JP2013166765A - ステロイド節約剤およびそれを使用する方法 - Google Patents

ステロイド節約剤およびそれを使用する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、クローン病（ＣＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症の治療において、ステロイド療法に対する必要性を減少および／または排除するためのステロイド節約剤の提供。
【解決手段】モノクローナル抗体の免疫学的に活性なフラグメント、特にα４β１インテグリンが結合したナタリズマブの使用。
【選択図】図１

Description

本発明は、一般的に、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症の治療用薬剤の調製のためのステロイド節約剤の使用方法に関するものであり、それを必要とする患者にステロイド節約型免疫グロブリンまたは小分子組成物を投与する工程を含む。本発明はまた、一般的に、これらの状態の治療のための併用療法に関する。
炎症は、感染または損傷に対する血管新生化組織の応答であり、血管内皮細胞への白血球の付着および周囲組織へのその浸潤による影響を受ける。正常の炎症では、浸潤白血球は毒性の媒介物を放出して侵入生物を殺し、壊死組織片および死細胞を貪食し、組織修復および免疫応答で役割を果たす。しかしながら、病的な炎症では、浸潤白血球は過剰応答し、重篤または致命的損傷をもたらし得る。例えば、Ｈｉｃｋｅｙ、Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＩＩ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９０）を参照のこと。
インテグリンは、細胞接着、免疫細胞の移動および活性化に関与する細胞表面糖タンパク質のファミリーである。アルファ−４インテグリンは、好中球を除くすべての循環白血球によって発現され、ベータ−１（β１）またはベータ−７（β７）インテグリンサブユニットとともにヘテロ二量体受容体を形成する。アルファ−４ベータ−１（α４β１）およびアルファ−４ベータ−７（α４β７）は血管内皮を貫通する白血球の移動に役割を果たし（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、Ｃｅｌｌ １９９４、７６：３０１〜１４頁、Ｂｕｔｃｈｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６、２７２：６０〜６頁）、実質内の細胞活性化および生存に寄与する（Ｄａｍｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３、１５１：２３６８〜７９頁、Ｋｏｏｐｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４、１５２：３７６０〜７頁、Ｌｅｕｓｓｉｎｋら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２００２、１０３：１３１〜１３６頁）。α４β１は、リンパ球、単球、マクロファージ、マスト細胞、好塩基球および好酸球上で主に発現する。
α４β１（超遅延抗原（very late antigen）−４、ＶＬＡ−４としても知られている）は、血管細胞接着分子１に結合する（Ｌｏｂｂら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４、９４：１７２２〜８頁）が、これは、慢性炎症の多くの部位において血管内皮によって発現される（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａら、１９９３ Ａｎｎｕ．Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１：７６７〜８０４頁、Ｐｏｓｔｉｇｏら、１９９３ Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４：７２３〜３５頁）。α４β１は、フィブロネクチンおよび他の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を含む他のリガンドを有する。
α４β７二量体は、粘膜アドレシン細胞接着分子（ＭＡｄＣＡＭ−１）と相互作用し、リンパ球の腸へのホーミングを媒介する（Ｆａｒｓｔａｄら、１９９７ Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１５０：１８７〜９９頁、Ｉｓｓｅｋｕｔｚら、１９９１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：４１７８〜８４頁）。血管内皮上のＭＡｄＣＡＭ−１の発現は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有する患者の腸管における炎症部位においても増加する（Ｂｒｉｓｋｉｎら、１９９７ Ａｍ，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１５１：９７〜１１０頁）。
α４インテグリンのような接着分子は、治療薬の有望な標的である。例えば、α４インテグリンがサブユニットであるＶＬＡ−４受容体は、脳内皮細胞に存在するリガンドとの相互作用のため、重要な標的である。脳の炎症により生じる疾患および状態は、特に重度の結果を有する。他の例において、α４β７インテグリン二量体は、胃腸管におけるリンパ球ホーミングおよび病的炎症に関与するため、重要な標的である。
α４β１インテグリンは、活性化リンパ球および単球の細胞外表面上に発現され、これらは、多発性硬化症（ＭＳ）に伴う急性炎症性脳病変および血液脳関門（ＢＢＢ）の崩壊の病因に関与している（Ｃｏｌｅｓら、１９９９ Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４６（３）：２９６〜３０４頁）。α４インテグリンに対する薬剤の抗炎症能がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で試験されている（Ｙｅｄｎｏｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ １９９２、３５６：６３〜６６頁、１９９８年１１月２４日発行のＢｅｎｄｉｇらへの米国特許第５８４０２９９号および１９９９年１２月１４日発行のＴｈｏｒｓｅｔｔらへの米国特許第６００１８０９号を参照）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、α４インテグリン抗体が脳内皮細胞へのリンパ球の付着を阻害することが示された。多発性硬化症を模倣する人工的に誘発された状態である実験的アレルギー脳脊髄炎（ＥＡＥ）を有する動物に対するα４インテグリン抗体の効果を試験する実験で、抗α４インテグリン抗体の投与によって動物における脳の炎症と後に続く麻痺が防止されることが示された。まとめると、これらの実験によって、抗α４インテグリン抗体は多発性硬化症および他の炎症性疾患および障害の治療のための有望かつ有用な治療薬であることが認められている。
米国特許第５，８４０，２９９号 米国特許第６，００１，８０９号
Ｈｉｃｋｅｙ、Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＩＩ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９０） Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、Ｃｅｌｌ １９９４、７６：３０１〜１４頁、Ｂｕｔｃｈｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６、２７２：６０〜６頁 Ｄａｍｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３、１５１：２３６８〜７９頁 Ｋｏｏｐｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４、１５２：３７６０〜７頁 Ｌｅｕｓｓｉｎｋら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２００２、１０３：１３１〜１３６頁 Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａら、１９９３ Ａｎｎｕ．Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１：７６７〜８０４頁 Ｐｏｓｔｉｇｏら、１９９３ Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４：７２３〜３５頁 Ｌｏｂｂら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４、９４：１７２２〜８頁 Ｆａｒｓｔａｄら、１９９７ Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１５０：１８７〜９９頁 Ｉｓｓｅｋｕｔｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：４１７８〜８４頁 Ｂｒｉｓｋｉｎら、１９９７ Ａｍ，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１５１：９７〜１１０頁 Ｃｏｌｅｓら、１９９９ Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４３（３）：２９６〜３０４頁 Ｙｅｄｎｏｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ １９９２、３５６：６３〜６６頁
ステロイドは、炎症状態の治療にしばしば適応されるが、長期間安全に使用することはできない。ステロイドは、免疫系を弱めながら炎症を低減させる。ステロイドを服用している患者は、ステロイドに対して依存性、不耐性または不応性になる可能性がある。ステロイドの例としては、ヒドロコルチゾン、ベタメタゾン、フルオロメトロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、メドリゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、リメキソロンおよびトリアムシノロンなどがある。
多くの深刻な副作用がステロイドの使用には付きものである。ステロイドの長期の使用は、長期にわたる副作用の危険性が高いため断念される。よくみられる副作用のいくつかとして、免疫抑制、糖尿病、体重増加、あくね、白内障、高血圧、精神病、多毛症、気分変動、胃炎、筋脱力、易挫傷、骨粗鬆症、感染および無菌性壊死のリスクの増加などである。２カ月間以上ステロイドを服用する患者は、骨粗鬆症を予防するために、カルシウムおよびビタミンＤ補助食品またはビホスホネートなどの他の薬物をしばしば服用しなければならない。小児におけるステロイドの長期の使用は、発育の遅滞および成人で発生する副作用のリスクをもたらす。
現在までのところ、例えば、クローン病、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症などの炎症状態を、ステロイドを必要としないで安全かつ有効に治療することを可能にしたり、あるいはステロイドの漸減および／または中止を可能にする療法は発見されていない。統計的に有意な量のステロイドによる治療に対して無応答性、不耐性または依存性である対象におけるステロイドの必要を低減または排除するためのステロイド節約剤およびこれらの薬剤を用いる方法は、炎症性疾患の治療のために必要であり、探求し続けられている。
上記のことに基づいて、ステロイドの使用を必要とする炎症性疾患を効果的に治療または抑制して、患者が長い寿命とより良い生活の質を達成することができるように、これらの疾患を治療する新規の組成物および方法が必要である。
本発明は、一般的に、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症の治療用の薬剤の調製のためのステロイド節約剤の使用方法に関するものであり、ステロイドの使用を低減または排除することを可能にする薬剤を投与する工程を含む。
本発明の薬剤がステロイド節約型であることが意外にも発見された。ステロイドは、しばしば炎症状態の治療に向くことが示されているが、長期間に安全に使用することはできない。ステロイドは、免疫系を弱める炎症を低減させる。ステロイドを服用している患者は、ステロイドに対して依存性、不耐性または不応性になる可能性がある。
したがって、本発明の薬剤は、クローン病、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症などの炎症状態の安全かつ有効な治療を、ステロイドの必要を必要としないで可能にするか、あるいはステロイドの漸減および／または中止を可能にする。
１つの実施形態において、ステロイド節約剤は、抗体またはその免疫学的に活性なフラグメント、好ましくは抗α４免疫グロブリンであってよい。抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントは、好ましくはナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））またはその免疫学的に活性なフラグメントである。したがって、抗α４免疫グロブリンは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症からなる群から選択される疾患の治療のために対象に投与することができる。治療上有効な量を投与すると、抗α４免疫グロブリンは、対象のステロイド療法を漸減することを可能にする。したがって、抗α４免疫グロブリンを本発明により対象に投与すると、対象は抗α４免疫グロブリンを投与しない場合に必要な量より少ない治療上有効な量のステロイドを必要とすることが驚くべきことに発見された。
他の実施形態において、ステロイド節約剤は本明細書に記載されるような小分子であってよい。したがって、該小分子は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症からなる群から選択される疾患の治療のために対象に投与することができる。本明細書に記載するような小分子は、治療上有効な量を投与すると、対象のステロイド療法を漸減することを可能にする。したがって、本明細書に記載されるような小分子を本発明による対象に投与すると、対象は該化合物を投与しない場合に必要な量より少ない治療上有効な量のステロイドを必要とすることが驚くべきことに発見された。
本発明はまた、一般的に、これらの状態の治療のための併用療法に関する。したがって、本発明のステロイド節約剤は、他のステロイド節約剤と併用して、ならびに免疫抑制剤（但し、免疫抑制剤はステロイドではない）、抗ＴＮＦ組成物、５−ＡＳＡ組成物およびその組合せと併用して、投与することができる。ステロイド節約剤は、本明細書で以下に記載するような小分子であり得る。別法では、ステロイド節約剤は、ＶＬＡ−４に対する抗体もしくはその免疫学的に活性なフラグメント、またはＶＬＡ−４に結合し、それにより同族リガンドに結合することを妨げるポリペプチドであってよい。
本発明はさらに、医薬品として許容できる担体および本明細書に開示されるような治療上有効な量のステロイド節約剤を含み、それを必要としている対象に投与したときステロイドの使用を低減または排除することを可能にする医薬品組成物に関する。
本発明の組成物は、経口、非経口（例えば、皮下、硬膜下、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、腹腔内、大脳内、動脈内または病変内の投与ルート）、局所、局在型（例えば、外科的適用または外科的坐剤）、腸および肺（例えば、エアゾール剤、吸入剤または散剤）を含む様々な投与ルートにより投与することができる。好ましくは、本発明の組成物は、非経口的に投与される。
本発明のこれらおよび他の目的、利点ならびに特徴は、以下により完全に記載されている方法および処方の詳細を読むことによって当業者には明らかになるであろう。
クローン病試験において患者に投与したときのナタリズマブに対する反応を示すグラフである（実施例２を参照）。 クローン病試験において患者に投与したときのナタリズマブに対する反応の寛解のレベルを示すグラフである（実施例２を参照）。 ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ集団（ＩＴＴ）、Ｃ反応性タンパク質上昇集団（ＣＲＰ）、免疫抑制剤に対して無応答性または不耐性の集団（免疫ＵＩ）およびステロイドに対して無応答性、不耐性または依存性の集団（ステロイドＵＩＤ）などの種々の集団におけるクローン病試験において患者に投与したときのナタリズマブに対する反応の寛解のレベルを示すグラフである（実施例２を参照）。これらの分類は、これらの薬剤についての患者の以前の使用歴に基づくものであった。
本発明の方法および治療剤を説明する前に、本発明は記載される特定の使用および治療剤に限定されず、したがって、もちろん変化し得るものと理解すべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で用いた用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであって、限定することを意図するものでないことも理解すべきである。
数値の範囲が示されている場合、他で明確に記載の無い限り、当該範囲の上限および下限の間の下限の単位の十分の一までの各間の値、ならびに当該指定範囲内の他の指定または間の値は本発明に含まれると理解される。これらのより小さい範囲の上および下限は、指定された範囲における特に除外された限界に属するより小さいものに独立に含まれることがある。指定された範囲が限界の１つまたは両方を含む場合、それらの含まれた限界の両方のいずれかを除外する範囲も本発明に含まれる。引用された範囲内に入るいずれかの値も予想される。
特に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で記載されるものと類似または同等な方法および材料も本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料が以下に説明される。本明細書で言及したすべての刊行物は、その刊行物がそれに関連して挙げられている方法および／または材料を開示し説明するために、参照により本明細書に合体される。
１．略語および定義
この詳細な説明に従って、以下の略語および定義が適用される。本明細書で用いられる場合、文脈が明確に別に要求するものでない限り、「ａ」「ａｎ」「ｔｈｅ（該）」の単数形は複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「an antibody(抗体)」という表示は複数のそのような抗体を含み、「the dosage(該用量)」は１つまたは複数の用量を含み、当業者に知られているものに相当する等である。
本明細書で述べる刊行物は、本出願の出願日前の開示のためにだけ記載する。本明細書におけるいずれも、本明細書のいかなる部分も先行の発明に基づくという理由により上記刊行物に先行する資格が本発明にないと認められると解釈すべきでない。さらに、記載した刊行物の日付は、実際の公表日と異なる可能性があり、これは独立に確認する必要がある。
１．１ 略語
以下の略語を本明細書で用いた。
ＡＣＴＨ 副腎皮質刺激ホルモン
ＡＮＡ 抗核抗体
ａｑまたはａｑ．水性
ＢＢＢ 血液脳関門
Ｃ 免疫グロブリンの定常領域
ＣＤ クローン病
ＣＤＡＩ クローン病活動度指数
ｃＤＮＡ 相補的デオキシリボ核酸
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＣＤＲ１ 相補性決定領域１
ＣＤＲ２ 相補性決定領域２
ＣＤＲ３ 相補性決定領域３
ＣＮＳ 中枢神経系
ＣＯＸ−２ シクロオキシゲナーゼ−２
ＣＲＰ Ｃ反応性タンパク質
ＣＳ コケーン症候群
ＣＳＦ コロニー刺激因子
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＥＡＥ 実験的自己免疫脳脊髄炎
ＥＢＮＡ２ エプスタイン−バーウイルス核抗原２
ＥＣＭ 細胞外マトリックス
ＥＬＡＭＳ 内皮接着分子
ＥＭ 電子顕微鏡
ＦＡＣＳ 蛍光活性化細胞解析分取装置
ＦＲ フレームワーク領域
ＦＲ１ フレームワーク領域１
ＦＲ２ フレームワーク領域２
ＦＲ３ フレームワーク領域３
ＧＭ−ＣＳＦ 顆粒球単球コロニー刺激因子
