DE60020955T2

DE60020955T2 - Verfahren zur behandlung einer fibrose unter verwendung eines antagonisten der integrin alpha-4 untereinheit

Info

Publication number: DE60020955T2
Application number: DE60020955T
Authority: DE
Inventors: Philip Gotwals; R. Roy LOBB
Original assignee: Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 2000-04-21
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2020-04-22
Also published as: BG106118A; KR20070050979A; ATE298249T1; CN100360183C; GEP20063844B; IS6105A; IL145898A; US20040037827A1; YU74901A; EE200100549A; ES2243259T3; NO20015122D0; WO2000064474A1; JP2014065747A; EA200101116A1; CN1596979A; JP2002542300A; CN1356911A; KR20070102760A; CN1679935A

Description

Hintergrund der Erfindung
Fibronectin und Kollagen sind Proteine, die für die Aufrechterhaltung der Integrität der extrazellulären Matrix, die man im Bindegewebe findet, wesentlich ist. Die Produktion dieser Proteine ist ein stark regulierter Vorgang und dessen Störung kann zur Entwicklung von Gewebefibrose führen. Während die Bildung von fibrösem Gewebe Teil des normalen günstigen Heilungsprozesses nach einer Verletzung ist, gibt es unter manchen Umständen eine anomale Akkumulation von fibrösen Materialien, so dass dies letztendlich zu Organversagen führen kann (Border et al. (1994) New Engl. J. Med. 331:1286–1292). Bei jedem Organ führt eine Verletzung zu einer stereotypen physiologischen Reaktion: Thrombocyten-induzierte Hämostase, gefolgt von einem Einströmen inflammatorischer Zellen und aktivierter Fibroblasten. Cytokine, die von diesen Zelltypen stammen, steuern die Bildung von neuer extrazellulärer Matrix und Blutgefäßen (Granulationsgewebe). Die Erzeugung von Granulationsgewebe ist ein sorgfältig geplantes Programm, bei dem die Expression von Proteaseinhibitoren und extrazellulären Matrixproteinen hochreguliert wird und die Expression der Proteasen verringert wird, was zur Akkumulation von extrazellulärer Matrix führt.
Im Zentrum der Entwicklung von fibrotischen Zuständen, ob induziert oder spontan, steht die Stimulation der Fibroblastenaktivität. Das Einströmen von inflammatorischen Zellen und aktivierten Fibroblasten in das verletze Organ hängt von der Fähigkeit dieser Zelltypen ab, mit der interstitiellen Matrix zu interagieren, die hauptsächlich aus Fibronectin und Kollagen besteht. Diese Zell-Zell- oder Zellextrazelluläre Matrix-Interaktionen werden durch mehrere Familien von Zelladhäsionsmolekülen vermittelt, wobei eine Familie die Integrine einschließt. Integrine sind strukturell und funktional verwandte Glycoproteine, die aus verschiedenen heterodimeren alpha- (alpha 1, alpha 2 bis derzeit alpha 11) und beta (beta 1 und beta 7)-Transmembranrezeptordomänen bestehen, die man in verschiedenen Kombinationen auf praktisch jedem Säugerzelltyp findet. (Vgl. Übersichtsartikel: E.C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox et al., „The Pharmacology of the Integrins." Medicinal Research Rev. Bd. 195 (1994) und V. W. Engleman et al., „Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets" in Ann, Revs. Medicinal Chemistry, Bd. 31, J. A. Bristol, Herausg.; Acad. Press, NY, 1996, S. 191). Es wurden zwei alpha4-Untereinheit enthaltende Integrine beschrieben, und sie werden als alpha4beta1 (VLA-4) und alpha4beta7 bezeichnet.
Die interstitielle Lungenfibrose (ILF) ist der Endweg vieler interstitieller Lungenerkrankungen, die zu einer Verringerung der Lungencompliance und zur Beeinträchtigung der lebenswichtigen Gasaustauschfunktion führt. Ungeachtet der Ätiologie wird die ILF durch inflammatorische und fibroproliferative Veränderungen der Lunge und einer übermäßigen Akkumulation von Kollagen im Interstitium charakterisiert. Patienten mit ILF zeigen im Allgemeinen ein Vorhandensein von rekrutierten Immun- und inflammatorischen Zellen während der aktiven Lungenfibrose, was zeigt, dass die Lungenfibrose das Ergebnis einer anomalen Reparatur nach einem ersten inflammatorischen Angriff ist. Die rekrutierten inflammatorischen Zellen sind wahrscheinlich in vielen Fällen an dem ersten Angriff beteiligt. Zusätzlich können diese Zellen eine komplexe Rolle bei der Regulierung des Reparaturprozesses spielen. In jedem Fall kann die Rekrutierung der Immun- und inflammatorischen Zellen in die Lunge eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der fibrotischen Reaktion spielen. Das Einströmen von inflammatorischen Zellen und aktivierten Fibroblasten in die verletzte Lunge hängt von der Fähigkeit dieser Zelltypen ab, mit den Komponenten der EZM zu interagieren. Der Transport und der Aktivierungszustand der Leukocyten werden von verschiedenen Integrinen moduliert. Das Verhindern des Einströmens von inflammatorischen Zellen in die Lungen kann bei der Begrenzung der nachfolgenden fibrotischen Reaktion entscheidend sein.
Viele dieser Erkrankungen, die mit der Proliferation von fibrösem Gewebe assoziiert sind, sind sowohl chronisch als auch häufig schwächend, einschließlich beispielsweise Hauterkrankungen wie Skleroderma. Einige, einschließlich Lungen fibrose, können teilweise aufgrund der Tatsache, dass die derzeit zur Verfügung stehenden Behandlungen für diese Erkrankung signifikante Nebenwirkungen haben und im Allgemeinen bei der Verlangsamung oder der Heilung der Progression der Fibrose nicht wirksam sind, tödlich sein [Nagler et al. 1996, Am. J. Respir. Crit. Care Med, 154:1082–86]. Es gibt infolgedessen einen ständigen Bedarf für neue anti-fibrotische Agentien.
–WO-A-97/18838 beschreibt Behandlungsmethoden unter Verwendung von humanisierten Immunglobulinen, die spezifisch an alpha4-Integrin binden und die bei der Behandlung von Erkrankungen wie der akuten Leukocyten-vermittelten Lungenschädigung verwendet werden können (S. 25).–
–WO 97/11718 offenbart die Verwendung eines neutralisierenden Antikörpers, der für die RGD-Erkennungsstelle von Integrinen spezifisch ist und der ein neutralisierender Antikörper sein kann, der für den Integrinrezeptor spezifisch ist.–
–Kidney International, 1996, 49:127–134 offenbart, dass es keine starke Verbindung zwischen der glomerulären Expression von LFA-1, VLA-4, ICAM-1, VCAM-1 und der glomerulären Makrophageninfiltration sowie der chronischen histologischen Schädigung gibt.–
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Antagonisten einer Interaktion zwischen einem alpha4-Untereinheit tragenden Integrin zur Herstellung eines Arzneimittels bereit, das für die Behandlung von Fibrose bei einem Patienten nützlich ist. Wir haben die mögliche Rolle der Antagonisten der alpha1- und alpha4-Untereinheit enthaltenden Integrine in der Pathogenese von Fibrose untersucht, indem Mäusen mit Lungenfibrose ein Antagonist eines alpha1- und alpha4-Untereinheit enthaltenden Integrins verabreicht wurde. Der nützliche Effekt, den diese Antagonisten sowohl auf die Akkumulation von Gesamtkollagen als auch auf das Ausmaß der Lungenfibroseläsionen haben, wie in der der vorliegenden Mitteilung dargestellt, legt nahe, dass die alpha1- und/oder die alpha4-Untereinheit enthaltenden Integrine ein vernünftiges Ziel für die antifibrotische Therapie sein können. Ein erfindungsgemäßer Aspekt ist die Verwendung einer Zusammensetzung, die einen Antagonisten einer Interaktion zwischen einem alpha4-Untereinheit tragenden Integrin und einem Liganden für ein alpha4-Untereinheit tragendes Integrin umfasst zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Patienten mit einem fibrotischen Zustand. Der Antagonist ist ein alpha4-Integrin bindendes Mittel oder ein alpha4-Integrinliganden bindendes Mittel. Bevorzugte alpha4-Integrin bindende Mittel werden aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus: a) einem Antikörperhomolog, das die Interaktion von sowohl VLA-4 als auch alpha4beta7 mit ihren entsprechenden alpha4-Liganden antagonisiert; b) ein Antikörperhomolog, das die Interaktion von VLA-4 mit seinem alpha4-Liganden antagonisiert; und c) ein Antikörperhomolog, das die Interaktion von alpha4beta7 mit seinem alpha4-Liganden antagonisiert. In anderen Ausführungsformen wird das Antikörperhomolog aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus einem menschlichen Antikörper, einem chimären Antikörper, einem humanisierten Antikörper und Fragmenten davon.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Antagonisten einer Interaktion zwischen einem alpha4-Untereinheittragenden Integrin und einem Liganden für ein alpha4-Untereinheittragendes Integrin zur Herstellung eines Arzneimittels, um den Anstieg der durch den fibrotischen Zustand induzierten Leukocyten in einer Probe einer bronchoalveolären Lavage-Flüssigkeit eines Patienten mit einem fibrotischen Zustand zu senken.
In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen wird das alpha4-Integrin bindende Mittel von einer Nucleinsäuresequenz codiert, die eine Nucleinsäure umfasst, die unter mehreren stringenten Bedingungen mit definierten Nuclleinsäuresequenzen, ausgewählt aus den Sequenzgruppen in Tabelle 6 von US-Patent 5,840,299, oder dem Komplement der Nucleinsäuresequenzen, hybridisiert. In anderen Aspekten des Verfahrens wird das alpha4-Integrin bindende Mittel von einer Nucleinsäuresequenz codiert, die eine Nucleinsäure umfasst, die unter definierten stringenten Bedingungen mit einer Nucleinsäuresequenz hybridisiert, die eine Polypeptidsequenz codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus bestimmten definierten Polypeptiden, die man im US-Patent 5,932,214 findet oder die von der Zelllinie ATCC CRL 11175 produziert werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
I. Definitionen
Um die Thematik der beanspruchten Erfindung klarer und deutlicher herauszustellen, werden folgende Definitionen für spezifische Begriffe verwendet, die in der folgenden schriftlichen Beschreibung und den beigefügten Patentansprüchen verwendet werden.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung beschrieben, in der folgende Definitionen eingeschlossen sind:
Die sehr späte Integrinantigen (VLA)-Superfamilie besteht aus strukturell und funktional verwandten Glycoproteinen, die aus heterodimeren (alpha und beta), transmembranen Rezeptormolekülen bestehen, die man in verschiedenen Kombinationen auf fast jedem Säugerzelltyp findet. (Vgl. Übersichtsartikel E. C. Butcher, Cell 1, 67, 1033 (1991); D. Cox et al., „The Pharmacology of the Integrins." Medicinal Research Rev. (1994) und V. W. Engleman et al., „Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets." in Ann. Report in Medicinal Chemistry, Bd. 31, J. A. Bristol, Herausg.; Acad. Press, NY, 1996, S. 191). Integrine der VLA-Familie schließen (derzeit) VLA-1, -2, -3, -4, -5, -6, -9 und -11 ein, wobei jedes der Moleküle eine β1-Kette umfasst, die jeweils nicht kovalent an eine alpha-Kette (α1, α2, α3, α4, α5, α6 und dergleichen) gebunden ist.
Das alpha4beta1 (α4β1)-Integrin ist ein Zelloberflächenrezeptor für VCAM-1, Fibronectin und möglicherweise andere Liganden (wobei die letzteren Liganden einzeln und kollektiv als „alpha4-Ligand(en)" bezeichnet werden. Der Begriff (α4β1)-Integrin („VLA-4" oder „a4b1" oder „alpha4beta1-Integrin", austauschbar verwendet) bezieht sich hier daher auf Polypeptide, die an VCAM-1 und Mitglieder der extrazellulären Matrixproteine, insbesondere Fibronectin binden können, oder Homologe oder Fragmente davon, obwohl sich der Fachmann bewusst ist, dass andere Liganden für VLA-4 existieren können und unter Verwendung herkömmlicher Verfahren analysiert werden können. Dennoch ist bekannt, dass die alpha4-Untereinheit mit anderen beta-Untereinheiten neben beta1 assoziiert, so dass wir den Begriff „alpha (α) 4-Integrin" oder „alpha (α) 4-Untereinheit enthaltendes Integrin" als jene Integrine definieren, deren alpha4-Untereinheit mit der einen oder anderen der beta-Untereinheiten assoziiert. Ein anderes Beispiel eines „alpha4"-Integrins neben VLA4 ist alpha4beta7 (Vgl. Lobb und Adams, a.a.O.). Ebenso sind ein „alpha1"-Integrin oder ein „alpha1-Untereinheit enthaltendes Integrin" diejenigen Integrine, deren alpha1-Untereinheit mit der einen oder anderen der beta-Untereinheiten assoziiert.
Ein Intergrin-„Antagonist" schließt jede Verbindung ein, die alpha1- und/oder alpha4-Untereinheit enthaltende Integrine hemmt, an einen Integrinliganden und/oder -rezeptor zu binden. Anti-Integrinantikörper oder ein Antikörperhomolog enthaltende Proteine (nachstehend diskutiert) sowie andere Moleküle wie lösliche Formen der Ligandenproteine für Integrine sind nützlich. Lösliche Formen der Ligandenproteine für alpha4-Untereinheit enthaltende Integrine schließen lösliche VCAM-1, VCAM-1-Fusionsproteine oder bifunktionale VCAM-1/Ig-Fusionsproteine ein. Beispielsweise kann eine lösliche Form eines Integrinliganden oder ein Fragment davon verabreicht werden, um Integrin zu binden und vorzugsweise um eine Integrinbindungsstelle auf Zellen zu konkurrieren, was zu Effekten führt, die der Verabreichung von Antagonisten wie anti-Integrin (z.B. VLA-1, VLA-4)-Antikörpern ähneln. Im den Erfindungsumfang sind insbesondere lösliche Integrinmutanten eingeschlossen, die Liganden binden, jedoch keine integrinabhängige Signalgebung hervorrufen. Derartige Integrinmutanten können als kompetitive Inhibitoren von Wildtyp-Integrinprotein wirken und werden als „Antagonisten" betrachtet. Andere in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Antagonisten sind „kleine Moleküle", wie nachstehend definiert.
Die Verwendung von Molekülen, die die Wirkung von mehr als einem alpha4-Untereinheit enthaltenden Integrin antagonisieren, wie kleine Moleküle oder Antikörperhomologe, die sowohl VLA-4 als auch alpha4beta7 oder andere Kombinationen von alpha4-Untereinheit enthaltenden Integrinen antagonisieren, ist in die Erfindung ebenfalls eingeschlossen. Ebenfalls eingeschlossen ist die Verwendung von Molekülen, die die Wirkung von mehr als einem alpha1-Untereinheit enthaltenden Integrin antagonisieren. In den Erfindungsumfang ist auch die Verwendung einer Kombination von Molekülen eingeschlossen, so dass die Kombination die Wirkung von mehr als einem Integrin antagonisiert, wie die Verwendung mehrerer kleiner Moleküle oder Antikörperhomologe, die in Kombination sowohl VLA-4 als auch alpha4beta7 oder andere Kombinationen von alpha4-Untereinheiten enthaltenden Integrinen antagonisieren.
Wie hier diskutiert, können bestimmte Integrinantagonisten fusioniert oder auf andere Weise konjugiert werden, beispielsweise mit einem Antikörperhomolog wie einem Immunglobulin oder einem Fragment davon, und sie sind nicht auf einen besonderen Typ oder eine besondere Struktur eines Integrins oder Liganden oder eines anderen Moleküls begrenzt. Daher wird für die Zwecke der Erfindung jedes Mittel, das ein chimäres Protein erzeugen kann (wie nachstehend definiert) und an Integrinliganden binden kann und das effektiv ein alpha4- und/oder alpha1-Untereinheit enthaltendes Integrin blockiert oder bedeckt, als Äquivalent der hier in den Beispielen verwendeten Antagonisten betrachtet.
„Antikörperhomolog" schließt intakte Antikörper ein, die aus leichten und schweren Immunglobulinketten bestehen, die über Disulfidbrücken verbunden sind. Der Begriff „Antikörperhomolog" soll auch ein Protein umfassen, das ein oder mehrere Polypeptide umfasst, ausgewählt aus leichten Immunglobulinketten, schweren Immunglobulinketten und antigenbindenden Fragmenten davon, die an ein oder mehrere Antigene (d.h. Integrin oder Integrinligand) binden können. Die Komponentenpolypeptide eines Antikörperhomologs, das aus mehr als einem Polypeptid besteht, können fakultativ über eine Disulfidbrücke verbunden oder ansonsten kovalent vernetzt sein. Infolgedessen schließen daher „Antikörperhomologe" intakte Immunglobuline der Typen IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (sowie Subtypen davon) ein, wobei die leichten Immunglobulinketten vom kappa- oder lambda-Typ sein können. „Antikörperhomologe" schließen auch Teile intakter Antikörper ein, die die antigenbindende Spezifität beibehalten haben, beispielsweise Fab-Fragmente, Fab'-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, F(v)-Fragmente, schwere und leichte Kettenmonomere oder Dimere oder Gemische davon.
„Humanisiertes Antikörperhomolog" ist ein durch rekombinante DNA-Technologie hergestelltes Antikörperhomolog, bei dem einige oder alle Aminosäuren einer menschlichen leichten oder schweren Immunglobulinkette, die nicht für die Antigenbindung erforderlich sind, mit den entsprechenden Aminosäuren aus einer nicht menschlichen leichten oder schweren Säuger-Immunglobulinkette ersetzt wurden. Ein „menschliches Antikörperhomolog" ist ein Antikörperhomolog, bei dem alle Aminosäuren einer leichten oder schweren Immunglobulinkette (ungeachtet dessen, ob sie für die Antigenbindung erforderlich sind oder nicht) von einer menschlichen Quelle stammen.
Wie hier verwendet, ist ein „menschliches Antikörperhomolog" ein durch rekombinante DNA-Technologie hergestelltes Antikörperhomolog, bei dem alle Aminosäuren einer leichten oder schweren Immunglobulinkette von einer menschlichen Quelle stammen.
Ein Integrin-„Antagonist" schließt jede Verbindung ein, die den Integrinliganden aktiviert.
Eine „Aminosäure" ist eine monomere Einheit eines Peptids, Polypeptids oder Proteins. Es gibt 20 Aminosäuren, die man in natürlich auftretenden Peptiden, Polypeptiden und Proteinen findet, von denen alle L-Isomere sind. Der Begriff schließt auch Analoga der Aminosäuren und D-Isomere der Proteinaminosäuren und deren Analoga ein.
„Kovalent gekoppelt" – bedeutet, dass die spezifizierten erfindungsgemäßen Einheiten (z.B. PEGylierter alpha4- und/oder alpha1-Integrinantagonist, Immunglobulinfragment/alpha4- oder alpha1-Integrinantagonist) entweder direkt kovalent aneinander gebunden sind oder ansonsten indirekt kovalent durch eine dazwischenliegende Einheit oder Einheiten wie eine Spacereinheit oder -einheiten aneinander gebunden sind. Die dazwischen liegende Einheit oder Einheiten werden als „Kopplungsgruppe" bezeichnet. Der Begriff „konjugiert" wird austauschbar mit „kovalent gekoppelt" verwendet. In dieser Hinsicht bezieht sich ein „Spacer" auf eine Einheit, die zwischen einer Aminosäure oder anderen Komponente eines Integrinantagonisten oder eines Fragments davon und dem Rest des Moleküls eingebaut werden kann. Ein Spacer kann die Trennung zwischen der Aminosäure oder einer anderen Komponente und dem Rest des Moleküls bereitstellen, so dass verhindert wird, dass die Modifikation mit der Proteinfunktion interferiert und/oder es für die Aminosäure oder die andere Komponente einfacher wird, sich mit anderen Einheiten zu verbinden.
