HU226383B1 - Eljárás fibrózis kezelésére az integrin alfa-4-alegységének antagonistájával - Google Patents

Description

A fibronektin és a kollagén a kötőszövetekben található extracelluláris mátrix integritásának fenntartásához szükséges fehérjék. E fehérjék termelődése nagymértékben szabályozott folyamat, és az abban bekövetkező zavar szöveti fibrózis kialakulásához vezethet. Noha a fibrózus szövet kialakulása a sérülést követő gyógyulásban a normális, hasznos folyamat része, bizonyos körülmények között a fibrózus anyagok abnormális felhalmozódása lép fel úgy, hogy ez végső soron szervi elégtelenséghez vezethet [Bordér és munkatársai, New Engl. J. Med. 331: 1286-1292 (1994)]. Bármely szervet érő sérülés „sablonos” fiziológiás válaszreakcióhoz vezet: vérlemezke által indukált hemosztázishoz, amelyet gyulladásos sejtek beáramlása és aktivált fibroblasztok beáramlása beszűrődése követ. Az ilyen sejtekből származó citokinek vezérlik új extracelluláris mátrix és vérerek képződését (granulation tissue, granulómaszövet). A granulómaszövet kialakulása gondosan összehangolt program, amely során proteázinhibitorok és extracelluláris mátrixfehérjék expressziója felerősödik, és a proteázok expressziója csökken, amely extracelluláris mátrix felhalmozódásához vezet.

A fibrotikus körülmények kialakulása szempontjából központi jelentőségű az, hogy a fibroblasztstimulálódás indukált vagy spontán jellegű. A gyulladásos sejteknek és aktivált fibroblasztoknak a sérült szervbe történő beáramlása az ilyen sejttípusoknak az elsődlegesen fibronektinből és kollagénből álló intersticiális mátrixszal szemben mutatott kölcsönhatási képességétől függ. Ezeket a sejt-sejt vagy sejt-extracelluláris mátrix típusú kölcsönhatásokat a sejtadhéziós molekulák néhány családja közvetíti; az ilyen családok közül az egyik az integrinek családja. Az integrinek szerkezeti és funkcionális rokonságot mutató glikoproteinek, amelyek különböző alfa (alfa-1, alfa-2, jelenleg alfa-11-ig) és béta (béta-1 és béta-7) heterodimer transzmembrán jellegű receptordoménből állnak, amelyek különböző kombinációkban megtalálhatóak gyakorlatilag minden emlőseredetű sejttípuson [lásd a következő összefoglalókat: Butcher, E. C., Cell 67: 1033 (1991); Cox, D. és munkatársai, „The Pharmacology of the Integrins.” Medical Research Rév. 195, és Engleman és munkatársai, „Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets, Ann. Revs. Medicinái Chemistry, 31, 191. szerk.: Bristol, J. A.; kiad.: Acad. Press, NY (1996)]. Két, alfa-4alegységet tartalmazó integrint írtak le, és alfa-4-béta1-nek (VLA-4) és alfa-4-béta-7-nek nevezték el.

Az intersticiális pulmonáris fibrózis (IPF) sok, intersticiális tüdőbetegség végső folyamata, amely a tüdő teljesítményének csökkenéséhez, és a létfontosságú gázcserefunkció károsodásához vezet. Az etiológiára való tekintet nélkül az IPF a tüdő gyulladásos és fibroproliferatív elváltozásaival, és a kollagén intersticiális térben való túlzott mértékű felhalmozódásával jellemezhető. Az IPF-ben szenvedő betegek az aktív pulmonáris fibrózis során általában toborzott immunsejtek és gyulladásos sejtek jelenlétét mutatják, ami azt jelzi, hogy a pulmonáris fibrózis kezdeti gyulladásos sérülést követő abnormális helyreállítási mechanizmus eredménye. A toborzott gyulladásos sejtek valószínűleg sok esetben szerepet játszanak a kezdeti sérülésben. Ráadásul ezek a sejtek komplex szerepet játszhatnak a helyreállítási folyamat szabályozásában. Mindenesetre immunsejtek és gyulladásos sejtek tüdőbe történő toborzása fontos szerepet játszhat a fibrotikus válaszreakció meghatározásában. A gyulladásos sejtek és aktivált fibroblasztok sérült tüdőbe történő beáramlása e sejttípusoknak az ECM-komponensekkel való kölcsönhatási képességével függ össze. A leukociták forgalmát és aktiváltsági állapotát különböző integrinek modulálják. A gyulladásos sejtek tüdőbe történő beáramlásának megelőzése kritikus lehet az ezt követő fibrotikus válaszreakció megfékezésében.

A fibrotikus szövet proliferációjával összefüggő betegségek közül sok krónikus és gyakran legyengítő hatású, például többek között a bőrbetegségek, mint a scleroderma. Ezek közül néhány, mint például a pulmonáris fibrózis, végzetes lehet, részben annak a ténynek köszönhetően, hogy a betegség jelenleg hozzáférhető kezelési módjai jelentős mértékű mellékhatásokkal járnak, és általában nem hatásosak a fibrózis előrehaladásának lassításában vagy megállításában [Nagler és munkatársai, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 154:1082-86 (1996)]. Ennek megfelelően folyamatosan szükség van új, fibrózisellenes hatóanyagokra.

Az alábbiakban a találmány rövid összefoglalását adjuk.

A találmány tárgyát képezi fibrózis kezelésére szolgáló eljárás. Tanulmányoztuk az alfa-1- és alfa-4alegységet tartalmazó integrinek antagonistáinak a fibrózis patogenezisében betöltött lehetséges szerepét úgy, hogy az alfa-1- vagy az alfa-4-alegységet tartalmazó integrinek antagonistáit tüdőfibrózisos egereknek beadtuk. Az a jótékony hatás, amelyet ezek az antagonisták a teljes kollagénfelhalmozódásra és a tüdőfibrózisos károsodás közül mindkettőre gyakoroltak, amint azt a leírásban bemutatjuk, azt valószínűsíti, hogy az alfa-1-alegységet és/vagy az alfa-4-alegységet tartalmazó integrinek az antifibrotikus terápia ésszerű célpontjai lehetnek. A találmány egyik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi alfa-4-alegységet hordozó integrin és alfa-4-alegységet hordozó integrin liganduma közötti kölcsönhatás antagonistáját tartalmazó készítmény hatásos mennyiségének fibrotikus állapotú betegnek történő beadása. Az antagonista alfa-4-integrint kötő hatóanyag, vagy alfa-4-integrin ligandumát kötő hatóanyag. Az előnyös, alfa-4-integrint kötő hatóanyag lehet: a) antitesthomológ, amely a VLA-4 és az alfa-4-béta-7 közül mindkettő, megfelelő ligandumaikkal való kölcsönhatását antagonizálja; b) a VLA-4-nek alfa-4-ligandumával való kölcsönhatását antagonizáló antitesthomológ; és c) az alfa-4-béta-7-nek alfa-4-ligandumával való kölcsönhatását antagonizáló antitesthomológ. A találmány más megvalósítási módjai szerint az antitesthomológ lehet humán eredetű antitest, kiméraantitest, humanizált antitest és ezek fragmensei.

A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi bronchoalveoláris öblítőfolyadékmintában leukociták fibrotikus állapot által indukált (mennyiségi) növekedésének csökkentésére szolgáló

HU 226 383 Β1 eljárás, amely tartalmazza alfa-4-alegységet hordozó integrin és alfa-4-alegységet hordozó integrin liganduma közötti kölcsönhatás antagonistáját tartalmazó készítmény hatásos mennyiségének fibrotikus állapotú betegnek történő beadását. A találmány meghatározott megvalósítási módjai szerint alfa-4-integrint kötő hatóanyagot olyan nukleinsavszekvencia kódolja, amely tartalmaz az 5.840.299 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 6. táblázatában felsoroltak, vagy azokkal komplementer szekvenciacsoportok közül való, meghatározott nukleinsavszekvenciákkal többféle mértékben „stringent körülmények (a hibridizálási körülmények szigorúságát jellemző körülmények) között hibridizáló nukleinsavat. Az eljárás más szempontjai szerint az alfa-4-integrint kötő hatóanyagot olyan nukleinsavszekvencia kódolja, amely tartalmaz az 5.932.214 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban található, bizonyos meghatározott polipeptidek, vagy az ATCC CRL 11175. sejtvonal által termelt polipeptidek közül való polipeptidet kódoló nukleinsavszekvenciával meghatározott mértékben „stringent” körülmények között hibridizáló nukleinsavat.

Az idézett szakirodalmi hivatkozások közül mindegyikre, valamint az alábbiakban következő feltárásban megadott hivatkozásokra is úgy hivatkozunk, mintha teljes terjedelmükben beépítettük volna a leírásba, és ezek a kitanítás részét képezik.

Az alábbiakban a találmány részletes leírását adjuk.

1. Definíciók

Abból a célból, hogy világosabban és tömören megfogalmazhassuk a találmány tárgyát, az alábbi leírásban és a csatolt igénypontokban alkalmazott specifikus kifejezésekre a következő definíciókat adjuk meg.

A következőkben a találmányt részletesen ismertetjük a következő, részletes leírás segítségével, amely ismertetésnek részét képezik a megadott definíciók:

Az integrin „very laté” antigén-szupercsalád (VLA, „nagyon későn megjelenő aktiválási antigén”) szerkezeti és funkcionális rokonságot mutató glikoproteinekből áll, amelyek (alfa és béta) heterodimer, transzmembrán jellegű, csaknem minden emlőseredetű sejttípuson különböző kombinációkban megtalálható receptormolekulák [lásd a következő összefoglalókat: Butcher, E. C., Cell 67: 1033 (1991); Cox, D. és munkatársai, „The Pharmacology of the Integrins.” Medical Research Rév. 195, és Engleman és munkatársai, „Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets, Ann. Revs. Medicinái Chemistry, 31, 191. szerk.: Bristol, J. A.; kiad.: Acad. Press, NY (1996)]. A VLA-családba tartozó integrinek (jelenleg): a VLA-1, -2, -3, -4, -5, -6, -9 és -11, ahol minden molekula tartalmaz β1 láncot, amely nem kovalens módon kötődik alfa-lánchoz (α1, α2, α3, α4, α5, a6 és hasonlók).

Az alfa-4-béta-1-integrin (α4β1) a VCAM-1, a fibronektin és esetleg más ligandumok sejtfelszíni receptora (az utóbbi ligandumokat egyedileg és gyűjtőnéven alfa-4-ligandumoknak nevezzük). Az α4β1-integrin kifejezés (a „VLA-4 vagy „a4b1” vagy „alfa-4-béta-1-integrin kifejezést egymással felcserélhető módon alkalmazzuk) így olyan polipeptideket jelent, amelyek képesek VCAM1-1-hez és az extracelluláris mátrixfehérjékhez, közelebbről fibronektinhez, vagy annak homológjaihoz vagy fragmenseihez való kötődésre, azonban szakember számára nyilvánvaló, hogy a VLA-4 más ligandumai létezhetnek, és ezek vizsgálhatóak hagyományos eljárások alkalmazásával. Mindazonáltal közismert, hogy az alfa-4-alegység a béta-1-alegységen kívül más béta-alegységekkel asszociálhat, így definiálhatjuk az „alfa(a)-4-integrin, vagy „alfa(a)-4-alegységet tartalmazó integrin” kifejezéseket, amely olyan integrinekre vonatkozik, amelyek alfa-4-alegysége egyik vagy másik béta-alegységgel asszociál. A VLA-4-en kívül az „alfa-4-integrinekre” egy másik példa az alfa-4-béta-7 (lásd Lobb és Adams, fentebb). Ehhez hasonlóan, „alfa-1-integrin” vagy alfa-1-alegységet tartalmazó integrin” az az integrin, amely alfa-1alegysége egyik vagy másik béta-alegységgel asszociál.

Az „integrinantagonista” kifejezés magában foglal bármely vegyületet, amely gátolja az alfa-1 és/vagy alfa-4-alegységet tartalmazó integrin integrinligandumhoz és/vagy receptorhoz való kötődését. Alkalmazható integrin elleni antitestet vagy antitesthomológot tartalmazó fehérjék (alább ismertetjük), valamint más molekulák, mint például integrinek ligandumfehérjéinek oldható formái. Az alfa-4-alegységet tartalmazó integrinek ligandumfehérjéinek oldható formája lehet többek között oldható VCAM1, VCAM-1-fúziós fehérjék, vagy bifunkciós, fúziós VCAM-1/lg fehérjék. Például integrinligandum oldható formája, vagy annak fragmense alkalmazható integrinkötés céljából, és előnyösen sejteken integrinkötőhelyekért való kompetícióban, ezáltal antagonistákhoz hasonló hatásokat elérve, mint például integrin (például VLA-1, VLA-4) elleni antitestek alkalmazásával. Közelebbről a találmány oltalmi körébe tartoznak az olyan oldható integrinmutánsok, amelyek ligandumot kötnek, de nem váltanak ki integrinfüggő jelátvitelt. Az ilyen integrinmutánsok vad típusú integrinfehérje kompetitív inhibitoraként fejthetik ki hatásukat, és „antagonistáknak” tekintjük ezeket. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott, más antagonisták „kis molekulák”, az alább következő definíciók szerint.

Szintén a találmány tárgyát képezik a több, mint egy alfa-4-alegységet tartalmazó integrin hatását antagonizáló molekulákat, mint például a VLA-4 és alfa4béta-7 közül mindkettőt, vagy az alfa4-alegységet tartalmazó integrinek más kombinációit antagonizáló kis molekulákat vagy antitesthomológokat alkalmazó eljárások. Szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak azok az eljárások, amelyekben molekulakombinációkat alkalmazunk úgy, hogy a kombináció több, mint egy integrin hatását antagonizálja, mint például néhány olyan kis molekulát vagy antitesthomológot felhasználó eljárások, amely molekulák kombinálva a VLA-4 és az alfa-4-béta-7 közül mindkettőt, vagy az alfa4-alegységet tartalmazó integrinek más kombinációit antagonizálják.

Az itt megadott diszkusszió szerint néhány integrinantagonista fuzionáltatható, vagy más módon konjugálható például antitesthomológgal, mint például im3

HU 226 383 Β1 munglobulinnal vagy annak fragmensével, és nem korlátozódik konkrét szerkezeti típusú integrinre vagy ligandumra vagy más molekulára. így a találmány szerinti megoldás céljaira bármely, (az alábbi definíció szerint meghatározott) kimérafehérje kialakítására képes, és integrinligandum kötésére képes hatóanyagot, amely ezenkívül hatásosan blokkol vagy burkol alfa-4és/vagy alfa-1-alegységet tartalmazó integrint, az itt megadott példákban alkalmazott antagonistákkal egyenértékűnek tekintjük.

Az „antitesthomológ” kifejezés diszulfidkötéssel összekapcsolt immunglobulin könnyű láncból és nehéz láncból álló intakt antitestet foglal magában. Az „antitesthomológ kifejezés alatt értünk olyan fehérjét is, amely tartalmaz a következők közül egyet vagy többet: immunglobulin könnyű lánc, immunglobulin nehéz lánc és ezek antigénkötő fragmensei, amelyek képesek egy vagy több antigén (azaz integrin vagy integrinligandum) kötésére. Az egynél több polipeptidből álló antitesthomológot alkotó polipeptidek adott esetben lehetnek diszulfidkötéssel vagy más módon kovalensen keresztkötve. Ennek megfelelően így az „antitesthomológ” kifejezés magában foglal IgA, IgG, IgE, IgD, IgM típusú intakt immunglobulinokat (valamint ezek altípusait), ahol az immunglobulin könnyű láncai lehetnek kappa vagy lambda típusúak. Az „antitesthomológ kifejezés magában foglalja intakt antitestek olyan részeit, amelyek megtartják antigénkötő specifitásukat, például az Fab fragmenseket, az Fab’ fragmenseket, az F(ab)2’ fragmenseket, az F(v) fragmenseket, nehéz lánc és könnyű lánc monomereket, vagy ezek dimerjeit vagy keverékeit.

A „humanizált antitesthomológ olyan, rekombináns DNS technológiával előállított antitesthomológ, amelyben humán eredetű immunglobulin könnyű láncát vagy nehéz láncát alkotó, az antigénkötéshez nem szükséges aminosavak közül néhányat vagy mindegyiket nem humán eredetű immunglobulin könnyű láncát vagy nehéz láncát alkotó, megfelelő aminosavakkal szubsztituáljuk. A „humán antitesthomológ alatt olyan antitesthomológot értünk, melyben immunglobulin könnyű láncát vagy nehéz láncát alkotó minden aminosav (függetlenül attól, hogy szükségesek-e antigénkötésben) humán eredetű.

Az „integrinagonista’’ kifejezés alatt értünk bármely, az integrinligandumot aktiváló vegyületet.

Az „aminosav” kifejezés alatt peptid, polipeptid vagy fehérje monomeregységét értjük A természetes körülmények között előforduló peptidekben, polipeptidekben és fehérjékben húsz aminosav található, amelyek mindegyike L-izomer. A kifejezés magában foglal aminosavanalógokat és a fehérjeaminosavak D-izomerjeit, és ezek analógjait is.

A „kovalens módon kapcsolt” kifejezés alatt azt értjük, hogy a találmány tárgyát képező, adott molekularészek (például PEG-gel kapcsolt alfa-4- és/vagy alfa-1 integrinantagonista, immunglobulinfragmens/alfa-4vagy alfa-1-integrinantagonista) akár direkt módon, kovalens kötéssel vannak összekötve, vagy pedig indirekt módon, kovalens kötéssel vannak kapcsolva, közvetítő molekularészen vagy molekularészeken, mint például spaceren át. A közbenső molekularészt vagy molekularészeket „kapcsolócsoportnak'’ nevezzük. A „konjugált” kifejezést a „kovalens módon kapcsolt kifejezéssel felcserélhető módon alkalmazzuk. Ebből a szempontból a „spacer” kifejezés alatt olyan molekularészt értünk, amely integrinantagonista vagy annak fragmense aminosava vagy más komponense és a molekula többi része közé van illesztve. Spacer az aminosav vagy más komponens és a molekula között elkülönülést (távtartást) biztosít, ezáltal megakadályozva a fehérjefunkcióval interferáló módosítást és/vagy megkönnyíti az aminosavnak vagy más komponensnek más molekularészhez való kapcsolását.

Az „expressziós kontrollszekvencia kifejezés alatt olyan polinukleotidszekvenciát értünk, amely gének expresszióját vezérli és szabályozza, ha a génekkel működőképesen kapcsolva van.

Az „expressziós vektor” kifejezés alatt olyan polinukleotidot, mint például DNS-plazmidot vagy fágot (más, általános példák között) értünk, amely lehetővé teszi legalább egy gén expresszióját, ha az expressziós vektort gazdasejtbe juttatjuk. A vektor lehet a sejtben replikációra képes, vagy nem képes.

A találmány szerinti hatóanyag „hatásos mennyisége” olyan mennyiség, amely a kezelendő, konkrét állapot esetében eredményt mutat vagy hatást fejt ki.

Aminosav „funkcionális ekvivalense” alatt értjük 1. a funkcionális ekvivalens által helyettesített aminosavhoz hasonló reaktív tulajdonsággal rendelkező aminosavat,

2. a találmány szerinti antagonista aminosavát, amely a funkcionális ekvivalens által helyettesített aminosavhoz hasonló reaktív tulajdonsággal rendelkezik, 3. nem aminosav jellegű molekulát, amely a funkcionális ekvivalens által helyettesített aminosavhoz hasonló reaktív tulajdonsággal rendelkezik.

