DE69407758T3

DE69407758T3 - Antikörper zur behandlung von insulinabhängigem diabetes

Info

Publication number: DE69407758T3
Application number: DE69407758T
Authority: DE
Inventors: Linda C. West Newton BURKLY
Original assignee: Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Biogen MA Inc
Priority date: 1993-02-09
Filing date: 1994-02-09
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2014-02-10
Also published as: ES2114183T3; CA2155303A1; ATE161730T1; CA2155303C; HK1008731A1; JP3593343B2; AU687790B2; DE69407758T2; DE69407758D1; JPH08508719A; GR3026531T3; WO1994017828A3; US20050208053A1; EP0682529B2; EP0682529B1; AU6237994A; DK0682529T3; EP0682529A1; WO1994017828A2; DK0682529T4

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Behandlung von insulinabhängigem (Typ-I) Diabetes. Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf die Verwendung von Antikörpern, die das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von Integrin VLA4 (sehr spätes Antigen 4) erkennen, bei der Verhütung von Diabetes, gemäß der Ansprüche.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Insulinabhängiger Diabetes (auch als Typ-I Diabetes und früher insulinabhängiger Diabetes (mellitus) bezeichnet) ist während der vergangenen zwei Dekaden als eine chronische Autoimmunkrankheit klassifiziert worden. Bei dieser Krankheit werden Insulin produzierende Zellen (beta Zellen) innerhalb der Pankreasinseln selektiv aufgefangen und durch ein zelluläres Infiltrat des Pankreas zerstört. Dieses die Inseln beeinträchtigende entzündliche Infiltrat ist als Insulitis bezeichnet worden. Zellen, die Insulin produzieren, umfassen die Mehrheit von Inselzellen aber weniger als 2% der gesamten Pankreasmasse (Castano und Eisenbarth, 1990, [1], Fujita et al., 1982 [2], Foulis et al., 1986 [3]). Die Entwicklung von Typ I Diabetes kann konzeptionell in sechs Stufen geteilt werden, beginnend mit kinetischer Suszeptibilität und endend mit vollständiger beta Zellzerstörung (Eisenbarth, 1986 [4]). Stufe I ist genetische Suszeptibilität, welche eine notwendige aber unzureichende Bedingung für die Entwicklung der Krankheit ist. Ein hypothetisches Triggerereignis (Stufe II) führt zu aktiver Autoimmunität gegen beta Zellen (Stufe III). Es wird die Hypothese aufgestellt, daß bei der Stufe III die beta-Zellmasse abnimmt, und es werden immunologische Abnormalitäten wie beispielsweise gegen Insulin gerichtete Autoantikörper und zytoplasmatische Inselantigene gefunden. Stimulierte Insulinausscheidung wird bei dieser Stufe noch bewahrt.
Über eine Periode von Jahren führt jedoch der fortschreitende Verlust von beta Zellen zu verminderter Insulinausscheidung bei intravenösen Glucosetoleranztests (IVGTT), während das Individuum noch normoglykämisch (Stufe IV) ist. Offensichtliche Diabetes (d.h. Diabetesanfall oder klinische Manifestierung der Krankheit) gekennzeichnet durch Hyperglykämie) ist Stufe V und kann sich Jahre später entwickeln, wenn annähernd 90% der Pankreas-beta-Zellen zerstört sind. Wenn in Stufe V offensichtliche Diabetes zuerst erkannt wird, bleibt etwas restliche Insulinproduktion zurück (wie dargestellt durch das Vorhandensein des verbindenden Peptids von Proinsulin, C Peptid, in dem Serum), aber das Individuum hat üblicherweise exogenes Insulin zum Leben nötig. Letztendlich werden in Stufe VI selbst die verbleibenden beta Zellen zerstört, und C Peptid kann nicht länger in der Zirkulation nachgewiesen werden.
Während der Initiierungsfaktor (en) und spezifische Sequenz von Ereignissen, die zu Diabetes führen, einschließlich der relativen Bedeutung von unterschiedlichen Zelltypen und Cytokinen noch umfassend erörtert werden, wird eine Schlüsselrolle für die reaktiven Selbst-Antigen-T-Zellen im allgemeinen anerkannt (Miller et al., 1988 [5]; Harada und Makino, 1986 [6]; Koike et al., 1987 [7]; Makino et al. 1986 [8]). Neben T- Lymphozyten ist Insulitis gekennzeichnet durch Makrophagen, dendritische Zellen (Voorbij et al., 1989 [9]) und B Zellen, welche als professionelle Antigen präsentierende Zellen (APC) dienen können. Makrophagen können auch Insel-beta-Zellen selbst durch Freigabe von Cytokinen oder freien Radikalen zerstören (Nomikos et al., 1986 [10]). Somit beruht Autoimmundiabetes sowohl auf zellulärer Migration wie auch Immunstimulation von neuen Residentzellen.
Zelltreiben (cell trafficking) zu entzündlichen Stellen wird reguliert durch hinzukommende Moleküle LFA-1, MAC-1 und VLA4 (Larson und Springer, 1990 [11]; Hemler et al., 1990 [12]) auf der Oberfläche von Lymphozyten (LFA-1, VLA4) und Makrophagen (MAC-1, VLA4) und durch ihre Gegenliganden ICAM (für LFA-1 und MAC-1) und VCAM (für VLA4), welche nicht durch Cytokine auf vaskuärem Endothelium reguliert sind (Larson und Springer, 1990 (11]; Lobb, 1992 [13]; Osborn, 1990 [14]). Darüberhinaus bindet VLA4 an eine extrazelluläre Matrixkomponente, die CS-1 Domäne von Fibronektin (FN) (Wayner et al., 1989 [15]). Die relative Bedeutung dieser Wege für beispielsweise LFA-1 und VLA4 auf Lymphozyten oder MAC-1 und VLA4 auf Monzyten beim Kontrollieren von Zellmigration ist noch ein Thema der Untersuchung. In vitro Daten schlagen vor, daß die differentielle Verwendung dieser Wege sowohl von dem Aktivierungsstatus der Leukozyten wie auch der Endothelialzellen abhängt (Shimizu et al., 1991 [16]). Ihre Fähigkeit, Zellmigration zu entzündlichen Stellen in vivo zu kontrollieren, ist direkt mit monoklonalen Antikörpern (mAbs) zu ICAM, MAC-1 oder VLA4 gezeigt worden, die verschiedene Modelle von Tierkrankheiten inhibieren (Barton et al., 1989 [17], Phorbol-Ester induzierte Kaninchenlungenentzündung; Issekutz und Issekutz, 1991 [18], Hypersensitivität vom verzögerten Typ; Issekutz, 1991 (19], mit Hilfsmittel induzierte Arthritis; Yednock et al., 1992 (20], Transfer von experimenteller allergischer Enzephalomyelitis (EAE); Lobb, 1992 [21], Asthma).
ICAM und VCAM werden auch auf der Oberfläche von Makrophagen und dendritischen Zellen in lymphatischen Geweben gefunden (Dustin et al., 1986 [22]; Rice et al., 1990 [23]; Rice et al., 1991 [24]). Ihre Verteilung auf diesen professionellen APC stimmt mit funktionellen Daten überein, die eine Rolle für LFA-1 und VLA4 bei der T Zellen-Aktivierung anzeigen (Shimuzu et al., 1990 [25], Burkley et al., 1991 [26]). Es können jedoch zahlreiche andere Rezeptor-Ligandenpaare einschließlich CD4/MHC Klasse II und CD8/MHC Klasse I (Rudd et al, 1989 [27], CD2/LFA-3 (Moingeon et al., 1989 [28 ], CD28/B7 (Harding et al., 1992 [29]) auch Adhäsion unterstützen oder T Zellen während T/APC oder T/Zielzellenwechselwirkungen costimulieren. Die spezifischen Beiträge dieser zahlreichen Wege in der Entwicklung von Diabetes ist ungelöst. Es ist über eine erhöhte Adhäsion von Monozyten von Insulin abhängigen Diabetes mellitus Patienten an endotheliale Zellen in Kultur (Nouv. Rev. Fr. Hematol. (1992)34[Suppl]:555-559) neben erhöhter Expression von CD11b/Cd18 Molekülen an der Oberfläche von Diabetesmonozyten berichtet worden. Weil es mehrfache Molekülwege für Zelladhäsion und T Zellenaktivierung gibt, ist es nicht möglich vorherzusagen, ob die Erfindung den Anfall von Schwere von Diabeteskrankheit auf einem oder mehreren dieser Wege beeinträchtigen würde, und insbesondere, welcher dieser Wege entscheidend oder relevant gegenüber dem Krankheitsverfahren sein würde.
Gegen T Zellen gerichtete Antikörper sind in Murin und Rattenmodellen für spontane Diabetes und angenommenen Transfer von Diabetes verwendet worden, wodurch T Zellen entleert und somit Krankheit verhindert wird (siehe beispielsweise Harada und Makino, 1986 [6], Anti-Thy 1, 2; Koike et al., 1987 [7], Miller et al., 1988 [5] und Shizuru et al., 1988 [30], Anti-CD4; Barlow und Like, 1992 [31], Anti-CD2; Like et al., 1986 [32], Anti-CD5 und Anti-CD8). Darüberhinaus ist ein Antikörper gerichtet auf das komplementäre Rezeptor Typ 3 (CR3) Molekül oder MAC-1 auf Makrophagen verwendet worden, um Makrophagen- und T Zelleninfiltration von Pankreasgewebe in einem angenommenen Murintransfermodell von Krankheiten zu verhindern (Hutchings et al., 1990 [33]). Es ist unbekannt, ob V1A4 relevant gegenüber Insulitis oder der Aktivität von inselspezifischen Zellen nach Lokalisierung in dem Pankreas ist.
Für Typ I Diabetes vorgeschlagene gegenwärtige Behandlungsprotokolle haben bestimmte Immunmodulatorarzneimittel mit einbezogen, die von Federlin und Becker [34] und den hier zitierten Referenzen zusammengefaßt sind. Eine lange Prädiabetesperiode mit immunologischen Abnormalitäten und fortschreitender beta-Zellzerstörung schlägt vor, daß es möglich ist, beta-Zellverlust bei Immunmaßnahme anzuhalten (Castano und Eisenbarth, 1990 [1].
Vorgeschlagene Mittel/Protokolle haben bestimmte Immunmodulator- und immunsuppressive Mittel mit einbezogen: Levamisol, Theophyllin, Thymushormone, Ciamexon, Anti-Thymozytenglobulin, Interferon, Nicotinamid, Gammaglobulininfusion, Plasmapherese oder Transfusion weißer Zellen. Mittel wie Cyclosporin A und Azathioprin, welche T-Zellenaktivierung bzw. T-Zellentwicklung beeinträchtigen, sind bei klinischen Versuchen verwendet worden (Zielasek et al., 1989 [35]). Die vielversprechendsten Ergebnisse sind mit Cyclosporin A (Castano und Eisenbarth, 1990 [1]) erzielt worden. Federlin und Becker, 1990 [34] schlagen jedoch vor, daß Cyclosporin A nicht für allgemeine oder Langzeitverwendung wegen toxischer Nebenwirkungen, zumindest wenn in höheren Dosierungen verabreicht, empfohlen werden soll. Höhere Dosierungen von Cyclosporin oder in Kombination mit anderen immunsupressiven Arzneimitteln oder beides sind mit der Entwicklung von Lymphom und irreversiblem Nierenschaden verbunden (Eisenbarth, 1986 [4]; Eisenbarth, 1987 [36]). Zusätzliche Untersuchungen mit anderen vorgeschlagenen Mitteln sind notwendig, um Sicherheit und Wirksamkeit zu gewährleisten. Selbst die Cyclosporin A Untersuchungen zeigen, daß seine Wirksamkeit beim Aufrechterhalten von Remission der Diabetes ein Jahr bei etwa 30-60% der neuen Anfalldiabetes beträgt. Innerhalb von drei Jahren jedoch sind Remissionen beinahe unveränderlich verlorengegangen (Castano und Eisenbarth, 1990 [1]). Behandlungsprotokolle nach Krankheitsanfall sind besonders problematisch, weil beispielsweise zu der Zeit, wo Diabetes beim Menschen diagnostiziert wird, Insulitis üblicherweise schon bis zu einem Verlust von mehr als 80% der beta Zellen fortgeschritten ist. Somit ist es möglich, daß Cyclosporin A weitere beta Zellzerstörung verhindern kann, aber so wenige beta Zellen können bei dem Diabetesanfall vorhanden sein, daß sie nicht einen nicht diabetischen Zustand über die Zeit beibehalten können (Castano und Eisenbarth, 1990 [1]). Unterdrückung von Insulitis und/oder Verhütung von Krankheit kann günstiger sein, wenn die Behandlung bei einer früheren Phase beginnen könnte, d.h. vor Krankheitsanfall.