„Expressionskontrollsequenz"- eine Sequenz aus Polynucleotiden, die die Expression von Genen kontrolliert und reguliert, wenn sie mit jenen Genen funktional verbunden ist.
„Expressionsvektor" – ein Polynucleotid wie ein DNA-Plasmid oder Phage (neben anderen gebräuchlichen Beispielen), das die Expression von mindestens einem Gen zulässt, wenn der Expressionsvektor in eine Wirtszelle eingeführt wird. Der Vektor kann in einer Zelle replizieren oder nicht.
Eine „wirksame Menge" eines erfindungsgemäßen Mittels ist diejenige Menge, die ein Ergebnis produziert oder einen Einfluss auf den bestimmten behandelten Zustand ausübt.
„Funktionales Äquivalent" eines Aminosäurerests ist (i) eine Aminosäure mit ähnlichen reaktiven Eigenschaften wie der Aminosäurerest, der durch das funktionale Äquivalent ersetzt wurde; (ii) eine Aminosäure eines erfindungsgemäßen Anta gonisten, wobei die Aminosäure ähnliche Eigenschaften besitzt wie der Aminosäurerest, der durch das funktionale Äquivalent ersetzt wurde; (iii) ein Nicht-Aminosäuremolekül mit ähnlichen Eigenschaften wie der Aminosäurerest, der durch das funktionale Äquivalent ersetzt wurde.
Ein erstes Polynucleotid, das einen erfindungsgemäßen Proteinantagonisten codiert, ist „funktional äquivalent" im Vergleich zu einem zweiten Polynucleotid, das den Proteinantagonisten codiert, falls es mindestens einer der folgenden Bedingungen genügt:

(a) das „funktionale Äquivalent" ist ein erstes Polynucleotid, das mit dem zweiten Polynucleotid unter Standardhybridisierungsbedingungen hybridisiert und/oder gegenüber der ersten Polynucleotidsequenz degeneriert ist. Am meisten bevorzugt, codiert es ein mutiertes Protein mit der Aktivität eines Integrinantagonistenproteins;
(b) das „funktionale Äquivalent" ist ein erstes Polynucleotid, das bei Expression eine Aminosäuresequenz codiert, die von dem zweiten Polynucleotid codiert wird. Die in der Erfindung verwendeten Integrinantagonisten schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf die hier angeführten Agentien sowie auf ihre funktionalen Äquivalente. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „funktionales Äquivalent" daher auf einen Integrinantagonisten oder ein Polynucleotid, das den Integrinantagonisten codiert, der denselben oder einen verbesserten nützlichen Effekt auf den Empfänger hat, wie der Integrinantagonist, für dessen funktionales Äquivalent er gehalten wird. Wie dem Fachmann bewusst ist, kann ein funktionales äquivalentes Protein durch rekombinante Verfahren z.B. durch Expression einer „funktionalen äquivalenten DNA" hergestellt werden. Infolgedessen umfasst die vorliegende Erfindung Integrinproteine, die von natürlich auftretenden DNAs sowie nicht natürlich auftretenden DNAs codiert werden, die dasselbe Protein codieren, das von der natürlich auftretenden DNA codiert wird. Aufgrund der Degeneration der Nucleotid codierenden Sequenzen können andere Polynucleotide verwendet werden, um ein Integrinprotein zu codieren. Diese schließen alle oder Teile der vorstehenden Sequenzen ein, die durch die Substitution verschiedener Codons verändert werden, die denselben Aminosäurererest in der Sequenz codieren, so dass daher ein stummer Austausch erzeugt wird. Derartig veränderte Sequenzen werden als Äquivalente dieser Sequenzen betrachtet. Beispielsweise wird Phe (F) von zwei Codons, TTC oder TTT, codiert, Tyr (Y) wird von TAC oder TAT codiert und His (H) wird von CAC oder CAT codiert. Andererseits wird Trp (W) von einem einzigen Codon, TGG, codiert. Infolgedessen ist man sich bewusst, dass es für eine gegebene DNA-Sequenz, die ein besonderes Integrin codiert, viele degenerierte DNA-Sequenzen gibt, die es codieren. Diese degenerierten DNA-Sequenzen werden als im Umfang dieser Erfindung inbegriffen betrachtet.

Der Begriff „chimär" bei Bezugnahme auf einen erfindungsgemäßen Antagonisten bedeutet, dass der Antagonist eine Bindung (chemische Vernetzung oder kovalente Bindung oder eine andere Bindungsart) von zwei oder mehreren Proteinen umfasst, die ungleiche Strukturen besitzen und/oder ungleiche Ursprungsquellen aufweisen. Daher kann ein chimärer alpha4-Integrinantagonist eine Einheit einschließen, die ein alpha4-Integrinantagonist oder ein Fragment ist, und eine weitere Einheit, die kein alpha4-Integrinantagonist ist. Ein chimärer alpha1-Integrinantagonist kann eine Einheit einschließen, die ein alpha1-Integrinantagonist oder ein Fragment ist, und eine weitere Einheit, die kein alpha1-Integrinantagonist ist.
Eine Spezies des „chimären" Proteins ist eine „Fusion" oder ein „Fusionsprotein", was sich auf eine colineare, kovalente Bindung von zwei oder mehr Proteinen oder Fragmenten davon über deren individuelle Peptidrückgrate bezieht, am meisten bevorzugt durch die genetische Expression eines Polynucleotidmoleküls, das jene Proteine codiert. Daher sind die bevorzugten Fusionsproteine chimäre Proteine, die einen alpha4- (oder alpha1-) Integrinantagonisten oder ein Fragment einschließen, der/das kovalent an eine zweite Einheit gebunden ist, die kein alpha4- (oder alpha1-) Integrinantagonist ist. Bevorzugte erfindungsgemäße Fusionsproteine können Teile von intakten Antikörpern einschließen, die die antigenbindende Spezifität beibehalten, beispielsweise Fab-Fragmente, Fab'-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, F(v)-Fragmente, schwere Kettenmonomere oder -dimere, leichte Kettenmonomere oder -dimere, Dimere, die aus einer schweren und einer leichten Kette bestehen, und dergleichen.
Die am meisten bevorzugten Fusionsproteine sind chimär und umfassen eine Integrinantagonisteneinheit, die an alle oder einen Teil der Gelenkregionen und konstanten Regionen einer leichten Kette, schweren Kette eines Immunglobulins oder an beide fusioniert oder anderweitig gebunden ist. Daher zeichnet sich diese Erfindung durch ein Molekül aus, das (1) eine Integrinantagonisteneinheit, (2) ein zweites Peptid einschließt, z.B. eines, das die Löslichkeit oder die in-vivo-Lebensdauer der Integrinantagonisteneinheit erhöht, z.B. ein Mitglied der Immunglobulinsuperfamilie oder ein Fragment oder ein Teil davon, z.B. ein Teil oder ein Fragment von IgG1, z.B. der konstanten Region der schweren Kette des menschlichen IgG1, z.B. CH2, CH3 und Gelenkregionen. Genauer gesagt, ist eine „Integrinantagonist/Ig-Fusion" ein Protein, das erfindungsgemäße biologisch aktive Integrinantagonistenmoleküle (z.B. einen löslichen VLA-4- oder VLA-1-Liganden) oder ein biologisch aktives Fragment davon umfasst, die an einen N-Terminus einer Immunglobulinkette gebunden sind, wobei ein Teil des N-Terminus des Immunglobulins durch den Integrinantagonisten ersetzt ist. Eine Spezies der Integrinantagonist/Ig-Fusion ist eine „Integrin/Fc-Fusion", die ein Protein ist, das einen erfindungsgemäßen Integrinantagonisten umfasst, der an mindestens einen Teil der konstanten Domäne eines Immunglobulins gebunden ist. Eine bevorzugte Fc-Fusion umfasst einen erfindungsgemäßen Integrinantagonisten, der an ein Fragment eines Antikörpers gebunden ist, der die C-terminale Domäne der schweren Immunglobulinketten enthält.
Mit dem Begriff „Fusionsprotein" ist auch ein Integrinantagonist gemeint, der chemisch über ein mono- oder heterofunktionales Molekül an eine zweite Einheit gebunden ist, die kein Integrinantagonist ist (was zu einem „chimären" Molekül führt), und de novo aus gereinigtem Protein hergestellt wird, wie nachstehend beschrieben. Daher kann ein Beispiel eines chemisch gebundenen, im Gegensatz zu rekombinant gebundenen, chimären Moleküls, das ein Fusionsprotein ist, umfassen: (1) eine alpha4-Integrinuntereinheit-Zieleinheit, z.B. eine VCAM-1-Einheit, die an VLA-4 binden kann, auf der Oberfläche von VLA-4 tragenden Zellen; (2) ein zweites Molekül, das die Löslichkeit oder die in-vivo-Lebensdauer der Zieleinheit erhöht, z.B. ein Polyalkylenglykolpolymer wie Polyethylenglykol (PEG). Die alpha4-Zieleinheit kann jeder natürlich auftretende alpha4-Ligand oder Fragment davon sein, z.B. ein VCAM-1-Peptid oder eine ähnliche konservativ substituierte Aminosäuresequenz.
„Heterologer Promotor" – wie hier verwendet, ist ein Promotor, der nicht natürlich mit einem Gen oder einer gereinigten Nucleinsäure assoziiert ist.
„Homologie" – wie hier verwendet, ist synonym mit dem Begriff „Identität" und bezieht sich auf die Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Polypeptiden, Molekülen oder zwischen zwei Nucleinsäuren. Wenn eine Position in beiden der zwei verglichenen Sequenzen von derselben Base oder Aminosäuremonomeruntereinheit besetzt ist (beispielsweise, falls eine Position in jedem der beiden DNA-Moleküle von Adenin besetzt ist oder eine Position in jedem der beiden Polypeptide von einem Lysin besetzt ist), dann sind die entsprechenden Moleküle an jener Position homolog. Die prozentuale Homologie zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl der übereinstimmenden oder homologen Positionen, die zwei Sequenzen gemeinsam ist, geteilt durch die Anzahl der verglichenen Positionen × 100. Falls beispielsweise 6 der 10 Positionen in zwei Sequenzen übereinstimmen oder homolog sind, dann sind die beiden Sequenzen 60% homolog. Beispielsweise weisen die DNA-Sequenzen CTGACT und CAGGTT 50% Homologie auf (3 der insgesamt 6 Positionen stimmen überein). Im Allgemeinen erfolgt ein Vergleich, wenn zwei Sequenzen ausgerichtet werden, so dass sich eine maximale Homologie ergibt. Eine derartige Ausrichtung kann beispielsweise unter Verwendung des Verfahrens von Karlin und Altschul erfolgen, das nachstehend detaillierter beschrieben wird.
Homologen Sequenzen sind identische oder ähnliche Aminosäurereste gemeinsam, wobei ähnliche Reste konservative Substitutionen für oder „erlaubte Punktmutationen" von entsprechende(n) Aminosäurereste(n) in einer ausgerichteten Referenzsequenz sind. In dieser Hinsicht ist eine „konservative Substitution" eines Rests in einer Referenzsequenz diejenige Substitution, die den entsprechenden Referenzresten physikalisch oder funktional ähnelt, z.B. die eine ähnliche Größe, Form, elektrische Ladung, chemische Eigenschaften besitzen, einschließlich der Fähigkeit kovalente Bindungen oder Wasserstoffbrücken oder dergleichen zu erzeugen. Besonders bevorzugte konservative Substitutionen sind diejenigen, die die Kriterien erfüllen, die für eine „akzeptierte Punktmutation" in Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Ergänz. 3, Kapitel 22: 354–352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978) definiert werden.
„Homologie" und „Identität" sind hier austauschbar, und jeder Begriff bezieht sich auf die Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Polypeptidsequenzen. Die Homologie und Identität können bestimmt werden, indem eine Position in jeder Sequenz, die für Vergleichszwecke ausgerichtet werden kann, verglichen wird. Wenn eine Position in der verglichenen Sequenz von demselben Aminosäurerest besetzt ist, dann können die Polypeptide als an dieser Position identisch bezeichnet werden; wenn die äquivalente Position von derselben Aminosäure (z.B. identisch) oder einer ähnlichen Aminosäure (z.B. ähnlich in der sterischen und/oder elektronischen Natur) besetzt ist, dann kann man die Moleküle als an dieser Position homolog bezeichnen. Eine prozentuale Homologie oder Identität zwischen den Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl übereinstimmender oder homologer Positionen, die den Sequenzen gemeinsam sind. Eine „nicht verwandte" oder „nicht homologe" Sequenz weist weniger als 40 Prozent Identität, sogar vorzugsweise weniger als 25 Prozent Identität, mit einer Sequenz der vorliegenden Erfindung auf.
Die „prozentuale Homologie" von zwei Aminosäuresequenzen oder zwei Nucleinsäuresequenzen wird unter Verwendung des Ausrichtungsalgorithmus von Karlin und Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci., USA 87: 2264 (1990)) bestimmt, wie bei Karlin und Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci., USA 90: 5873 (1993)) modifiziert. Ein derartiger Algorithmus ist in die NBLAST- oder XBLAST-Programme von Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990) eingebaut. Die BLAST-Suche erfolgt mit dem NBLAST-Programm, Score = 100, Wortlänge = 12, um Nucleotidsequenzen zu erhalten, die zu einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure homolog sind. Die BLAST-Proteinsuche erfolgt mit dem XBLAST-Programm, Score = 50, Wortlänge = 3, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die zu einem Referenzpolypeptid homolog sind. Um für Vergleiche Ausrichtungen mit Lücken zu erhalten, wird Gapped BLAST verwendet, wie bei Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389 (1997) beschrieben. Bei Verwendung von BLAST und Gapped BLAST werden die Standardparameter des entsprechenden Programms (XBLAST und NBLAST) verwendet. Vgl. http://www/ncbi.nlm.nih.gov.
Mit „isoliert" (austauschbar mit „im Wesentlichen rein" verwendet), bei Bezugnahme auf Nucleinsäuresequenzen, d.h. Polynucleotidsequenzen, die Integrinantagonisten codieren, ist ein RNA- oder DNA-Polynucleotid, ein Teil eines genomischen Polynucleotids, cDNA- oder synthetisches Polynucleotid gemeint, das aufgrund seines Ursprungs oder seiner Bearbeitung: (i) nicht mit allen Polynucleotiden assoziiert ist, mit denen es in der Natur assoziiert ist (z.B. in einer Wirtszelle als Expressionsvektor oder als Teil davon vorhanden ist); oder (ii) mit einer Nucleinsäure oder einer anderen chemischen Einheit verbunden ist, die nicht diejenige ist, mit der sie in der Natur verbunden ist; oder (iii) nicht in der Natur auftritt. Mit „isoliert" ist ferner eine Polynucleotidsequenz gemeint, die (i) in vitro beispielsweise durch Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert wird; (ii) chemisch synthetisiert wird; (iii) rekombinant durch Clonieren hergestellt wird; oder (iv) gereinigt wird, wie durch Spaltung oder Gelauftrennung. Daher ist eine „im Wesentlichen reine Nucleinsäure" eine Nucleinsäure, die nicht unmittelbar an eine oder beide codierenden Sequenzen grenzt, an die sie normalerweise im natürlich auftretenden Genom des Organismus grenzt, von dem die Nucleinsäure stammt. Im Wesentlichen reine DNA schließt auch eine rekombinante DNA ein, die Teil eines Hybridgens ist, das zusätzliche Integrinsequenzen codiert.
Mit „isoliert" (austauschbar verwendet mit „im Wesentlichen rein"), bei Bezugnahme auf Polypeptide, ist ein Polypeptid oder ein Teil davon gemeint, das/der aufgrund seines Ursprungs oder Bearbeitung: (i) in einem Wirt als Expressionsprodukt eines Teils eines Expressionsvektors vorliegt; oder (ii) an ein Protein oder eine andere chemische Einheit gebunden ist, die nicht diejenige ist, an die sie in der Natur gebunden ist; oder (iii) nicht in der Natur auftritt, beispielsweise ein Protein, das durch Anhängen oder Hinzufügen von mindestens einer hydrophoben Einheit an das Protein chemisch bearbeitet ist, so dass das Protein in einer Form vorliegt, die man nicht in der Natur findet. Mit „isoliert" ist ferner ein Protein gemeint, das (i) chemisch synthetisiert wird; oder (ii) in einer Wirtszelle exprimiert wird und von assoziierten und kontaminierenden Proteinen freigereinigt wird. Der Begriff bedeutet im Allgemeinen ein Polypeptid, das von anderen Proteinen und Nucleinsäuren getrennt wurde, mit denen es natürlich auftritt. Vorzugsweise wird das Polypeptid auch von Substanzen wie Antikörpern oder der Gelmatrix (Polyacrylamid) getrennt, die zu seiner Reinigung verwendet werden.
„Multivalenter Proteinkomplex" – bezieht sich auf eine Vielzahl von Integrinantagonisten (d.h. einen oder mehrere). Ein anti-Integrinantikörperhomolog oder Fragment kann vernetzt oder an ein anderes Antikörperhomolog oder Fragment gebunden sein. Jedes Protein kann dasselbe sein oder sich unterscheiden und jedes Antikörperhomolog oder Fragment kann dasselbe sein oder sich unterscheiden.
„Mutante" – jegliche Änderung des genetischen Materials eines Organismus insbesondere jegliche Änderung (d.h. Deletion, Substitution, Addition oder Änderung) in einer Wildtyppolynucleotidsequenz oder jegliche Änderung in einem Wildtypprotein. Der Begriff „Mutein" wird austauschbar mit „Mutante" verwendet.
„Funktional verbunden" – eine Polynucleotidsequenz (DNA, RNA) ist mit einer Expressionskontrollsequenz funktional verbunden, wenn die Expressionskontrollsequenz die Transkription und Translation jener Polynucleotidsequenz kontrolliert und reguliert. Der Begriff „funktional verbunden" schließt den Besitz eines geeigneten Startsignals (z.B. ATG) vor der zu exprimierenden Polynucleotidsequenz und das Aufrechterhalten des richtigen Leserahmens ein, um die Expression der Polynucleotidsequenz unter der Kontrolle der Expressionskontrollsequenz und die Produktion des gewünschten Polypeptids zuzulassen, das von der Polynucleotidsequenz codiert wird.
Ein „pharmakologisches Mittel" wird definiert als eine oder mehrere Verbindungen oder Moleküle oder andere chemische Einheiten, die einem Patienten (zusätzlich zum erfindungsgemäßen Antagonisten) verabreicht werden, die die Wirkung des Antagonisten beeinflussen. Der Begriff „pharmakologisches Mittel", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein derartiges/derartige Mittel, das/die während einer „Kombinationstherapie" verabreicht wird/werden, wobei der erfindungsgemäße Antagonist entweder vor, nach oder gleichzeitig mit der Verabreichung von einem oder mehreren pharmakologischen Mitteln verabreicht wird.
„Protein" – jegliches Polymer, das im Wesentlichen aus irgendeiner der 20 Aminosäuren besteht. Obwohl häufig „Polypeptid" in Bezug auf relativ große Polypeptide verwendet wird und „Peptid" häufig in Bezug auf kleine Polypeptide verwendet wird, überschneidet sich die Verwendung dieser Begriffe im Fachgebiet und wird variiert. Der Begriff „Protein", wie hier verwendet, bezieht sich auf Peptide, Proteine und Polypeptide, wenn nicht anders angegeben.
Die Begriffe „Peptid(e)", „Protein(e)" und „Polypeptid(e)" werden hier austauschbar verwendet. Die Begriffe „Polynucleotidsequenz" und „Nucleotidsequenz" werden hier ebenfalls austauschbar verwendet.