ＧＶＨＤ 移植片対宿主病
ｈまたはｈｒ 時間
Ｈ 免疫グロブリンの重鎖
ＨＡＭＡ ヒト抗マウス抗体
Ｈ−Ｅ ヘマトキシリン−エオシン
ｈｅｘＡ ヘキソアミニダーゼＡ
ＨＩＣ 疎水性クロマトグラフィー
ＨＩＧ ヒト免疫グロブリン
ＨＭＳＮ ＩＶ 遺伝性運動感覚性ニューロパシーＩＶ（遺伝性多発性神経炎性失調としても知られている）
Ｈ２Ｏ 水
ＩＣＡＭ−１ 細胞間接着分子１
Ｉｇ 免疫グロブリン
ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ
ＩｇＭ 免疫グロブリンＭ
ＩＬ インターロイキン
ＩＬ−１ インターロイキン１
ＩＬ−２ インターロイキン２
ＩＬ−８ インターロイキン８
ＩＢＤ 炎症性腸疾患
ＩＢＤＱ 炎症性腸疾患質問票
ｉｍｍｕｎｏＵＩ 免疫抑制剤に対して無応答性または不耐性の集団
ＩＴＴ ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ（投与を受けたかどうかにかかわりなく、無作為化されたすべての対象を含める）
Ｌ 免疫グロブリンの軽鎖
ＬＦＡ−１ リンパ球機能関連抗原１（β２インテグリン、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８およびαＬβ２としても知られている）
ＭＡｂｓ モノクローナル抗体
Ｍａｃ−１ αＭβ２インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８としても知られている）
ＭＡｄＣＡＭ−１ 粘膜アドレシン細胞接着分子
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ マトリックス援用レーザー脱着イオン化／時間飛行質量分析
ＭＣＰ−１ 単球走化性タンパク質１
ＭｅＯＨ メタノール
ＭＩＰ−１α マクロファージ炎症性タンパク質１α
ＭＩＰ−１β マクロファージ炎症性タンパク質１β
ＭＬＤ 異染性白質ジストロフィ
ＭＳ 多発性硬化症
Ｎ 正常
ＮＳＡＩＤ 非ステロイド性抗炎症薬
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＫＵ フェニルケトン尿症
ＰＬＰ プロテロリピドタンパク質
ＲＮＡ リボ核酸
ｒｔ 室温
ＲＴ−ＰＣＲ 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＡＥ 重篤な有害事象
ＳＤＳ ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
ＳＦ−３６ 生活の質質問票
ＳＡＭＩｓ 選択的接着分子阻害剤
ｓａｔまたはｓａｔ．飽和
ｓｃＦｖ 短鎖Ｆｖフラグメント
ステロイドＵＩＤ ステロイドに対して無応答性、不耐性または依存性の集団
ＴＧＦ−β 腫瘍増殖因子β
ＴＬＣまたはｔｌｃ 薄層クロマトグラフィー
ＴＮＦ 腫瘍壊死因子
ＴＮＦ−α 腫瘍壊死因子α
ＴＮＦ−β 腫瘍壊死因子β
ＶＣＡＭ−１ 血管細胞接着分子１
ＶＨ 可変領域の重鎖
ＶＬ 可変領域の軽鎖
ＶＬＡ−４ 超遅延抗原４（アルファ−４ベータ−１、α４β１としても知られている）
１．２ 定義
２０種の天然に存在するアミノ酸の略記は、従来の慣用法に従う（ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ−Ａ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（２ｎｄ ｅｄ．、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ＆Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ、ｅｄｓ．、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．、１９９１））。２０種の通常のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α，α−二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸および他の非定型的アミノ酸も本発明のポリペプチドの適切な成分であってよい。非定型的アミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、ω−Ｎ−メチルアルギニンならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）などがある。さらに、アミノ酸は、グリコシル化、リン酸化等により修飾してよい。
本明細書で用いられるポリペプチドの表記法において、標準慣用法および慣例に従って、左方向はアミノ末端方向であり、右方向はカルボキシ末端方向である。同様に、特に断らない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と呼ばれる。ナセントＲＮＡ転写物の３’付加に対する５’の方向は、転写方向と呼ばれる。ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれる。ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
「ポリヌクレオチド配列」という句は、５’から３’末端まで読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本または二本鎖ポリマーを指す。これは、自己複製プラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマーおよび非機能性ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
次の用語は、２つ以上のポリヌクレオチド間の配列関係を説明するために用いられる。すなわち、「対照標準配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」および「実質的同一性」。「対照標準配列」は、配列の比較のための基礎として用いられる定義された配列である。対照標準配列は、例えば、配列一覧に示されている全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントとしてのより大きい配列のサブセットであってよく、あるいは完全なＤＮＡまたは遺伝子配列を含んでいてよい。一般的に、対照標準配列は、長さが少なくとも２０ヌクレオチド、しばしば長さが少なくとも２５ヌクレオチド、またしばしば長さが少なくとも５０ヌクレオチドである。２つのポリヌクレオチドは各々（１）２つのポリヌクレオチド間で類似した配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部）を含む可能性があり、（２）２つのポリヌクレオチド間で互いに異なる配列をさらに含む可能性があるので、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列の比較は、配列類似性の局所領域を特定し、比較するために、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウインドウ」にわたり比較することによって一般的に行われる。本明細書で用いられる「比較ウインドウ」は、少なくとも２０の連続ヌクレオチド位置の概念的セグメントを指し、あるポリヌクレオチド配列を少なくとも２０の連続ヌクレオチドの対照標準配列と比較することができ、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適の整列のために、対照標準配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてよい。比較ウインドウを整列するための配列の最適の整列は、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁（１９７０）の相同性整列アルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４頁（１９８８）の類似方法の調査により（各々をすべての目的のためにその全体を参照により援用する）、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）のコンピュータによる実行により、または視察により行うことができ、種々の方法により得られる最善な整列（すなわち、比較ウインドウにわたる最高の割合の配列類似性をもたらす）を選択する。「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列が比較ウインドウにわたり同一である（すなわち、ヌクレオチドごとに）ことを意味する。「配列同一性の割合」は、比較ウインドウにわたり２つの最適に整列させた配列を比較し、両配列に同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）が存在する位置の数を測定して一致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を得ることによって計算される。本明細書で用いられる「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、少なくとも２０のヌクレオチド位置の比較ウインドウにわたり、しばしば少なくとも２５〜５０ヌクレオチドのウインドウにわたり対照標準配列と比較して少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、より通常少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列の特徴を意味し、配列の同一性の割合は、対照標準配列を、比較ウインドウにわたり対照標準配列の合計２０％以下の欠失または付加を含んでいてよいポリヌクレオチド配列と比較することによって計算する。対照標準配列は、より大きい配列のサブセットであってよい。
ポリペプチドに適用される場合、「配列同一性」という用語は、ペプチドが対応する位置に同一アミノ酸を共有することを意味する。「配列類似性」という用語は、ペプチドが対応する位置に同一または類似アミノ酸を有すること（すなわち、同類置換）を意味する。「実質的同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップ重量を用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどにより最適に配列させたとき、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性またはそれ以上（例えば、９９％の配列同一性）を共有することを意味する。同一でない残基位置は、同類アミノ酸置換によって異なっていることが好ましい。「実質的同一性」という用語は、２つのペプチド配列が対応する割合の配列類似性を共有することを意味する。
本明細書で用いられる「実質的に類似」という用語は、機能的に同等のアミノ酸がポリペプチドにおける１つまたは複数のアミノ酸を置換しており、それにより、該ポリペプチドの結合特性に全く影響を及ぼさない、または比較的わずかな影響を及ぼす変化をもたらすような配列の変化を有するポリペプチドを意味する。例えば、配列内の１つまたは複数のアミノ酸残基は、類似の極性または類似のサイズの他のアミノ酸で置換することができる。
「実質的に純粋」という用語は、目的種が存在する優勢な種であり（すなわち、モル基準で、組成物中の他の個別の種より豊富である）、好ましくは実質的に精製された画分が組成物であり、目的種が存在するすべての巨大分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を含むことを意味する。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種の約８０〜９０％以上を含む。最も好ましくは、目的種は本質的な同質になるまで精製され（従来の検出方法により汚染種を組成物中に検出することができない）、組成物が単一巨大分子種から本質的になっている。
アミノ酸置換を同類または非同類と分類する目的のために、アミノ酸を次のように分類した。群１（疎水性側鎖）：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、群２（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、群ＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ、群ＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、群Ｖ（鎖配向に影響を及ぼす残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ、および群ＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。同類置換は、同じクラスのアミノ酸間の置換を伴う。非同類置換は、これらのクラスの１つのメンバーと他とを交換することである。
免疫グロブリンの成熟重および軽鎖の可変領域のアミノ酸は、それぞれＨｘおよびＬｘｘと表される。ここで、「ｘ」は、Ｋａｂａｔら、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７）および（１９９１））（以後、総称して「Ｋａｂａｔ」と呼ぶ、それらの全体を参照により援用する）のスキームに従ってアミノ酸の位置を表す数である。Ｋａｂａｔは、各サブクラスに対する抗体の多くのアミノ酸配列を列挙し、当該サブクラスにおける各残基位置において最も一般的に存在するアミノ酸を列挙する。Ｋａｂａｔは、列挙された配列における各アミノ酸に残基番号を割り当てる方法を使用し、この残基番号を割り当てる方法は、当分野における標準になっている。Ｋａｂａｔのスキームは、問題の抗体をＫａｂａｔにおけるコンセンサス配列の１つと整列させることによって、一覧に含まれていない他の抗体に拡大することができる。Ｋａｂａｔ番号付けシステムを用いることによって、異なる抗体の同等の位置におけるアミノ酸を容易に同定することができる。例えば、ヒト抗体のＬ５０位置におけるアミノ酸は、マウス抗体のアミノ酸位置Ｌ５０と同等の位置を占める。
「試薬」または「薬剤」は、リガンド受容体に結合する生物学的に活性な分子を示すのに用いる。例えば、ＶＬＡ−４受容体またはＶＣＡＭ−１と免疫反応する抗体またはそのフラグメントは、ステロイドに対して無応答性、不耐性または依存性である対象におけるステロイドの必要を排除することができる。細胞表面受容体に作用して結合することができるペプチドまたはペプチドミメティックスもしくは関連化合物も考慮され、当技術分野で知られている方法による合成により調製することができる。本明細書で述べるように、あるいは当業者に明らかなようにＶＬＡ−４受容体と反応する他の試薬も考慮される。
「ステロイド節約剤」は、本明細書で用いられる場合、ステロイドによる治療に対して無応答性、不耐性または依存性である対象におけるステロイドの必要を統計的に有意な量で低減または排除する薬剤を指す。好ましくは、そのような薬剤としては、有効な量を投与したとき、ステロイドによる治療に対して無応答性、不耐性または依存性である対象におけるステロイドの必要を低減または排除する、免疫グロブリン（例えば、抗体、抗体フラグメントおよび組換えにより生産した抗体または抗体フラグメント）、ポリペプチド（例えば、インテグリンに対するリガンドタンパク質の可溶形）および小分子などがある。これらの薬剤は、抗α４インテグリン薬（好ましくは抗α４β１または抗α４β７拮抗薬）および抗ＶＣＡＭ−１薬であってよい。しかし、本発明に関しては、そのような抗α４インテグリンおよび抗ＶＣＡＭ−１薬は、有効な量を投与したときステロイドによる治療に対して無応答性、不耐性または依存性である対象におけるステロイドの必要を低減または排除するもののみを含む。
本明細書で用いられる「抗α４インテグリン薬」という用語は、α４サブユニットを含むインテグリンに特異的に結合し、インテグリンの活性を阻害するあらゆる薬剤を指す。
「インテグリン拮抗薬」は、α４サブユニットを含むインテグリンがインテグリンリガンドおよび／または受容体に結合することを阻害するあらゆる薬剤を含む。好ましくは、インテグリン拮抗薬はα４β１二量体および／またはα４β７二量体がその同族リガンドに結合することを阻害する。そのような拮抗薬は、抗インテグリン抗体または抗体同族体を含むタンパク質およびインテグリンに対する可溶形のリガンドタンパク質などの他の分子を含み得る。α４サブユニットを含むインテグリンに対する可溶形のリガンドタンパク質は、可溶性ＶＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１融合タンパク質または二元機能ＶＣＡＭ−１／Ｉｇ融合タンパク質を含む。例えば、可溶形のインテグリンリガンドまたはそのフラグメントは、インテグリンに結合し、好ましくは細胞上のインテグリン結合部位に対して競合し、それにより抗インテグリン（例えば、ＶＬＡ−４）抗体のような拮抗薬の投与と同様な効果をもたらすために投与することができる。特に、リガンドに結合するが、インテグリン依存性シグナリングを誘発しない可溶性インテグリン突然変異体は、本発明の範囲内に含まれる。
「ナタリズマブ」または「Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）」は、全体を参照により本明細書に取り込まれる同一所有権者による米国特許第５８４０２９９号および第６０３３６６５号明細書に記載されているようにＶＬＡ−４に対するヒト化抗体である。他のＶＬＡ−４特異抗体も本明細書において考慮されている。そのようなステロイド節約型抗体および免疫グロブリンは、米国特許第６６０２５０３号および第６５５１５９３号明細書、公告済み米国特許出願番号第２００２０１９７２３３号（Ｒｅｌｔｏｎら）明細書に記載され、また本明細書でさらに述べる免疫グロブリンを含むが、これらに限定されない。
長期投与法の状況において本明細書で用いる「有効性」という用語は、特定の治療法の有効性を指す。有効性は、本発明の薬剤に反応しての疾患の経過の変化に基づいて測定することができる。例えば、ＭＳの治療において、有効性は再発寛解型ＭＳにおける再発の頻度により、またＭＲＩのような方法を用いて検出される中枢神経系の新たな病変の存非により測定することができる。
長期治療法の状況において本明細書で用いる「成功」という用語は、特定の治療法の有効性を指す。これは、有効性、毒性（例えば、製剤または投与単位の副作用および患者耐性）、患者服薬遵守等のバランスを含む。「成功」とみなされる長期投与法については、最も好ましい患者転帰を得るために患者ケアおよび有効性の種々の側面を均衡させるものでなければならない。
本明細書で用いる「特異的に結合する」という用語は、特異的結合対の１つのメンバーがその特異的結合パートナー（例えば、その結合パートナーに対して約１０００倍以上の親和力を有する）以外の分子に対して有意な結合を示さない状況を指す。本発明では、Ｎ−［Ｎ−（３−ピリジンスルホニル）−Ｌ−３，３−ジメチル−４−チアプロリル］−Ｏ−［１−メチルピペラジン−４−イルカルボニル］−Ｌ−チロシンイソプロピルエステルのような小化合物は、α４インテグリンまたはα４インテグリンを含む受容体以外のポリペプチドに有意な結合を示さない。例えば、０．３ｎＭを超える結合親和力を有するα４インテグリンに結合する本発明の方法で用いられるすべての小化合物は、α４インテグリンに特異的に結合すると言われる。
本明細書で用いる「免疫反応を誘発する」および「宿主免疫反応を誘発する」という用語は、対象への本発明の薬剤の導入による、対象におけるα４インテグリンを含む受容体に対する免疫反応の発生を指す。対象における免疫反応は、約１：１００の血清希釈度を用いて血清免疫反応性を測定した場合、無処置対照の反応性の少なくとも２倍、より好ましくは無処置対照の反応性の３倍、さらにより好ましくは無処置対照の反応性の少なくとも４倍であるα４インテグリン受容体との血清反応性によって特徴付けることができる。
「製薬上許容できる担体または賦形剤」という用語は、単に担体として作用することを意図する、すなわちそれ自体生物学的活性を有することを意図しない製剤の一部を形成させるのに用いられる化合物を意味することを意図する。製薬上許容できる担体または賦形剤は、一般的に安全かつ無毒性で、生物学的にも他の点でも望ましくないものでないものである。本明細書および特許請求の範囲で用いられる製薬上許容できる担体または賦形剤は、１つおよび複数のそのような担体を含む。
