＤＮＡの無作為変異誘発によって調製され得る。有用な方法としては、Ｐ
ＣＲ変異誘発および飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓ
ｉｓ）が挙げられる。無作為アミノ酸配列改変体のライブラリーはまた、縮重オ
リゴヌクレオチド配列のセットを合成することによって生成され得る。改変され
たＤＮＡおよびペプチドを用いて、所定のタンパク質のアミノ酸配列改変体を生
成する方法は、当該分野において周知である。このような方法の以下の例は、本
発明の範囲を限定することを意図されず、単に例示的技術を例証するために提供
される。当業者は、他の方法もまたこれに関して有用であることを認識する。

ＰＣＲ変異誘発：例えば、Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １
：１１−１５を参照のこと。

飽和変異誘発：１つの方法が、Ｍａｙｅｒｓら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２９、２４２に一般的に記載されている。

縮重オリゴヌクレオチド変異誘発：例えば、Ｈａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８
３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９、３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎ
．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３、３２３ならびにＩｔａｋｕｒａら、Ｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ．３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏ
ｓｉｕｍ ｏｎ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、第２７３〜２８９頁（Ａ．Ｇ
．Ｗａｌｔｏｎ編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８１を参照
のこと。

（Ｅ．改変されたＤＮＡおよびペプチド配列の生成：方向付けられた方法）
無作為ではない変異誘発（すなわち、方向付けられた変異誘発）は、単離され
たポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の特定の部分に特定の配列ま
たは変異を提供し、その単離されたポリペプチドの既知のアミノ酸配列の残基の
欠失、挿入、または置換を含む改変体を提供する。変異部位は、例えば、以下に
よって個々にまたは連続して改変され得る：（１）最初に、保存的アミノ酸で置
換し、次いで達成される結果に依存して、より過激な選択肢で置換する工程；（
２）標的残基を欠失させる工程；または（３）位置付けられた部位に隣接して同
一または異なるクラスの残基を挿入する工程、あるいは選択肢１〜３の組み合わ
せ。

明らかに、このような部位特異的方法は、Ｎ末端システイン（または機能的糖
化物）を、所定のポリペプチド配列中に導入して、疎水性部分についての付着部
位を提供し得る１つの方法である。

アラニン走査変異誘発：ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４、１０８１−１０８５を参照のこと。

オリゴヌクレオチド媒介性変異誘発：例えば、Ａｄｅｌｍａｎら（１９８３）
ＤＮＡ ２、１８３を参照のこと。

カセット変異誘発：Ｗｅｌｌｓら（１９８５）Ｇｅｎｅ ３４、３１５を参照
のこと。

コンビナトリアル変異誘発：例えば、Ｌａｄｎｅｒら、ＷＯ８８／０６６３０
を参照のこと。

ファージディスプレイストラテジー：例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：２６７ １６００７−１６０１０（１９９２）による概説
を参照のこと。

（Ｆ．インテグリンアンタゴニストの他の改変体）
改変体は、アミノ酸配列においてか、もしくは配列を含まない様式、またはそ
の両方において、本明細書中に記載された他のインテグリンアンタゴニストと異
なり得る。本発明の最も好ましいポリペプチドは、インビボまたはインビトロで
の化学的誘導体化（例えば、Ｎ末端の）、ならびにアセチル化、メチル化、リン
酸化、アミド化、カルボキシル化、またはグリコシル化における可能な変化を含
む、好ましい非配列改変を有する。

他のアナログとしては、１以上の保存的アミノ酸置換もしくは１以上の非保存
的アミノ酸置換によってか、または単離されたタンパク質の生物学的活性を破棄
しない欠失もしくは挿入によって、米国特許第５，８４０，２９９号または同第
５，８８８，５０７号；同第５，９３２，２１４号（すべて本明細書中で参考と
して援用される）またはＰＣＴ ＵＳ／９４／００２６６において見出される配
列と配列が異なるタンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。
保存的置換は、代表的に、以下の群内での置換のような、類似の特徴を有する別
のアミノ酸での１つのアミノ酸の置換を含む：バリン、アラニン、およびグリシ
ン；ロイシンおよびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパ
ラギンおよびグルタミン；セリンおよびスレオニン；リシンおよびアルギニン；
ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸としては、ア
ラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリ
プトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリ
シン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグル
タミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、
リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては
、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。他の保存的置換は、当業者
に容易に明らかである。例えば、アミノ酸アラニンについて、保存的置換は、Ｄ
アラニン、グリシン、β−アラニン、Ｌ−システインおよびＤ−システインから
取得され得る。リシンについて、置換は、Ｄ−リシン、アルギニン、Ｄ−アルギ
ニン、ホモ−アルギニン、メチオニン、Ｄ−メチオニン、オルニチンまたはＤ−
オルニチンのうちの任意のものであり得る。

本発明において使用される他のアナログは、ペプチド安定性を増大する改変を
有するアナログである。このようなアナログは、例えば、そのペプチド配列中に
１以上の非ペプチド結合（これは、ペプチド結合を置換する）を含み得る。天然
に存在するＬ−アミノ酸以外の残基（例えば、Ｄ−アミノ酸、あるいは天然に存
在しないアミノ酸または合成アミノ酸（例えば、βアミノ酸またはガンマアミノ
酸））を含むアナログ、および環状アナログもまた含まれる。単離されたヘッジ
ホッグポリペプチドへのＬ−アミノ酸に代わるＤ−アミノ酸の組み込みは、プロ
テアーゼに対するその耐性を増大し得る。例えば、米国特許第５，２１９，９９
０号（前出）を参照のこと。

好ましい抗体ホモログは、ＰＳ／２抗体のアミノ酸配列（実施例を参照のこと
）に対して少なくとも６０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％相
同なアミノ酸配列を含むか、または米国特許第５，８４０，２９９号（配列番号
１５−軽鎖可変領域または配列番号１７−重鎖可変領域）または米国特許第５，
９３２，２１４号（配列番号２または４）；および公開特許出願ＷＯ９４／１６
０９４（寄託された細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ１１１７５の抗ＶＬＡ４抗体に見い
出される配列）に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、８０％、
９０％、９５％、９８％または９９％相同なアミノ酸配列を含む。

（Ｇ．ポリマー結合体形態）
本発明の広範な範囲において、単一のポリマー分子が、α１インテグリンアン
タゴニストまたはα４インテグリンアンタゴニストとの結合体化に使用され得る
が、１より多いポリマー分子が同様に結合され得ることもまた意図される。本発
明の結合体化されたα４インテグリンアンタゴニスト組成物は、インビボおよび
非インビボでの両方の適用における有用性を見い出し得る。さらに、その結合体
化ポリマーは、その最終的な用途適用に適切なように、任意の他の基、部分また
は他の結合体種を利用し得ることも認識される。例として、ＵＶ分解耐性または
抗酸化、あるいは他の特性または特徴をポリマーに付与する官能性部分を、その
ポリマーに共有結合させることが、いくつかの適用において有用であり得る。さ
らなる例として、ポリマーを反応性にし、そしてそのポリマーを薬物分子に架橋
し得るようにポリマーを官能化し、結合体化された材料全体の種々の特性または
特徴を増強することが、いくつかの適用において有利であり得る。従って、ポリ
マーは、結合体化されたα４インテグリンアンタゴニスト組成物のその意図され
る目的に対する効力を排除しない、任意の官能性、反復基、連結または他の構成
構造を含み得る。本発明の他の目的および利点は、以後の開示および添付の特許
請求の範囲からより十分に明らかである。