„Rekombinant", wie hier verwendet, bedeutet, dass ein Protein von rekombinanten Säugerexpressionssystemen stammt. Da Integrin weder glycosyliert ist noch Disulfidbrücken enthält, kann es in den meisten prokaryontischen und eukaryontischen Expressionssystemen exprimiert werden.
„Kleines Molekül" – entspricht der Definition wie in Abschnitt A2.
Mit dem Begriff „Oberflächenaminosäure" ist jede Aminosäure gemeint, die bei der Faltung eines Proteins in seiner nativen Form einem Lösungsmittel ausgesetzt ist.
Mit „Hybridisierungsbedingungen" sind im Allgemeinen Salz- und Temperaturbedingungen gemeint, die im Wesentlichen 0,5 X SSC bis etwa 5 X SSC und 65°C sowohl in Bezug auf die Hybridisierung als auch die Waschschritte entsprechen. Der Begriff „Standardhybridisierungsbedingungen", wie hier verwendet, ist daher eine operationale Definition und umfasst einen Bereich von Hybridisierungsbedingungen. Dennoch schließen „hoch stringente" Bedingungen die 12–20-stündige Hybridisierung mit Plaquedurchmusterungspuffer (0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll 400; 0,2% Rinderserumalbumin, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 M NaCl; 0,1 % Natriumpyrophosphat; 1 % SDS); 10% Dextransulfat und 100 μg/ml denaturierter, mit Ultraschall behandelter Lachssperma-DNA bei 65°C und Waschen mit 75 mM NaCl/7,5 mM Natriumcitrat (0,5 × SSC)/1 % SDS bei 65°C ein. „Niedrige stringente" Bedingungen schließen die 12–20-stündige Hybridisierung mit Plaquedurchmusterungspufter, 10% Dextransulfat und 110 μg/ml denaturierter, mit Ultraschall behandelter Lachssperma-DNA bei 55°C und Waschen mit 300 mM NaCl/30mM Natriumcitrat (2,0 × SSC)/1% SDS bei 55°C ein. Vgl. auch Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York, Abschnitte 6.3.1–6.3.6, (1989).
Eine „therapeutische Zusammensetzung", wie hier verwendet, wird so definiert, dass sie die erfindungsgemäßen Antagonisten und andere biologisch kompatible Bestandteile umfasst. Die therapeutische Zusammensetzung kann Excipienten wie Wasser, Mineralien und Träger wie Protein enthalten.
Ein „Patient mit einem fibrotischen Zustand" bezieht sich auf, ist jedoch nicht begrenzt auf Patienten, die an einer Fibrose eines inneren Organs leiden, Patienten, die an einer dermalen Fibrosestörung leiden, und Patienten, die an fibrotischen Zuständen des Auges leiden. Die Fibrose der inneren Organe (z.B. Leber, Lunge, Niere, Blutgefäße des Herzens oder der Gastrointestinaltrakt) tritt bei Erkrankungen wie Lungenfibrose, Myelofibrose, Leberzirrhose, mesangialer proliferativer Glomerulonephritis, rasch progredienter Glomerulonephritis, diabetischer Nephropathie, renaler interstitieller Fibrose, renaler Fibrose bei Patienten, die Cyclosporin erhalten, und HIV-assoziierter Nephropathie auf. Dermale Fibrosestörungen schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Skleroderma, Morphea, Keloide, hypertrophische Narben, familiäres kutanes Kollagenom oder Bindegewebsnaevi vom Kollagentyp. Fibrotische Zustände des Auges schließen Zustände wie diabetische Retinopathie, postoperative Narbenbildung (beispielsweise nach einer filtrierenden Glaukomoperationen und nach einer Schieloperation) und proliferative Vitreoreti nopathie ein. Zusätzliche fibrotische Zustände, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen ein: rheumatoide Arthritis, Erkrankungen, die mit anhaltenden Gelenkschmerzen und zerstörten Gelenken assoziiert sind; progressive systemische Sklerose, Polymyositis, Dermatomyositis, eosinophile Fascitis, Morphea, Raynaud-Syndrom und nasale Polypose. Zudem schließen fibrotische Zustände, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, auch die Hemmung der Überproduktion von Narbengewebe bei Patienten ein, von denen bekannt ist, dass sie Keloide oder hypertrophe Narben bilden, die Hemmung oder das Verhindern der Narbenbildung oder Überproduktion von Narbengewebe während der Heilung von verschiedenen Arten von Wunden, einschließlich Operationsinzisionen, Operationswunden des Abdomens und traumatische Lazerationen, die Hemmung oder das Verhindern der Narbenbildung und des Wiederverschließens von Arterien nach koronarer Angioplasie, die Hemmung oder das Verhindern der überschüssigen Bildung von Narben- oder fibrösem Gewebe, assoziiert mit einer Fibrose des Herzens nach einem Infarkt und bei hypersensitiver Vasculopathie.
„Eine wirksame Menge" ist eine Menge, die ausreicht, um nützliche oder gewünschte Ergebnisse zu erzielen. Eine wirksame Menge kann in einer oder mehreren Gaben verabreicht werden. Hinsichtlich der Behandlung ist eine „wirksame Menge" eines Antagonisten zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eine Menge, die ausreicht, um das Fortschreiten eines fibrotischen Zustandes in Übereinstimmung mit zulässigen Standards für die zu behandelnden Erkrankungen zu lindern, zu verbessern, zu stabilisieren, umzukehren, zu verlangsamen oder zu verzögern. Der Nachweis und die Messung von Indikatoren der Wirksamkeit kann durch zahlreiche, zur Verfügung stehende diagnostische Werkzeuge, einschließlich beispielsweise durch physische Untersuchung einschließlich Bluttests, Lungenfunktionsprüfungen und Röntgen der Brust; CT-Scan; Bronchoskopie; bronchoalveoläre Lavage; Lungenbiopsie und CT-Scan gemessen werden.
In der Praxis der vorliegenden Erfindung werden, wenn nicht anders angegeben, herkömmliche Verfahren der Zellbiologie, Zellkultur, Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA, Proteinchemie, Pharmakologie und Immunologie angewandt, die es im Fachgebiet gibt. Derartige Verfahren sind in der Literatur beschrieben.
II. Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Anmeldung ist auf die Entdeckung gerichtet, dass Antagonisten gegen alpha1- und/oder alpha4-Untereinheiten enthaltene Integrine und Fragmente davon für die Behandlung von Lungenfibrose verwendet werden können.
A. Integrinantagonisten
Für die erfindungsgemäßen Zwecke kann ein Integrinantagonist ein Antagonist für jede Interaktion zwischen einem Integrin und seinem dazu gehörigen Liganden oder Rezeptor sein, so dass die normale Funktion, die von den Liganden-Rezeptor-Interaktionen induziert werden, geändert wird (d.h. verhindert oder verlangsamt oder anderweitig modifiziert). Eine bevorzugte Ausführungsform eines Integrinantagonisten ist ein Antagonist der Interaktionen von alpha4-Integrinen mit ihren Liganden, wie die VCAM-1/VLA-4-Interaktion. Das ist ein Mittel, z.B. ein Polypeptid oder ein anderes Molekül, das die VCAM-1- und/oder VLA-4-vermittelte Bindung hemmen oder blockieren kann oder das anderweitig die VCAM-1 und/oder VLA-4-Funktion modulieren kann, z.B. durch Hemmen oder Blockieren der VLA-4-Liganden-vermittelten VLA-4-Signaltransduktion oder VCAM-1-Liganden-vermittelten VCAM-1-Signaltransduktion, und das bei der Behandlung von akuten Gehirnverletzungen wirksam ist, vorzugsweise auf dieselbe Weise, wie es bei den VLA-4-Antikörpern der Fall ist.
Ein Antagonist der VCAM-1-/VLA-4-Interaktion ist ein Mittel, das eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften besitzt: (1) es bedeckt oder bindet an VLA-4 an der Oberfläche einer VLA-4-tragenden Zelle (z.B. einer Endothelzelle) mit genügend Spezifität, um eine VLA-4-Liganden/VLA-4-Interaktion zu hemmen, z.B. die VCAM-1/VLA-4-Interaktion; (2) es bedeckt oder bindet an VLA-4 an der Oberfläche einer VLA-4-tragenden Zelle (z.B. eines Lymphocyten) mit genügend Spezifität, um die Übertragung eines VLA-4-vermittelten Signals, z.B. der VLA-4/VCAM-1-vermittelten Signalgebung zu modifizieren und vorzugsweise zu hemmen; (3) es bedeckt oder bindet an einen VLA-4-Liganden (z.B. VCAM-1) auf Endothelzellen mit genügend Spezifität, um die VLA-4/VCAM-1-Interaktion zu hemmen; (4) es bedeckt oder bindet an einen VLA-4-Liganden (z.B. VCAM-1) mit genügend Spezifität, um die Übertragung einer VLA-4-Liganden-vermittelten VLA-4-Signalgebung, z.B. der VCAM-1-vermittelten VLA-4-Signalgebung, zu modifizieren und vorzugsweise zu hemmen. In bevorzugten Ausführungsformen besitzt der Antagonist eine oder beide der Eigenschaften 1 und 2. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen besitzt der Antagonist eine oder beide der Eigenschaften 3 und 4. Außerdem kann mehr als ein Antagonist verwendet werden, z.B. kann ein Mittel, das an VLA-4 bindet, mit einem Mittel kombiniert werden, das an VCAM-1 bindet.
Eine weitere Ausführungsform eines Integrinantagonisten ist ein Antagonist der Interaktionen von alpha1-Integrinen mit ihren Liganden wie der Kollagen/VLA-1-Interaktion. Das ist ein Mittel, z.B. ein Polypeptid oder ein anderes Molekül, das die Kollagen- und/oder die VLA-1-vermittelte Bindung hemmen oder blockieren kann oder das ansonsten die Kollagen- und/oder VLA-1-Funktion z.B. durch Hemmen oder Blockieren der VLA-1-Liganden vermittelten VLA-1-Signalübertragung oder Kollagen-vermittelten Kollagen-Signalübertragung modulieren kann. Ein Antagonist der Kollagen/VLA-1-Interaktion ist ein Mittel, das eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften besitzt: (1) es bedeckt oder bindet an VLA-1 an der Oberfläche einer VLA-1-tragenden Zelle (z.B. Kollagen) mit genügend Spezifität, um eine VLA-1-Liganden/VLA-1-Interaktion zu hemmen, z.B. die KollagenNLA-1-Interaktion; (2) es bedeckt oder bindet an VLA-1 an der Oberfläche einer VLA-1-tragenden Zelle mit genügend Spezifität, um die Übertragung eines VLA-1-vermittelten Signals, z.B. der VLA-1/Kollagen-vermittelten Signalübertragung, zu modifizieren und vorzugsweise zu hemmen; (3) es bedeckt oder bindet an einen VLA1-Liganden (z.B. Kollagen) mit genügend Spezifität, um die VLA-1/Kollagen-Interaktion zu hemmen; (4) es bedeckt oder bindet an einen VLA-1-Liganden mit genügend Spezifität, um die Übertragung einer VLA-1-Liganden-vermittelten VLA-1-Signalgebung, z.B. der Kollagen-vermittelten VLA-1-Signalgebung, zu modifizieren und vorzugsweise zu hemmen. In bevorzugten Ausführungsformen besitzt der alpha1-Antagonist eine oder beide der Eigenschaften 1 und 2. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen besitzt der Antagonist eine oder beide der Eigenschaften 3 und 4. Außerdem kann mehr als ein Antagonist an einen Patienten verabreicht werden, z.B. kann ein Mittel, das an VLA-1 bindet, mit einem Mittel kombiniert werden, das an Kollagen bindet.
Wie hier diskutiert, sind die in der Erfindung verwendeten Antagonisten nicht auf eine bestimmte Molekülart oder eine bestimmte Molekülstruktur begrenzt, so dass für erfindungsgemäße Zwecke und ausschließlich beispielhaft jedes Mittel, das alpha4-Integrine (z.B. VLA-4) auf der Oberfläche von Zellen oder einen alpha4- Liganden wie VCAM-1 auf der Oberfläche von alpha4-Liganden-tragenden Zellen binden kann und das alpha4-Integrin (z.B. VLA-4) oder den alpha4-Liganden (z.B. VCAM-1), wirksam blockieren oder bedecken kann, wobei es als „alpha4-Integrin bindendes Mittel" bzw. „alpha4-Integrinliganden bindendes Mittel" bezeichnet wird, als Äquivalent der hier in den Beispielen verwendeten Antagonisten betrachtet wird.
Beispielsweise sind Antikörper oder Antikörperhomologe (nachstehend diskutiert) sowie lösliche Formen der natürlichen Bindeproteine für VLA-4 und VCAM-1 nützlich. Lösliche Formen der natürlichen Bindeproteine für VLA-4 schließen lösliche VCAM-1-Peptide, VCAM-1-Fusionsproteine, bifunktionale VCAM-1/Ig-Fusionsproteine (z.B. „chimäre" Moleküle, vorstehend diskutiert), Fibronectin, Fibronectin mit einem alternativ gespleißten non-Typ III-Verbindungssegment und Fibronectinpeptide, die die Aminosäuresequenz EILDV oder eine ähnliche konservativ substituierte Aminosäuresequenz enthalten, ein. Die löslichen Formen der natürlichen Bindeproteine für VCAM-1 schließen lösliche VLA-4-Peptide, VLA-4-Fusionsproteine, bifunktionale VLA-4/Ig-Fusionsproteine und dergleichen ein. Wie hier verwendet, ist ein „lösliches VLA-4-Peptid" oder ein „lösliches VCAM-1-Peptid" ein VLA-4- oder VCAM-1-Polypeptid, das sich nicht selbst in einer Membran verankern kann. Derartige lösliche Polypeptide schließen beispielsweise VLA-4- und VCAM-1-Polypeptide ein, denen ein ausreichender Anteil ihrer membranumspannenden Domäne fehlt, um das Polypeptid zu verankern, oder die so modifiziert sind, dass die membranumspannende Domäne nicht funktional ist. Diese bindenden Agentien können wirken, indem sie mit dem zelloberflächenbindenden Protein um VLA-4 konkurrieren oder indem sie ansonsten die VLA-4-Funktion ändern. Es kann beispielsweise eine lösliche Form von VCAM-1 (vgl. z.B. Osborn et al. 1989, Cell, 59: 1203–1211) oder ein Fragment davon verabreicht werden, um an VLA-4 zu binden und vorzugsweise um eine VLA-4-Bindestelle auf VCAM-1-tragenden Zellen zu konkurrieren, was so zu Effekten führt, die der Verabreichung von Antagonisten wie kleinen Moleküle oder anti-VLA-4-Antikörpern, ähnelt.
1. Anti-Integrin-Antikörperhomologe
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen sind die in der Erfindung, zur Bindung, einschließlich Blockierung und Bedeckung, an das Zelloberflächen-alpha1- und/oder -alpha4-Integerin (wie VLA-1, VLA-4 oder alpha4beta7) und/oder Zelloberflächenliganden für alpha1- und/oder alpha4-Integrine (wie Kollagen bzw. VCAM-1) verwendeten Antagonisten ein monoclonaler anti-VLA-1- oder anti-VLA-4- und/oder ein anti-Kollagen- und/oder ein anti-VCAM-1-Antikörper oder ein Antikörperhomolog, wie kürzlich definiert. Bevorzugte Antikörper und Homologe zur Behandlung, insbesondere zur Behandlung von Menschen, schließen menschliche Antikörperhomologe, humanisierte Antikörperhomologe, chimäre Antikörperhomologe, Fab-, Fab'-, F(ab')2- und F(v)-Antikörperfragmente und Monomere oder Dimere der schweren oder leichten Ketten von Antikörpern oder Gemische davon ein. Monoclonale Antikörper gegen VLA-4 sind ein bevorzugtes bindendes Mittel beim erfindungsgemäßen Verfahren.
2. Kleinmolekülige Integrinantagonisten
Der Begriff „kleinmoleküliger" Integrinantagonist bezieht sich auf chemische Agentien (d.h. organische Moleküle), die die Integrin/Integrinliganden-Interaktion stören können, indem beispielsweise die VLA-4/VCAM-Interaktionen durch Bindung von VLA-4 auf der Zelloberfläche oder Bindung von VCAM-1 auf der Zelloberfläche blockiert werden. Derartige kleine Moleküle können auch entsprechende VLA-4- und VCAM-1-Rezeptoren binden. Kleinmolekülige VLA-4- und VCAM-1-Inhibitoren können selbst Peptide, Semipeptidverbindungen oder Nicht-Peptidverbindungen sein, wie kleine organische Moleküle, die Antagonisten der VCAM-1/VLA-4-Interaktion sind. „Kleinmolekülig", wie hier definiert, soll nicht einen Antikörper oder ein Antikörperhomolog umfassen. Das Molekulargewicht von beispielhaften kleinen Molekülen liegt im Allgemeinen unter 1000.
Es können beispielsweise kleine Moleküle wie Oligosaccharide eingesetzt werden, die die Bindungsdomäne eines VLA-4-Liganden nachahmen und in die Rezeptordomäne von VLA-4 passen. (Vgl. J.J. Devlin et al., 1990, Science 249: 400–406 (1990), J.K. Scott und G.P. Smith, 1990, Science 249: 386–390 und US-Patent 4,833,092 (Geysen)).
Umgekehrt können kleine Moleküle verwendet werden, die die Bindungsdomäne eines VCAM-1-Liganden nachahmen und in die Rezeptordomäne von VCAM-1 passen.
Beispiele anderer kleiner Moleküle, die in der Erfindung nützlich sind, kann man bei Komoriya et al. („The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-Specific Adhesion Site (CS1) Within the Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronectin Is Leucine-Aspartic Acid-Valine", J. Biol. Chem., 266 (23), S. 15075–79 (1991)) finden. Sie identifizierten die minimale aktive Aminosäuresequenz, die notwendig ist, um VLA-4 zu binden und synthetisierten eine Vielzahl von sich überschneidenden Peptiden, basierend auf der Aminosäuresequenz der CS-1-Region (der VLA-4 bindenden Domäne) einer bestimmten Fibronectinspezies. Sie identifizierten ein Peptid aus 8 Aminosäuren, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr, sowie zwei kleinere sich überschneidende Pentapeptide, Glu-Ile-Leu-Asp-Val und Leu-Asp-Val-Pro-Ser, die hemmende Aktivität gegen Fibronektin-abhängige Zelladhäsion besaßen. Es wurde anschließend gezeigt, das bestimmte größere Peptide, die die LDV-Sequenz enthielten, in vivo aktiv waren (T. A. Ferguson et al., „Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-cell-Mediated Immune Responses In Vivo", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, S. 8072–76 (1991); und S. M. Wahl et al., „Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment", J. Clin. Invest., 94, S. 655–62 (1994)). Ein zyklisches Pentapeptid, Arg-Cys-Asp-TPro-Cys (wobei TPro 4-Thioprolin bedeutet), das sowohl die VLA-4- als auch die VLA-5-Adhäsion an Fibronectin hemmen kann, wurde ebenfalls beschrieben. (Vgl. z.B. D.M. Nowlin et al. „A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits Alpha4Beta1 Integrin-mediated Cell Adhesion", J. Biol. Chem., 268(27), S. 20352–59 (1993); und PCT-Veröffentlichungsschrift PCT/US91/04862). Dieses Pentapeptid basierte auf der Tripeptidsequenz Arg-Gly-Asp aus Fibronectin, die als übliches Motiv in der Erkennungsstelle für mehrere extrazelluläre Matrixproteine bekannt ist. Über Beispiele anderer VLA-4-Inhibitoren wurde berichtet, beispielsweise bei Adams et al. „Cell Adhesion Inhibitors", PCT US97/13013, wobei lineare Peptidylverbindungen beschrieben wurden, die beta-Aminosäuren enthalten, die zelladhäsionshemmende Aktivitäten besitzen. Die internationalen Patentanmeldungen WO 94/15958 und WO 92/00995 beschreiben zyklische Peptid- und peptidomimetische Verbindungen mit zelladhäsionshemmender Aktivität. Die internationalen Patentanmeldungen WO 93/08823 und WO 92/08464 beschreiben Guanidinyl-, Harnstoff- und Thioharnstoffenthaltende zelladhäsionshemmende Verbindungen. Das US-Patent Nr. 5,260,277 beschreibt zelladhäsionsmodulierende Guanidinyl-Verbindungen. Es wurden andere Peptidylantagonisten von VLA-4 bei D. Y. Jackson et al., „Potent α4β1 peptide antagonists as potential anti-inflammatory agents", J. Med. Chem., 40,3359 (1997); H. Shroff et al., „Small peptide inhibitors of α4β7 mediated MadCAM-1 adhesion to lymphocytes", Bio. Med, Chem. Lett, 1 2495 (1996); im US-Patent 5,510,332, in den PCT-Veröffentlichungen WO98/53814, WO97/03094, WO97/02289, WO96/40781, WO96/22966, WO96/20216, WO96/01644, WO96/06108 und WO95/15973 sowie weiteren beschrieben.