Es gibt zwei vorbeugende Hauptmaßnahmen, um irgendeine vorbeugende Behandlung für Diabeteskrankheit zu entwickeln: (1) die Fähigkeit, genau das vordiabetische Individuum zu identifizieren, und (2) die Entwicklung von sicheren, spezifischen und wirksamen vorbeugenden Behandlungen. Ein beträchtlicher Fortschritt ist beim Identifizieren von Prädiabetesindividuen gemacht worden, es bleibt jedoch viel Arbeit bei der Entwicklung von sicheren, spezifischen und wirksamen vorbeugenden Behandlungen, wie von Eisenbarth und Kollegen diskutiert und zusammengefaßt, zurück (siehe beispielsweise Ziegler und Eisenbarth, 1990 [37]; Ziegler et al., 1990 [38]; Ziegler et al., 1990 [39]). Es ist möglich gewesen, bestimmte Risikofaktoren und Risikogruppen für Typ I Diabetes zu identifizieren und somit Individuen höchst wahrscheinlich vorherzusagen, wie die klinische Krankheit verläuft und die annähernde Geschwindigkeit des Krankheitsanfalls bei diesen Individuen abzuschätzen. Die Fähigkeit, Individuen mit Empfänglichkeit für Diabetes zu identifizieren oder Typ I Diabetes in der vorklinischen Stufe durch die Kombination von genetischen (HLA Typing), immunologischen (Insel- und Insulinantikörper) und metabolischen (erste Phase Insulinausscheidung zu intravenöser Glucose, die der Entwicklung von Hyperglykämie vorangeht) Markern vorherzusagen, macht die Identifizierung und Verwendung von prophylaktischen immuntherapeutischen Arzneimitteln und Protokollen während der Evolution des Autoimmunkrankheitsverfahrens möglich, wenn beta Zellzerstörung nur teilweise ist. Bis heute gibt es jedoch wenig Erfolg beim Behandeln menschlicher Diabetes. Im allgemeinen weil die Behandlung des Menschen nur nach Krankheitsanfall angewendet worden ist, wobei sich der Behandlung eine zeitweilige vollständige oder teilweise Remission nur bei einer bestimmten Anzahl von Patienten anschloß. Weil immunsuppressive Mechanismen Insulitis und/oder Diabetes verhindern können, besteht ein Verlangen nach immunsuppressiven Komponenten für die Verwendung in der vordiabetischen Stufe. Insbesondere besteht ein Verlangen nach sichereren und mehr spezifisch wirkenden Verbindungen, beispielsweise monoklonalen Antikörpern, welche das Eintreten von Effektorzellen in den Pankreas oder die Funktion jener Zellen inhibieren, welche schon in die Langerhansinseln eingetreten sein können.
PCT/WO 93/08823, veröffentlicht am 13. Mai 1993 (zitiert unter Artikel 54(3)EPC) beschreibt Guanidinyl und verwandte Zelladhäsionsmodulationsverbindungen, welche gegen Rezeptoren gerichtet sind, die Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) erkennen. Typ I Diabetes wird unter den vielen Krankheiten und Bedingungen genannt, an die sich derartige Zelladhäsionsmodulationsverbindungen richten.
Die am 21 Juli 1994 veröffentlichte PCT/WO 94/16094 (zitiert unter Artikel 54(3)EPC) beschreibt rekombinante Anti-VLA4 Antikörpermoleküle, die geeignet bei der Behandlung von spezifischer und nicht spezifischer Entzündung, einschließlich Asthma und entzündlicher Darmerkrankung sind.
Es ist jetzt überraschenderweise festgestellt worden, daß das Verabreichen eines Anti-VLA4 Antikörpers, der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop von VLA-4 zu binden, signifikant das Auftreten von Diabetes in einem Nagetiermodell von Diabetes Krankheit reduzierte. Das NOD Maus Modell von Diabetes ist ein gut begründetes Modell, das direkt vergleichbar mit Typ I Human-Diabetes ist. Unter Verwenden eines Experimentprotokolls einer angenommenen übertragenen Krankheit wurden bestrahlten nicht diabetischen NOD Mäusen Splenozyten von spontan diabetischen NOD Mäusen für die akute Übertragung der Krankheit verabreicht. Diese Splenozyten wurden mit Anti-VLA4 Antikörper, der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop von VLA-4 zu binden, vor Verabreichung behandelt, und die Rezipienten wurden auch verschiedene Zeitperioden nach dem Transfer mit einem solchen Anti-VLA4 Antikörper behandelt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß liefert die vorliegende Erfindung neue Verwendungen für die Herstellung von Medikamenten für die Verwendung bei der Verhütung von insulinabhängigen (Typ-I) Diabetes bei Vordiabetesindividuen, gemäß der Ansprüche.
Somit liefert die vorliegende Erfindung eine Verwendung eines Anti-VLA4 Antikörpers, der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA-4 zu binden, für die Herstellung eines Medikaments für die Verwendung als das einzige Medikament bei der Verhütung von insulinabhängiger (Typ I) Diabetes bei einem Vordiabetesindividuum.
Insbesondere ist der Antikörper ausgewählt aus Antikörper HP1/2 oder einem humanisierten Anti-VLA4 Antikörper, der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 zu binden, abstammend von HP1/2. Auch wird die Verwendung analoger Antikörper oder Antikörperfragmente, die die Wirkung der gewünschten Anti-VLA4 Antikörper bei der Behandlung von Diabetes nachahmen, in Betracht gezogen.
Darüberhinaus liefert die vorliegende Erfindung eine Verwendung eines Antikörpers, eines rekombinanten Antikörpers, eines chimären Antikörpers oder Fragmenten derartiger Antikörper, die sich dazu eignen, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 zu binden, oder Kombinationen von irgendwelchen der Vorhergehenden für die Herstellung eines Medikaments für die Verwendung bei der Behandlung von Diabetes, gemäß der Ansprüche. Auch wird ein VCAM 2D-IgG Fusionsprotein, das sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA-4 zu binden, in Betracht gezogen.
Dieses Mittel wirkt, indem es mit dem Zelloberflächenbindungsprotein in Bezug auf VLA4 in Konkurrenz tritt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung des Anti-VLA4 Antikörpers (R1-2) beschreibt und die Verhütung von Diabetes nach angenommenem Transfer von Milzzellen kontrolliert; die Häufigkeit von Rezipienten, welche diabetisch wurden, und der Tag des Krankheitsanfalls sind für den Transfer von 2 × 10⁷ Splenozyten von diabetischen (D) NOD Donatoren ohne Behandlung (geschlossene Kreise), bei einer nicht spezifischen Ratten IgG2b Behandlung (geschlossene Dreiecke) und bei R1-2 Anti-VLA4 Behandlung (geschlossene Rhombusse) wie auch für den Transfer von Splenozyten aus nicht diabetischen (Y) NOD Donatoren (offene Quadrate) gezeigt; die Splenozyten wurden mit R1-2 oder Ratten IgG2b oder ohne mAb übertragen, und anschließend wurde R1-2 oder Ratten IgG2b jeden anderen Tag bis (through) Tag 12 post Transfer injiziert (n = 8 – 10 für alle Gruppen).
2 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung des Anti-VLA4 Antikörpers (R1-2) beschreibt und die Verhütung von Diabetes nach angenommenen Transfer von Milzzellen kontrolliert; die Häufigkeit von Rezipienten, welche diabetisch wurden und der Tag des Krankheitsanfalls sind für den Transfer von 3 × 10⁷ Splenozyten aus diabetischen (D) NOD Donatoren ohne Behandlung (geschlossene Kreise), mit einer nicht spezifischen Ratten IgG2b Behandlung (geschlossene Dreiecke) und mit R1-2 Anti-VLA4 Behandlung (geschlossene Rhombusse) wie auch für den Transfer von Splenozyten aus nicht diabetischen (Y) NOD Donatoren (offene Quadrate) dargestellt; die Splenozyten wurden mit R1-2 oder Ratten IgG2b oder ohne mAb übertragen, und dann wurde R1-2 oder Ratten IgG2b alle 3,5 Tage bis Tag 25 post Transfer (n = 4 – 5 für alle Gruppen) injiziert.
3 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung des Anti-VLA4 Antikörpers (R1-2) beschreibt und die Verhütung von Diabetes nach angenommenem Transfer von Milzzellen kontrolliert; die Häufigkeit von Rezipienten, welche diabetisch wurden, und der Tag des Krankheitsanfalls sind für den Transfer von 2 – 3 × 10⁷ Splenozyten aus diabetischen (D) NOD Donatoren ohne Behandlung (geschlossene Kreise), mit einer nicht spezifischen Ratten IgG2b Behandlung (geschlossene Dreiecke) und mit R1-2 Anti-VLA4 Behandlung (geschlossene Rhombusse) wie auch für den Transfer von Splenozyten aus nicht diabetischen (Y) NOD Donatoren (offene Quadrate) oder für PBS allein (offene Kreise) gezeigt; die Splenozyten wurden mit R1-2 oder Ratten IgG2b oder ohne mAb übertragen, und dann wurde R1-2 oder Ratten IgG2b alle 3, 5 Tage bis zum Tag 25 post Transfer (n = 5 für alle Gruppen) injiziert.
4 ist eine graphische Barrendarstellung, die die Wirkung des Anti-VLA4 Antikörpers (R1-2) zeigt und den Grad der Insulitis nach angenommenem Transfer von Milzzellen kontrolliert; die Häufigkeit der nicht infiltrierten Insel: (Grad 0-1 Infiltrat, gepunkteter Barren) und infiltrierten Inseln (Grad II-IV Insulitis, fester Barren) wurde quantitativ bestimmt und ist gezeigt nach dem Transfer von Zellen, die mit R1-2, Ratten IgG2b oder ohne mAb behandelt waren und dann mit R1-2 oder Ratten IgG2b alle 3,5 Tage bis zum Tag 25 gespritzt waren, wobei die Mäuse geopfert wurden, als sie diabetisch waren oder am Tag 26 post Transfer. Pankreasabschnitte von n = 4 – 5 Mäusen wurden für jede experimentelle Gruppe markiert, d.h. Y→Y (nicht diabetische Donorzellen) oder D→Y (diabetische Donorzellen) in nicht diabetische (Y) Rezipienten mit keiner mAb Behandlung, Behandlung mit Ratten IgG2b oder Behandlung mit R1-2.
5 ist graphische Darstellung in Barrenform, die die Wirkung des Anti-VLA4 Antikörpers (R1-2) beschreibt und den Grad der Insulitis nach angenommenem Transfer der Milzzellen kontrolliert; die Häufigkeit der nicht infiltrierten Inseln (Grad 0-I Infiltrat, gepunkteter Barren) und infiltrierten Inseln (Grad II-IV Insulitis, fester Barren) wurde quantitativ bestimmt und gezeigt nach Transfer von Zellen, die mit R1-2, Ratten IgG2b oder ohne mAb behandelt waren und dann mit R1-2 oder Ratten IgG2b jeden anderen Tag bis zum Tag 12 post Transfer gespritzt waren und dann ohne weitere mAb Injektion gehalten waren, bis sie geopfert wurden, als sie diabetisch waren oder am Tag 29 post Transfer.
Pankreasabschnitte von n = 4 – 5 Mäusen wurden für jede experimentelle Gruppe markiert, d.h. Y→Y (nicht diabetische Donorzellen) oder D→Y (diabetische Donorzellen) in nicht diabetische (Y) Rezipienten ohne mAb Behandlung, Behandlung mit Ratten IgG2b oder Behandlung mit R1-2.