これらの所望の特性を達成するために有用に使用され得る例示的ポリマーを、
本明細書以下の例示的反応スキームにおいて記載する。共有結合されたアンタゴ
ニスト／ポリマー結合体において、そのポリマーは官能化され得、次いで、その
アンタゴニストの遊離アミノ酸に結合され、易動性（ｌａｂｉｌｅ）の結合を形
成する。

α４サブユニットまたはα１サブユニットを含むインテグリンに対するアンタ
ゴニストは、そのポリマーの末端の反応基を介して最も好ましく結合体化される
が、結合体化はまた、非末端の反応基から分枝され得る。反応基を有するポリマ
ーは、本明細書中で「活性化されたポリマー」と称される。反応基は、アンタゴ
ニスト分子上の遊離アミノ基または他の反応基と選択的に反応する。活性化され
たポリマーは、結合が、任意の利用可能なα４インテグリンアンタゴニストアミ
ノ基（例えば、αアミノ基またはリジンのεアミノ基）で生じ得るように反応さ
れる。α４インテグリンアンタゴニストの、遊離カルボキシル基、適切に活性化
されたカルボニル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、酸化された炭水化物成分
およびメルカプト基もまた（利用可能である場合）、結合部位として使用され得
る。

ポリマーは、インテグリンアンタゴニスト分子のいかなる箇所でも結合され得
るが、インテグリンアンタゴニスト（特に、タンパク質であるアンタゴニスト）
へのポリマー結合に好ましい部位は、インテグリンアンタゴニストのＮ末端であ
る。第２の部位は、Ｃ末端またはＣ末端近辺であるか、糖部分（もしあれば）を
介する。従って、本発明は：（ｉ）α１インテグリンアンタゴニストおよびα４
インテグリンアンタゴニストのＮ末端結合型ポリマー結合体；（ｉｉ）α１イン
テグリンアンタゴニストおよびα４インテグリンアンタゴニストのＣ末端結合型
ポリマー結合体；（ｉｉｉ）糖結合型結合体；ならびに（ｉｖ）α１インテグリ
ンアンタゴニストおよびα４インテグリンアンタゴニストのＮ結合型、Ｃ結合型
および糖結合型のポリマー結合体を意図する。

アンタゴニスト濃度に依存して、一般に、１モルのアンタゴニストあたり約１
．０〜約１０モルの活性化ポリマーが使用される。最終的な量は、反応の程度を
最大化する一方で生成物の非特異的改変を最小化することと、それと同時に、最
適な活性を維持する化学物質を規定しながら、もし可能ならばそれと同時に、ア
ンタゴニストの半減期を最適化することとの間のバランスである。好ましくは、
アンタゴニストの少なくとも約５０％の生物学的活性が保持され、そして最も好
ましくは、１００％が保持される。

反応は、生物学的に活性な材料を不活性ポリマーと反応させるために使用され
る、任意の適切な当該分野で認識される方法によって生じ得る。一般に、このプ
ロセスは、活性化されたポリマー（これは、少なくとも１つの末端ヒドロキシル
基を有し得る）を調製し、その後、アンタゴニストを活性化されたポリマーと反
応させて、処方に適切な可溶性タンパク質を生成する工程を包含する。上記の改
変反応は、いくつかの方法によって実施され得、これらは、１以上の工程を含み
得る。

上述のように、本発明の特定の実施形態は、インテグリンアンタゴニストのＮ
末端をポリマーに対する連結部分（ｌｉｎｋａｇｅ）として利用する。適切な従
来の方法は、Ｎ末端改変型のα１インテグリンアンタゴニストまたはα４インテ
グリンアンタゴニストを選択的に得るために利用可能である。１つの方法は、還
元的アルキル化法によって例示され、これは、適切なインテグリンアンタゴニス
トに対する誘導体化に利用可能である、異なる型の一級アミノ基の示差的な反応
性（リジン上のεアミノ基 対 Ｎ末端メチオニン上のアミノ基）を使用する。
適切な選択条件下で、適切なインテグリンアンタゴニストの、そのＮ末端でのカ
ルボニル基含有ポリマーとの実質的に選択的な誘導体化が、達成され得る。この
反応は、インテグリンアンタゴニストのリジン残基のε−アミノ基とＮ末端残基
のα−アミノ基との間の、ｐＫａの差異を利用を可能にするｐＨで行われる。こ
の型の化学は、当業者に周知である。

ポリアルキレングリコールポリマー（例えば、ＰＥＧ）を、α１インテグリン
アンタゴニストまたはα４インテグリンアンタゴニスト（例えば、タンパク質と
して）のＣ末端へ標的化するためのストラテジーは、ポリマー成分を標的化する
ために使用され得る部位を、化学的に結合させるか、または遺伝子操作すること
である。例えば、タンパク質のＣ末端またはＣ末端近辺にある部位でのＣｙｓの
組み込みは、当該分野で認識されるマレイミド、ビニルスルホンまたはハロアセ
テートで活性されたポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）の誘導体を使
用する特異的改変を可能にする。これらの誘導体は、これらの試薬のＣｙｓに対
する高い選択性に起因して、この操作されたシステインの改変に特異的に使用さ
れ得る。標的化され得るヒスチジンタグ（Ｆａｎｃｙら、（１９９６）Ｃｈｅｍ
．＆ Ｂｉｏｌ．３：５５１）またはさらなるグリコシル化部位のタンパク質上
への組み込みのような他のストラテジーは、本発明のインテグリンアンタゴニス
トのＣ末端を改変するための他の代替法を表す。

化学改変の部位として糖を標的化するための方法もまた周知であり、従って、
ポリアルキレングリコールポリマーが、酸化を介して活性化されたインテグリン
アンタゴニスト上の糖（もしあれば）に、直接的および特異的に付加され得るよ
うである。例えば、アルデヒドおよびケトンとの縮合による、比較的安定なヒド
ラゾン結合を形成する、ポリエチレングリコール−ヒドラジドが生成され得る。
この特性は、酸化されたオリゴサッカリド連結を介するタンパク質の改変のため
に使用されている。Ａｎｄｒｅｓｚ，Ｈ．ら（１９７８）、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．
Ｃｈｅｍ．１７９：３０１を参照のこと。特に、亜硝酸塩でのＰＥＧ−カルボキ
シメチルヒドラジドの処理によって、アミノ基に対して反応性ｍｐ求電子的に活
性な基である、ＰＥＧ−カルボキシメチルアジドが生成される。この反応を使用
して、同様にポリアルキレングリコール改変タンパク質が調製され得る。米国特
許第４，１０１，３８０号および同第４，１７９，３３７号を参照のこと。

当業者は、タンパク質の架橋をさらに容易にし、多価のα１インテグリンアン
タゴニスト組成物またはα４インテグリンアンタゴニスト組成物を形成するため
に、当該分野で認識されるチオールリンカー媒介化学を使用し得る。特に、当業
者は、過ヨウ素酸ナトリウムを用いて、炭水化物部分上に反応性アルデヒドを生
じ得、このアルデヒドを介してシスタミン結合体を形成し、そしてシスタミン上
のチオール基を介する架橋を誘導する。Ｐｅｐｉｎｓｋｙ，Ｂ．ら、（１９９１
）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１８２４４−１８２４９およびＣｈｅｎ
，Ｌ．Ｌ．ら、（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１８２３７−
１８２４３を参照のこと。従って、この型の化学はまた、ポリアルキレングリコ
ールポリマーでの改変に適切であり、ここでは、リンカーが、糖に組み込まれ、
そしてポリアルキレングリコールポリマーが、このリンカーに結合される。アミ
ノチオールまたはヒドラジンを含有するリンカーは、単一のポリマー基の付加を
可能にするが、そのリンカーの構造は、複数のポリマーが付加されるように、そ
して／またはインテグリンアンタゴニストに対するポリマーの空間的な方向が変
化されるように、変更され得る。

