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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Behandlung von insulinabhängigem (Typ-I)
Diabetes. Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf die Verwendung
von Antikörpern,
die das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit von Integrin VLA4 (sehr spätes Antigen
4) erkennen, bei der Verhütung
von Diabetes, gemäß der Ansprüche.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Insulinabhängiger Diabetes
(auch als Typ-I Diabetes und früher
insulinabhängiger
Diabetes (mellitus) bezeichnet) ist während der vergangenen zwei
Dekaden als eine chronische Autoimmunkrankheit klassifiziert worden.
Bei dieser Krankheit werden Insulin produzierende Zellen (beta Zellen)
innerhalb der Pankreasinseln selektiv aufgefangen und durch ein
zelluläres
Infiltrat des Pankreas zerstört.
Dieses die Inseln beeinträchtigende
entzündliche
Infiltrat ist als Insulitis bezeichnet worden. Zellen, die Insulin
produzieren, umfassen die Mehrheit von Inselzellen aber weniger
als 2% der gesamten Pankreasmasse (Castano und Eisenbarth, 1990,
[1], Fujita et al., 1982 [2], Foulis et al., 1986 [3]). Die Entwicklung
von Typ I Diabetes kann konzeptionell in sechs Stufen geteilt werden,
beginnend mit kinetischer Suszeptibilität und endend mit vollständiger beta
Zellzerstörung
(Eisenbarth, 1986 [4]). Stufe I ist genetische Suszeptibilität, welche
eine notwendige aber unzureichende Bedingung für die Entwicklung der Krankheit
ist. Ein hypothetisches Triggerereignis (Stufe II) führt zu aktiver Autoimmunität gegen
beta Zellen (Stufe III). Es wird die Hypothese aufgestellt, daß bei der
Stufe III die beta-Zellmasse abnimmt, und es werden immunologische
Abnormalitäten
wie beispielsweise gegen Insulin gerichtete Autoantikörper und
zytoplasmatische Inselantigene gefunden. Stimulierte Insulinausscheidung
wird bei dieser Stufe noch bewahrt.
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Über eine
Periode von Jahren führt
jedoch der fortschreitende Verlust von beta Zellen zu verminderter Insulinausscheidung
bei intravenösen
Glucosetoleranztests (IVGTT), während
das Individuum noch normoglykämisch
(Stufe IV) ist. Offensichtliche Diabetes (d.h. Diabetesanfall oder
klinische Manifestierung der Krankheit) gekennzeichnet durch Hyperglykämie) ist
Stufe V und kann sich Jahre später
entwickeln, wenn annähernd
90% der Pankreas-beta-Zellen zerstört sind. Wenn in Stufe V offensichtliche
Diabetes zuerst erkannt wird, bleibt etwas restliche Insulinproduktion
zurück
(wie dargestellt durch das Vorhandensein des verbindenden Peptids
von Proinsulin, C Peptid, in dem Serum), aber das Individuum hat üblicherweise
exogenes Insulin zum Leben nötig.
Letztendlich werden in Stufe VI selbst die verbleibenden beta Zellen
zerstört,
und C Peptid kann nicht länger
in der Zirkulation nachgewiesen werden.
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Während der
Initiierungsfaktor (en) und spezifische Sequenz von Ereignissen,
die zu Diabetes führen, einschließlich der
relativen Bedeutung von unterschiedlichen Zelltypen und Cytokinen
noch umfassend erörtert werden,
wird eine Schlüsselrolle
für die
reaktiven Selbst-Antigen-T-Zellen im allgemeinen anerkannt (Miller
et al., 1988 [5]; Harada und Makino, 1986 [6]; Koike et al., 1987
[7]; Makino et al. 1986 [8]). Neben T- Lymphozyten ist Insulitis
gekennzeichnet durch Makrophagen, dendritische Zellen (Voorbij et
al., 1989 [9]) und B Zellen, welche als professionelle Antigen präsentierende
Zellen (APC) dienen können.
Makrophagen können
auch Insel-beta-Zellen
selbst durch Freigabe von Cytokinen oder freien Radikalen zerstören (Nomikos
et al., 1986 [10]). Somit beruht Autoimmundiabetes sowohl auf zellulärer Migration
wie auch Immunstimulation von neuen Residentzellen.
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Zelltreiben
(cell trafficking) zu entzündlichen
Stellen wird reguliert durch hinzukommende Moleküle LFA-1, MAC-1 und VLA4 (Larson
und Springer, 1990 [11]; Hemler et al., 1990 [12]) auf der Oberfläche von Lymphozyten
(LFA-1, VLA4) und Makrophagen (MAC-1, VLA4) und durch ihre Gegenliganden
ICAM (für LFA-1
und MAC-1) und VCAM (für
VLA4), welche nicht durch Cytokine auf vaskuärem Endothelium reguliert sind
(Larson und Springer, 1990 (11]; Lobb, 1992 [13]; Osborn, 1990 [14]).
Darüberhinaus
bindet VLA4 an eine extrazelluläre
Matrixkomponente, die CS-1 Domäne
von Fibronektin (FN) (Wayner et al., 1989 [15]). Die relative Bedeutung
dieser Wege für
beispielsweise LFA-1 und VLA4 auf Lymphozyten oder MAC-1 und VLA4
auf Monzyten beim Kontrollieren von Zellmigration ist noch ein Thema
der Untersuchung. In vitro Daten schlagen vor, daß die differentielle
Verwendung dieser Wege sowohl von dem Aktivierungsstatus der Leukozyten
wie auch der Endothelialzellen abhängt (Shimizu et al., 1991 [16]).
Ihre Fähigkeit,
Zellmigration zu entzündlichen Stellen
in vivo zu kontrollieren, ist direkt mit monoklonalen Antikörpern (mAbs)
zu ICAM, MAC-1 oder VLA4 gezeigt worden, die verschiedene Modelle
von Tierkrankheiten inhibieren (Barton et al., 1989 [17], Phorbol-Ester
induzierte Kaninchenlungenentzündung;
Issekutz und Issekutz, 1991 [18], Hypersensitivität vom verzögerten Typ;
Issekutz, 1991 (19], mit Hilfsmittel induzierte Arthritis; Yednock
et al., 1992 (20], Transfer von experimenteller allergischer Enzephalomyelitis
(EAE); Lobb, 1992 [21], Asthma).
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ICAM
und VCAM werden auch auf der Oberfläche von Makrophagen und dendritischen
Zellen in lymphatischen Geweben gefunden (Dustin et al., 1986 [22];
Rice et al., 1990 [23]; Rice et al., 1991 [24]). Ihre Verteilung
auf diesen professionellen APC stimmt mit funktionellen Daten überein,
die eine Rolle für
LFA-1 und VLA4 bei der T Zellen-Aktivierung anzeigen (Shimuzu et
al., 1990 [25], Burkley et al., 1991 [26]). Es können jedoch zahlreiche andere
Rezeptor-Ligandenpaare einschließlich CD4/MHC Klasse II und
CD8/MHC Klasse I (Rudd et al, 1989 [27], CD2/LFA-3 (Moingeon et al., 1989 [28 ], CD28/B7
(Harding et al., 1992 [29]) auch Adhäsion unterstützen oder
T Zellen während
T/APC oder T/Zielzellenwechselwirkungen costimulieren. Die spezifischen
Beiträge
dieser zahlreichen Wege in der Entwicklung von Diabetes ist ungelöst. Es ist über eine
erhöhte
Adhäsion
von Monozyten von Insulin abhängigen
Diabetes mellitus Patienten an endotheliale Zellen in Kultur (Nouv.
Rev. Fr. Hematol. (1992)34[Suppl]:555-559) neben erhöhter Expression
von CD11b/Cd18 Molekülen
an der Oberfläche
von Diabetesmonozyten berichtet worden. Weil es mehrfache Molekülwege für Zelladhäsion und
T Zellenaktivierung gibt, ist es nicht möglich vorherzusagen, ob die
Erfindung den Anfall von Schwere von Diabeteskrankheit auf einem
oder mehreren dieser Wege beeinträchtigen würde, und insbesondere, welcher
dieser Wege entscheidend oder relevant gegenüber dem Krankheitsverfahren
sein würde.
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Gegen
T Zellen gerichtete Antikörper
sind in Murin und Rattenmodellen für spontane Diabetes und angenommenen
Transfer von Diabetes verwendet worden, wodurch T Zellen entleert
und somit Krankheit verhindert wird (siehe beispielsweise Harada
und Makino, 1986 [6], Anti-Thy 1, 2; Koike et al., 1987 [7], Miller
et al., 1988 [5] und Shizuru et al., 1988 [30], Anti-CD4; Barlow
und Like, 1992 [31], Anti-CD2; Like et al., 1986 [32], Anti-CD5
und Anti-CD8). Darüberhinaus
ist ein Antikörper
gerichtet auf das komplementäre
Rezeptor Typ 3 (CR3) Molekül
oder MAC-1 auf Makrophagen verwendet worden, um Makrophagen- und T Zelleninfiltration von
Pankreasgewebe in einem angenommenen Murintransfermodell von Krankheiten
zu verhindern (Hutchings et al., 1990 [33]). Es ist unbekannt, ob
V1A4 relevant gegenüber
Insulitis oder der Aktivität
von inselspezifischen Zellen nach Lokalisierung in dem Pankreas
ist.
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Für Typ I
Diabetes vorgeschlagene gegenwärtige
Behandlungsprotokolle haben bestimmte Immunmodulatorarzneimittel
mit einbezogen, die von Federlin und Becker [34] und den hier zitierten
Referenzen zusammengefaßt
sind. Eine lange Prädiabetesperiode
mit immunologischen Abnormalitäten
und fortschreitender beta-Zellzerstörung schlägt vor, daß es möglich ist, beta-Zellverlust
bei Immunmaßnahme
anzuhalten (Castano und Eisenbarth, 1990 [1].
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Vorgeschlagene
Mittel/Protokolle haben bestimmte Immunmodulator- und immunsuppressive
Mittel mit einbezogen: Levamisol, Theophyllin, Thymushormone, Ciamexon,
Anti-Thymozytenglobulin,
Interferon, Nicotinamid, Gammaglobulininfusion, Plasmapherese oder
Transfusion weißer
Zellen. Mittel wie Cyclosporin A und Azathioprin, welche T-Zellenaktivierung
bzw. T-Zellentwicklung beeinträchtigen,
sind bei klinischen Versuchen verwendet worden (Zielasek et al.,
1989 [35]). Die vielversprechendsten Ergebnisse sind mit Cyclosporin
A (Castano und Eisenbarth, 1990 [1]) erzielt worden. Federlin und
Becker, 1990 [34] schlagen jedoch vor, daß Cyclosporin A nicht für allgemeine
oder Langzeitverwendung wegen toxischer Nebenwirkungen, zumindest
wenn in höheren
Dosierungen verabreicht, empfohlen werden soll. Höhere Dosierungen
von Cyclosporin oder in Kombination mit anderen immunsupressiven
Arzneimitteln oder beides sind mit der Entwicklung von Lymphom und
irreversiblem Nierenschaden verbunden (Eisenbarth, 1986 [4]; Eisenbarth,
1987 [36]). Zusätzliche
Untersuchungen mit anderen vorgeschlagenen Mitteln sind notwendig,
um Sicherheit und Wirksamkeit zu gewährleisten. Selbst die Cyclosporin
A Untersuchungen zeigen, daß seine
Wirksamkeit beim Aufrechterhalten von Remission der Diabetes ein
Jahr bei etwa 30-60% der neuen Anfalldiabetes beträgt. Innerhalb
von drei Jahren jedoch sind Remissionen beinahe unveränderlich
verlorengegangen (Castano und Eisenbarth, 1990 [1]). Behandlungsprotokolle
nach Krankheitsanfall sind besonders problematisch, weil beispielsweise
zu der Zeit, wo Diabetes beim Menschen diagnostiziert wird, Insulitis üblicherweise
schon bis zu einem Verlust von mehr als 80% der beta Zellen fortgeschritten
ist. Somit ist es möglich,
daß Cyclosporin
A weitere beta Zellzerstörung
verhindern kann, aber so wenige beta Zellen können bei dem Diabetesanfall
vorhanden sein, daß sie
nicht einen nicht diabetischen Zustand über die Zeit beibehalten können (Castano
und Eisenbarth, 1990 [1]). Unterdrückung von Insulitis und/oder
Verhütung
von Krankheit kann günstiger
sein, wenn die Behandlung bei einer früheren Phase beginnen könnte, d.h.
vor Krankheitsanfall.
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Es
gibt zwei vorbeugende Hauptmaßnahmen,
um irgendeine vorbeugende Behandlung für Diabeteskrankheit zu entwickeln:
(1) die Fähigkeit,
genau das vordiabetische Individuum zu identifizieren, und (2) die Entwicklung
von sicheren, spezifischen und wirksamen vorbeugenden Behandlungen.