A találmány szerinti fehérjeszerű antagonistát kódoló polinukleotid, „funkcionálisan ekvivalens egy másik, az antagonistafehérjét kódoló polinukleotiddal, ha a következő feltételek közül legalább egynek megfelel:

a) egy első polinukleotid „funkcionális ekvivalens, ha standard körülmények között hibridizál egy másik polinukleotiddal, és/vagy degenerált az első polinukleotidszekvenciához viszonyítva.

b) egy első polinukleotid „funkcionálisan ekvivalens”, ha expresszió tekintetében a második polinukleotid által kódolt aminosavszekvenciát kódol.

A találmány szerinti megoldásban alkalmazott integrinantagonista magában foglalja, nem kizárólagosan, az itt felsorolt hatóanyagokat, valamint azok funkcionális ekvivalenseit is. A „funkcionális ekvivalens kifejezés alatt olyan integrinantagonistát vagy az integrinantagonistát kódoló polinukleotidot értjük, amely a recipiensre ugyanolyan, vagy javított, előnyös hatást gyakorol, mint az integrinantagonista, amelynek ez funkcionális ekvivalense. Amint azt a szakember belátja, funkcionálisan ekvivalens fehérje előállítható rekombinánstechnikák alkalmazásával, például „funkcionálisan ekvivalens DNS” expresszálásával. Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezik természetes körül4

HU 226 383 Β1 mények között előforduló DNS-ek által, valamint az ugyanazt a fehérjét kódoló, nem természetes körülmények között előforduló DNS-ek által kódolt integrinfehérjék. A nukleotid kódolószekvenciájának degenerált volta miatt más polinukleotidok alkalmazhatóak integrinfehérjék kódolása céljából. Ezek magukban foglalják a fenti szekvenciák egészét vagy részét, amelyeket különféle, a szekvenciában ugyanazt az aminosavat kódoló kodonok szubsztitúciójával, így „csendes” mutáció előállításával megváltoztattunk. Az így megváltoztatott szekvenciákat a szekvenciák ekvivalensének tekintjük. Például a Phe-t (F) két kodon kódolja, a TTC vagy a TTT, a Tyr-t (Y) TAC vagy TAT, és a His-t (H) CAC vagy CAT. Másrészt a Trp-t (W) egyetlen kodon, a TGG kódolja. Ennek megfelelően belátható, hogy konkrét integrint kódoló, adott DNS-szekvencia esetében sok, az integrint kódoló, degenerált DNS-szekvencia van. Ezek a degenerált DNS-szekvenciák a találmány tárgyát képezik.

A „kiméra” kifejezés alatt a találmány tárgyát képező antagonistára vonatkozóan azt értjük, hogy az antagonista két vagy több, eltérő szerkezetű és/vagy eltérő eredetű fehérje (kémiai keresztkötést, vagy kovalens, vagy más típusú) kapcsolódásából áll. így kiméra alfa4-integrinantagonista tartalmazhat egy molekularészt, amely alfa-4-integrinantagonista vagy fragmense, és egy másik molekularészt, amely nem alfa-4-integrinantagonista. Kiméra alfa-1-integrinantagonista tartalmazhat egy molekularészt, amely alfa-1-integrinantagonista vagy fragmense, és egy másik molekularészt, amely nem alfa-1-integrinantagonista.

A „kimérafehérjék” egy fajtája a „fúzió” vagy „fúziós fehérje”, amely két vagy több fehérje vagy ezek fragmensei kolineáris, kovalens kötése egyedi peptidláncukon keresztül, a legelőnyösebb módon az ilyen fehérjéket kódoló polinukleotidmolekulák genetikai expresszióján át. így az előnyös fúziós fehérjék olyan kimérafehérjék, amelyek magukban foglalnak alfa-4-integrinantagonistát (vagy alfa-1-integrinantagonistát) vagy fragmensét, amely kovalens módon van kötve egy másik molekularészhez, amely nem alfa-4-integrinantagonista (vagy alfa-1-integrinantagonista). A találmány tárgyát képező, előnyös fúziós fehérjék tartalmazhatják intakt antitestek részeit, amelyek megtartják antigénkötő specifitásukat, például Fab fragmenseket, az Fab’ fragmenseket, az F(ab)2’ fragmenseket, az F(v) fragmenseket, nehéz lánc és könnyű lánc monomereket vagy dimereket, egy nehéz láncból és egy könnyű láncból álló dimereket, és hasonlókat.

A legelőnyösebb fúziós fehérjék kimérák, és tartalmaznak integrinantagonista-molekularészt fuzionáltatva vagy más módon kapcsolva immunglobulin könnyű lánc, immunglobulin nehéz lánc, vagy mindkettő kapocsrégiójához (hinge region) és konstans régiójához, vagy annak részéhez. így a találmány tárgyát képezi molekula, amely tartalmaz: 1. integrinantagonista-molekularészt; 2. egy másik peptidet, amely például megnöveli az integrinantagonista-molekularész szolubilitását vagy in vivő életidejét, például az immunglobulinszupercsalád tagját, fragmensét vagy részét, például

IgG, a humán eredetű lgG1 nehéz láncának konstans régiójának fragmensét vagy részét, például a CH2-t, CH3-at és a kapocsrégiót. Specifikusan „integrinantagonista/lgG-fúzió” alatt olyan fehérjét értünk, amely tartalmazza a találmány szerinti, biológiailag aktív integrinantagonista-molekulát (például szolúbilis VLA-4vagy VLA-1 -ligandumot, vagy ezek biológiailag aktív részét immunglobulinlánc N-terminálisához kapcsolva, ahol az immunglobulin N-terminálisának egy része az integrinantagonistával van helyettesítve. Az integrinantagonista/lgG-fúzió egy fajtája az „integrin/Fc-fúzió”, amely a találmány tárgyát képező integrinantagonistát immunglobulin konstans doménja legalább egy részéhez kapcsolva tartalmazó fehérje. Előnyős Fc-fúzió tartalmazza a találmány tárgyát képező integrinantagonistát immunglobulin nehéz láncok C-terminális doménját tartalmazó antitestfragmenshez kapcsolva.

A „fúziós fehérje” kifejezés alatt értünk integrinantagonistát is, amely mono-, heterofunkcionális molekula által egy másik, nem integrinantagonista-molekularészhez van kapcsolva („kiméramolekulát” eredményezve), és de novo tisztított fehérjékből az alábbiakban leírt módon van előállítva. így kémiailag kapcsolt kiméramolekula (a rekombináns módon kapcsolttal ellentétben) azaz fúziós fehérje tartalmazhat: 1. alfa-4 integrinalegységet megcélzó (targeting) molekularészt, például VLA-4 kötésére képes VCAM-1-molekularészt) VLA-4-et hordozó sejtek felszínén; 2. egy másik molekulát, amely növeli a megcélzó (targeting) molekularész szolubilitását vagy in vivő életidejét, például polialkilénglikolpolimert, mint például polietilénglikolt (PEG). Az alfa-4-et megcélzó (atargeting) molekularész lehet természetes körülmények között előforduló alfa-4-ligandum vagy annak fragmense, például VCAM-1-peptid vagy hasonlóan konzervatív módon szubsztituált aminosavszekvencia.

A „heterológ promoter” kifejezésen olyan promotert értünk, amely egy génnel vagy egy tisztított nukleinsavval természetes körülmények között nem asszociált.

A „homológia” kifejezést az „azonosság kifejezés szinonimájaként alkalmazzuk, és két polipeptid, molekula, vagy két nukleinsav közötti szekvenciahasonlóságot értünk alatta. Ha mindkét, összehasonlított szekvenciában egy pozíciót ugyanaz a bázis- vagy aminosavmonomer-alegység foglal el (például ha mindkét DNS-molekula egy pozíciójában adenin van, vagy mindkét polipeptid egy pozíciójában lizin van), akkor a megfelelő molekulák abban a pozícióban homológok. Két szekvencia között a homológia százalékos értéke a két szekvencia között a megegyező vagy homológ pozíciók számának és az összehasonlított pozíciók számának hányadosa, 100-szal szorozva. Például két szekvenciában a 10 pozícióból 6 megegyezik vagy homológ, akkor a két szekvencia 60%-ban homológ. Példaként említve, a CTGSCT és CAGGTT 50%-ban homológ (az összesen 6 pozícióból 3 megegyezik). Általában összehasonlítást végzünk, ha két szekvenciát egymáshoz rendezünk maximális homológia elérése céljából. Az ilyen összerendezést elérhetjük például Kariin és Altschul eljárásával, amelyet az alábbiakban részletesebben ismertetünk.

HU 226 383 Β1

A homológ szekvenciáknak vannak azonos vagy hasonló aminosavai, ahol a hasonló aminosavak az összerendezett referenciaszekvencia megfelelő aminosavak konzervatív szubsztitúciói, vagy „megengedett pontmutációi”. Ebből a szempontból a referenciaszekvenciához képest aminosav „konzervatív szubsztitúciója” alatt az olyan szubsztitúciókat értjük, amelyek a megfelelő referenciaaminosavakkal fizikailag vagy funkcionálisan hasonlóak, például azok, amelyek hasonló mérettel, alakkal, elektromos töltéssel, kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek, többek között kovalens vagy hidrogénkötések kialakításának képességével, vagy hasonlókkal. Különösen előnyös konzervatív helyettesítések azok, amelyek kielégítik a „megengedett pontmutáció’’ definícióját, amely megtalálható a következőben: Dayhoff és munkatársai „Atlas of Protein Sequence and Structure, 5. melléklet, 22. 354-352, kiad.: Nat. Biomed. Rés. Foundation, Washington, D. C. (1978).

A „homológia” és az „azonosság” kifejezéseket a leírásban felcserélhető módon alkalmazzuk, és mindkettő két polipeptidszekvencia közötti szekvenciahasonlóságot jelöl. A homológiát és azonosságot úgy határozhatjuk meg, hogy az összehasonlítás céljából összerendezni kívánt mindkét szekvenciában egy pozíciót összehasonlítunk. Ha az összehasonlított szekvenciában egy pozíciót ugyanaz az aminosav foglal el, akkor a polipeptideket abban a pozícióban azonosaknak tekintjük; ha az ekvivalens helyet ugyanaz az aminosav foglalja el (például azonos), vagy hasonló aminosav (például szterikusan és/vagy elektromosan hasonló jellegű), akkor a molekulákat abban a pozícióban homológnak tekintjük. Szekvenciák között a homológia százalékos értéke a szekvenciákban a megegyező vagy homológ pozíciók számának függvénye. „Nem rokon” vagy „nem homológ” szekvenciák a találmány tárgyát képező szekvenciával kisebb, mint 40%-os azonosságot, előnyösen kisebb, mint 25%-os azonosságot mutatnak.

Két aminosavszekvencia vagy két nukleinsavszekvencia közötti „százalékos homológiát Kariin és Altschul [Kariin és Altschul, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 87; 2264 (1990)] illesztőalgoritmusával határozzuk meg, amelyet Kariin és Altschul [Kariin és Altschul, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 90: 5873 (1993)] módosított. Ilyen algoritmust van Altschul és munkatársai [Altschul és munkatársai, J. Mól. Bioi. 215: 406 (1990)] NBLAST vagy XSLAST-programjaiban beépítve. SLAST-kereséseket hajtunk végre az NBLAST-programmal, score=100, wordlength=12, a találmány szerinti nukleinsawal homológ nukleotidszekvenciák keresése céljából. BLAST-fehérjekereséseket hajtunk végre azXBLASr-programmal, score=50, wordlength=3, a referenciapolipeptiddel homológ aminosavszekvencia keresése céljából, összehasonlítás céljára gapped (hézagokat tartalmazó) illesztések előállítására, gapped BLAST-ot alkalmaztunk Altschul és munkatársai [Altschul és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 25:3389 (1997)] által leírtak szerint. BLAST és gapped BLAST alkalmazásakor a megfelelő programok (XBLAST és

NBLAST) alapértelmezési paramétereit alkalmaztuk (lásd http://www/ncbi. min.nih.gov.).

Az „izolált” (az „alapvetően tiszta” kifejezéssel felcserélhető módon alkalmazva) kifejezésen nukleinsav-, például integrinantagonistát kódoló polinukleotidszekvencia) esetében RNS- vagy DNS-polinukleotidot, genomi polinukleotid részét, cDNS-t vagy szintetikus polinukleotidot értünk, amely eredeténél fogva vagy a beavatkozás szempontjából 1. nem asszociálódik mindegyik polinukleotiddal, amellyel természetes körülmények között asszociálódik (például gazdasejtben expressziós vektorként, vagy annak részeként van jelen); vagy 2. más nukleinsavhoz, vagy más kémiai molekularészhez van kapcsolva, mint amelyhez természetes körülmények között kapcsolódik; vagy 3. nem fordul elő természetes körülmények között. Az „izolált” kifejezés alatt ráadásul olyan nukleotidszekvenciát értünk, amely 1. in vitro, például polimeráz-lánceakcióval (PCR) amplifikáltak; 2. kémiailag szintetizáltak; 3. rekombináns eljárással, klónozással állítottak elő; vagy 4. tisztítással, mint például hasítással és gélszűréssel állítottak elő. így az „alapvetően tiszta nukleinsav” kifejezés alatt olyan nukleinsavat értünk, amely nem közvetlenül szomszédos egyik vagy mindkettő kódolószekvenciával, amelyekkel normális körülmények között közvetlenül szomszédos a természetes körülmények között előforduló genomban, abban a szervezetben, amelyből a nukleinsav származik. Az alapvetően tiszta DNS magában foglal rekombináns DNS-t is, amely további integrinszekvenciákat kódoló hibrid gén része.

Az „izolált” kifejezés (az „alapvetően tiszta kifejezéssel felcserélhető módon alkalmazva) polipeptidekre vonatkoztatva olyan polipeptidet vagy annak részét jelenti, amely eredete vagy a beavatkozás szempontjából: 1. gazdasejtben expressziós vektor részének termékeként van jelen 2. más fehérjéhez vagy kémiai molekularészhez kapcsolódik, mint természetes körülmények között; 3. nem fordul elő természetes körülmények között, például olyan fehérje, amely kémiailag módosítva van legalább egy hidrofób molekularész fehérjéhez történő csatolásával vagy hozzáadásával, természetes körülmények között nem előforduló módon. „Izolált” kifejezésen ráadásul értünk olyan fehérjét, amely 1. kémiailag lett szintetizálva; vagy 2. gazdasejtben lett expresszálva és az asszociálódó és szennyező fehérjéktől megtisztították. A kifejezés általában olyan polipeptidet jelent, amelyet más, természetes körülmények között azzal együtt előforduló fehérjéktől és nukleinsavaktól elválasztottak. Előnyösen, a polipeptid el van választva olyan anyagoktól is, mint az antitestek, vagy gélmátrixtól (poliakrilamid), amelyeket a tisztításakor alkalmaznak.

A „multivalens fehérjekomplex” kifejezésen integrinantagonisták sokaságát értjük (azaz egyet vagy többet). Integrin elleni antitesthomológ vagy fragmens lehet keresztkötött, vagy más antitesthomológhoz vagy fragmenshez kötve. Mindegyik fehérje lehet azonos vagy különböző, és mindegyik antitesthomológ vagy fragmens lehet azonos vagy különböző.

HU 226 383 Β1

A „mutáns” kifejezésen értünk egy szervezet genetikai anyagában bármely változást, közelebbről a vad típusú polinukleotidszekvenciában vagy vad típusú fehérjében bármely változást (azaz deléciót, szubsztitúciót, addíciót vagy alterációt). A „mutein” kifejezést a „mutáns” kifejezéssel felcserélhető módon alkalmazzuk.

A „működőképesen kapcsolt”: egy polinukleotidszekvencia (DNS, RNS) expressziós kontrollszekvenciához, ha az expressziós kontrollszekvencia szabályozza és vezérli az adott polinukleotidszekvencia transzkripcióját és transzlációját. A „működőképesen kapcsolt” kifejezés magában foglalja alkalmas startszignál (például ATG) jelenlétét az expresszálni kívánt polinukleotid előtt, és a helyes leolvasási keret fenntartását a polinukleotidnak az expressziós kontrollszekvenciák szabályozásával történő expresszió lehetővé tétele céljából, és a polinukleotidszekvencia által kódolt polipeptid termelődését.

A „gyógyászati hatóanyag” definíció szerint egy vagy több olyan vegyület vagy molekula vagy más kémiai entitás, amely egy személynek beadva (a találmány tárgyát képező antagonista mellett) az antagonista működésére hatást gyakorol. A „gyógyászati hatóanyag” kifejezés alatt olyan (hatóanyagot) hatóanyagokat értünk, amelyet „kombinációs terápiában” alkalmazunk, ahol a találmány tárgyát képező antagonistát egy vagy gyógyászati hatóanyag beadása előtt, után, vagy azzal egyidejűleg adjuk be.

A „fehérje” bármely, alapvetően a 20 aminosav bármelyikéből álló polimer. Noha a „polipeptid kifejezést gyakran alkalmazzuk viszonylag nagy polipeptidek esetében, és a „peptid” kifejezést kis polipeptidek esetében, a kifejezések alkalmazása a technikában (irodalomban) átfedő és változó. A „fehérje” kifejezés alatt értünk peptideket, fehérjéket és polipeptideket, ha másképp nem jelezzük.

A „peptid, peptidek, fehérje, fehérjék, polipeptid és polipeptidek kifejezéseket egymással felcserélhető módon alkalmazzuk. A „polinukleotidszekvencia és „nukleotidszekvencia” kifejezéseket szintén egymással felcserélhető módon alkalmazzuk.

A „rekombináns” kifejezésen rekombináns, emlőseredetű expressziós rendszerből származó fehérjét értünk. Mivel az integrin nem glikozilált és diszulfidkötéseket sem tartalmaz, expresszálható a legtöbb prokarióta- és eukariótaeredetű expressziós rendszerben.

A „kis molekula” definíciója megtalálható az A2-részben.

A „felszíni aminosav” olyan aminosavat jelent, amely az oldószernek van kitéve, ha a fehérje natív formájában van feltekeredve.

A „hibridizációs körülmények” általában olyan só (sókoncentráció) és hőmérsékleti körülményeket jelent, amelyek egyenértékűek 0,5xSSC-5xSSC és 65 ’C körülményekkel, hibridizáció és mosás esetében is. A „standard hibridizációs körülmények” kifejezés ezáltal műveleti definíció, és magában foglalja a hibridizációs körülmények egy tartományát. Mindazonáltal az erősen „stringent („szigorú”, high stringecy) körülmények többek között: hibridizáció plaque screen pufferrel (0,2% polivinipirrolidin, 0,2% Ficoll-400, 0,2% marhaeredetű szérumalbumin, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 M NaCI, 0,1% nátrium-pirofoszfát, 1% SDS), 10% dextrán-szulfát, és 100 pg/ml denaturált, szonikált lazacsperma-DNS 65 ’C-on 12-20 órán át, és mosás: 75 mM NaCI, 7.5 mM nátrium-citrát (0,5xSSC), 1% SDS 65 °C-on. A kevéssé „stringent” (low stringency) körülmények többek között: hibridizáció plaque screen pufferrel, 10% dextrán-szulfáttal és 110 100 pg/ml denaturált, szonikált lazacsperma-DNS 55 ’C-on 12-20 órán át, és mosás: 300 mM NaCI, 30 mM nátrium-citrát (2,0xSSC), 1% SDS 55 ’C-on. Lásd továbbá a következő kiadványban: „Current Protocols in Molecular Biology kiad.: John Wiley & Sons, Inc. New York, 6.3.1-6.3.6. fejezetek (1989).