本発明の実施において、Ｃ１〜Ｃ４アルキルのポリアルキレングリコール（好
ましくは、ポリエチレングリコール）のポリアルキレングリコール残基、または
このようなグリコールのポリ（オキシ）アルキレングリコール残基が、目的のポ
リマー系に有利に組み込まれる。従って、タンパク質が結合されるポリマーは、
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のホモポリマーであり得るか、またはポリオ
キシエチル化ポリオールであり、ただし、全ての場合において、ポリマーは、室
温で水に可溶である。このようなポリマーの非限定的な例として、ＰＥＧまたは
ポリプロピレングリコールのようなポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリ
オキシエチル化グリコール（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎａｔｅｄ ｇｌｙｃ
ｏｌｓ）、それらのコポリマーおよびそれらのブロックコポリマーが挙げられる
が、ただし、ブロックコポリマーの水溶性は維持される。ポリオキシエチル化ポ
リオールとしては、例えば、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシエチ
ル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコースなどが挙げられる。ポリオキ
シエチル化グリセロールのグリセロール骨格は、天然に存在する（例えば、動物
およびヒトにおいて）モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド中の
骨格と同じ骨格である。従って、これらの分枝は、必ずしも、体内で外因性因子
としてみなされない。

ポリアルキレンオキシドに対する代替物として、デキストラン、ポリビニルピ
ロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物ベースのポリ
マーなどが使用され得る。当業者は、前述の列挙が単に例示的であり、本明細書
中に記載される性質を有する全てのポリマー材料が意図されることを認識する。

ポリマーは、任意の特定の分子量を有する必要はないが、分子量は、約３００
と１００，０００との間、より好ましくは、１０，０００と４０，０００との間
であることが好ましい。特に、２０，０００以上のサイズが、腎臓における濾過
に起因する産物の損失を妨げるのに最良である。

ポリアルキレングリコール誘導体化は、以下のポリアルキレングリコール誘導
体の特性に関連して、本発明の実施におけるポリマー−インテグリンアンタゴニ
スト結合体の形成において多くの有利な特性を有する：水溶性の改善、それと同
時に、抗原性応答または免疫原性応答を誘発しないこと；高度の生体適合性；ポ
リアルキレングリコール誘導体のインビボ生分解性の非存在；および生存してい
る生物による排泄の容易性。

さらに、本発明の別の局面において、当業者は、結合体の特性として、切断可
能な共有結合性の化学結合を含む、ポリマー成分に共有結合したα１インテグリ
ンアンタゴニストまたはα４インテグリンアンタゴニストを利用し得る。これは
、ポリマーがインテグリンアンタゴニストから切断され得る時間経過の点におけ
る制御を可能にする。インテグリンアンタゴニストとポリマーとの間のこの共有
結合は、化学反応または酵素反応によって切断され得る。ポリマー−インテグリ
ンアンタゴニスト生成物物は、受容可能な量の活性を保持する。同時に、ポリエ
チレングリコールの部分が、この結合体化ポリマー中に存在して、このポリマー
−インテグリンアンタゴニスト結合体に高い水溶性および長期間の血液循環能力
を付与する。これらの改善された特性の結果として、本発明は、活性なポリマー
−α４インテグリンアンタゴニスト種の非経口送達、経鼻送達および経口送達、
ならびにインビボ適用における、加水分解切断後のインテグリンアンタゴニスト
自体のバイオアベイラビリティの両方を意図する。

本明細書中に記載される反応スキームは、例示目的のためのみで提供され、そ
してα１インテグリンアンタゴニストまたはα４インテグリンアンタゴニストの
改変（例えば、溶解性、安定性、ならびに非経口投与および経口投与のための細
胞膜親和性を達成するため）に利用され得る反応および構造を制限しないことが
理解されるべきである。これらのインテグリンアンタゴニスト結合体の活性およ
び安定性は、異なる分子サイズのポリマーを使用することによって、いくつかの
方法で変更され得る。結合体の溶解性は、ポリマー組成物中に組み込まれるポリ
エチレングリコールフラグメントの割合およびサイズを変更することによって、
変更され得る。

（ＩＩＩ．有用性）
キャリア材料と組み合わせて単回投薬形態を生じ得る活性成分の量は、処置さ
れる被験体、および特定の投与形態に依存して変化する。しかし、任意の特定の
被験体についての特定の投薬および処置レジメンは、使用される特定の化合物の
活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食餌、投与時間、排泄速度、薬物
の組み合わせ、ならびに処置する主治医の判断および処置される特定の疾患の重
篤度を含む、種々の因子に依存する。活性成分の量はまた、その成分と同時に投
与される治療薬剤または予防薬剤（もしあれば）に依存する。

本発明に従う処置の方法は、本発明の有効量のアンタゴニストを被験体に投与
する工程を包含する。本発明の方法における用量は、有効な非毒性の量である。
慣用的な臨床試験を用いる当業者は、処置される特定の疾患について最適な用量
を決定し得る。

（薬学的調製物）
本発明の方法において、本発明のアンタゴニストは、非経口的に投与され得る
。本明細書中で使用される場合、用語「非経口的」は、皮下、静脈内、筋内、関
節内、滑膜内（ｉｎｔｒａ−ｓｙｎｏｖｉａｌ）、胸骨内、髄腔内（ｉｎｔｒａ
ｔｈｅｃａｌ）、肝臓内、病変内および頭蓋内の注射または注入技術を含む。所
望の用量は、１日１回以上、静脈内に、経口的に、直腸内に、非経口的に、鼻内
に、局所的に、または吸入によって被験体に投与される。所望の用量はまた、連
続的な静脈内注入によっても与えられる。

抗体ホモログは、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアを含む滅菌薬学的
組成物として投与され、このキャリアは、多くの周知のキャリア（例えば、水、
生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノ
ールなど、またはそれらの組み合わせ）の１つであり得る。本発明の化合物は、
無機酸および無機塩基または有機酸および有機塩基から誘導された、薬学的に受
容可能な塩の形態で使用され得る。このような酸性塩には、とりわけ、以下が含
まれる：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩
、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳塩（ｃａｍｐｈ
ｏｒａｔｅ）、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸、ジグルコン酸
、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グ
リセロリン酸塩、亜硫酸塩（ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅ）、ヘプタン酸塩、ヘキサ
ン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホ
ン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン
酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモエート、ペクチン酸塩（ｐｅｃｔｉｎａ
ｔｅ）、過硫酸塩、３−フェニル−プロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバレート
、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレート（ｔｏ
ｓｙｌａｔｅ）およびウンデカン酸塩。塩基性塩としては、アンモニウム塩、ア
ルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩およびカリウム塩）、アルカリ土類金属塩
（例えば、カルシウム塩およびマグネシウム塩）、有機塩基との塩（例えば、ジ
シクロヘキシルアミン塩）、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシ
メチル）メチルアミン、ならびにアミノ酸（例えば、アルギニン、リジン）との
塩、などが含まれる。また、塩基性の窒素含有基は、低級アルキルハライド（例
えば、塩化メチル、塩化エチル、塩化プロピルおよび塩化ブチル、臭化メチル、
臭化エチル、臭化プロピルおよび臭化ブチル、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨ
ウ化プロピルおよびヨウ化ブチル）；ジアルキル硫酸塩（例えば、硫酸ジメチル
、硫酸ジエチル、硫酸ジブチルおよび硫酸ジアミル）、長鎖ハライド（例えば、
塩化デシル、塩化ラウリル、塩化ミリスチルおよび塩化ステアリル、臭化デシル
、臭化ラウリル、臭化ミリスチルおよび臭化ステアリル、ヨウ化デシル、ヨウ化
ラウリル、ヨウ化ミリスチルおよびヨウ化ステアリル）、アラルキルハライド（
例えば、ベンジルブロミドおよびフェニルブロミド）などの薬剤で、４級化（ｑ
ｕａｔｅｒｎｉｚｅ）され得る。これによって、水または油に溶解性または分散
性の生成物が得られる。