Ein beträchtlicher
Fortschritt ist beim Identifizieren von Prädiabetesindividuen gemacht
worden, es bleibt jedoch viel Arbeit bei der Entwicklung von sicheren,
spezifischen und wirksamen vorbeugenden Behandlungen, wie von Eisenbarth
und Kollegen diskutiert und zusammengefaßt, zurück (siehe beispielsweise Ziegler
und Eisenbarth, 1990 [37]; Ziegler et al., 1990 [38]; Ziegler et
al., 1990 [39]). Es ist möglich
gewesen, bestimmte Risikofaktoren und Risikogruppen für Typ I
Diabetes zu identifizieren und somit Individuen höchst wahrscheinlich
vorherzusagen, wie die klinische Krankheit verläuft und die annähernde Geschwindigkeit
des Krankheitsanfalls bei diesen Individuen abzuschätzen. Die Fähigkeit,
Individuen mit Empfänglichkeit
für Diabetes
zu identifizieren oder Typ I Diabetes in der vorklinischen Stufe
durch die Kombination von genetischen (HLA Typing), immunologischen
(Insel- und Insulinantikörper)
und metabolischen (erste Phase Insulinausscheidung zu intravenöser Glucose,
die der Entwicklung von Hyperglykämie vorangeht) Markern vorherzusagen,
macht die Identifizierung und Verwendung von prophylaktischen immuntherapeutischen
Arzneimitteln und Protokollen während
der Evolution des Autoimmunkrankheitsverfahrens möglich, wenn
beta Zellzerstörung
nur teilweise ist. Bis heute gibt es jedoch wenig Erfolg beim Behandeln
menschlicher Diabetes. Im allgemeinen weil die Behandlung des Menschen
nur nach Krankheitsanfall angewendet worden ist, wobei sich der
Behandlung eine zeitweilige vollständige oder teilweise Remission
nur bei einer bestimmten Anzahl von Patienten anschloß. Weil
immunsuppressive Mechanismen Insulitis und/oder Diabetes verhindern
können,
besteht ein Verlangen nach immunsuppressiven Komponenten für die Verwendung
in der vordiabetischen Stufe. Insbesondere besteht ein Verlangen nach
sichereren und mehr spezifisch wirkenden Verbindungen, beispielsweise
monoklonalen Antikörpern,
welche das Eintreten von Effektorzellen in den Pankreas oder die
Funktion jener Zellen inhibieren, welche schon in die Langerhansinseln
eingetreten sein können.
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PCT/WO
93/08823, veröffentlicht
am 13. Mai 1993 (zitiert unter Artikel 54(3)EPC) beschreibt Guanidinyl
und verwandte Zelladhäsionsmodulationsverbindungen,
welche gegen Rezeptoren gerichtet sind, die Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD)
erkennen. Typ I Diabetes wird unter den vielen Krankheiten und Bedingungen
genannt, an die sich derartige Zelladhäsionsmodulationsverbindungen
richten.
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Die
am 21 Juli 1994 veröffentlichte
PCT/WO 94/16094 (zitiert unter Artikel 54(3)EPC) beschreibt rekombinante Anti-VLA4
Antikörpermoleküle, die
geeignet bei der Behandlung von spezifischer und nicht spezifischer
Entzündung,
einschließlich
Asthma und entzündlicher
Darmerkrankung sind.
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Es
ist jetzt überraschenderweise
festgestellt worden, daß das
Verabreichen eines Anti-VLA4 Antikörpers, der sich dazu eignet,
an das B1- oder B2-Epitop von VLA-4 zu binden, signifikant das Auftreten
von Diabetes in einem Nagetiermodell von Diabetes Krankheit reduzierte.
Das NOD Maus Modell von Diabetes ist ein gut begründetes Modell,
das direkt vergleichbar mit Typ I Human-Diabetes ist. Unter Verwenden
eines Experimentprotokolls einer angenommenen übertragenen Krankheit wurden
bestrahlten nicht diabetischen NOD Mäusen Splenozyten von spontan
diabetischen NOD Mäusen
für die
akute Übertragung
der Krankheit verabreicht. Diese Splenozyten wurden mit Anti-VLA4
Antikörper,
der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop von VLA-4 zu binden,
vor Verabreichung behandelt, und die Rezipienten wurden auch verschiedene
Zeitperioden nach dem Transfer mit einem solchen Anti-VLA4 Antikörper behandelt.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Demgemäß liefert
die vorliegende Erfindung neue Verwendungen für die Herstellung von Medikamenten
für die
Verwendung bei der Verhütung
von insulinabhängigen
(Typ-I) Diabetes bei Vordiabetesindividuen, gemäß der Ansprüche.
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Somit
liefert die vorliegende Erfindung eine Verwendung eines Anti-VLA4
Antikörpers,
der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit
von VLA-4 zu binden, für
die Herstellung eines Medikaments für die Verwendung als das einzige
Medikament bei der Verhütung
von insulinabhängiger
(Typ I) Diabetes bei einem Vordiabetesindividuum.
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Insbesondere
ist der Antikörper
ausgewählt
aus Antikörper
HP1/2 oder einem humanisierten Anti-VLA4 Antikörper, der sich dazu eignet,
an das B1- oder B2-Epitop
der α4-Untereinheit von VLA4 zu binden, abstammend
von HP1/2. Auch wird die Verwendung analoger Antikörper oder
Antikörperfragmente,
die die Wirkung der gewünschten
Anti-VLA4 Antikörper
bei der Behandlung von Diabetes nachahmen, in Betracht gezogen.
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Darüberhinaus
liefert die vorliegende Erfindung eine Verwendung eines Antikörpers, eines
rekombinanten Antikörpers,
eines chimären
Antikörpers
oder Fragmenten derartiger Antikörper,
die sich dazu eignen, an das B1- oder
B2-Epitop der α4-Untereinheit von VLA4 zu binden, oder Kombinationen
von irgendwelchen der Vorhergehenden für die Herstellung eines Medikaments
für die
Verwendung bei der Behandlung von Diabetes, gemäß der Ansprüche. Auch wird ein VCAM 2D-IgG
Fusionsprotein, das sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop
der α4-Untereinheit von VLA-4 zu binden, in Betracht
gezogen.
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Dieses
Mittel wirkt, indem es mit dem Zelloberflächenbindungsprotein in Bezug
auf VLA4 in Konkurrenz tritt.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine graphische Darstellung, die die Wirkung des Anti-VLA4 Antikörpers (R1-2)
beschreibt und die Verhütung
von Diabetes nach angenommenem Transfer von Milzzellen kontrolliert;
die Häufigkeit
von Rezipienten, welche diabetisch wurden, und der Tag des Krankheitsanfalls
sind für
den Transfer von 2 × 107 Splenozyten von diabetischen (D) NOD Donatoren
ohne Behandlung (geschlossene Kreise), bei einer nicht spezifischen
Ratten IgG2b Behandlung (geschlossene Dreiecke) und bei R1-2 Anti-VLA4
Behandlung (geschlossene Rhombusse) wie auch für den Transfer von Splenozyten
aus nicht diabetischen (Y) NOD Donatoren (offene Quadrate) gezeigt;
die Splenozyten wurden mit R1-2 oder Ratten IgG2b oder ohne mAb übertragen,
und anschließend
wurde R1-2 oder Ratten IgG2b jeden anderen Tag bis (through) Tag
12 post Transfer injiziert (n = 8 – 10 für alle Gruppen).
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2 ist
eine graphische Darstellung, die die Wirkung des Anti-VLA4 Antikörpers (R1-2)
beschreibt und die Verhütung
von Diabetes nach angenommenen Transfer von Milzzellen kontrolliert;
die Häufigkeit
von Rezipienten, welche diabetisch wurden und der Tag des Krankheitsanfalls
sind für
den Transfer von 3 × 107 Splenozyten aus diabetischen (D) NOD Donatoren
ohne Behandlung (geschlossene Kreise), mit einer nicht spezifischen
Ratten IgG2b Behandlung (geschlossene Dreiecke) und mit R1-2 Anti-VLA4
Behandlung (geschlossene Rhombusse) wie auch für den Transfer von Splenozyten
aus nicht diabetischen (Y) NOD Donatoren (offene Quadrate) dargestellt;
die Splenozyten wurden mit R1-2 oder Ratten IgG2b oder ohne mAb übertragen,
und dann wurde R1-2 oder Ratten IgG2b alle 3,5 Tage bis Tag 25 post
Transfer (n = 4 – 5
für alle Gruppen)
injiziert.
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3 ist
eine graphische Darstellung, die die Wirkung des Anti-VLA4 Antikörpers (R1-2)
beschreibt und die Verhütung
von Diabetes nach angenommenem Transfer von Milzzellen kontrolliert;
die Häufigkeit
von Rezipienten, welche diabetisch wurden, und der Tag des Krankheitsanfalls
sind für
den Transfer von 2 – 3 × 107 Splenozyten aus diabetischen (D) NOD Donatoren ohne
Behandlung (geschlossene Kreise), mit einer nicht spezifischen Ratten
IgG2b Behandlung (geschlossene Dreiecke) und mit R1-2 Anti-VLA4
Behandlung (geschlossene Rhombusse) wie auch für den Transfer von Splenozyten
aus nicht diabetischen (Y) NOD Donatoren (offene Quadrate) oder
für PBS
allein (offene Kreise) gezeigt; die Splenozyten wurden mit R1-2
oder Ratten IgG2b oder ohne mAb übertragen,
und dann wurde R1-2 oder Ratten IgG2b alle 3, 5 Tage bis zum Tag 25
post Transfer (n = 5 für
alle Gruppen) injiziert.
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4 ist
eine graphische Barrendarstellung, die die Wirkung des Anti-VLA4
Antikörpers
(R1-2) zeigt und den Grad der Insulitis nach angenommenem Transfer
von Milzzellen kontrolliert; die Häufigkeit der nicht infiltrierten
Insel: (Grad 0-1 Infiltrat, gepunkteter Barren) und infiltrierten
Inseln (Grad II-IV Insulitis, fester Barren) wurde quantitativ bestimmt
und ist gezeigt nach dem Transfer von Zellen, die mit R1-2, Ratten
IgG2b oder ohne mAb behandelt waren und dann mit R1-2 oder Ratten
IgG2b alle 3,5 Tage bis zum Tag 25 gespritzt waren, wobei die Mäuse geopfert
wurden, als sie diabetisch waren oder am Tag 26 post Transfer. Pankreasabschnitte von
n = 4 – 5
Mäusen
wurden für
jede experimentelle Gruppe markiert, d.h. Y→Y (nicht diabetische Donorzellen)
oder D→Y
(diabetische Donorzellen) in nicht diabetische (Y) Rezipienten mit
keiner mAb Behandlung, Behandlung mit Ratten IgG2b oder Behandlung
mit R1-2.
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5 ist
graphische Darstellung in Barrenform, die die Wirkung des Anti-VLA4
Antikörpers
(R1-2) beschreibt und den Grad der Insulitis nach angenommenem Transfer
der Milzzellen kontrolliert; die Häufigkeit der nicht infiltrierten
Inseln (Grad 0-I Infiltrat, gepunkteter Barren) und infiltrierten
Inseln (Grad II-IV Insulitis, fester Barren) wurde quantitativ bestimmt
und gezeigt nach Transfer von Zellen, die mit R1-2, Ratten IgG2b
oder ohne mAb behandelt waren und dann mit R1-2 oder Ratten IgG2b
jeden anderen Tag bis zum Tag 12 post Transfer gespritzt waren und
dann ohne weitere mAb Injektion gehalten waren, bis sie geopfert
wurden, als sie diabetisch waren oder am Tag 29 post Transfer.
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Pankreasabschnitte
von n = 4 – 5
Mäusen
wurden für
jede experimentelle Gruppe markiert, d.h. Y→Y (nicht diabetische Donorzellen)
oder D→Y
(diabetische Donorzellen) in nicht diabetische (Y) Rezipienten ohne mAb
Behandlung, Behandlung mit Ratten IgG2b oder Behandlung mit R1-2.
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6 ist
eine graphische Darstellung, die die Wirkung des Anti-VLA4 Antikörpers (R1-2)
beschreibt und die Verhütung
von Diabetes in einem Spontankrankheitsmodell für Diabetes kontrolliert; die
Häufigkeit
der Rezipienten, welche diabetisch wurden, und der Tag des Krankheitsanfalls
sind für
NOD Mäuse
ohne Behandlung (geschlossene Quadrate), mit einer nicht spezifischen
Ratten IgG2b Behandlung (geschlossene Kreise) und mit R1-2 Anti-VLA4
Behandlung (geschlossene Dreiecke) gezeigt; R1-2 oder Ratten IgG2b
wurde 8 Wochen lang in NOD Mäuse
zweimal wöchenlich
von Woche vier bis Woche zwölf
an Alter gespritzt. 7 ist eine graphische Darstellung,
die die Wirkung des VCAM 2D-IgG Fusionsproteins, das sich dazu eignet,
an das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit von VLA4 zu binden, beschreibt
und die Verhütung
von Diabetes nach angenommenen Transfer der Milzzellen kontrolliert;
die Häufigkeit
von Rezipienten, welche diabetisch wurden, und der Tag des Krankheitsanfalls
sind für
den Transfer von 2 × 107 Splenozyten von diabetischen (D) NOD Donatoren
mit einer irrelevanten Ratten-LFA-3Ig Fusionsproteinbehandlung (geschlossene
Quadrate) und mit Behandlung mit VCAM 2D-IgG, das sich dazu eignet,
an das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit von VLA4 zu binden (offene
Kreise), und von Rezipienten, welche PBS allein ohne übertragene
Zellen erhielten (geschlossene Dreiecke), dargestellt; die Splenozyten
wurden mit VCAM 2D-IgG, das sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop
der α4-Untereinheit
von VLA4 zu binden, oder Ratten LFA-3Ig übertragen, und anschließend wurde
VCAM 2D-IgG, das sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit
von VLA4 zu binden, oder Ratten LFA-3Ig jeden anderen Tag bis zum
Tag 17 post-Transfer (n = 5 für
alle Gruppen) injiziert.