A „terápiás készítmény” definíció szerint tartalmazza a találmány szerinti antagonistát és más, biológiailag kompatibilis összetevőket. A terápiás készítmény tartalmazhat excipienseket, mint például vizet, ásványi anyagokat és hordozókat, mint például fehérjéket.

A „fibrotikus állapotú személy” kifejezés alatt nem kizárólagosan olyan személyeket értünk, akik belső szervi fibrózisban, dermális fibrózisos rendellenességben, és a szem fibrotikus állapotában szenvednek. A belső szervek (például a máj, tüdő, vese, a szív erei, emésztőrendszer) fibrózisa olyan rendellenességekben fordul elő, mint a pulmonáris fibrózis, mielofibrózis, májcirrhózis, mesangialis proliferatív glomerulonephritis, crescentképződéssel (félholdképződéssel) járó glomerulonephritis, diabetikus nephropatia, renalis interstitialis fibrosis, ciklosporinkezelésben részesült betegek renalis fibrózisa, és a HIV-ve\ összefüggő nephropatia. A dermális fibrózisos rendellenességek többek között, de nem kizárólagosan, a scleroderma, a morphea, a keloidok, a hipertrofikus hegek, a familiáris bőrkollagenóma, és kollagén típusú kötőszöveti anyajegyek. A szemet érintő fibrotikus állapotok többek között a diabetikus retinopátia, a sebészeti beavatkozást követő hegesedés [például „glaukómaszűrési (filtering) sebészeti beavatkozást és kancsalságot kezelő sebészeti beavatkozást követően] és a proliferatív vitreoretinopátia. A találmány szerinti eljárásokkal kezelhető további fibrotikus állapotok: rheumatoid arthritis, hosszadalmas ízületi fájdalommal és ízületi kopással (roncsolódással) összefüggő betegségek, progresszív szisztémás sclerosis, polimiositis, dermatomiositis, eozinofil fascitis, morphea, Raynaud-szindróma, és orrpollp. Ráadásul a találmány szerinti eljárásokkal kezelhető fibrotikus állapotok többek között a hegesedés meggátlása olyan betegek esetében, akik kelőid képzésre vagy hipertrofikus hegek képzésére hajlamosak, a hegképződés vagy hegesedés megelőzése vagy meggátlása különböző típusú sebek, többek között sebészeti bemetszések, sebészeti hasi sérülések és traumás roncsolódások gyógyulásakor, artériák hegesedésének és visszazáródásának megelőzése vagy meggátlása szívkoszorúér angioplastiát követően, infarktust követően, és hiperszenzitív vasculopatiában a szív fibrózisával összefüggő, túlzott mértékű hegesedés és fibrózus szövet kialakulásának megelőzése vagy meggátlása.

HU 226 383 Β1

A „hatásos mennyiség” kifejezésen olyan mennyiséget értünk, amely elegendő ahhoz, hogy a jótékony vagy a kívánt hatást eredményezze. Hatásos mennyiség beadható egyszeri vagy többszöri beadással. A kezelés szempontjából a találmány szerinti alkalmazás célját szolgáló antagonista „hatásos mennyisége” olyan mennyiség, amely elegendő a kezelendő rendellenesség elfogadott standardjának megfelelően fibrotikus állapot előrehaladásának csillapítására, enyhítésére, stabilizálására, visszafordítására, lassítására vagy késleltetésére. A hatásosság mutatóinak detektálása és mérése végrehajtható számos, rendelkezésre álló diagnosztikai eszköz alkalmazásával, például többek között fizikai vizsgálatokkal, többek között vérvizsgálatokkal, pulmonáris funkciós tesztekkel, mellkasi röntgennel CT-vizsgálattal, bronchoszkópiával, bronchoalveolaris öblítéssel, tüdőbiopsziával és CT-vizsgálattal.

A találmány szerinti megoldás gyakorlati alkalmazásakor, ha másképp nem jelezzük, a sejtbiológia, sejttenyésztés, molekuláris biológia, mikrobiológia, rekombináns DNS technika, fehérjekémia, farmakológia és immunológia olyan hagyományos eljárásait alkalmazzuk, amely a szakember számára rendelkezésre áll. Az ilyen eljárások leírása a szakirodalomban megtalálható. Ha másképp nem határozzuk meg, a részletes leírásban idézett hivatkozásokra úgy hivatkozunk, mintha a leírásba teljes terjedelmükben beépítettük volna, és ezek a kitanítás részét képzik.

Az alábbiakban a találmány előnyös megvalósítási módjait ismertetjük.

A szabadalmi találmány kidolgozása során arra a felismerésre jutottunk, hogy az alfa-1-alegységet és/vagy az alfa-4-alegységet tartalmazó integrinek antagonistái és ezek fragmensei alkalmazhatóak pulmonáris fibrózis kezelésére.

A. Integrinantagonisták

A találmány szerinti megoldás céljait szolgáló integrinantagonista lehet integrin és annak általános kapcsolódó liganduma vagy receptora közötti bármely kölcsönhatás antagonistája úgy, hogy a ligandum-receptor kölcsönhatás által indukált normál funkció megváltozzon (azaz gátlódjon, lassuljon vagy másképpen módosuljon). A találmány előnyös megvalósítási módja szerinti integrinantagonista az alfa-4-integrinek, ezek ligandumával való kölcsönhatásainak, mint például a VCAM-1/VLA-4 kölcsönhatás antagonistája. Ez olyan hatóanyag, például polipeptid vagy más molekula, amely a VCAM-1 és/vagy VLA-4 által közvetített kötés gátlására képes, vagy amely más módon modulálhatja a VCAM-1 és/vagy VLA-4 funkciót, például a VLA-4ligandum által közvetített VLA-4-jelátvitel, vagy a VCAM-1-ligandum által közvetített VCAM-1-jelátvitel gátlásával vagy blokkolásával, és amely hatásos akut agysérülés kezelésében, előnyösen a VLA-4-antitestekkel azonos módon.

A VCAM-1/VLA-4 kölcsönhatás antagonistája olyan hatóanyag, amely a következőkben felsoroltak közül egy vagy több tulajdonsággal rendelkezik: 1. VLA-4-et hordozó sejteken (például endotélsejtek) VLA-4-hez kötődik, vagy burkolja azt megfelelő specifitással ahhoz, hogy gátolja a VLA-4-ligandum/VLA-4 kölcsönhatást, például a VCAM-1/VLA-4 kölcsönhatást; 2. VLA-4-et hordozó sejtek (például limfocita) felszínén VLA-et burkol be, vagy köt meg, megfelelő specifitással ahhoz, hogy módosítson, és előnyösen gátoljon VLA által közvetített jelátvitelt, azaz a VLA-4/VCAM-1 által közvetített jelátvitelt; 3. endotélsejteken VLA-4-ligandumhoz (például VCAM-1-hez) köt vagy azt burkolja, megfelelő specifitással ahhoz, hogy gátolja a VLA-4/VCAM-1 kölcsönhatást; 4. VLA-4-ligandumhoz (például VCAM-1hez) köt vagy azt burkolja, megfelelő specifitással ahhoz, hogy módosítsa, és előnyösen gátolja a VLA-4-ligandum által közvetített VLA-4-jelátvitelt, például a VCAM-1 által közvetített VLA—4-jelátvitelt. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az antagonista rendelkezik az 1. és 2. tulajdonságok közül egyikkel vagy mindkettővel. A találmány más, előnyös megvalósítási módjai szerint az antagonista rendelkezik a 3. és 4. tulajdonságok közül egyikkel vagy mindkettővel. Ráadásul alkalmazható egynél több antagonista, például a VLA-4-hez kötődő hatóanyag kombinálható a VCAM-1hez kötődő hatóanyaggal.

A találmány más megvalósítási módjai szerint az integrinantagonista alfa-1-integrinek ligandumaikkal való kölcsönhatásának, mint például a kollagén/VLA-1 kölcsönhatás antagonistája. Ez olyan hatóanyag, például polipeptid vagy más molekula, amely képes gátolni vagy blokkolni a kollagén és/vagy VLA-1 által közvetített kötést, vagy amely más módon képes modulálni a kollagén és/vagy a VLA-1-funkciót, például a VLA-1-ligandum által közvetített VLA-1-jelátvitel vagy a kollagén által közvetített kollagén-jelátvitel gátlásával vagy blokkolásával. A kollagén-VLA-1-kölcsönhatás antagonistája olyan hatóanyag, amely a következő tulajdonságok közül egyikkel vagy másikkal rendelkezik: 1. VLA-1-et hordozó sejteken VLA-1-hez köt (például kollagén), vagy burkolja azt megfelelő specifitással ahhoz, hogy gátolja a VLA-1 -ligandum/VLA-1 kölcsönhatást, például a kollagén/VLA-1 kölcsönhatást; 2. VLA-1-et hordozó sejteken VLA-1-hez köt vagy burkolja azt megfelelő specifitással ahhoz, hogy, módosítsa, és előnyösen gátolja a VLA-1 által közvetített jelátvitelt, például a VLA-1/kollagén által közvetített jelátvitelt; 3. VLA-1-ligandumot (például kollagént) köt vagy burkol megfelelő specifitással ahhoz, hogy gátolja a VLA-1 által közvetített VLA-1-jelátvitelt, például a kollagén által közvetített VLA-1-jelátvitelt. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az alfa-1 -antagonista rendelkezik az 1. és 2. tulajdonságok közül egyikkel vagy mindkettővel. A találmány más, előnyös megvalósítási módjai szerint az antagonista rendelkezik a

3. és 4. tulajdonságok közül egyikkel vagy mindkettővel. Ráadásul betegnek beadható egynél több antagonista, például a VLA-1-hez kötődő hatóanyag kombinálható a VCAM-1-hez kötődő hatóanyaggal.

Az itt diszkutáltak szerint a találmány tárgyát képező eljárásokban alkalmazandó antagonisták nem korlátozódnak konkrét típusú vagy szerkezetű molekulára,

HU 226 383 Β1 így a találmány céljaira és csak példaként említve bármely hatóanyag, amely sejtek felszínén alfa-4-integrinekhez (például VLA-4-hez), vagy alfa-4-ligandumhoz (mint például a VCAM-1 az alfa-4-ligandumot hordozó sejtek felszínén) kötésre képes, és amely hatásosan blokkol vagy burkol alfa-4-integrint (például VLA-4-et) vagy alfa-4-ligandumot (például VCAM-1-et), „alfa-4integrint kötő hatóanyagnak” és alfa-4 integrinligandumot kötő hatóanyagnak” nevezzük, és az itt ismertetett példákban alkalmazott antagonistákkal egyenértékű.

Például antitestek és antitesthomológok (az alábbiakban diszkutálva), valamint a VLA-4-hez és a VCAM-1-hez természetes körülmények között kötődő fehérjék oldható formái alkalmazhatóak. A VLA-4-hez természetes körülmények között kötődő fehérjék oldható formái többek között az oldható VCAM-1-peptidek, a VCAM-1-fúziós peptidek, a VCAM-1-fúziós fehérjék, a bifunkcionális VCAM-1/lg-fúziós fehérjék (például a fent diszkutált „kiméramolekulák”), fibronektin, alternatív módon összeillesztésre került (alternatively spliced) nem III. típusú kötőszegmenssel rendelkező fibronektin, és az E/ÍDV-aminosavszekvenciát, vagy hasonló konzervatív módon szubsztituált aminosavszekvenciát tartalmazó fibronektlnpeptidek. A VCAM-1 természetes kötőfehérjéinek oldható formái magukban foglalják az oldható VLA-4-peptideket, a VLA-4 fúziós fehérjéket, a kétfunkciós VLA-4/lg-fúziós fehérjéket és az ehhez hasonlókat. Az „oldható VLA-4peptid” vagy „oldható VCAM-1-peptid kifejezés alatt olyan VLA-4- vagy VCAM-1-polipeptidet értünk, amely önmagában nem képesek membránban történő beágyazódásra. Az ilyen oldható polipeptidek magukban foglalják például az olyan VLA-4- és VCAM-polipeptideket, amelyek membránt átívelő doménjüknek horgonyzáshoz elegendő része hiányzik ahhoz, vagy úgy vannak módosítva, hogy a membránt átívelő doménjük nem funkcionális. Ezek a kötő hatóanyagok hathatnak a VLA-4 sejtfelszíni kötőfehérjéjével kompetícióban, vagy a VLA-funkciót más módon megváltoztatva. Például a VCAM-1 oldható formája [lásd például Osborn és munkatársai Cell 59: 1203-1211 (1989)], vagy annak oldható fragmense alkalmazható a VLA-4 kötésére, és előnyösen a VGAM-1-et hordozó sejteken a VLA-4-kötő helyekért kompetíció céljára, ezáltal antagonisták, mint kis molekulák vagy VLA-4 elleni antitestek alkalmazásához hasonló hatásokat elérve.

1. Integrin elleni antitesthomológok

A találmány más, előnyös megvalósítási módjai szerint a találmány tárgyát képező eljárásban alkalmazásra kerülő, sejtfelszíni alfa-1 és/vagy alfa-4-integrin (mint például VLA-1, VLA-4 vagy alfa-4-béta-7) és/vagy az alfa-1- és/vagy alfa-4-integrin (mint például kollagén vagy VCAM-1) kötését, többek között blokkolását vagy burkolását szolgáló antagonista VLA-1 elleni vagy VLA-4 elleni, és/vagy kollagén elleni és/vagy VCAM-1 elleni monoklonális antitest vagy antitesthomológ, a korábban definiáltak szerint. Kezelés, közelebbről ember kezelése célját szolgáló előnyös antitestek és homológok többek között a humán eredetű antitestek vagy antitesthomológok humanizált antitesthomológok, kiméra antitesthomológok, Fab, Fab’, F(ab)2' antitestfragmensek, és antitest nehéz lánc vagy könnyű lánc monomer vagy dimer, vagy ezek keverékei. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható előnyös kötőanyagok a VLA-4 elleni monoklonális antitestek.

2. Kismolekulájú integrinantagonisták

A „kis molekulájú” integrinantagonista kifejezés alatt olyan kémiai hatóanyagokat (azaz szerves molekulákat) értünk, amelyek képesek az integrin/integrinligandum kölcsönhatás megbontására például a VLA-4/VCAM blokkolásával a VLA-4 vagy a VCAM-1 sejtfelszínen történő megkötésével. Az ilyen kis molekulák megköthetik a megfelelő VLA-4- vagy VCAM-1-receptorokat is. A VLA-4 és a VCAM-1 kis molekulájú inhibitorai lehetnek peptidek, félpeptid jellegű vegyületek vagy nem peptid jellegű vegyületek, mint például kis molekulájú szerves molekulák, amelyek a VCAM-1/VLA-4 kölcsönhatás antagonistái. A „kis molekula” definíció szerint nem foglal magában antitestet vagy antitesthomológot. A példaként szolgáló kis molekulák molekulatömege általában 1000-nél kisebb.

Például alkalmazhatóak olyan kis molekulák például oligoszacharidok, amelyek a VLA-4-ligandum kötödoménjét mímelik, és illeszkednek a VLA-4-receptor doménjához [lásd például Devlin, J. J. és munkatársai Science 249:400-406 (1990); Scott, J. K. és Smith, G. P. Science 249: 386-390 (1990), és a 4.833.092 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Geysen)]. A fenti idézetekre úgy tekintünk, mintha teljes terjedelmükben a leírásba beépítettük volna, és ezek a kitanítás részét képezik. Ugyanígy alkalmazhatóak az olyan kis molekulák, amelyek a VCAM-1-ligandum kötődoménjét mímelik, és illeszkednek a VCAM-1-receptor doménjához.

A találmány szerinti megoldásban alkalmazható kis molekulákra példákat találhatunk Komoriya és munkatársai közleményében [Komoriya, „The Mimical Essential Sequence fór a Major Cell Type-Specific Adhesion Site (CS1) Within the Altematively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronectin Is Leucine-Aspartic Acid-Valine”, L. Bioi. Chem. 266(23): 1505-79 (1991)]. A közlemény szerzői azonosították a VLA-4 kötéséhez szükséges minimális aktív aminosavszekvenciát, és szintetizáltak egy sor átlapolópeptidet adott fajtájú fibronektin CS-1-régió (a VLA-kötő dómén) aminosavszekvenciája alapján. Azonosítottak egy 8 aminosavból álló peptidet (Glu-lle-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), valamint két kisebb, átlapoló pentapeptidet (Glu-LeuAsp-Val és Leu-Asp-Val-Pro-Ser), amelyek a fibronektinfüggő sejtadhézió elleni gátlóhatással rendelkeznek. Ezt követően néhány, az LDL-szekvenciát tartalmazó nagyobb peptid in vivő aktívnak bizonyult [Ferguson, T. A. és munkatársai, „Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-cell-Mediated Immuné Responses In Vivő”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 80-72-76 (1991); és Wahl, S. M. és munkatársai, „Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment, J. Clin. Invest. 94. 655-62

HU 226 383 Β1 (1994)]. Leírtak egy olyan ciklikus pentapeptidet is (ArgCys-Asp-Tpro-Cys, ahol a Tpro 4-tio-prolint jelöl), amely a VLA-4 és a VLA-5 közül mindkettő fibronektinhez való adhézióját gátolni képes [lásd például Nowlin, D. M. és munkatársai, „A Növel Cyclic Pentapeptide Inhibits Alpha4Betal Integrin-mediated Cell Adhesion”, J. Bioi. Chem. 268 (27): 20 352-59 (1993), és a PCT/US91/04862 sz. nemzetközi közzététel]. A pentapeptid alapja a fibronektinből származó Arg-Gly-Asp tripeptidszekvencia, amely néhány extracelluláris mátrixfehérje felismerőhelyének általános motívumaként volt ismert. A VLA-4-inhibitorokra példákat tesznek közzé Adams és munkatársai [Adams és munkatársai, „Cell Adhesion Inhibitors”, PCT US97/13013 sz. nemzetközi szabadalmi leírás], ahol sejtadhéziót gátló aktivitással rendelkező, béta-aminosavakat tartalmazó lineáris peptidvegyületek leírása található. A WO94/15958 sz. és a W092/00995 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentésben sejtadhéziót gátló aktivitással rendelkező ciklikus peptidés peptidomimetikus vegyületek leírása található. A WO93/08823 sz. és a WO92/08464 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentésben guanldinil-, karbamid- és tiolkarbamid-tartalmú, sejtadhéziót gátló aktivitással rendelkező vegyületeket írtak le. Az 5.260.277 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat sejtadhéziót gátló aktivitással rendelkező, guanidilvegyületeket ír le. A VLA-4 más peptidantagonistáját írják le Jackson, D. Y. és munkatársai [Jackson, D. Y. és munkatársai, „Potent a4p1-peptide antagonists as potential antiinflammatory agents”, J. Med. Chem. 40: 3359 (1997); Shroff, H. és munkatársai, Bői. Med. Chem. Lett., 1: 2495 (1996); az 5.510.332 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, a WO98/53814, a W097/03094, a WO97/02289, a WO96/40781, a WO96/22966, a WO96/20216, a W096/06108, a WO95/15973 sz. nemzetközi közzétételi iratok és mások.]