本発明の薬学的組成物は、本発明の任意の化合物またはその薬学的に受容可能
な塩を、任意の薬学的に受容可能なキャリアと一緒に含む。本明細書中で使用さ
れる場合、用語「キャリア」は、受容可能なアジュバントおよびビヒクルを含む
。本発明の薬学的組成物に使用され得る、薬学的に受容可能なキャリアとしては
、イオン交換体、アルミナ、アルミニウムデンプン、レシチン、血清タンパク質
（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、リン酸塩）、グリシン、
ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水
、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン）、リン酸水素二ナトリウム、リン
酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネ
シウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコ
ール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸、蝋、ポリエチ
レン−ポリオキシプロピレン−ブロックコポリマー、ポリエチレングリコールお
よび羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に従って、薬学的組成物は、滅菌注射用調製物（例えば、滅菌した注射
用の水性または油性の懸濁液）の形態にあり得る。この懸濁液は、適切な分散剤
または湿潤剤、および懸濁剤を使用して、当該分野で公知の技術に従って処方さ
れ得る。滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な賦形剤または
溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶
液）であり得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒は、とりわけ、水
、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌した不揮
発性油が、溶媒または懸濁媒体として慣用的に使用される。本目的のために、合
成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無菌性の不揮発性油が使
用され得る。脂肪酸（例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体）が、特
にポリオキシエチル化形態の、天然の薬学的に受容可能な油（例えば、オリーブ
油またはヒマシ油）のように、注射用調製物において有用である。

本発明の薬学的組成物は、経口的に与えられ得る。経口的に与えられる場合、
これらは、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液または液剤を含むが、これらに限定さ
れない任意の経口的に受容可能な投薬形態で投与され得る。経口的使用のための
錠剤の場合において、通常使用されるキャリアとしては、ラクトースおよびコー
ンスターチが挙げられる。潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）もまた
、代表的に添加される。カプセル形態での経口投与のために、有用な賦形剤とし
ては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁剤が、経口
使用に必要とされる場合、活性薬剤は、乳化剤および懸濁剤と組み合わせられる
。所望の場合、特定の甘味剤、矯味矯臭剤または着色剤もまた、使用され得る。

本発明の方法における使用のための特定の組成物は、アゴニストが、ビヒクル
中に処方されている組成物（例えば、リポソーム含有組成物）である。リポソー
ムは、両親媒性分子（例えば、極性脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホス
ファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセリン）、スフィンゴミエリ
ン、カルジオリピン、プラスマロゲン、ホスファチジン酸およびセレブロシド）
によって形成されるビヒクルである。適切な両親媒性分子を、水または水溶液中
で膨張させて、水性材料によって互いに離された多くの二重層から構成される多
層構造の液晶（粗リポソームとも呼ばれる）が形成される場合に、リポソームが
形成される。水性材料をカプセル化する単一の二重層からなることが公知の、別
の型のリポソームは、単層ビヒクルと称される。水溶性材料は、脂質の膨張中に
水相に含まれている場合、これらは、脂質二重層の間の水層に捕捉される。

本発明のアンタゴニストのリポソーム処方形態を調製するための特に簡便な方
法は、ＥＰ−Ａ−２５３，６１９（これは、本明細書中に参考として援用される
）に記載される方法である。この方法において、カプセル化された活性成分を含
む単一二重層リポソームは、脂質成分を有機媒体中に分散させ、この脂質成分の
有機溶液を圧力下で水性成分に注入しながら、同時に、高速ホモジナイザーまた
は混合手段によってこの有機成分および水性成分を混合し、ここで、リポソーム
が自然に形成されることによって、調製される。カプセル化された活性成分を含
むこの単一二重層リポソームは、直接的に使用され得るか、またはそれらは、局
所投与のための適切な薬学的に受容可能なキャリア中で使用され得る。リポソー
ムの粘性は、１以上の適切な濃化剤（例えば、キサンタンガム、ヒドロキシプロ
ピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびそれらの混合物）
の添加によって増加され得る。水性成分は、水単独からなり得るか、または電解
質、緩衝系および他の成分（例えば、保存剤）を含み得る。使用され得る適切な
電解質としては、アルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩のような金属塩が上
げられる。好ましい金属塩は、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、および塩化カ
リウムである。電解質の濃度は、０〜２６０ｍＭ、好ましくは、５ｍＭ〜１６０
ｍＭで変化し得る。水性成分は、適切な容器中に配置され、この容器は、有機成
分の注入の間に、大きい渦流を生じることによってホモジナイゼーションを生じ
るように適応され得る。この２つの成分のホモジナイゼーションは、この容器内
で達成され得るか、あるいは、水性成分および有機成分を、容器外の混合手段に
別々に注入し得る。後者の場合、リポソームは、この混合手段中で形成され、次
いで、収集目的のための別の容器に移される。

有機成分は、適切な非毒性の薬学的に受容可能な溶媒（例えば、エタノール、
グリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのような）
、およびその溶媒中に可溶性の適切なリン脂質からなる。使用され得る適切なリ
ン脂質としては、例えば、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセ
リン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リソホ
スファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールが挙げられる。他の親油
性添加剤が、リポソームの特性を選択的に改変するために使用され得る。このよ
うな他の添加剤の例としては、ステアリルアミン、ホスファチジン酸、トコフェ
ロール、コレステロールおよびラノリン抽出物が挙げられる。

さらに、リン脂質の酸化を防止し得る他の添加剤が、有機成分に添加され得る
。このような他の成分の例としては、トコフェロール、ブチルヒドロキシアニソ
ール、ブチルヒドロキシトルエン、アスコルビン酸パルミテートおよびアスコル
ビン酸オレートが挙げられる。安息香酸、メチルパラベンおよびプロピルパラベ
ンのような保存剤もまた、添加され得る。

上記の組成物とは別に、適切な量の抗ＶＬＡ抗体治療剤を含む、例えば、プラ
スター、バンテージ、包帯、ガーゼパッドなどのカバーが使用され得る。いくつ
かの場合において、治療剤処方物を含む局所的処方物が含浸された、プラスター
、バンテージ、包帯、ガーゼパッドなどが使用され得る。

本発明の薬学的組成物はまた、噴霧器、乾燥粉末吸入器または定容量吸入器（
ｍｅｔｅｒｅｄ ｄｏｅｓ ｉｎｈａｌｅｒ）の使用を介する、経鼻エアロゾル
または吸入によっても投与され得る。このような組成物は、薬学的処方物の分野
で周知の技術に従って調製され、そしてベンジルアルコールまたは他の適切な保
存剤、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン
、および／あるいは従来の可溶化剤または分散剤を使用して、生理食塩水中の溶
液として調製され得る。