6 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung des Anti-VLA4 Antikörpers (R1-2) beschreibt und die Verhütung von Diabetes in einem Spontankrankheitsmodell für Diabetes kontrolliert; die Häufigkeit der Rezipienten, welche diabetisch wurden, und der Tag des Krankheitsanfalls sind für NOD Mäuse ohne Behandlung (geschlossene Quadrate), mit einer nicht spezifischen Ratten IgG2b Behandlung (geschlossene Kreise) und mit R1-2 Anti-VLA4 Behandlung (geschlossene Dreiecke) gezeigt; R1-2 oder Ratten IgG2b wurde 8 Wochen lang in NOD Mäuse zweimal wöchenlich von Woche vier bis Woche zwölf an Alter gespritzt. 7 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung des VCAM 2D-IgG Fusionsproteins, das sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 zu binden, beschreibt und die Verhütung von Diabetes nach angenommenen Transfer der Milzzellen kontrolliert; die Häufigkeit von Rezipienten, welche diabetisch wurden, und der Tag des Krankheitsanfalls sind für den Transfer von 2 × 10⁷ Splenozyten von diabetischen (D) NOD Donatoren mit einer irrelevanten Ratten-LFA-3Ig Fusionsproteinbehandlung (geschlossene Quadrate) und mit Behandlung mit VCAM 2D-IgG, das sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 zu binden (offene Kreise), und von Rezipienten, welche PBS allein ohne übertragene Zellen erhielten (geschlossene Dreiecke), dargestellt; die Splenozyten wurden mit VCAM 2D-IgG, das sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 zu binden, oder Ratten LFA-3Ig übertragen, und anschließend wurde VCAM 2D-IgG, das sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 zu binden, oder Ratten LFA-3Ig jeden anderen Tag bis zum Tag 17 post-Transfer (n = 5 für alle Gruppen) injiziert.
8 ist eine schematische beschreibende Struktur des in Beispiel 5 beschriebenen VCAM 2DIgG Fusionsproteins, das sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 zu binden. VCAM 2D-IgG ist eine lösliche Form des Liganden für VLA4 (VCAM1) und besteht aus den zwei N-terminalen Domänen von VCAM1, die an die schwerkettigen konstanten IgG1 Humanregionssequenzen (Hinges, C_H2 und C_H3) fusioniert sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf eine Behandlung, die die Verhütung von insulinabhängigem (Typ I) Diabetes einschließt. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von Antikörpern zum B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 bei der Behandlung von Diabetes bei einem Prädiabetesindividuum. Der Begriff „prädiabetisch" soll ein Individuum bezeichnen, bei dem ein Risiko für die Entwicklung von Diabeteskrankheit (d.h. genetisch vorbestimmt) in irgendeinem Stadium des Krankheitsprozesses vor offensichtlicher Diabetes oder Diabetesanfall besteht. Der Ausdruck „diabetisch" soll ein Individuum mit offensichtlicher Hyperglykämie (d.h. Fastenblutglucosespiegel ≥ 250 mg/dl) bedeuten. Der Ausdruck „offensichtliche Diabetes" oder „Diabetesanfall" soll einen Krankheitszustand bedeuten, bei dem die Pankreasinselzellen zerstört sind, und welcher klinisch durch offensichtliche Hyperglykämie (d.h. Fastenblutglucosespiegel ≥ 250 mg/dl) manifestiert ist.
In dem ersten Aspekt liefert die Erfindung eine Behandlung von Diabetes, umfassend die Stufe des Verabreichens einer Zusammensetzung, die einen Antikörper einschließt, der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 zu binden, oder ein VCAM 2D-IgG Fusionsprotein, das sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 zu binden, die sich dazu eignet, zu binden, einschließlich Blockieren oder Überziehen, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 auf der Oberfläche von VLA4 positiven Zellen, einschließlich Lymphozyten und Makrophagen. Für die Zwecke der Erfindung soll der Ausdruck „Binden an B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4" Umsetzen mit dem B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 Antigenen auf Zellen und dadurch interferieren mit Wechselwirkungen zwischen VLA4 Antigenen und entweder VCAM-1 oder Fibronektin auf der Oberfläche von anderen Zellen oder dadurch Induzieren einer Änderung in der Funktion der VLA-4 positiven Zellen bedeuten. Wie hier dargestellt, führt ein derartiges Binden, einschließlich Blockieren oder Überziehen, des B1- oder B2-Epitops der α₄-Untereinheit von VLA4 zu einer Verhütung oder Schutz gegen das Auftreten von Diabetes. Diese Demonstration verwendete einen monoklonalen Antikörper gegen VLA4 als ein Bindungsmittel, welches wirksam das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 blockierte oder überzog.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der gewünschte Antikörper, der bei der erfindungsgemäßen Verwendung verwendet wird, zu binden, einschließlich blockieren oder überziehen, an Zelloberflächen-B1- oder B2-Epitope der α₄-Untereinheit von VLA4, ein monoklonaler Antikörper oder Antikörperderivat. Bevorzugte gewünschte Antikörperderivate für die Behandlung, insbesondere für die menschliche Behandlung, umfassen humanisierte rekombinante Antikörper, rekombinante Chimärenantikörper, Fab, Fab', F(ab')₂ und F(v) Antikörperfragmente und Monomere oder Dimere von schweren oder leichten Antikörperketten oder Zwischenmischungen davon, die sich dazu eignen, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA-4 zu binden. Somit sind die monoklonalen Antikörper gegen das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA-4 ein bevorzugtes Bindungsmittel bei dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Die Technologie zum Herstellen von monoklonalen Antikörpern ist gut bekannt. Kurz gesagt, eine unsterbliche Zelllinie (typischerweise Myelomzellen) wird an Lymphozyten (üblicherweise Splenozyten) von einem Säuger, der mit ganzen Zellen immunisiert ist, die ein gegebenes Antigen, beispielsweise VLA4 exprimieren, fusioniert, und die Kulturüberstände der sich ergebenden Hybridomzellen werden in Bezug auf Antikörper gegen das Antigen gescreent. (Siehe allgemein Kohler et al., 1975 [40]).
Immunisierung kann unter Verwenden von Standardverfahren durchgeführt werden. Die Einheitsdosis und Immunisierungssysteme hängen von der Art des immunisierten Säugers, seinem Immunzustand, dem Körpergewicht des Säugers etc. ab. Typischerweise läßt man die immunisierten Säuger bluten, und das Serum aus jeder Blutprobe wird in Bezug auf bestimmte Antikörper unter Verwenden entsprechender Screeningassays untersucht. Beispielsweise können die Anti-VLA4 Antikörper mittels Immunfällung von ¹²⁵J-markierten Zelllysaten aus VLA4 exprimierenden Zellen identifiziert werden (siehe Sanchez-Madrid et al. 1986 [41] und Hemler et al. 1987 [42]). Anti-VLA4 Antikörper können auch mittels Fließzytometrie, beispielsweise durch Messen von fluoreszierendem Färben von Ramoszellen, die mit einem Antikörper inkubiert sind, von dem man annimmt, daß er VLA4 erkennt, identifiziert werden (siehe, Elices et al., (1990) [43]). Die bei der Herstellung von Hybridomzellen verwendeten Lymphozyten werden typischerweise aus immunisierten Säugern isoliert, deren Seren schon positiv in Bezug auf das Vorhandensein von Anti-VLA4 Antikörpern unter Verwenden derartiger Screeningassays getestet worden sind.
Typischerweise stammt die unsterbliche Zelllinie (beispielsweise eine Myelomzelllinie) von der gleichen Säugerspecies wie die Lymphozyten ab. Bevorzugte unsterbliche Zelllinien sind Mausmyelomzelllinien, die empfindlich gegenüber Kulturmedium sind, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin („HAT" Medium) enthält.
Typischerweise werden HAT empfindliche Mausmyelomzellen an Maussplenozyten unter Verwenden von 1500 molekulargewichtigem Polyethylenglycol („PEG 1500") fusioniert. Aus der Fusion resultierende Hybridomzellen werden dann unter Verwenden von HAT Medium ausgewählt, welches nicht fusionierte und unproduktiv fusionierte Myelomzellen tötet (nicht fusionierte Splenozyten sterben nach mehreren Tagen, weil sie nicht transformiert sind). Einen gewünschten Antikörper produzierende Hybridome werden durch Screenen der Hybridomkulturüberstände nachgewiesen. Beispielsweise können Hybridome, die hergestellt sind, um die gewünschten Anti-VLA4 Antikörper zu erzeugen, durch Testen des Hybridomkulturüberstandes in Bezug auf ausgeschiedene Antikörper mit der Fähigkeit, an das B1- oder B2-Epitop einer rekombinanten α₄-Untereinheitexprimierenden Zelllinie zu binden, wie beispielsweise transfektionierte K-562 Zellen, gescreent werden (siehe Elices et al. [43]).
Um die gewünschten Anti-VLA4 Antikörper herzustellen, wurden Hybridomzellen, die in derartigen Screeningtests positiv testeten, in einem Nährmittelmedium unter Bedingungen und für eine ausreichende Zeit kultiviert, die es den Hybridomzellen ermöglichte, die monoklonalen Antikörper in das Kulturmedium auszuscheiden. Gewebekulturtechniken und Kulturmedien, die für Hybridomzellen geeignet sind, sind gut bekannt. Der konditionierte Hybridomkulturüberstand kann gesammelt und die gewünschten Anti-VLA4 Antikörper gewünschtenfalls weiterhin mittels gut bekannter Verfahren gereinigt werden.
Alternativ kann der gewünschte Antikörper hergestellt werden, indem die Hybridomzellen in die Bauchfellhöhle einer nicht immunisierten Maus injiziert werden. Die Hybridomzellen vermehren sich in der Bauchfellhöhle, wobei sie den Antikörper ausscheiden, der sich als Ascitesflüssigkeit ansammelt. Der gewünschte Antikörper kann geerntet werden, indem die Ascitesflüssigkeit aus der Bauchfellhöhle mit einer Spritze abgezogen wird.
Mehrere Anti-VLA4 naonoklonale Mausantikörper sind zuvor beschrieben worden (siehe beispielsweise Sanchez-Madrid et al., 1986 [41]; Hemler et al., 1987 [42]; Pulido et al., 1991 [44]). Diese monoklonalen Anti-VLA4 Antikörper wie beispielsweise HP1/2 und andere Anti-VLA4 Antikörper (beispielsweise mAb, HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, P4G9), die dazu fähig sind, das B1- oder B2-Epitop der α-Kette von VLA4 zu erkennen, eignen sich bei den Behandlungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Anti-VLA4 Antikörper, die die B1- oder B2-Epitope der VLA-alpha₄ Ketten erkennen, die in das Binden an VCAM-1 und Fibronektinliganden verwickelt sind (d.h. Antikörper, welche an das B1- oder B2-Epitop von VLA4 an einer Stelle binden können, die in die Ligandenerkennung verwickelt ist und VCAM-1 und Fibronektinbinden blockieren) sind bevorzugt. Derartige Antikörper sind als B Epitop spezifische Antikörper (B1 oder B2) (siehe Pulido et al. (1991) [36]) definiert worden. Der, wie hier beschrieben, verwendete R1-2 Antikörper ist ein B Epitop Typ Antikörper.