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8 ist
eine schematische beschreibende Struktur des in Beispiel 5 beschriebenen
VCAM 2DIgG Fusionsproteins, das sich dazu eignet, an das B1- oder
B2-Epitop der α4-Untereinheit
von VLA4 zu binden. VCAM 2D-IgG ist eine lösliche Form des Liganden für VLA4 (VCAM1)
und besteht aus den zwei N-terminalen Domänen von VCAM1, die an die schwerkettigen
konstanten IgG1 Humanregionssequenzen (Hinges, CH2
und CH3) fusioniert sind.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung bezieht sich auf eine Behandlung, die die Verhütung von
insulinabhängigem
(Typ I) Diabetes einschließt.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von Antikörpern zum
B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit von VLA4 bei der Behandlung
von Diabetes bei einem Prädiabetesindividuum. Der
Begriff „prädiabetisch" soll ein Individuum
bezeichnen, bei dem ein Risiko für
die Entwicklung von Diabeteskrankheit (d.h. genetisch vorbestimmt)
in irgendeinem Stadium des Krankheitsprozesses vor offensichtlicher
Diabetes oder Diabetesanfall besteht. Der Ausdruck „diabetisch" soll ein Individuum
mit offensichtlicher Hyperglykämie
(d.h. Fastenblutglucosespiegel ≥ 250
mg/dl) bedeuten. Der Ausdruck „offensichtliche
Diabetes" oder „Diabetesanfall" soll einen Krankheitszustand
bedeuten, bei dem die Pankreasinselzellen zerstört sind, und welcher klinisch
durch offensichtliche Hyperglykämie
(d.h. Fastenblutglucosespiegel ≥ 250
mg/dl) manifestiert ist.
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In
dem ersten Aspekt liefert die Erfindung eine Behandlung von Diabetes,
umfassend die Stufe des Verabreichens einer Zusammensetzung, die
einen Antikörper
einschließt,
der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit
von VLA4 zu binden, oder ein VCAM 2D-IgG Fusionsprotein, das sich
dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit von
VLA4 zu binden, die sich dazu eignet, zu binden, einschließlich Blockieren
oder Überziehen,
an das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit von VLA4 auf der Oberfläche von
VLA4 positiven Zellen, einschließlich Lymphozyten und Makrophagen.
Für die
Zwecke der Erfindung soll der Ausdruck „Binden an B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit
von VLA4" Umsetzen
mit dem B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit von VLA4 Antigenen auf Zellen
und dadurch interferieren mit Wechselwirkungen zwischen VLA4 Antigenen
und entweder VCAM-1 oder Fibronektin auf der Oberfläche von
anderen Zellen oder dadurch Induzieren einer Änderung in der Funktion der
VLA-4 positiven Zellen bedeuten. Wie hier dargestellt, führt ein
derartiges Binden, einschließlich
Blockieren oder Überziehen,
des B1- oder B2-Epitops der α4-Untereinheit von VLA4 zu einer Verhütung oder
Schutz gegen das Auftreten von Diabetes. Diese Demonstration verwendete
einen monoklonalen Antikörper
gegen VLA4 als ein Bindungsmittel, welches wirksam das B1- oder
B2-Epitop der α4-Untereinheit von VLA4 blockierte oder überzog.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der gewünschte
Antikörper,
der bei der erfindungsgemäßen Verwendung
verwendet wird, zu binden, einschließlich blockieren oder überziehen,
an Zelloberflächen-B1-
oder B2-Epitope
der α4-Untereinheit von VLA4, ein monoklonaler
Antikörper
oder Antikörperderivat. Bevorzugte
gewünschte
Antikörperderivate
für die
Behandlung, insbesondere für
die menschliche Behandlung, umfassen humanisierte rekombinante Antikörper, rekombinante
Chimärenantikörper, Fab,
Fab', F(ab')2 und
F(v) Antikörperfragmente
und Monomere oder Dimere von schweren oder leichten Antikörperketten
oder Zwischenmischungen davon, die sich dazu eignen, an das B1-
oder B2-Epitop der α4-Untereinheit von VLA-4 zu binden. Somit
sind die monoklonalen Antikörper
gegen das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit von VLA-4 ein bevorzugtes
Bindungsmittel bei dem erfindungsgemäßen Verfahren.
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Die
Technologie zum Herstellen von monoklonalen Antikörpern ist
gut bekannt. Kurz gesagt, eine unsterbliche Zelllinie (typischerweise
Myelomzellen) wird an Lymphozyten (üblicherweise Splenozyten) von
einem Säuger,
der mit ganzen Zellen immunisiert ist, die ein gegebenes Antigen,
beispielsweise VLA4 exprimieren, fusioniert, und die Kulturüberstände der
sich ergebenden Hybridomzellen werden in Bezug auf Antikörper gegen
das Antigen gescreent. (Siehe allgemein Kohler et al., 1975 [40]).
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Immunisierung
kann unter Verwenden von Standardverfahren durchgeführt werden.
Die Einheitsdosis und Immunisierungssysteme hängen von der Art des immunisierten
Säugers,
seinem Immunzustand, dem Körpergewicht
des Säugers
etc. ab. Typischerweise läßt man die
immunisierten Säuger
bluten, und das Serum aus jeder Blutprobe wird in Bezug auf bestimmte
Antikörper
unter Verwenden entsprechender Screeningassays untersucht. Beispielsweise können die
Anti-VLA4 Antikörper
mittels Immunfällung
von 125J-markierten Zelllysaten aus VLA4
exprimierenden Zellen identifiziert werden (siehe Sanchez-Madrid
et al. 1986 [41] und Hemler et al. 1987 [42]). Anti-VLA4 Antikörper können auch
mittels Fließzytometrie,
beispielsweise durch Messen von fluoreszierendem Färben von
Ramoszellen, die mit einem Antikörper
inkubiert sind, von dem man annimmt, daß er VLA4 erkennt, identifiziert
werden (siehe, Elices et al., (1990) [43]). Die bei der Herstellung
von Hybridomzellen verwendeten Lymphozyten werden typischerweise
aus immunisierten Säugern
isoliert, deren Seren schon positiv in Bezug auf das Vorhandensein
von Anti-VLA4 Antikörpern
unter Verwenden derartiger Screeningassays getestet worden sind.
-
Typischerweise
stammt die unsterbliche Zelllinie (beispielsweise eine Myelomzelllinie)
von der gleichen Säugerspecies
wie die Lymphozyten ab. Bevorzugte unsterbliche Zelllinien sind
Mausmyelomzelllinien, die empfindlich gegenüber Kulturmedium sind, das
Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin („HAT" Medium) enthält.
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Typischerweise
werden HAT empfindliche Mausmyelomzellen an Maussplenozyten unter
Verwenden von 1500 molekulargewichtigem Polyethylenglycol („PEG 1500") fusioniert. Aus
der Fusion resultierende Hybridomzellen werden dann unter Verwenden
von HAT Medium ausgewählt,
welches nicht fusionierte und unproduktiv fusionierte Myelomzellen
tötet (nicht
fusionierte Splenozyten sterben nach mehreren Tagen, weil sie nicht
transformiert sind). Einen gewünschten
Antikörper
produzierende Hybridome werden durch Screenen der Hybridomkulturüberstände nachgewiesen.
Beispielsweise können
Hybridome, die hergestellt sind, um die gewünschten Anti-VLA4 Antikörper zu
erzeugen, durch Testen des Hybridomkulturüberstandes in Bezug auf ausgeschiedene
Antikörper
mit der Fähigkeit,
an das B1- oder
B2-Epitop einer rekombinanten α4-Untereinheitexprimierenden Zelllinie zu
binden, wie beispielsweise transfektionierte K-562 Zellen, gescreent
werden (siehe Elices et al. [43]).
-
Um
die gewünschten
Anti-VLA4 Antikörper
herzustellen, wurden Hybridomzellen, die in derartigen Screeningtests
positiv testeten, in einem Nährmittelmedium
unter Bedingungen und für
eine ausreichende Zeit kultiviert, die es den Hybridomzellen ermöglichte,
die monoklonalen Antikörper
in das Kulturmedium auszuscheiden. Gewebekulturtechniken und Kulturmedien,
die für
Hybridomzellen geeignet sind, sind gut bekannt. Der konditionierte
Hybridomkulturüberstand
kann gesammelt und die gewünschten
Anti-VLA4 Antikörper
gewünschtenfalls
weiterhin mittels gut bekannter Verfahren gereinigt werden.
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Alternativ
kann der gewünschte
Antikörper
hergestellt werden, indem die Hybridomzellen in die Bauchfellhöhle einer nicht
immunisierten Maus injiziert werden. Die Hybridomzellen vermehren
sich in der Bauchfellhöhle,
wobei sie den Antikörper
ausscheiden, der sich als Ascitesflüssigkeit ansammelt. Der gewünschte Antikörper kann
geerntet werden, indem die Ascitesflüssigkeit aus der Bauchfellhöhle mit
einer Spritze abgezogen wird.
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Mehrere
Anti-VLA4 naonoklonale Mausantikörper
sind zuvor beschrieben worden (siehe beispielsweise Sanchez-Madrid et al., 1986
[41]; Hemler et al., 1987 [42]; Pulido et al., 1991 [44]). Diese
monoklonalen Anti-VLA4 Antikörper
wie beispielsweise HP1/2 und andere Anti-VLA4 Antikörper (beispielsweise
mAb, HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, P4G9), die dazu fähig sind, das B1- oder B2-Epitop
der α-Kette
von VLA4 zu erkennen, eignen sich bei den Behandlungsverfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung. Anti-VLA4 Antikörper,
die die B1- oder B2-Epitope der VLA-alpha4 Ketten
erkennen, die in das Binden an VCAM-1 und Fibronektinliganden verwickelt
sind (d.h. Antikörper,
welche an das B1- oder B2-Epitop von VLA4 an einer Stelle binden
können, die
in die Ligandenerkennung verwickelt ist und VCAM-1 und Fibronektinbinden
blockieren) sind bevorzugt. Derartige Antikörper sind als B Epitop spezifische
Antikörper
(B1 oder B2) (siehe Pulido et al. (1991) [36]) definiert worden.
Der, wie hier beschrieben, verwendete R1-2 Antikörper ist ein B Epitop Typ Antikörper.
-
Monoklonale
Humanantikörper
gegen das B1- oder B2-Epitop
der α4-Untereinheit
von VLA4 sind ein weiteres bevorzugtes Bindungsmittel, welches VLA4 α4-Untereinheit-B1- oder B2-Epitop-Antigene
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
blockieren oder überziehen
kann. Diese können
unter Verwenden von in vitro geprimerten Humansplenozyten hergestellt
werden, wie von Boerner et al. 1991 [45] beschrieben. Alternativ
können
sie mithilfe von Repertoireklonen, wie von Persson et al., 1991
[46] oder von Huang und Stollar, 1991 [47] beschrieben, hergestellt werden.
Ein weiteres bevorzugtes Bindungsmittel, welches VLA4 α4-Untereinheit-B1- oder
B2-Epitop-Antigene bei dem erfindungsgemäßen Verfahren blockieren oder überziehen
kann, ist ein chimärer
rekombinanter Antikörper
mit Anti-VLA4 α4-Untereinheit-B1-
oder B2-Epitop-Spezifität
und einer konstanten Humanantikörperregion.
Jedoch noch ein weiteres bevorzugtes Bindungsmittel, welches VLA4 α4-Untereinheit-B1-
oder B2-Epitop-Antigene bei dem erfindungsgemäßen Verfahren blockieren oder überziehen kann,
ist ein humanisierter rekombinanter Antikörper mit Anti-VLA4 α4-Untereinheit-B1-
oder B2-Epitop- Spezifität.
Humanisierte Antikörper
können hergestellt
werden, wie beispielhaft in Jones et al., 1986 [48], Riechmann,
1988 [49], Queen et al., 1989 [50] und Orlandi et al., 1989 [51]
beschrieben. Bevorzugte Bindungsmittel, welche chimäre rekombinante
und humanisierte rekombinante Antikörper mit B Epitop Spezifität einschließen, sind
hergestellt worden und in der in Gemeinbesitz befindlichen (commonly
owned) internationalen Patentanmeldung, WO 9416094, veröffentlicht
am 21. Juli, 1994 [52] beschrieben. Das Ausgangsmaterial für die Herstellung
der gewünschten
Chimären
(Maus V – Human
C) und der gewünschten
humanisierten Anti-VLA4 Antikörpern
kann ein Murin monoklonaler Anti-VLA4 α4-Untereinheit B1-
oder B2-Epitop -Antikörper,
wie zuvor beschrieben, ein monoklonaler Anti-VLA4- α4-Untereinheit-B1- oder B2-Epitop-Antikörper, kommerziell
erhältlich (beispielsweise
HP2/1, A mac International, Inc., Westbrook, Maine) oder ein monoklonaler
Anti-VLA4-α4-Untereinheit-B1-
oder B2-Epitop-Antikörper,
hergestellt in Übereinstimmung
mit der Lehre hier sein. Beispielsweise sind die variablen Regionen
der schweren und leichten Ketten des Anti-VLA4 Antikörpers HP1/2
kloniert, sequenziert und exprimiert worden in Kombination mit konstanten
Regionen der schweren und leichten Humanimmunglobulinketten. Ein
derartiger gewünschter
chimärer
HP1/2 Antikörper
ist in Bezug auf Spezifität
und Potenz ähnlich
zu dem Murin HP1/2 Antikörper
und kann geeignet bei den Behandlungsverfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung sein. Die HP1/2 VH DNA Sequenz
und ihre übersetzten
Aminosäuresequenzen
sind in SEQ ID NR: 1 bzw. SEQ ID NR: 2 dargelegt. Die HP1/2Vk DNA Sequenz und ihre übersetzte Aminosäuresequenz
sind in SEQ ID NR: 3 bzw. SEQ ID NR: 4 dargelegt. In ähnlicher
Weise können
humanisierte rekombinante Anti-VLA4-α4-Untereinheit-B1- oder B2-Epitop-Antikörper geeignet
bei diesen Verfahren sein. Ein bevorzugter humanisierter rekombinanter
Anti- VLA4 Antikörper ist
ein AS/SVMDY Antikörper,
beispielsweise der AS/SVMDY Antikörper, hergestellt mithilfe
der mit der ATCC am 3. November, 1992 und gegebenen Hinterlegungsnummer
CRL 11175 hinterlegten Zelllinie. Der AS/SVMDY humanisierte Antikörper ist
zumindest equipotent mit oder vielleicht potenter als der Murin
HP1/2 Antikörper.