別の実施形態に従って、本発明の化合物を含む組成物はまた、コルチコステロ
イド、抗炎症剤、免疫抑制剤、代謝拮抗物質、および免疫調節物質からなる群よ
り選択される、さらなる薬剤を含み得る。これらのクラスの各々における特定の
化合物は、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ」（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，９
７０−９８６頁（１９９０）（これらの開示は、本明細書中で参考として援用さ
れる））における適切な群の見出しに列挙される化合物のいずれかから選択され
得る。テオフィリン、サルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）および
アミノサリチレート（抗炎症剤）；シクロスポリン、ＦＫ−５０６、およびラパ
マイシン（免疫抑制剤）；シクロホスファミドおよびメトトレキサート（代謝拮
抗物質）；ステロイド（吸入、経口、または局所）ならびにインターフェロン（
免疫調節剤）のような化合物もまた、この群に含まれる。

所望の効果を産み出すのに効果的な本発明の化合物の投薬および用量率は、種
々の因子（例えば、アンタゴニストの性質、被験体の大きさ、処置の目的、処置
されるべき病理の性質、使用される特定の薬学的組成物、および処置する医者の
診断）に依存する。

１日あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重と約１００ｍｇ／ｋｇ体重との間の活
性成分化合物の用量レベル、好ましくは、１日あたり約０．１ｍｇ／ｋｇ体重と
約５０ｍｇ／ｋｇ体重との間の活性成分化合物の用量レベルが有用である。最も
好ましくは、ＶＬＡ−４結合因子（抗体または抗体誘導体の場合）が、約０．１
ｍｇ／ｋｇ体重／日と約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日との間の範囲、好ましくは、約
０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日と約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日との間の範囲の用量で、
かつ１〜１４日間の間隔で投与される。非抗体結合因子または低分子結合因子に
関して、用量範囲は、好ましくは、モル等量からこれらの量の抗体の間でなけれ
ばならない。好ましくは、抗体組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌの抗体の原形
質レベルを提供するのに効果的な量で投与される。投薬の最適化は、結合因子の
投与、その後のインビボで所定の用量で投与された後、時間の経過によりこの因
子によるインテグリン陽性細胞の被覆を評価することによって決定される。

投与された因子の存在は、個々の細胞が、それ自体が（例えば、蛍光色素によ
って）標識されている同一の因子を結合することが不能であるか、またはそれの
減少された能力によってインビトロ（またはエキソビボ）において検出され得る
。好ましい投薬は、大部分のインテグリン陽性細胞の検出可能な被覆を産生する
べきである。好ましくは、被覆は、抗体相同体の場合、１〜１４日間持続される
。

当業者は、本発明のアンタゴニストが、意図する効果を有する場合、容易に試
験し得る。臨床的な回復のための標準的な試験（例えば、抗体結合のための洗浄
およびＦＡＣＳスキャン；努力肺活量における改善）は、当業者によって用いら
れ、効力を決定する。例えば、個々の肺組織のサンプルに含まれる細胞は、投与
された因子を検出するための第２の因子を用いてインビトロ（またはエキソビボ
）でこの因子の存在について調査される。例えば、これは、投与された因子に特
異的な蛍光色素で標識された抗体であり得、投与された因子は、次いで標準的な
ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離装置）分析によって測定される。あるいは、投与さ
れた因子の存在は、個々の細胞が、それ自体が（例えば、蛍光色素によって）標
識されている、同一の因子を結合することが不能であるか、またはそれの減少さ
れた能力によってインビトロ（またはエキソビボ）で検出される。好ましい投薬
は、大部分のインテグリン陽性細胞の検出可能な被覆を産生するべきである。好
ましくは、被覆は、抗体相同体の場合、１〜１４日間持続される。

以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、そして本発明を限定する
ように解釈されるべきではない。

（実施例１：肺線維症動物モデル）
多数の証拠は、広く使用されているブレビオマイシン（ＢＬ）げっ歯類モデル
において肺繊維症における炎症性細胞およびメディエーターの関与を記録してい
る。このモデルは、多数のヒトの疾患の要素を有する繊維症の特徴的な事実を示
し、そしてＢＬ誘導肺繊維症をヒト化学療法における副作用を十分に理解するの
で、魅力的である。げっ歯類におけるＢＬの気管内（ＩＴ）点滴注入は、繊維発
生の機構を研究するため、および潜在的に所望される抗繊維症化合物をスクリー
ニングするために広く用いられる。ＢＬ誘導肺毒性の最初の原因が、それが鉄お
よびＤＮＡに結合するとすぐに活性酸素種（ＲＯＳ）の生成に帰するが、肺繊維
症の最終的な徴候を導く過程は、種々の炎症性メディエーターの放出に関与する
（ＧｉｒｉおよびＷａｎｇ，Ｃｏｍｍｅｎｔｓ Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３：１４５
−１７６（１９８９））。ＢＬ誘導肺傷害の病因を、水腫、出血、および好中球
およびマクロファージによって優位にされる細胞浸潤によって最初に誘導する。
肺の脈管の空間、肺の間質性の空間、および肺胞の空間における炎症性白血球の
過剰蓄積は、ＲＯＳおよびタンパク質分解酵素の生成による小脈管傷害および実
質傷害を負わせ得る。好中球は、実質的な量のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ
）を含み、ＭＰＯは、Ｈ２０２との反応においてＣｌから次亜塩素酸（ＨＯＣＩ
）に酸化し得、そして好中球誘導ＨＯＣｌは、細胞毒性の原因として公知である
。マクロファージ誘導ＲＯＳおよび好中球誘導ＲＯＳは、強化された繊維増殖性
応答を媒介する、炎症前（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインおよ
び繊維形成誘導性サイトカインの産生を刺激し得る（ＰｈａｎおよびＫｕｎｋｅ
ｌ，Ｅｘｐ．Ｌｕｎｇ Ｒｅｓ，１８：２９−４３（１９９２））。大きな炎症
性細胞浸潤の近くで、線維芽細胞過程は、活性化線維芽細胞の過増殖性応答によ
ってさらに特徴付けられる。線維芽細胞様細胞は、肺コラーゲン含量における決
定的な上昇、およびコラーゲン型の超微細な外観および空間的な配置における異
常性の主な原因である。

（実施例２：繊維症の、α４サブユニット保有インテグリンに対するアンタゴ
ニストでの阻害）
（材料および方法）
非特異的コントロール抗体（１Ｅ６）およびα４サブユニット保有インテグリ
ン（ＰＳ２）に対する抗体を用いた。１Ｅ６は、マウス抗ヒトＬＦＡ３（ドメイ
ン１）ＩｇＧ１モノクロナール抗体である。Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｏｃｈｍａｎ，Ｍ
ｅｉｅｒ，Ｔｉｚａｒｄ，Ｂｉｘｌｅｒ，ＲｏｓａおよびＷａｌｌｎｅｒ（１９
９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２１１−２２２を参照のこと。ＰＳ／２を
、Ｍｉｙａｋｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３：５９９−６０７（１９９１
）の方法によって産生する。

体重が２５〜３０ｇである慢性呼吸病でないオスのＣ５７ＢＬ／６マウスを、
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。ブレビオマ
イシンサルフェート（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅとして登録商標である）を、Ｂｒｉｓ
ｔｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｙｒａｃｕｓｅ，ＮＹ）から譲り受けた
。プロリルヒドロキシラーゼのプロコラーゲン基質を標識するためのＬ−［３，
４−３Ｈ］プロリンを、ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から得た。Ｚ−ｆｉｘ（水溶性緩衝化亜鉛ホルマリン）
を、Ａｎａｔｅｃｈ，ＬＴＤ（Ｂａｔｔｌｅ Ｃｒｅｅｋ，ＭＩ）から入手した
。全てのその他の試薬は、試薬等級または高純度のものであり、そして標準的な
供給源から得た。