Monoklonale Humanantikörper gegen das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit von VLA4 sind ein weiteres bevorzugtes Bindungsmittel, welches VLA4 α₄-Untereinheit-B1- oder B2-Epitop-Antigene bei dem erfindungsgemäßen Verfahren blockieren oder überziehen kann. Diese können unter Verwenden von in vitro geprimerten Humansplenozyten hergestellt werden, wie von Boerner et al. 1991 [45] beschrieben. Alternativ können sie mithilfe von Repertoireklonen, wie von Persson et al., 1991 [46] oder von Huang und Stollar, 1991 [47] beschrieben, hergestellt werden. Ein weiteres bevorzugtes Bindungsmittel, welches VLA4 α₄-Untereinheit-B1- oder B2-Epitop-Antigene bei dem erfindungsgemäßen Verfahren blockieren oder überziehen kann, ist ein chimärer rekombinanter Antikörper mit Anti-VLA4 α₄-Untereinheit-B1- oder B2-Epitop-Spezifität und einer konstanten Humanantikörperregion. Jedoch noch ein weiteres bevorzugtes Bindungsmittel, welches VLA4 α4-Untereinheit-B1- oder B2-Epitop-Antigene bei dem erfindungsgemäßen Verfahren blockieren oder überziehen kann, ist ein humanisierter rekombinanter Antikörper mit Anti-VLA4 α₄-Untereinheit-B1- oder B2-Epitop- Spezifität. Humanisierte Antikörper können hergestellt werden, wie beispielhaft in Jones et al., 1986 [48], Riechmann, 1988 [49], Queen et al., 1989 [50] und Orlandi et al., 1989 [51] beschrieben. Bevorzugte Bindungsmittel, welche chimäre rekombinante und humanisierte rekombinante Antikörper mit B Epitop Spezifität einschließen, sind hergestellt worden und in der in Gemeinbesitz befindlichen (commonly owned) internationalen Patentanmeldung, WO 9416094, veröffentlicht am 21. Juli, 1994 [52] beschrieben. Das Ausgangsmaterial für die Herstellung der gewünschten Chimären (Maus V – Human C) und der gewünschten humanisierten Anti-VLA4 Antikörpern kann ein Murin monoklonaler Anti-VLA4 α₄-Untereinheit B1- oder B2-Epitop -Antikörper, wie zuvor beschrieben, ein monoklonaler Anti-VLA4- α₄-Untereinheit-B1- oder B2-Epitop-Antikörper, kommerziell erhältlich (beispielsweise HP2/1, A mac International, Inc., Westbrook, Maine) oder ein monoklonaler Anti-VLA4-α₄-Untereinheit-B1- oder B2-Epitop-Antikörper, hergestellt in Übereinstimmung mit der Lehre hier sein. Beispielsweise sind die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten des Anti-VLA4 Antikörpers HP1/2 kloniert, sequenziert und exprimiert worden in Kombination mit konstanten Regionen der schweren und leichten Humanimmunglobulinketten. Ein derartiger gewünschter chimärer HP1/2 Antikörper ist in Bezug auf Spezifität und Potenz ähnlich zu dem Murin HP1/2 Antikörper und kann geeignet bei den Behandlungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sein. Die HP1/2 V_H DNA Sequenz und ihre übersetzten Aminosäuresequenzen sind in SEQ ID NR: 1 bzw. SEQ ID NR: 2 dargelegt. Die HP1/2V_k DNA Sequenz und ihre übersetzte Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NR: 3 bzw. SEQ ID NR: 4 dargelegt. In ähnlicher Weise können humanisierte rekombinante Anti-VLA4-α4-Untereinheit-B1- oder B2-Epitop-Antikörper geeignet bei diesen Verfahren sein. Ein bevorzugter humanisierter rekombinanter Anti- VLA4 Antikörper ist ein AS/SVMDY Antikörper, beispielsweise der AS/SVMDY Antikörper, hergestellt mithilfe der mit der ATCC am 3. November, 1992 und gegebenen Hinterlegungsnummer CRL 11175 hinterlegten Zelllinie. Der AS/SVMDY humanisierte Antikörper ist zumindest equipotent mit oder vielleicht potenter als der Murin HP1/2 Antikörper. Die AS V_H DNA Sequenz und ihre übersetzten Aminosäuresequenzen sind in SEQ ID NR: 5 bzw. SEQ ID NR: 6 dargelegt. Die SVMDY V_K DNA Sequenz und ihre übersetzte Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NR: 7 bzw. SEQ ID NR: 8 dargelegt.
Alternativ können die bei der Verwendung der Erfindung verwendeten Bindungsmittel keine Antikörper oder Antikörperderivate sein, sondern können eher ein VCAM 2D-IgG-Fusionsprotein sein, das sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA-4 zu binden. Diese Bindungsmittel wirken, indem sie mit dem Zelloberflächenbindungsprotein in Bezug auf VLA4 konkurrieren.
Bei dieser Verwendung in Bezug auf den ersten Aspekt der Erfindung werden gewünschte VLA4 Bindungsmittel vorzugsweise parenteral verabreicht. Die gewünschten VLA4 Bindungsmittel werden vorzugsweise als eine sterile pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält, welcher irgendeiner der zahlreichen gut bekannten Träger sein kann, wie beispielsweise Wasser, physiologische Kochsalzlösung, phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol, und dergleichen, oder Kombinationen davon. Vorzugsweise wird das gewünschte VLA4 Bindungsmittel, falls ein Antikörper oder Antikörperderivat, in einer Dosis verabreicht, die im Bereich zwischen etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht/Tag und etwa 20 mg/kg Körpergewicht/Tag, vorzugsweise im Bereich zwischen etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht/Tag und etwa 10 mg/kg Körpergewicht/Tag liegt und in Intervallen von jeweils 1-14 Tagen. Für VCAM 2D-IgG sollte der Dosisbereich vorzugsweise zwischen molaren Äquivalentmengen zu diesen Antikörpermengen sein. Vorzugsweise wird eine Antikörperzusammensetzung in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, einen Plasmaspiegel von Antikörper von mindestens 1 µg/ml zu liefern. Die Optimierung von Dosierungen kann durch Verabreichung der Bindungsmittel, gefolgt von Bewertung des Überziehens der VLA4 positiven Zellen mithilfe des Mittels über eine Zeit nach Verabreichung einer gegebenen Dosis in vivo bestimmt werden. Periphere mononukleare Blutzellen, welche in einer Probe des peripheren Bluts des Individuums enthalten waren, sollten im Hinblick auf das Vorhandensein des Agenzes in vitro (oder ex vivo) unter Verwenden eines zweiten Reagenzes zum Nachweisen des verabreichten Mittels untersucht werden. Beispielsweise kann dieses ein mit Fluorochrom markierter Antikörper sein, der spezifisch für den verabreichten gewünschten Antikörper oder das gewünschte VCAM 2D-IgG-Fusionsprotein ist, welches dann mithilfe von Standard FACS (Fluoreszenz aktivierter Zellsortierer) Analyse gemessen wird. Alternativ kann das Vorhandensein des verabreichten gewünschten Antikörpers oder des gewünschten VCAM 2D-IgG-Fusionsproteins in vitro (oder ex vivo) durch die Unfähigkeit oder verringerte Fähigkeit der Zellen des Individuums, das gleiche Mittel zu binden, welches selbst markiert worden ist (beispielsweise mithilfe eines Fluorochroms) nachgewiesen werden. Die bevorzugte Dosierung sollte nachweisbares Überziehen der breiten Mehrheit von VLA4-positiven Zellen erzeugen. Vorzugsweise wird der Überzug im Fall eines gewünschten monoklonalen Antikörpers oder gewünschten monoklonalen Antikörperderivats für eine 1-14 Tage Dauer aufrechterhalten.
Die Behandlung mit gewünschten VLA4 Bindungsmitteln wird vorzugsweise für so lange fortgesetzt, wie das Prädiabetessubjekt einen stabilen normoglykämischen Plasmaspiegel und einen stabilen prädiabetischen Zustand, wie mithilfe einer Anzahl von bekannten Markern reflektiert, wie zuvor beschrieben, beibehält. In den Beispielen, welche folgen, ist festgestellt worden, daß Anti-VLA4 mAb, der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA-4 zu binden, beispielsweise R1-2 mAb, Verabreichung Diabetesanfall während der Behandlung verhinderte, und daß die restlichen günstigen Ergebnisse der Behandlung so lange wie zwei Monate im Anschluß an das Aufhören von R1-2 Behandlung ausgedehnt wurden. Um jedoch die vollständige schützende Wirkung des gewünschten VLA4 Bindungsmittels gegen Diabetesanfall aufrechtzuerhalten, ist kontinuierliche Behandlung mit den Bindungsmitteln bevorzugt.
Die Verwendung, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht, umfaßt Verabreichen einer einen Anti-VLA4 Antikörper, der sich dazu eignet, das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit zu binden, enthaltenden Zusammensetzung einem prädiabetischen Individuum. Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die beobachteten Ergebnisse in einem Nagetierkrankheitsmodell. Diese Ergebnisse zeigen eine Schutzwirkung des gewünschten Anti-VLA4 Antikörper bei Krankheitsanfall in dem akuten Übertragungsmodell der Krankheit. Die nicht fettleibige diabetische (NOD) Maus ist ein wichtiges Modell des Typ I oder Insulin abhängigen Diabetes mellitus seit ihrer Einführung durch Makino et al., 1980 [7] geworden und ist als ein besonders relevantes Modell für Humandiabetes dokumentiert worden (siehe beispielsweise Castano und Eisenbarth [1], Miller et al., 1988 [5], Hutchings et al., 1990 [33] und darin zitierte Referenzen). Daß die in der NOD Maus und dem Menschen gezeigten diabetischen Syndrome ähnlich sind, ist mittels verschiedener Beweislinien gezeigt worden. Beispielsweise gibt es sowohl in der NOD Maus wie dem Menschen [1] eine starke genetische Assoziierung von Diabetes mit Loci des Haupthistokompatibilitätskomplexes. Darüberhinaus wird beispielsweise in beiden Species eine Autoimmunpathogenese durch (i) das Vorhandensein von lymphozytärer Entzündung in den Pankreasinseln (d.h. Insulitis) bewiesen, welches die selektive Zerstörung von beta Zellen, (ii) das Vorhandensein von Anti-Inselzellantikörpern und (iii) die modulierenden Wirkungen von Cyclosporin A zu vermitteln scheint. Weiterer Beweis in der NOD Maus für eine Autoimmunethiologie von Diabeteskrankheit ist (i) die Fähigkeit, Diabetes mit Milzzellen (einschließlich gereinigte Milz T Zellen) aus diabetischen Donatoren zu übertragen, (ii) die Verhütung von Diabetes durch in vivo Behandlung mit Antikörpern, die spezifisch für T Zellen sind, und (iii) Versagen einer Thymusnacktmaus mit NOD genetischem Hintergrund, Moulitis oder Diabetes zu entwickeln (siehe beispielsweise Miller et al., 1988 [5], Hutchings et al., 1990 [33] und darin zitierte Entgegenhaltungen).
Obwohl die präzisen zu Diabetes führenden Ereignisse unklar bleiben, scheint eine bei der NOD Maus fortschreitende entzündliche Reaktion in dem Pankreas die anfängliche histologische Schädigung zu sein, welche als ein periduktales/perivaskuläres mononukleares Zellinfiltrat mit einem Alter von 3-4 Wochen beginnt. Bei etwa 4-6 Wochen Alter kann Insulitis beobachtet werden und beginnend mit etwa 12 Wochen Alter tritt offensichtliche Diabetes auf (d.h. übereinstimmende Werte von 1+ oder höher unter Verwenden eines Testape (Eli Lilly, Indianapolis, IN) Assays für Glykosurie oder größer a1s 250 mg/dl, wenn Plasmaglucose angezeigt wird). Um Veränderungen in dem Immunstatus der Tiere zu vermeiden, werden die NOD Mäuse aus einer spezifischen pathogenfreien Kolonie erhalten und zeigen stabiles, hohes Vorkommen von Diabetes von etwa 80% der Weibchen und 20% der Männchen, welche typischerweise diabetisch mit etwa 20 Wochen Alter werden. Die bevorzugte Quelle für die in den hier beschriebenen Experimenten verwendeten NOD Mäuse ist Taconic Farms (Germantown, NY). Ein großer Teil an Daten, insbesondere aus Untersuchungen der BB Ratte und NOD Maus hat angezeigt, daß Typ I Diabetes eine T-Zellen vermittelte Krankheit sein kann. Datenoffenkundigkeit legt eine wichtige Rolle für beide Haupt-T-Zellsubpopulationen (CD4/L3T4 und CD8/Ly2) bei der Entwicklung von Diabetes im Menschen und in der NOD Maus nahe. Die Daten, die die wesentliche Rolle von T Zellen in Diabetes unterstützen, schließen nicht die Möglichkeit aus, daß T Lymphozyten andere Zellen (beispielsweise Makrophagen) als die letztendlichen Effektoren für beta-Zellzerstörung rekrutieren können. Makrophagen sind basierend auf ihrem Vorhandensein in der infiltrierten Insel und der Fähigkeit chronischer Silikabehandlung zum Vorbeugen von Krankheit (siehe beispielsweise Hutchings et al., 1990 [33] und hier zitierte Referenzen) in das Krankheitsverfahren verwickelt.
Unter Verwenden des NOD Stammes von Mäusen haben Forscher ein akutes Krankheitsübertragungsmodell entwickelt, welches mit dem spontanen Krankheitsmodell insofern parallel verläuft, als daß übertragene Zellen, die von Diabetes verursachenden NOD Mäusen abstammen, das Krankheitsverfahren vermitteln, welches gekennzeichnet ist durch immunreaktive Zellen, die Insulitis und Insel-beta-zellspezifische Zerstörung vermitteln. Darüberhinaus ist bei diesem Modell gezeigt worden, daß bestimmte monoklonale Antikörper gegen T Zellen (siehe beispielsweise Miller et al., 1988 [5]) und Makrophagen (siehe beispielsweise Hutchings et al., 1990 [33]) Krankheitsanfall aufheben. Derartige monoklonale Antikörper sind bei der Behandlung von spontaner Krankheit und angenommener Übertragungskrankheit verwendet worden, wobei beispielsweise gezeigt worden ist, daß Anti-CD4 Antikörper Krankheit in beiden Modellen aufhebt (Miller et al., 1988 (5] und Shizuru et al., 1988 (30]). Behandlungsergebnisse mit einem Mittel bei dem angenommenen Übertragungsmodell oder spontanen Krankheitsmodell zeigen die Fähigkeit des Mittels an, das Humankrankheitsverfahren anzupassen.