Derartige kleinmolekülige Mittel können hergestellt werden, indem eine Vielzahl von Peptiden (z.B. mit einer Länge von 5 bis 20 Aminosäuren), Semipeptidverbindungen oder nicht-peptidische, organische Verbindungen synthetisiert werden und anschließend jene Verbindungen nach ihrer Fähigkeit, die entsprechende VLA-1/Kollagen oder VLA-4NCAM-1-Interaction zu hemmen, durchmustert werden. Vgl. allgemein US-Patent Nr. 4,833,092, Scott und Smith, „Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library", Science, 249, S. 386–90 (1990) und Devlin et al., „Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules", Science, 249, S. 40407 (1990).
B. Verfahren zur Herstellung von Anti-Integrin-Antikörperhomologen
Die Technologie zur Herstellung monoclonaler Antikörper, einschließlich beispielsweise monoclonaler anti-Integrin-Antikörper, ist gut bekannt. Vgl. beispielsweise, Mendrick et al. 1995, Lab. Invest. 72:367–375 (mAk gegen murinen anti-α1β1 und anti-(α2β1); Sonnenberg et al. 1987 J Biol. Chem. 262:10376–10383 (mAk gegen murinen anti-α6β1); Yao et al. 1996, J Cell Sci 1996 109:3139–50 (mAk gegen murinen anti-(α7β1); Hemler et al. 1984, J Immunol 132:3011–8 (mAk gegen menschliches α1β1); Pischel et al. 1987 J Immunol 138:226–33 (mAk gegen menschliches α2β1); Wayner et al. 1988, J Cell Biol 107:1881–91 (mAk gegen menschliches (α3β1); Hemler et al. 1987 J Biol Chem 262:11478–85 (mAk gegen menschliches α4β1); Wayner et al. 1988 J Cell Biol 107:1881–91 (mAk gegen menschliches α5β1); Sonnenberg et al. 1987, J. Biol. Chem. 262:10376–10383 (mAk gegen menschliches α6β1); A Wang et al. 1996 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:664–672 (mAk gegen menschliches α9β1); Davies et al. 1989 J Cell Biol 109:1817–26 (mAk gegen menschliches αVβ1); Sanchez-Madrid et al. 1982, Proc Natl Acad Sci USA 79:7489–93 (mAk gegen menschliches αLβ1); Diamond et al. 1993, J Cell Biol 120:1031–43 (mAk gegen menschliches αMβ1); Stacker et al. 1991 J Immunol 146:648–55 (mAk gegen menschliches αXβ1); Van der Vieren et al 1995 Immunity 3:683–90 (mAk gegen menschliches αDβ1); Bennett et al. 1983 Proc Natl Acad Sci USA 80:2417–21 (mAk gegen menschliches αIIbβ8); Hessle et al. 1984, Differentiation 26:49–54 (mAk gegen menschliches α6β4); Weinacker et al. 1994 J Biol Chem 269:6940–8 (mAk gegen menschliches αVβ5); Weinacker et al. 1994 J Biol Chem 269:6940–8 (mAk gegen menschliches αVβ6); Cerf-Bensussan et al. 1992 Eur J Immunol 22:273–7 (mAk gegen menschliches αEβ7); Nishimura et al. 1994 J Biol Chem 269:28708–15 (mAk gegen menschliches αVβ8); Bossy et al. 1991 EMBO J 10:2375–85 (polyclonale Antiseren gegen menschliches α8β1); Camper et al. 1998 J. Biol. Chem. 273:20383–20389 (polyclonale Antiseren gegen menschliches α10β1).
Die bevorzugten hier in Betracht gezogenen Integrinantagonisten können aus intakter oder verkürzter genomischer DNA oder cDNA oder aus synthetischen DNAs in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen exprimiert werden. Die dimeren Proteine können aus dem Kulturmedium isoliert werden und/oder rückgefaltet und in vitro dimerisiert werden, um biologisch aktive Zusammensetzungen zu erzeugen. Heterodimere können in vitro durch Kombinieren von getrennten unterschiedlichen Polypeptidketten erzeugt werden. Alternativ können Heterodimere in einer Einzelzelle durch gemeinsame Expression von Nucleinsäuren erzeugt werden, die getrennte unterschiedliche Polypeptidketten codieren. Vgl. beispielsweise WO93/09229 oder US-Pat. Nr. 5,411,941 bezüglich Vorschriften zur Herstellung mehrerer, beispielhafter, rekombinanter, heterodimerer Proteine. Derzeit bevorzugte Wirtszellen schließen ohne Einschränkung Prokaryonten einschließlich E.coli oder Eukaryonten einschließlich Saccharomyces, Insektenzellen oder Säugerzellen wie CHO-, COS- oder BSC-Zellen ein. Dem Fachmann ist bewusst, dass andere Wirtszellen vorteilhaft verwendet werden können.
Beispielsweise können anti-VLA-4-Antikörper durch Immunpräzipitation von 125J-markierten Zelllysaten aus VLA-4-exprimierenden Zellen identifiziert werden. (Vgl. Sanchez-Madrid et al. 1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343–1349 und Hemler et al. 1987, J. Biol. Chem, 262, 11478–11485). Anti-VLA-4-Antikörper können auch mittels Durchflusscytometrie identifiziert werden, z.B. durch Messen der Fluoreszenzfärbung von Ramos-Zellen, die mit einem Antikörper inkubiert werden, von dem man annimmt, dass er VLA-4 erkennt (vgl. Elices et al., 1990 Cell, 60: 577584). Die bei der Herstellung von Hybridomzellen verwendeten Lymphocyten werden typischerweise aus immunisierten Säugern isoliert, deren Seren bereits positiv auf das Vorliegen von anti-VLA-4-Antikörpern unter Verwendung derartiger Durchmusterungstests getestet wurden.
Die unsterbliche Zelllinie (z.B. eine Myelomzelllinie) stammt typischerweise von derselben Säugerspezies wie die Lymphocyten. Bevorzugte unsterbliche Zelllinien sind Maus-Myelomzelllinien, die gegenüber dem Kulturmedium sensitiv sind, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin („HAT-Medium") enthält. Die HAT-sensitiven Maus-Myelomzellen werden typischerweise mit Maus-Splenocyten unter Verwendung von Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1500 („PEG 1500") fusioniert. Die sich aus der Fusion ergebenden Hybridomzellen werden dann unter Verwendung von HAT-Medium selektiert, das nicht fusionierte und nichtproduktiv fusionierte Myelomzellen abtötet (nicht fusionierte Splenocyten sterben nach mehreren Tagen, da sie nicht transformiert sind). Hybridome, die einen gewünschten Antikörper produzieren, werden nachgewiesen, indem die Hybridomkulturüberstände durchmustert werden. Beispielsweise können Hybridome, die zur Herstellung von anti-VLA-4-Antikörpern hergestellt werden, durchmustert werden, indem der Hybridomkulturüberstand auf sekretierte Antikörper mit der Fähigkeit, an eine rekombinante alpha4-Untereinheiten-exprimierende Zelllinie zu binden, getestet wird (vgl. Elices et al., a.a.O.).
Um anti-VLA-4-Antikörperhomologe herzustellen, die intakte Immunglobuline sind, wurden positiv getestete Hybridomzellen in derartigen Durchmusterungstests in einem Nährmedium und unter Bedingungen ausreichend lange kultiviert, so dass die Hybridomzellen monoclonale Antikörper in das Kulturmedium sekretieren konnten. Die Gewebekulturverfahren und Kulturmedien, die für Hybridomzellen geeignet sind, sind gut bekannt. Der konditionierte Hybridomkulturüberstand kann gesammelt werden, und die anti-VLA-4-Antikörper können fakultativ durch gut bekannte Verfahren weiter gereinigt werden.
Alternativ kann der gewünschte Antikörper hergestellt werden, indem die Hybridomzellen in die Peritonealhöhle einer nicht immunisierten Maus injiziert werden. Die Hybridomzellen proliferieren in der Peritonealhöhle, wobei der Antikörper sekretiert wird, der als Ascitesflüssigkeit akkumuliert. Der Antikörper kann geerntet werden, indem die Ascitesflüssigkeit aus der Peritonealhöhle mit einer Spritze abgezogen wird.
Mehrere monoclonale Maus-anti-VLA-4-Antikörper wurden kürzlich beschrieben. Vgl. z.B. Sanchez-Madrid et al., 1986, a.a.O.; Hemler et al., 1987, a.a.O.; Pulido et al., 1991, J. Biol. Chem., 266 (16), 10241–10245); Issekutz und Wykretowicz, 1991, J. Immunol., 147: 109 (TA-2-mAk). Diese monoclonalen anti-VLA-4-Antikörper und andere anti-VLA-4-Antikörper (z.B. US-Patent 5,888,507-Biogen, Inc. und darin zitierte Referenzen), die die alpha- und/oder beta-Kette von VLA-4 erkennen können, sind bei den Behandlungsverfahren nach der vorliegenden Erfindung nützlich. Anti-VLA-4-Antikörper, die die Epitope der VLA-4-alpha4-Ketten erkennen, die an der Bindung an VCAM-1- und Fibronectinliganden beteiligt sind (d.h. Antikörper, die an VLA-4 an einer Stelle binden können, die an der Ligandenerkennung beteiligt ist und die die VCAM-1- und Fibronectinbindung blockieren können) werden bevorzugt. Derartige Antikörper wurden als B-Epitopspezifische Antikörper (B1 oder B2) definiert (Pulido et al., 1991, a.a.O.) und sind ebenfalls anti-VLA-4-Antikörper nach der vorliegenden Erfindung.
Vollständig menschliche monoclonale Antikörperhomologe gegen VLA-4 sind ein weiteres bevorzugtes bindendes Mittel, das VLA-4-Liganden im erfindungsgemäßen Verfahren blockieren oder bedecken kann. In ihrer intakten Form können diese unter Verwendung von in vitro-sensibilisierten menschlichen Splenocyten hergestellt werden, wie von Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147, 86–95, beschrieben. Alternativ können sie durch Repertoire-Clonierung, wie von Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432–2436 oder von Huang und Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227–236, beschrieben, hergestellt werden. US-Patent 5,798,230 (25. Aug. 1998, „Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use"), das die Herstellung von menschlichen monoclonalen Antikörpern aus menschlichen B-Zellen beschreibt. Nach diesem Verfahren werden menschliche antikörperproduzierende B-Zellen durch Infektion mit einem Epstein-Barr-Virus oder einem Derivat davon immortalisiert, das das Kernantigen 2 des Epstein-Barr-Virus (EBNA2) exprimiert. Die EBNA2-Funktion, die für die Immortalisierung erforderlich ist, wird anschließend abgeschaltet, was zu einer Zunahme der Antikörperproduktion führt.
In einem noch anderen Verfahren zur Herstellung vollkommen menschlicher Antikörper beschreibt US-Patent 5,789,650 (4. Aug. 1998, „Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies") transgene Lebewesen, die keine Menschen sind und heterologe Antikörper produzieren können, und transgene Lebewesen, die keine Menschen sind, mit inaktivierten endogenen Immunglobulingenen. Endogene Immunglobulingene werden durch Antisense-Polynucleotide und/oder durch Antiserum unterdrückt, das gegen endogene Immunglobuline gerichtet ist. Heterologe Antikörper werden von Immunglobulingenen codiert, die man normalerweise nicht im Genom jener Spezies von Lebewesen, die keine Menschen sind, findet. Ein oder mehrere Transgene, die Sequenzen von nicht umgelagerten, heterologen schweren Ketten des menschlichen Immunglobulins enthalten, werden in ein Tier, das kein Mensch ist, eingeführt, so dass ein transgenes Tier erzeugt wird, das die transgenen Immunglobulinsequenzen funktional umlagern kann und ein Antikörperrepertoir aus verschiedenen Isotypen produzieren kann, die von menschlichen Immunglobulingenen codiert werden. Derartige heterologe menschliche Antikörper werden in B-Zellen produziert, die anschließend immortalisiert werden, z.B. durch Fusionieren mit einer immortalisierten Zelllinie wie ein Myelom oder durch Manipulieren derartiger B-Zellen durch andere Verfahren, um eine Zelllinie aufrechtzuerhalten, die ein monoclonales, heterologes, vollkommen menschliches Antikörperhomolog produzieren kann.
Große nicht immunisierte menschliche Phagen-Displaybanken können auch verwendet werden, um Antikörper mit hoher Affinität, die als Therapeutika für Menschen entwickelt werden können, unter Verwendung von Standard-Phagentechnologie zu isolieren (Vaughan et al, 1996).
Ein noch weiteres bevorzugtes bindendes Mittel, das Integrinliganden im erfindungsgemäßen Verfahren blockieren oder bedecken kann, ist ein humanisiertes rekombinantes Antikörperhomolog mit anti-Integrinspezifität. Wenn man die frühen Verfahren zur Herstellung von echten „chimären Antikörpern" (bei denen die gesamten konstanten und gesamten variablen Regionen von verschiedenen Quellen stammen) verfolgt, wurde in EP 0239400 (Winter et al.) ein neuer Ansatz beschrieben, in dem Antikörper durch Substitution (innerhalb einer vorgegebenen variablen Region) ihrer komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) für eine Spezies durch diejenigen einer anderen verändert werden. Dieses Verfahren kann beispielsweise verwendet werden, um die CDRs aus den Domänen der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten von menschlichem Ig mit alternativen CDRs aus Domänen von murinen variablen Regionen zu substituieren. Diese veränderten variablen Regionen von Ig können anschließend mit den konstanten Regionen des menschlichen Ig kombiniert werden, um Antikörper zu erzeugen, die in der Zusammensetzung vollkommen menschlich sind, mit Ausnahme der substituierten murinen CDRs. Derartige CDR-substituierte Antikörper würden im Vergleich zu echten chimären Antikörpern voraussichtlich mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit eine Immunreaktion bei Menschen hervorrufen, da die CDR-substituierten Antikörper beträchtlich weniger nicht menschliche Komponenten enthalten. Das Verfahren zur Humanisierung monoclonaler Antikörper über CDR-„Grafting" wurde als Umformung („reshaping") bezeichnet (Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323–327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534–1536).
Typischerweise werden die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) eines murinen Antikörpers in die entsprechenden Regionen in einem menschlichen Antikörper transplantiert, da es die CDRs sind (drei in den schweren Ketten des Antikörpers, drei in den leichten Ketten), die die Bereiche des Maus-Antikörpers ausmachen, die an ein spezifisches Antigen binden. Die Transplantation von CDRs wird durch ein gentechnisches Verfahren erreicht, bei dem die CDR-DNA-Sequenzen durch Clonierung von Genabschnitten der variablen (V) Region der schweren und leichten murinen Kette bestimmt werden und dann auf die entsprechenden menschlichen V-Regionen durch ortsgerichtete Mutagenese übertragen werden. Im letzten Stadium des Verfahrens werden Genabschnitte der menschlichen konstanten Region des gewünschten Isotyps (normalerweise gamma I für CH und kappa für die CL) zugegeben, und die Gene der humanisierten schweren und leichten Kette werden gemeinsam in Säugerzellen exprimiert, um lösliche humanisierte Antikörper zu produzieren.
Der Transfer dieser CDRs auf einen menschlichen Antikörper verleiht diesem Antikörper die antigenbindenden Eigenschaften des ursprünglichen murinen Antikörpers. Die sechs CDRs im murinen Antikörper befinden sich strukturell auf einer „Gerüst"region der V-Region. Der Grund dafür, dass das CDR-Grafting erfolgreich ist, ist, dass die Gerüstregionen zwischen Maus- und menschlichem Antikörper sehr ähnliche 3-D-Strukturen mit ähnlichen Bindungspositionen für CDRs aufweisen können, so dass die CDRs ausgetauscht werden können. Derartige humanisierte Antikörperhomologe können hergestellt werden, wie bei Jones et al., 1986, Nature 321, 522–525; Riechmann, 1988, Nature 332, 323–327; Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 10029 und Orlandi et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 3833, beispielhaft beschrieben.
Nichtsdestotrotz glaubt man, dass bestimmte Aminosäuren in den Gerüstregionen mit den CDRs interagieren und die gesamte Antigenbindungsaffinität beeinflussen. Der direkte Transfer von CDRs von einem murinen Antikörper, um einen rekombinanten humanisierten Antikörper ohne jegliche Modifikationen der Gerüstregion der menschlichen V-Region herzustellen, führt häufig zu einem teilweisen oder vollständigen Verlust der Bindungsaffinität. In zahlreichen Fällen scheint es kritisch zu sein, die Reste in der Gerüstregion des Akzeptorantikörpers zu ändern, um eine Bindungsaktivität zu erhalten.
Queen et al., 1989 (a.a.O.) und WO 90/07861 (Protein Design Labs) beschrieben die Herstellung eines humanisierten Antikörpers, der modifizierte Reste in den Gerüstregionen des Akzeptorantikörpers enthält, indem die CDRs eines murinen MAk (anti-Tac) mit menschlichen Immunglobulin-Gerüstregionen und konstanten Regionen kombiniert werden. Sie haben eine Lösung bezüglich des Problems des Bindungsaffinitätsverlustes gezeigt, der häufig auf den direkten CDR-Transfer ohne jegliche Modifikationen der Gerüstreste der menschlichen V-Region zurückzuführen ist; die Lösung beinhaltet zwei Hauptschritte. Erstens werden die Gerüstregionen der menschlichen V-Region von Computeranalysten nach der optimalen Proteinsequenzhomologie zur Gerüstregion der V-Region des ursprünglichen murinen Antikörpers ausgewählt, in diesem Fall der anti-Tac-MAk. Im zweiten Schritt wird die Tertiärstruktur der murinen V-Region mittels Computer modelliert, um die Aminosäurereste der Gerüstregion sichtbar zu machen, die wahrscheinlich mit den murinen CDRs interagieren, und diese murinen Aminosäurereste werden dann auf die homologen menschlichen Gerüstregion überlagert. Vgl. auch US-Patente 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089 und 5,530,101 (Protein Design Labs).
Man kann einen unterschiedlichen Ansatz verwenden (Tempest et al., 1991, Biotechnology 9, 266–271) und als Standard die Gerüstregionen der V-Region, die von den schweren und leichten Ketten von NEWM bzw. REI stammen, zum CDR-Grafting verwenden, ohne die radikale Einführung der Maus-Reste. Ein Vorteil der Verwendung des Ansatzes von Tempest et al., auf NEWM und REI basierende humaniserte Antiköper zu konstruieren, besteht darin, dass die dreidimensionalen Strukturen der variablen Regionen von NEWM und REI aus der Röntgenkristallographie bekannt sind und daher spezifische Interaktionen zwischen den CDRs und den Resten der Gerüstregion der V-Region modelliert werden können.