（動物の処置）
マウスを、ケージあたり４匹ずつ飼育し、そしてＡｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒ
ｅのためのＮＩＨの説明書に従って世話をした。このマウスを、全ての処置の前
に１週間その設備において順応させた。１２ｈ／１２ｈの明／暗サイクルを維持
し、そして任意に水およびＲｏｄｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｈｏｗを利
用した。動物を、４つの実験群に無作為に分けた：１）ＳＡ＋ＳＡ；２）ＢＬ＋
ＩＥ６；３）ＢＬ＋ＳＡ；および４）ＢＬ＋ＰＳ２。マウスを、キサラジンおよ
び塩酸ケタミン知覚運動麻痺の下で生理食塩水または０．０８ユニット／１００
μｌ／マウスのＢＬの単一用量を用いて気管内（ＩＴ）注射した。ＩＴ点滴注入
後、このマウスは、１週間に３回ＩＥ６、ＳＡまたはＰＳ２（０．２ｍｌ／マウ
ス中１００μｇ）のＩＰ注射を受けた。ＢＬ点滴注入から２１日目に、マウスを
、気管支肺胞の洗浄液体（ＢＡＬＦ）分析、生化学的分析、および組織病理学的
分析のためにペントバルビタール知覚運動麻痺の下で屠殺した。

（ＢＡＬＦおよび肺組織の調製）
知覚運動麻酔の後、腹腔を開き、続いて下行腹大動脈の採血を行った。この肺
を、シリンジに装着したブラント（ｂｌｕｎｔ）針を用いて気管をカニューレ挿
入することによって洗浄のために調整した。洗浄を、１ｍｌアリコートで渡され
る冷等張生理食塩水の３ｍｌを用いて実行した。ＢＡＬＦのアリコートを、細胞
総数について分けた。残りのＢＡＬＦを、１５００ｇで２０分間４℃で遠心分離
し、得られた上清を、アリコートにし、次いで−７０℃で保存した。ＢＡＬＦの
後、肺葉を、非実質組織を離れてすぐに解剖し、液体窒素で急速凍結し、そして
−７０℃で保存した。

後ほど、凍結した肺を融解し、そしてＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（Ｂｒ
ｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ
）を用いて０．１Ｍ ＫＣｌ、０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）中でホモジ
ナイズした。このホモジネートを、繰り返し転倒によって完全に混合し、そして
最終的なホモジネート容量（４〜５ｍｌ）を記録した。このホモジネートを、い
くつかのアリコートに分け、そして生化学的測定のために−７０℃で保存した。

（肺マロンジアルデヒド当量およびヒドロキシプロリン含量の決定）
肺マロンジアルデヒド当量を、Ｏｈｋａｗａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
，９５：３５１（１９７９）の方法によって分別していないホモジネート中の全
量のチオバルビツール酸反応産物から推定した。肺ヒドロキシプロリンアッセイ
に関しては、１ｍｌのホモジネートを、０．２５ｍｌ氷冷５０％（ｗ／ｖ）トリ
クロロ酢酸を用いて沈殿し、遠心分離し、そしてこの沈殿物を、２ｍｌの６Ｎ
ＨＣｌ中で１８時間１１０℃で加水分解した。ヒドロキシプロリン含量を、Ｗｏ
ｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，９３
：４４０（１９６１）によって記載された技術によって測定した。

（プロリルヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１１．２）活性の決定）
プロリルヒドロキシラーゼ基質（プロコラーゲン）の調製およびプロリルヒド
ロキシラーゼアッセイの方法は、Ｇｉｒｉ，Ｓ．Ｎ．ら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｐａ
ｔｈｏｌ．３９：３１７（１９８３）に記載される。簡潔には、１０日齢ニワト
リ胚から単離された新鮮な脛骨を、無プロリン培地において３７℃で、６時間［
３Ｈ］−プロリンを用いて標識した。洗浄によって非取り込み標識を除去した後
、この組織をホモジナイズし、そして３０００ｇで２０分間４℃で遠心分離した
。得られた上清を、大規模に透析し、非取り込み標識を除去した。標識したプロ
コラーゲン基質をアリコートにし、そして−７０℃で保存した。全量２ｍｌの酵
素アッセイのためのインキュベーション混合物は、硫酸鉄（ＩＩ）アンモニウム
（０．１ｍｍｏｌ／ｌ）、α−ケトグルタル酸（０．１ｍｍｏｌ／ｌ）、［３Ｈ
］プロリンプロコラーゲン（２００，００ｄｐｍ）、肺ホモジネート（０．２ｍ
ｌ）、アスコルビン酸（０．５ｍｍｏｌ／ｌ）、およびＴＲＩＳ塩酸緩衝液（０
．１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．８）からなる。この反応を、Ｄｕｂｎｏｆｆ代謝振盪
機において３０分間３７℃で振盪した後、０．２ｍｌの５０％トリクロロ酢酸を
添加した。反応の間、トリチウム化した水を、プロリルヒドロキシル化に対する
化学量論比において放出し、そしてこれを酵素活性の測定として用いる。この反
応系のトリチウム化した水を、反応混合物全体の減圧蒸留によって分離し、そし
て放射能を計測した。この酵素活性を、３０分あたりの全肺あたりの放出された
トリチウム化された水のｄｐｍとして示した。

（ＢＡＬＦにおける細胞数の決定）
ＢＡＬＦにおける細胞総数を、Ｗａｎｇ，Ｑ．ら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，
６７：２３４−２４２（１９９２）において記載されるように決定した。このＢ
ＡＬＦにおける全白血球数を、使用者の説明書に従いＣｏｕｌｔｅｒ ｃｏｕｎ
ｔｅｒ（Ｍｏｄｅｌ Ｆ，Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．
，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）によって推定した。

（ＢＡＬＦタンパク質アッセイ）
ＢＡＬＦ上清におけるタンパク質含量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を用
いて決定し、そしてウシ血清アルブミンを標準として用いた。

（組織病理学分析および免疫組織化学的分析）
各々の処理群由来の３〜４匹の動物を、この実験の最後に組織病理学的評価お
よび免疫組織化学的評価のために無作為に選択した。この動物の腹腔を開き、そ
の後、下行腹大動脈の採血を行った。その後すぐに、この肺組織を、上記のＷａ
ｎｇらに記載のように組織学的分析のために調製した。ブラント針を用いて気管
をカニューレ挿入した後、胸腔を開き、次い心臓および肺の両方を、まとめて取
り出した。この肺を、３０ｃｍの水の圧力で気管を介してＺ−ｆｉｘ溶液を用い
て固定した。右上葉および尾部葉ならびに左葉を、後でパラフィンにおいてブロ
ックし、包み込み、７μｍ切片に切断し、そしてヘマトキシリンおよびエオシン
を用いて染色した。αＳＭＡの免疫組織化学的染色のために、この肺組織切片の
パラフィンを外し、そして内因性のペルオキシダーゼをブロックした。次いで、
染色されるべき切片を、ブロッキングヤギ血清で３０分間処理し、そして１次モ
ノクロナール抗αＳＭＡ抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて１６時間インキュベートした。

（データの統計学的分析）
動物データを、全肺毎に基づいて表し、そして平均±標準誤差（ＳＥ）として
報告した。データを二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏ
ｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）（ＳＩＧＭＡＳＴＡＴ）およびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗ
ｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法を用いて４群内で比較した。Ｐ≦０．０５の値を有意とみ
なした。