「治療すること」および「治療」という用語は、一般的に所望の薬理学的および生理学的効果を得ることを意味するように本明細書で用いられる。より具体的には、本明細書に記載される試薬は、ステロイドによる治療に対して無応答性、不耐性または依存性である対象におけるステロイドの必要を低減かつ／または排除するために用いられる。したがって、その効果は、その疾患、症状または状態を防止または部分的に防止するという点から予防的であってよく、かつ／あるいは疾患、状態、症状、または治療される状態または疾患によって疾患に起因する有害な影響の部分的または完全な治癒という点から治療的であってよい。「治療」という用語は、本明細書で用いる場合、哺乳類、特にヒトにおける疾患の治療を含み、（ａ）疾患の素因があるが、疾患を有すると未だ診断されていない対象における疾患が発生することを予防すること、（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、その発現を抑えること、あるいは（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患および／またはその症状もしくは状態の後退をもたらすことを含む。本発明は、病的炎症に関連する疾患に罹患している患者の治療を対象とする。本発明は、長期間にわたる、かつ／または長期間にわたり生体系に存在する不適切な炎症に対する生理的反応によって引き起こされるような病的炎症、好ましくは、クローン病のような炎症性腸疾患、喘息、ＭＳ、ＲＡまたは種々の脊椎関節症に起因する有害な影響を予防、抑制または軽減することに関する。
「治療上有効な量」とは、哺乳類に投与したとき、ステロイドによる治療に対して無応答性、不耐性または依存性である対象におけるステロイドの必要を統計的に有意な量で低減または排除するのに十分な本明細書に開示する薬剤、試薬または試薬の組合せの量を意味する。
「ステロイド節約有効量」という用語は、ステロイドによる治療に対して無応答性、不耐性または依存性である対象におけるステロイドの必要を統計的に有意な量で低減または排除するのに有効な薬剤、試薬または組成物の量を意味する。「ステロイド節約有効量」は、組成または組成物、治療する特定の疾患およびその重症度、治療する哺乳類の年齢、体重等によって異なる。
「長期投与」とは、ステロイドによる治療に対して無応答性、不耐性または依存性である対象におけるステロイドの必要の低減または排除をもたらす量および周期性での本発明の薬剤、試薬または併用療法の投与を意味する。投与は、好ましくは週２回、週１回、月１回または隔月であるが、毎日であり得る。より好ましくは、治療は週１回または月１回であり、治療する疾患または状態によって６カ月間から数年間または患者の寿命の残りの期間投与する。
式Ｉから式ＩＸの化合物に関するさらなる定義は、本明細書で定義するとおりである。
２．本発明の一般的態様
２．１ 疾患および状態
以下の疾患および／または状態は、本発明のステロイド節約剤を用いて治療かつ／または防止することができる。
２．１．１ 炎症性腸疾患
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、腸の炎症を引き起こす疾患に付与された一般名である。炎症性腸疾患は、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む。
２．１．１．１ クローン病
クローン病は、小腸の炎症を引き起こす。クローン病は、通常、小腸の下部、すなわち、回腸に発生するが、消化管のあらゆる部分を冒し得る。炎症は、罹患した臓器の裏層の深部に達し、疼痛を引き起こし、しばしば腸を空にする。クローン病は、回腸炎または腸炎と呼ばれることもある。クローン病は、男性と女性を同等に罹患させ、一部の家族を罹患させる。クローン病を有する人々の約２０％がなんらかの種類のＩＢＤを有する血族を有する。
クローン病の疾患の原因は、不明である。１つの理論は、免疫系が腸の持続性炎症を引き起こすことによってウイルスまたは細菌と反応するということである。クローン病に罹患している患者は、免疫系の異常を有する傾向があるが、これらの異常が疾患の原因または結果であるかどうかは不明である。
クローン病の最も一般的な症状は、しばしば右下部における腹痛および下痢などである。直腸出血、体重減少および発熱も起こることがある。出血は、重篤かつ持続性で、貧血につながることがある。クローン病を有する小児は、発育遅滞および発育阻害に罹患することがある。
クローン病の最も一般的な合併症は、腸の閉塞である。閉塞は、クローン病が腫脹および瘢痕組織による腸壁の肥厚をもたらし、腸の通路を狭窄させるために起こる。クローン病は、罹患部位を通り抜けて膀胱、膣または皮膚などの周囲組織に入るトンネルを作るびらんおよび潰瘍も引き起こすことがある。瘻と呼ばれるトンネルは、一般的な合併症であり、しばしば感染された状態になる。時として、瘻は投薬により治療することができるが、手術を必要とすることが多い。
タンパク質、カロリーおよびビタミンの欠乏のような栄養合併症がクローン病に一般的である。クローン病に伴う他の合併症は、関節炎、皮膚問題、眼もしくは口の炎症、腎臓結石、胆石または肝臓および胆管系の他の疾患などである。
クローン病の治療は、疾患の位置および重症度、合併症ならびに以前の治療に対する反応に依存する。治療の目標は、炎症を抑制し、栄養欠乏の矯正ならびに腹痛、下痢および直腸出血のような症状を軽減することである。治療は、薬剤、栄養補給、手術またはこれらの選択肢の組合せを含んでいてよい。現時点では、治療による治癒はない。一部の患者は、症状がない長期の寛解を有する。しかし、クローン病は通常、人の生涯の種々の時点に再発する。寛解がいつ起こるか、あるいは症状がいつ再発するかを予測することは可能ではない。
ほとんどの患者が最初に炎症の抑制の助けとなる物質であるメサラミンを含む薬剤の投与を受ける。スルファサラジンも一般的に用いられている。それによる利益を得ない患者、あるいはそれに耐えることができない患者には、Ｄｉｐｅｎｔｕｍ（登録商標）またはＰｅｎｔａｓａ（登録商標）のような５−ＡＳＡ剤として一般的に知られている他のメサラミン含有薬を投与してよい。メサラミン製剤の発生し得る副作用は、悪心、嘔吐、胸やけ、下痢および頭痛などである。
一部の患者に、炎症を抑制するためにブデソニドのようなステロイドが投与される。これらの薬剤は、活動性のクローン病に最も有効であるが、感染に対するより大きい感受性を含む重大な副作用を引き起こすことがある。免疫系を抑制する薬剤もクローン病の治療に用いられている。最も一般的には６−メルカプトプリンおよびアザチオプリンが含まれる。免疫抑制剤は、炎症の一因である免疫反応を妨げることによって作用する。これらの薬剤は、悪心、嘔吐および下痢のような副作用を引き起こし、炎症に対する患者の抵抗性を低下させることがある。
狭窄、瘻または以前の手術が原因となる小腸における細菌の異常増殖を処置するために抗生物質が用いられている。この一般的な問題に対して、医師はアンピシリン、スルホンアミド、セファロスポリン、テトラサイクリンまたはメトロニダゾールなどの抗生物質を処方する。
生物学的製剤もクローン病の治療に用いられている。インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））は、標準療法（すなわち、メサラミン物質、コルチコステロイドおよび免疫抑制剤）に対して反応しない中等度から重度のクローン病の治療および開放排膿性瘻の治療を適応とする。インフリキシマブは、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）物質である。ＴＮＦは、クローン病に伴う炎症を引き起こすことがある免疫系によって産生されるタンパク質である。
腸の一部を除去する手術は、クローン病を改善することができるが、治癒させることはできない。除去された部位に隣接する腸の部位に炎症が再発する傾向がある。多くのクローン病患者は、薬物療法に反応しない症状を軽減するため、あるいは腸の閉塞、穿孔、膿瘍または出血のような合併症を矯正するために、手術を必要とする。一部の患者は、結腸切除術により結腸全体の切除を受けなければならない。ＨＡＲＲＩＳＰＯＮ’Ｓ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＩＮＴＥＲＮＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥ、１３ｔｈ ＥＤ．、（１９９４）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１４０３〜１４０５頁、ＴＨＥ ＰＨＹＳＩＣＩＡＮ’Ｓ ＤＥＳＫ ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ、５８ｔｈ Ｅｄ．（２００４）Ｔｈｏｍｓｏｎ ＰＤＲ、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ、４０２頁、１１３０頁、２７０７頁、３１５３〜３１５５頁、３１７３頁を参照のこと。
２．１．１．２ 潰瘍性大腸炎
潰瘍性大腸炎は、結腸粘膜に生ずる慢性、炎症性および潰瘍性疾患である。潰瘍性大腸炎の原因は、不明である。遺伝的素因が環境、食事または感染性物質に対する無秩序な腸の免疫反応を引き起こすことを示唆する証拠がある。しかし、誘因となる抗原は同定されていない。
病理学変化は、粘膜上皮の下のレチクリン線維の変性、上皮下毛細管の閉塞ならびに形質細胞、好酸球、リンパ球およびマスト細胞による固定層の進行性浸潤から始まる。陰窩膿瘍、上皮壊死および粘膜潰瘍が最終的に発生する。疾患は、通常直腸Ｓ状結腸に始まり、結腸全体に及ぶことがあり、あるいは大腸の大部分を巻き込むことがある。
症状としては、血性下痢、腹膜炎および深在性毒血症などがある。一部の症例は、実証済み感染（すなわち、アメーバ症または細菌性赤痢により）の後に発生する。倦怠感、発熱、貧血、食欲不振、体重減少、白血球増加症および低アルブミン血症が存在する可能性がある。出血が最も一般的な局所合併症である。他の重篤な合併症である中毒性大腸炎は、潰瘍形成の拡大が限局性腸閉塞および腹膜炎をもたらすときに起こる。中毒性大腸炎が進行するにつれて、結腸は筋緊張を失い、数時間あるいは数日以内に拡張し始める。
横行結腸の直径が６ｃｍを超えているとき、中毒性巨大結腸（または中毒性拡張）が存在し、高熱、白血球増加、腹痛および反跳痛がもたらされる。穿孔、汎発性腹膜炎および敗血症のような危険な合併症を避けるために、治療は初期に行わなければならない。結腸全体が罹患し、疾患がその活動性にかかわりなく１０年を超えて持続するとき、結腸癌の発生率が増加する。癌の発生率は汎発性潰瘍性結腸炎の場合に最も高いが、そのリスクは、Ｓ状結腸の上の潰瘍性結腸炎の程度とともに著しく増加する。
他の合併症としては、末梢性関節炎、強直性脊椎炎、仙腸骨炎、前部ぶどう膜炎、結節性紅斑、皮膚合併症ならびに小児における成長および発達の遅滞などがある。肝疾患は、脂肪肝として、あるいはより重篤には自己免疫性肝炎、原発性硬化性胆管炎または硬変として発現する。
潰瘍性大腸炎は、慢性であり、増悪と寛解の繰返しを伴う。広範な潰瘍性大腸炎を有する患者のほぼ三分の一が手術を必要とする。全直腸結腸切除術は治癒力があり、余命および生活の質は正常に復し、結腸癌のリスクはなくなる。
潰瘍性大腸炎の症状は、下痢止め薬および食事の変化に反応することがある。中等度から重度の症状は、１つまたは複数の薬物を必要とする。直腸のみにおける疾患の場合、局所療法が適応となる。結腸全体の炎症の場合、免疫系を抑制するための薬物（アザチオプリン、６−メルカプトプリンまたはシクロスポリン）および炎症を抑制するための薬物（ステロイド）のような全身に作用する薬物が必要である。ＨＡＲＲＩＳＰＯＮ’Ｓ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＩＮＴＥＲＮＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥ、１３ｔｈ ＥＤ．、（１９９４）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１４０３〜１４０５頁、ＴＨＥ ＰＨＹＳＩＣＩＡＮ’Ｓ ＤＥＳＫ ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ、５８ｔｈ Ｅｄ．（２００４）Ｔｈｏｍｓｏｎ ＰＤＲ、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ、４０２頁、１１３０頁、２７０７頁、３１５３〜３１５５頁、３１７３頁を参照のこと。
２．１．２ 移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および宿主対移植片病
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、免疫系が抑制され、輸血または骨髄移植を受けた人を襲う可能性があるまれな障害である。宿主対移植片病は、免疫系の抑制を有し、臓器移植を受けた患者に発生する。これらの状態の症状は、皮疹、結腸炎と類似した腸の問題および肝機能不全などである。
ＧＶＨＤの場合、免疫抑制レシピエントにおける免疫適格ドナーＴ細胞は抗原に対して反応する。急性ＧＶＨＤの症状は、発熱、剥脱性皮膚炎、高ビリルビン血症を伴う肝炎、嘔吐、下痢および腹痛などであり、腸閉塞および体重減少に進行する可能性がある。ＧＶＨＤは、同種骨髄移植（ＢＭＴ）後の死亡および重症罹病の主要な原因であり続けている。
骨髄移植レシピエントの約１／３〜１／２が慢性型のＧＶＨＤを発現する。皮膚、肝臓および腸は依然として主として罹患する器官であるが、他の部位（すなわち、関節、肺）における併発も認められる。最終的に患者の２０〜４０％がＧＶＨＤに伴う合併症により死亡する。
１つの治療方法は、骨髄の再注入の前にロゼッティング法または機械的分離を用いて、モノクローナル抗体によりドナー骨髄からＴ細胞を除去することである。Ｔ細胞枯渇は、ＧＶＨＤの発生率および重症度の低減に非常に有効であった。しかし、生着不全および再発の発生率は増加する。考えられる説明は、移植片対宿主反応で発生したサイトカインが幹細胞増殖と生着に必要な成熟を促進するということである。ＧＶＨＤを予防または治療するのに用いられる他の薬剤は、メトトレキサート、コルチコステロイドおよび成熟Ｔ細胞上に発現する抗原に対するモノクローナル抗体などである。
ＧＶＨＤはまた、例外的な症例における輸血の結果として起こることがある。その理由は、少数のドナーＴ細胞さえもＧＶＨＤの原因となり得るためである。そのような状況としては、子宮内胎児輸血ならびに骨髄移植レシピエント、白血病、リンパ腫、線維芽腫、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を有する患者のような免疫抑制患者における輸液などがある。ＴＨＥ ＭＥＲＣＫ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＭＥＤＩＣＡＬ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ（１９９７）、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎｔ、ＰＡ、８３６〜８３７頁を参照のこと。
２．１．３ 多発性硬化症
多発性硬化症（ＭＳ）は、成人初期に出現し、大部分の症例で重大な能力障害に進行する慢性神経疾患である。米国だけでＭＳの症例が約３５００００例存在する。外傷を以外では、ＭＳは成人初期から中期までの神経障害の最も一般的な原因である。
ＭＳの原因は未だ確定されていない。ＭＳは、慢性炎症、脱髄および神経膠症（瘢痕化）によって特徴付けられる。脱髄は、軸索伝導に対して陰性または陽性影響をもたらす可能性がある。陽性伝導異常は、軸索伝導遅延、高いが低くない周波数のインパルス列の存在下で起こる可変伝導ブロックまたは完全伝導ブロックなどである。陽性伝導異常は、異所性インパルス発生、自発性または追従性機械的ストレスおよび脱髄軸索間の異常な「クロストーク」などである。
ミエリンタンパク質、すなわちミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）に対して反応性のＴ細胞が、実験的アレルギー性脳脊髄炎におけるＣＮＳ炎症を媒介することが認められた。患者はＣＮＳ免疫グロブリン（Ｉｇ）のレベルの上昇を有することも認められた。ＭＳに認められる組織損傷の一部は活性化Ｔ細胞、マクロファージまたは星状細胞のサイトカイン産物によって媒介されるというさらなる可能性がある。
今日、ＭＳと診断された８０％の患者が疾患の発症後２０年間生存する。ＭＳを管理するための療法として、（１）急性増悪の治療および疾患の長期抑制に向けての治療を含む疾患経過の変化を目的とした治療、（２）ＭＳの症状の治療、（３）内科的合併症の予防および治療、ならびに（４）二次性の個人的および社会的問題の管理などが挙げられる。
ＭＳの発症は、劇的である場合があり、あるいは患者に医学的対応処置を求めさせないほど温和である場合もある。最も一般的な症状は、四肢の１つまたは複数の脱力、視神経炎に起因する視力障害、感覚障害、複視および運動失調などである。疾患の経過は、次の３つの一般的カテゴリーに層別することができる。（１）再発性ＭＳ、（２）慢性進行性ＭＳ、および（３）不活動性ＭＳ。再発性ＭＳは、神経機能不全の再発発作によって特徴付けられる。ＭＳ発作は一般的に、数日から数週間にわたって徐々に発生し、その後、完全に回復、部分的に回復または全く回復しない。まれにはある程度の回復が２年またはそれ以上の年数持続することがあるが、発作からの回復は一般に症状のピークから数週間から数カ月以内に起こる。
慢性進行性ＭＳは、安定化または寛解の期間なしに緩徐な進行性悪化をもたらす。患者の２０％では、再発を想起できないが、この型は、再発性ＭＳの既往歴を有する患者に発現する。急性再発は、進行性経過中にも起こることがある。
第３の型は、不活動性ＭＳである。不活動性ＭＳは、種々の程度の固定した神経脱落症状によって特徴付けられる。不活動性ＭＳを有するほとんどの患者は、再発性ＭＳの既往歴を有する。
疾患の経過は、患者の年齢にも依存する。例えば、好ましい予後因子は、早期発症（小児期を除く）、再発性の経過および発症後５年目に残存能力障害がほとんどないことなどである。これに対して、不良な予後は、晩年（すなわち、４０歳以上）の発症および進行性の経過に伴うものである。ＭＳを再発する慢性進行性ＭＳは晩年に始まる傾向があるので、これらの変数は相互依存性がある。慢性進行性ＭＳによる能力障害は、通常、患者の進行性対麻痺または四肢麻痺（完全麻痺）に起因する。本発明の１つの態様において、患者が疾患の再発段階にあるときでなく、寛解状態にあるときに、患者を治療することが好ましい。
副腎皮質刺激ホルモンまたは経口コルチコステロイド（例えば、経口プレドニゾンまたは静脈内メチルプレドニゾロン）の短期使用は、ＭＳの急性悪化を有する患者を治療するための唯一の特異的治療手段である。
ＭＳのより新しい療法としては、インターフェロンβ１ｂ、インターフェロンβ１ａおよびＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）（以前はコポリマー１として知られていた）を患者に投与することが挙げられる。これらの３つの薬剤は、疾患の再発率を有意に低下させることが示された。これらの薬剤は、筋肉内または皮下に自己投与する。
２．１．４ 喘息
喘息は、空気を肺に運ぶ気管支、すなわち気道の炎症を伴う呼吸器系の疾患である。気道は、アレルゲンならびに煙、寒冷空気および／または他の環境因子に対して過剰に反応する。気道は狭くなり、呼吸困難になる。アレルゲンが慢性炎症を引き起こすことがある。
喘息は、しばしば小児期または十代に発現し、最も一般的な慢性小児期疾患である。喘息のほとんどの症例は、制御することができる。しかし、重度の症例では、喘息エピソードは致命的であり得る。喘息の症例数は過去３０年に着実に増加してきたため、米国および世界の主要な公衆衛生問題のうちの１つとなった。
喘息は遺伝、環境および免疫因子によって引き起こされ、これらの因子が複合して喘息エピソードの原因となり得る炎症を引き起こす。一部の患者では、炎症を起こした気道は、煙や寒冷空気のような環境中の物質に対して過剰に反応する。他の患者では、免疫系がアレルゲンに反応して炎症を引き起こす細胞を放出する。
喘息は、種々の時間に、様々な要因により発生する。タバコの煙や大気汚染が発作を引き起こすことがある。さらに、笑いや泣きなどの強い感情の表現が発作の原因となり得る。
喘息エピソードの症状は、軽度から重度までの重症度であり得、喘鳴、咳、胸部ひっ迫、急速、浅表性呼吸または呼吸困難、息切れ、運動時に急速に疲労することなどであるが、これらに限定されない。
治療は、炎症および喘息エピソードを抑制するための薬物の服用ならびに炎症を増大させる物質を回避することを含む。炎症が抑制されない場合、喘息が気管支の永久的変化の原因となり得る。