Az ilyen kis molekulájú hatóanyagokat előállíthatjuk (például 5-20 aminosav hosszúságú) peptidek, félpeptid jellegű vagy nem peptid jellegű szerves vegyületek sokaságának szintetizálásával, és ezt követően a vegyületek megfelelő VLA-1/kollagén vagy VLA-4/VCAM-1 kölcsönhatást gátló képességének szkrínelésével [lásd általában a 4.833.092 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot; Scott és Smith, „Searching fór Peptide Ligands with an Epitope Library”, Science 249:386-90 (1990), és Devlin és munkatársai, „Random PeptideLibraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules”, Science 249:404-407 (1990)].

B. Integrin elleni antitesthomológok előállítására szolgáló eljárások

A monoklonális antitestek, többek között az integrin elleni monoklonális antitestek előállítására szolgáló technológia jól ismert [lásd például Mendrick és munkatársai, Láb. Invest. 72: 367-375 (1995) (mAb-k, egéreredetű anti-aipi-hez és antl-a2p 1-hez); Sonnenberg és munkatársai, J. Bioi. Chem. 262: 10 376-10 383 (1987) (mAb-k, egéreredetű anti-αββ 1-hez); Yao és munkatársai, J. Cell. Sci. 109: 3139-50 (1996) (mAb-k, egéreredetű anti-a7pi-hez); Hemler és munkatársai, J.

Immunoi. 132: 3011-8 (1984) (mAb-k, humán eredetű αΐβΐ-hez); Pischler és munkatársai, J. Immunoi. 738:226-33 (1987) (mAb-k, humán eredetű a2pi-hez); Wayner és munkatársai, J. Cell. Bioi. 107: 1881-91 (1988) (mAb-k, humán eredetű α3β1-ίιβζ); Hemler és munkatársai, J. Bioi. Chem. 262: 11 478-85 (1987) (mAb-k, humán eredetű a4pi-hez); Wayner és munkatársai, J. Cell. Bioi. 107: 1881-91 (1988) (mAb-k, humán eredetű a5p1-hez); Sonnenberg és munkatársai, J. Bioi. Chem. 262: 10 376-10 383 (1987) (mAb-k, humán eredetű αθβΐ-hez); Wang, A. és munkatársai, Am. Respir. Cell. Mól. Bioi. 75: 664-672 (1996) (mAb-k, humán eredetű α9β 1-hez); Davies és munkatársai, J. Cell. Bioi. 709: 1817-26 (1989) (mAb-k, humán eredetű aVpi-hez); Sanchez-Madrid és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7489-93 (1982) (mAb-k, humán eredetű aLp2-höz); Diamond és munkatársai, J. Cell. Bioi. 720: 1031-43 (1993) (mAb-k, humán eredetű αΜβ2höz); Stacker és munkatársai, J. Immunoi. 146:648-55 (1991) (mAb-k, humán eredetű aXp2-höz); Van dér Vieren és munkatársai, Immunity 3:683-90 (1995) (mAb-k, humán eredetű aDp2-höz); Bennett és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2417-21 (1983) (mAb-k, humán eredetű allbp3-hoz); Hessle és munkatársai, Differentiation 26:49-54 (1984) (mAb-k, humán eredetű a6p4-hez); Weinacker és munkatársai, J. Bioi. Chem. 269:6940-8 (1994) (mAb-k, humán eredetű aVp5-höz); Weinacker és munkatársai, J. Bioi. Chem. 269: 6940-8 (1994) (mAb-k, humán eredetű aVp6-hoz); Cerf-Bensussan és munkatársai, Eur. J. Immunoi. 22: 273-7 (1992) (mAb-k, humán eredetű aEp7-hez); Nishimura és munkatársai, J. Bioi. Chem. 269: 28 708-15 (1994) (mAb-k, humán eredetű aVp8-hoz); Bossy és munkatársai, EMBO J. 70: 2375-85 (1991) (poliklonális antiszérum humán eredetű αββΐ-hez); Camper és munkatársai, J. Bioi. Chem. 273:20 383-20 389 (1998) (poliklonális antiszérum humán eredetű αΐθβΐ-hez)].

A találmány szerinti megoldásban alkalmazandó előnyös integrinantagonista expresszálható intakt vagy rövidített genomi vagy cDNS-ből vagy szintetikus DNSekből prokarióta- vagy eukariótaeredetű gazdasejtekben. A dimer fehérjék izolálhatóak a tenyészközegből és/vagy a „refolding” és a dimerizáció végrehajtható in vitro biológiailag aktív összetevőkből kiindulva. Heterodimerek kialakíthatóak in vitro különálló, elkülönülő polipeptidláncok kombinálásával. Alternatív módon heterodimerek kialakíthatóak egyetlen sejtben különálló, elkülönülő polipeptidláncokat kódoló nukleinsavak koexpresszálása által. Lásd például a WO9309229 sz. nemzetközi közzétételi iratot és az 5.411.41 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást, amelyekben néhány példaként szolgáló rekombináns heterodimer fehérjetermelési előirat található. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható, előnyös gazdasejtek többek között, de nem kizárólagosan, prokarióták, beleértve az E. colit, vagy eukarióták, többek között gombák, Saccharomyces, rovarsejtek, emlőseredetű sejtek, mint például a CHO-, a COS- vagy a SSC-sejtek. Szakember számára nyilvánvaló, hogy alkalmazhatóak eredményesen más gazdasejtek is.

HU 226 383 Β1

Példaként említjük, hogy VLA-4 elleni antitestek azonosíthatóak VLA-4-et expresszáló sejtek 1251-vel jelölt lizátumaiból immunprecipitációval [lásd SanchezMadrid és munkatársai, Eur. J. Immunoi. 16: 1343-1349 (1986), és Hemler és munkatársai, J. Bioi. Chem. 262:11 478-11 485 (1987)]. VLA-4 elleni antitestek azonosíthatóak flow citometria alkalmazásával, például feltételezhetően VLA-4-et felismerő antitesttel inkubált Ramos-sejtek fluoreszcenciafestődésének mérésével [lásd Elices és munkatársai, Cell 60: 577-584 (1990)]. A hibridómasejtek előállításában alkalmazott limfocitákat jellemző módon olyan, immunizált állatokból izolálják, amelyek széruma az ilyen szkrínelési mérési eljárások alkalmazásával pozitívnak bizonyult VLA-4-antitestek jelenlétére.

Jellemző módon az immortalizált sejtvonal (például mielóma-sejtvonal) a limfocitákkal azonos emlősfajból származik. Előnyös immortalizált sejtvonalak az egéreredetű mielóma-sejtvonalak, amelyek érzékenyek hipoxantint, aminopterint és timidint tartalmazó tenyészközegre (,,HAT”-tenyészközeg). Jellemző módon HATra érzékeny, egéreredetű mielómasejteket egéreredetű splenocitákkal fuzionáltatunk 1500-as molekulatömegű polietilénglikol („PEG-1500”) alkalmazásával. A fúzió eredményeképpen kapott hibridómasejteket HAT-lenyészközeggel szelektáljuk, amely elöli a nem fuzionált és nem produktívan fuzionált mielómasejteket (a nem fuzionált splenociták elpusztulnak néhány nap múlva, mivel nem transzformáltak). A kívánt antitestet termelő hibridómákat a hibridómatenyészet felülúszóinak szkrínelésével detektáljuk. Például a VLA-4-antitestek termelése céljából előállított hibridómákat úgy szkrínelhetjük, hogy a hibridómatenyészet felülúszóit teszteljük rekombináns alfa-4-alegységet expresszáló sejtvonalhoz való kötődési képességgel rendelkező szekretált antitestekre (lásd például Elices és munkatársai, fent).

Olyan VLA-4-antitestek előállítása céljából, amelyek intakt immunglobulinok, az ilyen szkrínelési mérési eljárásokban pozitív hibridómasejteket tenyészközegben tenyésztjük olyan körülmények között és annyi ideig, amely megfelelő ahhoz, hogy a hibridómasejtek a monoklonális antitesteket a tenyészközegbe szekretálják. Jól ismertek azok a szövettenyésztési technikák és tenyészközegek, amelyek alkalmasak hibridómasejtek céljaira. A kondicionált hibridómatenyészet-felülúszó összegyűjthető, és a VLA-4 elleni antitestek adott esetben további tisztításnak vethetőek alá jól ismert eljárások alkalmazásával.

Alternatív módon a kívánt antitest előállítható úgy, hogy a hibridómasejteket egy nem immunizált egér peritoneális üregébe injektáljuk. A hibridómasejtek a peritoneális üregben proliféráinak, szekretálják az antitestet, amely ascites folyadékként akkumulálódik. Az antitest összegyűjthető úgy, hogy az ascites folyadékot a peritoneális üregből fecskendővel eltávolítjuk.

Korábban leírtak néhány egéreredetű VLA-4 elleni monoklonális antitestet [lásd például Sanchez-Madrid és munkatársai (1986), fentebb; Hemler és munkatársai (1987), fentebb; Pulido és munkatársai, J. Bioi. Chem. 266(16):10 241-10 245 (1991); Issekutz és

Wykretwicz, J. Immunoi. 147:109 (1991) (Ta-2 mAb)]. Ezek a VLA-4 alfa- és/vagy β-láncának felismerésére képes, VLA-4 elleni monoklonális antitestek, és más, VLA-4 elleni antitestek (például a Biogen, Inc. 5.888.507 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irata, és az itt idézett hivatkozások) alkalmazhatóak a találmány szerinti kezelésre szolgáló eljárásokban történő alkalmazásra. Előnyösek azok a VLA-4 elleni antitestek, amelyek a VLA-4-alfa4-lánc VCAM-1-hez és fibronektin ligandumokhoz történő kötésében szerepet játszó epitópjait ismeri fel (azaz az olyan antitestek, amelyek a VLA-hoz a ligandumfelismerésben szerepet játszó helyre kötődnek és blokkolják a VCAM-1 és a fibronektin kötését). Az ilyen antitesteket B-specifikus antitestekként (B1 vagy B2) definiáljuk [Pulido és munkatársai (1991), fentebb] és ezek szintén a találmány tárgyát képező VLA-4 elleni antitestek.

Más előnyös kötőanyag a teljes mértékben humán eredetű, VLA-4 elleni monoklonális antitesthomológok, amelyek blokkolhatják vagy burkolhatják a VLA-4-iigandumokat a találmány szerinti eljárásban alkalmazva. Intakt formájukban ezek előállíthatóak in vitro serkentett („prímed”) splenociták alkalmazásával [Boerner és munkatársai, J. Immunoi. 147:86-95 (1991)]. Alternatív módon ezek előállíthatóak repertoár-klónozási eljárással [a Persson és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2432-2436 (1991), vagy Huang és Stollar, J. Immunoi. Methods 141: 227-236 (1991) által leírtak szerint]. Az 5.798.230 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat [(aug. 25. 1998) „Process of humán monoclonal antibodies and their use”] a humán, monoklonális antitestek humán eredetű B-sejtekből történő előállítását írja le. Az eljárás szerint humán eredetű, antitesttermelő B-sejteket Epstein-Barr-v\russai, vagy annak Epstein-Barr-víws 2. nukleáris antigént (EBNA2) expresszáló származékával történő fertőzéssel immortalizálnak. Az EBNA2-funkciót, amely az immortalizációhoz szükséges, ezt követően „kikapcsolják”, ez az antitesttermelés növekedését eredményezi.

A teljes mértékben humán eredetű antitestek termelésére szolgáló másik eljárás [Az 5.789.650 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (aug. 4, (1998) „Transgenic non-human animals fór producing heterologous antibodies)] olyan, transzgenikus, heterológ antitestek előállítására alkalmas, embertől eltérő állatokat ír le, amelyek inaktivált, endogén immunglobulingénekkel rendelkeznek. Az endogén immunglobulingének hatását endogén immunglobulinok elleni antiszenz polinukleotidok és/vagy antiszérum alkalmazásával fojtják el. Immunglobulingének által kódolt heterológ antitestek normális esetben nem találhatóak meg az adott, embertől eltérő állatfajban. Nem átrendeződött, heterológ, humán eredetű immunglobulin nehéz láncok szekvenciáit tartalmazó, egy vagy több transzgént juttatunk be embertől eltérő állatba, ezáltal olyan transzgenikus állatot létrehozva, amely képes a transzgenikus immunglobulinszekvenciák funkcionális átrendezésére, és a humán eredetű immunglobulingének által kódolt, különböző izotípusú antitestek repertoárjának termelésére. Az ilyen heterológ, humán antiteste11

HU 226 383 Β1 két olyan B-sejtek termelik, amelyeket ezután immortalizáltak, például immortalizáló sejtvonallal, mint például mielómával történő fúzió által, vagy az ilyen B-sejteket más eljárásokkal manipulálva, teljes mértékben humán eredetű, heterológ, monoklonális antitesthomológ termelésére alkalmas, stabil sejtvonalat alapítása céljából.

Nagy, nem immunizált humán eredetű lág-displaykönyvtárak szintén alkalmazhatóak olyan, nagy affinitású antitestek izolálására, amelyek standard fágtechnológiával [Vaughan és munkatársai (1996)], humán terápiás célokra kifejleszthetőek.

Egy másik, előnyös, a találmány szerinti eljárásban alkalmazható kötőanyag a humanizált, rekombináns antitesthomológ, amely rendelkezik integrin elleni specifitással. Valódi „kiméraantitestek” (ahol a teljes konstans régió és a teljes variábilis régió különböző forrásból származik) előállítására szolgáló, korai (régi) eljárásokat követve az előállítás egy új megközelítését írták le (Winter és munkatársai), ahol antitesteket úgy változtattak meg, hogy egy adott fajból származó antitest komplementaritást meghatározó régiói (CDR-ek) más fajból származó régióval vannak szubsztituálva (adott variábilis régión belül). Ez az eljárás alkalmazható például arra, hogy lg variábilis nehéz lánc és könnyű lánc doménja CDR-jeit szubsztituáljuk egéreredetű variábilis régió dómén alternatív CDR-jeivel. Ezek a megváltoztatott Ig-variábilis régiók ezt követően kombinálhatóak humán eredetű Ig-konstansrégióval olyan antitestek létrehozása céljából, amelyek összetételükben teljes mértékben humán eredetűek, a szubsztituált, egéreredetű CDR-ek kivételével. Az ilyen CDR-szubsztituált antitestek előre láthatóan kisebb valószínűséggel váltanak ki immunválaszt emberben valódi kiméraantitestekhez viszonyítva, mivel a CDR-szubsztituált antitestek számottevően kevesebb, embertől eltérő összetevőt tartalmaznak. A monoklonális antitestek CDRgrafting (átültetés) humanizálására szolgáló eljárást reshapingnek (újjáalakításnak) nevezték el.

Jellemző módon egéreredetű antitest komplementaritást meghatározó régióit (CDR-eket) ültetik át humán eredetű antitest megfelelő régióira, mivel az egéreredetű antitest CDR-jei (három az antitest nehéz láncokon, három a könnyű láncokon) kötődnek specifikus antigénhez. A CDR-ek transzplantációját genetikai műveletek végrehajtásával érjük el, ahol a CDR DNSszekvenciáit egéreredetű nehéz lánc és könnyű lánc variábilis régiószegmensek (V) klónozásával határozzuk meg, és ezután ezeket megfelelő, humán eredetű V-régiókra visszük át helyspecifikus mutagenezis által. Az eljárás végső stádiumában a megfelelő izotípusú (általában a CH esetében gamma-l, és a CL esetében kappa), humán eredetű konstansrégió-génszegmenst adjuk hozzá, és ezután a humanizált nehéz lánc és könnyű lánc géneket koexpresszáljuk emlőseredetű sejtekben szolubilizált, humanizált antitest előállítása céljából.

A CDR-ek humán eredetű antitestre történő átvitele az eredeti, egérből származó antitest antigénkötő tulajdonságait kölcsönzi ennek az antitestnek. Az egéreredetű antitest hat CDR-je a V-régió „vázszerkezet-régióján strukturálisan helyezkedik el. A CDR-átültetés sikerének oka az, hogy az egéreredetű és a humán eredetű vázszerkezet régiói nagyon hasonló 3-dimenziós szerkezettel rendelkezhetnek, a CDR-ek számára hasonló csatlakozási pontokkal. így a CDR-ek kicserélhetőek. Az ilyen humanizált antitesthomológok előállíthatóak a következők irodalmi hivatkozásokban leírt példák szerint: Jones és munkatársai, Natúré 321: 522-525 (1986); Riechmann, Natúré 322: 323-327 (1988); Queen és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10 029 (1989); Orlandi és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833 (1989).

Mindazonáltal feltételezik, hogy a vázszerkezet-régióban néhány aminosav kölcsönhatásba lép a CDRekkel és hatást gyakorol az antigénkötő affinitás egészére. A CDR-ek egéreredetű antitestből történő, rekombináns, humanizált antitest előállítása céljából való közvetlen átvitele, a humán eredetű V-régió vázszerkezet bármely módosítása nélkül gyakran a kötőaffinitás részleges vagy teljes elvesztését eredményezi. Számos esetben kritikusnak látszik az akceptorantitest vázszerkezet-régióban elhelyezkedő aminosavak megváltoztatása kötőaktivitás elérése céljából.

Queen és munkatársai közleményében (1989, fentebb) és a W090/07861 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés (Protein design Labs) olyan humanizált, módosított aminosavakat tartalmazó vázszerkezetű akceptorantitestet tartalmazó antitestek előállítását írja le, ahol egéreredetű Mab (Tac elleni) CDR-jeit humán eredetű immunglobulin-vázszerkezettel és konstans régióval kombinálták. Egy megoldást mutattak be a kötési affinitás elvesztésének problémájára, amely gyakran a CDR közvetlen, a humán eredetű V-vázszerkezet aminosavak bármely módosítása nélküli átvitele eredménye; az általuk bemutatott megoldás két kulcslépést foglal magában. Először, a humán eredetű V-vázszerkezet-régiót számítógépes analizátorok alkalmazásával választottuk ki az eredeti, egéreredetű antitest, ebben az esetben a Tac elleni Mab V-régió-vázszerkezethez viszonyított optimális fehérjeszekvencia-homológia céljából. A második lépésben az egéreredetű V-régió negyedleges szerkezetét számítógép alkalmazásával modelleztük, azoknak a vázszerkezet-aminosavak megjelenítése céljából, amelyek valószínűleg kölcsönhatásba lépnek az egéreredetű CDR-ekkel, ezeket az egéreredetű aminosavakat a homológ, humán eredetű vázszerkezetre ráillesztjük [lásd még az 5.693.762; az 5.693.761; az 5.585.089 sz. és az 5.530.101 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Protein Design Labs)].

Alkalmazhatunk más megközelítést [Tempest és munkatársai, Biotechnology 9: 266-271 (1991)] és standardként alkalmazhatjuk a NEWM- és a REI-eredetű nehéz és könnyű láncokat „CDR-átültetésre” egéreredetű aminosavak radikális bevitele nélkül. Tempest és munkatársai megközelítésének a NEWM- és a R£/-alapú humanizált antitestek előállítását szolgáló alkalmazásának egyik előnye az, hogy a NEWM és a REI variábilis régióinak háromdimenziós szerkezete

HU 226 383 Β1 röntgenkrísztallográfiás vizsgálatok eredményeképpen ismert, és így a CDR-ek és a V-régió vázszerkezete aminosavai közötti specifikus kölcsönhatások modellezhetőek.