BEISPIEL 1
WIRKUNG DER ANTI-VLA4 ANTIKÖRPERBEHANDLUNG AUF ANGENOMMENEN TRANSFER VON DIABETES
Für den angenommenen Transfer von Diabetesexperimenten wurden NOD Mäuse von Taconic Farms (Germantown, NY) oder von Joslin Diabetes Center (Boston, MA) erhalten. Spontane diabetische (D) Weibchen mit kürzlichem Anfall (13-20 Wochen an Alter) wurden als Milzzelldonatoren verwendet und 8 Wochen alte nicht diabetische (Y) Weibchen dienten als Rezipienten.
Milzzellen von vier Wochen alten nichtdiabetischen (Y) weiblichen Donatoren, welche versagen, Krankheit zu übertragen, wurden als eine negative Kontrolle verwendet.
Rezipientenmäuse wurden auf angesäuertes Wasser (1:8400 Verdünnung von konzentrierter HCl in Wasser) eine Woche vor sublethaler Bestrahlung (775 Rad) gebracht, welche in Anteilsdosierungen (300 Rad, 300 Rad und 175 Rad) an jeweils drei Tagen (Tag -2, -1 und Tag des Transfers) durchgeführt wurden, um irgendwelches Auftreten von intestinaler Infektion folgend Hochdosierungsbestrahlung (Gamma Zellen 1000 Cesium¹³⁷ Quelle, Nordion International, Inc., Ontario, Canada) zu minimieren. Milzen wurden von diabetischen Donatoren geerntet oder aus nicht diabetischen Kontrollen, hergestellten Zellsuspensionen und roten, mit Hämolytischer Geys Lösung lysierten Zellen. Milzzellen wurden intravenös (2 – 3 × 10⁷ in 0,2 ml PBS) injiziert, mit sowohl 75 µg R1-2 monoklonalem Antikörper (mAb) wie auch 75 µg Ratten IgG2b vorbehandelt oder nicht behandelt. Für die Antikörperbehandlung wurden die Zellen einfach bei 1 – 1,5 × 10⁸ Zellen/ml mit mAb bei 375 µg/ml suspendiert und bis zur Injektion auf Eis gehalten. Der Zeitpunkt der Injektion betrug 3 Stunden nach der letzten Bestrahlung. Einige Rezipienten erhielten PBS allein. Das Anti-VLA4 mAb R1-2 und isotypen-markiertes Ratten IgG2b wurden von Pharmingen (La Jolla, CA) gekauft. Das R1-2 (Ratten-Anti-Maus) Anti-VLA4 mAb war ursprünglich von Holzmann et al., 1989 [53] beschrieben. Das R1-2 Anti-VLA4 mAb blockiert VLA₄ Binden an seine Liganden (Hession et al., 1992 [54]) und gehört deshalb per Definition zu der B Gruppe (Pulido et al., 1991 [44], d.h. ist äquivalent zu dem Anti-Human VLA4 mAbs der B Gruppe (beispielsweise HP1/2 oder HP2/1).
Das R1-2 mAb oder Ratten IgG2b wurde mit einer Dosierung von 75 µg/0,2 ml intraperitoneal alle 2-3 Tage verabreicht, ein Dosierungsbereich, welcher bestimmt wurde, das maximale Überziehen von VLA4 positiven Zellen in dem peripheren Blut, Lymphoidorganen und Knochenmark, wie nachgewiesen, durch Färben von peripheren Blutzellen und Einzelzellsuspensionen, beizubehalten, welche aus diesen Organen mit einem Fluorchrom markiertem mAb hergestellt sind, das spezifisch für die R1-2 mAb und FACS Analyse ist, um positiven Fluorchromzellen zu messen (wie zuvor beschrieben). Injektionen wurden bis zum Tag 12 oder Tag 24 post Transfer beibehalten. Mäuse wurden in Bezug auf Diabetes überwacht, indem Glykosurie mit Testape (Eli Lilly, Indianapolis, IN) und mittels Plasmaglucosespiegeln (Glucometer, 3 Blutglucosemeter, Miles, Inc., Elkhart, IN) untersucht wurde, und wurden nach zwei aufeinanderfolgenden positiven Urintests [Testapewerte von [+] oder höher] oder Plasmaglucosespiegeln > 250 mg/dl als diabetisch angesehen.
Eine Inhibitorwirkung des Anti-VLA4 mAb auf den Diabetesanfall wurde gezeigt, als aus NOD diabetischen Donatoren isolierte Milzzellen mit einer sättigenden Menge von Anti-VLA4 mAb R1-2 behandelt wurden, gefolgt von Transfer in nicht diabetisch bestrahlte Wirte, wie zuvor beschrieben, und das R1-2 mAb wurde dann jeden anderen Tag 12 Tage lang verabreicht, um maximales Überziehen aller VLA4-positiven Zellen in dem peripheren Blut und Lymphoidorganen zwei Wochen lang aufrechtzuerhalten. 1 zeigt die Häufigkeit von Rezipienten, die diabetisch wurden, und den Tag des Krankheitsanfalls für den Transfer von 2 × 10⁷ Splenozyten aus diabetischem NOD Donator (D→Y) (i) ohne Behandlung (geschlossene Kreise), (ii) mit Ratten IgG2b Behandlung (geschlossene Dreiecke) und (iii) mit R1-2 Anti-VLA4 Behandlung (geschlossene Rhombusse) wie auch für den Transfer von Splenozyten aus nichtdiabetischen NOD Donatoren (Y→Y) (offene Quadrate). Injektion von PBS allein ergab 0% Vorkommen. Unter diesen Bedingungen wurden nur 1 von 8 individuellen mit R1-2 mAb behandelten Rezipienten diabetisch, mit einem Anfall am Tag 29 nach Transfer. Im Unterschied dazu wurden 6/10 und 5/9 Individuen nach Erhalten von Splenozyten aus diabetischen Donatoren, welche mit keinem mAb oder mit nicht spezifischem Ratten IgG2b behandelt waren, diabetisch. Wie in 1 dargestellt, trat der Diabetesanfall so früh wie am Tag 14 nach Transfer auf, obwohl Verabreichung des irrelevanten Ratten IgG2b den Anfall etwas verzögerte.
Diese Daten zeigen eine Schutzwirkung des R1-2 mAb, welches von seiner Spezifität für ein B-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 abhängig war. Die Rezipienten von Splenozyten aus nicht diabetischen Mäusen oder von PBS allein versagten, diabetisch zu werden. Somit reduzierte die Behandlung mit dem gewünschten Anti-VLA4 Antikörper die Häufigkeit von Diabetes während 30 Tagen nach Transfer.
Obwohl die in 1 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß klinische Diabetes nur in 1 von 8 Anti-VLA4 behandelten Tieren auftrat, war es möglich, daß der Anti-VLA4 Antikörper nur eine geringe Verzögerung bei dem Krankheitsanfall erzeugte. Plasmaglucosespiegel wurden parallel mit Uringlucose überwacht, um irgendeinen Anstieg an Blutzuckerspiegeln mengenmäßig zu bestimmen und dadurch Fortschritt zu klinischer Krankheit nachzuweisen. Bei der mit Anti-VLA4 Antikörper behandelten Gruppe, die in 1 gezeigt ist, waren alle Mäuse noch normoglykämisch am Tag 29 mit einem Durchschnittsplasmaglucosewert von 100 ± 7 mg/dl, n = 7, mit Ausnahme des einzelnen Individuums, das sich als klinisch diabetisch durch den Urintest und Plasmaglucose > 500 mg/dl erwies. Somit war der Krankheitsfortschritt nicht in irgendeinem der anderen mit Anti-VLA4 Antikörper behandelten Rezipienten offensichtlich, wie in 1 am Tag 29 nach Transfer gezeigt, volle zwei Wochen nach der letzten Anti-VLA4 Antikörperinjektion. Analyse der Seren von diesen Mäusen bestätigte, daß das Anti-VLA4 mAb auf niedrige oder nicht nachweisbare Spiegel an Tagen 18 bis 21 post Transfer sank.
Zusätzliche Zelltransfers wurden durchgeführt, um zu bestätigen, daß der gewünschte Anti-vLA4 mAb gegen Transfer von Diabetes schützte. Bei diesen Experimenten wurde die Anti-VLA4 Antikörperbehandlung bis zum Tag 25 nach Transfer ausgedehnt, aber alle 3,5 Tage verabreicht, wodurch sättigende Spiegel von R1-2 mAb oder Ratten IgG2b bis zum Tag 26 beibehalten wurden, als die Mäuse in Bezug auf Pankreasgewebe geopfert wurden. Unter diesen Bedingungen wurde eine Inhibitorwirkung des Anti-VLA4 mAb, der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit zu binden, auf den Diabetesanfall auch bei Milzzelltransfer und R1-2 Behandlung gezeigt. 2 zeigt die Häufigkeit von Rezipienten (n = 4 – 5 für jede Gruppe), die diabetisch wurden/und den Tag des Krankheitsanfalls für den Transfer von 3 × 10⁷ Splenozyten von diabetischen NOD Donatoren (D→Y) (i) ohne Behandlung (geschlossene Kreise), (ii) mit IgG2b Behandlung (geschlossene Dreiecke) und mit R1-2 Anti-VLA4 Behandlung (geschlossene Rhombusse) wie auch für den Transfer von Splenozyten aus nichtdiabetischen NOD Donatoren (Y→Y; offene Quadrate). Das Einspritzen von PBS allein ergab 0% Vorkommen. 2 zeigt, daß nur 1 von 5 R1-2 mAb behandelten Mäusen diabetisch am Tag 22 post Transfer wurde, wohingegen Diabetes in 4/4 Rezipienten ohne R1-2 mAb und 5/5 mit Ratten IgG2b behandelte übertragen wurde. Krankheitsanfall trat so früh wie am Tag 13 nach Transfer auf. Diese Experimente zeigen individuell und kollektiv, daß Anti-VLA4 mAb, der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit zu binden, reproduzierbar gegen Diabetesentwicklung in einem akuten Krankheitsübertragungsmodell schützt.
Weitere Experimente wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob der gewünschte Anti-VLA-4 mAb einfach den Krankheitsanfall während der Behandlungsperiode verzögerte, oder ob es eine Langdauerschutzwirkung erzielen könnte. 3 zeigt den Diabetesanfall in Mäusen über eine Zeit nach R1-2 Injektion (einmal alle 3,5 Tage bis zum Tag 25), wobei nur 2/5 Mäuse an den Tagen 35 und 38 nach Transfer diabetisch wurden, 10-13 Tage nach der letzten R1-2 Injektion. Im Unterschied dazu trat Diabetes in den unbehandelten und IgG2b behandelten Gruppen so früh wie am Tag 11 nach Transfer auf, mit 100 Vorkommen spätestens um die Tage 18-21. Überraschenderweise erhöhte sich das Krankheitsvorkommen in der R1-2 behandelten Gruppe selbst so lange wie 2 Monate nach der letzten R1-2 Injektion nicht weiter. Plasmaglucosewerte, die parallel während dieser Zeit angezeigt wurden, zeigen, daß diese drei Individuen beständig normoglykämisch waren. Nach diesem Punkt (d.h. annähernd 3 Monate nach Transfer) beginnen selbst die negativen Kontrollgruppen, welche PBS allein erhielten, oder nicht diabetische Zellen spontane Krankheit zu entwickeln. Zusammengefaßt, der VLA-4-spezifische mAb, der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α₄-Untereinheit zu binden, reduziert das Vorkommen von Diabetestransfer. Darüberhinaus wird seine Schutzwirkung gegen Krankheit in der Abwesenheit von weiterer mAb Behandlung aufrechterhalten.