（結果）
（マウス肺における脂質過酸物化）
脂質過酸化物化の指数としての肺マロンジアルデヒド当量を種々の群のマウス
でアッセイした。ＢＬ点滴注入は、ＳＡ＋ＳＡ群およびＢＬ＋ＰＳ２群と比較し
て、ＢＬ＋ＩＥ６群およびＢＬ＋ＳＡ群の両方でマウス肺におけるマロンジアル
デヒド当量を有意に増大させた（データは示さず）。ＰＳ２での処置は、ＢＬ誘
導肺脂質過酸化物化を有効にブロックした。なぜなら、ＢＬ＋ＰＳ２群における
肺マロンジアルデヒドに等しいレベルは、ＳＡ＋ＳＡ群のレベルと異ならないか
らである。

（マウス肺における肺ヒドロキシプロリン含有量）
肺ヒドロキシプロリン（肺コラーゲンレベルの重要な指数）を、４群のマウス
について決定した。ＢＬのＩＴ点滴注入は、ＢＬ＋ＩＥ６群およびＢＬ＋ＳＡ群
において肺ヒドロキシプロリンレベルを、それぞれＳＡ＋ＳＡコントロール群の
１８５％および２０５％に有意に上昇させた。ＢＬ＋ＰＳ２群における肺ヒドロ
キシプロリンレベルのＢＬ誘導増加は、ＢＬ＋ＳＡ群と比較して、ＰＳ２での処
置により３５％まで有意に低減した。ＢＬ＋ＴＲ群における肺ヒドロキシプロリ
ンレベルは、ＩＴ ＳＡコントロール（ＳＡ＋ＳＡ）群のレベルより有意には高
くなかった。

（マウス肺におけるプロリルヒドロキシラーゼ活性）
種々の群の肺におけるプロリルヒドロキシラーゼ活性は、ＢＬ単独により、Ｂ
Ｌ＋ＳＡ群における肺ヒドロキシラーゼ活性がＳＡ＋ＳＡコントロール群の２０
７％に有意に増大したことを示した。ＰＳ２は、ＢＬ＋ＳＡ群においてＢＬ処置
により上昇したプロリルヒドロキシラーゼ活性を有意に低下させた。

（マウス肺における総ＢＡＬＦ細胞含有量）
生理食塩水またはＢＬをＩＴ点滴注入して２１日後の種々の群のＢＡＬＦにお
ける総細胞数は、生理食塩水コントロール群（ＳＡ＋ＳＡ）と比較して、ＢＬ＋
ＩＥ６群およびＢＬ＋ＳＡ群由来のＢＡＬＦにおける総細胞数がＢＬ処置により
増大したが、ＢＬ＋ＩＥ６群のみがＳＡ＋ＳＡ群より有意に高いレベルを有した
ことを示した。ＢＬ＋ＰＳ２群におけるＢＡＬＦ細胞数は、ＳＡ＋ＳＡ群の細胞
数と異ならなかった。

（ＢＡＬＦにおけるタンパク質含有量）
４実験群についてのＢＡＬＦ上清のタンパク質含有量は、ＢＬのＩＴ点滴注入
により、ＳＡ＋ＳＡ群と比較して、ＢＬ処置群全てのＢＡＬＦタンパク質が有意
に増大することを明らかにした。しかし、ＢＬ＋ＰＳ２群におけるＰＳ２での処
置により、ＢＡＬＦ上清タンパク質におけるＢＬ誘導増加が減少したが、差異は
統計的に有意ではなかった。

（マウス肺の組織病理学）
マウス肺の組織学的試験により、ＳＡ＋ＳＡ群における正常肺実質組織が明ら
かになった。しかし、ＢＬ＋ＩＥ６群およびＢＬ＋ＳＡ群由来の肺は、細胞外線
維の蓄積を含む斑状肺胞炎（ｐａｔｃｈｙ ａｌｖｅｏｌｉｔｉｓ）および多病
巣性間質線維症（ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｆｉｂｒ
ｏｓｉｓ）を示した。これらの群におけるマウスの肺は、肥厚化した肺胞間隔壁
および隣接する気腔における炎症性細胞を有した。ＢＬ＋ＩＥ６群およびＢＬ＋
ＳＡ群と比較すると、ＢＬ＋ＰＳ２群由来の肺は、はるかに少ない線維症性病巣
を有したが、いくつかの葉は、軽度の実質性線維症をなお示した。

（マウス肺におけるαＳＭＡについての免疫組織化学的染色）
ＢＬ処置後にマウスにおける線維芽細胞および線維芽細胞様細胞の蓄積を決定
するために、本発明者らは、ＸＳＭＡに対するモノクローナル抗体を使用して、
肺組織におけるＸＳＭＡの発現を試験した。コントロール群において、血管およ
び気管支平滑筋層に免疫陽性が生じた。ＢＬおよびコントロール抗体または生理
食塩水で処置した肺において、線維症性領域内に広範囲かつ強い免疫染色があっ
た（間隙よび胸膜両方において）。しかし、ＢＬおよびＰＳ２処置肺は、ＢＬ＋
ＩＥ６群およびＢＬ＋ＳＡ群と比較して、αＳＭＡのはるかに減少した免疫染色
を示した。

（考察）
ＩＰＦは、害の大きな疾患であり現在の治療に対してはあまり応答しない。本
研究において、本発明者らは、α４サブユニット保有インテグリンがＩＰＦを管
理する際に他のあり得る標的であるという証拠を提供する。一般に、肺の白血球
は、ＲＯＳ、線維発生サイトカインおよび増殖因子の分泌により肺線維症の進展
に関与すると仮定されている。白血球の輸送および活性化状態は、インテグリン
のような種々の表面タンパク質により調節される。細胞間相互作用ならびに細胞
−ＥＣＭ相互作用が肺線維症の病理に重要であることは明らかである。活動性肺
線維症を有する患者および線維症性肺疾患の動物モデルにおける一致した知見は
、線維症を受けた領域における免疫細胞および炎症性細胞の増大した数の蓄積で
ある。

ＶＬＡ−４は、全ての循環している白血球で発現され、そして血管細胞接着分
子（ＶＣＡＭ−１）（サイトカイン活性化内皮細胞上に発現されるＩｇ遺伝子ス
ーパーファミリーのメンバーである）に結合し、そしてマトリックスタンパク質
であるフィブロネクチンに結合する。α４β７は、Ｔ細胞およびＢ細胞、ナチュ
ラルキラー細胞ならびに好酸球のサブセット上で発現される。α４β７は、粘膜
血管アドレシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）（ＭＡｄＣＡＭ−１）（接着分子のＩｇ
およびムチン様ファミリーのメンバー）ならびにＶＣＡＭ−１およびフィブロネ
クチンに結合する。インビトロでの研究により、ＶＣＡＭ−１とのＶＬＡ−４相
互作用が、内皮細胞への単核白血球および好酸球接着および内皮細胞を通過する
移動に関与することが決定され、そしてα４β７は、腸関連リンパ組織に対する
白血球漸増に主に関与すると考えられている。