Az alkalmazott megközelítésre való tekintet nélkül az eddig előállított kezdeti, humanizált antitesthomológok példái azt mutatták, hogy ez nem célravezető eljárás. Azonban még annak elismerésével, hogy az ilyen vázszerkezeti változtatások szükségesek lehetnek, nem lehetséges a technika jelenlegi állása szerint annak előrejelzése, hogy melyik vázszerkezeti aminosavak megváltoztatása szükséges (ha egyáltalán szükséges) ahhoz, hogy a kívánt specifitással rendelkező, humanizált, rekombináns antitestet kapjuk. Az eddigi eredmények azt jelzik, hogy a specifitás és/vagy az affinitás megőrzéséhez szükséges változtatások a legtöbb esetben adott antitest esetében egyediek, és egy másik antitest humanizálása alapján előre nem kiszámíthatóak.

A találmány szerinti megoldásban alkalmazható, meghatározott, alfa-4-alegységet tartalmazó integrinantagonlsták többek között az olyan, kiméra és humanizált rekombináns, B-epitóp-specifitással rendelkező antitesthomológok (azaz intakt immunglobulinok és ezek részei), amelyeket az 5.932.214 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban írtak le és annak alapján állítottak elő (ΗΡί/2-mab). A kiméra (egéreredetű variábilis lánc és humán eredetű konstans lánc) és humanizált, integrin elleni antitesthomológok előállítására szolgáló kiindulási anyag lehet a korábban leírtak szerint egéreredetű, monoklonális, integrin elleni antitest, kereskedelmi forgalomban kapható, monoklonális, integrin elleni antitest (például HP2/1, Amae International, Inc., Westbrook, Maine), vagy az itt megadott kitanítással összhangban előállított monoklonális integrin elleni antitest. Más, előnyös, humanizált, VLA-4 elleni antitesthomológokat ír le a PCT/US95/01219 sz. nemzetközi közzétételi irat (Athena Neurosciences, Inc., 1995. júl. 27) és az 5.840.299 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (amelyre úgy hivatkozunk, mintha teljes terjedelmében beépítettük volna a leírásba, és a kitanítás részét képezik).

Ezek a humanizált, VLA-4 elleni antitestek humanizált könnyű láncot és humanizált nehéz láncot tartalmaznak. A humanizált könnyű lánc három komplementaritást meghatározó régiót tartalmaz (CDR1, CDR2 és CDR3), amelyek aminosavszekvenciái az egéreredetű, 21-6 immunglobulin könnyű lánc megfelelő komplementaritást meghatározó régiójából származnak, és humán eredetű, kappa-könnyű lánc eredetű variábilis vázszerkezetrégió-szekvenciákból származó variábilis könnyű lánc vázszerkezetet, kivéve legalább az egéreredetű, 21-6 immunglobulin könnyű lánc variábilis könnyű lánc vázszerkezet megfelelő pozíciójában található, azonos aminosavak által elfoglalt pozíciót. A humanizált nehéz lánc három komplementaritást meghatározó régiót tartalmaz (CDR1, CDR2 és CDR3), amelyek aminosavszekvenciái szekvenciái az egéreredetű, 21-6 immunglobulin nehéz lánc megfelelő komplementaritást meghatározó régiójából származnak, és humán eredetű nehéz lánc variábilis régió vázszerkezetéből származó vázszerkezetrégió-szekvenciákat, kivéve legalább egy pozíciót, azt az aminosavpozíciót, amelyet az egéreredetű, 21-6 immunglobulin nehéz lánc variábilis régió vázszerkezet megfelelő aminosava foglal el.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazhatóak olyan antagonisták, amelyeket alfa-4-alegységet tartalmazó integrinek elleni antitesteket kódoló nukleinsavszekvenciákkal „stringent („szigorú”) körülmények között hibridizáló nukleinsav kódol. Például a találmány szerinti antagonista lehet olyan fehérje, amely nukleinsava erősen „stringent” körülmények között hibridizál az 5.840.299 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban található 6. táblázat nukleinsavszekvenciái, vagy az azokkal komplementer szekvenciák közül eggyel vagy többel. Az antagonisták szintén lehetnek olyan fehérjék, amelyek nukleinsava erősen „stringent körülmények között hibridizál az 5.932.214 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat 2. azonosító számú vagy 4. azonosító számú szekvenciáit kódoló nukleinsavval. Ráadásul az antagonisták lehetnek olyan fehérjék is, amelyek nukleinsava erősen „stringent körülmények között hibridizál az ATCC CRL 11175 sejtvonal által termelt antitest variábilis doménját kódoló nukleinsavval.

Alternatív módon a találmány szerinti antagonista lehet olyan fehérje, amely nukleinsava mérsékelten „stringent” körülmények között hibridizál az 5.840.299 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban található 6. táblázat nukleinsavszekvenciái, vagy az azokkal komplementer szekvenciák közül eggyel vagy többel. Az antagonisták szintén lehetnek olyan fehérjék, amelyek nukleinsava mérsékelten „stringent” körülmények között hibridizál az ATCC CRL 11175 sejtvonal által termelt antitest variábilis doménját kódoló nukleinsavval.

C. Fragmensek és analógok előállítása

Izolált alfa-4 integrinantagonisták fragmensei (például az itt leírt antitesthomológok fragmensei) hatékonyan előállíthatóak rekombináns eljárások alkalmazásával, proteolitikus emésztéssel, vagy a technikában ismert eljárásokat alkalmazva kémiai szintézissel is. Rekombináns eljárásokban polipeptid internális vagy terminális fragmense előállítható az izolált, sündisznóeredetű polipeptidet kódoló DNS-szekvencia egyik végéről (terminális fragmens céljára), vagy mindkét végéről történő, (internális fragmens céljára) egy vagy több nukleotid eltávolításával. A mutagenizált DNS expressziója polipeptidfragmenseket eredményez. A „véghasító” endonukleázokkal történő emésztés szintén fragmensek sorát kódoló DNS-eket állít elő. Fehérjefragmenseket kódoló DNS-ek előállíthatóak random hasítással, restrikciós emésztéssel vagy a kettő kombinálásával. Fehérjefragmensek előállíthatóak közvetlenül intakt fehérjékből. Peptidek hasíthatóak specifikusan proteolitikus enzimekkel, többek között, de nem kizárólag plazminnal, trombinnal, tripszinnel, kimotripszinnel vagy pepszinnel. A felsorolt enzimek mindegyike specifikus az általuk támadott peptidkötés típusára. A trip13

HU 226 383 Β1 szín olyan peptidkötés hidrolízisét katalizálja, amelyben a karbonilcsoport bázikus aminosav, rendszerint arginin vagy lizin. A pepszin és a kimotripszin aromás aminosavak, mint például a triptofán, tirozin és a fenilalanin utáni peptidkötések hidrolízisét katalizálja. Hasított fehérjefragmensek alternatív készletét állítjuk elő úgy, hogy megakadályozzuk a proteolitikus enzimekre érzékeny helyen történő hasítást. Például lizin ε-aminocsoportjának etil-fluoro-tioacetáttal enyhén bázikus oldatban végbemenő reakciója olyan, blokkolt aminocsoportokat eredményez, amelyekhez viszonyított szomszédos peptidkötés többé nem érzékeny a tripszines hidrolízisre. A fehérjék módosíthatóak úgy, hogy proteolitikus enzimekre érzékeny peptidkötést hozzunk létre. Például a ciszteinek β-halo-etil-aminokkal (etilamin β-halogenidjeivel) történő alkilálása olyan peptidkötéseket eredményez, amelyeket a tripszin hidrolizál [Lindey, Natúré 178: 647 (1956)]. Ráadásul alkalmazhatunk a peptidláncot specifikus aminosavaknál hasító kémiai reagenseket. Például a cián-bromid a peptideket metionincsoportoknál hasítja [Gross és Witkip, J. Am. Chem. Soc. 83:1510 (1961)]. így a fehérjéket különböző módosítók, proteolitikus enzimek és/vagy kémiai reagensek kombinációjával kezelve a fehérjék a kívánt hosszúságú, nem átfedő, vagy a kívánt hosszúságú, átfedőfragmensekre bonthatóak.

A fragmensek előáll íthatóak kémiai szintézissel, a technikában ismert eljárások, mint például a Merrifieldféle szilárd fázisú, kémiai F-moc- vagy f-Soc-eljárás alkalmazásával [Merrifield, Recent Progress in Hormoné Research 23:451 (1967)].

A technika korábbi állása szerinti eljárások olyan példáit ismertetjük az alábbiakban, amelyek lehetővé teszik fragmensek előállítását és tesztelését. Ilyen, vagy ezekkel analóg eljárások alkalmazhatóak izolált alfa-4-integrinantagonisták olyan fragmensei és analógjai előállítására és szkrínelésére, amelyek kimutathatóan rendelkeznek biológiai aktivitással. A IV. részben és a Példáknál olyan, példaként szolgáló eljárás található, amely annak tesztelésére szolgál, hogy az alfa-4-integrinantagonisták fragmensei és analógjai rendelkeznek-e biológiai aktivitással.

D. Megváltoztatott DNS- és peptideszekvenciák: random eljárások

Fehérje aminosavszekvencla-változata előállítható a fehérjét, vagy adott részét kódoló DNS-szekvencia random mutagenezisével. Alkalmazható eljárás többek között a PCR-mutagenezis és a „telítési” mutagenezis. Random aminosavszekvencia-változatok könyvtára előállítható degenerált oligonukleotidszekvenciák készletének szintézisével is. Adott fehérje aminosavszekvencia-változatainak előállítására szolgáló, megváltoztatott DNS-t és peptideket alkalmazó eljárások a technikában jól ismertek. Az ilyen eljárások alábbiakban következő példái a találmány oltalmi körét nem szűkítik, csak a jellemző technikák illusztrálását szolgálja. A technikában jártas szakember elismeri, hogy ebből a szempontból más eljárások szintén alkalmazhatóak.

PCR-mutagenezis: lásd például Leung és munkatársai, Technique 1:11-15 (1989).

„Telítési” mutagenezis: Egy eljárás általános leírását találjuk Mayers és munkatársai [Mayers és munkatársai, Science 229:242 (1989)].

„Degenerált oligonukleotid mutagenezis: lásd például a Harang, S. A., Tetrahedron 39:3 (1983); Itakura és munkatársai, Ann. Rév. Biochem. 53:323 és Itakura és munkatársai, Recombinant DNA, Proc. 3^rd. Cleveland Symposium on Macromolecules, 273-289 (szerk.: Walton, A. G.; kiad.: Elsevier, Amsterdam, 1981) közleményeket.

E. Megváltoztatott DNS- és peptidszekvenciák: irányított eljárások

A nem random jellegű vagy irányított mutagenezis izolált polipeptidet kódoló polinukleotidszekvenciák specifikus részeiben specifikus szekvenciákat vagy mutációkat nyújt, az izolált polipeptid ismert aminosavszekvenciája aminosavainak delécióit, inszercióit vagy szubsztitúcióit magában foglaló változatok előállítása céljából. A mutációs helyek lehetnek módosítva egyedileg vagy sorozatban, például: 1. először konzervált aminosavakkal helyettesítve, azután az elért eredménytől függően radikálisabb módosítást végrehajtva; 2. a célzott aminosav deletálásával; 3. az adott hellyel szomszédos aminosawal azonos, vagy különböző osztályú aminosavak inszertálása, vagy az 1-3. lehetőségek kombinációja.

Nyilvánvaló módon az ilyen helyspecifikus eljárások adják annak egyik módját, ahogy N-terminális ciszteint (vagy funkcionális ekvivalenst) juttathatunk be adott polipeptidszekvenciába, hidrofób molekularész kapcsolódóhelye biztosítása céljából.

Alanin-scanrimg-mutagenezis: lásd Cunníngham és Wells, Science 244:1081-1085 (1989).

Oligonukleotid által közvetített mutagenezis: Lásd például Adelman és munkatársai, DNA 2:183 (1983).

Kazetta-mutagenezis: lásd Wells és munkatársai, Gene 34:315 (1985).

Kombinatorikus mutagenezis: lásd például Ladner és munkatársai, a WO 88/06630 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentést.

Fág-d/sp/ay-stratégiák: lásd például Marks és munkatársai irodalmi összefoglalóját [Marks és munkatársai, J. Bioi. Chemistry: 267:16 007-16 010 (1992)].

F. Integrinantagonisták más változatai

A változatok az itt leírt, más integrinantagonistáktól különbözhetnek aminosavszekvenciájukban vagy a szekvenciában nem megjelenő módon, vagy mindkettőben. A találmány szerinti, legelőnyösebb polipeptidek olyan, előnyös szekvenciamódosulatok, amelyek magukban foglalják az in vivő vagy in vitro kémiai módosítást (például N-terminális végükön), valamint az acetilálást, metilálást, foszforilálást, amidálást, karboxilálást vagy glikozilálást érintő lehetséges változtatást.

Más analógok, többek között, az olyan fehérjék vagy azok biológiailag aktív fragmensei, amelyek szekvenciái egy vagy több konzervatív aminosavszubsztitú14

HU 226 383 Β1 cióban, vagy egy vagy több nem konzervatív aminosavszubsztitúcióban, vagy az izolált fehérje biológiai aktivitását nem megszüntető delécióban vagy inszercióban különböznek az 5.840.299 sz., az 5.88.507 sz., az 5.932.214 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban (amelyekre úgy hivatkozunk, mintha teljes terjedelmükben beépítettük volna a leírásba, és ezek a kitanítás részét képezik), vagy a PCT US94/00266 sz. nemzetközi szabadalmi leírás található szekvenciáktól. Jellegzetes módon a konzervatív szubsztitúció magában foglalja aminosav más, hasonló jellemzőkkel rendelkező aminosawal történő helyettesítését, mint például a következő csoportokon belüli helyettesítések: valin, alanin és glicin; leucin és izoleucin; aszparaginsav és glutaminsav; aszparagin és glutamin; szerin és treonin; lizin és arginin, és fenil-alanin és tirozin. A nem poláros hidrofób aminosavak csoportja az alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenil-alanin, triptofán és metionin aminosavakat tartalmazza. A poláros, neutrális aminosavak csoportja a glicint, szerint, treonint, ciszteint, tirozint, aszparagint és glutamint tartalmazza. A pozitív töltésű (bázikus) aminosavak az arginin, a lizin és a hisztidin. A negatív töltésű (savas) aminosavak az aszparaginsav és a glutaminsav. A technikában jártas szakember ismer más, konzervatív szubsztitúciókat. Például az alanin aminosav konzervatív módon helyettesíthető a D-alanin, a glicin, a béta-alanin, az L-cisztein és a D-cisztein bármelyikével. A lizint helyettesíthetjük D-lizinnel, argininnel, D-argininnal, homoargininnal, metioninnal, D-metioninnal, ornitinnal, vagy D-ornitinnal.

A találmány szerinti megoldásban alkalmazható más analógok azok, amelyek módosításai növelik a peptid stabilitását. Az ilyen analógok tartalmazhatnak például a peptidszekvenciában egy vagy több nem peptidjellegű kötést (amelyek a peptidkötést helyettesítik). Ilyenek még többek között: a természetes körülmények között előforduló L-aminosavaktól eltérő aminosavakat, mint például D-aminosavakat vagy nem természetes, szintetikus aminosavakat, mint például béta- vagy gamma-aminosavakat és ciklikus analógokat tartalmazó analógok. Az L-aminosavak helyett D-aminosavaknak az izolált, sündisznó-eredetű polipeptidbe történő beillesztése megnövelheti a proteázokkal szembeni ellenállást (lásd fentebb, az 5.219.990 amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást).

Az előnyös antitesthomológok magukban foglalják a PS/2-antitest (lásd a Példát) aminosavszekvenciájával legalább 60%-os, 80%-os, 90%-os, 95%-os, 98%-os vagy 99%-os homológiát mutató aminosavszekvenciát, vagy az 5.840.299 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (15. azonosító számú szekvencia: könnyű lánc variábilis régió, vagy a 17. azonosító számú szekvencia: nehéz lánc variábilis régió) leírt aminosavszekvenciájával, vagy az 5.932.214 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírt aminosavszekvenciával (2. és 4. azonosító számú szekvencia), és a WO94/16094 sz. közzétett szabadalmi bejelentésben leírt aminosavszekvenciákkal (ezeket a szekvenciák a letétbe helyezett, ATCC CRL 11175 sz. sejtvonalban található VLA-4 elleni antitestben találhatóak) legalább 60%-os, 80%-os, 90%-os, 95%-os,

98%-os vagy 99%-os homológiát mutató aminosavszekvenciát.

G. Polimer konjugátumformák

A találmány széles oltalmi körén belül alkalmazható egyedülálló (egyetlen) polimermolekula alfa-1- vagy alfa-4-integrinantagonistával történő konjugáció céljára, azonban a találmány szerinti megoldásban egynél több polimermolekulát is kapcsolhatunk. A találmány szerinti alfa-4-integrinantagonista készítmény alkalmazható in vivő és in vitro alkalmazásokban is. Ráadásul nyilvánvaló, hogy a konjugáló polimerként alkalmazhatunk bármely csoportot, molekularészt, vagy más, konjugált molekulaféleséget, a végső alkalmazási célnak megfelelően. Például egyes alkalmazások esetén hasznos lehet, ha a polimerhez olyan funkcionális molekularészt kapcsolunk kovalensen, amely UV-degradáció elleni rezisztenciát, antioxidáns tulajdonságot vagy a polimerre jellemző más tulajdonságot ad a polimernek. További példaként említve egyes alkalmazásokban előnyös lehet, ha a polimert „funkcionalizáljuk” úgy, hogy, reaktíwá tesszük, és így alkalmassá válik arra, hogy keresztkötést alakítson ki drogmolekulával, a teljes konjugált anyag különböző tulajdonságainak vagy a teljes konjugált anyag jellemvonásainak erősítése céljából. Ennek megfelelően a polimer tartalmazhat bármely funkciós csoportot, ismétlődő csoportot, kötést, vagy más összetevőt, amely nem zárja ki a konjugált alfa-4-integrinantagonista-készítmény hatásosságát az alkalmazási cél szempontjából. A találmány további tárgyai és előnyei még nyilvánvalóbbak a következő feltárás és a csatolt szabadalmi igénypontok alapján.

Illusztrálásként említhető, az említett, megkívánt jellemzők elérését szolgáló, jól alkalmazható polimerek leírását adjuk az alábbi, példaként szolgáló reakcióvázlatokban. Kovalens módon kötött antagonista-polimerkonjugátumokban a polimert „funkcionalizálhatjuk, azután az antagonista szabad aminosavhoz (amonisavakhoz) kapcsolhatjuk labilis kötés kialakítása céljából.

Alfa-4- vagy alfa-1-alegységet tartalmazó integrinek antagonistáit a legelőnyösebben a polimer terminális reaktív csoportján keresztül konjugálhatjuk, azonban a konjugátumokat leágaztathatjuk nem terminális reaktív csoportokból is. A reaktív csoportokkal rendelkező polimert „aktivált polimer”-nek nevezzük. A reaktív csoport szelektív módon reagál az antagonista molekula szabad aminocsoportjaival, vagy az antagonista más reaktív csoportjaival. Az aktivált polimert (polimereket) úgy reagáltatjuk, hogy kapcsolódás jöhessen létre az integrinantagonista bármely, elérhető aminocsoportjával, mint például a lizinek alfa-aminocsoportjával vagy epszilon-aminocsoportjával. Az alfa-4-integrinantagonista szabad karboxilcsoportjai, alkalmas módon aktivált karbonil-, hidroxil-, guanidilcsoportok, oxidált szénhidrátcsoportjai és merkaptocsoportjai (ha rendelkezésre állnak) szintén alkalmazhatóak kapcsolódási helyként.