BEISPIEL 2
WIRKUNG DES ANTI-VLA4 mAb, DER SICH DAZU EIGNET, AN DAS B1- ODER B2-EPITOP DER α4-UNTEREINHEIT ZU BINDEN, AUF PANKREASINSULITIS
Für die histologische Analyse wurden Mäuse zwischen 2-4 Wochen nach Transfer, wie in diesem Beispiel beschrieben, geopfert, und Bauchspeicheldrüsen in 10% Formalin gepufferter physiologischer Kochsalzlösung für Paraffin eingelagerte Abschnitte geerntet, welche mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) für die Histologie gefärbt wurden. Der Insulitisgrad wurde folgendermaßen markiert: Grad 0: keine Insulitis [Insel, der es an Entzündung fehlte]; Grad I: Peri-Insulitis [entzündliche mononukleare Zellen peripheral zu der Insel angeordnet]; Grad II: < 25% infiltriert [< 25% des Inselinneren enthält entzündliche Lymphozytenzellen]; Grad III: 25-50% infiltriert [Lymphozyteninfiltration]; Grad IV: > 50% infiltriert. Der Prozentsatz an Inseln in jedem Grad wurde dann relativ zu der Gesamtzahl an untersuchten Inseln berechnet.
Histologische Abschnitte wurden untersucht und in Bezug auf den Grad an Insulitis markiert im Anschluß an den angenommenen Transfer von NOD Splenozyten mit und ohne Anti-VLA4 mAb Behandlung, und die Ergebnisse tabelliert. In spezifischer Weise wurde die Frequenz der nicht infiltrierten Inseln (Grad 0-1 Infiltrat) und Inseln mit Grad II-IV Insulitis (wie zuvor beschrieben) quantitativ bestimmt. Für jede experimentelle Gruppe wurden pankreatische Abschnitte von n = 4 – 5 Mäusen markiert.
Das Pankreasgewebe wurde von Rezipienten, die mit dem gewünschten Anti-VLA-4 mAb verschiedene Zeitperioden lang behandelt waren, gewonnen, um seine Wirkung auf die Begründung der inselspezifischen zellulären Infiltrate zu richten. Mäuse wurden mit nicht spezifischem Ratten IgG2b oder R1-2 mAb alle 3,5 Tage bis zum Tage 14 behandelt, als sie geopfert wurden. In ähnlicher Weise wurden die Mäuse bis zum Tag 25 Tag behandelt und geopfert, nachdem Diabetes diagnostiziert war, oder am 26. Tag nach Transfer. Mäuse, die kontinuierlich mit dem R1-2 mAb 14 Tage nach Transfer behandelt waren, behalten eine hohe Häufigkeit (76%) von nicht infiltrierten Inseln mit nur 24% Fortschreiten bis zu Grad II-IV Insulitis. Im Unterschied dazu zeigen jene, die mit nicht spezifischem Ratten IgG2b behandelt waren, das wechselseitige Muster mit 74% schwerer Insulitis. In ähnlicher Weise wurde bei den Mäusen, die mit R1-2 bis zum Tag 25 Tag behandelt waren (20% diabetisch, aus Mäusen isolierte Bauchspeicheldrüsen, dargestellt in 2) eine hohe Häufigkeit (58%) an nicht infiltrierten Inseln bewahrt, ähnlich zu derjenigen (55% nicht infiltriert) bei nicht diabetischen Rezipienten von jungen NOD Splenozyten, wie in 4 dargestellt. Im Unterschied dazu hatten sowohl die unbehandelten wie auch die mit mit IgG2b behandelten Mäuse nur 28% nicht infiltrierte Inseln und hatten umgekehrt erhöhte (72%) Insulitis. Somit scheint die Behandlung mit dem gewünschten Anti-VLA-4 Antikörper spezifisch oder alternativ die Entwicklung von Insulitis bei angenommenem Transfer von Diabetes verursachenden Milzzellen zu verzögern.
Um zwischen diesen Alternativen zu unterscheiden, wurde das Insulitismuster nach vier Wochen post Transfer bestimmt, als die Mäuse mit Ratten IgG2b oder R1-2 mAb 12 Tage lang behandelt waren und anschließend ohne weitere Behandlung aufrechterhalten. Die Mäuse wurden bei Diabetesdiagnose oder am 29. Tag post Transfer geopfert. Die Serenanalyse von diesen Mäusen bestätigte, daß Zirkulieren des Anti-VLA-4 mAb zu nicht nachweisbaren Spiegeln an Tagen 18-21 nach Transfer sank. Bei diesem Protokoll war der Insulitisgrad bei der R1-2 behandelten Gruppe (69% Insulitis, 25% diabetisch) ähnlich zu demjenigen bei nicht behandelten Rezipienten (73% Insulitis, 60% diabetisch), obwohl noch niedriger als derjenige bei den mit Ratten IgG2b behandelten Mäusen (96% Insulitis, 75% diabetisch), wie in 5 dargestellt. Bezeichnenderweise war die Schwere an Insulitis ähnlich zwischen den R1-2 behandelten, nicht behandelten und mit Ratten IgG2b behandelten Gruppen bei einem Durchschnitt von 57%, 47%, 64% Grad III/IV Infiltraten. Selbst wenn man nur die nicht diabetischen R1-2 behandelten Individuen betrachtet, zeigten sie noch 59% Insulitis bei 52% Grad III/IV Infiltraten. Rezipienten von nicht Diabetes verursachenden NOD Splenozyten hatten nur 7% Grad III/IV Infiltrate. Umgekehrt zeigt 5, daß die Häufigkeit von nicht infiltrierten Inseln bei den R1-2 behandelten Mäusen im Vergleich zu den Rezipienten von physiologischer Kochsalzlösung oder nicht Diabetes verursachenden Milzzellen verringert war. Somit schritt der Grad an Insulitis bei diesen R1-2 behandelten Mäusen (5) im Vergleich zu Mäusen voran, wo die R1-2 Behandlung aufrechterhalten war (4) und näherte sich-demjenigen bei den nicht behandelten und mit Ratten IgG2b behandelten Kontrollgruppen. Zusammengenommen zeigen diese Daten, daß die Verabreichung von Anti-VLA-4 mAb, der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-Epitop der α4-Untereinheit von VLA4 zu binden, das Fortschreiten von Insulitis in einem akuten Krankheitsübertragungsmodell verzögern kann.
BEISPIEL 3
VERGLEICH VON UNTERSCHIEDLICHER ANTI-VLA4 ANTIKÖRPERBEHANDLUNG BEI ANGENOMMENEM DIABETESTRANSFER
Dieses Beispiel liefert vergleichende Wirksamkeitsergebnisse von PS/2, einem Anti-VLA-4 Antikörper, der sich dazu eignet, an ein B-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 zu binden, mit R1-2 unter Verwenden des angenommenen Transfermodells und des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens. NOD Mäuse wurden mit (a) einem irrelevanten Kontrollantikörper (D/Ratten IgG2b, n = 19 Mäuse), (b) R1-2 Antikörper (D/R1-2 mAb, n = 24 Mäuse), (c) PS/2 mAb (D/PS/2 mAb, n = 5 Mäuse) oder (d) keine Behandlung (keine, n = 26 Mäuse) behandelt. Milzzellen wurden intravenös injiziert (2 – 3 × 10⁷ in 0,2 ml PBS) und mit entweder 75 µg R1-2 mAb, 75 µg PS/2 mAb, 75 µg Ratten IgG2b vorbehandelt oder nicht behandelt. Die Isolierung und Reinigung von PS/2 Anti-VLA4 mAb war ursprünglich von Miyake et al., 1991 [55] beschrieben.
Das R1-2 mAb, PS/2 mAb oder Ratten IgG2b wurde in einer Dosis von 75 µg/0,2 ml intraperitoneal alle 2-3 Tage verabreicht, ein Dosierungsbereich, welcher festgelegt wurde, das maximale Überziehen von VLA4-positiven Zellen in dem peripheren Blut, Lymphoidorganen und Knochenmark aufrechtzuerhalten, wie nachgewiesen wurde durch Färben von peripheren Blutzellen und einzelnen Zellsuspensionen, hergestellt aus diesen Organen mit einem Fluorchrom markiertem mAb, welches spezifisch für die R1-2 und PS/2 mAb und FACS Analyse zum Messen von Fluorochrom positiven Zellen (wie zuvor beschrieben) ist. Injektionen wurden 22 Tage bis 25 Tage post Transfer beibehalten. Die Mäuse wurden in Bezug auf Diabetes durch Testen von Glykosurie mit TesTape (Eli Lilly, Indianapolis, IN) und durch Plasmaglucosespiegel (Glucometer, 3 Blood Glucosemeter, Miles, Inc., Elkhart, IN) überwacht und nach zwei Wochen aufeinanderfolgenden positiven Urintests [Testape werte von [+1] oder höher] oder Plasmaglucosespiegeln > 250 mg/dl als diabetisch angesehen.
Eine Inhibitorwirkung des Anti-VLA4 mAb auf den Diabetesanfall wurde gezeigt, als die aus NOD diabetischen Donatoren isolierten Milzzellen mit einer sättigenden Menge von Anti-VLA4 mAb R1-R2 oder PS/2 behandelt waren, gefolgt von dem Transfer in nicht diabetische bestrahlte Wirte, wie zuvor beschrieben, und das R1-2 mAb oder PS/2 mAb wurde dann jeden anderen Tag 22 bis 25 Tage lang verabreicht, um maximales Überziehen aller VLA4 positiven Zellen in dem peripheren Blut und Lymphoidorganen etwa zwei Wochen lang aufrechtzuerhalten. Tabelle 1 zeigt die Häufigkeit von Rezipienten, die diabetisch wurden, und den Tag des Krankheitsanfalls für den Transfer von Splenozyten aus diabetischem NOD Donor (i) ohne Behandlung (D), (ii) mit Ratten IgG2b Behandlung (D/nicht spezifisches Ratten IgG2b), (iii) mit R1-2 Anti-VLA4 Behandlung (D/R1-2 mAb), (iv) mit PS/2 Behandlung (D/PS/2 mAb) wie auch für den Transfer von Splenozyten aus nicht diabetischen NOD Donatoren (nicht-D). Nicht diabetische Mäuse, die PBS und keine Splenozyten (KEINE) erhielten, waren als eine Kontrolle eingeschlossen. Die Injektion von PBS allein ergab 4% Auftreten. Unter diesen Bedingungen wurde nur 1 von 24 individuellen R1-2 mAb behandelten Rezipienten diabetisch, mit Anfall am Tag 22 post Transfer, wohingegen keiner der fünf individuellen PS/2 mAb behandelten Rezipienten diabetisch wurde. Im Unterschied dazu wurden 16/19 Individuen diabetisch nach Erhalten von Splenozyten aus diabetischen Donatoren, die mit keinem mAb oder mit nicht spezifischem Ratten IgG2b behandelt waren. Wie in Tabelle 1 dargestellt, trat Diabetesanfall so früh wie am Tag 14 nach Transfer auf, obwohl Verabreichung des irrelevanten Ratten IgG2b den Anfall um einen Tag etwas verzögerte.
Diese Daten zeigen eine Schutzwirkung des R1-2 mAb und PS/2, welche von ihrer Spezifität in Bezug auf VLA4 abhängen. Rezipienten von Splenozyten aus nicht diabetischen Mäusen oder von PBS allein versagten darin, diabetisch zu werden. Somit reduzierte die Behandlung mit Anti-VLA4 Antikörper, der sich dazu eignet, an ein B-Epitop der α₄-Untereinheit von VLA4 zu binden, die Häufigkeit von Diabetes während 30 Tagen nach Transfer. Analyse von Seren aus diesen Mäusen bestätigte, daß Spiegel von R1-2 und PS/2 Anti-VLA4 mAb nicht nachweisbar zwischen Tagen 26 und 34 nach Transfer werden. TABELLE 1 ANTI-VLA4 mAbs inhibieren angenommenen Transfer von Diabetes in NOD Mäusen

* Milzzellen von vier Wochen alten nicht diabetischen (NON-D) oder von neuen anfallsdiabetischen (D) NOD Weibchen wurden übertragen, wobei die D Zellen in mAb oder Ratten IgG suspendiert waren, oder ohne mAB vor Transfer, und die Rezipienten zweimal wöchenlich 22-25 Tage behandelt waren. Die Mäuse wurden einen Monat lang nach Transfer überwacht. Die Daten sind aus fünf Experimenten gesammelt.