Ungeachtet der verwendeten Ansätze zeigten die Beispiele der ersten humanisierten Antikörperhomologe, die bisher hergestellt wurden, dass es kein geradliniger Prozess ist. Es ist jedoch nicht möglich, auch wenn man anerkennt, dass derartige Änderungen der Gerüstregion notwendig sein können, auf der Grundlage des zur Verfügung stehenden Standes der Technik vorherzusagen, ob irgendwelche Reste der Gerüstregion geändert werden müssen, um funktionale humanisierte rekombinante Antikörper mit der gewünschten Spezifität zu erhalten. Die Ergebnisse zeigen bisher, dass Änderungen, die notwendig sind, um die Spezifität und/oder die Affinität zu bewahren, größtenteils einzigartig für den gegebenen Antikörper sind und auf der Grundlage der Humanisierung eines anderen Antikörpers nicht vorhergesagt werden können.
Bestimmte alpha4-Untereinheit enthaltende Integrinantagonisten, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen chimäre und humanisierte rekombinante Antikörperhomologe (d.h. intakte Immunglobuline und Teile davon) mit B-Epitopspezifität ein, die hergestellt wurden und im US-Patent 5,932,214 (mAk HP1/2) beschrieben werden. Das Ausgangsmaterial für die Herstellung chimärer (Maus variabel – menschlich konstant) und humanisierter anti-Integrin-Antikörperhomologe kann ein monoclonaler muriner anti-Integrin-Antikörper sein, wie früher beschrieben, ein im Handel erhältlicher monoclonaler anti-Integrin-Antikörper (z.B. HP2/1, Amae International, Inc., Westbrook, Maine) oder ein monoclonaler anti-Integrin-Antikörper, der gemäß der hier dargelegten Ausführungen hergestellt wurde. Andere bevorzugte humanisierte anti-VLA4-Antikörperhomologe werden von Athena Neurosciences, Inc. in PCT/US95/01219 (27. Juli 1995) und im US-Patent 5,840,299 beschrieben.
Diese humanisierten anti-VLA4-Antikörper umfassen eine humanisierte leichte Kette und eine humanisierte schwere Kette. Die humanisierte leichte Kette umfasst drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3) mit Aminosäuresequenzen aus den entsprechenden komplementaritätsbestimmenden Regionen einer leichten Kette von Maus-21.6- Immunglobulin und eine Gerüstregion der variablen Region aus einer Gerüstregion der variablen Region der menschlichen leichten Kappa-Kette mit der Ausnahme, dass in mindestens Position die Aminosäure von derselben Aminosäure besetzt ist, die in der äquivalenten Position der Gerüstregion der variablen Region einer leichten Kette von Maus-21.6-Immunglobulin vorliegt. Die humanisierte schwere Kette umfasst drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3) mit Aminosäuresequenzen aus den entsprechenden komplementaritätsbestimmenden Regionen einer schweren Kette von Maus-21.6-Immunglobulin und eine Gerüstregion der variablen Region aus einer Sequenz der Gerüstregion der variablen Region der menschlichen schweren Kette mit der Ausnahme, dass in mindestens einer Position die Aminosäure von derselben Aminosäure besetzt ist, die in der äquivalenten Position der Gerüstregion der variablen Region einer schweren Kette von Maus-21.6-Immunglobulin vorliegt.
Die vorliegende Erfindung kann Antagonisten nutzen, die von Nucleinsäuresequenzen codiert werden, die unter stringenten Bedingungen mit Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, die Antikörper codieren, die gegen die alpha4-Untereinheiten enthaltende Integrine gerichtet sind. Ein Antagonist der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise ein Protein sein, dessen Nucleinsäure unter hoch stringenten Bedingungen mit einer oder mehreren jener Nucleinsäuresequenzen, die man in Tabelle 6 von US-Patent 5,840,299 findet, oder dem Komplement einer derartigen Sequenz oder von mehreren derartigen Sequenzen hybridisiert. Antagonisten können auch ein Protein sein, dessen Nucleinsäure unter hoch stringenten Bedingungen mit einer Nucleinsäure hybridisiert, die SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 4 codiert, die man im US-Patent 5,932,214 findet. Ferner können Antagonisten auch ein Protein sein, dessen Nucleinsäure unter hoch stringenten Bedingungen mit einer Nucleinsäure hybridisiert, die eine variable Domäne des Antikörpers codiert, der von der Zelllinie ATCC CRL 11175 produziert wird.
Alternativ kann ein Antagonist der vorliegenden Erfindung ein Protein sein, dessen Nucleinsäure unter niedrig stringenten Bedingungen mit einer oder mehreren jener Nucleinsäuresequenzen, die man in Tabelle 6 von US-Patent 5,840,299 findet, oder dem Komplement einer derartigen Sequenz oder von mehreren derartigen Sequenzen hybridisiert. Antagonisten können auch ein Protein sein, dessen Nucleinsäure unter niedrig stringenten Bedingungen mit einer Nucleinsäure hybridisiert, die SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 4 codiert, die man im US-Patent 5,932,214 findet. Ferner können Antagonisten auch ein Protein sein, dessen Nucleinsäure unter niedrig stringenten Bedingungen mit einer Nucleinsäure hybridisiert, die eine variable Domäne des Antikörpers codiert, der von der Zelllinie ATCC CRL 11175 produziert wird.
C. Herstellung von Fragmenten und Analoga
Fragmente eines isolierten alpha4-Integrinantagonisten (z.B. Fragmente von hier beschriebenen Antikörperhomologen) können auch effizient mittels rekombinanter Verfahren, proteolytischer Spaltung oder chemischer Synthese unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Bei den rekombinanten Verfahren können interne oder terminale Fragmente eines Polypeptids erzeugt werden, indem ein oder mehrere Nucelotide von einem Ende (für ein terminales Fragment) oder beiden Enden (für ein internes Fragment einer DNA-Sequenz entfernt werden, die das isolierte Hedgehog-Peptid codiert. Die Expression der mutagenisierten DNA erzeugt Polypeptidfragmente. Die Spaltung mit Endonucleasen, die „das Ende abknabbern", kann ebenfalls DNAs erzeugen, die eine Reihe von Fragmenten codieren. DNAs, die Fragmente eines Proteins codieren, können auch durch zufälliges Scheren, Restriktionsspaltung oder einer Kombination davon erzeugt werden. Proteinfragmente können direkt aus intakten Proteinen erzeugt werden. Peptide können durch proteolytische Enzyme, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf Plasmin, Thrombin, Trypsin, Chymotrypsin oder Pepsin spezifisch gespalten werden. Jedes dieser Enzyme ist spezifisch für die Art der Peptidbindung, die es angreift. Trypsin katalysiert die Hydrolyse von Peptidbindungen, bei denen die Carbonylgruppe aus einer basischen Aminosäure stammt, normalerweise Arginin oder Lysin. Pepsin und Chymotrypsin katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen aus aromatischen Aminosäuren wie Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin. Alternative Sätze aus gespaltenen Proteinfragmenten werden dadurch erzeugt, dass die Spaltung an einer Position verhindert wird, die für ein proteolytisches Enzym zugänglich ist. Beispielsweise ergibt die Reaktion der ε-Aminosäuregruppe von Lysin mit Ethyltrifluorthioacetat in schwach basischer Lösung blockierte Aminosäurereste, deren benachbarte Peptidbindung nicht mehr für die Hydrolyse durch Trypsin zugänglich ist. Proteine können modifiziert werden, um Peptidbindungen zu erzeugen, die für proteolytische Enzyme zugänglich sind. Beispielsweise ergibt die Alkylierung von Cysteinresten mit β-Haloethylaminen Peptidbindungen, die von Trypsin hydrolysiert werden (Lindley, (1956) Nature 178, 647). Zudem können chemische Reagenzien verwendet werden, die Peptidketten an spezifischen Resten spalten. Beispielsweise spaltet Cyanogenbromid Peptide an Methioninresten (Gross und Witkip, (1961) J. Am. Chem. Soc. 83, 1510). Daher können die Proteine durch Behandlung mit verschiedenen Kombinationen von modifizierenden Mitteln, proteolytischen Enzymen und/oder chemischen Reagenzien in Fragmente einer gewünschten Länge, ohne dass sich die Fragmente überschneiden, geteilt werden oder in sich überschneidende Fragmente einer gewünschten Länge geteilt werden.
Fragmente können auch chemisch unter Verwendung von Verfahren synthetisiert werden, die im Fachgebiet bekannt sind, wie die F-moc- oder t-Boc-Festphasen-Chemie von Merrifield. Merrifield, Recent Progress in Hormone Research 23: 451 (1967)
Beispiele von Verfahren nach dem Stand der Technik, die die Herstellung und das Testen von Fragmenten und Analoga zulassen, werden nachstehend diskutiert. Diese oder analoge Verfahren können verwendet werden, um Fragmente und Analoga eines isolierten alpha4-Integrinantagonisten, von denen gezeigt werden kann, dass sie biologische Aktivität besitzen, herzustellen und zu durchmustern. Ein beispielhaftes Verfahren, um zu testen, ob Fragmente und Analoga von alpha4-Untereinheiten enthaltenden Integrinantagonisten biologische Aktivität besitzen, findet man im Abschnitt IV und den Beispielen.
D. Herstellung von veränderter DNA und veränderten Peptidseguenzen: Zufallsverfahren
Aminosäuresequenzvarianten eines Proteins können durch Zufallsmutagenese der DNA hergestellt werden, die das Protein oder einen bestimmten Anteil davon codiert. Nützliche Verfahren schließen die PCR-Mutagenese und Sättigungsmutagenese ein. Eine Bank mit Zufallsaminosäuresequenzvarianten kann auch durch die Synthese eines Satzes von degenerierten Oligonucleotidsequenzen hergestellt werden. Verfahren zur Erzeugung von Aminosäuresequenzvarianten eines gegebenen Proteins unter Verwendung von veränderter DNA und veränderten Peptiden sind im Fachgebiet gut bekannt. Die folgenden Beispiele derartiger Verfahren sollen nicht den Umfang der vorliegenden Erfindung begrenzen, sondern nur dazu dienen, die repräsentativen Verfahren zu veranschaulichen. Der Fachmann erkennt, dass andere Verfahren in dieser Hinsicht ebenfalls nützlich sind.
PCR-Mutagenese: Vgl. beispielsweise Leung et al., (1989) Technique 1, 11–15.
Sättiqungsmutagenese: Ein Verfahren wird allgemein bei Mayers et al., (1989) Science 229, 242, beschrieben.
Mutagenese von degenerierten Oligonucleotiden: Vgl. beispielsweise Harang, S.A., (1983) Tetrahedron 39, 3; Itakura et al., (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 323 und Itakura et al., Recombinant DNA, Proc. 3^rd Cleveland Symposium on Macromolecules, S. 273–289 (A.G. Walton, Herausg.), Elsevier, Amsterdam, 1981.
E. Herstellung von veränderter DNA und veränderten Peptidsequenzen: Gerichtete Mutagenese
Die Nicht-Zufallsmutagenese oder gerichtete Mutagenese stellt spezifische Sequenzen oder Mutationen in spezifischen Teilen einer Polyncleotidsequenz bereit, die ein isoliertes Polypeptid codiert, um Varianten bereitzustellen, die Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Resten der bekannten Aminosäuresequenz des isolierten Polypeptids bereitstellen. Die Mutationsorte können einzeln oder in Serie modifiziert werden, beispielsweise (1) zuerst durch Substitution mit konservierten Aminosäuren und dann, indem eine radikalere Auswahl getroffen wird, je nach den erzielten Ergebnissen; (2) durch Deletion des Zielrests; oder (3) durch Insertion von Resten derselben oder einer sich unterscheidenden Klasse, die an die lokalisierte Stelle grenzt, oder Kombinationen der Optionen 1–3.
Offenbar sind derartige ortsgerichtete Verfahren ein Weg, mit dem ein N-terminales Cystein (oder ein funktionales Äquivalent) in eine gegebene Polypeptidsequenz eingeführt werden kann, um die Bindestelle für eine hydrophobe Einheit bereitzustellen.
Alanin-Scanning-Mutagenese: Vgl. Cunningham und Wells, (1989) Science 244, 1081–1085).
Oligonucleotid-vermittelte Mutagenese: Vgl. beispielsweise Adelman et al., (1983) DNA 2, 183.
Kassetten-Mutagenese: Vgl. Wells et al., (1985) Gene 34, 315.
Kombinatorische Mutagenese: Vgl. beispielsweise Ladner et al., WO 88/06630
Phagen-Display-Strategien: Vgl. beispielsweise den Übersichtsartikel von Marks et al., J. Biol. Chemistry: 267 16007–16010 (1992).
F. Andere Varianten der Integrinantagonisten
Varianten können sich von den anderen hier beschriebenen Integrinantagonisten in der Aminosäuresequenz oder auf eine Art und Weise unterscheiden, die sich nicht auf die Sequenz bezieht oder beides. Die am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Polypeptide besitzen bevorzugte nicht auf die Sequenz bezogene Modifikationen, die die chemische in-vivo- oder in-vitro-Derivatisierung (z.B. seines N-terminalen Endes) sowie mögliche Änderungen der Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Carboxylierung oder Glycosylierung einschließen.
Andere Analoga schließen ein Protein oder seine biologisch aktiven Fragmente ein, deren Sequenzen sich von denjenigen, die man in den US-Patenten 5,840,299 oder 5,888,507; 5,932,214 oder PCT US/94/00266 findet, durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen oder durch eine oder mehrere nicht konservative Aminosäuresubstitutionen oder durch Deletionen oder Insertionen unterscheiden, die die biologische Aktivität des isolierten Proteins nicht aufheben. Konservative Substitutionen schließen typischerweise die Substitution einer Aminosäure für eine andere mit ähnlichen Merkmalen ein, wie Substitutionen innerhalb folgender Gruppen: Valin, Alanin und Glycin; Leucin und Isoleucin; Asparginsäure und Glutaminsäure; Asparagin und Glutamin; Serin und Threonin; Lysin und Arginin; und Phenylalanin und Tyrosin. Die nicht polaren hydrophoben Aminosäuren schließen Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein. Andere konservative Substitutionen können leicht vom Fachmann erkannt werden. Beispielsweise kann für die Aminosäure Alanin eine konservative Substitution von irgendeiner der Aminosäuren D-Alanin, Glycin, beta-Alanin, L-Cystein und D-Cystein ausgewählt werden. Für Lysin kann die Substitution irgendeine von D-Lysin, Arginin, D-Arginin, Homoarginin, Methionin, D-Methionin, Ornithin oder D-Ornithin sein.
Andere in der Erfindung verwendete Analoga sind diejenigen mit Modifikationen, die die Peptidstabilität erhöhen. Derartige Analoga können beispielsweise eine oder mehrere Nicht-Peptidbindungen (die die Peptidbindungen ersetzen) in der Peptidsequenz enthalten. Ebenfalls eingeschlossen sind: Analoga, die Reste einschließen, die keine natürlich auftretenden L-Aminosäuren sind, wie D-Aminosäuren oder nicht natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäuren wie beta- oder gamma-Aminosäuren und cyclische Analoga. Der Einbau von D-anstelle von L-Aminosäuren in das isolierte Hedgehog-Peptid kann seine Resistenz gegenüber Proteasen erhöhen. Vgl. US-Patent 5,219,990 a.a.O.
Bevorzugte Antikörperhomologe schließen eine Aminosäuresequenz ein, die mindestens 60%, 80%, 90%, 95%, 98% oder 99% homolog zu einer Aminosäuresequenz des PS/2-Antikörpers (vgl. Beispiel) ist, oder schließen eine Aminosäuresequenz ein, die mindestens 60%, 80%, 90%, 95%, 98% oder 99% homolog zu einer Aminosäuresequenz ist, die im US-Patent 5,840,299 (SEQ ID NR 15- variable Region der leichten Kette oder SEQ ID NR: 17- variable Region der schweren Kette) oder US-Patent 5,932,214 (SEQ ID NR: 2 oder 4) beschrieben wird; und veröffentlichte Patentanmeldung WO94/16094 (jene Sequenzen, die man im anti-VLA-4-Antikörper der hinterlegten Zelllinie ATCC CRL 11175 findet).
G. Polymer-Koniugatformen
Innerhalb des breiten Umfangs der vorliegenden Erfindung kann ein einzelnes Polymermolekül zur Konjugation mit einem alpha1- oder alpha4-Integrinantagonisten verwendet werden, obwohl auch in Erwägung gezogen wird, dass mehr als ein Polymermolekül ebenfalls gebunden werden kann. Erfindungsgemäße konjugierte alpha4-Integrinantagonisten-Zusammensetzungen können sowohl in in-vivo- als auch in nicht in-vivo-Anwendungen Verwendung finden. Außerdem wird anerkannt, dass das konjugierende Polymer jegliche andere Gruppen, Einheiten oder andere konjugierte Spezies nutzen kann, wie es für die Endanwendung geeignet ist. Es kann beispielsweise bei einigen Anwendungen nützlich sein, eine funktionale Einheit kovalent an das Polymer zu binden, die UV-Abbauresistenz oder Antioxidation oder andere Eigenschaften oder Merkmale dem Polymer verleihen. Als weiteres Beispiel kann es bei einigen Anwendungen vorteilhaft sein, das Polymer zu funktionalisieren, um es reaktiv zu machen und es dazu zu befähigen, mit einem Arzneistoffmolekül zu vernetzen, um verschiedene Eigenschaften oder Merkmale des gesamten konjugierten Materials zu verstärken. Infolgedessen kann das Polymer jegliche Funktionalität, sich wiederholende Gruppen, Verbindungen oder andere Bestandteilsstrukturen enthalten, die die Wirksamkeit der konjugierten alpha4-Integrinantagonisten-Zusammensetzung für seinen beabsichtigten Zweck nicht ausschließt. Andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich viel deutlicher aus der folgenden Offenbarung und der Patentansprüche im Anhang.
Polymere zur Veranschaulichung, die nützlich eingesetzt werden können, um diese wünschenswerten Merkmale zu erreichen, werden hier nachstehend in beispielhaften Reaktionsschemata beschrieben. In kovalent gebundenen Antagonisten/Polymer-Konjugaten kann das Polymer funktionalisiert werden und dann an eine freie Aminosäure/freie Aminosäuren des Antagonisten gekoppelt werden, um labile Bindungen zu erzeugen.
Antagonisten gegen alpha4- oder alpha1-Untereinheit enthaltende Integrine sind am meisten bevorzugt über eine terminale reaktive Gruppe auf dem Polymer konjugiert, obwohl die Konjugationen auch von nicht-terminalen reaktiven Gruppen abgezweigt werden können. Das Polymer mit der/den reaktiven Gruppe(n) wird hier als „aktiviertes Polymer" bezeichnet. Die reaktive Gruppe reagiert selektiv mit freien Amino- oder anderen reaktiven Gruppen am Antagonistenmolekül. Das aktivierte Polymer/die aktivierten Polymere lässt man reagieren, so dass die Bindung an jeder zur Verfügung stehenden Aminogruppe des alpha4-Integrinantagonisten auftritt, wie die alpha-Aminogruppen oder die epsilon-Aminogruppen der Lysine. Freie Carboxylgruppen, geeignete aktivierte Carbonylgruppen, Hydroxylgruppen, Guanidylgruppen, oxidierte Kohlenwasserstoffeinheiten und Mercaptogruppen des alpha4-Integrinantagonisten (falls verfügbar) können ebenfalls als Bindungsstellen verwendet werden.