吸入コルチコステロイド（ブデソニドおよびフルチカゾンなど）、炎症の低減が持続性喘息の一般的療法である。まれな例で、経口コルチコステロイド（プレドニゾンおよびデキサメタゾンなど）を喘息の抑制の助けとするために用いることができる。長時間作用性ベータ２作動薬（サルメテロールおよびホルモテロールなど）も適応とする。速やかな軽減のために投与される薬物は、短時間作用性ベータ２作動薬（アルブテロールおよびテルブタリンなど）および抗コリン薬（イプラトロピウムなど）などである。ＴＨＥ ＭＥＲＣＫ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＭＥＤＩＣＡＬ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ（１９９７）、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎｔ、ＰＡ、１３３〜１３７頁を参照のこと。
２．１．５ 慢性関節リウマチ
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、関節および関節周囲構造の進行性破壊をもたらす末梢関節の炎症によって特徴付けられる慢性症候群である。慢性関節リウマチの原因は、不明である。しかし、遺伝的素因は特定され、白人集団において、クラスＩＩ組織適合性遺伝子のＨＬＡ−ＤＲ１遺伝子座におけるペンタペプチドに限局化する。環境因子も１つの役割を果たす。免疫学的変化は、複数の因子によって開始される。全集団の約１％が罹患しており、女性は男性より２〜３倍罹患頻度が高い。発症は、あらゆる年齢に存在し、２５〜５０歳に最も頻繁である。
病因において重要であると思われる顕著な免疫学的異常は、滑液細胞および血管炎に認められる免疫複合体などである。形質細胞は、これらの複合体に寄与する抗体を産生する。滑膜組織に浸潤するリンパ球は、催炎症性サイトカインを産生することができる、主としてＴヘルパー細胞である。接着分子の増加は、炎症細胞の移動および滑膜組織における停留に寄与する。
リウマチ結節は、患者の最大３０％における通常皮下の慢性刺激部位に存在する。血管炎は、ＲＡの重症例の皮膚、神経または内臓に認められるが、少数の症例においてのみ臨床的に重要である。
発症は、通常潜行性で、関節の罹患は進行性であるが、急性で、複数の関節の同時の炎症が起こることがある。ほぼすべての炎症関節の圧痛および滑膜肥厚が一般的である。最初の症状発現は、あらゆる関節に起こり得る。
朝の起立時または長時間の無活動の後に３０分未満持続する硬直が一般的である。皮下リウマチ結節は、通常、初期症状発現ではない。内臓結節、脚潰瘍をもたらす血管炎または単神経炎複合、胸水または心膜液、リンパ節腫脹、フェルティ症候群、シェーグレン症候群および上強膜炎が他の症状である。発熱が存在することがある。
７５％もの患者が疾患の最初の年の保存療法により症候的に改善する。しかし、１０％未満の患者は、十分な治療にもかかわらず、最終的に重度の能力障害になる。この疾患は、ほとんどのＲＡ患者の生活に著しい影響を及ぼす。重症疾患の最も活動性の有痛段階中短期のベッドでの完全安静が時折指示される。重症度がより低い症例では、規則的安静を指示すべきである。
非ステロイド性抗炎症薬は、重要な症状の軽減をもたらす可能性があり、軽度ＲＡの単一療法として十分であると思われるが、疾患の長期経過を変化させないように思われる。アスピリンのようなサリチル酸塩は、治療に用いることができる。
サリチル酸塩または他のＮＳＡＩＤｓが十分に疼痛を軽減または活動性関節炎症を抑制しない場合、通常それらに加えて金化合物を投与する。一部の患者では、金は、臨床的寛解をもたらし、新たな骨びらんの形成を減少させる。非経口製剤は、金チオマレイン酸ナトリウムまたは金チオグルコースを含む。上の症状発現のいずれかが出現した場合、金は中止すべきである。軽微な中毒症状発現（例えば、軽度のかゆみ、軽微な発疹）は、金療法を一時的に差し控えることによって消失させることができ、その後、症状が鎮静してから約２週間後に金療法を慎重に再開する。しかし、中毒症状が進行する場合、金を中止し、患者にコルチコステロイドを投与すべきである。軽度金皮膚炎に対しては、局所コルチコステロイドまたは経口プレドニゾン１５〜２０ｍｇ／日を分割して投与する。血液学的合併症の場合には、より高い用量が必要となる可能性がある。高度の金反応後に金キレート化薬であるジメルカプロール２．５ｍｇ／ｋｇＩＭを最初の２日間にわたり最大４〜６回／日を、その後５〜７日間にわたり１日２回投与してよい。
ヒドロキシクロロキンも軽度または中等度に活動性ＲＡの症状を抑制することができる。毒性作用は通常軽度であり、皮膚炎、ミオパシーおよび一般的に可逆性の角膜混濁などである。しかし、非可逆性の網膜変性が報告された。スルファサラジンもＲＡの治療に用いることができる。
経口ペニシラミドは、金と類似した有用性を有し、金が活動性ＲＡを有する患者において無効であるか、または毒性をもたらす場合、一部の症例に用いることができる。中止を必要とする副作用は、金の場合より一般的であり、骨髄抑制、蛋白尿、ネフローゼ、他の重篤な毒性効果（例えば、重症筋無力症、天疱瘡、グッドパスチャー症候群、多発筋炎、狼瘡様症候群）、発疹および腐敗味などである。
ステロイドは、最も有効な短期抗炎症薬である。しかし、ＲＡに対するそれらの臨床的ベネフィットは時間とともにしばしば減少する。ステロイドは、関節の破壊の進行を予測して妨げることができない。さらに、活動性疾患におけるコルチコステロイドの中止後に重大なリバウンドが発生する。ステロイドの使用に対する禁忌は、消化性潰瘍、高血圧、無処置炎症、糖尿病および緑内障などである。
免疫抑制薬は、重症活動性ＲＡの管理にますます使用されている。しかし、肝疾患、肺炎、骨髄抑制など、ならびにアザチオプリンの長期使用後および悪性腫瘍などの重大な副作用が起こり得る。
関節副子固定は、局所炎症を減少させ、重度の局所症状を軽減することがある。筋肉量を回復させ、正常な関節可動域を確保するための活発な運動は、炎症が鎮静したときには重要であるが、疲れを招くようなものであるべきではない。疾患が活動性であるときに手術を実施してもよい。
２．１．６ 脊椎関節症
脊椎関節症は、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、ライター症候群および炎症性腸疾患に随伴する関節炎を含む疾患のファミリーである。
２．１．６．１ 強直性脊椎炎
強直性脊椎炎（ＡＳ）は、慢性であり、最も多くは脊椎を冒す関節炎の一種である。強直性脊椎炎は、腰部、背部、頚部および股関節部の腫脹および運動制限を伴う疲労、疼痛および硬直を引き起こす。治癒はないが、治療により通常症状を抑制し、状態が悪化することを防ぐことができる。強直性脊椎炎の合併症は、虹彩炎、上体の屈曲に起因する呼吸困難および胸壁の硬化などである。
早晩、脊椎の靭帯および関節の持続性炎症が脊椎を互いに融合させ（強直）、頚部および腰部の運動の喪失につながる。脊椎が融合または硬直すると、固定した前方屈曲変形（脊柱後弯）が結果として生じ、著しい能力障害につながる。強直性脊椎炎の炎症は、身体の他の部位、最も一般的には他の関節および眼に、時として肺および心臓弁に及ぶことがあり得る。
強直性脊椎炎は、１００人につき１人が罹患する。女性より男性に一般的であり、この状態は通常、十代後期または成人初期に始まる。治療としては、硬直を減少させ、良い姿勢および可動性を維持する助けとなる運動および理学療法、ならびに疼痛および炎症に対するステロイドを含む薬物療法などが挙げられる。
２．１．６．２ 乾癬性関節炎
乾癬性関節炎（ＰｓＡ）は、乾癬を有する一部の患者において発現する関節の腫脹によって特徴付けられる。乾癬性関節炎は、硬直、有痛性および腫脹関節のような他のタイプの関節炎の症状を示す。無処置乾癬性関節炎は、骨の喪失および関節の変形をもたらすことがある。乾癬性関節炎の疼痛と腫脹は、関節周囲組織の炎症を引き起こす過剰反応性免疫系によって引き起こされる。症状は、突発し、周期的に後退する。対称性関節炎が乾癬性関節炎の最も一般的なタイプであり、全症例の約５０％を占めている。症状は身体の両側に発生する。症状は、慢性関節リウマチと類似しており、対称性関節炎は、関節の永続的障害の原因となり得る。乾癬性関節炎の第２の最も一般的なタイプである非対称性関節炎は、より軽度であり、身体の片側のみに症状を引き起こす。
乾癬性関節炎のさほど一般的でない遠位指節間（ＤＩＰ）は、指爪および足指爪に近い関節を罹患させる。爪は、しばしば状態によっても罹患する。脊椎炎は、特に頚部および背部の運動を有痛性にすることがある。脊椎炎はまた、脊柱の炎症を引き起こすことがある。離断性関節炎は、しばしば衰弱性であり、乾癬性関節炎の破壊的な型である。これは、しばしば手および足ならびに背部および頚部を罹患させ、永続的変形をもたらすことがある。
乾癬性関節炎の症状は、他の種類の関節炎の症状と類似している。それらは、関節の硬直、関節の疼痛または腫脹、眼の刺激および発赤を含む。乾癬の通常の症状は、皮膚の赤色鱗状斑などである。
一般的な療法は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）などである。それらは、アスピリンおよびイブプロフェンのような多くの鎮痛大衆薬を含む。しかし、これらの薬物の慢性使用は、危険であり、胃腸の問題の原因となり得る。Ｃｏｘ−２阻害薬は、乾癬性関節炎の治療にしばしば用いられるクラスのＮＳＡＩＤｓである。副作用は、悪心および頭痛などである。
免疫抑制剤は、より温和な薬物に反応しない乾癬性関節炎の症例に用いられるより強力な薬剤である。このクラスの薬剤は、免疫系を抑制することによって作用するメトトレキサートのように乾癬の全身療法に用いられている。それらは重篤な副作用も引き起こし、感染のリスクをもたらす。アザルフィジンもしばしば処方される。マラリアの予防に用いられるある種の薬剤は、症状を改善することができ、時として乾癬性関節炎に対しても処方される。
ステロイドは長期間安全に用いることはできないが、経口ステロイドは激しい関節痛の除去の助けとするためにしばしば指示される。しかし、ステロイドの投与を突然中止した場合にも症状の突発が起こることがあり得る。生物学的製剤も乾癬の治療に用いられる。それらは、乾癬の症状を引き起こす免疫系反応を標的にすることによって作用し、関節が炎症状態になることを予防する。生物学的薬物も感染に対する免疫系の感受性をより高くする。
２．１．６．３ ライター症候群
反応性関節炎としても知られているライター症候群は、関節に加えて、眼、尿道および皮膚も罹患させる関節炎の１つの型である。
ライター症候群は、同時に出現または出現しない身体の種々の器官における多くの症状によって特徴付けられる。この疾患は、急性または慢性で、突然の寛解または再発を伴う。ライター症候群は、２０〜４０歳の主として男性を罹患させる。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を有する患者は、特にリスクが高い。
ライター症候群の原因は不明であるが、研究により遺伝的素因と他の因子との組合せによって引き起こされることが示唆される。ライター症候群は、しばしば、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）またはウレアプラスマウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）感染に後続する。
ライター症候群の最初の症状は、尿道または腸の炎症であり、これに関節炎が後続する。関節炎は通常、指、足指、くるぶし、股関節および膝関節が罹患する。他の症状は、有痛性排尿および分泌物を伴う尿道の炎症、口内潰瘍、眼の炎症ならびに膿漏性角皮症（手掌、足裏、躯幹または頭皮上の鱗状皮膚の斑）などである。
ライター症候群に対する特異的療法は存在しない。関節炎症は、通常非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）で治療する。皮疹および眼炎症は、ステロイドで治療することができる。ライター症候群の予後は様々である。一部の患者は、心筋の炎症、脊椎の硬化を伴う炎症、緑内障、進行性盲、足の異常または肺への液体の蓄積を含む合併症を発現する。
他の脊椎関節症は、炎症性腸疾患の脊椎炎（ＩＢＤ ＳｐＡ）、未分化脊椎関節症（ｕＳｐＡ）、若年性脊椎関節症（ＪＳｐＡ）を含むが、これらに限定されない。
ＴＨＥ ＭＥＲＣＫ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＭＥＤＩＣＡＬ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ（１９９７）、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎｔ、ＰＡ、２４３頁を参照のこと。
３．投与
一般的な意味で、本発明の方法は特定の投与法を対象としない。その理由は、投与法は活性薬の形態および活性薬を投与するために開発された製剤に依存するからである。投与法は、経口、非経口（例えば、皮下、硬膜下、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、腹腔内、大脳内、動脈内または病変内投与経路）、局所、限局（例えば、外科的適用または外科的坐剤）、腸および肺（例えば、エアゾール剤、吸入剤または散剤）を含む。好ましくは、投与経路は非経口である。投与経路は、当業者に知られているように、投与する組成物（例えば、免疫グロブリンは静脈内投与するのに対して小化合物は経口投与する）、標的とする組織（例えば、脊椎損傷の部位を標的とするために髄腔内投与）等に基づいている。
さらに、免疫グロブリンは、クローン病のような炎症性腸疾患、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症に伴う症状を治療、改善または軽減するために用いられる他の化合物または組成物と併用することができる。さらに、本明細書で開示する化合物は、単独投与または免疫抑制剤、５−ＡＳＡｓおよび抗ＴＮＦｓのような他の薬剤と併用投与することができる。併用投与する場合、免疫グロブリンは、これらの他の化合物または組成物と同じ製剤で、あるいは別の製剤で投与することができ、かつ、症状を治療、改善または軽減するために用いられる他の化合物または組成物の前、後または同時に投与することができる。
５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡｓ）は、クローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患を治療するために一般的に用いられているクラスの抗炎症薬である。１つの一般的な５−ＡＳＡは、Ｐｅｎｔａｓａ（登録商標）またはＲｏｗａｓａ（登録商標）を含むメサラミンである。オサラジン（Ｄｉｐｅｎｔｕｍ（登録商標））のような他の５−ＡＳＡｓは、体内でメサラミンに変換される。スルファサラジン（Ａｚｕｌｆｉｄｉｎｅ（登録商標））も一般的に投与される。５−ＡＳＡｓの副作用は、下血、頭痛、嘔吐および皮疹などである。
免疫抑制剤は、免疫系を弱めまたは抑制し、ひいては炎症を減弱させる。例としては、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサートおよびミコフェノレートなどがある。これらの薬物は、身体が新たに移植された臓器を拒絶することを予防するため、あるいは他の療法に反応しない炎症性状態に対して最も多く用いられる。これらの薬剤が症状を改善するには数カ月間を必要とし、投薬を中止すると疾患はしばしば再発する。免疫抑制剤の副作用は、悪心、嘔吐、下痢、胃潰瘍、皮疹、倦怠感、肝炎、骨髄抑制、発熱、膵炎およびある種の癌のリスクの増加などである。
抗ＴＮＦ剤も炎症状態の治療を適応とする。抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、炎症に関連する免疫系によって産生されるタンパク質である。抗ＴＮＦ剤は、ＴＮＦが腸に到達する前にＴＮＦを血流から除去し、それにより、炎症を予防する。インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））は、標準療法（すなわち、メサラミン物質、コルチコステロイドおよび免疫抑制剤）に対して反応しない中等度から重度のクローン病の治療および開放排膿性瘻の治療を適応とする抗ＴＮＦ剤である。
４．治療の適応
本明細書で開示される組成物、化合物および方法による治療に含められる炎症性疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症を含む。治療を考慮されるさらなる疾患または状態は、ステロイドにより伝統的に治療されているものを含む。
５．免疫グロブリン
１つの特定の実施形態において、本発明の薬剤は、患者に投与したとき、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症の診断および治療に用いることができ、以前にステロイドを服用していた患者にステロイドを漸減させかつ／またはそれらを中止させることができるような、免疫グロブリンである。これらの免疫グロブリンは、α４インテグリンもしくはα４β１のようなα４インテグリンを含む二量体に選択的に結合またはＶＣＡＭ−１に結合する免疫グロブリンから選択されてよい。好ましくは、免疫グロブリンはα４β１またはα４β７に結合し、α４β１またはα４β７活性を阻害する。免疫グロブリンは、好ましくは抗体またはそのフラグメントである。
「抗体」とは、ＩｇＧ１（もしくはＩｇＧサブクラス）またはＩｇＭのような完全な免疫グロブリン、あるいはナタリズマブのような抗体由来の阻害剤を含むことを意味する。
「抗体同族体」とは、ジスルフィド結合を介して結合した免疫グロブリン軽および重鎖からなる完全な抗体を含むことを意味する。「抗体同族体」という用語は、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖および１つまたは複数の抗原（すなわち、インテグリンまたはインテグリンリガンド）に結合することができるその抗原結合フラグメントから選択される１つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質を含むことも意図する。複数のポリペプチドからなる抗体同族体の成分ポリペプチドは、場合によってジスルフィド結合しているか、あるいは共有結合により架橋していてよい。したがって、「抗体同族体」は、免疫グロブリン軽鎖がカッパまたはラムダ型であってよい、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型（およびそのサブタイプ、例えば、ＩｇＧ１）の完全な免疫グロブリンを含む。「抗体同族体」はまた、抗原結合特異性を保持している完全な抗体の一部、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、重および軽鎖単量体または二量体またはその混合物を含む。
本発明の薬剤が抗体である場合、モノクローナル抗体が好ましい抗体である。一般的に異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤と異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一エピトープに対応している。モノクローナル抗体の第２の利点は、それらが、他の免疫グロブリンによって汚染されていない手段により、例えば、ファージディスプレイまたはハイブリドーマからの分離によって合成されることである。本発明は、本発明の薬剤としてポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含むことを意図しているが、モノクローナル抗体は、高度に特異的であるので好ましい。したがって、本発明は主としてモノクローナル抗体に関して検討する。
「天然抗体および免疫グロブリン」は、通常２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖とからなる約１５００００ダルトンのヘテロ４量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有結合性ジスルフィド結合により重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンイソ型の重鎖の間で異なっている。各重および軽鎖は、規則的に間隔があいた鎖間ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端における可変領域（ＶＨ）とそれに続く多数の定常領域を有する。各軽鎖は、一端における可変領域（ＶＬ）とその他端における定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域と整列し、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と整列している。特定のアミノ酸残基が、軽および重鎖可変領域の間の界面を形成していると考えられている（Ｃｌｏｔｈｉａら、１９８５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８６：６５１〜６３頁、Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４５９２〜６頁）。