本研究において、ＰＳ２での処置が、ＢＡＬＦにおける総白血球のＢＬ誘導増
加を減少させた。ＢＬ＋ＰＳ２マウスの肺において減少した白血球は、ＢＬ処置
動物の肺における炎症性傷害および線維症の減少の原因であり得る。ＢＬ誘導肺
傷害は、肺脂質過酸化物化を測定することにより示されるように、ＰＳ２の処置
により有意に減少した。肺における増加したコラーゲンは、間質および肺胞腔自
体における線維芽細胞の増大した数と関連している。これらの線維芽細胞様細胞
の多くは、筋線維芽細胞である。筋線維芽細胞は、αＳＭＡ（平滑筋細胞に共通
して見出され、そして線維発生および創傷治癒において重要であると考えられる
収縮性タンパク質）の発現を含む、特徴的な表現型を有する。本研究の重要な発
見は、ＰＳ２処置がＢＬ誘導筋線維芽細胞増殖を弱めたことである。任意の特定
の理論に拘束されることを望まないが、αインテグリンに対する抗体を用いた投
与は、侵襲性白血球により放出された肺中の増殖因子のレベルを低減させ得るか
、または筋線維芽細胞の挙動に直接影響を及ぼし得る。いずれにしても、筋線維
芽細胞の減少した増殖は、ＢＬ＋ＰＳ２群におけるＢＬ処理動物の肺コラーゲン
蓄積に減少をもたらし得る。

（実施例３：α１サブユニット保有インテグリンに対するアンタゴニストを用
いた線維症の阻害）
（動物の処置）
雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウス（体重２８〜３０ｇ）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓ
ｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅにより認可を受けた施設で、プラスチック
ケージに入れて４群で飼育した。実験を開始する前に、動物を実験条件に１週間
馴らした。マウスは、Ｒｏｄｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｈｏｗ ５００
１（Ｐｕｒｉｎａ Ｍｉｌｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および水
を自由給餌にし、そして空気がフィルターに通された１２時間明／１２時間暗サ
イクルを有する部屋で飼育した。マウスを以下の群に割り当てた。

硫酸ブレオマイシンを、気管内（ＩＴ）点滴注入の直前に、発熱物質を含有し
ない等張性生理食塩水に溶解する。メトキシフルラン麻酔下で、適切な群のマウ
スに１００μｌの滅菌等張生理食塩水溶液または０．０８ユニットのブレオマイ
シン溶液（１００μｌ）のいずれかを気管内投与することにより与えた。抗体（
４ｍｇ／ｋｇ）は、適切な群においてマウスに腹腔内注射することにより、１週
間に３回、点滴注入後２１日間投与する。その後、各群における動物を、過剰用
量のペントバルビタールナトリウム（１００〜１２５ｍｇ／ｋｇ ｉｐ）により
屠殺し、そしてそれらの肺を気管支肺胞洗浄、生化学的研究および組織病理学的
研究のために処理した。

（気管支肺胞洗浄における総細胞数およびタンパク質レベルの決定）
気管のカニューレ挿入の後に、１ｍｌの５つのアリコートに分けて５ｍｌの等
張性生理食塩水で肺を洗浄する。生理食塩水をカニューレを通してシリンジで投
与し、胸壁を穏やかにマッサージし、そして液体を引き抜く。液体を４℃で１５
００ｇ、２０分間遠心分離し、そして等張性生理食塩水溶液に再懸濁する。気管
支肺胞洗浄標本からの上清のタンパク質含有量をＬｏｗｒｙらの方法（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．１１９３：２６５−２７５（１９５１））により、ウシ血清ア
ルブミンを標準物質として用いて決定する。上清中の全白血球数を、Ｃｏｕｌｔ
ｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｈｉａｌｅ
ａｈ，ＦＬ）で決定する。

（ヒドロキシプロリンの決定）
生化学的研究のために用いた動物の肺を、氷冷等張性生理食塩水で右心室を介
してインサイチュで灌流して、左心耳（ｌｅｆｔ ａｕｒｉｃｌｅ）中の開口を
介して肺血管系から血液を洗い流す。肺葉を非実質組織を含まないように迅速に
切開し、急速凍結するために液体窒素中に入れ、次いで−８０℃で保存する。凍
結した肺を後に解凍し、そして０．１Ｍ ＫＣｌ、０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液
（ｐＨ７．６）中、ポリトロンホモジナイザーでホモジナイズする。コラーゲン
含有量の尺度としての肺ホモジネートのヒドロキシプロリン含有量を、Ｗｏｅｓ
ｓｎｅｒ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９３：４４０−４４７
（１９６１）の教示により定量する。

（組織病理学的研究）
肺洗浄の後、胸腔をあけ、そして心臓および肺をまとめて取り出す。肺を０．
１２Ｍカコジル酸緩衝液中の１％グルタルアルデヒド−パラホルムアルデヒド固
定液（３０ｃｍ Ｈ₂Ｏ圧で４００ｍＯｓｍ）に浸漬する。肺をこの圧力で約２
時間固定し、次いで、吸収した気管とともに固定液中で保存する。包埋する前に
、心臓および全ての非肺組織を遠慮なく切除して肺を分離し、そして取り出す。
組織の塊は、各肺の右上方、左尾側、および左胚葉から、少なくとも２つの矢状
板（２〜３ｍｍの厚さ）から切断する。各ブロックを切断し、表面は約１ｃｍ²
であった。ブロックは、徐々に変化させた一連のエタノールで脱水し、そしてパ
ラフィンに包埋する。切片（５μｍの厚さ）をパラフィンブロックから切り出し
、そして組織学的評価のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。

（データ分析および解釈）
平均値と平均の標準偏差および標準誤差についてデータを分析する。コンピュ
ーターベースの統計パッケージ（ＳＡＳ／ＳＴＡＴ Ｇｕｉｄｅ，第６版、Ｃａ
ｒｙ，Ｎ．Ｃ．１８３〜２６０頁（１９８５）を用いて、スチューデントのｔ検
定、χ二乗分布、相関係数、分散分析（ＡＮＯＶＡ）および多重比較検定を適用
して、コントロール群と処置群との間の有意差を判断する。

（結果）
この研究において、本発明者らは、インテグリンα１β１に対する中和抗体（
抗α１β１）がインビボでのブレオマイシン（ＢＬ）誘導肺線維症を減少すると
いう仮定を検定する。雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウスに生理食塩水（ＳＡ）またはＢ
Ｌ（０．１ｍｌ中０．０８Ｕ）気管内（ＩＴ）注射し、続いて、抗体（０．２ｍ
ｌ中１００μｇ）を１週間に３回、腹腔内（ＩＰ）注射する。ＩＴ点滴注入して
２１日後、マウスを気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）、生化学的分析および組織病理学
的分析のために屠殺する。

（肺の組織病理学的試験）
本発明者らは、生理食塩水およびコントロールＩｇＧで処置したマウスが目に
見える病変を有さず、そして正常な薄い外観を有する肺胞間隔壁を示しているこ
とを予測する。対照的に、ブレオマイシンおよびコントロールＩｇＧで処置した
マウスは、近位の小胞における多病巣性位置からときおり胸膜を含む散在性分布
まで変化した病変を有する。本発明者らは、ブレオマイシンおよび抗α１インテ
グリン抗体で処置したマウスの肺がＢ群（上記）におけるマウスの肺とより類似
しているようであるということを予測する。本発明者らは、Ｄ群の動物が、軽度
の多病巣性隔壁肥厚化および単核球の小さな凝集とともに、わずかな制限された
数の線維症性病変を示すと予測する。

前述の発明は、理解の明瞭さのために例示および実施例によりいくらか詳細に
記載されてきたが、特定の変更および改変が実施されることは当業者に明らかで
ある。従って、この説明および実施例は、添付の特許請求の範囲により表される
本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

Claims (1)

1. 本願明細書に記載された発明。