⁺D/R1-2 und D/PS/2 mAb behandelte Gruppen unterscheiden sich beträchtlich von D und D/Ratten IgG2b behandelten Gruppen durch Chi Quadrattest mit Yates Korrektur wie folgt: R1-2 gegen IgG2b behandelte und D Gruppe, p < 0,0001; PS/2 gegen IgG2b behandelte und D Gruppe, p < 0,003.

BEISPIEL 4
WIRKUNG VON ANTI-VLA4 ANTIKÖRPERBEHANDLUNG AUF SPONTANES DIABETES MODELL
Dieses Beispiel beschrieb Wirksamkeitsergebnisse unter Verwenden von R1-2 mAb bei dem spontanen Diabetesmodell, welches NOD Mäuse verwendet. NOD Mäuse wurden 8 Wochen lang mit (a) einem irrelevanten Kontrollantikörper (NOD/Ratten IgG2b, n = 10 Mäuse), (b) R1-2 Antikörper (NOD/R1-2, n = 20 Mäuse), behandelt, oder (c) keine Behandlung (NOD, n = 10 Mäuse), wobei mit Woche vier bis Woche zwölf an Alter begonnen wurde. mAb wurde mit einer Dosierung von 75 µg in 0,2 ml PBS iv zweimal wöchenlich verabreicht. Die Mäuse wurden in Bezug auf diabetische Ereignisse mittels TesTape in Bezug auf Glykosurie, wie zuvor beschrieben, überwacht.
6 zeigt eine markierte Verzögerung bei Diabetesanfall (12-16 Wochen Verzögerung) im Anschluß an R1-2 Verabreichung im Vergleich zu den beiden Kontrollgruppen. Die NOD Mäuse, welche irrelevantes IgG2b mAb oder keine Behandlung erhielten, entwickelten Diabetes so früh wie 13 Wochen. Dieses spontane Krankheitsmodell ergibt parallel die angenommenen Transferergebnisse mit R1-2 mAb, veranschaulicht in 1, und zeigt direkt, daß der gewünschte Anti-VLA4 Antikörper gegen Diabetesanfall schützt.
BEISPIEL 5
WIRKUNG EINES VCAM-Ig FUSIONSPROTEINS AUF ANGENOMMENEN TRANSFER VON DIABETES
Das in Beispiel 1 beschriebene angenommene Transferexperiment wurde mit einem VCAM-Ig Fusionsprotein (VCAM 2D-IgG) anstelle eines ANTI-VLA4 mAb durchgeführt. VCAM 2D-IgG ist eine lösliche Form des Liganden für VLA4 (VCAM1), welcher aus den zwei N-terminalen Domänen von VCAM1, fusioniert an die Human IgG1 schwerkettigen konstanten Regionssequenzen (Hinges, C_H2 und C_H3) besteht. Die VCAM 2D-IgG DNA Sequenz und ihre übersetzte Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NR: 9 gezeigt. 8 veranschaulicht die Fusionsproteinstruktur. Das Fusionsprotein wurde mithilfe rekombinanter Techniken, wie im nachfolgenden beschrieben, konstruiert.
ISOLIERUNG VON cDNA AUS HUMAN IgG1 SCHWERKETTIGER REGION UND KONSTRUKTION VON PLASMID pSAB144
Um eine cDNA Kopie der Human IgG1 schwerkettigen Region zu isolieren, wurde RNA aus COS 7 Zellen hergestellt, welche vorübergehend mit dem Plasmid VCAM1-IgG1 (auch bekannt als pSAB133) transfektioniert waren. Die Konstruktion des Plasmids VCRM1-IgG1 ist in der PCT Patentanmeldung WO 90/13300 beschrieben. Die RNA wurde reverse transkribiert, wobei cDNA unter Verwenden Reverser Transcriptase und zufälliger Hexamere als Primer erzeugt wurde. Nach 30 Minuten bei 42°C wurde die Reverse Transkriptase Reaktion durch 5 minütige Inkubation der Reaktion bei 95°C beendet. Die cDNA wurde dann mittels PCR (Polymerasekettenreaktion, siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning, Band 3, Seiten 14,1-14,35 (Gold Spring Harbor; 1989)) unter Verwenden der folgenden Kinaseprimer amplifiziert: 370-31 (SEQ ID NR: 10):
5'TCGTC GAC AAA ACT CAC ACA TGC C
Asp Lys Thr His Thr Cys
welcher eine SalI Stelle enthält, und
370-32 (SEQ ID NR: 11):
5' GTAAATGAGT GCGGCGGCCG CCAA,
welcher das Carboxy terminale Lysin der IgG1 schwerkettigen konstanten Region codiert, gefolgt von einer NotI Stelle.
Die PCR amplifizierte cDNA wurde mittels Agarosegelelektrophorese und Glaskugeleluntion zum Klonieren in Plasmid pNNO₃ gereinigt. Plasmid pNNO₃ wurde konstruiert, indem die synthetische Polylinkersequenz aus dem kommerziell erhältlichen Plasmid pUC8 (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) mittels Restriktionsendonukleaseverdauung entfernt wurde, und die synthetische Polylinkersequenz durch die folgende neue synthetische Sequenz (SEQ ID NR: 12) ersetzt wurde:
GCGGCCGCGG TCCAACCACC AATCTCAAAG CTTGGTACCC GGGAATTCAG ATCTGCAGCA TGCTCGAGCT CTAGATATCG ATTCCATGGA TCCTCACATC CCAATCCGCG GCCGC.
Das gereinigte PCR amplifizierte cDNA Fragment wurde an pNNO₃ ligasiert, welches mit EcoRV gespalten, entphosphoryliert und mittels Niedrigschmelzagarosegelelektrophorese gereinigt worden war. Die Ligasierungsreaktion wurde verwendet, E. coli JA221 zu transformieren, und die sich ergebenden Kolonien wurden im Hinblick auf ein Plasmid gescreent, welches eine Insertion von annähernd 700 bp enthielt. Die Identität der korrekten Insertion wurde mittels DNA Sequenzanalyse bestätigt, und das Plasmid wurde als pSAB144 bezeichnet.
KONSTRUKTION DES PLASMIDS pSAB142
Das Plasmid pSAB142 wurde folgendermaßen konstruiert. CDNA, hergestellt aus mit pSAB133 transfektionierten COS Zellen (wie in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben) wurde PCR Amplifizierung unter Verwenden von Oligonukleotiden 370-01 und 370-29 ausgesetzt. Oligonukleotid 370-01 umfaßt eine NotI Stelle und die Nukleotide, die den Aminosäuren 1 bis 7 der VCAM-1 Signalsequenz entsprechen (SEQ ID NR: 13):
5' GAGCTCGAGGCGGCCGCACCATGCCTGGGAAGATGGTCGTG
MetProGLyLysMetValVal
Oligonukleotid 370-29 entspricht den VCAM-1 Aminosäuren 214-219 und umfaßt eine SalI Stelle (SEQ ID NR: 14):
5'AA GTC GAC TTG CAA TTC TTT TAC.
Das amplifizierte DNA Fragment wurde an das Vektorfragment von pNNO₃ ligasiert, mittels EcoRV gespalten.
KONSTRUKTION VON pSAB132
pJOD-S (Barsoum, J., DNA und Cell Biol., 9, Seiten 293-300 (1990)) wurde modifiziert, wobei eine einzige NotI Stelle stromabwärts von dem späten Hauptadenoviruspromotor eingesetzt wurde, so daß NotI Fragmente in den Expressionsvektor eingefügt werden konnten. pJOD-S wurde durch NotI Spaltung der Plasmid DNA linearisiert. Die heraustretenden 5' Enden wurden unter Verwenden von Mung Bean Nuclease mit glatten Enden versehen, und das linearisierte DNA Fragment wurde mittels Niedrigschmelztemperaturagarosegelelektrophorese gereinigt. Das DNA Fragment wurde unter Verwenden von T4 DNA Lipase religasiert. Die ligasierten Moleküle wurden dann in E. coli JA221 transformiert. Die Kolonien wurden in Bezug auf das Fehlen einer NotI Stelle gescreent. Der sich ergebende Vektor wurde als pJOD-S delta NotI bezeichnet. pJOD-8 delta NotI wurde unter Verwenden von SalI linearisiert, und die 5' Enden wurden entphosphoryliert, wobei alkalische Kalbsphosphatase verwendet wurde. Das linearisierte DNA Fragment wurde mit Niedrigschmelztemperaturgelelektrophorese gereinigt und in der Anwesenheit von phosphoryliertem Oligonucleotid ACE175 ligasiert, welches die folgende Sequenz hat (SEQ ID NR: 15):
TCGACGCGGC CGCG
Die Ligasierungsmischung wurde in E. coli JA221 transformiert, und die Kolonien wurden in Bezug auf das Vorhandensein eines Plasmids mit einer NotI Stelle gescreent. Das gewünschte Plasmid wurde mit pMDR901 bezeichnet.
Um die beiden SV40 Verstärkerwiederholungen in dem SV40 Promotor zu löschen, welcher Transkription der DHFR cDNA kontrolliert, pMDR901 und pJOD_Δe-tPA (Barsoum, DNA and Cell Biol., 9, Seiten 293-300 (1990)), wurden beide mit-AatII und DraIII gespalten. Das 2578 bp AatII-DraIII Fragment von pMDR901 und das 5424 bp AatII-DraIII Fragment von pJOD_Δe-tPA wurden mittels Niedrigschmelztemperaturgelelelektrophorese isoliert und zusammen ligasiert. Im Anschluß an die Transformation in E. coli JA221 wurde das sich ergebende Plasmid, pMDR902, isoliert. pSAB132 wurde dann gebildet, indem das EcoRI-NotI Fragment von pMDR902 eliminiert wurde, welches den späten Adenovirushauptpromotor enthält, und indem es mit einem 839 bp EcoRI-NotI Fragment aus Plasmid pCMV-B (Clontech, Palo Alto, California), welches den unmittelbaren frühen Humancytomegalovirus Promotor und Verstärker enthält, ersetzt wurde.
KONSTRUKTION VON pSAB146
pSAB144 wurde mit SalI und NotI gespalten, und das 693 bp Fragment isoliert.: pSAB142 wurde mit NotI und SalI gespalten, und das 664 bp Fragment wurde isoliert. Die beiden Fragmente wurden zu pSAB132 ligasiert, welches mit NotI gespalten worden war, und die 5' Termini wurden durch alkalische Kalbsphosphatase entphosphoryliert. Das sich ergebende Plasmid, pSAB146, enthielt die DNA Sequenz, die die VCAM-1 Signalsequenz, die aminoterminalen 219 Aminosäuren des reifen VCAM-1, 10 Aminosäuren der Gerüstregion von IgG1 und die C_H2 und C_H3 konstanten Domänen von IgG1 codiert.
HERSTELLUNG VON VCAM 2D-IgG AUS EINER STABIL TRANSFORMIERTEN CHO ZELLLINIE
Es wurde ein rekombinanter 2D-IgG Expressionsvektor, wie im nachfolgenden beschrieben, konstruiert und in CHO Zellen unter Herstellen einer Zelllinie, welche kontinuierlich VCAM 2D-IgG ausscheidet, transfektioniert.
Das 1,357 kb NotI Fragment, welches die VCAM 2D-IgG codierende Sequenz von pSAB146 enthält, wurde mithilfe von Agarosegelelektrophorese gereinigt. Dieses Fragment wurde in die NotI Klonierungsstelle des Expressionsvektors pMDR901 ligasiert, welcher den späten Adenovirus-2-Hauptpromotor für heterologe Genexpression und den selektierbaren amplifizierbaren Dihydrofolatreduktase (dhfr) Marker verwendet. Die ligasierte DNA wurde verwendet, E. coli DH5 zu transformieren. Kolonien, welche das Plasmid mit der gewünschten, korrekt orientierten Insertion enthielten, wurden durch das Vorhandensein von 5853 und 3734 bp bei Verdauung mit HindIII identifiziert, und 4301, 2555, 2293 und 438 bp Fragmente bei Verdauung mit BgIII. Der sich ergebende rekombinante VCAM 2D-IgG Expressionsvektor wurde als pEAG100 bezeichnet. Die Identität der korrekten Insertion wurde mittels DNA Sequenzanalyse bestätigt.
Das rekombinante Expressionsplasmid pEAG100 wurde in CHO Zellen, denen es an dhfr fehlte, gemäß dem veröffentlichten Protokoll von J. Barsoum (DNA Cell Biol 9: 293-300, 1990) mit den folgenden Änderungen elektroporatisiert: 200 µg von PvuI-linearisiertem pEAG100 Plasmid und 200 µg von beschallter Salmspermium DNA wurden bei dem Elektroporationsprotokoll verwendet. Zusätzlich wurden Zellen in mit 200 nM Methotrexat ergänztem alph-Vollmedium selektiert.