Die AS VH DNA Sequenz und ihre übersetzten
Aminosäuresequenzen
sind in SEQ ID NR: 5 bzw. SEQ ID NR: 6 dargelegt. Die SVMDY VK DNA Sequenz und ihre übersetzte Aminosäuresequenz
sind in SEQ ID NR: 7 bzw. SEQ ID NR: 8 dargelegt.
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Alternativ
können
die bei der Verwendung der Erfindung verwendeten Bindungsmittel
keine Antikörper oder
Antikörperderivate
sein, sondern können
eher ein VCAM 2D-IgG-Fusionsprotein
sein, das sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit
von VLA-4 zu binden. Diese Bindungsmittel wirken, indem sie mit
dem Zelloberflächenbindungsprotein
in Bezug auf VLA4 konkurrieren.
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Bei
dieser Verwendung in Bezug auf den ersten Aspekt der Erfindung werden
gewünschte
VLA4 Bindungsmittel vorzugsweise parenteral verabreicht. Die gewünschten
VLA4 Bindungsmittel werden vorzugsweise als eine sterile pharmazeutische
Zusammensetzung verabreicht, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält, welcher
irgendeiner der zahlreichen gut bekannten Träger sein kann, wie beispielsweise
Wasser, physiologische Kochsalzlösung,
phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol,
und dergleichen, oder Kombinationen davon. Vorzugsweise wird das
gewünschte
VLA4 Bindungsmittel, falls ein Antikörper oder Antikörperderivat,
in einer Dosis verabreicht, die im Bereich zwischen etwa 0,1 mg/kg
Körpergewicht/Tag
und etwa 20 mg/kg Körpergewicht/Tag,
vorzugsweise im Bereich zwischen etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht/Tag
und etwa 10 mg/kg Körpergewicht/Tag
liegt und in Intervallen von jeweils 1-14 Tagen. Für VCAM 2D-IgG
sollte der Dosisbereich vorzugsweise zwischen molaren Äquivalentmengen
zu diesen Antikörpermengen
sein. Vorzugsweise wird eine Antikörperzusammensetzung in einer
Menge verabreicht, die wirksam ist, einen Plasmaspiegel von Antikörper von
mindestens 1 µg/ml
zu liefern. Die Optimierung von Dosierungen kann durch Verabreichung
der Bindungsmittel, gefolgt von Bewertung des Überziehens der VLA4 positiven
Zellen mithilfe des Mittels über
eine Zeit nach Verabreichung einer gegebenen Dosis in vivo bestimmt werden.
Periphere mononukleare Blutzellen, welche in einer Probe des peripheren
Bluts des Individuums enthalten waren, sollten im Hinblick auf das
Vorhandensein des Agenzes in vitro (oder ex vivo) unter Verwenden eines
zweiten Reagenzes zum Nachweisen des verabreichten Mittels untersucht
werden. Beispielsweise kann dieses ein mit Fluorochrom markierter
Antikörper
sein, der spezifisch für
den verabreichten gewünschten
Antikörper
oder das gewünschte
VCAM 2D-IgG-Fusionsprotein ist, welches dann mithilfe von Standard
FACS (Fluoreszenz aktivierter Zellsortierer) Analyse gemessen wird.
Alternativ kann das Vorhandensein des verabreichten gewünschten
Antikörpers
oder des gewünschten
VCAM 2D-IgG-Fusionsproteins in vitro (oder ex vivo) durch die Unfähigkeit
oder verringerte Fähigkeit
der Zellen des Individuums, das gleiche Mittel zu binden, welches
selbst markiert worden ist (beispielsweise mithilfe eines Fluorochroms)
nachgewiesen werden. Die bevorzugte Dosierung sollte nachweisbares Überziehen
der breiten Mehrheit von VLA4-positiven Zellen erzeugen. Vorzugsweise
wird der Überzug
im Fall eines gewünschten
monoklonalen Antikörpers
oder gewünschten monoklonalen
Antikörperderivats
für eine
1-14 Tage Dauer aufrechterhalten.
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Die
Behandlung mit gewünschten
VLA4 Bindungsmitteln wird vorzugsweise für so lange fortgesetzt, wie
das Prädiabetessubjekt
einen stabilen normoglykämischen Plasmaspiegel
und einen stabilen prädiabetischen
Zustand, wie mithilfe einer Anzahl von bekannten Markern reflektiert,
wie zuvor beschrieben, beibehält. In
den Beispielen, welche folgen, ist festgestellt worden, daß Anti-VLA4
mAb, der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit
von VLA-4 zu binden, beispielsweise R1-2 mAb, Verabreichung Diabetesanfall
während
der Behandlung verhinderte, und daß die restlichen günstigen
Ergebnisse der Behandlung so lange wie zwei Monate im Anschluß an das
Aufhören
von R1-2 Behandlung ausgedehnt wurden. Um jedoch die vollständige schützende Wirkung
des gewünschten
VLA4 Bindungsmittels gegen Diabetesanfall aufrechtzuerhalten, ist
kontinuierliche Behandlung mit den Bindungsmitteln bevorzugt.
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Die
Verwendung, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht, umfaßt Verabreichen
einer einen Anti-VLA4 Antikörper,
der sich dazu eignet, das B1- oder
B2-Epitop der α4-Untereinheit zu binden, enthaltenden Zusammensetzung
einem prädiabetischen
Individuum. Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die beobachteten
Ergebnisse in einem Nagetierkrankheitsmodell. Diese Ergebnisse zeigen
eine Schutzwirkung des gewünschten
Anti-VLA4 Antikörper
bei Krankheitsanfall in dem akuten Übertragungsmodell der Krankheit.
Die nicht fettleibige diabetische (NOD) Maus ist ein wichtiges Modell
des Typ I oder Insulin abhängigen
Diabetes mellitus seit ihrer Einführung durch Makino et al.,
1980 [7] geworden und ist als ein besonders relevantes Modell für Humandiabetes
dokumentiert worden (siehe beispielsweise Castano und Eisenbarth
[1], Miller et al., 1988 [5], Hutchings et al., 1990 [33] und darin
zitierte Referenzen). Daß die
in der NOD Maus und dem Menschen gezeigten diabetischen Syndrome ähnlich sind,
ist mittels verschiedener Beweislinien gezeigt worden. Beispielsweise
gibt es sowohl in der NOD Maus wie dem Menschen [1] eine starke
genetische Assoziierung von Diabetes mit Loci des Haupthistokompatibilitätskomplexes.
Darüberhinaus
wird beispielsweise in beiden Species eine Autoimmunpathogenese
durch (i) das Vorhandensein von lymphozytärer Entzündung in den Pankreasinseln
(d.h. Insulitis) bewiesen, welches die selektive Zerstörung von
beta Zellen, (ii) das Vorhandensein von Anti-Inselzellantikörpern und
(iii) die modulierenden Wirkungen von Cyclosporin A zu vermitteln scheint.
Weiterer Beweis in der NOD Maus für eine Autoimmunethiologie
von Diabeteskrankheit ist (i) die Fähigkeit, Diabetes mit Milzzellen
(einschließlich
gereinigte Milz T Zellen) aus diabetischen Donatoren zu übertragen,
(ii) die Verhütung
von Diabetes durch in vivo Behandlung mit Antikörpern, die spezifisch für T Zellen sind,
und (iii) Versagen einer Thymusnacktmaus mit NOD genetischem Hintergrund,
Moulitis oder Diabetes zu entwickeln (siehe beispielsweise Miller
et al., 1988 [5], Hutchings et al., 1990 [33] und darin zitierte
Entgegenhaltungen).
-
Obwohl
die präzisen
zu Diabetes führenden
Ereignisse unklar bleiben, scheint eine bei der NOD Maus fortschreitende
entzündliche
Reaktion in dem Pankreas die anfängliche histologische
Schädigung
zu sein, welche als ein periduktales/perivaskuläres mononukleares Zellinfiltrat
mit einem Alter von 3-4 Wochen beginnt. Bei etwa 4-6 Wochen Alter
kann Insulitis beobachtet werden und beginnend mit etwa 12 Wochen
Alter tritt offensichtliche Diabetes auf (d.h. übereinstimmende Werte von 1+
oder höher
unter Verwenden eines Testape (Eli Lilly, Indianapolis, IN) Assays
für Glykosurie
oder größer a1s
250 mg/dl, wenn Plasmaglucose angezeigt wird). Um Veränderungen
in dem Immunstatus der Tiere zu vermeiden, werden die NOD Mäuse aus
einer spezifischen pathogenfreien Kolonie erhalten und zeigen stabiles,
hohes Vorkommen von Diabetes von etwa 80% der Weibchen und 20% der
Männchen,
welche typischerweise diabetisch mit etwa 20 Wochen Alter werden. Die
bevorzugte Quelle für
die in den hier beschriebenen Experimenten verwendeten NOD Mäuse ist
Taconic Farms (Germantown, NY). Ein großer Teil an Daten, insbesondere
aus Untersuchungen der BB Ratte und NOD Maus hat angezeigt, daß Typ I
Diabetes eine T-Zellen vermittelte Krankheit sein kann. Datenoffenkundigkeit
legt eine wichtige Rolle für
beide Haupt-T-Zellsubpopulationen
(CD4/L3T4 und CD8/Ly2) bei der Entwicklung von Diabetes im Menschen
und in der NOD Maus nahe. Die Daten, die die wesentliche Rolle von
T Zellen in Diabetes unterstützen,
schließen
nicht die Möglichkeit
aus, daß T
Lymphozyten andere Zellen (beispielsweise Makrophagen) als die letztendlichen
Effektoren für
beta-Zellzerstörung
rekrutieren können.
Makrophagen sind basierend auf ihrem Vorhandensein in der infiltrierten
Insel und der Fähigkeit
chronischer Silikabehandlung zum Vorbeugen von Krankheit (siehe
beispielsweise Hutchings et al., 1990 [33] und hier zitierte Referenzen)
in das Krankheitsverfahren verwickelt.
-
Unter
Verwenden des NOD Stammes von Mäusen
haben Forscher ein akutes Krankheitsübertragungsmodell entwickelt,
welches mit dem spontanen Krankheitsmodell insofern parallel verläuft, als
daß übertragene
Zellen, die von Diabetes verursachenden NOD Mäusen abstammen, das Krankheitsverfahren
vermitteln, welches gekennzeichnet ist durch immunreaktive Zellen,
die Insulitis und Insel-beta-zellspezifische Zerstörung vermitteln.
Darüberhinaus
ist bei diesem Modell gezeigt worden, daß bestimmte monoklonale Antikörper gegen
T Zellen (siehe beispielsweise Miller et al., 1988 [5]) und Makrophagen
(siehe beispielsweise Hutchings et al., 1990 [33]) Krankheitsanfall
aufheben. Derartige monoklonale Antikörper sind bei der Behandlung von
spontaner Krankheit und angenommener Übertragungskrankheit verwendet
worden, wobei beispielsweise gezeigt worden ist, daß Anti-CD4
Antikörper
Krankheit in beiden Modellen aufhebt (Miller et al., 1988 (5] und Shizuru
et al., 1988 (30]). Behandlungsergebnisse mit einem Mittel bei dem
angenommenen Übertragungsmodell
oder spontanen Krankheitsmodell zeigen die Fähigkeit des Mittels an, das
Humankrankheitsverfahren anzupassen.
-
BEISPIEL 1
-
WIRKUNG DER ANTI-VLA4
ANTIKÖRPERBEHANDLUNG
AUF ANGENOMMENEN TRANSFER VON DIABETES
-
Für den angenommenen
Transfer von Diabetesexperimenten wurden NOD Mäuse von Taconic Farms (Germantown,
NY) oder von Joslin Diabetes Center (Boston, MA) erhalten. Spontane
diabetische (D) Weibchen mit kürzlichem
Anfall (13-20 Wochen an Alter) wurden als Milzzelldonatoren verwendet
und 8 Wochen alte nicht diabetische (Y) Weibchen dienten als Rezipienten.
-
Milzzellen
von vier Wochen alten nichtdiabetischen (Y) weiblichen Donatoren,
welche versagen, Krankheit zu übertragen,
wurden als eine negative Kontrolle verwendet.
-
Rezipientenmäuse wurden
auf angesäuertes
Wasser (1:8400 Verdünnung
von konzentrierter HCl in Wasser) eine Woche vor sublethaler Bestrahlung
(775 Rad) gebracht, welche in Anteilsdosierungen (300 Rad, 300 Rad
und 175 Rad) an jeweils drei Tagen (Tag -2, -1 und Tag des Transfers)
durchgeführt
wurden, um irgendwelches Auftreten von intestinaler Infektion folgend
Hochdosierungsbestrahlung (Gamma Zellen 1000 Cesium137 Quelle,
Nordion International, Inc., Ontario, Canada) zu minimieren. Milzen
wurden von diabetischen Donatoren geerntet oder aus nicht diabetischen
Kontrollen, hergestellten Zellsuspensionen und roten, mit Hämolytischer
Geys Lösung
lysierten Zellen. Milzzellen wurden intravenös (2 – 3 × 107 in
0,2 ml PBS) injiziert, mit sowohl 75 µg R1-2 monoklonalem Antikörper (mAb)
wie auch 75 µg
Ratten IgG2b vorbehandelt oder nicht behandelt. Für die Antikörperbehandlung
wurden die Zellen einfach bei 1 – 1,5 × 108 Zellen/ml
mit mAb bei 375 µg/ml suspendiert
und bis zur Injektion auf Eis gehalten. Der Zeitpunkt der Injektion
betrug 3 Stunden nach der letzten Bestrahlung. Einige Rezipienten
erhielten PBS allein. Das Anti-VLA4
mAb R1-2 und isotypen-markiertes Ratten IgG2b wurden von Pharmingen
(La Jolla, CA) gekauft. Das R1-2 (Ratten-Anti-Maus) Anti-VLA4 mAb
war ursprünglich
von Holzmann et al., 1989 [53] beschrieben. Das R1-2 Anti-VLA4 mAb
blockiert VLA4 Binden an seine Liganden
(Hession et al., 1992 [54]) und gehört deshalb per Definition zu
der B Gruppe (Pulido et al., 1991 [44], d.h. ist äquivalent
zu dem Anti-Human VLA4 mAbs der B Gruppe (beispielsweise HP1/2 oder
HP2/1).