さらに、他の抗体は、当技術分野で利用可能な手法を用いて同定することができる。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、ファージディスプレイ法を用いて産生させることができる。次いで、α４インテグリンまたはα４インテグリンを含む二量体に選択的に結合する抗体フラグメントを分離する。ファージディスプレイにより抗体を生産する好ましい例示的方法は、すべての目的のために全体を参照により本明細書に援用する米国特許第６２２５４４７号、第６１８０３３６号、第６１７２１９７号、第６１４０４７１号、第５９６９１０８号、第５８８５７９３号、第５８７２２１５号、第５８７１９０７号、第５８５８６５７号、第５８３７２４２号、第５７３３７４３号および第５５６５３３２号に開示されている。
「変異型」抗体は、本明細書では親抗体配列における１つまたは複数のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換により「親抗体」アミノ酸配列とアミノ酸配列が異なる免疫グロブリン分子を指す。親抗体または免疫グロブリンは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）抗体またはいずれかの抗体フラグメントであってよい。この好ましい実施形態において、変異型は、親抗体の１つまたは複数の超可変領域における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えば、変異型は、親抗体の１つまたは複数の超可変領域における少なくとも１つ、例えば、約１から約１０まで、好ましくは約２から約５までの置換を含む。通常、変異型は、親抗体重または軽鎖可変領域配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。この配列に関する同一性または相同性は、必要な場合、最大の割合の配列同一性を達成するために配列および導入ギャップを整列した後に、親抗体残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の割合と本明細書において定義する。Ｎ末端、Ｃ末端または内部拡張、欠失または抗体配列への挿入は、配列同一性または相同性に影響を及ぼすと解釈されるべきではない。変異型は、受容体に結合する能力を保持し、好ましくは親抗体の特性より優れた特性を有する。例えば、変異型は、より強い結合親和力、受容体を活性化する高い能力等を有する。そのような特性を解析するために、変異型のＦａｂ型を親抗体のＦａｂ型と、または変異型の全長型を親抗体の全長型と比較すべきである。本明細書で特に対象とする変異型抗体は、親抗体と比較して少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも約２０倍、最も好ましくは少なくとも５０倍高い生物活性を示すものである。本明細書における「親」抗体は、変異型の調製に用いるアミノ酸配列によってエンコードされるものである。好ましくは、親抗体は、ヒトフレームワーク領域を有し、ヒト抗体定常領域を有する。例えば、親抗体は、ヒト化またはヒト抗体であってよい。「分離」抗体は、同定され、その自然環境の成分から分離かつ／または回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断上または治療上の使用を妨げるような物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質であってよい。好ましい実施形態において、抗体は（１）Ｌｏｗｒｙ法により測定される抗体の９５重量％を超える、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシークエネータを用いてＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、あるいは（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いた還元または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一性になるまで精製する。抗体の自然環境の少なくとも１つの成分は存在しないので、分離抗体は組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕでの抗体を含む。しかし、通常、分離抗体は、少なくとも１つの精製段階により調製する。
５．１ モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ法または遺伝子工学的手法を用いて生産することもできる。これらの方法は、多くの特異抗原に対する高レベルのモノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞系を生産するために広く適用されており、本発明のモノクローナル抗体を生産するために用いることもできる。例えば、腹腔内注射によりマウス（例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス）を抗原性α４エピトープで免疫化することができる。免疫応答を可能にするのに十分な時間が経過した後に、マウスを屠殺し、脾臓細胞を採取し、当技術分野でよく知られている技術を用いてミエローマ細胞と融合させる。得られた融合細胞、すなわちハイブリドーマを選択培地中で増殖させ、生存細胞を限界希釈条件を用いてそのような培地中で増殖させる。クローニングおよびリクローニングの後に、標的、α４またはα４インテグリンを含む二量体に選択的に結合する抗体（例えば、ＩｇＧもしくはＩｇＭクラスまたはＩｇＧ１サブクラスの）を分泌するハイブリドーマを分離することができる。ヒト使用のための特異的な薬剤を製造するために、分離モノクローナルを用いてキメラおよびヒト化抗体を生産することができる。抗ペプチド抗体である抗体も調製することができる。そのような抗ペプチド抗体は、α４インテグリンのペプチドに対して調製することができよう。
本発明の薬剤に言及するとき「キメラ」という用語は、薬剤が異なる構造を有し、かつ／または異なる起源を有する２つ以上のタンパク質の結合（化学的架橋または共有結合または他の種類）からなることを意味する。したがって、キメラα４インテグリン拮抗薬は、α４インテグリン拮抗薬またはフラグメントである１つの部分とα４β１インテグリン拮抗薬でない他の部分を含んでいてよい。
「キメラ」タンパク質の種は、それらの個々のペプチド骨格を介して、最も好ましくはそれらのタンパク質をエンコードするポリヌクレオチド分子の遺伝的発現による２つ以上のタンパク質またはそのフラグメントの共直線状共有結合を指す「融合」または「融合タンパク質」である。したがって、好ましい融合タンパク質は、抗体に対してオリジナルでない（すなわち、他の免疫グロブリンまたはポリペプチドに由来する）第２の部分に共有結合している抗体またはそのフラグメントを含むキメラタンパク質である。本発明の好ましい融合タンパク質は、抗原結合特異性を保持している完全な抗体の一部、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、重鎖単量体または二量体、軽鎖単量体または二量体、１つの重鎖と１つの軽鎖からなる二量体等を含んでいてよい。
最も好ましい融合タンパク質は、キメラであり、免疫グロブリン軽鎖、重鎖または両方のヒンジおよび定常領域のすべてまたは一部に融合または別の方法で結合した部分を含む。したがって、本発明は、（１）第１の部分、（２）第２のペプチド、例えば、該部分の溶解度またはｉｎ ｖｉｖｏ寿命を増加させるもの、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーまたはそのフラグメントもしくは一部、例えば、ＩｇＧの一部またはフラグメント、例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域を含む分子を対象とする。特に、「ステロイド節約／Ｉｇ融合」は、本発明の生物学的に活性なステロイド節約部分を含むタンパク質である。薬剤の種は、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部に結合している本発明のステロイド節約型免疫グロブリンを含むタンパク質である「インテグリン／Ｆｃ融合」である。好ましいＦｃ融合は、重鎖免疫グロブリンのＣ末端ドメインを含む抗体のフラグメントに結合した本発明のステロイド節約型免疫グロブリンを含む。
「融合タンパク質」という用語は、ステロイド節約部分でない第２の部分（「キメラ」分子をもたらす）にモノまたはヘテロ官能分子を介して化学的に結合し、下記のように精製タンパク質から新たに調製されるステロイド節約部分も意味する。したがって、組換えにより結合したに対立するものとしての化学的に結合した融合タンパク質であるキメラ分子の１つの例は、（１）α４インテグリンサブユニット標的部分、例えば、ＶＬＡ−４を有する細胞上のＶＬＡ−４に結合することができるＶＣＡＭ−１部分、（２）標的部分の溶解度またはｉｎ ｖｉｖｏ寿命を増加させる第２の分子、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリアルキレングリコールポリマーを含んでいてよい。α４標的部分は、あらゆる天然に存在するα４リガンドまたはそのフラグメント、例えば、ＶＣＡＭ−１ペプチドまたは同様な同類置換アミノ酸配列であり得る。
キメラｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）およびヒト化抗体は、非ヒト抗体から生産することができ、それらが生産される元の抗体と同じまたは類似の結合親和力を有することができる。適切な抗原特異性のマウス抗体分子の遺伝子を、例えば、適切な生物活性のヒト抗体分子の遺伝子とともにスプライシングすることによってキメラ抗体を生産するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１頁、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４ Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４頁、Ｔａｋｅｄａら、１９８５ Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２頁）を用いることができる。そのような抗体は、本発明の範囲内にある。例えば、マウスモノクローナル抗体の可変（Ｖ）領域をエンコードする核酸は、ヒト定常（Ｃ）領域、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４をエンコードする核酸に結合させることができる。したがって、得られる抗体は、非ヒト抗体の抗原結合ドメインとヒト抗体のＣまたはエフェクタードメインとを通常含む種ハイブリッドである。
ヒト化抗体は、主としてヒト抗体（アクセプター抗体）からであるが、実質的に非ヒト抗体（ドナー抗体）からの相補性決定領域を有する可変領域を含む抗体である。例えば、Ｑｕｅｅｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９〜３３頁、ＷＯ９０／０７８６１ならびに米国特許第６０５４２９７号、第５６９３７６１号、第５５８５０８９号、第５５３０１０１号および５２２４５３９号を参照のこと。これらの抗体の定常領域または複数の定常領域も一般的にヒト抗体からのものである。ヒト可変領域は、一般的に、所望の非ヒト可変領域結合ドメインと高い相同性を示す配列を有するヒト抗体から選択される。重および軽鎖可変残基は、同じ抗体、または異なるヒト抗体から得ることができる。さらに、配列は、ＷＯ９２／２２６５３に記載されているようないくつかのヒト抗体のコンセンサスとして選択することができる。
ヒト可変領域内の特異的アミノ酸は、予測されるコンフォーメーションおよび抗原結合特性に基づいて置換のために選択される。これは、コンピュータモデリングのような技術、可変領域内の特定の位置におけるアミノ酸の挙動および結合特性の予測、ならびに置換の影響の観察を用いて決定することができる。例えば、アミノ酸が非ヒト可変領域とヒト可変領域とで異なる場合、ヒト可変領域は非ヒト可変領域のアミノ酸組成を反映するように改変させることができる。抗α４抗体をヒト化するいくつかの例を本明細書に記載する。
「ヒト化抗体同族体」とは、抗原結合に必要とされないヒト免疫グロブリン軽または重鎖のアミノ酸の一部またはすべてが非ヒト哺乳類免疫グロブリン軽または重鎖の対応するアミノ酸に置換された、組換えＤＮＡ技術により生産された抗体同族体を意味する。「ヒト抗体同族体」は、免疫グロブリン軽または重鎖（抗原結合に必要とされるか否かにかかわりなく）のすべてのアミノ酸がヒト源由来である抗体同族体である。
特定の実施形態において、本発明の長期投与法に用いられる抗体は、参照により本明細書に援用する米国特許第５８４０２９９号に開示されているようなヒト化抗体である。
他の実施形態において、ヒト抗体遺伝子を含むトランスジェニックマウスを抗原性α４構造で免疫化することができ、ハイブリドーマ技術を用いてα４に選択的に結合するヒト抗体を得ることができる。
キメラ、ヒトおよび／またはヒト化抗体は、ミエローマ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における組換え発現、例えば、ヒトハイブリドーマにおける発現（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５））により生産することができる。あるいは、抗体コーディング配列を、動物のゲノムに導入するのに適したベクターに組込み、それにより、トランスジェニック動物を生産することができる。１つの例は、ウシのようなトランスジェニック動物の乳汁中でのそのような抗体の生産であろう。米国特許第５８４９９９２号および第５３０４４８９号を参照のこと。適切なトランス遺伝子は、乳腺特異遺伝子、例えば、カゼインまたはβ−ラクトグロブリンからのプロモータ／またはエンハンサを有するトランス遺伝子などである。
５．２ ヒト化抗体およびＰｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）抗体
本発明の１つの実施形態において、有効な量を投与すると、クローン病のような炎症性腸疾患、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症の治療および診断に用いることができる、ステロイドが必要でないようなＶＬＡ−４のα４サブユニットに対して特異的なヒト化（およびｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標））免疫グロブリン（または抗体）を提供する。ヒト化およびｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）抗体は、遺伝子工学技術を用いて修飾された動物（一般的に哺乳類）由来の抗体である。これらの技術は、抗体の最初の抗原特異性を維持しながら、定常領域および／または可変領域フレームワーク配列をヒト配列で置換するために用いられる。ヒト化およびｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（登録商標）抗体は、ヒト抗原（例えば、ヒトＶＣＡＭ−１またはヒトＶＬＡ−４）に対する特異性を有するげっ歯類（例えば、マウスおよびハムスター）抗体から一般的に得られる。治療目的のために抗体を投与される予定である動物からの配列を有するようにドナー抗体（抗原を投与された動物からの抗体）を再構築することによって、抗体投与時の動物における宿主反応は減弱するであろう。Ｆｃ領域のみまたは相補性決定領域（ＣＤＲｓ）以外のすべてをアクセプタードメインで置換することができる。アクセプターは、再構築抗体を投与される動物（例えば、ヒト、家畜化動物、農業動物等の動物）である。
炎症性腸疾患、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症を治療するために有効な量で患者に投与したとき、ＶＬＡ−４のα４サブユニットに結合する抗体が好ましい。
特異抗原に結合するマウス抗体（またはあらゆる他の動物抗体）の領域はＣＤＲｓ（すなわち、抗体重鎖に３つ、軽鎖に３つ）であるので、典型的に、マウス抗体のＣＤＲｓをヒト抗体の対応する領域上に移植する。遺伝子工学により、マウス重および軽鎖可変（Ｖ）領域遺伝子セグメントをクローニングしてＣＤＲ ＤＮＡ配列を決定し、部位特異的突然変異誘発により対応するヒトＶ領域に転移させることによって、ＣＤＲｓの移植を実現する。前記工程の最終段階において、所望のイソ型のヒト定常領域遺伝子セグメント（通常、ＣＨではガンマＩ、ＣＬではカッパ）を付加し、ヒト化重および軽鎖遺伝子を哺乳類細胞中で共発現させて、可溶性ヒト化抗体を生産する。
これらのＣＤＲｓのヒト抗体への転移により、元のマウス抗体の抗原結合特性がこの抗体に付与される。マウス抗体における６つのＣＤＲｓがＶ領域「フレームワーク」領域に構造的にマウントされる。ＣＤＲ移植が成功する理由は、フレームワーク領域が、マウス抗体とヒト抗体とで、ＣＤＲｓが相互に交換できるようなＣＤＲｓに対する類似した付着点を有する非常に類似した３Ｄ構造を有することである。例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５頁、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜７頁、Ｑｕｅｅｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９頁およびＯｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３頁に例示されているように、そのような抗体同族体を調製することができる。
それにもかかわらず、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸は、ＣＤＲｓと相互作用し、全体的な抗原結合親和力に影響を及ぼすと考えられている。ヒトＶ領域フレームワークを修飾せずに組換えヒト化抗体を生産するためにマウス抗体からＣＤＲｓを直接転移させると、しばしば結合親和力が部分的または完全に消失する。いくつかの場合に、結合活性を得るためにアクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）のフレームワーク領域における残基を改変させることは重要であると思われる。
Ｑｕｅｅｎら、１９８９（前出）およびＷＯ９０／０７８６１（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）は、マウスＭＡｂ（抗Ｔａｃ）のＣＤＲｓをヒト免疫グロブリンフレームワークおよび定常領域と組み合わせることにより、アクセプター抗体のフレームワーク領域に修飾残基を含むヒト化抗体の製剤を調製することを記載した。ヒトＶ領域フレームワーク残基を修飾しない場合に結合親和力が失われるという問題を解決するための１つの解決策は、２つの重要な段階を含む。最初に、元のマウス抗体のＶ領域フレームワークとの最適なタンパク質配列相同性を得るために、ヒトＶフレームワーク領域をコンピュータ解析により選択する。第２の段階では、マウスＣＤＲｓと相互作用する可能性があるフレームワークアミノ酸残基を可視化するために、マウスＶ領域の３次構造をコンピュータによりモデル化する。これらのマウスアミノ酸残基を相同ヒトフレームワークに重ね合わせる。さらなる詳細については、米国特許第５６９３７６２号、第５６９３７６１号、第５５８５０８９号および第５５３０１０１号（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）を参照のこと。