Um die Expressionsspiegel von ausgeschiedenem VCAM 2D-IgG zu bestimmen, wurden Klone auf eine flachen Mikrotiterbodenplatte mit 96 Vertiefungen übertragen, bis zur Konfluenz gezüchtet und mithilfe des im nachfolgenden beschriebenen ELISA untersucht.
Vertiefungen von Immulon 2 Platten (Dynatech, Chantilly, Virginia) wurden jeweils mit Anti-VCAM MAb 4B9 überzogen (isoliert und auf Protein A Sepharose gereinigt, wie von Carlos et al, 1990 [56] beschrieben), mit 100 µl von Anti-VCAM 4B9 MAb verdünnt zu 10 µg/ml in 0,05 M Natriumcarbonat/Bicarbonatpuffer, pH 9,6, überzogen, mit Parafilm bedeckt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurde der Platteninhalt abgelassen und mit 200 µl/Vertiefung eines Blockierungspuffers blockiert (5% fötales Kalbsserum in 1 × PBS), welcher durch ein 2 µl Filter filtriert worden war. Der Puffer wurde nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur entfernt, und die Platten wurden zweimal mit einer Lösung von 0,05 Tween-20 in 1 × PBS gewaschen. Konditioniertes Medium wurde zu verschiedenen Verdünnungen hinzugefügt. Als eine positive Kontrolle war ein Anti-Maus Ig auch mit einbezogen. Blockpuffer und LFA-3TIP bildeten negative Kontrollen. Die Proben und Kontrollen wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Platten wurden dann zweimal mit einer Lösung von 0,05% Tween-20 in 1 × PBS gewaschen. Jede Vertiefung, mit Ausnahme der positiven Kontrollvertiefung, wurde dann mit 50 µl einer 1:2000 Verdünnung von HRP-Donkey Anti-Human IgG (H + L) (Jackson Immune Research Laboratories, Inc.; West Grove, Pennsylvania) in Blockierungspuffer befüllt. Die positive Kontrollvertiefung wurde mit 50 µl einer 1:2000 Verdünnung von HRP-Ziegen-Anti-Maus IgG (H + L)(Jackson Immune Research Laboratories, Inc.; West Grove, Pennsylvania) in Blockierungspuffer befüllt. Die Platten wurden dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Die HRP konjugierten Ab Lösungen wurden entfernt, und die Vertiefungen wurden zweimal mit 0,05% Tween-20 in 1 × PBS gewaschen. Dann wurden 100 µl HRP-Substratpuffer zu jeder Vertiefung bei Raumtemperatur hinzugegeben. HRP-Substratpuffer wurde folgendermaßen hergestellt: 0,5 ml 42 mM 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), (ICN Immunobiologicals, Lisle, South Carolina, Katalognr. 980501) in DMSO (Aldrich) wurde langsam zu 50 ml von Substratpuffer (0,1 M Natriumacetat/Zitronensäure, pH 4,9) hinzugegeben, gefolgt von Zugabe von 7,5 µl 30% Wasserstoffperoxid (Sigma, Katalognr. H-1009).
Die Entwicklung einer blauen Farbe in jeder Vertiefung wurde auf einem Mikrotiterplattenleser bei 650 nm kontrolliert. Nach 7-10 Minuten wurde die Entwicklung durch die Zugabe von 100 µl 2N Schwefelsäure beendet. Die sich ergebende gelbe Farbe wurde bei 450 nm auf einem Mikrotiterplattenleser abgelesen. Es wurde eine negative Kontrollvertiefung für die Bestimmung des Blindwerts der Maschine verwendet.
REINIGUNG VON VCAM 2D-IgG
CHO Zellen, die VCAM 2D-IgG exprimieren, wurden in Rollflaschen auf Collagenkugeln gezüchtet. Konditioniertes Medium (5 Liter) wurde zu 500 ml unter Verwenden eines Amicon S1Y10 Spiralultrafiltrationseinsatzes (Amicon, Danvers, MA) konzentriert. Das Konzentrat wurde mit 11 Pierce Protein A Bindungspuffer (Pierce, Rockford, IL) verdünnt und auf eine 10 ml Protein A Säule (Sepharose 4 Fast Flow, Pharmacia, Piscataway, NJ) schwerkraftbeschickt. Die Säule wurde 9mal mit 10 ml Protein A Bindungspuffer gewaschen und dann 7mal mit 10 ml PBS. VCAM 2D-IgG wurde mit 12 5 ml Stufen eluiert, welche 25 mM H₃PO₄ pH 2,8, 100 mM NaCl enthielten. Die neutralisierten Proben wurden durch Hinzugeben von 0,5 M Na₂HPO₄ pH 8,6 zu 25 mM neutralisiert. Die Fraktionen wurden in Bezug auf das Absorptionsvermögen bei 280 nm und mittels SDS-PAGE analysiert. Die drei Peakfraktionen von höchster Reinheit wurden zusammengegeben, filtriert, in Aliquote gebracht und bei –70°C gelagert. Durch SDS-PAGE war das Produkt mehr als 95% rein. Das Material enthielt weniger als 1 Endotoxineinheit pro mg Protein. In einigen Fällen war es notwendig, das Protein A Eluatprodukt auf Q-Sepharose FF (Pharmacia) weiter zu reinigen. Das Protein A Eluat wurde mit 3 Volumenteilen 25 mM Tris HCl pH 8,0 verdünnt und auf eine Q-Sepharose FF Säule mit 10 mg VCAM 2D-IgG pro ml Harz geladen. Das VCAM 2D-IgG wurde dann von der Q-Sepharose mit PBS eluiert.
BEWERTUNG VON VCAM 2D-IgG
Milzzellsuspensionen wurden von diabetischen Donatoren oder aus nicht diabetischen Kontrollen, wie zuvor beschrieben, hergestellt. Milzzellen wurden intravenös (2 – 3 × 10⁷ in 0,2 ml PBS) injiziert und entweder mit 100 µg VCAM 2D-IgG oder 100 µg irrelevanter LFA-3Ig Fusionsproteinkontrolle vorbehandelt. Eine weitere Gruppe erhielt PBS allein ohne übertragene Zellen. Das Fusiansprotein LFA-3Ig (LFA-3TIP) wurde isoliert und wie in PCT US92/02050 und Miller et al., 1993 [57] beschrieben, gereinigt. Das VCAM 2D-IgG Fusionsprotein oder irrelevantes. LFA-3Ig Protein wurde in einer Dosis von 100 µg/0,2 ml intraperitoneal zweimal wöchenlich bis zum Tag 17 verabreicht. Diese Konzentration war ausreichend, einen Serumspiegel von Fusionsprotein zu liefern, der ausreicht, VLA4-positive Zellen zu sättigen, wobei die Serenspiegel mithilfe des zuvor beschriebenen ELISA bestimmt wurden. Diabetesanfall wurde, wie zuvor beschrieben, kontrolliert.
Die Ergebnisse der Bewertung sind in 7 dargestellt. Wie in dieser Figur gezeigt, inhibiert das VCAM 2D-IgG Fusionsprotein beträchtlich den Diabetesanfall in Zellempfängern von diabetischen Donormäusen (D/VCAM-Ig, offene Kreise) bei 60% Vorkommen bis zum Tag 30 post-Transfer, verglichen mit den Mäusen, welche Zellen vom diabetischen Donor (Daten nicht gezeigt) und LFA-3Ig irrelevantes Kontroll Ig Fusionsprotein (D/LFA-3 Ig) erhielten, welches schon 60% Vorkommen bis zum Tag 15 post-Transfer erzielt hatte. Mäuse, welche keine Zellen (nur PBS) erhielten, entwickelten keine Krankheit. Es gab nur n = 5 Mäuse pro experimentelle Gruppe.
Zusammengefaßt, die gewünschten Anti-VLA4 Antikörper schützten gegen Diabeteskrankheitsanfall (Beispiele 1, 3 und 4) und waren wirksam beim Verzögern des Fortschreitens von Insulitis (Beispiel 2) bei Verwenden eines Murinmodels für Humandiabetes. Das gewünschte lösliche VCAM-Derivat (VCAM 2D-IgG) eignete sich auch beim Schützen gegen Diabeteskrankheitsanfall (Beispiel 5). Die vorhergehenden Beispiele dienen als eine Veranschaulichung der erfindungsgemäßen Verwendung und sind nicht als eine Begrenzung der im nachfolgenden beanspruchten Erfindung dargestellt. Aus der vorhergehenden Offenbarung sind zahlreiche Modifikationen und zusätzliche Ausführungsformen der Erfindung den Fachleuten offensichtlich.
Beispielsweise können die verwendete aktuelle Dosierung, der verwendete Typ des Antikörpers oder Antikörperfragments, die Verabreichungsform, genaue Zusammensetzung, Zeit und Verabreichungsart der Behandlung und viele andere Merkmale variiert werden, ohne von der zuvor angegebenen Beschreibung abzuweichen. Alle derartigen Modifikationen und zusätzlichen Ausführungsformen liegen innerhalb der Absicht dieser Anmeldung und innerhalb des Umfangs der angefügten Ansprüche.
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[57] Miller et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 211.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Anti-VLA4-Antikörpers, der sich dazu eignet, an das B1- oder B2-epitope die α₄-Untereinheit von VLA4 zu binden, für die Herstellung eines Medikaments, das im Wesentlichen aus diesem Antikörper in einem pharmazeutisch verträglichen Träger besteht, für die Verwendung als alleiniges Medikament bei der Verhütung von insulinabhängigem (Typ I) Diabetes bei einem Vordiabetes-Individuum.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Anti-VL4A-Antikörper aus der Gruppe aus HP1/2, HP2/1, HP2/4, L25 und P4C2 ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Anti-VL4A-Antikörper HP1/2 oder ein Fragment davon ist, fähig an das B1- oder B2-Epitope der α₄-Untereinheit von VLA4 zu binden.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Anti-VLA4-Antikörper ein humanisierter HP1/2-Antikörper oder ein Fragment davon ist, fähig an das B1- oder B2-Epitope der α₄-Untereinheit von VLA4 zu binden.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament in einer Dosierung verabreicht wird, die etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg, bezogen auf das Gewicht des Vordiabetes-Individuums, liefert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, VLA4-positive Zellen in dem peripheralen Blut während einer Dauer von 1 bis 14 Tagen zu überziehen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, einen Plasmaspiegel des Antikörpers in dem Vordiabetes-Individuum von mindestens 1 µg/ml zu liefern.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament vor der Entwicklung von offensichtlicher Diabetes, gemessen durch einen Serumglucosespiegel von weniger als etwa 250 mg/dl, verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Vordiabetes-Individuum ein Mensch ist.
Verwendung eines Antikörpers, eines rekombinanten Antikörpers, eines chimären Antikörpers, von Fragmenten derartiger Antikörper oder eines VCAM 2D-IgG-Fusionsproteins, fähig an das B1- oder B2-Epitope der α₄-Untereinheit von VLA4 zu binden, oder von Kombinationen aus einem der Vorhergehenden für die Herstellung eines Medikaments, das im Wesentlichen aus diesem Antikörper, rekombinantem Antikörper, chimärem Antikörper, Fragmenten derartiger Antikörper oder einem VCAM 2D-IgG-Fusionsprotein in einem pharmazeutisch verträglichen Träger besteht, für die Verwendung als alleiniges Medikament bei der Behandlung von Diabetes.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei der Antikörper aus monoklonalem Antikörper HP1/2, Fab, Fab', F(ab')₂ oder F(v)-Fragmenten eines derartigen Antikörpers ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Medikament eine Vielzahl von Anti-VLA4 monoklonalen Antikörpern oder VLA4-Bindungsfragmenten davon umfasst.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Medikament in einer Dosierung verabreicht wird, die etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg des Antikörpers oder Antikörperfragments, basierend auf dem Gewicht des empfänglichen Säugers, liefert.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Medikament in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, VLA4-positive Zellen in dem peripheralen Blut während einer Dauer von 1 bis 14 Tagen zu überziehen.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Medikament in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, einen Plasmaspiegel des Antikörpers in dem Säuger von mindestens 1 µg/ml über eine Dauer von 1 bis 14 Tagen zu liefern.