-
Das
R1-2 mAb oder Ratten IgG2b wurde mit einer Dosierung von 75 µg/0,2 ml
intraperitoneal alle 2-3 Tage verabreicht, ein Dosierungsbereich,
welcher bestimmt wurde, das maximale Überziehen von VLA4 positiven
Zellen in dem peripheren Blut, Lymphoidorganen und Knochenmark,
wie nachgewiesen, durch Färben von
peripheren Blutzellen und Einzelzellsuspensionen, beizubehalten,
welche aus diesen Organen mit einem Fluorchrom markiertem mAb hergestellt
sind, das spezifisch für
die R1-2 mAb und FACS Analyse ist, um positiven Fluorchromzellen
zu messen (wie zuvor beschrieben). Injektionen wurden bis zum Tag
12 oder Tag 24 post Transfer beibehalten. Mäuse wurden in Bezug auf Diabetes überwacht,
indem Glykosurie mit Testape (Eli Lilly, Indianapolis, IN) und mittels
Plasmaglucosespiegeln (Glucometer, 3 Blutglucosemeter, Miles, Inc.,
Elkhart, IN) untersucht wurde, und wurden nach zwei aufeinanderfolgenden
positiven Urintests [Testapewerte von [+] oder höher] oder Plasmaglucosespiegeln > 250 mg/dl als diabetisch
angesehen.
-
Eine
Inhibitorwirkung des Anti-VLA4 mAb auf den Diabetesanfall wurde
gezeigt, als aus NOD diabetischen Donatoren isolierte Milzzellen
mit einer sättigenden
Menge von Anti-VLA4 mAb R1-2 behandelt wurden, gefolgt von Transfer
in nicht diabetisch bestrahlte Wirte, wie zuvor beschrieben, und
das R1-2 mAb wurde dann jeden anderen Tag 12 Tage lang verabreicht,
um maximales Überziehen
aller VLA4-positiven Zellen in dem peripheren Blut und Lymphoidorganen
zwei Wochen lang aufrechtzuerhalten. 1 zeigt
die Häufigkeit
von Rezipienten, die diabetisch wurden, und den Tag des Krankheitsanfalls
für den
Transfer von 2 × 107 Splenozyten aus diabetischem NOD Donator
(D→Y) (i)
ohne Behandlung (geschlossene Kreise), (ii) mit Ratten IgG2b Behandlung
(geschlossene Dreiecke) und (iii) mit R1-2 Anti-VLA4 Behandlung
(geschlossene Rhombusse) wie auch für den Transfer von Splenozyten
aus nichtdiabetischen NOD Donatoren (Y→Y) (offene Quadrate). Injektion
von PBS allein ergab 0% Vorkommen. Unter diesen Bedingungen wurden
nur 1 von 8 individuellen mit R1-2 mAb behandelten Rezipienten diabetisch,
mit einem Anfall am Tag 29 nach Transfer. Im Unterschied dazu wurden
6/10 und 5/9 Individuen nach Erhalten von Splenozyten aus diabetischen
Donatoren, welche mit keinem mAb oder mit nicht spezifischem Ratten
IgG2b behandelt waren, diabetisch. Wie in 1 dargestellt, trat
der Diabetesanfall so früh
wie am Tag 14 nach Transfer auf, obwohl Verabreichung des irrelevanten
Ratten IgG2b den Anfall etwas verzögerte.
-
Diese
Daten zeigen eine Schutzwirkung des R1-2 mAb, welches von seiner
Spezifität
für ein
B-Epitop der α4-Untereinheit
von VLA4 abhängig
war. Die Rezipienten von Splenozyten aus nicht diabetischen Mäusen oder
von PBS allein versagten, diabetisch zu werden. Somit reduzierte
die Behandlung mit dem gewünschten Anti-VLA4
Antikörper
die Häufigkeit
von Diabetes während
30 Tagen nach Transfer.
-
Obwohl
die in 1 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß klinische
Diabetes nur in 1 von 8 Anti-VLA4 behandelten Tieren auftrat, war
es möglich,
daß der
Anti-VLA4 Antikörper nur
eine geringe Verzögerung
bei dem Krankheitsanfall erzeugte. Plasmaglucosespiegel wurden parallel
mit Uringlucose überwacht,
um irgendeinen Anstieg an Blutzuckerspiegeln mengenmäßig zu bestimmen
und dadurch Fortschritt zu klinischer Krankheit nachzuweisen. Bei
der mit Anti-VLA4 Antikörper
behandelten Gruppe, die in 1 gezeigt
ist, waren alle Mäuse
noch normoglykämisch
am Tag 29 mit einem Durchschnittsplasmaglucosewert von 100 ± 7 mg/dl, n
= 7, mit Ausnahme des einzelnen Individuums, das sich als klinisch
diabetisch durch den Urintest und Plasmaglucose > 500 mg/dl erwies. Somit war der Krankheitsfortschritt
nicht in irgendeinem der anderen mit Anti-VLA4 Antikörper behandelten
Rezipienten offensichtlich, wie in 1 am Tag
29 nach Transfer gezeigt, volle zwei Wochen nach der letzten Anti-VLA4
Antikörperinjektion.
Analyse der Seren von diesen Mäusen bestätigte, daß das Anti-VLA4
mAb auf niedrige oder nicht nachweisbare Spiegel an Tagen 18 bis
21 post Transfer sank.
-
Zusätzliche
Zelltransfers wurden durchgeführt,
um zu bestätigen,
daß der
gewünschte
Anti-vLA4 mAb gegen Transfer von Diabetes schützte. Bei diesen Experimenten
wurde die Anti-VLA4 Antikörperbehandlung bis
zum Tag 25 nach Transfer ausgedehnt, aber alle 3,5 Tage verabreicht,
wodurch sättigende
Spiegel von R1-2 mAb oder Ratten IgG2b bis zum Tag 26 beibehalten
wurden, als die Mäuse
in Bezug auf Pankreasgewebe geopfert wurden. Unter diesen Bedingungen
wurde eine Inhibitorwirkung des Anti-VLA4 mAb, der sich dazu eignet,
an das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit zu binden,
auf den Diabetesanfall auch bei Milzzelltransfer und R1-2 Behandlung
gezeigt. 2 zeigt die Häufigkeit
von Rezipienten (n = 4 – 5
für jede
Gruppe), die diabetisch wurden/und den Tag des Krankheitsanfalls
für den
Transfer von 3 × 107 Splenozyten von diabetischen NOD Donatoren
(D→Y) (i)
ohne Behandlung (geschlossene Kreise), (ii) mit IgG2b Behandlung
(geschlossene Dreiecke) und mit R1-2 Anti-VLA4 Behandlung (geschlossene
Rhombusse) wie auch für
den Transfer von Splenozyten aus nichtdiabetischen NOD Donatoren
(Y→Y; offene
Quadrate). Das Einspritzen von PBS allein ergab 0% Vorkommen. 2 zeigt,
daß nur
1 von 5 R1-2 mAb behandelten Mäusen
diabetisch am Tag 22 post Transfer wurde, wohingegen Diabetes in
4/4 Rezipienten ohne R1-2 mAb und 5/5 mit Ratten IgG2b behandelte übertragen
wurde. Krankheitsanfall trat so früh wie am Tag 13 nach Transfer
auf. Diese Experimente zeigen individuell und kollektiv, daß Anti-VLA4
mAb, der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit
zu binden, reproduzierbar gegen Diabetesentwicklung in einem akuten
Krankheitsübertragungsmodell
schützt.
-
Weitere
Experimente wurden durchgeführt,
um zu bestimmen, ob der gewünschte
Anti-VLA-4 mAb einfach den Krankheitsanfall während der Behandlungsperiode
verzögerte,
oder ob es eine Langdauerschutzwirkung erzielen könnte. 3 zeigt
den Diabetesanfall in Mäusen über eine
Zeit nach R1-2 Injektion (einmal alle 3,5 Tage bis zum Tag 25),
wobei nur 2/5 Mäuse
an den Tagen 35 und 38 nach Transfer diabetisch wurden, 10-13 Tage
nach der letzten R1-2 Injektion. Im Unterschied dazu trat Diabetes
in den unbehandelten und IgG2b behandelten Gruppen so früh wie am
Tag 11 nach Transfer auf, mit 100 Vorkommen spätestens um die Tage 18-21. Überraschenderweise
erhöhte
sich das Krankheitsvorkommen in der R1-2 behandelten Gruppe selbst
so lange wie 2 Monate nach der letzten R1-2 Injektion nicht weiter.
Plasmaglucosewerte, die parallel während dieser Zeit angezeigt
wurden, zeigen, daß diese
drei Individuen beständig
normoglykämisch
waren. Nach diesem Punkt (d.h. annähernd 3 Monate nach Transfer)
beginnen selbst die negativen Kontrollgruppen, welche PBS allein
erhielten, oder nicht diabetische Zellen spontane Krankheit zu entwickeln.
Zusammengefaßt,
der VLA-4-spezifische
mAb, der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit
zu binden, reduziert das Vorkommen von Diabetestransfer. Darüberhinaus
wird seine Schutzwirkung gegen Krankheit in der Abwesenheit von
weiterer mAb Behandlung aufrechterhalten.
-
BEISPIEL 2
-
WIRKUNG DES ANTI-VLA4
mAb, DER SICH DAZU EIGNET, AN DAS B1- ODER B2-EPITOP DER α4-UNTEREINHEIT
ZU BINDEN, AUF PANKREASINSULITIS
-
Für die histologische
Analyse wurden Mäuse
zwischen 2-4 Wochen nach Transfer, wie in diesem Beispiel beschrieben,
geopfert, und Bauchspeicheldrüsen
in 10% Formalin gepufferter physiologischer Kochsalzlösung für Paraffin
eingelagerte Abschnitte geerntet, welche mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) für die Histologie
gefärbt
wurden. Der Insulitisgrad wurde folgendermaßen markiert: Grad 0: keine
Insulitis [Insel, der es an Entzündung
fehlte]; Grad I: Peri-Insulitis [entzündliche mononukleare Zellen
peripheral zu der Insel angeordnet]; Grad II: < 25% infiltriert [< 25% des Inselinneren enthält entzündliche
Lymphozytenzellen]; Grad III: 25-50% infiltriert [Lymphozyteninfiltration];
Grad IV: > 50% infiltriert.
Der Prozentsatz an Inseln in jedem Grad wurde dann relativ zu der
Gesamtzahl an untersuchten Inseln berechnet.
-
Histologische
Abschnitte wurden untersucht und in Bezug auf den Grad an Insulitis
markiert im Anschluß an
den angenommenen Transfer von NOD Splenozyten mit und ohne Anti-VLA4
mAb Behandlung, und die Ergebnisse tabelliert. In spezifischer Weise
wurde die Frequenz der nicht infiltrierten Inseln (Grad 0-1 Infiltrat)
und Inseln mit Grad II-IV Insulitis (wie zuvor beschrieben) quantitativ
bestimmt. Für
jede experimentelle Gruppe wurden pankreatische Abschnitte von n
= 4 – 5
Mäusen
markiert.
-
Das
Pankreasgewebe wurde von Rezipienten, die mit dem gewünschten
Anti-VLA-4 mAb verschiedene Zeitperioden lang behandelt waren, gewonnen,
um seine Wirkung auf die Begründung
der inselspezifischen zellulären
Infiltrate zu richten. Mäuse
wurden mit nicht spezifischem Ratten IgG2b oder R1-2 mAb alle 3,5
Tage bis zum Tage 14 behandelt, als sie geopfert wurden. In ähnlicher
Weise wurden die Mäuse
bis zum Tag 25 Tag behandelt und geopfert, nachdem Diabetes diagnostiziert
war, oder am 26. Tag nach Transfer. Mäuse, die kontinuierlich mit
dem R1-2 mAb 14 Tage nach Transfer behandelt waren, behalten eine
hohe Häufigkeit
(76%) von nicht infiltrierten Inseln mit nur 24% Fortschreiten bis
zu Grad II-IV Insulitis. Im Unterschied dazu zeigen jene, die mit
nicht spezifischem Ratten IgG2b behandelt waren, das wechselseitige
Muster mit 74% schwerer Insulitis. In ähnlicher Weise wurde bei den
Mäusen,
die mit R1-2 bis zum Tag 25 Tag behandelt waren (20% diabetisch,
aus Mäusen
isolierte Bauchspeicheldrüsen,
dargestellt in 2) eine hohe Häufigkeit
(58%) an nicht infiltrierten Inseln bewahrt, ähnlich zu derjenigen (55% nicht
infiltriert) bei nicht diabetischen Rezipienten von jungen NOD Splenozyten,
wie in 4 dargestellt. Im Unterschied dazu hatten sowohl
die unbehandelten wie auch die mit mit IgG2b behandelten Mäuse nur
28% nicht infiltrierte Inseln und hatten umgekehrt erhöhte (72%)
Insulitis. Somit scheint die Behandlung mit dem gewünschten
Anti-VLA-4 Antikörper
spezifisch oder alternativ die Entwicklung von Insulitis bei angenommenem
Transfer von Diabetes verursachenden Milzzellen zu verzögern.