本発明において有用な特定のα４サブユニット含有インテグリン拮抗薬は、米国特許第５９３２２１４号において調製され、記載されているＢエピトープ特異性を有するキメラおよびヒト化組換え抗体同族体（ＭＡｂ ＨＰ１／２）（すなわち、完全な免疫グロブリンおよびその一部）などである。キメラ（マウス可変−ヒト定常）およびヒト化抗インテグリン抗体同族体の調製の出発物質は、以前に述べたようなマウスモノクローナル抗インテグリン抗体、市販のモノクローナル抗インテグリン抗体（例えば、ＨＰ２／１、Ａｍａｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、Ｍｅ）であってよい。他の好ましいヒト化抗ＶＬＡ−４抗体同族体は、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１２１９（１９９５年７月２７日）、米国特許第５８４０２９９号および第６０３３６６５号においてＡｔｈｅｎａ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．により記載されている。第５９３２２１４号、第５８４０２９９号および第６０３３６６５号の内容は、それらの全体を参照により本明細書に援用する。
これらのヒト化抗ＶＬＡ−４抗体は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖を含む。ヒト化軽鎖は、マウス２１．６免疫グロブリン軽鎖の対応する相補性決定領域のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲＩ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）、およびマウス２１．６免疫グロブリン軽鎖可変領域フレームワークの同等の位置に存在する同じアミノ酸によってアミノ酸の位置が占められている少なくとも１つの位置を除く、ヒトカッパ軽鎖可変領域フレームワーク配列の可変領域フレームワークを含む。ヒト化重鎖は、マウス２１．６免疫グロブリン重鎖の対応する相補性決定領域のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲＩ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）、およびマウス２１．６免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワークの同等の位置に存在する同じアミノ酸によってアミノ酸の位置が占められている少なくとも１つの位置を除く、ヒト重鎖可変領域フレームワーク配列の可変領域フレームワークを含む。米国特許第５８４０２９９号および第６０３３６６５号を参照のこと。
分離α４インテグリン拮抗薬のフラグメント（例えば、本明細書で述べる抗体同族体のフラグメント）も組換え法、タンパク質分解消化、または当業者に知られている方法を用いた化学合成により効率的に生産することができる。組換え法では、ポリペプチドの内部または末端フラグメントは、分離ハリネズミポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列の１つの末端（末端フラグメントのため）または両末端（内部フラグメントのため）から１つまたは複数のヌクレオチドを除去することによって得ることができる。突然変異誘発ＤＮＡの発現がポリペプチドフラグメントを生成させる。特定のエンドヌクレアーゼによる消化によってもフラグメントのアレイをエンコードするＤＮＡｓを得ることができる。タンパク質のフラグメントをエンコードするＤＮＡｓもランダムシェアリング、制限消化またはその組合せによって得ることができる。タンパク質フラグメントは、完全なタンパク質から直接得ることができる。ペプチドは、プラスミン、トロンビン、トリプシン、キモトリプシンまたはペプシンを含むが、これらに限定されないタンパク質分解酵素によって特異的に切断することができる。これらの酵素の各々が、それが攻撃するペプチド結合の種類に特異的である。トリプシンは、カルボニル基が塩基性アミノ酸、通常アルギニンまたはリシンからのものであるペプチド結合の加水分解を触媒する。ペプシンおよびキモトリプシンは、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンのような芳香族アミノ酸のペプチド結合の加水分解を触媒する。代替の組の切断タンパク質フラグメントが、タンパク質分解酵素に感受性である部位での切断を妨げることによって得られる。例えば、わずかに塩基性の溶液中でのリシンのε−アミノ酸基とエチルトリフルオロチオ酢酸との反応により、隣接ペプチド結合がトリプシンによる加水分解に対してもはや感受性でない保護アミノ酸残基が得られる。タンパク質を修飾して、タンパク質分解酵素に感受性であるペプチド結合を形成させることができる。例えば、β−ハロエチルアミンによるシステイン残基のアルキル化により、トリプシンにより加水分解されるペプチド結合が得られる（Ｌｉｎｄｌｅｙ、１９５６、Ｎａｔｕｒｅ １７８：６４７頁）。さらに、特定の残基においてペプチド鎖を切断する化学試薬を用いることができる。例えば、臭化シアンは、メチオニン残基においてペプチドを切断する（Ｇｒｏｓｓら、１９６１、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８３：１５１０頁）。したがって、修飾剤、すなわちタンパク質分解酵素および／または種々の組合せによってタンパク質を処理することにより、タンパク質をフラグメントの重複のない所望の長さのフラグメントに、あるいは所望の長さの重複フラグメントに分割することができる。
５．３ ナタリズマブおよび関連ヒト化抗体
本発明は、クローン病のような炎症性腸疾患、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症を診断かつ／または治療するために、ＶＬＡ−４リガンドに特異的に結合するヒト化免疫グロブリンを単独または組み合わせて使用する方法を提供する。そのような治療の方法および薬剤に使用する１つの好ましい抗体は、その全体を本明細書に援用するＥｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓに譲渡された米国特許第５８４０２９９号に記載されているものを含む。他の態様は、ｉｎ ｖｉｖｏで評価されたこれらの抗体のフラグメントの使用を考慮するものである。
ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖を含む。１つの態様において、ヒト化軽鎖は、マウス２１．６免疫グロブリン軽鎖の対応する相補性決定領域のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（すなわち、ＣＤＲＩ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）、およびアミノ酸位置がマウス２１．６免疫グロブリン軽鎖可変領域フレームワークの同等の位置に存在する同じアミノ酸によって占められている、位置Ｌ４５、Ｌ４９、Ｌ５８およびＬ６９からなる第１の群から選択される少なくとも１つの位置を除く、ヒトカッパ軽鎖可変領域フレームワーク配列の可変領域フレームワークを含むことができる。
ヒト化重鎖は、マウス２１．６免疫グロブリン重鎖の対応する相補性決定領域のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（すなわち、ＣＤＲＩ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）、およびアミノ酸位置がマウス２１．６免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワークの同等の位置に存在する同じアミノ酸によって占められている、Ｈ２７、Ｈ２８、Ｈ２９、Ｈ３０、Ｈ４４、Ｈ７１からなる群から選択される少なくとも１つの位置を除く、ヒト重鎖可変領域フレームワーク配列の可変領域フレームワークを含む。免疫グロブリンは、約１０７Ｍ−１の下限およびマウス２１．６免疫グロブリンの親和力の約５倍の上限を有する親和力でＶＬＡ−４に特異的に結合する。
通常、ヒト化軽および重鎖可変領域フレームワークは、それぞれＲＥ１および２１／２８’ＣＬ可変領域フレームワーク配列からのものである。ヒト化軽鎖可変領域フレームワークがＲＥ１からのものである場合、少なくとも２つのフレームワークアミノ酸が置換されている。１つのアミノ酸は、上記の位置の第１の群からのものである。他のアミノ酸は、位置Ｌ１０４、Ｌ１０５およびＬ１０７からなる第３群からのものである。この位置は、ＲＥ１以外のヒト免疫グロブリンのカッパ軽鎖の同等な位置に存在する同じアミノ酸によって占められている。
一部のヒト化免疫グロブリンは、ＬａまたはＬｂと呼ばれる成熟軽鎖可変領域配列、あるいはＨａ、ＨｂまたはＨｃと呼ばれる成熟重鎖可変領域配列を有する。好ましいヒト化免疫グロブリンとしては、Ｌａ軽鎖およびＨａ、ＨｂまたはＨｃ重鎖を有するものが挙げられる。
ヒト化免疫グロブリンは、実質的にヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリンと呼ぶ）からの可変フレームワーク領域および実質的にｍｕＭＡｂ２１．６と呼ぶマウス免疫グロブリン（ドナー免疫グロブリンと呼ぶ）からの相補性決定領域を有する。存在する場合、定常領域も実質的にヒト免疫グロブリンからのものである。ヒト化抗体は、ＶＬＡ−４に対する少なくとも１０７、１０８、１０９または１０１０Ｍ−１の特異的結合親和力を示す。通常、ＶＬＡ−４に対するヒト化抗体の結合親和力の上限は、ｍｕＭＡｂ２１．６のそれ（約１０９Ｍ−１）の３または５倍以内である。結合親和力の下限もしばしばｍｕＭＡｂ２１．６のそれの３または５倍以内である。
ヒト化抗体は、例えば、マウスＭＡｂ２１．６モノクローナル抗体を用いて、例示するように生産することができる。ヒト化抗体の生産の出発物質は、ｍｕＭＡｂ２１．６である。この抗体の分離および特性は、すべての目的のためにその全体を参照により援用するＥｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許第６０３３６５５号に記載されている。簡単に述べると、ｍｕＭＡｂ２１．６は、ＶＬＡ−４のα４サブユニットに対して特異的であり、腫瘍壊死因子で刺激したラット脳細胞の組織培養へのヒトリンパ球の結合を阻害することが示された。Ｎ末端からＣ末端まで、軽および重鎖は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４ドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ番号付け慣例に従う。
次の段階は、供給フレームワーク残基に対するヒト抗体を選択することを含む。ヒト可変領域フレームワーク内へのマウスＣＤＲｓの置換は、ヒト可変領域フレームワークがＣＤＲｓが起源するマウス可変フレームワークに対して同じまたは類似のコンフォーメーションを採用するならば、それらの正しい空間配向の保持をもたらす可能性が高い。これは、フレームワーク領域が、ＣＤＲｓが由来するマウス可変フレームワークドメインとの高度の配列同一性を示すヒト抗体からのヒト可変領域を得ることによって達成される。重および軽鎖可変フレームワーク領域は、同じまたは異なるヒト抗体配列から得ることができる。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であってよく、あるいはいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であってよい。Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ４：７７３頁（１９９１）、Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ６：９７１頁（１９９３）を参照のこと。
適切なヒト抗体配列は、マウス可変領域のアミノ酸配列と既知のヒト抗体の配列とのコンピュータ比較により特定される。比較は重鎖と軽鎖について別個に行うが、原理は各々で同様である。この比較により、ｍｕ２１．６軽鎖は、サブタイプカッパ１のヒト軽鎖との最大の配列同一性を示し、ｍｕ２１．６重鎖は、前出のＫａｂａｔによって定義されたようなサブタイプのヒト重鎖との最大の配列同一性を示すことが明らかになる。したがって、軽および重ヒトフレームワーク領域は、通常これらのサブタイプのヒト抗体から、あるいはそのようなサブタイプのコンセンサス配列から得られる。ｍｕＭＡｂ２１．６からの対応する領域との最大の配列同一性を示す好ましい軽および重鎖ヒト可変領域は、それぞれ抗体ＲＥ１および２１／２８’ＣＬからのものである。
次いで、コンピュータモデリングを用いてヒト化抗体がその同族抗原に結合する能力をさらに増大させることができる。マウスＣＤＲ領域とヒト可変フレームワーク領域との不自然な並置は、特定のアミノ酸残基の置換により是正しない限り、結合親和力の喪失につながる、不自然なコンフォーメーション制限をもたらし得る。置換に用いるアミノ酸残基の選択は、コンピュータモデリングにより一部は決定される。免疫グロブリン分子の３次元像を得るためのコンピュータハードウエアおよびソフトウエアは、広く入手可能である。一般的に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖またはそのドメインの構造解析から開始して得ることができる。モデル化される鎖を解析した３次元構造の鎖またはドメインとアミノ酸配列の類似性について比較し、最大の配列類似性を示す鎖またはドメインを分子モデルの構造の出発点として選択する。例えば、ｍｕＭＡｂ２１．６の軽鎖については、フレームワーク領域、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域のモデリングの出発点は、ヒト軽鎖ＲＥ１であった。ＣＤＲ３領域については、出発点は、異なるヒト抗体ＨｙＨＥＬ−５の軽鎖のＣＤＲ３領域であった。モデル化される免疫グロブリン鎖またはドメインにおける実際のアミノ酸と出発構造におけるアミノ酸との差異に対処するために、解析済みの出発構造が修正される。次いで、修正済みの構造を複合免疫グロブリンに組み立てられる。最後に、エネルギー最小化と、すべての原子が互いに適切な距離内にあり、結合長さおよび角度が化学的に許容できる限界内のあることを確認することにより、モデルが精密にされる。
上記のように、本発明のヒト化抗体は、実質的にヒト免疫グロブリンからの可変フレームワーク領域とｍｕＭＡｂ２１．６と呼ぶ実質的にマウス免疫グロブリンからの相補性決定領域を含む。ｍｕＭＡｂ２１．６の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）および適切なヒトアクセプター免疫グロブリンを明確にしたならば、次の段階は、得られたヒト化抗体の特性を最適化するために、もしあるならば、これらのコンポーネントのどの残基を置換すべきかを決定することである。一般的に、マウス残基の導入により抗体がヒトにおけるＨＡＭＡ反応を誘発するリスクが高くなるため、ヒトアミノ酸残基をマウス残基で置換することは最小限にすべきである。ＣＤＲコンフォーメーションおよび／または抗原への結合に対する想定される影響に基づいて、置換に用いるアミノ酸を選択する。そのような起こり得る影響の検討は、モデリング、特定の位置におけるアミノ酸の特徴の検討、または特定のアミノ酸の置換もしくは突然変異誘発の影響の経験的観察による。
アミノ酸がｍｕＭＡｂ２１．６可変フレームワーク領域と同等なヒト可変フレームワーク領域とで異なっているとき、アミノ酸が以下のとおりであることが合理的に予想されるならば、ヒトフレームワークアミノ酸を通常同等なマウスアミノ酸で置換すべきである。
（１）抗原に直接非共有結合する（例えば、ｍｕＭＡｂ２１．６の位置Ｌ４９、Ｌ６９におけるアミノ酸）
（２）ＣＤＲ領域に隣接する、Ｃｈｏｔｈｉａら（前出）によって提案された代替の定義のもとでのＣＤＲ領域の一部である、またはＣＤＲ領域と別の仕方で相互作用する（例えば、ＣＤＲ領域の約３Å以内である）（例えば、ｍｕＭＡｂ２１．６の位置Ｌ４５、Ｌ５８、Ｈ２７、Ｈ２８、Ｈ２９、Ｈ３０およびＨ７１におけるアミノ酸）
あるいは
（３）ＶＬ−ＶＨ界面に関係する（例えば、ｍｕＭＡｂ２１．６の位置Ｈ４４におけるアミノ酸）。
置換の他の候補は、その位置のヒト免疫グロブリンでは異常であるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である（例えば、ｍｕＭＡｂ２１．６の位置Ｌ１０４、Ｌ１０５およびＬ１０７におけるアミノ酸）。これらのアミノ酸は、より典型的なヒト免疫グロブリンの同等の位置のアミノ酸で置換することができる。あるいは、マウスＭＡｂ２１．６の同等の位置のアミノ酸は、同等の位置のヒト免疫グロブリンに典型的なものである場合、ヒトフレームワーク領域に導入することができる。
一般的に、上の基準を満たすすべてまたは大部分のアミノ酸の置換が望ましい。しかし、場合によっては、特定のアミノ酸が上の基準を満たし、代替の変異型免疫グロブリンが産生され、そのうちの１つがその特定の置換を受け、そのうちの他のものは受けないかどうかについて若干の不明確さがある。ヒト化抗体は、通常、Ｌ４５、Ｌ４９、Ｌ５８およびＬ６９位置の少なくとも１、２または３つ、より通常４つにおける対応するｍｕＭＡｂ２１．６残基によるヒト軽鎖フレームワーク残基の置換を含む。ヒト化抗体は通常、Ｈ２７、Ｈ２８、Ｈ２９、Ｈ３０、Ｈ４４およびＨ７１位置の少なくとも１、２、３、４または５つおよび時として６つにおけるヒト重鎖フレームワーク残基の置換も含む。場合によって、Ｈ３６も置換されていてよい。好ましい実施形態において、ヒト軽鎖アクセプター免疫グロブリンがＲＥ１である場合、軽鎖は、Ｌ１０４、Ｌ１０５およびＬ１０７位置の少なくとも１または２つ、より通常３つにおける置換も含む。これらの位置は、より典型的なアミノ酸残基を有するヒト免疫グロブリンの同等の位置からのアミノ酸で置換されている。
通常、ヒト化抗体のＣＤＲ領域は、ｍｕＭＡｂ２１．６抗体の対応するＣＤＲ領域と実質的に同じであり、より通常、同じである。しかし、場合によっては、ＣＤＲ領域における残基の１つを交換することが望ましい。ｍｕＭＡｂ２１．６のＣＤＲ３とＶＣＡＭ−１リガンドとの間にアミノ酸類似性が存在する。この知見は、ＶＣＡＭ−１にさらに似るように重鎖ＣＤＲ３領域のデザインを改善することによって、ヒト化抗体の結合親和力が改善されることを示唆している。したがって、ＣＤＲ３ドメインの１つまたは複数のアミノ酸をＶＣＡＭ−１結合ドメインのアミノ酸で置換することができる。通常望ましくないが、得られるヒト化免疫グロブリンの結合親和力に認め得るほどの影響を与えずに、ＣＤＲ残基の１つまたは複数の同類アミノ酸置換を行うことが時として可能である。
上記の特定のアミノ酸置換の場合以外は、ヒト化免疫グロブリンのフレームワーク領域は、それらが由来したヒト抗体のフレームワーク領域と通常実質的に同じであり、より通常、同じである。もちろん、フレームワーク領域におけるアミノ酸の多くは、抗体の特異性や親和力にほとんど、または全く寄与していない。したがって、フレームワーク残基の多くの個別の同類置換は、得られるヒト化免疫グロブリンの特異性または親和力の認め得るほどの変化を伴わずに耐えることができる。しかし、一般的に、そのような置換は望ましくない。
５．３．１ 可変領域の生産
ヒト化免疫グロブリンのＣＤＲおよびフレームワークコンポーネントを概念的に選択したならば、そのような免疫グロブリンを生産するための様々な方法が利用可能である。コードの同義性のため、種々の核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をエンコードする。所望の核酸配列は、新規固相ＤＮＡ合成により、あるいは所望のポリヌクレオチドの以前の調製済み変異型のＰＣＲ突然変異誘発により生産することができる。オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発は、標的ポリペプチドＤＮＡの置換、欠失および挿入変異型を調製する好ましい方法である。Ａｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ２：１８３頁（１９８３）を参照のこと。簡単に述べると、所望の突然変異をエンコードするオリゴヌクレオチドを１本鎖ＤＮＡ鋳型とハイブリッド形成させることによって、標的ポリペプチドＤＮＡを改変する。ハイブリッド形成の後に、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを組込み、標的ポリペプチドＤＮＡにおける選択される改変をエンコードする鋳型の第２の全相補鎖を合成する。
５．３．２ 定常領域の選択