Obwohl das Polymer irgendwo auf dem Integrinantagonistenmolekül gebunden werden kann, ist eine bevorzugte Stelle für die Polymerkopplung an Integrinantagonisten (insbesondere solche, die Proteine sind) der N-Terminus des Integrinantagonisten. Eine sekundäre Stelle liegt/sekundäre Stellen liegen am oder in der Nähe des C-Terminus und an Zuckereinheiten (falls vorhanden). Daher sieht die Erfindung vor: (i) N-terminal gekoppelte Polymerkonjugate der alpha1-und alpha4-Integrinantagonisten; (ii) C-terminal gekoppelte Konjugate der alpha1-und alpha4-Integrinantagonisten; (iii) Zucker-gekoppelte Konjugate; (iv) sowie N-, C- und Zucker-gekoppelte Polymerkonjugate der alpha1- und alpha4-Integrinantagonisten.
Im Allgemeinen werden etwa 1,0 bis etwa 10 Mol aktiviertes Polymer pro Mol Antagonist, abhängig von der Antagonistenkonzentration, eingesetzt. Die Endmenge ist ein Gleichgewicht zwischen der Maximierung des Reaktionsausmaßes, während unspezifische Modifikationen des Produkts minimiert werden, und gleichzeitig der Definition der Chemie, die die optimale Aktivität aufrechterhält, während gleichzeitig, falls möglich, die Halbwertszeit des Antagonisten optimiert wird. Vorzugsweise werden mindestens etwa 50% der biologischen Aktivität des Antagonisten beibehalten und am meisten bevorzugt werden 100% beibehalten.
Die Reaktionen können mittels jedes geeigneten im Fachgebiet anerkannten Verfahrens erfolgen, das zur Reaktion biologisch aktiver Materialien mit inerten Polymeren verwendet wird. Im Allgemeinen beinhaltet das Verfahren die Herstellung eines aktivierten Polymers (das mindestens eine terminale Hydroxylgruppe besitzen kann) und die anschließende Reaktion des Antagonisten mit dem aktivierten Polymer, um das lösliche, zur Formulierung geeignete Protein herzustellen. Die vorstehende Modifikation kann durch mehrere Verfahren erfolgen, die einen oder mehrere Schritte beinhalten.
Wie vorstehend erwähnt, nutzen bestimmte erfindungsgemäße Ausführungsformen das N-terminale Ende eines Integrinantagonisten als Verbindung zum Polymer. Geeignete herkömmliche Verfahren stehen zur Verfügung, um einen N-terminal modifizierten alpha1- oder alpha4-Integrinantagonisten zu erhalten. Ein Verfahren wird durch ein reduktives Alkylierungsverfahren beispielhaft angeführt, das die unterschiedliche Reaktivität verschiedener Arten primärer Aminogruppen (die epsilon-Aminogruppen auf Lysin gegenüber den Aminogruppen auf einem N-terminalen Methionin) ausnutzt, die zur Derivatisierung auf einem geeigneten Integrinantagonisten zur Verfügung stehen. Unter geeigneten Selektionsbedingungen kann eine im Wesentlichen selektive Derivatisierung eines geeigneten Integrinantagonisten an dessen N-Terminus mit einem eine Carbonylgruppe enthaltenden Polymer erreicht werden. Die Reaktion erfolgt bei einem pH-Wert, der einem erlaubt, einen Vorteil aus den pKa-Wert-Unterschieden zwischen den epsilon-Aminogruppen der Lysinreste und denjenigen der alpha- Aminogruppen eines N-terminalen Rests des Integrinantagonisten zu ziehen. Diese Art von Chemie ist dem Fachmann gut bekannt.
Eine Strategie, um ein Polyalkylenglykolpolymer wie PEG zum C-Terminus eines alpha1- oder alpha4-Integrinantagonisten (z.B. als Protein) zu leiten, wäre eine Stelle, die zum Leiten der Polymereinheit verwendet werden kann, chemisch zu binden oder gentechnisch herzustellen. Beispielsweise würde der Einbau eines Cys an einer Stelle, die sich an oder in der Nähe des C-Terminus eines Proteins befindet, die spezifische Modifikation unter Verwendung von im Fachgebiet anerkannten Maleimid-, Vinylsulfon- oder Haloacetat-aktivierten Derivaten von Polyalkylenglykol (z.B. PEG) zulassen. Diese Derivate können spezifisch aufgrund der hohen Selektivität dieser Reagenzien für Cys zur Modifikation der gentechnisch hergestellten Cysteine verwendet werden. Weitere Strategien wie der Einbau einer Histidin-Markierung, die angesteuert werden kann (Fancy et al., (1996) Chem. & Biol. 3: 551) oder eine zusätzlich Glycosylierungsstelle auf einem Protein sind andere Alternativen zur Modifikation des C-Terminus eines erfindungsgemäßen Integrinantagonisten.
Verfahren zum Ansteuern von Zuckern als Orte für die chemische Modifikation sind ebenfalls gut bekannt, und daher ist es wahrscheinlich, dass ein Polyalkylenglykolpolymer direkt und spezifisch an durch Oxidierung aktivierten Zucker (falls vorhanden) auf einem Integrinantagonisten hinzugefügt werden kann. Beispielsweise kann ein Polyethylenglykolhydrazin erzeugt werden, das relativ stabile Hydrazonbindungen durch Kondensation mit Aldehyden und Ketonen bildet. Diese Eigenschaft wurde für die Modifikationen von Proteinen durch oxidierte Oligosaccharidbindungen verwendet. Vgl. Andresz, H. et al., (1978), Makromol. Chem. 179: 301. Die Behandlung von PEG-Carboxymethylhydrazid mit Nitrit erzeugt insbesondere PEG-Carboxymethylazid, das eine elektrophil aktive Gruppe ist, die gegenüber Aminogruppen reaktiv ist. Diese Reaktion kann verwendet werden, um auch Polyalkylenglykol-modifizierte Proteine herzustellen. Vgl. US-Patente 4,101,380 und 4,179,337.
Man kann im Fachgebiet anerkannte Thiol-Linker-vermittelte Chemie verwenden, um die Vernetzung von Proteinen weiter zu erleichtern, so dass multivalente alpha1- oder alpha4-Integrinantagonisten-Zusammensetzungen erzeugt werden. Insbesondere kann man mit Natriumperjodat reaktive Aldehyde auf Kohlenwasserstoffeinheiten erzeugen, wobei sich durch die Aldehyde Cystaminkonjugate bilden und die Vernetzung über Thiolgruppen auf den Cystaminen induziert wird. Vgl. Pepinsky, B. et al., (1991), J. Biol. Chem., 266: 18244–18249 und Chen, L.L. et al., (1991) J. Biol. Chem., 266: 18237–18243. Daher wäre diese Art von Chemie auch für die Modifikation mit Polyalkylenglykolpolymeren geeignet, wobei ein Linker in den Zucker eingebaut wird und das Polyalkylenglykolpolymer an den Linker gebunden wird. Während Aminothiol oder Hydrazin-enthaltende Linker die Addition einer einzelnen Polymergruppe zulassen, kann die Struktur des Linkers variiert werden, so dass multiple Polymere hinzugefügt werden und/oder die räumliche Orientierung des Polymers hinsichtlich des Integrinantagonisten verändert wird.
In der Praxis der vorliegenden Erfindung werden Polyalkylenglykolreste der C1-C4-Alkylpolyalkylenglykole, vorzugsweise Polyethylenglykol (PEG), oder Poly(oxy)alkylenglykolreste derartiger Glykole vorteilhaft in die Polymersysteme von Interesse eingebaut. Daher kann das Polymer, an das das Protein gebunden ist, ein Homopolymer von Polyethylenglykol (PEG) sein oder es ist ein polyoxyethyliertes Polyol, vorausgesetzt, dass in alle Fällen das Polymer bei Raumtemperatur wasserlöslich ist. Nicht einschränkende Beispiele derartiger Polymere schließen Polyalkylenoxidhomopolymere wie PEG oder Polypropylenglykole, polyoxyethylierte Glykole, Copolymere davon und Blockcopolymere davon ein, vorausgesetzt, dass die Wasserlöslichkeit des Blockcopolymers aufrechterhalten wird. Beispiele von polyoxyethylierten Polyolen schließen beispielsweise polyoxyethyliertes Glycerin, polyoxyethyliertes Sorbit, polyoxyethylierte Glucose oder dergleichen ein. Das Glycerinrückgrat von polyoxyethyliertem Glycerin ist dasselbe Rückgrat, das natürlicherweise beispielsweise bei Tieren und Menschen in Mono-, Di- und Triglyceriden auftritt. Daher würde diese Verzweigung nicht notwendigerweise als fremdes Agens im Körper angesehen.
Als Alternative zu Polyalkylenoxiden können Dextran, Polyvinylpyrrolidone, Polyacrylamide, Polyvinylalkohole, auf Kohlenwasserstoff basierende Polymere und dergleichen verwendet werden. Der Fachmann erkennt, dass die vorhergehende Liste nur der Veranschaulichung dient und dass alle Polymermaterialien mit den hier beschriebenen Eigenschaften in Erwägung gezogen werden.
Das Polymer muss kein bestimmtes Molekulargewicht aufweisen, aber es wird bevorzugt, dass das Molekulargewicht zwischen etwa 300 und 100.000, noch stärker bevorzugt zwischen 10.000 und 40.000 liegen soll. Insbesondere Molekulargewichte von 20.000 oder mehr sind am besten geeignet, um Produktverluste aufgrund der Filtration in den Nieren zu vermeiden.
Die Polyalkylenglykolderivatisierung hat zahlreiche vorteilhafte Eigenschaften bei der Formulierung von Polymer-Integrinantagonisten-Konjugaten in der Praxis der vorliegenden Erfindung, die mit den folgenden Eigenschaften der Polyalkylenglykolderivate assoziiert sind: Verbesserung der Wasserlöslichkeit, während gleichzeitig keine antigene oder immunogene Reaktion hervorgerufen wird; ein hoher Grad an Biokompatibilität; Fehlen des in-vivo-Bioabbaus der Polyalkylenglykolderivate und Erleichterung der Exkretion durch lebende Organismen.
Zudem kann man in einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt einen alpha1- oder alph4-Integrinanatgonisten verwenden, der kovalent an die Polymerkomponente gebunden ist, wobei die Natur der Konjugation spaltbare kovalente chemische Bindungen beinhaltet. Dies lässt die Kontrolle des Zeitverlaufs zu, während dessen das Polymer vom Integrinantagonisten gespalten werden kann. Diese kovalente Bindung zwischen dem Integrinantagonisten und dem Polymer kann durch chemische oder enzymatische Reaktion gespalten werden. Das Polymer-Integrinantagonisten-Produkt behält eine akzeptable Aktivitätsmenge bei. Gleichzeitig sind Anteile der Polyethylenglykole im konjugierenden Polymer vorhanden, um das Polymer-Integrinantagonisten-Konjugat mit hoher Wasserlöslichkeit und mit der Kapazität zu versehen, länger im Blut zu zirkulieren. Als Folge dieser verbesserten Merkmale zieht die Erfindung die parenterale, nasale und orale Verabreichnung sowohl der aktiven Polymer-alpha4-Integrinantagonisten-Spezies als auch nach der hydrolytischen Spaltung die Bioverfügbarkeit des Integrinantagonisten per se in in-vivo-Anwendungen in Betracht.
Es soll klar sein, dass die hier beschriebenen Reaktionsschemata ausschließlich zu Illustrationszwecken bereitgestellt werden und nicht einschränkend hinsichtlich der Reaktionen und Strukturen sein sollen, die bei der Modifikation des alpha1- oder alpha4-Integrinantagonisten genutzt werden können, z.B. um Löslichkeit, Stabilisierung und Zellmembranaffinität für die parenterale und orale Verabreichung zu erreichen. Die Aktivität und Stabilität dieser Integrinantagonisten-Konjugate können auf mehrere Arten variiert werden, indem ein Polymer mit unterschiedlichem Molekulargewicht verwendet wird. Die Löslichkeiten der Konjugate können variiert werden, indem die Proportion und Größe des Polyethylenglykol-Fragments geändert werden, das in die Polymerzusammensetzung eingebaut ist.
III. Nutzen
Die Menge des aktiven Inhaltstoffes, die mit den Trägermaterialien kombiniert werden kann, um eine Einzeldarreichungsform herzustellen, variiert abhängig vom behandelten Patienten und der besonderen Verabreichungsweise. Es sollte jedoch klar sein, dass ein spezifisches Dosierungs- und Behandlungsschema für einen bestimmten Patienten von einer Vielzahl von Faktoren abhängt, einschließlich der Aktivität der verwendeten spezifischen Verbindung, dem Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht, der Ernährung, der Verabreichungszeit, der Exkretionsrate, der Arzneistoffkombination sowie der Beurteilung des behandelnden Arztes und der Schwere der bestimmten, behandelten Erkrankung. Die Menge des aktiven Inhaltstoffes kann auch vom Therapeutikum oder dem prophylaktischen Mittel, falls vorhanden, abhängen, mit dem der Inhaltstoff zusammen verabreicht wird.
Nach dieser Erfindung sollen die Antagonisten der vorliegenden Erfindung dem Patienten in einer wirksamen Menge verabreicht werden. Dosierungen im erfindungsgemäßen Gebrauch beinhalten eine wirksame, nicht toxische Menge. Der Fachmann, der routinemäßige klinische Testverfahren verwendet, kann die optimalen Dosierungen für die bestimmte, behandelte Erkrankung bestimmten.
Pharmazeutische Zubereitung
Erfindungsgemäße Antagonisten können erfindungsgemäß parentaral verabreicht werden. Der Begriff „parenteral", wie hier verwendet, schließt subkutane, intravenöse, intramuskuläre, intraartikuläre, intrasynoviale, intrasternale, intrathekale, intrahephatische, intraläsionale und intracraniale Injektions- oder Infusionsverfahren ein. Die gewünschte Dosis soll einem Patienten ein- oder mehrmals am Tag intravenös, oral, rektal, parenteral, intranasal, topisch oder durch Inhalation verabreicht werden. Die gewünschte Dosis kann auch durch kontinuierliche intravenöse Infusion verabreicht werden.
Antikörperhomologe werden vorzugsweise als sterile Arzneimittel verabreicht, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten, der einer der zahlreichen gut bekannten Träger wie Wasser, Salzlösung, phosphatgepufferte Salzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol und dergleichen oder Kombinationen davon sein kann. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in Form von pharmazeutisch verträglichen Salzen, die von anorganischen oder organischen Säuren und Basen stammen, verwendet werden. Eingeschlossen in derartige saure Salze sind die Folgenden: Acetat, Adipat, Alginat, Aspartat, Benzoat, Benzolsulfonat, Bisulfat, Butyrat, Citrat; Camphorat, Camphorsulfonat, Cyclopentanpropionat, Digluconat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Fumarat, Glucoheptanoat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Heptanoat, Hexanoat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydrojodid, 2-Hydroxyethansulfonat, Lactat, Maleat, Methansulfonat, 2-Naphthalensulfonat, Nicotinat, Oxalat, Pamoat, Pectinat, Persulfat, 3-Phenylpropionat, Picrat, Pivalat, Propionat, Succinat, Tartrat, Thiocyanat, Tosylat und Undecanoat. Basische Salze schließen Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze wie Natrium- und Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze wie Calcium- und Magnesiumsalze, Salze mit organischen Basen wie Dicyclohexylaminsalze, N-Methyl-D-glucamin, Tris(hydroxymethyl)methylamin und Salze mit Aminosäuren wie Arginin, Lysine usw. ein. Die basischen stickstoffenthaltenden Gruppen können ebenfalls mit solchen Agentien wie niedrigen Alkylhalogeniden wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Butylchloriden, -bromiden und -jodiden; Dialkylsulfaten wie Dimethyl-, Diethyl-, Dibutyl- und Diamylsulfaten, langkettigen Halogeniden wie Decyl-, Lauryl-, Myristyl- und Stearylchloriden, -bromiden und -jodiden, Aralkylhalogeniden wie Benzyl- und Phenethylbromiden und anderen quaternisiert. Dadurch werden wasser- oder öllösliche oder dispergierbare Produkte erhalten.
Die Arzneimittel dieser Erfindung umfassen irgendeine der Verbindungen der vorliegenden Erfindung oder pharmazeutisch verträgliche Derivate davon, zusammen mit irgendeinem pharmazeutisch verträglichen Träger. Der Begriff „Träger", wie hier verwendet, schließt verträgliche Adjuvantien und Vehikel ein. Pharmazeutisch verträgliche Träger, die in den Arzneimitteln dieser Erfindung verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Ionenaustauscher, Tonerde, Aluminiumstearat, Lecithin, Serumproteine wie menschliches Serumalbumin, Puffersubstanzen wie Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, Teilglyceringemische von gesättigten Gemüsefettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyte wie Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidales Kieselgel, Magnesiumtrisilikat, Polyvinylpyrrolidon, auf Cellulose basierende Substanzen, Polyethylenglykol, Natriumcarboxymethylcellulose, Polyacrylate, Wachse, Polyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere, Polyethylenglykol und Wollfett.
Nach dieser Erfindung können die Arzneimittel in Form einer sterilen injizierbaren Zubereitung vorliegen, beispielsweise einer sterilen injizierbaren wässrigen oder öligen Suspension. Diese Suspension kann nach den im Fachgebiet bekannten Verfahren unter Verwendung geeigneter Dispersions- oder Befeuchtungsmittel und Suspendiermittel formuliert werden. Die sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht toxischen parenteral verträglichen Verdünnungs- oder Lösungsmittel sein, beispielsweise als Lösung in 1,3-Butandiol. Unter den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, sind Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden herkömmlicherweise sterile fette Öle als Lösungsmittel oder Suspensionsmedium verwendet. Für diesen Zweck kann jedes milde fette Öl verwendet werden, einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride. Fettsäuren wie Ölsäure und seine Glycerinderivate sind nützlich bei der Herstellung von Injektionen, genauso wie natürliche, pharmazeutisch verträgliche Öle wie Olivenöl oder Rinzinusöl, insbesondere in ihren polyoxyethylierten Versionen.
Die Arzneimittel dieser Erfindung können oral verabreicht werden. Falls sie oral verabreicht werden, können sie in jeder oralen verträglichen Darreichungsform verabreicht werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf Kapseln, Tabletten, wässrige Suspensionen oder Lösungen. Im Falle von Tabletten für den oralen Gebrauch schließen herkömmlicherweise verwendete Träger Lactose und Maisstärke ein. Gleitmittel wie Magnesiumstearat werden ebenfalls typischerweise zugesetzt. Für die orale Verabreichung in Kapselform schließen nützliche Verdünnungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke ein.
Wenn wässrige Suspensionen für den oralen Gebrauch erforderlich sind, wird der aktive Inhaltstoff mit Emulgatoren und Suspensionsmitteln kombiniert. Falls gewünscht, können ebenfalls bestimmte Süßstoffe, Geschmacksstoffe oder Farbstoffe zugesetzt werden.
Besondere Zusammensetzungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, bei denen der Antagonist in Vesikeln wie Liposomenenthaltenden Zusammensetzungen formuliert wird. Liposomen sind Vesikel, die von amphiphatischen Molekülen wie polaren Lipiden, beispielsweise Phosphatidylcholinen, Ethanolaminen und Serinen, Sphingomyelinen, Cardiolipinen, Plasmalogenen, Phosphatidsäuren und Cerebiosiden erzeugt werden. Liposomen werden erzeugt, wenn man geeignete amphiphatische Moleküle in Wasser oder wässrigen Lösungen quellen lässt, so dass sich flüssige Kristalle bilden, die gewöhnlich eine mehrschichtige Struktur aufweisen, die aus vielen Doppelschichten besteht, die voneinander durch wässriges Material getrennt sind (auch als raue Liposomen bezeichnet). Ein anderer Liposomentyp, von dem bekannt ist, dass er aus einer einzigen Doppelschicht besteht, die wässriges Material umgibt, wird als unilamelläres Vesikel bezeichnet. Falls wasserlösliche Materialien in der wässrigen Phase während des Quellens der Lipide eingeschlossen sind, werden sie in der wässrigen Schicht zwischen den Lipiddoppelschichten eingeschlossen.