-
Um
zwischen diesen Alternativen zu unterscheiden, wurde das Insulitismuster
nach vier Wochen post Transfer bestimmt, als die Mäuse mit
Ratten IgG2b oder R1-2 mAb 12 Tage lang behandelt waren und anschließend ohne
weitere Behandlung aufrechterhalten. Die Mäuse wurden bei Diabetesdiagnose
oder am 29. Tag post Transfer geopfert. Die Serenanalyse von diesen
Mäusen
bestätigte,
daß Zirkulieren
des Anti-VLA-4 mAb zu nicht nachweisbaren Spiegeln an Tagen 18-21
nach Transfer sank. Bei diesem Protokoll war der Insulitisgrad bei
der R1-2 behandelten Gruppe (69% Insulitis, 25% diabetisch) ähnlich zu
demjenigen bei nicht behandelten Rezipienten (73% Insulitis, 60%
diabetisch), obwohl noch niedriger als derjenige bei den mit Ratten
IgG2b behandelten Mäusen
(96% Insulitis, 75% diabetisch), wie in 5 dargestellt.
Bezeichnenderweise war die Schwere an Insulitis ähnlich zwischen den R1-2 behandelten, nicht
behandelten und mit Ratten IgG2b behandelten Gruppen bei einem Durchschnitt
von 57%, 47%, 64% Grad III/IV Infiltraten. Selbst wenn man nur die
nicht diabetischen R1-2 behandelten Individuen betrachtet, zeigten
sie noch 59% Insulitis bei 52% Grad III/IV Infiltraten. Rezipienten
von nicht Diabetes verursachenden NOD Splenozyten hatten nur 7%
Grad III/IV Infiltrate. Umgekehrt zeigt 5, daß die Häufigkeit
von nicht infiltrierten Inseln bei den R1-2 behandelten Mäusen im
Vergleich zu den Rezipienten von physiologischer Kochsalzlösung oder
nicht Diabetes verursachenden Milzzellen verringert war. Somit schritt
der Grad an Insulitis bei diesen R1-2 behandelten Mäusen (5)
im Vergleich zu Mäusen
voran, wo die R1-2 Behandlung aufrechterhalten war (4)
und näherte sich-demjenigen
bei den nicht behandelten und mit Ratten IgG2b behandelten Kontrollgruppen.
Zusammengenommen zeigen diese Daten, daß die Verabreichung von Anti-VLA-4
mAb, der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit
von VLA4 zu binden, das Fortschreiten von Insulitis in einem akuten
Krankheitsübertragungsmodell
verzögern
kann.
-
BEISPIEL 3
-
VERGLEICH VON UNTERSCHIEDLICHER
ANTI-VLA4 ANTIKÖRPERBEHANDLUNG
BEI ANGENOMMENEM DIABETESTRANSFER
-
Dieses
Beispiel liefert vergleichende Wirksamkeitsergebnisse von PS/2,
einem Anti-VLA-4 Antikörper, der
sich dazu eignet, an ein B-Epitop der α4-Untereinheit von
VLA4 zu binden, mit R1-2 unter Verwenden des angenommenen Transfermodells
und des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens. NOD Mäuse wurden
mit (a) einem irrelevanten Kontrollantikörper (D/Ratten IgG2b, n = 19
Mäuse),
(b) R1-2 Antikörper
(D/R1-2 mAb, n = 24 Mäuse),
(c) PS/2 mAb (D/PS/2 mAb, n = 5 Mäuse) oder (d) keine Behandlung
(keine, n = 26 Mäuse)
behandelt. Milzzellen wurden intravenös injiziert (2 – 3 × 107 in 0,2 ml PBS) und mit entweder 75 µg R1-2
mAb, 75 µg
PS/2 mAb, 75 µg
Ratten IgG2b vorbehandelt oder nicht behandelt. Die Isolierung und
Reinigung von PS/2 Anti-VLA4 mAb war ursprünglich von Miyake et al., 1991
[55] beschrieben.
-
Das
R1-2 mAb, PS/2 mAb oder Ratten IgG2b wurde in einer Dosis von 75 µg/0,2 ml
intraperitoneal alle 2-3 Tage verabreicht, ein Dosierungsbereich,
welcher festgelegt wurde, das maximale Überziehen von VLA4-positiven
Zellen in dem peripheren Blut, Lymphoidorganen und Knochenmark aufrechtzuerhalten,
wie nachgewiesen wurde durch Färben
von peripheren Blutzellen und einzelnen Zellsuspensionen, hergestellt
aus diesen Organen mit einem Fluorchrom markiertem mAb, welches
spezifisch für
die R1-2 und PS/2 mAb und FACS Analyse zum Messen von Fluorochrom
positiven Zellen (wie zuvor beschrieben) ist. Injektionen wurden 22
Tage bis 25 Tage post Transfer beibehalten. Die Mäuse wurden
in Bezug auf Diabetes durch Testen von Glykosurie mit TesTape (Eli
Lilly, Indianapolis, IN) und durch Plasmaglucosespiegel (Glucometer,
3 Blood Glucosemeter, Miles, Inc., Elkhart, IN) überwacht und nach zwei Wochen
aufeinanderfolgenden positiven Urintests [Testape werte von [+1]
oder höher]
oder Plasmaglucosespiegeln > 250
mg/dl als diabetisch angesehen.
-
Eine
Inhibitorwirkung des Anti-VLA4 mAb auf den Diabetesanfall wurde
gezeigt, als die aus NOD diabetischen Donatoren isolierten Milzzellen
mit einer sättigenden
Menge von Anti-VLA4 mAb R1-R2 oder PS/2 behandelt waren, gefolgt
von dem Transfer in nicht diabetische bestrahlte Wirte, wie zuvor
beschrieben, und das R1-2 mAb oder PS/2 mAb wurde dann jeden anderen
Tag 22 bis 25 Tage lang verabreicht, um maximales Überziehen
aller VLA4 positiven Zellen in dem peripheren Blut und Lymphoidorganen
etwa zwei Wochen lang aufrechtzuerhalten. Tabelle 1 zeigt die Häufigkeit
von Rezipienten, die diabetisch wurden, und den Tag des Krankheitsanfalls
für den
Transfer von Splenozyten aus diabetischem NOD Donor (i) ohne Behandlung
(D), (ii) mit Ratten IgG2b Behandlung (D/nicht spezifisches Ratten
IgG2b), (iii) mit R1-2 Anti-VLA4 Behandlung (D/R1-2 mAb), (iv) mit
PS/2 Behandlung (D/PS/2 mAb) wie auch für den Transfer von Splenozyten
aus nicht diabetischen NOD Donatoren (nicht-D). Nicht diabetische
Mäuse,
die PBS und keine Splenozyten (KEINE) erhielten, waren als eine
Kontrolle eingeschlossen. Die Injektion von PBS allein ergab 4%
Auftreten. Unter diesen Bedingungen wurde nur 1 von 24 individuellen
R1-2 mAb behandelten Rezipienten diabetisch, mit Anfall am Tag 22
post Transfer, wohingegen keiner der fünf individuellen PS/2 mAb behandelten
Rezipienten diabetisch wurde. Im Unterschied dazu wurden 16/19 Individuen
diabetisch nach Erhalten von Splenozyten aus diabetischen Donatoren,
die mit keinem mAb oder mit nicht spezifischem Ratten IgG2b behandelt
waren. Wie in Tabelle 1 dargestellt, trat Diabetesanfall so früh wie am
Tag 14 nach Transfer auf, obwohl Verabreichung des irrelevanten
Ratten IgG2b den Anfall um einen Tag etwas verzögerte.
-
Diese
Daten zeigen eine Schutzwirkung des R1-2 mAb und PS/2, welche von
ihrer Spezifität
in Bezug auf VLA4 abhängen.
Rezipienten von Splenozyten aus nicht diabetischen Mäusen oder
von PBS allein versagten darin, diabetisch zu werden. Somit reduzierte
die Behandlung mit Anti-VLA4 Antikörper, der sich dazu eignet,
an ein B-Epitop der α
4-Untereinheit
von VLA4 zu binden, die Häufigkeit
von Diabetes während
30 Tagen nach Transfer. Analyse von Seren aus diesen Mäusen bestätigte, daß Spiegel
von R1-2 und PS/2 Anti-VLA4 mAb nicht nachweisbar zwischen Tagen
26 und 34 nach Transfer werden. TABELLE
1 ANTI-VLA4
mAbs inhibieren angenommenen Transfer von Diabetes in NOD Mäusen
- * Milzzellen von vier Wochen alten nicht
diabetischen (NON-D) oder von neuen anfallsdiabetischen (D) NOD Weibchen
wurden übertragen,
wobei die D Zellen in mAb oder Ratten IgG suspendiert waren, oder
ohne mAB vor Transfer, und die Rezipienten zweimal wöchenlich
22-25 Tage behandelt waren. Die Mäuse wurden einen Monat lang
nach Transfer überwacht.
Die Daten sind aus fünf
Experimenten gesammelt.
- +D/R1-2 und D/PS/2 mAb behandelte Gruppen
unterscheiden sich beträchtlich
von D und D/Ratten IgG2b behandelten Gruppen durch Chi Quadrattest
mit Yates Korrektur wie folgt: R1-2 gegen IgG2b behandelte und D Gruppe,
p < 0,0001; PS/2
gegen IgG2b behandelte und D Gruppe, p < 0,003.
-
BEISPIEL 4
-
WIRKUNG VON ANTI-VLA4
ANTIKÖRPERBEHANDLUNG
AUF SPONTANES DIABETES MODELL
-
Dieses
Beispiel beschrieb Wirksamkeitsergebnisse unter Verwenden von R1-2
mAb bei dem spontanen Diabetesmodell, welches NOD Mäuse verwendet.
NOD Mäuse
wurden 8 Wochen lang mit (a) einem irrelevanten Kontrollantikörper (NOD/Ratten
IgG2b, n = 10 Mäuse),
(b) R1-2 Antikörper
(NOD/R1-2, n = 20 Mäuse),
behandelt, oder (c) keine Behandlung (NOD, n = 10 Mäuse), wobei
mit Woche vier bis Woche zwölf
an Alter begonnen wurde. mAb wurde mit einer Dosierung von 75 µg in 0,2
ml PBS iv zweimal wöchenlich
verabreicht. Die Mäuse
wurden in Bezug auf diabetische Ereignisse mittels TesTape in Bezug
auf Glykosurie, wie zuvor beschrieben, überwacht.
-
6 zeigt
eine markierte Verzögerung
bei Diabetesanfall (12-16 Wochen Verzögerung) im Anschluß an R1-2
Verabreichung im Vergleich zu den beiden Kontrollgruppen. Die NOD
Mäuse,
welche irrelevantes IgG2b mAb oder keine Behandlung erhielten, entwickelten
Diabetes so früh
wie 13 Wochen. Dieses spontane Krankheitsmodell ergibt parallel
die angenommenen Transferergebnisse mit R1-2 mAb, veranschaulicht
in 1, und zeigt direkt, daß der gewünschte Anti-VLA4 Antikörper gegen
Diabetesanfall schützt.
-
BEISPIEL 5
-
WIRKUNG EINES VCAM-Ig
FUSIONSPROTEINS AUF ANGENOMMENEN TRANSFER VON DIABETES
-
Das
in Beispiel 1 beschriebene angenommene Transferexperiment wurde
mit einem VCAM-Ig Fusionsprotein (VCAM 2D-IgG) anstelle eines ANTI-VLA4
mAb durchgeführt.
VCAM 2D-IgG ist eine lösliche
Form des Liganden für
VLA4 (VCAM1), welcher aus den zwei N-terminalen Domänen von
VCAM1, fusioniert an die Human IgG1 schwerkettigen konstanten Regionssequenzen
(Hinges, CH2 und CH3)
besteht. Die VCAM 2D-IgG DNA Sequenz und ihre übersetzte Aminosäuresequenz
sind in SEQ ID NR: 9 gezeigt. 8 veranschaulicht
die Fusionsproteinstruktur. Das Fusionsprotein wurde mithilfe rekombinanter
Techniken, wie im nachfolgenden beschrieben, konstruiert.
-
ISOLIERUNG VON cDNA AUS
HUMAN IgG1 SCHWERKETTIGER REGION UND KONSTRUKTION VON PLASMID pSAB144
-
Um
eine cDNA Kopie der Human IgG1 schwerkettigen Region zu isolieren,
wurde RNA aus COS 7 Zellen hergestellt, welche vorübergehend
mit dem Plasmid VCAM1-IgG1 (auch bekannt als pSAB133) transfektioniert
waren. Die Konstruktion des Plasmids VCRM1-IgG1 ist in der PCT Patentanmeldung
WO 90/13300 beschrieben. Die RNA wurde reverse transkribiert, wobei
cDNA unter Verwenden Reverser Transcriptase und zufälliger Hexamere
als Primer erzeugt wurde. Nach 30 Minuten bei 42°C wurde die Reverse Transkriptase Reaktion
durch 5 minütige
Inkubation der Reaktion bei 95°C
beendet. Die cDNA wurde dann mittels PCR (Polymerasekettenreaktion,
siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning, Band 3,
Seiten 14,1-14,35 (Gold Spring Harbor; 1989)) unter Verwenden der
folgenden Kinaseprimer amplifiziert: 370-31 (SEQ ID NR: 10):
5'TCGTC GAC AAA ACT
CAC ACA TGC C
Asp Lys Thr His Thr Cys
welcher eine SalI
Stelle enthält,
und
370-32 (SEQ ID NR: 11):
5' GTAAATGAGT GCGGCGGCCG CCAA,
welcher
das Carboxy terminale Lysin der IgG1 schwerkettigen konstanten Region
codiert, gefolgt von einer NotI Stelle.
-
Die
PCR amplifizierte cDNA wurde mittels Agarosegelelektrophorese und
Glaskugeleluntion zum Klonieren in Plasmid pNNO3 gereinigt.