上記のように生産したヒト化抗体の可変セグメントは、典型的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部に結合している。ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、種々のヒト細胞、好ましくは不死化Ｂ細胞からよく知られている手順に従って分離することができる（Ｋａｂａｔら、前出およびＷＯ８７／０２６７１を参照）（それぞれ全体を参照により本明細書に援用する）。通常、前記抗体は、軽鎖および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、通常ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４領域を含む。
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むあらゆるイソ型を含むすべての型の定常領域を有する抗体を含む。ヒト化抗体が細胞毒性活性を示すことが望ましい場合、定常領域は通常、補体固定定常領域であり、クラスは典型的にＩｇＧ１である。そのような細胞毒性活性が望ましくない場合、定常領域はＩｇＧ２クラスであってよい。ヒト化抗体は、複数のクラスまたはイソ型の配列を含んでいてよい。
５．３．３ 他の抗ＶＬＡ−４抗体
他の抗ＶＬＡ−４抗体は、ＨＰ１／２、ＨＰ２／１、ＨＰ２／４、Ｌ２５およびＰ４Ｃ２を含むが、これらに限定されない。本明細書に述べるように、また当技術分野で知られているように、当業者が容易に認めるように、これらの抗体は、炎症性腸状態を診断かつ／または治療するために有効な量で投与してもよい。
しばしば、マウスにおいて産生させたモノクローナル抗体は、マウス抗体を注射されたヒト対象におけるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）免疫反応を避けるために後にヒト化する。これは、ＣＤＲの移植または再構築により発生する。したがって、一般的に前記抗体は、２１．６抗体について上述したように、ＣＤＲ移植または再構築によりヒト化される最初のマウスモノクローナル抗体である。
特に、前記ヒト化抗体は、ＶＬＡ−４に対する特異性を有し、炎症性腸状態を診断かつ／または治療する能力を有する。これらの抗体は、可変領域の少なくとも１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）がドナー非ヒト抗ＶＬＡ−４抗体に由来する源（例えば、典型的にマウス）から得られる。これらの抗体では、ドナー抗体結合特異性を保持するためにアクセプター抗体重および／または軽鎖可変フレームワーク領域の最低限の改変が存在していることも、または存在していないこともある。好ましくは、ＣＤＲ移植重鎖可変領域の抗原結合領域は、３１〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜６５（ＣＤＲ２）および９５〜１０２（ＣＤＲ３）位置に対応するＣＤＲｓを含む。好ましい実施形態において、重鎖はさらに、フレームワーク位置２７〜３０（Ｋａｂａｔ番号付け）における非ヒト残基を含むことができる。重鎖はさらに、フレームワーク位置７７〜７９または６６〜６７および６９〜７１または８４〜８５または３８および４０または２４（Ｋａｂａｔ番号付け）における非ヒト残基を含むことができる。好ましくは、ＣＤＲ移植軽鎖可変領域の抗原結合領域は、２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ３）位置に対応するＣＤＲｓを含む。好ましい実施形態において、軽鎖は、フレームワーク位置６０および６７（Ｋａｂａｔ番号付け）における非ヒト残基をさらに含むことができる。これらの残基の呼称は、Ｋａｂａｔ番号付け（Ｋａｂａｔら、第５版、４巻、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ（１９９１））に従って番号付けされたものである。
マウス抗体ＨＰ１／２の合成およびヒト化。ＨＰ１／２は、ＶＬＡ−４に対して産生される他の抗体である。ヒト対象用のこの抗体のヒト化型を調製する方法は、本明細書に記載されており、また、Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．に譲渡され、すべての目的のために全体を参照により援用する米国特許第６６０２５０３号にさらに記載されている。ヒト化抗体の配列は次のとおりである。ＨＰ１／２ＶＨＤＮＡ配列およびその翻訳アミノ酸配列は以下のとおりである。
Figure 2013166765
ＨＰ１／２ＶＨの２つの配列とファミリーＩＩＣのコンセンサス配列との比較から、唯一の異常な残基はアミノ酸位置８０および１２１（すなわち、Ｋａｂａｔ番号付けで７９、９４および１２１）に存在することがわかった。Ｔｒｙ−８０はサブグループＩＩＣにおける非変異体であるが、他の配列決定済みマウスＶＨ領域は、いずれもＴｒｐを有さないが、この位置に他の芳香族アミノ酸を有する。ヒトおよびマウスＶＨの大多数はＫａｂａｔ位置９４にアルギニン残基を有する。ＨＰ１／２ＶＨにおけるＡｓｐ−９４の存在はまれであり、この位置における負に荷電した残基の唯一の報告例が存在する。Ｋａｂａｔ位置１１３におけるプロリンも異常であるが、遠いため、ＣＤＲｓのコンフォーメーションにおいて重要であるとは考え難い。ＣＤＲ１を構成するアミノ酸は、他の３つの配列決定済みマウスＶＨ領域に認められた。しかし、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、ＨＰ１／２に特有であり、他の報告されたマウスＶＨに認められなかった。
ＨＰ１／２ＶＫＤＮＡ配列およびその翻訳アミノ酸配列は、次のとおりである。
Figure 2013166765
ＨＰ１／２ＶＫは、ＫａｂａｔファミリーＶのメンバーであり（Ｋａｂａｔら、第５版、４巻、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１））、異常な残基を有さない。ＣＤＲ１およびＣＤＲ３のアミノ酸は、特有である。ＣＤＲ２を構成するアミノ酸は、他の１つのマウスＶＫにおいて報告された。
ＣＤＲ移植抗ＶＬＡ−４抗体の設計。ＣＤＲ移植抗ＶＬＡ−４抗体を設計するために、マウスＨＰ１／２のどの残基が軽および重鎖のＣＤＲｓを含むかを判定することが必要であった。より少ない可変フレームワーク配列の間の高変異性の３つの領域が軽および重鎖に認められる（ＷｕおよびＫａｂａｔ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１〜２５０頁（１９７０）、Ｋａｂａｔら、（１９９１））。ほとんどの場合、これらの高変異性領域はＣＤＲに対応するが、超えている可能性がある。マウスＨＰ１／２のＣＤＲｓは、他のＶＨおよびＶＫ配列との整列によりＫａｂａｔら、（１９９１）に従って解明された。マウスＨＰ１／２ＶＨのＣＤＲｓは、特定され、ヒト化ＶＨ配列で特定された残基と以下のように対応する。
Figure 2013166765
これらは、Ｋａｂａｔ番号付けにおけるそれぞれＡＡ３１〜ＡＡ３５、ＡＡ５０〜ＡＡ６５およびＡＡ９５〜ＡＡ１０２に対応する。マウスＨＰ１／２ＶＫのＣＤＲｓは、特定され、ヒト化ＶＫ配列で特定された残基に以下のように対応している。
Figure 2013166765
これらは、Ｋａｂａｔ番号付けにおける同じ番号付けアミノ酸に対応している。したがって、ＶＫのＣＤＲｓのみ（ＶＨは該当せず）がＫａｂａｔＣＤＲ残基に対応していた。ＨＰ１／２（ドナー）ＣＤＲｓを受け入れるように選択されたヒトフレームワークは、重および軽鎖についてそれぞれＮＥＷＭおよびＲＥ１であった。ＮＥＷＭおよびＲＥ１配列は、Ｋａｂａｔら、（１９９１）に公表された。
ヒト化ＨＰ１／２抗体のヒト化重鎖可変領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2013166765
ヒト化ＨＰ１／２抗体のヒト化軽鎖可変領域のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2013166765
上のヒト化ＨＰ１／２抗体軽および重鎖に加えて、他のアクセプター重および軽鎖領域もドナーＨＰ１／２領域の挿入のために用いることができる。次のすべての構成体は、Ｓｅｒ−７５（Ｋａｂａｔ番号付け）を含む。ＳＴＡＷ構成体はさらに位置７７にＧｌｎ〜Ｔｈｒを、位置７８にＰｈｅ〜Ａｌａを、位置７９（Ｋａｂａｔ番号付け）にＳｅｒ〜Ｔｒｐを含む。ＶＨＤＮＡ配列およびその翻訳アミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2013166765
ＫＡＩＴＡＳ構成体は、ＡｒｇからＬｙｓへの（位置６６）、ＶａｌからＡｌａへの（位置６７）、ＭｅｔからＩｌｅへの（位置６９）、ＬｅｕからＴｈｒへの（位置７０）およびＶａｌからＡｌａへの（位置７１）（Ｋａｂａｔ番号付け）さらなる変化を含む。ＫＡＩＴＡＳ ＶＨＤＮＡ配列およびその翻訳アミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2013166765
ＳＳＥ構成体は、ＡｌａからＳｅｒへの（位置８４）、ＡｌａからＧｌｕへの（位置８５）（Ｋａｂａｔ番号付け）さらなる変化を含む。ＳＳＥ ＶＨＤＮＡ配列およびその翻訳アミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2013166765
ＫＲＳ構成体は、ＡｒｇからＬｙｓへの（位置３８）、ＰｒｏからＡｒｇへの（位置４０）（Ｋａｂａｔ番号付け）さらなる変化を含む。ＫＲＳ ＶＨＤＮＡ配列およびその翻訳アミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2013166765
ＡＳ構成体は、位置２４（Ｋａｂａｔ番号付け）におけるＶａｌからＡｌａへの変化を含む。ＡＳ ＶＨは、以下のとおりである。
Figure 2013166765
ヒト化軽鎖は、たとえあるにしても、一般的にほとんど修飾を必要としない。しかし、ヒト化抗ＶＬＡ−４抗体の調製において、いくつかの経験的変更により、抗体のそのリガンドに対する生物学的活性が改善した。例えば、マウス軽鎖を含むＳｅｒ突然変異を有するヒト化重鎖は、マウスＨＰ１／２より効力が約２．５倍低かった。ヒト化軽鎖を含む同じヒト化重鎖は、効力が約４倍低かった。
ヒト化ＶＫ構成体（ＶＫ１）は、位置６０におけるＳｅｒからＡｓｐへの置換および位置６７におけるＴｒｙの代わりにＳｅｒを含む。ＤＮＡ配列およびその翻訳アミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2013166765
他のＶＫ構成体（すなわち、ＶＫ２）は、修復された元のＲＥ１フレームワークのＤＱＭＤＹ配列を有する。ＤＮＡおよびその翻訳アミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2013166765
第３のＶＫ構成体は、ＫＶ３であり、アミノ末端におけるＤＱＭに
対するＳＶＭおよび他の２つの残基変化を含む。ＤＮＡおよびその翻訳アミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2013166765
これらの軽および重鎖配列のそれぞれをどのように調製するのかに関する詳細は、すべての目的のために全体を参照により援用する米国特許第６６０２５０３号に記載されている。上の軽および重鎖の種々の組合せは、当技術分野で知られているコンピュータモデリングに基づいて調製することができる。
α４インテグリンを認識し、それに結合するさらなる抗体は、当技術分野で知られている。これらは、ＧＧ５／３（Ｋｅｓｚｔｈｅｌｙｉら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ４７（４）：１０５３〜１０５９頁（１９９６））、ＦＷ３−２１８−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．：ＨＢ−２６１、ヒツジα４インテグリンに対するＩｇＧ２ｂ抗体）およびＲ１−２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．：ＨＢ−２２７、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）において発生したＩｇＧ２ｂ抗体）を含むが、これらに限定されない。抗体がマウスまたは他の動物において発生したかどうにかかわりなく、配列の各々を、当技術分野で知られていることに基づき、またコンピュータモデリングを用いてヒト化されるように遺伝子工学により処理することができる。次に、抗α４インテグリンヒト化抗体を、本明細書に開示するｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイに基づいて、炎症性腸状態を診断かつ／または治療するそれらの能力について評価することができる。
５．４ 抗体フラグメント
ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ−１相互作用を阻害するように抗α４またはＶＣＡＭ−１に結合する抗体の抗体フラグメントを、炎症性腸状態を診断かつ／または治療するのに使用することにも考慮される。抗体フラグメントは、本明細書に開示する組成物に用いることができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦｖフラグメントを含む。
本明細書で用いる「Ｆａｂフラグメント」という用語は、抗体分子の重および軽鎖の一部からなる単一抗原結合領域を含む部分的抗体分子を指す。
本明細書で用いる「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、抗体分子の軽鎖および重鎖の一部からなる両単一抗原結合領域を含む部分的抗体分子を指す。
本明細書で用いる「Ｆｖフラグメント」という用語は、抗原認識および結合に関与する抗体分子の部分を指す。
本明細書で用いる「ｓｃＦｖ」という用語は、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを指す。これらのｓｃＦｖフラグメントは、フレキシブルリンカーにより接続されている抗体重および軽鎖の可変領域のみからなる組換え抗体誘導体である。ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬ領域を含み、これらの領域は単一ポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするＶＨおよびＶＬ領域間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖのレビューについては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｖｏｌ．１１３、２６９〜３１５頁（ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９４）を参照のこと。
抗体フラグメントに二重特異性抗体も含まれる。「二重特異性抗体」という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結されている重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小抗体フラグメントを指す。短すぎて同じ鎖上の２つの領域間の対の形成ができないリンカーを用いることによって、領域は他の鎖の相補領域と対を形成することを余儀なくされ、２つの抗原結合部位を形成する。二重特異性抗体は、例えば、欧州特許第４０４０９７号、ＷＯ９３／１１１６１およびＨｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４〜８頁により十分に記述されている。
抗体フラグメントは、線状抗体も含む。本願書を通して用いるとき「線状抗体」という表現は、例えば、Ｚａｐａｔａら、１９９５ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７〜６２頁に記述されている抗体を指す。簡単に述べると、これらの抗体は、抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｄセグメントの対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
抗体のパパイン消化により、各々が単一抗原結合部位および残余「Ｆｃ」フラグメントを含み、その名称が容易に結晶化するその能力を反映している「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントが生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋させることができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが生成する。
いくつかのマウス抗ＶＬＡ−４モノクローナル抗体が以前に記載された。例えば、さらに本明細書で論じ、すべての目的のために全体を参照により本明細書に援用する米国特許第６６０２５０３号、第６０３３６６５号および第５８４０２９９号、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄら、１９８６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：１３４３〜９頁、Ｈｅｍｌｅｒら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１１４７８〜８５頁、Ｐｕｌｉｄｏら、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１０２４１〜４５頁、Ｉｓｓｅｋｕｔｚら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：１０９頁（ＴＡ−２ ＭＡｂ）を参照のこと。ＶＬＡ−４のアルファおよび／またはベータ鎖を認識することができるこれらの抗ＶＬＡ−４モノクローナル抗体および他の抗ＶＬＡ−４抗体は、本発明による治療の方法に有用であろう。ＶＣＡＭ−１およびフィブロネクチンリガンドへの結合に関与するＶＬＡ−４α４鎖エピトープを認識する抗ＶＬＡ−４抗体（すなわち、リガンド認識に関与する部位においてＶＬＡ−４に結合し、ＶＣＡＭ−１およびフィブロネクチン結合を阻害することができる抗体）が好ましい。そのような抗体は、Ｂエピトープ特異抗体（Ｂ１またはＢ２）と定義され（Ｐｕｌｉｄｏら、１９９１、前出）、本発明による抗ＶＬＡ−４抗体でもある。
ＶＬＡ−４に対する完全にヒトモノクローナル抗体同族体は、本発明の方法においてＶＬＡ−４リガンドを阻害または被覆する可能性がある他の好ましい結合剤である。これらは、Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：８６〜９５頁により記述されているようにｉｎ ｖｉｔｒｏ初回免疫ヒト脾細胞を用いてそれらの完全な形で調製することができる。あるいは、それは、Ｐｅｒｓｓｏｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：２４３２〜３６頁により、あるいはＨｕａｎｇら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１４１：２２７〜２３６頁により記述されているようにレパートリークローニングにより調製することができる。米国特許第５７９８２３０号（１９９８年８月２５日、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ」）はヒトＢ細胞からのヒトモノクローナル抗体の調製を記述している。本発明によれば、ヒト抗体産生Ｂ細胞を、エプスタイン−バーウイルスまたはエプスタイン−バーウイルス核抗原２（ＥＢＮＡ２）を発現するその誘導体に感染させることによって不死化する。不死化に必要であるＥＢＮＡ２機能をその後遮断する。これにより抗体産生の増加がもたらされる。別の方法が当技術分野で知られている。