Ein besonders praktisches Verfahren zur Herstellung von liposomenformulierten Formen der vorliegenden Antagonisten ist das in EP-A-253,619 beschriebene Verfahren. In diesem Verfahren werden einzelne doppelschichtige Liposomen hergestellt, die aktive Bestandteile verkapselt haben, indem die Lipidkomponente in einem organischen Medium gelöst wird, die organische Lösung der Lipidkomponente unter Druck in eine wässrige Komponente injiziert wird, während gleichzeitig die organischen und wässrigen Komponenten mit einem Hochgeschwindigkeitshomogenisator oder einem Mischgerät gemischt werden, wobei die Liposomen spontan erzeugt werden. Die einzelnen doppelschichtigen Liposomen, die den verkapselten aktiven Inhaltstoff enthalten, können direkt verwendet werden, oder sie können in einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen Träger für die topische Verabreichung verwendet werden. Die Viskosität der Liposomen kann durch Zugabe von einem oder mehreren geeigneten Verdickungsmitteln wie beispielsweise Xanthangummi, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Gemischen davon erhöht werden. Die wässrige Komponente kann ausschließlich aus Wasser bestehen oder sie kann Elektrolyte, gepufferte Systeme oder andere Inhaltstoffe wie beispielsweise Konservierungsmittel enthalten. Geeignete Elektrolyte, die verwendet werden können, schließen Metallsalze wie Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze ein. Die bevorzugten Metallsalze sind Calciumchlorid, Natriumchlorid und Kaliumchlorid. Die Konzentration der Elektrolyte kann in einem Bereich von 0 bis 260 mM, vorzugsweise von 5 mM bis 160 mM liegen. Die wässrige Komponente wird in ein geeignetes Gefäß gegeben, das angepasst werden kann, so dass die Homogenisierung erfolgt, indem große Turbulenzen während der Injektion der organischen Komponente herbeigeführt werden. Die Homogenisierung der zwei Bestandteile kann innerhalb des Gefäßes erfolgen, oder alternativ können die wässrigen und organischen Komponenten getrennt in ein Mischgerät injiziert werden, das sich außerhalb des Gefäßes befindet. Im letzteren Fall werden die Liposomen im Mischgerät erzeugt und dann in ein anderes Gefäß für Sammelzwecke überführt.
Die organische Komponente besteht aus einem geeigneten nicht toxischen, pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittel wie beispielsweise Ethanol, Glycerin, Propylenglykol und Polyethylenglykol und einem geeigneten Phospholipid, das im Lösungsmittel löslich ist. Geeignete Phospholipide, die verwendet werden können, schließen beispielsweise Lecithin, Phosphatidylcholin, Phosphatydylserin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinosit, Lysophosphatidylcholin und Phosphatidylglycerin ein. Andere lipophile Zusatzstoffe können verwendet werden, um die Merkmale der Liposomen selektiv zu modifizieren. Beispiele derartiger anderer Zusatzstoffe schließen Stearylamin, Phosphatidsäure, Tocopherol, Cholesterin und Lanolinextrakte ein.
Zusätzlich können andere Inhaltstoffe, die die Oxidation der Phospholipide verhindern können, der organischen Komponente zugesetzt werden. Beispiele von derartigen anderen Inhaltstoffen schließen Tocopherol, butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluol, Ascorbylpalmitat und Ascorbyloleat ein. Konservierungsstoffe wie Benzoesäure, Methylparaben und Propylparaben können ebenfalls zugesetzt werden.
Abgesehen von den vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen kann von Bedeckungen, z.B. Pflastern, Bandagen, Verbänden, Gazetampons und dergleichen Gebrauch gemacht werden, die eine geeignete Menge eines anti-VLA-Antikörpertherapeutikums enthalten. In einigen Fällen kann von Pflastern, Bandagen, Verbänden, Gazetampons und dergleichen Gebrauch gemacht werden, die mit einer topischen Formulierung imprägniert wurden, die die therapeutische Formulierung enthält.
Die Arzneimittel dieser Erfindung können auch durch nasale Aerosole oder Inhalation unter Verwendung eines Verneblers, eines Trockenpulverinhalators oder eines Dosierinhalators verabreicht werden. Derartige Zusammensetzungen werden nach den im Fachgebiet der pharmazeutischen Formulierung gut bekannten Verfahren hergestellt und können als Lösungen in Salzlösung hergestellt werden, wobei Benzylalkohol oder andere geeignete Konservierungsstoffe, Absorptionspromotoren, um die Bioverfügbarkeit zu erhöhen, Fluorcarbone und/oder andere herkömmliche Solubilisierungs- und Dispersionsmittel verwendet werden.
Nach einer weiteren Ausführungsform können Zusammensetzungen, die eine Verbindung dieser Erfindung umfassen, auch ein zusätzliches Mittel umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Corticosteroiden, antiinflammatorschen Mitteln, Immunsuppressiva, Antimetaboliten und Immunmodulatoren. Spezifische Verbindungen innerhalb jeder dieser Klassen können aus irgendeiner jener aufgelisteten Verbindungen unter der geeigneten Gruppenüberschrift in „Comprehensive Medicinal Chemistry", Pergamon Press, Oxford, England, S. 970–986 (1990) ausgewählt werden, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. In diese Gruppe sind auch Verbindungen wie Theophyllin, Sulfasalazin und Aminosalicylate (antiinflammatorische Mittel); Cyclosporin, FK-506 und Rapamycin (Immunsuppressiva); Cyclophosphamid und Methotrexat (Antimetaboliten); Steroide (inhaliert, oral oder topisch) und Interferone (Immunmodulatoren) eingeschlossen.
Die Dosierung und die Dosisrate der Verbindungen dieser Erfindung, die wirksam sind, um die gewünschten Effekte hervorzurufen, hängen von einer Vielzahl von Faktoren wie der Natur des Antagonisten, der Größe des Patienten, dem Behandlungsziel und der Natur der zu behandelnden Erkrankung, von dem verwendeten spezifischen Arzneimittel und der Beurteilung des behandelnden Arztes ab.
Dosierungsniveaus im Bereich von etwa 0,001 bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise zwischen etwa 0,1 und etwa 50 mg/kg Körpergewicht pro Tag des aktiven Inhaltstoffes sind nützlich. Am meisten bevorzugt wird das VLA-4 bindende Mittel, falls es ein Antikörper oder ein Antikörperderivat ist, bei einer Dosis im Bereich zwischen etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht/Tag bis etwa 20 mg/kg Körpergewicht/Tag, vorzugsweise im Bereich zwischen etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht/Tag bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht/Tag und in Intervallen von 1–14 Tagen verabreicht. Für Nicht-Antikörper oder kleinmolekülige bindende Mittel sollte der Dosisbereich vorzugsweise zwischen molaren äquivalenten Mengen zu diesen Antikörpermengen liegen. Vorzugsweise wird eine Antikörperzusammensetzung in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, einen Antikörper-Plasmaspiegel von mindestens 1 mg/ml bereitzustellen. Die Optimierung der Dosierungen kann durch die Verabreichung der bindenden Mittel erfolgen, gefolgt von der Beurteilung der Bedeckung der Integrin-positiven Zellen durch das Mittel in einem Zeitraum, nachdem eine gegebene Dosis in vivo verabreicht wurde.
Das Vorliegen des verabreichten Mittels kann in vitro (oder ex vivo) durch das Unvermögen oder die verringerte Fähigkeit der Zellen des Individuums, dasselbe Mittel zu binden, das selbst markiert wurde (z.B. mit Fluorchrom), nachgewiesen werden. Die bevorzugte Dosierung sollte eine nachweisbare Bedeckung des Großteils der Integrin-positiven Zellen hervorzurufen. Vorzugsweise wird die Bedeckung im Falle eines Antikörperhomologs für einen Zeitraum von 1–14 Tagen aufrechterhalten.
Der Fachmann kann leicht testen, ob ein erfindungsgemäßer Antagonist die beabsichtigte Wirkung besitzt. Standardtests für die klinische Erholung (z.B. Lavage und FACS-Scan für Antikörperbindung; Verbesserung der forcierten vitalen Lungenkapazität) werden von Fachmann verwendet, um die Wirksamkeit zu bestimmen. Beispielsweise werden Zellen, die in einer Lungengewebeprobe des Individuums enthalten sind, auf das Vorliegen des Mittels in vitro (oder ex vivo) unter Verwendung eines zweiten Reagenz getestet, um das verabreichte Mittel nachzuweisen. Beispielsweise kann dies ein Fluorchrom-markierter Antikörper sein, der für das verabreichte Mittel spezifisch ist, das dann durch Standard-FACS (Fluoreszenz aktivierter Zellsortierungs)-Analyse gemessen wird. Alternativ wird das Vorliegen des verabreichten Mittels in vitro (oder ex vivo) durch das Unvermögen oder die verringerte Fähigkeit der Zellen des Individuums, dasselbe Mittel zu binden, das selbst markiert wurde (z.B. mit Fluorchrom), nachgewiesen. Die bevorzugte Dosierung sollte eine nachweisbare Bedeckung des Großteils der Integrin-positiven Zellen hervorzurufen. Vorzugsweise wird die Bedeckung im Falle eines Antikörperhomologs für einen Zeitraum von 1–14 Tagen aufrechterhalten.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen und sollten nicht als deren Einschränkung ausgelegt werden.
BEISPIEL I: TIERMODELLE DER LUNGENFIBROSE
Viele Hinweise dokumentierten die Beteiligung von inflammatorischen Zellen und Mediatoren bei der Lungenfibrose in verbreitet verwendeten Bleomycin (BL)-Nagetiermodellen. Dieses Modell ist ansprechend, da es ein charakteristisches Bild der Fibrose mit vielen Komponenten der menschlichen Erkrankung liefert und da BL-induzierte Lungenfibrose eine gut erkannte Nebenwirkung der menschlichen Chemotherapie ist. Die intratracheale (IT) Instillation von BL bei Nagern wurde verbreitet verwendet, um die Mechanismen der Fibrogenese zu studieren und um potentiell wünschenswerte antifibrotische Verbindungen zu durchmustern. Obwohl die Erstursache der BL-induzierten Lungentoxizität der Erzeugung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zugeschrieben wird, sobald sie an Eisen und DNA bindet, beinhaltet der Prozess, der zur endgültigen Manifestation von Lungenfibrose führt, die Freisetzung verschiedener inflammatorischer Mediatoren (Giri und Wang., Comments Toxicol., 3: 145–176 (1989)). Die Pathogenese der BL-induzierten Lungenschädigung äußert sich anfänglich in Ödemen, Hämorrhagie und einer zellulären Infiltration, bei der Neutrophile und Makrophagen vorherrschen. Eine überschüssige Akkumulation der inflammatorischen Leukocyten in vaskulären, institiellen und alveolären Räumen der Lunge könnte vaskuläre und parenchymale Schädigungen zufügen, indem ROS und proteolytische Enzyme erzeugt werden. Neutrophile enthalten wesentliche Mengen an Myeloperoxidase (MPO), die Cl^– zu Hypochlorsäure (HOCl) in einer Reaktion mit H₂O₂ oxidieren kann, und von der von Neutrophilen stammenden HOCl ist bekannt, dass es zelluläre Toxizität verursacht. Das von Makrophagen und Neutrophilen stammende ROS kann die Produktion von proinflammatorischen und fibrinogenen Cytokinen stimulieren, die die erhöhte fibroproliferative Reaktion verstärken (Phan und Kunkel, Exp. Lung Res., 18: 29-43 (1992)). Neben einer großräumigen Infiltration der inflammatorischen Zellen ist der Fibroseprozess ferner durch eine hyperproliferative Reaktion aktivierter Fibroblasten charakterisiert. Die fibroblastenartigen Zellen sind hauptsächlich für den absoluten Anstieg des Kollagengehalts der Lunge und eine Anomalie im ultrastrukturellen Erscheinungsbild und die räumliche Verteilung der Kollagentypen verantwortlich.
Beispiel 2:
Hemmung der Fibrose mit Antagonisten gegen das alpha4-Untereinheiten enthaltende Integrin
Material und Methoden
Es wurden ein unspezifischer Kontrollantikörper (IE6) und Antikörper gegen alpha4-Untereinheiten enthaltende Integrine (PS2) verwendet. IE6 ist ein monoclonaler Maus-anti-Mensch-LFA3 (Domäne 1)-IgG1-Antikörper. Vgl. Miller, Hochman, Meier, Tizard, Bixler, Rosa und Wallner (1992) J. Exp. Med. 178: 211-222. PS/2 wird durch das Verfahren von Miyake et al., J. Exp. Med., 173: 599–607 (1991) hergestellt.
Von chronischen respiratorischen Erkrankungen freie männliche C57BL/6-Mäuse mit einem Gewicht von 25–30 g wurden vom Charles River Laboratory käuflich erworben. Bleomycinsulfat (Markenname Blenoxane) war ein Geschenk von Bristol Laboratories, (Syracuse, NY). L-[3,4-3H]Prolin zur Markierung des Prokollagensubstrats von Prolylhydroxylase wurde von NEN Life Science Products (Boston, MA) erhalten. Z-fix, ein wässriges gepuffertes Zinkformalin, wurde von Anatech, LTD (Battle Creek, MI) käuflich erworben. Alle anderen Reagenzien waren von Reagenzgrad oder höherer Reinheit und wurden von kommerziellen Standardquellen erhalten.
Behandlung der Tiere
Die Mäuse wurden zu viert pro Käfig gehalten und gemäß den NIH's Guidelines for Animal Welfare versorgt. Man ließ die Mäuse vor allen Behandlungen eine Woche in den Anlagen akklimatisieren. Es wurde ein 12 h/12 h-Hell/Dunkelzyklus aufrechterhalten, und sie hatten Zugang zu Wasser und Rodent Laboratory Chow ad lib. Die Tiere wurden zufällig in vier experimentelle Gruppen aufgeteilt: 1) SA + SA; 2) BL + IE6; 3) BL + SA und 4) BL + PS2. Den Mäusen wurde intratracheal (IT) eine Einzeldosis Salzlösung oder BL zu 0,08 Einheiten/100 μl/Maus unter Xylazin- und Ketaminanästhesie injiziert. Nach der IT-Istillation erhielten die Mäuse dreimal wöchentlich eine IP-Injektion mit IE6, SA oder PS2 (100 μg in 0,2ml/Maus). 21 Tage nach der BL-Instillation wurden die Mäuse unter Pentobarbitalanästhesie für die bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) sowie für die biochemischen und histopathologischen Analysen getötet.
Herstellung von BALF und Lungengewebe.
Nach der Anästhesie wurde die Bauchhöhle geöffnet, gefolgt von einem Ausbluten der absteigenden abdominalen Aorta. Die Lungen wurden für die Lavage präpariert, indem die Trachea mit einer stumpfen, auf einer Spritze aufgesetzten Nadel kanüliert wurde. Die Lungen-Lavage erfolgte mit 3 ml kalter isotonischer Salzlösung, die in 1 ml-Aliquoten verabreicht wurde. Ein Aliquot BALF wurde für die Gesamtzellzählung aufgeteilt. Die restliche BALF wurde 20 min bei 1500 g bei 4°C zentrifugiert und der sich ergebende Überstand allquotiert und dann bei –70°C aufbewahrt. Nach der BALF wurden die Lungenflügel schnell von nicht parenchymalem Gewebe freiseziert, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –70°C aufbewahrt.
Später wurden die eingefrorenen Lungen aufgetaut und in 0,1 M KCl, 0,02 M Tris (pH 7,6) mit einem Polytron-Homogenisator (Brinkmann Instruments Inc., Westbury, NY) homogenisiert. Das Homogenat wurde gründlich durch wiederholtes Umkehren gemischt und die Homogenat-Endvolumina (4–5 ml) wurden aufgezeichnet. Das Homogenat wurde in mehrere Allquote aufgeteilt und bei –70°C für biochemische Messungen aufbewahrt.
Bestimmung des Lungen-Malondialdehyd-Äquivalents und des Hydroxyprolingehalts.
Das Lungen-Malondialdehyd-Äquivalent wurde aus der Gesamtmenge der mit Thiobarbitursäure reagierenden Produkte in nicht fraktioniertem Homogenat mittels des Verfahrens von Ohkawa et al., Anal. Biochem., 95: 351 (1979) abgeschätzt. Für den Lungen-Hydroxyprolin-Test wurde 1 ml Homogenat mit 0,25 ml eiskalter 50%-iger (Gew./Vol.) Trichloroessigsäure präzipitiert, zentrifugiert und das Präzipitat wurde 18 Stunden in 2 ml 6 N HCl bei 110°C hydrolysiert. Der Hydroxyprolingehalt wurde mittels des von Woessner J.F., Arch. Biochem. Biophys., 93: 440 (1961) beschriebenen Verfahrens gemessen.
Bestimmung der Prolylhydroxylase (EC 1.14.11.2) Aktivität.
Die Herstellung des Prolylhydroxylase-Substrats (Prokollagen) und das Verfahren für den Prolylhydroxylase-Test werden bei Giri, S.N. et al., Exp. Mol. Pathol. 39: 317 (1983) beschrieben. Kurz gesagt, wurden frisch isolierte Tibiae von 10 Tage alten Hühnerembryos mit [3H]-Prolin in prolinfreiem Kulturmedium 6 Std. bei 37°C markiert. Nach Entfernen der nicht eingebauten Markierung durch Waschen wurde das Gewebe homogenisiert und 20 min bei 3000 g bei 4°C zentrifugiert. Der sich ergebende Überstand wurde ausgiebig dialysiert, um die nicht eingebaute Markierung zu entfernen. Das markierte Prokollagensubstrat wurde allquotiert und bei –70°C aufbewahrt. Das Inkubationsgemisch für den Enzymtest in einem Gesamtvolumen von 2 ml bestand aus Eisenammoniumsulfat (0,1 mMol/l), alpha-Ketoglutarsäure (0,1 mMol/l), [3 H]-Prolinprokollagen (200.000 ZpM („dpm")), Lungenhomogenat (0,2 ml), Ascorbinsäure (0,5 mMol/l) und TRIS-Salzsäurepuffer (0,1 Mol/l, pH 7,8). Dem Reaktionsansatz wurde nach 30 min, bei 37°C in einem metabolischen Dubnoff-Schüttler 0,2 ml 50%-ige Trichloressigsäure zugegeben. Während der Reaktion wird tritiummarkiertes Wasser in stöchiometrischer Proportion zur Prolylhydroxylierung freigesetzt und wird als Maß der Enzymaktivität verwendet. Das tritiummarkierte Wasser des Reaktionssystems wurde durch Vakuumdestillation des gesamten Reaktionsgemisches getrennt und die radioaktiven Signale wurden gezählt. Die Enzymaktivität wurde als ZpM des tritiummarkierten Wassers ausgedrückt, das pro Gesamtlunge pro 30 min freigesetzt wurde.
Bestimmung der Zellzahl in der BALF.
Die Gesamtzellzahl in der BALF wurde bestimmt, wie von Wang, Q. et al., Lab. Invest., 67: 234–242 (1992) beschrieben. Die Gesamtleukocytenzahl in der BALF wurde vom Coulter-Zähler (Modell F, Coulter Electronics, Inc., Hialeah, FL) nach der Gebrauchsanweisung für den Benützer abgeschätzt.
BALF-Proteintest.
Der Proteingehalt im BALF-Überstand wurde unter Verwendung des Bio-Rad-Proteintests (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) bestimmt und Rinderserumalbumin wurde als Standard verwendet.