A polimer az integrinantagonista-molekulán bárhova kapcsolható, azonban az integrinantagonistához

HU 226 383 Β1 való (különösen a fehérjetermészetűek esetében) polimerkapcsoláshoz előnyös hely az integrinantagonista N-terminálisa. Másodlagos hely (helyek) a C-terminálishoz közeli helyek, és a kapcsolódás cukorcsoportokon át történik (ha vannak). Igy a találmány tárgyát képezi: 1. alfa-1- és alfa-4-integrinantagonisták N-terminálisan kapcsolt polimerkonjugátumai; 2. alfa-1- és alfa-4-integrinantagonisták C-terminálisan kapcsolt polimerkonjugátumai; 3. cukron keresztül kapcsolt konjugátumok; 4., valamint alfa-1- és alfa-4-integrinantagonisták N-, C- és cukorkötött polimerkonjugátumai.

Az alkalmazott aktivált polimerkoncentráció általában az antagonista koncentrációjától függően 1,0 mól aktivált polimer/mol antagonista koncentrációtól körülbelül 10 mól aktivált polimer/mol antagonista koncentrációig. A végső mennyiséget a reakció terjedelmének maximalizálása és a termék nemspecifikus módosítása közötti egyensúly szabja meg, és ugyanakkor meghatározva az optimális aktivitást fenntartó kémiai utakat, és ha lehetséges, optimalizálva az antagonista felezési idejét. Előnyösen az antagonista biológiai aktivitásának körülbelül legalább az 50%-át megtartjuk, és a legelőnyösebben a 100%-át megtartjuk.

A reakciók végrehajthatóak bármely alkalmas, a technika inért polimerek biológiailag aktív anyagokkal történő reagáltatását szolgáló eljárása alkalmazásával. Általában az eljárás tartalmazza aktivált polimer (amely tartalmazhat legalább egy terminális hidroxilcsoportot) előállítását, azután az aktivált polimer antagonistával történő reagáltatását, formulázásra alkalmas oldható fehérje előállítása céljából. A fenti módosítási reakció végrehajtható néhány olyan eljárás szerint, amely egy vagy több lépést tartalmazhat.

A fentiekben említettek szerint a találmány bizonyos megvalósítási módjai az integrinantagonista N-terminális végét alkalmazza kapcsolóként a polimerhez. Hozzáférhetőek hagyományos eljárások, amelyek alkalmasak szelektív módon N-terminálisan módosított alfa-1- vagy alfa-4-integrinantagonisták előállítására. Az egyik eljárásra példaként reduktív alkilálási eljárást említünk, amely az alkalmas integrinantagonistán a származékképzéshez rendelkezésre álló, különböző típusú elsődleges aminocsoportok különböző reakciókészségét (a lizin epszilon-aminocsoportjai, szemben a metionin N-terminális aminocsoportjaival) használja ki. Alkalmas szelekciós körülmények között alkalmas integrinantagonista N-terminálisan, karbonilcsoportot tartalmazó polimerrel történő, alapvetően szelektív származékképzés végrehajtható. A reakciót olyan pH-n hajtjuk végre, amely lehetővé teszi azt, hogy kihasználjuk a lizincsoportok epszilon-aminocsoportjai és az integrinantagonista N-terminális alfa-aminosava közötti pKa-különbségeket. A szakember számára az ilyen kémiai reakciók jól ismertek.

Polialkilénglikol, mint például PEG alfa-1- vagy alfa4-integrinantagonisták (például fehérjék) C-terminálisára történő célba juttatásra szolgáló stratégia lehet a polimer-molekularész célba juttatására alkalmazott hely kémiai kapcsolása, vagy genetikai műveletekkel történő létrehozása. Például fehérje C-terminálisán, vagy ahhoz közel Cys beépítése specifikus módosítást tesz lehetővé, a technikában ismertek szerint maleimid, vinil-szulfon vagy haloacetát által aktivált polialkilénglikol (például PEG) származéka alkalmazásával. E származékok specifikusan alkalmazhatóak a művileg bejuttatott cisztein módosítására, az említett reagensek Cys iránti erős szelektivitásának köszönhetően. Más stratégiák, mint célba vehető hisztidintoldalék [Fancy és munkatársai, Chem. & Bioi. 3; 551 (1996)] vagy további glikozilációs hely fehérjébe történő beépítése a találmány szerinti integrinantagonista C-terminálisa módosításának más alternatíváit reprezentálják.

Jól ismertek azok az eljárások is, amelyek a cukrok, mint kémiai módosítások helyeinek megcélzására szolgálnak, fgy valószínű, hogy polialkilénglikolpolimer direkt módon, és specifikusan cukrokhoz (ha egyáltalán jelen vannak) hozzáadható az oxidálással aktivált integrinantagonistához. Például előállítható polietilénglikol-hidrazid, amely aldehidekkel és ketonokkal történő kondenzációval viszonylag stabil hidrazonkötést alakít ki. Ezt a tulajdonságot alkalmazzuk fehérjék oxidált oligoszacharidkötéseken át történő módosításra [lásd Andresz, H. és munkatársai, Makromol. Chem. /79/301 (1978)]. Közelebbről PEG-karboxi-metilhidrazid nitrittel történő kezelése PEG-karboxi-metilazidot ad, amely elektrofilitási szempontból aktív csoport aminocsoportokkal szemben. Ez a reakció alkalmazható polialkilénglikollal módosított fehérjék előállítására is (lásd a 4.101.380 sz. és a 4.179.337 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást).

Alkalmazhatóak a technikában ismert tiolkapcsoló által közvetített kémiai reakciók fehérjék további keresztkötésének lehetővé tételére, multivalens alfa-1vagy alfa-4-integrinantagonista-készítmények kialakítása céljából. Közelebbről előállíthatunk reaktív aldehideket szénhidrátcsoportokon nátrium-perjodáttal, az aldehideken keresztül cisztaminkonjugátumokat kialakítva és a cisztaminokon a tiolcsoportokon keresztkötéseket indukálva [lásd Pepinsky, B. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 266: 18 244-18 249 (1991) és Chen, L. L. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 266: 18 237-18 243 (1991)]. Igy az ilyen típusú kémiai reakciók alkalmasak lehetnek polialkilénglikolpolimerekkel történő módosításra, ahol kapcsolót (linkért) építünk be a cukorba és a polialkilénglikolpolimert kapcsoljuk a linkerhez. Míg az amino-tiol- vagy hidrazidtartalmú kapcsolók lehetővé teszik egyedi polimercsoport hozzáadását, a kapcsoló szerkezete úgy változtatható, hogy több polimert adható és/vagy a polimer integrinantagonistához viszonyított térbeli orientációja megváltozik.

A találmány gyakorlati megvalósítása során C1— C4-alkil-polialkilénglikolok polialkiléncsoportjai, előnyösen az ilyen glikolok polietilénglikol (PEG) vagy poli(oxi)-alkilénglikol-csoportjait előnyösen az adott polimerrendszerbe építjük. így a polimer, amelyhez a fehérjét kapcsoljuk, lehet polietilénglikol (PEG) homopolimerje, vagy polioxi-etilált poliol, feltéve, hogy a polimer szobahőmérsékleten vízben oldható. Az ilyen polimerek nem korlátozó jellegű példái többek között polialkilén-oxid homopolimerek, mint például a PEG vagy

HU 226 383 Β1 polipropilénglikolok, polioxi-etilénezett glikolok, ezek kopolimerjei és blokk-kopolimerjei, feltéve, hogy a blokk-kopolimer vízoldhatósága megmarad. A polioxietilált poliolokra példa többek között a polioxi-etilált glicerin, a polioxi-etilált szorbitol, a polioxi-etilált glükóz, és az ehhez hasonlóak. A polioxi-etilált glicerin gliceringerinc ugyanolyan gerinc, mint amilyen természetes körülmények között előfordul például állatokban és emberben a mono-, di- és trigliceridekben. így ez az elágazás nem feltétlenül lesz idegen közeg a testben.

A polialkilén-oxidok alternatívájaként dextrán, poli(vinil-pirrolidon)-ok, poliakrilamidok, poli(vinil-alkohol)-ok, szénhidrátalapú polimerek és ehhez hasonlók alkalmazhatóak. A szakember elismeri, hogy az előző felsorolás csak az illusztráció célját szolgálja, és azt, hogy az itt leírt tulajdonságokkal rendelkező polimer anyagok a találmány tárgykörébe tartoznak.

Nem szükséges, hogy a polimer adott molekulatömeggel rendelkezzen, azonban előnyösen a molekulatömeg körülbelül 300-100 000, előnyösebben 10 000-40 000. Közelebbről a 20 000-esek, vagy nagyobb méretűek a legjobbak a termék mennyiségének a vese szűrőhatása miatti veszteségének megelőzésében.

A polialkilénglikolszármazékoknak a találmány gyakorlati megvalósításában számos előnyös tulajdonsága van a polimer-intregrinantagonista-konjugátum készítményében, a polialkilénglikolszármazékok következő tulajdonságaival összefüggésben: a vízoldhatóság javítása, ezzel egyidejűleg nem vált ki antigén vagy immunogén jellegű válaszreakciót; nagyfokú biokompatibilitás; a polialkilénglikolszármazékok in vivő biodegradálódásának hiánya; és az élő szervezet kiválasztásának megkönnyítése.

Ráadásul a találmány egy másik szempontja szerint alkalmazhatunk alfa-1- vagy alfa-4-integrinantagonistát, amely kovalens módon van kötve polimerkomponenshez, és a konjugáció hasítható kémiai kötéseket tartalmaz. Ez lehetővé teszi a polimer integrinantagonistáról történő lehasításának időbeni kontrollálását. Az integrinantagonista és a polimer közötti kovalens kötés hasítható kémiai vagy enzimatikus reakcióban. A polimer integrinantagonista termékben elfogadható mértékű aktivitás marad. Ezzel egyidejűleg polietilénglikolrészek vannak jelen a konjugáló polimerben abból a célból, hogy a polimer integrinantagonistát nagy vízoldhatósággal és meghosszabbított keringési kapacitással ruházza fel. E javított tulajdonságok eredményeképpen a találmány tárgyát képezi az aktív polimer-alfa-4-integrinantagonista-fajták közül mindkettő parenterális, nazális és orális bejuttatása, és hidrolitikus hasítás után az integrinantagonisták biológiai hozzáférhetősége per se, in vivő alkalmazásokban.

Meg kell értenünk, hogy az itt leírt reakcióvázlatok csak az illusztrálást szolgálják, és nem korlátozzák a reakciókat és szerkezeteket, amelyek alkalmazhatóak az alfa-1- vagy az alfa-4-integrinantagonisták módosításában, például a parenterális és orális beadást szolgáló oldhatóság, stabilizálás és a sejtmembrán-affinitás elérésében. Az integrinantagonista-konjugátumok aktivitása és stabilitása változtatható néhány módon, különböző molekulatömegű polimert alkalmazva.

A konjugátumok oldhatósága változhat a polimerkészítménybe kevert polietilkénglikolfragmens aránya és mérete változtatásával.

Ili. Az alábbiakban ismertetjük a találmány alkalmazásait.

Az aktív összetevő, amely kombinálható a hordozóanyagokkal egyszeri dózisforma előállítása céljából, mennyisége változik a kezelendő betegtől és a beadás módjától függően. Meg kell értenünk azonban, hogy bármelyik adott személy esetében a specifikus adagolási és kezelési rend számos tényezőtől függ, többek között az alkalmazott specifikus vegyülettől, az életkortól, a testsúlytól, az általános egészségi állapottól, a nemi hovatartozástól, az étrendtől, a kezelés időtartamától, a kiválasztás sebességétől, a hatóanyag-kombinációtól, a kezelőorvos elbírálásától és az adott, kezelendő betegség súlyosságától.

A találmány szerinti kezelési eljárás magában foglalja a találmány szerinti antagonista hatásos mennyisége betegnek történő beadását. A találmány szerinti eljárásban a dózisok hatásos, nem toxikus mennyiségek. A klinikai teszteket alkalmazó szakember képes arra, hogy meghatározza a kezelendő, konkrét esetében az optimális dózist.

Gyógyszerkészítmények

A találmány szerinti eljárásban a találmány szerinti antagonistát beadhatjuk parenterálisan. A „parenterális’' kifejezés magában foglalja a szubkután, az intravénás, az intramuszkuláris, az ízületbe, az ízületi folyadékba, a szegycsontba, a thecába, a májba, a sebbe és a koponyába történő beadást szolgáló injekciós vagy infúziós eljárásokat. A kívánt dózis beadható a betegnek naponta egy vagy két alkalommal intravénásán, orálisan, végbélen át, parenterálisan, intranazálisan, helyileg vagy inhalálással. A kívánt dózist beadható folyamatos intravénás infúzióval.

Az antitesthomológokat előnyösen olyan steril gyógyászati készítményként adjuk be, amely tartalmaz gyógyászatilag elfogadott hordozót, mint például vizet, sóoldatot, foszfáttal pufferolt sóoldatot, szőlőcukrot, glicerint, etanolt és ehhez hasonlókat, vagy ezek kombinációit. A találmány szerinti vegyületek alkalmazhatóak szervetlen vagy szerves savakból vagy bázisokból származó, gyógyászatilag elfogadható sók formájában. Az ilyen savas sók többek között: acetát, adipát, alginát, aszpartát, benzoát, benzil-szulfonát, biszulfát, butirát, citrát, kámforral képzett só, kámfor szulfonsavjával képzett só, ciklopentán-propionát, diglukonát, dodecilszulfát, etánszulfonát, fumarát, gluko-heptanoát, glicero-foszfát, hemiszulfát, heptanoát, hexanoát, hidroklorid, hidrobromid, hidrojodid, 2-hidroxi-etánszulfonát, laktát, malát, metánszulfonát, -2-naftalénszulfonát, nikotinsav sója, oxalát, parmoát, pektinát, perszulfát, 3-fenil-propionát, pikrát, privalát, propionát, szukcinát, tartarát, tiocianát, tozilát és undekanoát. A bázikus sók többek között az ammóniumsók, alkálifémsók, mint

HU 226 383 Β1 például nátrium- és káliumsók, alkáliföldfémsók, mint például kalcium- és magnéziumsók, szerves bázisok sói, mint például diciklohexil-amin-sók, N-metil-Dglukamin sói, trisz(hidroxi-metil)-metil-amin sói és aminosavakkal, például argininnel, lizinnel alkotott sók stb. A bázikus nitrogéntartalmú csoportok kvaterner csoporttá alakíthatóak például alacsony szénatomszámú alkil-halogenidekkel, mint például metil-, etil-, propil- és butil-klorid, -bromid és -jodid; dialkil-szulfátokkal, mint például dimetil, dietil-, dibutil- és diamil-szulfátok, hosszú láncú halogenidekkel, mint például decil-, lauril-, mirisztil- és sztearil-klorid, -bromid- és -jodid, aralkil-halogenidekkel, mint például benzil- és fenetil-bromid és mások. Ezáltal vízben vagy olajban oldható, vagy diszpergálható termékeket kapunk.

A találmány szerinti gyógyászati készítmény tartalmazhatja a találmány szerinti bármely vegyületet, vagy ezek gyógyászatilag elfogadott származékait, bármely, gyógyászatilag elfogadható hordozóval. A találmány szerinti gyógyászati készítményben alkalmazható, gyógyászatilag elfogadható hordozók többek között, de nem kizárólag, ioncserélők, alumínium-oxid, alumínium-sztearát, lecitin, szérumfehérjék, mint például szérumalbumin, pufferanyagok, mint például foszfátok, glicin, szorbinsav, kálium-szorbát, telített növényi zsírsavak részleges gliceridkeverékei, víz, sók vagy elektrolitok, mint például protamin-szulfát, dinátrium-hidrogén-foszfát, nátrium-hidrogén-foszfát, nátrium-klorid, cinksók, kolloid szilícium-dioxid, magnézium-triszilikát, poli(vinil-pirrolidon), cellulózalapú anyagok, polietilénglikol, natrium-karboxi-metil-cellulóz, poliakrilátok, viaszok, polietilén-polioxi-propilén-blokkpolimerek, polietilénglikol és lanolin.

A találmány szerinti megoldásban a gyógyászati készítmény lehet steril injektálható preparátum, például steril injektálható vizes vagy olajod szuszpenzió formájában. Ez a szuszpenzió formulázható a technika állása szerinti eljárásoknak megfelelően, alkalmas diszpergáló vagy nedvesítő hatóanyagok és szuszpendáló hatóanyagok alkalmazásával. A steril, injektálható készítmény lehet nem toxikus, parenterálisan elfogadható hígítóval vagy oldószerrel, például 1,3-butándiollal készült, steril, injektálható oldat vagy szuszpenzió. Az alkalmazható vivőanyagok és oldószerek többek között a víz, a R/'nger-féle oldat és az izotóniás nátrium-kloridoldat. Ráadásul steril, álladó olajakat hagyományosan alkalmaznak oldószerként vagy szuszpendálóközegként. Ebből a célból bármely steril, állandó olaj alkalmazható, többek között a szintetikus mono- vagy digliceridek. Az injektálható preparátumokban alkalmazhatóak zsírsavak, mint például olajsav és glicerinszármazékai, valamint a természetes, gyógyászatilag elfogadott olajok, mint például az olívaolaj vagy ricinusolaj, különösen ezek polioxi-etilált változatai.

A találmány szerinti készítmény beadható orálisan. Ha orálisan adjuk be, akkor alkalmazhatóak bármely orálisan elfogadható dózisformában, többek között, de nem kizárólagosan kapszulában, tablettában, vizes szuszpenziókban vagy oldatokban. Orálisan alkalmazandó tabletták esetében a hagyományosan alkalmazott hordozók többek között a laktóz és a kukoricakeményítő. Jellemző módon alkalmaznak kenőanyagokat, mint például a magnézium-sztearát. Orális beadásnál, kapszula esetében alkalmazható hígítók többek között a laktóz és a szárított kukoricakeményítő. Ha az orális beadáshoz vizes oldat szükséges, az aktív hatóanyagot emulgeáló és szuszpendáló hatóanyagokkal kombináljuk. Adhatóak bizonyos édesítő-, ízesítő- vagy színezőanyagok, ha szükséges.

A találmány szerinti eljárás alkalmazásában különösen azok a készítmények alkalmazhatóak, ahol az antagonista vezikulumokban van formulázva, mint például a liposzómákat tartalmazó készítmények. A liposzómák olyan vezikulumok, amelyeket amfipatikus molekulák, mint például poláros lipidek, például foszfatidilkolinok, etanol-aminok és -szerinek, szfingomielinek, kardiolipinek, plazmalogének, foszfatidsavak és cerebrozidok. Liposzómák képződnek, ha alkalmas amfipatikus molekulákat vízben vagy vizes oldatban duzzasztunk olyan folyadékkristályok kialakítása céljából, amelyek sok, kettős réteggel határolt, vizes anyaggal elválasztott, többrétegű szerkezetekből állnak, (ezeket durva liposzómáknak is nevezzük). A liposzómák egy másik típusát, amely vizes anyagot magába záró, egyszeres kettős rétegből áll, unilamelláris vezikulumnak nevezzük. Ha a vízben oldható anyagok a vizes fázisban vannak a lipidek duzzasztásakor, akkor ezek a lipid kettős rétegek közötti vizes rétegbe záródnak.