Plasmid pNNO3 wurde konstruiert, indem die
synthetische Polylinkersequenz aus dem kommerziell erhältlichen
Plasmid pUC8 (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) mittels Restriktionsendonukleaseverdauung
entfernt wurde, und die synthetische Polylinkersequenz durch die
folgende neue synthetische Sequenz (SEQ ID NR: 12) ersetzt wurde:
GCGGCCGCGG
TCCAACCACC AATCTCAAAG CTTGGTACCC GGGAATTCAG ATCTGCAGCA TGCTCGAGCT
CTAGATATCG ATTCCATGGA TCCTCACATC CCAATCCGCG GCCGC.
-
Das
gereinigte PCR amplifizierte cDNA Fragment wurde an pNNO3 ligasiert, welches mit EcoRV gespalten,
entphosphoryliert und mittels Niedrigschmelzagarosegelelektrophorese
gereinigt worden war. Die Ligasierungsreaktion wurde verwendet,
E. coli JA221 zu transformieren, und die sich ergebenden Kolonien
wurden im Hinblick auf ein Plasmid gescreent, welches eine Insertion
von annähernd
700 bp enthielt. Die Identität der korrekten
Insertion wurde mittels DNA Sequenzanalyse bestätigt, und das Plasmid wurde
als pSAB144 bezeichnet.
-
KONSTRUKTION DES PLASMIDS
pSAB142
-
Das
Plasmid pSAB142 wurde folgendermaßen konstruiert. CDNA, hergestellt
aus mit pSAB133 transfektionierten COS Zellen (wie in dem vorhergehenden
Abschnitt beschrieben) wurde PCR Amplifizierung unter Verwenden
von Oligonukleotiden 370-01 und 370-29 ausgesetzt. Oligonukleotid
370-01 umfaßt
eine NotI Stelle und die Nukleotide, die den Aminosäuren 1 bis
7 der VCAM-1 Signalsequenz entsprechen (SEQ ID NR: 13):
5' GAGCTCGAGGCGGCCGCACCATGCCTGGGAAGATGGTCGTG
MetProGLyLysMetValVal
-
Oligonukleotid
370-29 entspricht den VCAM-1 Aminosäuren 214-219 und umfaßt eine
SalI Stelle (SEQ ID NR: 14):
5'AA GTC GAC TTG CAA TTC TTT TAC.
-
Das
amplifizierte DNA Fragment wurde an das Vektorfragment von pNNO3 ligasiert, mittels EcoRV gespalten.
-
KONSTRUKTION VON pSAB132
-
pJOD-S
(Barsoum, J., DNA und Cell Biol., 9, Seiten 293-300 (1990)) wurde
modifiziert, wobei eine einzige NotI Stelle stromabwärts von
dem späten
Hauptadenoviruspromotor eingesetzt wurde, so daß NotI Fragmente in den Expressionsvektor
eingefügt
werden konnten. pJOD-S wurde durch NotI Spaltung der Plasmid DNA
linearisiert. Die heraustretenden 5' Enden wurden unter Verwenden von Mung
Bean Nuclease mit glatten Enden versehen, und das linearisierte
DNA Fragment wurde mittels Niedrigschmelztemperaturagarosegelelektrophorese
gereinigt. Das DNA Fragment wurde unter Verwenden von T4 DNA Lipase
religasiert. Die ligasierten Moleküle wurden dann in E. coli JA221
transformiert. Die Kolonien wurden in Bezug auf das Fehlen einer
NotI Stelle gescreent. Der sich ergebende Vektor wurde als pJOD-S
delta NotI bezeichnet. pJOD-8 delta NotI wurde unter Verwenden von
SalI linearisiert, und die 5' Enden
wurden entphosphoryliert, wobei alkalische Kalbsphosphatase verwendet
wurde. Das linearisierte DNA Fragment wurde mit Niedrigschmelztemperaturgelelektrophorese
gereinigt und in der Anwesenheit von phosphoryliertem Oligonucleotid
ACE175 ligasiert, welches die folgende Sequenz hat (SEQ ID NR: 15):
TCGACGCGGC
CGCG
-
Die
Ligasierungsmischung wurde in E. coli JA221 transformiert, und die
Kolonien wurden in Bezug auf das Vorhandensein eines Plasmids mit
einer NotI Stelle gescreent. Das gewünschte Plasmid wurde mit pMDR901
bezeichnet.
-
Um
die beiden SV40 Verstärkerwiederholungen
in dem SV40 Promotor zu löschen,
welcher Transkription der DHFR cDNA kontrolliert, pMDR901 und pJODΔe-tPA
(Barsoum, DNA and Cell Biol., 9, Seiten 293-300 (1990)), wurden
beide mit-AatII und DraIII gespalten. Das 2578 bp AatII-DraIII Fragment
von pMDR901 und das 5424 bp AatII-DraIII Fragment von pJODΔe-tPA
wurden mittels Niedrigschmelztemperaturgelelelektrophorese isoliert
und zusammen ligasiert. Im Anschluß an die Transformation in
E. coli JA221 wurde das sich ergebende Plasmid, pMDR902, isoliert.
pSAB132 wurde dann gebildet, indem das EcoRI-NotI Fragment von pMDR902
eliminiert wurde, welches den späten
Adenovirushauptpromotor enthält,
und indem es mit einem 839 bp EcoRI-NotI Fragment aus Plasmid pCMV-B
(Clontech, Palo Alto, California), welches den unmittelbaren frühen Humancytomegalovirus
Promotor und Verstärker
enthält,
ersetzt wurde.
-
KONSTRUKTION VON pSAB146
-
pSAB144
wurde mit SalI und NotI gespalten, und das 693 bp Fragment isoliert.:
pSAB142 wurde mit NotI und SalI gespalten, und das 664 bp Fragment
wurde isoliert. Die beiden Fragmente wurden zu pSAB132 ligasiert,
welches mit NotI gespalten worden war, und die 5' Termini wurden durch alkalische Kalbsphosphatase
entphosphoryliert. Das sich ergebende Plasmid, pSAB146, enthielt
die DNA Sequenz, die die VCAM-1 Signalsequenz, die aminoterminalen
219 Aminosäuren
des reifen VCAM-1, 10 Aminosäuren
der Gerüstregion von
IgG1 und die CH2 und CH3
konstanten Domänen
von IgG1 codiert.
-
HERSTELLUNG VON VCAM 2D-IgG
AUS EINER STABIL TRANSFORMIERTEN CHO ZELLLINIE
-
Es
wurde ein rekombinanter 2D-IgG Expressionsvektor, wie im nachfolgenden
beschrieben, konstruiert und in CHO Zellen unter Herstellen einer
Zelllinie, welche kontinuierlich VCAM 2D-IgG ausscheidet, transfektioniert.
-
Das
1,357 kb NotI Fragment, welches die VCAM 2D-IgG codierende Sequenz
von pSAB146 enthält, wurde
mithilfe von Agarosegelelektrophorese gereinigt. Dieses Fragment
wurde in die NotI Klonierungsstelle des Expressionsvektors pMDR901
ligasiert, welcher den späten
Adenovirus-2-Hauptpromotor für
heterologe Genexpression und den selektierbaren amplifizierbaren
Dihydrofolatreduktase (dhfr) Marker verwendet. Die ligasierte DNA
wurde verwendet, E. coli DH5 zu transformieren. Kolonien, welche
das Plasmid mit der gewünschten,
korrekt orientierten Insertion enthielten, wurden durch das Vorhandensein
von 5853 und 3734 bp bei Verdauung mit HindIII identifiziert, und
4301, 2555, 2293 und 438 bp Fragmente bei Verdauung mit BgIII. Der
sich ergebende rekombinante VCAM 2D-IgG Expressionsvektor wurde
als pEAG100 bezeichnet. Die Identität der korrekten Insertion wurde
mittels DNA Sequenzanalyse bestätigt.
-
Das
rekombinante Expressionsplasmid pEAG100 wurde in CHO Zellen, denen
es an dhfr fehlte, gemäß dem veröffentlichten
Protokoll von J. Barsoum (DNA Cell Biol 9: 293-300, 1990) mit den
folgenden Änderungen
elektroporatisiert: 200 µg
von PvuI-linearisiertem
pEAG100 Plasmid und 200 µg
von beschallter Salmspermium DNA wurden bei dem Elektroporationsprotokoll
verwendet. Zusätzlich
wurden Zellen in mit 200 nM Methotrexat ergänztem alph-Vollmedium selektiert.
-
Um
die Expressionsspiegel von ausgeschiedenem VCAM 2D-IgG zu bestimmen,
wurden Klone auf eine flachen Mikrotiterbodenplatte mit 96 Vertiefungen übertragen,
bis zur Konfluenz gezüchtet
und mithilfe des im nachfolgenden beschriebenen ELISA untersucht.
-
Vertiefungen
von Immulon 2 Platten (Dynatech, Chantilly, Virginia) wurden jeweils
mit Anti-VCAM MAb 4B9 überzogen
(isoliert und auf Protein A Sepharose gereinigt, wie von Carlos
et al, 1990 [56] beschrieben), mit 100 µl von Anti-VCAM 4B9 MAb verdünnt zu 10 µg/ml in
0,05 M Natriumcarbonat/Bicarbonatpuffer, pH 9,6, überzogen,
mit Parafilm bedeckt und über
Nacht bei 4°C
inkubiert. Am nächsten
Tag wurde der Platteninhalt abgelassen und mit 200 µl/Vertiefung
eines Blockierungspuffers blockiert (5% fötales Kalbsserum in 1 × PBS), welcher
durch ein 2 µl
Filter filtriert worden war. Der Puffer wurde nach 1 Stunde Inkubation
bei Raumtemperatur entfernt, und die Platten wurden zweimal mit einer
Lösung
von 0,05 Tween-20 in 1 × PBS
gewaschen. Konditioniertes Medium wurde zu verschiedenen Verdünnungen
hinzugefügt.
Als eine positive Kontrolle war ein Anti-Maus Ig auch mit einbezogen.
Blockpuffer und LFA-3TIP bildeten negative Kontrollen. Die Proben
und Kontrollen wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.
-
Die
Platten wurden dann zweimal mit einer Lösung von 0,05% Tween-20 in
1 × PBS
gewaschen. Jede Vertiefung, mit Ausnahme der positiven Kontrollvertiefung,
wurde dann mit 50 µl
einer 1:2000 Verdünnung
von HRP-Donkey Anti-Human IgG (H + L) (Jackson Immune Research Laboratories,
Inc.; West Grove, Pennsylvania) in Blockierungspuffer befüllt. Die
positive Kontrollvertiefung wurde mit 50 µl einer 1:2000 Verdünnung von HRP-Ziegen-Anti-Maus IgG (H + L)(Jackson
Immune Research Laboratories, Inc.; West Grove, Pennsylvania) in
Blockierungspuffer befüllt.
Die Platten wurden dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.
-
Die
HRP konjugierten Ab Lösungen
wurden entfernt, und die Vertiefungen wurden zweimal mit 0,05% Tween-20
in 1 × PBS
gewaschen. Dann wurden 100 µl
HRP-Substratpuffer zu jeder Vertiefung bei Raumtemperatur hinzugegeben.
HRP-Substratpuffer wurde folgendermaßen hergestellt: 0,5 ml 42
mM 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), (ICN Immunobiologicals,
Lisle, South Carolina, Katalognr. 980501) in DMSO (Aldrich) wurde
langsam zu 50 ml von Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat/Zitronensäure, pH
4,9) hinzugegeben, gefolgt von Zugabe von 7,5 µl 30% Wasserstoffperoxid (Sigma,
Katalognr. H-1009).
-
Die
Entwicklung einer blauen Farbe in jeder Vertiefung wurde auf einem
Mikrotiterplattenleser bei 650 nm kontrolliert. Nach 7-10 Minuten
wurde die Entwicklung durch die Zugabe von 100 µl 2N Schwefelsäure beendet.
Die sich ergebende gelbe Farbe wurde bei 450 nm auf einem Mikrotiterplattenleser
abgelesen. Es wurde eine negative Kontrollvertiefung für die Bestimmung
des Blindwerts der Maschine verwendet.
-
REINIGUNG VON VCAM 2D-IgG
-
CHO
Zellen, die VCAM 2D-IgG exprimieren, wurden in Rollflaschen auf
Collagenkugeln gezüchtet. Konditioniertes
Medium (5 Liter) wurde zu 500 ml unter Verwenden eines Amicon S1Y10
Spiralultrafiltrationseinsatzes (Amicon, Danvers, MA) konzentriert.
Das Konzentrat wurde mit 11 Pierce Protein A Bindungspuffer (Pierce,
Rockford, IL) verdünnt
und auf eine 10 ml Protein A Säule
(Sepharose 4 Fast Flow, Pharmacia, Piscataway, NJ) schwerkraftbeschickt.
Die Säule
wurde 9mal mit 10 ml Protein A Bindungspuffer gewaschen und dann
7mal mit 10 ml PBS. VCAM 2D-IgG wurde mit 12 5 ml Stufen eluiert,
welche 25 mM H3PO4 pH
2,8, 100 mM NaCl enthielten. Die neutralisierten Proben wurden durch
Hinzugeben von 0,5 M Na2HPO4 pH
8,6 zu 25 mM neutralisiert. Die Fraktionen wurden in Bezug auf das
Absorptionsvermögen
bei 280 nm und mittels SDS-PAGE analysiert. Die drei Peakfraktionen
von höchster
Reinheit wurden zusammengegeben, filtriert, in Aliquote gebracht
und bei –70°C gelagert.
Durch SDS-PAGE war das Produkt mehr als 95% rein. Das Material enthielt
weniger als 1 Endotoxineinheit pro mg Protein. In einigen Fällen war
es notwendig, das Protein A Eluatprodukt auf Q-Sepharose FF (Pharmacia)
weiter zu reinigen. Das Protein A Eluat wurde mit 3 Volumenteilen 25
mM Tris HCl pH 8,0 verdünnt
und auf eine Q-Sepharose FF Säule
mit 10 mg VCAM 2D-IgG pro ml Harz geladen. Das VCAM 2D-IgG wurde
dann von der Q-Sepharose mit PBS eluiert.