Histopathologische und immunhistochemische Analyse.
Drei bis vier Tiere aus jeder Behandlungsgruppe wurden zufällig für die histopathologische und immunhistochemische Beurteilung am Ende des Experiments ausgewählt. Die Bauchhöhle des Tieres wurde geöffnet, gefolgt von einem Ausbluten der absteigenden abdominalen Aorta. Unmittelbar danach wurde das Lungengewebe für die histologische Analyse präpariert, wie bei Wang et al., vorstehend, beschrieben. Nach der Kanülisierung der Trachea mit einer stumpfen Nadel wurde die Thoraxhöhle geöffnet und dann wurden sowohl das Herz als auch die Lunge en bloc entfernt. Die Lungen wurden mit Z-fix-Lösung über die Trachea bei einem Wasserdruck von 30 cm fixiert. Der rechte craniale und caudale Flügel und der linke Flügel wurden später blockiert, in Paraffin eingebettet und in 7-Micron-Schnitte geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Für die immunhistochemische Färbung für alphaSMA wurden die Lungengewebeschnitte entparaffinisiert und die endogene Peroxidase wurde blockiert. Die zu färbenden Schnitte wurden dann mit blockierendem Ziegenserum 30 min behandelt und 16 h mit primärem monoclonalem anti-alphaSMA-Antikörper (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) inkubiert.
Statistische Datenanalyse.
Die tierischen Daten wurden auf der Grundlage der Gesamtlunge ausgedrückt und als Mittelwert +/– Standardabweichung (SE) wiedergegeben. Die Daten wurde innerhalb der vier Gruppen unter Verwendung der Zweiweg-Varianzanalyse (SIGMASTAT) und der Student-Newman-Keuls-Verfahrens verglichen. Ein Wert von P ≤ 0,05 wurde als signifikant betrachtet.
ERGEBNISSE
Lipidperoxidation in der Maus-Lunge.
Der Lungenmalondialdehyd-Äquivalent-Gehalt wurde als Index der Lipidperoxidation in verschiedenen Gruppen der Mäuse angenommen. Die BL-Instillation erhöhte sowohl in den BL+IE6- als auch in den BL+SA-Gruppen im Vergleich zu den SA+SA- und BL+PS2-Gruppen den Malondialdehyd-Äquivalent-Gehalt in den Maus-Lungen signifikant (Daten nicht dargestellt). Die Behandlung mit PS2 blockierte wirksam die BL-induzierte Lungenlipidperoxidation, da sich der Lungen-Malondialdehyd-Äquivalent-Spiegel in der BL+PS2-Gruppe nicht von demjenigen der SA+SA-Gruppe unterschied.
Lungen-Hydroxyprolingehalt in der Maus-Lunge.
Lungen-Hydroxyprolin, der Schlüsselindex des Kollagenspiegels der Lunge, wurde bei vier Mäuse-Gruppen bestimmt. Die IT-Instillation von BL erhöhte den Hydroxyprolinspiegel in den BL+IE6- und BL+SA-Gruppen signifikant um 185% bzw. um 205% gegenüber der SA+SA-Kontrollgruppe. Der BL-induzierte Anstieg des Lungenhydroxyprolinspiegels in der BL+PS2-Gruppe wurde um 35% durch die Behandlung mit PS2 im Vergleich zur BL+SA-Gruppe signifikant gesenkt. Der Lungenhydroxyprolinspiegel in der BL+TR-Gruppe war nicht signifikant höher als derjenige der IT-SA-Kontroll (SA+SA)-Gruppe.
Prolylhydroxylase-Aktivität in der Maus-Lunge.
Die Prolylhydroxylase-Aktivitäten in den Lungen der verschieden Gruppen zeigte, dass BL allein die Lungen-Prolylhydroxylase-Aktivität in der BL+SA-Gruppe um 207% gegenüber der SA+SA-Kontrollgruppe signifikant erhöhte. PS2 senkte die Prolylhydroxylase-Aktivität signifikant, die durch die BL-Behandlung bei der BL+SA-Gruppe erhöht war.
Gesamt-BALF-Zellzahl in der Maus-Lunge.
Die Gesamtzellzahlen in der BALF der verschieden Gruppen 21 Tage nach der IT-Instillation von Salzlösung oder BL zeigte, dass die BL-Behandlung die Gesamtzellzahlen in der BALF aus den BL+IE6- und BL+SA-Gruppen im Vergleich zur Salzlösung-Kontrollgruppe (SA+SA) erhöhte, obwohl nur die BL+IE6-Gruppe signifikant höhere Spiegel als die SA+SA-Gruppe aufwies. Die BALF-Zellzählung in der BL+PS2-Gruppe unterschied sich nicht von derjenigen der SA+SA-Gruppe.
Proteingehalt in der BALF.
Der Proteingehalt des BALF-Überstandes für die vier experimentiellen Gruppen zeigte, dass die IT-Instillation von BL das BALF-Protein aller mit BL behandelten Gruppen im Vergleich zur SA+SA-Gruppe signifikant erhöhte. Jedoch senkte die Behandlung mit PS2 in der BL+PS2-Gruppe den BL-induzierten Anstieg im BALF-Überstandsprotein, obwohl der Unterschied nicht statistisch signifikant war.
Histopathologie der Maus-Lunge.
Die histologische Untersuchung der Maus-Lungen zeigte normales Lungenparenchymgewebe in der SA+SA-Gruppe. Jedoch zeigten die Lungen aus den BL+IE6- und BL+SA-Gruppen eine stellenweise Alveolitis und multifokale interstitielle Fibrose, die eine Akkumulation extrazellulärer Fasern enthielt. Die Lungen der Mäuse in diesen Gruppen wiesen verdickte interalveoläre Septen und inflammatorischen Zellen in den benachbarten Lufträumen auf. Im Vergleich zu den BL+IE6- und BL+SA-Gruppen wiesen die Lungen aus der BL+PS2-Gruppe viel weniger fibrotische Läsionen auf, obwohl einige Flügel noch einen leichten Grad an interstitieller Fibrose zeigten.
Immunhistochemische Färbung für alphaSMA in der Maus-Lunge
Um die Akkumulation der Fibroblasten und der fibroblastenartigen Zellen in Mäusen nach der BL-Behandlung zu bestimmen, untersuchten wir die Expression von (XSMA im Lungengewebe unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers gegen (XSMA. In den Kontroll-Lungen trat die Immunpositivität in den Gefäß- und weichen Bronchialmuskelschichten auf. In den mit BL und dem Kontrollantikörper oder mit Salzlösung behandelten Lungen gab es sowohl im Interstitium als auch in der Pleura eine extensive und intensive Immunfärbung innerhalb der fibrotischen Bereiche. Jedoch zeigten die mit BL und PS2 behandelten Lungen viel geringere Immunfärbung von alphaSMA im Vergleich zu den BL+IE6- und den BL+SA-Gruppen.
Diskussion
ILF ist eine verkrüppelnde Krankheit und reagiert schlecht auf die derzeitige Therapie. In der vorliegenden Studie liefern wir den Beweis, dass das alpha4-Untereinheiten enthaltende Integrin ein weiteres mögliches Ziel bei der Handhabung von ILF ist. Es wird im Allgemeinen angenommen, dass die Leukocyten der Lunge bei der Entwicklung der Lungenfibrose durch Sekretion von ROS, fibrogenen Cytokinen und Wachstumsfaktoren beteiligt sind. Der Transport und der Zustand der Aktivierung der Leukocyten werden durch verschiedene Oberflächenproteine wie die Integrine moduliert. Es ist klar, dass Zell-Zell-Interaktionen sowie Zell-EZM-Interaktionen für die Pathogenese der Lungenfibrose kritisch sind. Ein konsistenter Befund bei Patienten mit aktiver Lungenfibrose und in Tiermodellen von fibrotischen Lungenerkrankungen ist die Akkumulation einer erhöhten Anzahl von Immun- und inflammatorischen Zellen in Bereichen, die eine Fibrose durchmachen.
VLA-4 wird auf allen zirkulierenden Leukocyten exprimiert und bindet an das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül (VCAM-1), ein Mitglied der Ig-Gensuperfamilie, das auf cytokinaktivierten Endothelzellen exprimiert wird, sowie an das Matrixprotein Fibronectin. Alpha4beta7 wird auf einer Untergruppe von T- und B-Zellen, natürlichen Killerzellen und Eosinophilen exprimiert. Es bindet an das vaskuläre Schleimhautaddressin (MAdCAM-1), ein Mitglied der Ig- und Mucinartigen Adhäsionsmolekülfamilien, sowie an VCAM-1 und Fibronectin. Studien in vitro haben gezeigt, dass die VLA-4-Interaktion mit VCAM-1 an der Bindung von mononucleären Leukocyten und Eosinophilen an das Endothel und an der transendothelialen Wanderung beteiligt ist, und man glaubt, dass alpha4beta7 hauptsächlich an der Leukocytenrekrutierung zum darmassoziierten lymphatischen System beteiligt ist.
In der vorliegenden Studie senkte die Behandlung mit PS2 den BL-induzierten Anstieg der Gesamtleukocyten in der BALF. Die verringerten Leukocyten in den Lungen der BL+PS2-Mäuse können für die verringerten inflammatorischen Schädigungen und Fibrose in den Lungen von BL-behandelten Tieren verantwortlich sein. Die BL-induzierte Lungenschädigung wurde signifikant durch die Behandlung von PS2 verringert, wie durch Messen der Lungen-Lipidperoxidation gezeigt wurde. Das erhöhte Kollagen in der Lunge wurde mit einer erhöhten Anzahl von Fibroblasten im Interstitium und im alveolären Raum selbst assoziiert. Viele dieser fibroblastenartigen Zellen sind Myofibroblasten, die einen unterschiedlichen Phänotyp aufweisen, der die Expression von alphaSMA, einem kontraktilen Protein, einschließt, das man gewöhnlich in den glatten Muskelzellen findet und von dem man glaubt, dass es bei der Fibrogenese und der Wundheilung wichtig ist. Ein signifikanter Befund der vorliegenden Studie war, dass die PS2-Behandlung die BL-induzierte Myofibroblastenproliferation abschwächte. Ohne den Wunsch an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, kann die Verabreichung von Antikörpern gegen alpha-Integrin den Spiegel der Wachstumsfaktoren in der Lunge verringert haben, die durch infiltrierende Leukocyten freigesetzt wurden, oder kann direkt das Verhalten der Myofibroblasten beeinflusst haben. In beiden Fällen konnten die verringerten, proliferierenden Myofibroblasten zu einer Abnahme der Akkumulation von Kollagen in der Lunge bei den BL-behandelten Tieren in der BL-PS2-Gruppe führen.
BEISPIEL 3:
Hemmung der Fibrose mit Antagonisten gegen das alpha1-Untereinheiten enthaltende Integrin
Behandlung der Tiere
Männliche C57/BL6-Mäuse mit einem Gewicht von 28–30 g werden in Plastikkäfigen in Vierer-Gruppen in Anlagen gehalten, die von der American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care genehmigt wurde. Die Tiere durften sich eine Woche an die Laborbedingungen akklimatisieren, bevor die Versuche begannen. Sie hatten Zugang zu Rodent Laboratory Chow 5001 (Purina Mills, Inc., St. Louis, MO) und Wasser ad libitum und wurden in einem Raum gehalten, der mit gefilterter Luft versorgt wurde und einen 12 h-Hell/12 h-Dunkelzyklus aufwies. Die Mäuse wurden in folgende Gruppen eingeteilt:
Bleomycinsulfat wird in pyrogenfreier steriler isotonischer Salzlösung unmittelbar vor der intratrachealen (IT) Instillation gelöst. Unter Methoxyflurananästhesie erhielten die Mäuse in den entsprechenden Gruppen durch intratracheale Verabreichung entweder 100 μl sterile isotonische Lösung oder 0,08 Einheiten Bleomycinlösung in 100 μl. Den Mäusen in den entsprechenden Gruppen werden Antikörper (4 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion dreimal wöchentlich 21 Tage nach der Instillation injiziert. Danach wurden die Tiere in jeder Gruppe durch eine Überdosis Natriumpentobarbital (100–125 mg/kg ip) getötet und ihre Lungen für die bronchoalveoläre Lavagen sowie für die biochemischen und histopathologischen Studien verarbeitet.
Bestimmung der Gesamtzellzahl und des Proteinspiegels in der bronchoalveolären Lavage
Nach der Kanülierung der Trachea wurden die Lungen mit 5 ml isotonischer Salzlösung, verabreicht in 5 Aliquoten mit 1 ml gespült. Die Salzlösung wird mit einer Spritze durch die Kanüle verabreicht, die Brustwand wurde sanft massiert und die Flüssigkeit abgezogen. Die Flüssigkeit wird 20 Minuten bei 1500 g bei 4°C zentrifugiert und in isotonischer Salzlösung resuspendiert. Der Proteingehalt für den Überstand aus den bronchoalveolären Lavageproben wird durch ein Verfahren von Lowry et al., J Biol. Chem. 1193: 265–275 (1951) mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Die Gesamtzellzahl der Leukocyten in Suspension wird in einem Coulter-Zähler (Coulter Electronics, Hialeah, FL) bestimmt.
Bestimmung von Hydoxyprolin
Die Lungen der für die biochemischen Studien verwendeten Tiere werden in situ über den rechten Ventrikel mit eiskalter isotonischer Salzlösung perfundiert, um das Blut aus den Lungengefäßen über eine Öffnung im linken Aurikel auszuwaschen. Die Lungenflügel werden rasch von nicht parenchymalen Gewebe freiseziert, in flüssigen Stickstoff zum schnellen Einfrieren gelegt und dann bei –80°C aufbewahrt. Die gefrorenen Lungen werden später aufgetaut und in 0,1 M KCl, 0,02 M Tris-Puffer (pH 7,6) mit einem Polytron-Homogenisator homogenisiert. Der Hydroxyprolingehalt des Lungenhomogenats als Maß des Kollagengehalts wird mittels der Verfahren von Woessner, Arch. Biochem. Biophys. 93: 440–447 (1961) quantifiziert.
Histopathologische Studie
Nach der Lungen-Lavage wird die Thoraxhöhle geöffnet und das Herz und die Lungen wurden en bloc entfernt. Den Lungen wird eine 1%-ige Glutaraldehydparaformaldehyd-Fixierlösung in 0,12 M Cacodylatpuffer bei 400 mOsm bei 30 cm H₂O-Druck eingeträufelt. Die Lungen werden über diesen Druck etwa 2 Stunden fixiert und dann in Fixierlösung mit den verstopften Tracheae aufbewahrt. Vor der Einbettung wird die Lunge vom Herz isoliert und das gesamte Gewebe, das kein Lungengewebe ist, wird durch stumpfes Präparieren isoliert und entfernt. Aus mindestens zwei saggitalen Platten (2–3 mm dick) aus dem rechten cranialen, rechten caudalen und linken Lungenflügel jeder Lunge werden Gewebeblöcke herausgeschnitten. Jeder Block wird mit einer Fläche von etwa 1 cm² geschnitten. Die Blöcke werden in abgestuften Ethanolreihen dehydriert und in Paraffin eingebettet. Aus den Paraffinblöcken werden Schnitte (5 μm dick) präpariert und mit Hämatoxylin und Eosin für histologische Bewertungen gefärbt.
Datenanalyse und Interpretation
Die Daten werden hinsichtlich der Durchschnittswerte mit ihren Standardabweichungen und Standardabweichungen der Mittelwerte analysiert. Der Student-t-Test, Chi-Quadrat-Verteilungen, der Korrelationskoeffizient, die Varianzanalyse (ANOVA) und der multiple Vergleichstest werden angewandt, um unter Verwendung eines statistischen Softwarepakets (SAS/STAT Guide, 6. Ausg. Cary, N.C. S. 183–260 (1985)) die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Kontroll- und Behandlungsgruppen zu beurteilen.
Ergebnisse
In dieser Studie testen wir die Hypothese, dass der neutralisierende Antikörper für Integrin α1β1 (anti-α1β1) die Bleomycin (BL)-induzierte Lungenfibrose in vivo verringert. Männlichen C57/BL6-Mäusen wird dreimal wöchentlich intratracheal (IT) Salzlöung (SA) oder BL mit 0,08 U in 0,1 ml injiziert, gefolgt von einer intraperitonealen (IP) Injektion des Antikörpers (100 μg in 0,2 ml). 21 Tage nach der IT-Instillation werden die Mäuse für die bronchoalveoläre Lavage (BAL) sowie für biochemische und histopathologische Analysen getötet.
Histopathologische Untersuchungen der Lungen
Wir erwarten, dass mit Salzlösung und Kontroll-IgG behandelte Mäuse keine sichtbaren Läsionen und sichtbaren interalveolären Septen mit einem normalen dünnen Erscheinungsbild aufweisen. Dagegen werden mit Bleomycin und Kontroll-IgG behandelte Mäuse Läsionen aufweisen, die von multifokalen Stellen in proximalen Acini bis zu einer diffusen Verteilung variieren, die gelegentlich die Pleura miteinbezieht. Wir erwarten, dass die Lungen der mit Bleomycin und anti-alpha1-Integrinantikörper behandelten Mäuse mehr wie diejenigen in Gruppe B (vorstehend) aussehen. Wir erwarten, dass die Tiere der Gruppe D nur eine begrenzte Anzahl fibrotischer Läsionen mit leichter multifokaler septaler Verdickung und kleinen Aggregaten mononucleärer Zellen aufweisen.
Obwohl die vorhergehende Erfindung in Detail mittels Veranschaulichung und Beispielen für Verständniszwecke beschrieben wurde, ist es für den Fachmann offensichtlich, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen praktiziert werden. Deshalb sollten die Beschreibung und die Beispiele nicht als begrenzend für den Umfang der Erfindung gedeutet werden, die durch die Patentansprüche im Anhang beschrieben wird.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, die ein Antikörper-Homolog umfasst, das ein Antagonist einer Interaktion zwischen eine alpha4-Untereinheit tragendem Integrin und einem Liganden für eine alpha4-Untereinheit tragendes Integrin ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Fibrose in einem Individuum.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Fibrose die Fibrose eines inneren Organs ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das innere Organ die Leber, Lunge, Niere, Blutgefäße des Herzens oder der Gastrointestinaltrakt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Individuum an Lungenfibrose, Myelofibrose, Leberzirrhose, mesangialer proliferativer Glomerulonephritis, rasch progredienter Glomerulonephritis, diabetischer Nephropathie, renaler interstitieller Fibrose oder HIV-assoziierter Nephropathie leidet.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Fibrose dermale Fibrose ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Individuum an Sklerodermia, Morphea, Wulstnarben, hypertrophischen Narben, familiärem kutanem Kollagenom oder Bindegewebsnaevi vom Kollagentyp leidet.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Fibrose eine Fibrose des Auges ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Individuum an diabetischer Retinopathie, postoperativer Narbenbildung oder proliferativer Vitreoretinopathie leidet.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 8, wobei die Zusammensetzung ein anti-alpha4 Antikörper-Homolog umfasst.
Verwendung nach einem der vorgehenden Ansprüche, wobei das Antikörper-Homolog ein humanisiertes, menschliches oder chimäres Antikörper-Homolog ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 10, wobei das Arzneimittel zusammengesetzt ist, um verabreicht zu werden: (a) in einer Dosierung von 0,1 mg/kg pro Tag bis 10 mg/kg pro Tag; (b) über einen Dosierungszeitraum von 1 bis 14 Tagen; und (c) in einem Umfang, der ausreichend ist, um einen Plasmaspiegel des Antikörper-Homologs von 1 mg/ml oder höher beizubehalten.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 11, wobei das Antikörper-Homolog ein humanisierter Maus 21-6-Antikörper ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 12, wobei das Individuum ein Mensch ist.