Az antagonisták liposzómákkal formulázott formáinak előállítására szolgáló, különösen alkalmas eljárás leírását találjuk az EPA-A-253.619 sz. európai közzétételi iratban, amelyre úgy hivatkozunk, mintha teljes terjedelmükben beépítettük volna a leírásba, és a kitanítás részét képezi. Ebben az eljárásban az aktív hatóanyagokat kapszulázva tartalmazó, egyszeres kettős réteget úgy állítják elő, hogy a lipidkomponenst szerves közegben oldják, a lipidkomponens szerves oldatát nyomás alatt vizes komponensbe injektálják, és a szerves és a vizes komponens nagy sebességű homogenizátorral vagy keverőeszközzel történő, egyidejű keverése mellett, aminek következtében a liposzómák spontán módon kialakulnak. A kapszulázott aktív összetevőt tartalmazó, egyszeres kettős rétegű liposzómák alkalmazhatóak közvetlenül, vagy alkalmazhatóak alkalmas, gyógyászatilag elfogadható hordozóval helyi alkalmazásban. A liposzómák viszkozitása növelhető egy vagy több, alkalmas sűrítőanyag, például xantángumi, hidroxi-propil-cellulóz, hidroxi-propil-metil-cellulóz és ezek keverékei hozzáadásával. A vizes komponens állhat kizárólag vízből, vagy tartalmazhat elektrolitokat, pufferolt rendszereket és más összetevőket, mint például tartósítószereket. Az alkalmazható elektrolitok többek között fémsók, mint például alkálifémek és alkáliföldfémek. Előnyös fémsók a kalcium-klorid, nátrium-klorid és kálium-klorid. Az elektrolitok koncentrációja változóan 0-260 mM, előnyösen 5-160 mM között. A vizes komponenst alkalmas edénybe helyezzük, amelyet homogenizálóhatásnak tehetünk ki a szerves komponens injektálása közben. A két komponenst homogenizálhatjuk az edényben, vagy alternatív módon, a vizes és a

HU 226 383 Β1 szerves komponens injektálható elkülönítve a keverőeszközbe, amely az edényen kívül helyezkedik el. Az utóbbi esetben a liposzómák a keverőeszközben képződnek, és ezután egy másik edénybe visszük át azokat, összegyűjtés céljából.

A szerves komponens alkalmas nem toxikus, gyógyászatilag elfogadható oldószerből, mint például etanol, glicerin, propilénglikol és polietilénglikol, és alkalmas foszfolipidből áll, amely az oldószerben oldódik. Az alkalmazható foszfolipid többek között például lecitin, foszfatidil-kolin, foszfatidil-szerin, foszfatidil-etanolamin, foszfatidil-inozitol, lizofoszfatidil-kolin, és foszfatidil-glicerin. Az ilyen egyéb, lipofil összetevők például többek között a sztearil-amin, foszfatidsav, tokoferol, koleszterin és lanolinextraktumok.

Ráadásul adhatók a szerves komponenshez más összetevők, amelyek megakadályozhatják a foszfolipidek oxidációját. Az ilyen más összetevőkre példák a tokoferol, a butilált hidroxi-anizol, a butilált hidroxi-toluén, az aszkorbil-palmitát és az aszkorbil-oleát. Tartósítószerek, mint például benzoésav, metil-parabén és propil-parabén szintén adható.

A fent leírt készítményeken kívül alkalmazhatóak fedőkötések, például tapaszok, pólyák, kötések, gézpárnák és ehhez hasonlóak, amelyek helyi alkalmazású, a terápiás formulát tartalmazó formulával vannak átitatva.

A találmány szerinti gyógyászati készítmény beadható nazális aeroszollal vagy inhalálással porlasztó alkalmazásával, szárazpor-inhalátorral vagy mérésre alkalmas adagolóval ellátott dózisinhalátorral. Az ilyen készítményeket a technikában a gyógyászati készítmények esetében ismert eljárásoknak megfelelően állítjuk elő, és előáll íthatóak sóoldatban oldott oldatként, benzil-alkohol vagy más alkalmas tartósítószer, alkalmazásával, a biológiai hozzáférhetőség növelése céljából abszorpciógyorsító alkalmazásával, és fluortartalmú szénvegyületek és/vagy más, hagyományos szolubilizáló vagy diszpergáló hatóanyag alkalmazásával.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány szerinti vegyületet tartalmazó készítmény tartalmazhat további hatóanyagot: kortikoszteroidokat, gyulladásellenes anyagokat, immunszuppresszánsokat, antimetabolitokat és immunmodulátorokat. Minden, a fenti osztályokban tartozó specifikus vegyületet kiválaszthatjuk a megfelelő címszó alatt felsoroltak közül a következő kiadványban: „Comprehensive Medicinái Chemistry” 970-986 (1990) kiad., Pergamon Press, Oxford, Anglia, amely feltárásaira úgy hivatkozunk, mintha teljes terjedelmükben beépítettük volna a leírásba, és ezek a kitanítás részét képezik. Ebbe a csoportba sorolunk olyan vegyületeket, mint a teofillin, a szulfalazin és az amino-szalicilátok (gyulladás elleni anyagok); a ciklosporin, az FK-506, a rapamicin (immunszuppresszánsok); a ciklofoszfamid és a metotrexát (antimetabolitok); a szteroidok (inhalálva, orálisan vagy helyileg alkalmazva) és az interferonok (immunmodulátorok).

A találmány szerinti vegyület kívánt hatás kiváltásában hatásos dózisa és dózisaránya számos faktortól függ, mint például az antagonista természete, a kezelendő személy mérete, a kezelés célja, a kezelendő betegség természete, az alkalmazott, specifikus gyógyászati készítmény és a kezelőorvos megítélése.

Az aktív összetevő alkalmazható dózisszintje körülbelül 0,001-100 mg/kg testsúly/nap, előnyösen körülbelül 0,150 mg/kg testsúly/nap. A legelőnyösebben a VLA-4-kötő hatóanyagot, antitestet vagy akár antitestszármazékot 0,1-20 mg/kg testsúly/nap dózisban adjuk be, előnyösen 0,1-10 mg/kg testsúly/nap dózisban, és 1-14 napos intervallumokban. Nem antitest esetén vagy kis molekula jellegű kötőanyag esetében a dózistartomány előnyösen az antitest ilyen mennyiségeinek moláris ekvivalensei közé esik. Előnyösen az antitestkészítményt olyan mennyiségben adjuk be, amely az antitest legalább 1 mg/ml-es plazmaszintjét idézi elő. A dózisoptimalizálást a kötőanyag beadásával, és ezt követően a hatóanyaggal fedett integrinpozitív sejtek mennyiségének a beadás utáni időbeni in vivő változása becslésével hajthatjuk végre.

A beadott hatóanyag jelenlétét in vivő (vagy ex vivő) az egyén sejtjeinek a jelölésére (például fluorokróm) alkalmazott hatóanyaghoz való kötődési képességének hiányával, vagy csökkent képességével detektálhatjuk. Szükséges, hogy az előnyös dózis az integrinpozitív sejtek többségének döntő többségét detektálható módon burkolódását okozza. Előnyösen antiteshomológ esetében a burkoltság 1-14 napos időszakon át fennmarad.

A szakember könnyen tesztelheti, hogy a találmány szerinti antagonista rendelkezik-e a kívánt hatással. A szakember klinikai gyógyulási teszteket (például kimosódási és FACS-szkennelés az antitestkötődésre; az erőltetéses tüdőkapacitás javulása) alkalmaz a hatásosság meghatározására. Például az egyén tüdőszövetéből származó sejteket tartalmazó mintát a hatóanyag jelenlétére vizsgáljuk in vivő (vagy ex vivő) egy másik reagens alkalmazásával, a beadott hatóanyag detektálása céljából. Ez lehet például a beadott hatóanyagra specifikus, fluoro-krómmal jelölt antitest, amelyet azután standard FACS (fluoreszcencia által aktivált sejtválogató) alkalmazásával mérünk. Alternatív módon a beadott hatóanyag jelenlétét az egyén sejtjeinek a jelölésnél alkalmazott (például fluoro-krómmal jelölt) hatóanyaghoz való kötődési képességének csökkenése vagy a képesség hiánya által in vivő (vagy ex vivő) detektáljuk. Az előnyös dózis az integrinpozitív sejtek nagy többségének burkoltságát idézi elő. Előnyösen a burkoltsági állapot antitesthomológ esetében 1-14 napos időszakon át fennmarad.

A következő példák a találmány illusztrálását szolgálják, és nem szűkítik annak oltalmi körét.

1. példa

Tüdőfibrózis állatmodelljei

Sok bizonyíték támasztja alá azt, hogy a gyulladási sejtek és mediátorok szerepet játszanak a tüdőfibrózisban a széles körben alkalmazott a rágcsáló bleomicinmodellekben (BL). Ez a modell nagyon népszerű, mivel a fibrózis jellegzetes képét mutatja, a humán betegség sok komponensével, és amiért a BL által indukált tüdőfibrózis a humán kemoterápia jól ismert mellékhatása.

HU 226 383 Β1

Rágcsálók esetében a BL Intratekális becsepegtetése széles körben alkalmazott eljárás a fibrogenezis mechanizmusának vizsgálatában, és a potenciálisan kívánatos antifibrotikus vegyületek szkrínelésében. A BL által indukált tüdőtoxicitás a reaktív oxigénfajták keletkezésének (reactive oxige species, ROS) tudható be, azonban ha azok vashoz vagy DNS-hez kötőnek, a tüdőfibrózis végső megnyilvánulásához vezető folyamatban különböző gyulladási mediátorok felszabadulása játszik szerepet [Giri és Wang, Comments Toxicol. 3: 145-176 (1989)]. A BL által indukált tüdősérülés patogenezisét ödéma, vérzés és túlsúlyban neutrofilok és makrofágok celluláris infiltrálódása vezeti be. A gyulladási leukocitáknak a tüdő vaszkuláris, intersticiális és alveoláris és alveoláris tereiben, feleslegben történő felhalmozódása vaszkuláris és parenchimális sérüléseket idéz elő ROS és proteolitikus enzimek termelése által. A neutrofilok tekintélyes mennyiségű mieloperoxidázt (MPO) tartalmaznak, amely a Cl-t hipoklórossawá oxidálhatja a H₂O₂-vel való reakcióban és a neutrofileredetű HOCI ismert módon celluláris toxicitást okoz. A makrofágokból és a neutrofilokból származó ROS képes gyulladáskeltő és fibrogenikus citokinek termelésének stimulálására, amelyek megnövelt fibroproliferatív válaszreakciót közvetítenek [Phan és Kunkel, Exp. Lung Rés., 18:29-43 (1992)]. A nagymértékű sejtes beszűrődésen kívül a fibrotikus folyamatot a továbbiakban aktivált fibroblasztok hiperproliferatív válaszreakciója jellemzi. A fibroblasztszerű sejtek felelősek elsődlegesen a tüdő kollagéntartalmának abszolút növekedéséért, és az ultrastrukturális megjelenésének és a kollagén ípusok térbeli eloszlásának abnormalitásáért.

2. példa

Fibrózis gátlása alfa-4-alegységet tartalmazó integrinantagonistájával

Anyagok és módszerek

Nemspecifikus kontroliantitestet (1E6) és alfa-4alegységet tartalmazó integrinek elleni antitestet (PS2) alkalmaztunk. Az 1E6 egéreredetű, humán LFA3 (1. dómén) lgG1 monoklonális antitest [lásd Miller, Hochman, Meier, Tizard, Bixler, Rosa és Wallner, J. Exp. Med. 178: 211-222 (1992)]. A PS2-t Miyake és munkatársai [Miyake és munkatársai, J. Exp. Med. 173: 599-607 (1991)].

A krónikus légzőszervi betegségtől mentes, 25-30 g súlyú C57BL/6-egereket a Charles River Laboratory-tói szereztük be. A bleomycin-szulfát (Blenoxane védjegy alatt) a Bristol Laboratories (Syracuse, NY) ajándéka volt. A prolil-hidroxiláz prokollagén szubsztrátja jelölésére szolgáló L-[3,4—3H]prolint a Life Science Products (Boston, MA) szereztük be. A Z-fix-et, egy vizes pufferolt cinkformalint az Anatech LTD-től (Battle Creek, Ml) szereztük be. Minden más reagens reagensminőségű vagy nagyobb tisztaságú volt, és standard kereskedelmi forrásokból szereztük be.

Az állatok kezelése

Ketrecenként 4 egeret helyeztünk el, és az NIH Animál Welfare ajánlása szerint gondoztuk. Az állatokat minden kezelés előtt egy hétig hagytuk akklimatizálódni. 12 órás sötét—12 órás világos ciklust tartottunk fenn, és vizet és laboratóriumi rágcsálóeledelt adtunk nekik ad lib. Az állatokat random módon 4 kísérleti csoportra osztottuk: 1. SA+SA; 2. BL+IE6; 3. BL+SA; 4. BL+PS2. Az állatoknak intratekálisan (IT) egyszeres dózisban sóoldatot, vagy 0,08 egység/100 μΙ/egér mennyiségben BL-t injektáltunk xilazinnal és ketaminnal történő altatásban. Az IT „becsepegtetése után az egereknek IE6, SA vagy PS2 (100 pg/0,2 ml/egér) IP-injekciót adtunk 3-szor hetente. A BL beadása után 21 nappal az egereket pentobarbitállal történő altatásban feláldoztuk bronhchoalveolaris öblítőfolyadék (BALF) nyerése és biokémiai és hisztopatológiai analízisek céljából.

BALF és tüdőszövet előállítása

Az anesztéziát követően a hasüreget megnyitottuk, majd a „lehágó” (descending) abdominális aortát vértelenítettük. A tüdőt előkészítettük az öblítésre úgy, hogy a légcsőbe fecskendőhöz csatlakoztatott tompa hegyű tűt helyeztünk. A tüdőöblítést 3 ml hideg izotóniás, 1 ml-es részletekben adott sóoldattal hajtottuk végre. A BALF egy részét teljessejtszám-meghatározásra szétosztottuk. A maradék BALF-ot 1500 g-vel 20 percen át 4 °C-on centrifugáltuk, az eredményül kapott felülúszót szétosztottuk aliquotokra, és -70 °C-on tároltuk. A BALF nyerése után a tüdőlebenyekről a nem parenchimális szöveteket gyorsan eltávolítottuk, cseppfolyós nitrogénben azonnal megfagyasztottuk azokat és -70 °C-on tároltuk.

Később a fagyasztott tüdőket felolvasztottuk és 0,1 M KCI-ot, 0,02 M Trisz-t (pH 7,6) pufferben Polytron homogenizátorral (Brinkmann Instruments Inc., Wesfbury, NY) homogenizáltuk. A homogenizátumot alaposan összekevertük ismételt fejreállítás útján, és a végső térfogatot (4-5 ml) feljegyeztük. A homogenizátumot néhány aliquotra osztottuk, és 70 °C-on tároltuk biokémiai mérések céljára.

A tüdő malondialdehid-egyenértékének és hidroxiprolin-tartalmának meghatározása A tüdő malondialdehid-egyenértékét a nem frakcionált homogenizátumban a tiobarbitursav-reakciótermékek teljes mennyiségéből becsültük Ohkawa és munkatársai [Ohkawa és munkatársai, Anal. Biochem. 95: 351 (1979)] eljárásával. A tüdő hidroxi-prolin-mérési eljárásban 1 ml homogenizátumot 0,25 ml jéghideg, 50%-os (w/v) triklór-ecetsawal kicsaptunk, centrifugáltunk és a precipitátumot 2 ml 6 N HCI-ben 18 órán át 110 °C-on hidrolizáltuk. A hidroxi-prolin-tartalmat a Woessner által leírt módszerrel [Woessner, J. F., Arch. Biochem. Biophys. 93:440 (1961)] mértük meg.

A prolil-hidroxiláz (EC 1.14.11.2.) aktivitásának meghatározása

A prolil-hidroxiláz-szubsztrát (prokollagén) és a prolil-hidroxiláz-mérési eljárást Giri írta le [Giri, S. N. és munkatársai, Exp. Mól. Pathol. 39: 317 (1983)]. Röviden: 10 napos csirkeembrióból frissen izolált sípcsontokat [3H]-prolinnal jelöltünk prolinmentes tápfolyadékkal 37 °C-on 6 órán át. A be nem épült jelölőanyag mosással történő eltávolítása után a szövetet homogenizáltuk,

HU 226 383 Β1 és 3000 g-vel, 20 percen át, 4 °C-on centrifugáltuk. Az eredményül kapott felülúszót alaposan kidializáltuk a be nem épült jelölőanyag eltávolítása céljából. A jelölt prokollagén szubsztrátot aliquotokra osztottuk, és -70 °C-on tároltuk. Az enzimes mérési eljárásban az inkubációs keverék összetétele 2 ml végtérfogatban vas-ammónium-szulfát (0,1 mmol/l), alfa-keto-glutársav (0,1 mmol/l), [3H]-prolin-prokollagén (200 000 dpm), tüdőhomogenizátum (0,2 ml), aszkorbinsav (0,5 mmol/l) és TRIS-HCI-puffer (0,1 mol/l, pH 7,8). A reakciót 0,2 ml 50%-os triklór-ecetsav hozzáadásával állítottuk le a Dubnoff-féle metabolikus rázógépben végrehajtott 30 percig, 37 °C-on tartó inkubálás után. A reakció ideje alatt triciált víz szabadult fel a prolii hidroxiláltságával sztöchiometrikus arányban és ezt használtuk fel az enzimaktivitás mértékekét. A reakciórendszerből a triciált vizet a teljes reakcióelegy vákuumdesztillálása által választottuk el, és a radioaktivitást meghatároztuk. Az enzimaktivitást a teljes tüdőre vonatkoztatva a 30 perc alatt felszabadult triciált víz dpm-értékével adtuk meg.

A BALF-sejtszám meghatározása A BALF-ban a teljes sejtszámot a Wang [Wang, Q.

és munkatársai, Láb. Invest. 67: 234-242 (1992)] által leírtak szerint határoztuk meg. A BALF teljes leukocitaszámát Cou/fer-számlálóval (F-model, Coulter Electronics Inc., Hialeah, FL) határoztuk meg, a gyártó leírása szerint.

BALF-fehérjemeghatározás A BALF-felülúszó fehérjetartalmát Bio-Rad fehérjemérési eljárás (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) alkalmazásával határoztuk meg és marhaeredetű szérumalbumint alkalmaztunk standardként.