-
BEWERTUNG VON VCAM 2D-IgG
-
Milzzellsuspensionen
wurden von diabetischen Donatoren oder aus nicht diabetischen Kontrollen,
wie zuvor beschrieben, hergestellt. Milzzellen wurden intravenös (2 – 3 × 107 in 0,2 ml PBS) injiziert und entweder mit
100 µg
VCAM 2D-IgG oder 100 µg
irrelevanter LFA-3Ig Fusionsproteinkontrolle vorbehandelt. Eine
weitere Gruppe erhielt PBS allein ohne übertragene Zellen. Das Fusiansprotein
LFA-3Ig (LFA-3TIP) wurde isoliert und wie in PCT US92/02050 und
Miller et al., 1993 [57] beschrieben, gereinigt. Das VCAM 2D-IgG
Fusionsprotein oder irrelevantes. LFA-3Ig Protein wurde in einer
Dosis von 100 µg/0,2
ml intraperitoneal zweimal wöchenlich bis
zum Tag 17 verabreicht. Diese Konzentration war ausreichend, einen
Serumspiegel von Fusionsprotein zu liefern, der ausreicht, VLA4-positive
Zellen zu sättigen,
wobei die Serenspiegel mithilfe des zuvor beschriebenen ELISA bestimmt
wurden. Diabetesanfall wurde, wie zuvor beschrieben, kontrolliert.
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Die
Ergebnisse der Bewertung sind in 7 dargestellt.
Wie in dieser Figur gezeigt, inhibiert das VCAM 2D-IgG Fusionsprotein
beträchtlich
den Diabetesanfall in Zellempfängern
von diabetischen Donormäusen
(D/VCAM-Ig, offene Kreise) bei 60% Vorkommen bis zum Tag 30 post-Transfer, verglichen
mit den Mäusen,
welche Zellen vom diabetischen Donor (Daten nicht gezeigt) und LFA-3Ig
irrelevantes Kontroll Ig Fusionsprotein (D/LFA-3 Ig) erhielten,
welches schon 60% Vorkommen bis zum Tag 15 post-Transfer erzielt
hatte. Mäuse,
welche keine Zellen (nur PBS) erhielten, entwickelten keine Krankheit.
Es gab nur n = 5 Mäuse
pro experimentelle Gruppe.
-
Zusammengefaßt, die
gewünschten
Anti-VLA4 Antikörper
schützten
gegen Diabeteskrankheitsanfall (Beispiele 1, 3 und 4) und waren
wirksam beim Verzögern
des Fortschreitens von Insulitis (Beispiel 2) bei Verwenden eines
Murinmodels für
Humandiabetes. Das gewünschte
lösliche
VCAM-Derivat (VCAM 2D-IgG) eignete sich auch beim Schützen gegen
Diabeteskrankheitsanfall (Beispiel 5). Die vorhergehenden Beispiele
dienen als eine Veranschaulichung der erfindungsgemäßen Verwendung
und sind nicht als eine Begrenzung der im nachfolgenden beanspruchten
Erfindung dargestellt. Aus der vorhergehenden Offenbarung sind zahlreiche Modifikationen
und zusätzliche
Ausführungsformen
der Erfindung den Fachleuten offensichtlich.
-
Beispielsweise
können
die verwendete aktuelle Dosierung, der verwendete Typ des Antikörpers oder Antikörperfragments,
die Verabreichungsform, genaue Zusammensetzung, Zeit und Verabreichungsart
der Behandlung und viele andere Merkmale variiert werden, ohne von
der zuvor angegebenen Beschreibung abzuweichen. Alle derartigen
Modifikationen und zusätzlichen
Ausführungsformen
liegen innerhalb der Absicht dieser Anmeldung und innerhalb des
Umfangs der angefügten
Ansprüche.
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LISTE DER
ZITIERTEN REFERENZEN
-
- [1] Castano and Eisenbarth, 1990, Annu. Rev. Immunology
8: 647-79, "Type
I Diabetes; A Chronic Autoimmune Disease of Human, Mouse, and Rat"
- [2] Fujita et al., 1982, Biomed. Res. 3: 429-436, "Lymphocytic Insulitis
in a Non-obese Diabetic (NOD) Strain of Mice: An Immunohistochemical
and Electron Microscope Investigation"
- [3] Foulis et al., 1986, Diabetologia 29: 267, "The histopathology
of the pancreas in Type I (insulin-dependent) diabetes mellitus:
a 25-year review of deaths in patients under 20 years of age in
the United Kingdom"
- [4] Eisenbarth, 1986, New Engl. J. Med. 314: 1360-1368, "Type I Diabetes Mellitus – A Chronic
Autoimmune Disease"
- [5] Miller et al., 1988, J. Immunol. 140: 52-58, "Both the Lyt-2+ and
L3T4+ T Cell subsets are required for the transfer of diabetes in
Nonobese diabetic mice"
- [6] Harada and Makino, 1986, Exp. Anim. 35: 501, "Suppression of overt
diabetes in NOD mice by Anti-thymocyte serum or anti-Thy 1.2 antibody"
- [7] Koike et al., 1987, Diabetes 36: 539, "Preventive effect of monoclonal anti-L3T4 antibody on
development of diabetes in NOD mice"
- [8] Makino et al., 1986, Exp. Anim. 35: 495, "Absence of insulitis
and overt diabetes in athymic nude mice with NOD genetic background"
- [9] Voorbij et al., 1989, Diabetes 35: 1623-1629, "Dendritic cells and scavenger macrophages
in pancreatic islets of prediabetic BB rats"
- [10] Nomikos et al., 1986, Diabetes 35: 11302-1304, "Combined treatment
with nicotinamide and desferrioxamine prevents islet allograft destruction
in NOD mice"
- [11] Larson and Springer, 1990, Immunol. Rev. 114: 181-217, "Structure and Function
of Leukocyte Integrins"
- [12] Hemler et al., 1990, Immunol. Rev. 114: 45-66, "Structure of the
Integrin VLA-4 and its Cell-Cell and Cell-matrix adhesion functions"
- [13] Lobb, R.R., 1992, Adhesion: Its Role in Inflammatory Diseases.
ed. J.M. Harlan and D.Y. Liu, New York: W. H. Freeman. 1-18.
- [14] Osborn, L., 1990, Cell 62: 3-6, "Leukocyte Adhesion to Endothelium in
Inflammation"
- [15] Wayner et al., 1989, J. Cell. Biol. 109: 1321-1330, "Identification and
Characterization of the T Lymphocyte Adhesion Receptor for an Alternative
Cell Attachment Domain (CS-1) in Plasma Fibronectin"
- [16] Shimizu et al., 1991, J. Cell Biol. 113: 1203, "Four molecular pathways
to T cell adhesion to endothelial cells: roles of LFA-1 VCAH-1 and
ELAM-1 and changes in pathway hierarchy under different activation
conditions"
- [17] Barton et al., 1989, J. Immunol. 143: 1278, "The effect of anti-intercellular
adhesion molecule-1 on phorbolesterinduced rabbit lung inflammation"
- [18] Issekutz, T.B. and Issekutz, A.C., 1991, Clinical Immunol.
and Inmunopathol. 138: 300-312, "T
lymphocyte migration to arthritis joints and dermal inflammation
in the rat: differing migration patterns and the involvement of
VLA-4"
- [19] Issekutz, T.G., 1991, J. Immunol 147: 4178-4184, "Inhibition of In
Vivo Lymphocyte Migration to Inflammation an Homing to Lymphoid
Tissues by the TA-2 Monoclonal Antibody – A Likely Role for VLA-4 In
Vivo"
- [20] Yednock, et al., 1992, Nature 356: 63-66, "Prevention
of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against α4β1 integrin"
- [21] Lobb, U.S. Patent Application Serial No. 07/821,768 filed
January 13, 1992, "Treatment
for Asthma"
- [22] Dustin et al., 1986, J. Immunol. 137: 245-254 "Induction by IL-1
and Interferon-γ Tissue
Distribution, Biochemistry, and Function of a Natural Adherence
Molecule (ICAM-1)"
- [23] Rice et al., 1990, 3. Exp. Med. 171: 1369, "Inducible Cell Adhesion
Molecule 110 (INCAM-110) Is An Endothelial Receptor for Lymphocytes – A CD11/CD18-Independent Adhesion
Mechanism"
- [24] Rice et al., 1991, Am. J. Path. 138: 385393, "Vascular and Nonvascular
Expression of INCAM-110"
- [25] Shimuzu et al., 1990, Immunol. Rev. 114: 109-144, "Roles of Adhesion
Molecules in T-cell recognition: Fundamental Similarities between
four integrins on resting human T cells (LFA-1, VLA-4, VLA-5, VLA-6)
in expression, binding and costimulation"
- [26] Burkly et al., 1991, Eur. J. Immunol. 21: 2871-2875, "Signaling by vascular
cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) through VLA4 promotes CD3-dependent
T cell proliferation"
- [27] Rudd et al., 1989, Immunol. Rev. 111: 225-266, "Molecular Interactions,
T-Cell Subsets, and a Role of the CD4/CD8:p561ct Complex
in Human T-Cell Activation"
- [28] Moingeon et al., 1989, Immunol. Rev. 111: 111-144, "The Structural Biology
of CD2"
- [29] Harding et al., 1992, Nature 356: 607-609, "CD28-mediated signalling costimulates
murine T cells and prevents induction of energy in T cell clones"
- [30] Shizuru et al., 1988, Science 240: 659-662, "Immunotherapy of the Nonobese Diabetic
Mouse: Treatment with an Antibody to T-Helper Lymphocytes"
- [31] Barlow and Like, 1992, Amer. J. Pathol. 141: 1043-1051, "Anti-CD2 Monoclonal
Antibodies Prevent Spontaneous and Adoptive Transfer of Diabetes
in the BB/Wor Rat"
- [32] Like et al., 1986, J. Exp. Med. 164: 1145-1159, "Prevention of Diabetes
in Biobreeding/Worchester Rats with Monoclonal Antibodies that Recognize
T Lymphocytes or Natural Killer Cells"
- [33] Hutchings et al., 1990, Nature 348: 639-642, "Transfer of diabetes in mice prevented
by blockade of adhesionpromoting receptor on macrophages"
- [34] Federlin and Becker, 1990, Klin. Wochenschr. 68: Suppl.
XXI 38-43, "Specific
Therapeutic Attempts in Experimental and Clinical Type-I Diabetes"
- [35] Zielasek et al., 1989, Clin. Immunol. Immunopathol. 52:
347-365, "The Potentially
Simple Mathematics of Type I Diabetes"
- [36] Eisenbarth, 1987, Hosp. Prac. 22: 167-183, "Type I Diabetes: Clinical Implication
of Autoimmunity"
- [37] Ziegler and Eisenbarth, 1990, Horm. Res. 33; 144-150, "Multiple Target Antigens
in Pre-Type I Diabetes: Implications for Prediction"
- [38] Ziegler et al., 1990, Diabetes Care 13: 762-765, "Predicting Type I
Diabetes"
- [39] Ziegler et al., 1990, J. Autoimmun. 3 Suppl. 1: 69-74, "Type I Diabetes: polygenic
inheritance, multiple autoantigens and 'dual' parameter
prediction"
- [40] Kohler, G. and Milstein, 1975, C. Nature 265: 295-497, "Continuous Cultures
of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity"
- [41] Sanchez-Madrid et al., 1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343-1349, "VLA-3: A novel polypeptide
association within the VLA molecular complex: cell distribution
and biochemical characterization"
- [42] Hemler et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 11478-11485, "Characterization
of the cell surface heterodimer VLA4 and related peptides"
- [43] Elices et al., 1990, Cell 60: 577-584, "VCAM-1 on Activated Endothelium Interacts
with the Leukocyte Integrin VLA4 at a Site Distinct from the VLA4/Fibronectin
Binding Site"
- [44] Pulido et al., 1991, J. Biol. Chem., 266(16): 10241-10245, "Functional Evidence
for Three Distinct and Independently Inhibitable Adhesion Activities
Mediated by the Human Integrin VLA-4"
- [45] Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147: 86-95, "Production of Antigenspecific
Human Monoclonal Antibodies from In Vitro-Primed Human Splenocytes"
- [46] Persson et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88; 2432-2436, "Generation of diverse
high-affinity human monoclonal antibodies by repertoire cloning"
- [47] Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141: 227-236, "Construction of representative
immunoglobulin variable region cDNA libraries from human peripheral
blood lymphocytes without in vitro stimulation"
- [48] Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525, "Replacing the complementarity determining
regions in a human antibody with those from a mouse"
- [49] Riechmann, 1988, Nature 332: 323-327, "Reshaping human antibodies for therapy"
- [50] Queen et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029, "A humanized antibody
that binds to the interleukin 2 receptor"
- [51] Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833 "Cloning immunoglobulin
variable domains for expression by the polymerase chain reaction"
- [52] International Patent Application No. WO 9416094, published
on July 21, 1994, "Recombinant
Anti-VLA-4 Antibody Molecules"
- [53] Holzmann et al., 1989, Cell 56: 37-46, "Identification of a Murine Peyer's Patch-Specific
Lymphocyte Homing Receptor as an Integrin Molecule with α Chain Homologous
to Human VLA-4α"
- [54] Hession et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 183:
163-169, "Cloning
of Murine and Rat Vascular Cell Adhesion Molecule-1"
- [55] Miyake et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 599-607.
- [56] Carlos et al., 1990, Blood 17: 965, "Vascular Cell Adhesion molecule-1 (VCAM-1)mediates
Lymphocyte Adherence to Cytokine-activated Cultured Human Endothelial
Cells."
- [57] Miller et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 211.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-