Hisztopatológiai és immunhisztokémiai analízis Minden kezelési csoportból 3-4 állatot random módon kiválasztottunk a kezelési csoportokból hisztopatológiai és immunhisztokémiai értékelés céljára. A hasüreget megnyitottuk, majd a „lehágó” (descending) abdominális aortát vértelenítettük. Közvetlenül ezután a tüdőszövetet hisztológiai analízisre készítettük elő Wang és munkatársai (fent) leírása szerint. A légcsőbe tompahegyű tűkanült vezettünk be, a mellüreget megnyitottuk, és a szivet és a tüdőt en bloc eltávolítottuk. A tüdőt a légcsőn át Z-ffx-oldatban fixáltuk 30 cm vízoszlopnyomással. A jobb oldali cranialis és caudalis lebenyt és a bal oldali lebenyt később blokkoltuk, paraffinba ágyaztuk, 7 mikronos metszeteket vágtunk és hematoxilinnel és eozinnal festettük. Az alfa-SMA immunhosztokémiai festése céljából a tüdőmetszetek paraffintartalmát eltávolítottuk és az endogén peroxidázt blokkoltuk. A festendő metszeteket ezután 30 percen át blokkoló kecskeszérummal kezeltük, azután 16 órán át inkubáltuk az elsődleges monoklonális alfa-SMA elleni antitesttel (Sigma Chemical Co., St Louis, MO).

Az adatok statisztikai analízise te állatok adatait a teljes tüdőre vonatkoztattuk, és az átlag istandard hiba (SE) szerint adtuk meg. Az adatokat a négy csoport között kétutas varianciaanalízissel (SIGMASTAT) és Student-Newman-Keuls-féle eljárással hasonlítottuk össze. A P<0,05 értéket szignifikánsnak tekintettük.

Eredmények

Lipidperoxidáció az egértüdőben

A tüdőben a lipidperoxidáció mérőszámaként a malonaldehidekvivalens-tartalmat vizsgáltuk az egerek különböző csoportjaiban. A BL-adagolás szignifikáns mértékben megnövelte a malonaldehidekvivalens-tartalmat az egértüdőben a BL+IE6- és a BL+SA-csoportokban egyaránt, az SA+SAés a BL+PS2-csoportokhoz viszonyítva (az adatokat nem mutatjuk be). A PS2-vel való kezelés hatásosan gátolta a BL által indukált tüdőlipid-perixodációt, mivel a tüdő malonaldehidekvivalens-szintje a BL+PS2-csoportokban nem különbözött az SA+SA-csoportokban mért szinttől.

A tüdő hidroxi-prolin-tartalma az egértüdőben

A tüdő hidroxi-prolin-tartalmát, a tüdő kollagénszintjének kulcsfontosságú mérőszámát meghatároztuk a 4 egércsoport esetében. A BL IT-adagolása szignifikáns módon megnövelte a tüdő hidroxi-prolin-szintjét a BL+IE6- és a BL+SA-csoportokban az SA+SA-kontrollcsoport 185%-ára és 205%-ára. A BL által indukált tüdő hidroxi-prolin-tartalom növekedés a BL+PS2-csoportban 35%-kal csökkent a PS2-kezelésre a BL+SA+csoporthoz viszonyítva. A BL+TR+csoportban a tüdő hidroxi-prolin-szint nem volt szignifikáns módon magasabb, mint az IT-SA-kontrollcsoport (SA+SA) esetében.

Prolil-hidroxiláz-aktivitás az egértüdőben

A különböző csoportokban a tüdő prolil-hidroxilázaktivitásai azt mutatták, hogy a Bl önmagában szignifikáns módon megnövelte tüdő prolil-hidroxiláz-aktivitását a BL+SA-csoportban 207%-kal az SA+SA-kontrollcsoporthoz viszonyítva. A PS2 szignifikáns módon csökkentette a BL-kezeléssel megnövelt prolil-hidroxiláz-aktivitást a BL-SA-csoportban.

Teljes BALF-sejtszám az egértüdőben

A BALF teljes sejtszáma a különböző csoportokban 21 nappal az IT-módon történő sóoldat-, BL-beadás után azt mutatta, hogy a BL-kezelés megnövelte a BL+IE6-ból származó BALF teljes sejtszámot a sóoldat-kontrollcsoporthoz (SA+SA) viszonyítva, azonban csak a BL+IE6-csoport mutatott szignifikáns módon magasabb szinteket az +SA-csoporthoz viszonyítva.

A BALF fehérjetartalma

A 4 kísérleti csoportból származó BALF-felülúszó fehérjetartalma azt mutatta, hogy a BLIT adagolása szignifikánsan megnövelte a BALF fehérjetartalmát az összes BL kezelt csoportban az SA+SA csoporthoz viszonyítva. Ugyanakkor, a PS2 kezelés a BL+PS2 csoportban csökkentette a BALF-felülúszó fehérjetartalmának BL-indukált növekedését, noha a különbség nem volt statisztikailag szignifikáns.

HU 226 383 Β1

Az egértüdő hisztopatológiája

Az egértüdő hisztológiai vizsgálata az SA+SA-csoport normál pulmonáris parechimaszövetet mutatott ki. A BL+IE6-os és a BL+SA-csoportból származó tüdők foltos alveolitiszt és multifokális intersticiális fibrózist mutattak, amelyek exracelluláris szálak felhalmozódását tartalmazták. Ezekben a csoportokban az egértüdők elvékonyodott interalveoláris hártyákat és a szomszédos légrésekben gyulladásos sejteket tartalmaztak. A BL+IE6-os és a BL+SA-csoporthoz viszonyítva a BL+PS2-csoportból származó tüdők kevesebb fibrotikus sérülést tartalmaztak, azonban néhány tüdő még mutatta enyhe intersticiális fibrózis jeleit.

Az alfa-SMA immun-hisztokémiai festése az egértüdőben

Fibroblaszt és fibroblasztszerű sejteknek BL-kezelés után egerekben történő felhalmozódásának meghatározása céljából vizsgáltuk XSMA tüdőszövetben történő expresszióját XSMA elleni monoklonális antitest alkalmazásával. A kontrolltüdőkben az immunpozitivitás a vaszkuláris és bronchiális simaizomrétegekben jelent meg. A BL-lel és kontrollantitesttel vagy sóoldattal kezelt tüdőkben extenzív és intenzív volt az immunfestődés a fibrotikus területeken, az interstitiumban és a pleurában. A BL-lel és a PS2-vel kezelt tüdők azonban az alfa-SMA sokkal kisebb mértékű festődését mutatták, a BL+IE6-OS és a BL+SA-csoporthoz viszonyítva.

Diszkusszió

Az IPF bénító betegség, és gyengén reagál a jelenlegi terápiára. A vizsgálatok során bizonyítékot szolgáltatunk arra, hogy az alfa-4-alegységet tartalmazó integrin az IPF-kezelés egy másik lehetséges célpontja. Általánosan elfogadott, hogy a tüdőben a leukociták szerepet játszanak a pulmonáris fibrózis kialakulásában ROS, fibrogenikus citokinek és növekedési faktorok szekréciója által. A leukociták forgalmát és aktiváltsági állapotát különböző felszíni fehérjék, például az integrinek modulálják. Világos, hogy a sejt-sejt kölcsönhatások, valamint a sejt-ECM kölcsönhatások is kritikusak a pulmonáris fibrózis patogenezisében. Ezzel összefüggően aktív pulmonáris fibrózisban szenvedő betegek esetében és a fibrotikus tüdőbetegségek állatmodelljeiben a fibrózisos területeken nagyszámú immunsejt és gyulladásos sejt felhalmozódását találták.

A VLA minden keringő ieukocitán expresszálódlk, és az Ig-szupercsaládba tartozó, a citokin által aktivált endotélsejteken expresszálódó vaszkuláris sejtadhéziós molekulához (VCAM-1), valamint fibronektinhez, egy mátrixfehérjéhez kötődik. Az alfa4-béta-7 T-sejtek és B-sejtek részhalmazát képező sejteken, természetes ölősejteken és eozinofileken expresszálódlk. Az adhéziós molekulák lg- és mucinszerű molekulacsaládjába tartozó mukózális vaszkuláris addresszinhez (MAdCAM-1), valamint VCAM-1-hez és fibronektinhez kötődik. In vitro vizsgálatok kimutatták, hogy a VLA-4 és a VCAM-1 kölcsönhatása szerepet játszik a mononukleáris leukocita és eozinofil endotéliumhoz való adherenciájában, és a transzendoteliális migráció és alfa4béta-7 feltételezések szerint elsődleges szerepet játszik a bélasszociált limfoid szövetek leukocitatoborzásában.

Vizsgálataink során a PS2-val való kezelés csökkentette a BALF BL általi indukcióval megnövelt teljes leukocitaszámát. A BL+PS2-vel kezelt egerek esetében a tüdők csökkent leukocitaszáma lehet felelős a BL-lel kezelt egerek esetében a csökkent mértékű gyulladásos károsodásért és a tüdőfibrózisért a BL-lel kezelt egerek esetében. A BL-lel indukált tüdőkárosodás szignifikáns mértékben csökkent a PS2-kezelés hatására, amint azt a tüdő-lipidperoxidáció mérése jelezte. A tüdő megnövekedett kollagénszintje az intersticiumban és magában az alveoláris térben a fibroblasztok megnövekedett mennyiségével függ össze. E fibroblasztszerű sejtek közül sok miofibroblaszt, amely megkülönböztető fenotípusa magában foglalja többek között az alfaSMA-expressziót, amely rendszerint a simaizomsejtekben található kontraktilis (zsugorodásra képes) fehérje, és valószínűleg fontos szerepet játszik a fibrogenezisben és a sebgyógyulásban. Vizsgálataink jelentős eredménye volt az, hogy a PS2-kezelés csökkentette a BL által indukált miofibroblaszt-proliferáció mértékét. Nem kívánjuk magunkat elkötelezni egyik konkrét elmélet mellett sem, azonban az alfa-integrin elleni antitesttel történő kezelés csökkenthétté az infiltrálódó leukociták által kibocsátott növekedési faktorok szintjét vagy közvetlen hatást gyakorolhatott a miofibroblasztok viselkedésére. Bármelyik eset áll fenn, a miofibroblasztok proliferációja csökkent mértéke vezethetett a tüdőben a kollagénfelhalmozódás csökkenéséhez a BL-lel kezelt, BL+PS2-csoportba tartozó állatoknál.

3. példa

A fibrózis alfa-1 -alegységet tartalmazó integrinantagonistájával történő gátlása Az állatok kezelése

A 28-30 g súlyú, hím C57/BL6-egereket műanyag ketrecekben helyeztük el 4-es csoportokban az American Association fór Accreditation of Laboratory Animals Care által jóváhagyott körülmények között. Az állatokat egy hétig hagytuk akklimatizálódni a laboratóriumi körülmények között a kísérletek kezdete előtt. Rodent Laboratory Chow 5501 (Purina Mills, Inc., St. Louis, MO) és víz állt ad libitum az állatok rendelkezésére, és szűrt levegőjű, 12 órás sötét/12 órás világos ciklusú szobában helyeztük el azokat. Az állatokat a következő csoportokba osztottuk:

Csoport	Kezelés
A	Sóoldat+foszfáttal pufferolt sóoldat
B	Sóoldat+kontroll IgG-antitest
C	Bleomycin+kontroll IgG-antitest
D	Bleomycin+aipi-integrin elleni antitest

A bleomycin-szulfátot pirogénmentes, izotóniás sóoldatban oldottuk közvetlenül az intratekális (IT), csepegtetéssel történő beadás előtt. Metoxi-fluránnal történő altatás alatt a megfelelő csoportba tartozó egerek

HU 226 383 Β1 intratekális beadással 100 μΙ steril izotóniás oldatot, vagy 0,08 egység (100 μΙ-ben) bleomycinoldatot kaptak. Az antitesteket (4 mg/kg) a megfelelő csoportba tartozó egereknek intraperitoneális injekcióban adtuk be hetente háromszor, a kísérlet kezdete utáni 21. napig. Ezután minden csoport esetében az állatokat nátrium-pentobarbitállal (100-125 mg/kg ip) történő túlaltatással elöltük és tüdejüket bronchoalveoláris öblítéshez, biokémiai és hisztopatológiai vizsgálatokhoz előkészítettük.

A bronchoalveoláris öblítőfolyadék teljes sejtszámának és fehérjeszintjének meghatározása A légcsövekbe kanült helyeztünk, ezután a tüdőket

5, 1 ml-es részletben 5 ml izotóniás sóoldattal öblítettük. A sóoldatot a kanülön keresztül fecskendővel juttattuk be, a mellkast óvatosan masszíroztuk, és a folyadékot elvezettük. A folyadékot 1500 g-vel 20 percen át, 4 °C-on centrifugáltuk, és izotóniás sóoldatban reszuszpendáltuk. A bronchoalveoláris öblítőfolyadékminták felülúszóinak fehérjetartalmát Lowry és munkatársai [Lowry és munkatársai, J. Bioi. Chem. 1193: 265-275 (1951)] eljárásával határoztuk meg, standardként marhaeredetű szérumalbumint alkalmazva. A szuszpenzió teljes leukocitaszámát Cou/ter-számláló (Coulter Electronics, Hialeah, FL) határoztuk meg.

Hidroxi-prolin-meghatározás A biokémiai vizsgálatokban felhasznált állatok tüdejét in situ jéghideg, izotóniás sóoldattal átömlesztettük a vér pulmonáris vaszkulatúrából való kimosása céljából a bal kamrán és a bal pitvar nyílásán keresztül. A tüdőlebenyekről a nem parenchimális szövetet gyorsan lemetszettük, gyorsfagyasztás céljából cseppfolyós nitrogénbe dobtuk és ezután -80 °C-on tároltuk. A fagyasztott tüdőket később felolvasztottuk, és 0,1 M KCi-t, 0,02 M Triszt (pH 7,6) tartalmazó pufferben homogenizáltuk Polytron homogenizátorral. A tüdőhomogenizátum hidroxi-prolin-tartalmát, a kollagéntartalom mértékeként Woeesner eljárásai szerint [Woessner, Arch, Biochem Biophys. 93: 440-447 (1961)] határoztuk meg.

Hisztopatológiai vizsgálatok A tüdő átöblítése után a mellüreget megnyitottuk és a szivet és a tüdőt en bloc eltávolítottuk. A tüdőbe 1%-os glutáraldehid-paraformaldehid-fixálót (0,12 M) kakodilátpufferben, 400 mOsm ozmolalitással és 30 cm vízoszlopnyomással csepegtettünk. A tüdőt ilyen nyomással fixáltuk körülbelül 2 órán át, azután fixálóban tároltuk elzárt légcsövekkel. Beágyazás előtt a tüdőket a szívtől és minden, nem pulmonáris szövettől tompa metszéssel izoláltuk és ezeket eltávolítottuk. A szövetblokkokat minden tüdő esetében felvágtuk a jobb oldali kraniális, a jobb oldali kaudális irányból legalább két sagittalis szeletre (2-3 mm), és minden tüdő esetében a bal oldali lebenyeket. Minden blokkot körülbelül 1 cm²-es felszínűre vágtunk. A blokkokat növekvő koncentrációjú etanololdat-sorozatban dehidráltuk, és paraffinba ágyaztuk. Metszeteket (5 pm vastagságúakat) a paraffinblokkokból és hematoxilinnel és eozinnal festettük hisztológiai értékelés céljából.

Az adatok analízise és értelmezése

Az adatokat standard deviációs átlaggal és az átlag standard hibáját megadva analizáltuk. A kontrollcsoport és a kezelési csoportok közötti különbségek szignifikáns voltának megítélése céljából Student-féle t-tesztet, cft/'-négyzeteloszlási teszteket, korrelációs koefficienseket, varianciaanalízist (ANOVA) és többszörös összehasonlítási teszteket alkalmaztunk, komputeralapú statisztikai programcsomag [(SAS/STAT Guide, 6. kiad., szerk.: Cary, N. C. 183-260 (1985)].

Eredmények

Vizsgálataink során azt a hipotézist teszteltük, amely szerint az αΐβΐ-integrint (α1β1) neutralizáló antitest csökkenti a bleomycin (BL) által indukált tüdőfibrózist in vivő. Hímnemű, C57/BL6-egereknek intratekálisan (IT) injektáltunk sóoldatot (SA) vagy BL-t (0,08 egység, 0,1 ml-ben), majd intraperitoneálisan az antitestet (100 pg 0,2 ml-ben) háromszor egy héten. Az IT csepegtetéssel történő beadása után 21 nappal az egereket bronchoalveoláris öblítőfolyadék (BAL) kinyerése, biokémiai és hisztopatológiai analízis céljából elöltük.

A tüdők hisztopatológiás vizsgálata

Azt várjuk, hogy a sóoldattal és a kontroll IgG-antitesttel kezelt egerek esetében nem lesznek látható károsodások és az interalveoláris hártyák normális, vékony megjelenésűek lesznek. Ezzel szemben a bleomycinnel és kontroll IgG-vel kezelt egereknél a proximális adni multifokális elhelyezkedésű károsodásaitól a pleurát esetenként érintő, diffúz elhelyezkedésű károsodásig változó károsodást tapasztaltunk. Azt várjuk, hogy a bleomicinnel és alfa-1-integrin elleni antitesttel kezelt egerek tüdeje megjelenése jobban hasonlít a B csoportbeli egerek (fent) tüdejének megjelenésére. Azt várjuk, hogy a D csoportba tartozó egerek csak korlátozott számú fibrotikus károsodást mutatnak, enyhe, multifokális septalis elvékonyodással és mononukleáris sejtek kis aggregátumaival.

A találmány részletes leírását adtuk példával illusztrálva a tisztább érthetőség céljából, azonban a szakember számára nyilvánvaló, hogy bizonyos változtatásokat és módosításokat tehetünk a találmány gyakorlatba vétele során. Ezáltal a leírás és a példák nem tekinthetők az oltalmi kör szűkítésének. Az oltalmi kört a csatolt igénypontok határozzák meg.

Claims (13)

1. Antitesthomológot tartalmazó készítmény alkalmazása személyben fibrózis kezelésére szolgáló gyógyászati készítmény előállítására, amely antitesthomológ alfa-4-alegységet hordozó integrin és alfa-4-alegységet hordozó integrin ligandja közötti kölcsönhatás antagonistája.

HU 226 383 Β1

2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a fibrózis belső szerv fibrózisa.

3. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a belső szerv az alábbiak bármelyike: máj, tüdő, vese, szívér, emésztőrendszer.

4. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a személy az alábbiak bármelyikében szenved: tüdőfibrózis, mielofibrózis, májcirrhózis, mesangialis proliferatív glomerulonephritis, crescentképződéssel járó glomerulonephritis, diabetikus naphropatia, ranalis interstitialis fibrosis, HIV-ve\ összefüggő nephropatia.

5. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a fibrózis dermális fibrózis.

6. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a személy az alábbiak bármelyikében szenved: scleroderma, morphea, keloidok, hipertrofikus hegek, familiáris bőrkollagenóma, és kollagén típusú kötőszöveti anyajegyek.

7. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a fibrózis szem fibrózisa.

8. A 7. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a személy az alábbiak bármelyikében szenved: diabetikus retinopátia, sebészeti beavatkozást követő hegesedés, proliferatív vitreoretinopátia.

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény alfa-4-alegység elleni antitest5 homológot tartalmaz.

10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az antitesthomológ humanizált, humán vagy kiméra antitesthomológ.

11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti alkal10 mazás, ahol a gyógyászati készítmény a következő módon történő beadáshoz kialakított:

(a) naponta 0,1 mg/kg-tól 10 mg/kg-ig terjedő dózisban, (b) egytől tizennégy napig terjedő adagolási időtar15 tamban, és (c) az antitesthomológ legalább 1 mg/ml-es plazmaszintjének fenntartására elegendő mennyiségben.

12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az antitesthomológ humanizált, egérere20 detű, 21-6 antitest.

13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a személy ember.