ヒト抗体を完全に生産する他の方法については、異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物および不活性化内因性免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物を記述している米国特許第５７８９６５０号を参照のこと。内因性免疫グロブリン遺伝子は、アンチセンスポリヌクレチドおよび／または内因性免疫グロブリンに対する抗血清により抑制される。異種抗体は、非ヒト動物の当該種の遺伝子に通常認められない免疫グロブリン遺伝子によりエンコードされる。非再配列異種ヒト免疫グロブリン重鎖の配列を含むトランス遺伝子を非ヒト動物に導入し、それによりトランスジェニック免疫グロブリン配列を機能的に再配列し、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってエンコードされる種々のイソ型の抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物を形成させる。そのような異種ヒト抗体は、Ｂ細胞で産生され、その後これを、例えば、ミエローマのような不死化細胞系と融合することにより、あるいはモノクローナル異種完全ヒト抗体同族体を産生することができる細胞系を不死にする他の技術によりそのようなＢ細胞を操作することにより不死化する。標準ファージ技術を用いてヒト療法として開発することができる高親和力抗体を分離するために、大きい非免疫化ヒトファージディスプレイライブラリーを用いることもできる。
真の「キメラ抗体」（すなわち、全定常および全可変領域が異なる源由来である）の調製する初期の方法の後に、抗体を、１つの種のそれらの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を他の種のそれで置換する（所定の可変領域内での）ことにより改変する新規のアプローチが欧州特許第０２３９４００号（Ｗｉｎｔｅｒら）に記載された。この方法は、例えば、ヒト重および軽鎖Ｉｇ可変領域ドメインのＣＤＲｓをマウス可変領域ドメインの代替ＣＤＲｓで置換するために用いることができる。その後これらの改変Ｉｇ可変領域をヒトＩｇ定常領域と組み合わせて、置換マウスＣＤＲｓ以外は組成が完全にヒトである抗体を作ることができる。そのようなＣＤＲ置換抗体は、真のキメラ抗体と比較して、かなり少ない非ヒトコンポーネントを含むためヒトにおける免疫反応を誘発する可能性が低いと予想される。ＣＤＲ「移植」によりモノクローナル抗体をヒト化する方法は、「再構築（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）」と呼ばれている（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜７頁およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４〜６頁）。
５．５ 抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は、細胞内周辺腔内に産生させるか、または媒体中に直接分泌させることができる。抗体を細胞内に産生させる場合、第１段階として、宿主細胞または溶解フラグメントである粒子状デブリを例えば、遠心分離または限外濾過により除去する。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３〜７頁（１９９２）は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の周辺腔に分泌される抗体を分離する方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間にわたって解凍する。細胞デブリは遠心分離により除去することができる。抗体が媒体中に分泌される場合には、そのような発現システムの上清を一般的に最初に市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮する。タンパク質溶解を抑制するためにＰＭＳＦのようなプロテアーゼインヒビターを先行する工程のいずれかに含めることができ、外来性汚染物の成長を妨げるために抗生物質を含めることができる。
細胞から調製する抗体組成物は、好ましくはＬＰＨＩＣの前に少なくとも１つの精製工程にかける。適切な精製工程の例は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーなどであり、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製法である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソ型に依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、１９８３ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３頁）。すべてのマウスイソ型およびヒトγ３にはプロテインＧが推奨される（Ｇｕｓｓら、１９８６ ＥＭＢＯＪ．５：１５６７〜７５頁）。アフィニティーリガンドが付着するマトリックスはアガロースが最も多いが、他のマトリックスの利用可能である。多孔性制御ガラスあるいはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリックスは、アガロースにより達成することができるよりも速い流速と短い処理時間を実現することが可能である。抗体がＣＨ３領域を含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が精製に有用である。イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上クロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上クロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂上クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムなど）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術も、回収する抗体によって利用可能である。
予備精製工程の後に、問題の工程および汚染物質を含む混合物をＬＰＨＩＣに供する。しばしば、精製すべき抗体組成物は、前の精製工程の緩衝液中に存在する。しかし、ＬＰＨＩＣ工程の前に緩衝液を抗体組成物に加えることが必要である可能性がある。多くの緩衝液が利用可能であり、常用実験により選択することができる。精製する抗体およびローディングバッファ中の少なくとも１つの汚染物質を含む混合物のｐＨは、出発ｐＨによって酸または塩基を用いて約２．５〜４．５のｐＨに調整する。好ましくは、ローディングバッファは低い塩濃度を有する（すなわち、約０．２５Ｍ塩より低い）。
混合物をＨＩＣカラム上に加える。ＨＩＣカラムは通常、疎水性リガンド（例えば、アルキルまたはアリール基）が結合する塩基性マトリックス（例えば、架橋アガロースまたは合成コポリマー材料）を含む。好ましいＨＩＣカラムは、フェニル基で置換されたアガロース樹脂を含む（例えば、フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）カラム）。多くのＨＩＣカラムは市販されている。例は、低または高置換のフェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ６ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（商標）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）、フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）高性能カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）、オクチルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）高性能カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（商標）ＥＭＤプロピルもしくはＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（商標）ＥＭＤフェニルカラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）、ＭＡＣＲＯ−ＰＲＥＰ（商標）メチルもしくはＭＡＣＲＯ−ＰＲＥＰ（商標）ｔ−ブチル保持体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カルフォルニア）、ＷＰ ＨＩ−プロピル（Ｃ３）（商標）カラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー）およびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）エーテル、フェニルもしくはブチルカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ、ＰＡ）を含むが、これらに限定されない。
抗体は、通常ローディングバッファと同じである溶出緩衝液を用いてカラムから溶出させる。溶出緩衝液は、常用実験を用いて選択することができる。溶出緩衝液のｐＨは、約２．５〜４．５であり、低い塩濃度を有する（すなわち、約０．２５Ｍ塩より低い）。問題の抗体を溶出させるために塩勾配を用いる必要はないことが発見された。所望の生成物は、カラムにさほど結合しないフロースルー画分中に回収される。
ＬＰＨＩＣ工程は、適切に折りたたまれ、ジスルフィド結合した抗体を不必要な不純物（例えば、不適切に結合した軽および重フラグメント）から除去する方法を提供する。特に、該方法は、軽鎖と重鎖がジスルフィド結合により結合していない適切に折りたたまれた抗体フラグメントと本明細書で特徴付けられている不純物を実質的に除去する手段を提供する。
精製タンパク質の診断または治療用製剤は、抗体組成物を、例を以下に示す生理的に許容できる担体の形で提供することにより調製することができる。
ＨＩＣカラムを再使用できるようにＨＩＣカラムから不純物（例えば、折りたたまれていない抗体ならびに不適切に結合した軽および重フラグメント）を除去するために、尿素を含む組成物（例えば、６．０Ｍ尿素、１％ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．０、４ｍＭ硫酸アンモニウム）をカラムに流すことができる。他の方法が当技術分野で知られている。
５．６ 免疫グロブリン製剤
所望の治療効果を有する抗体および免疫グロブリンは、生理的に許容できる担体に混入して対象に投与することができる。抗体は、皮下、硬膜下、静脈内、筋肉内、くも膜下腔、腹腔内、大脳内、動脈内または病変内投与経路を含む非経口投与、局所（例えば、外科的適用または外科的坐剤）および肺（例えば、エアゾール剤、吸入剤または散剤）を含むが、これらに限定されない様々な方法、ならびにさらに下で述べるように投与することができる。
導入の方法によって、免疫グロブリンは様々な方法で製剤化することができる。製剤中の治療上有効な免疫グロブリンの濃度（すなわち、炎症性腸状態を診断かつ／または治療するのに十分な製剤）は、約１ｍｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌまで変化し得る。好ましくは、免疫グロブリン組成物は、それを必要とする対象に投与するとき、対象において約１０ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上の免疫グロブリンの血中濃度に達する。
好ましくは、免疫グロブリンは、滅菌生理食塩溶液のような適切な不活性担体で非経口投与用に製剤化する。例えば、担体溶液中の免疫グロブリンの濃度は、一般的に１〜１００ｍｇ／ｍｌである、投与量は、投与経路によって決定される。好ましい投与経路は、非経口または静脈内投与である。
非経口投与の場合、本発明の抗体は、生理的に許容できる希釈剤中物質の溶液または懸濁液の注射投剤として投与することができ、界面活性剤および他の製剤を添加した、または添加しない水および油であってよい薬剤担体は、石油、動物、植物または合成由来のもの、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油および鉱油である。一般的に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射液剤用の好ましい液体担体である。本発明の抗体は、有効成分の持続放出を可能にするように製剤化することができるデポ注射剤または植込剤の形で投与することができる。好ましい組成物は、ＨＣｌでｐＨ６．０に調整した５０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌからなる水性緩衝液で製剤化した５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体を含む。
本発明の重要な特徴によれば、ＶＬＡ−４を認識し、それに結合する免疫グロブリンは、単独で、あるいはクローン病のような炎症性腸疾患、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症を治療するために一般的に用いられる他の薬剤と併用して投与することができる。これらの薬剤の投与は、免疫グロブリンの投与の前、同時または後に行うことができる。好ましくは、他の薬剤はステロイドではない。
抗体または免疫グロブリン、例えば、ナタリズマブの治療上有効な量は、既知の抗体の確立された有効量との比較により、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいてナタリズマブについて得られたデータを考え合わせて推定することができる。好ましくは、データは、適宜、クローン病のような炎症性腸疾患、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および脊椎関節症の治療に試験から得られたデータである。当技術分野で知られているように、免疫グロブリンの変性または代謝、全身対局所送達、ならびに免疫グロブリンを投与する対象の年齢、体重、一般健康状態、性、食事、投与時間、薬物相互作用および状態の重症度により、用量の調節が必要である。当業者がそのような調節は行い、常用実験により適切な用量を決定することができる。
免疫グロブリンの治療用製剤は、所望の程度の純度を有する免疫グロブリンを任意選択の生理的に許容できる担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６ｔｈ ｅｄ．、Ａ．Ｏｓｏｌ、Ｅｄ、１９８０年およびより最新の版）と混合して、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で保存用に調製する。許容できる免疫グロブリン担体、賦形剤または安定化剤は、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して無毒性、非治療的かつ／または非免疫原性であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝剤、アスコルビン酸を含む抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンのようなアミノ酸、グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート化剤、マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール、ナトリウムのような塩形成対イオン、および／またはトゥイーン、プルロニクス（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤などである。担体分子の特定の例は、グルコサミノグルカン（例えば、ヘパリン硫酸）、ヒアルロン酸、硫酸ケタラン、コンドロイチン４硫酸、コンドロイチン６硫酸、ヘパラン硫酸およびダルマチン硫酸、パーレカン（ｐｅｒｌｅｃａｎ）およびペントポリ硫酸を含むが、これらに限定されない。
免疫グロブリンを含む薬剤組成物は、所望ならば、動物またはヒトへの投与用の薬剤組成物を調合するのに一般的に用いられる賦形剤である製薬上許容できる無毒性担体または希釈剤も含んでいてよい。希釈剤は、配合剤の生物学的活性に影響を及ぼさないように選択する。例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンクス液を含むが、これらに限定されない。
本発明の薬剤は、植物もしくは他の同様な油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールのような水性または非水性溶媒にそれらを溶解、懸濁または乳化して、注射剤に製剤化することができる。該製剤は、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤および保存剤も含んでいてよい。
免疫グロブリンはまた、吸入または肺送達により投与するためのエアゾール剤で用いることができる。本発明の薬剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の許容できる加圧噴射剤中に配合することができる。
免疫グロブリンはまた、例えば、コアセルベーション法もしくは界面重合により調製したマイクロカプセル（例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリメチルメタクリレートマイクロカプセル）、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中に封じ込めることができる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（前出）に開示されている。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に用いる免疫グロブリンは、無菌性でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に滅菌濾過膜により容易に実現することができる。免疫グロブリンは、通常、凍結乾燥の形態で、あるいは溶液として保存する。
治療用免疫グロブリン組成物は、一般的に滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針または同様な鋭利な器具を挿入できる栓を有する静脈注射液バッグまたはバイアルに入れる。
徐放性製剤の適切な例は、タンパク質を含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリックスなどであり、マトリックスは成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例は、Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７〜２７７頁（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８〜１０５頁（１９８２）により記述されたようにポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−グルタミン酸ガンマエチル（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ２２：５４７〜５５６頁、１９８３）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、前出）、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）のような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（すなわち、乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロライドからなる注射用マイクロスフェア）およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）などである。
エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日間にわたって分子を放出できるが、ある種のヒドロゲルは、より短期間分子を放出する。カプセル封入抗体が体内に長期間にわたって留まっているとき、それらは３７℃での水分への曝露の結果として変性または凝集して、生物学的活性の喪失と免疫原性の変化が引き起こされる可能性がある。免疫グロブリンの安定化について、関係するメカニズムに応じて合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されたならば、スルフヒドリル残基を修飾し、酢酸溶液から凍結乾燥し、適切な添加剤を用いて水分を調節し、特定のポリマーマトリックス組成物を開発する等によって安定化を達成することができる。
徐放性免疫グロブリン組成物は、リポソームにより封じ込められた免疫グロブリンも含む。免疫グロブリンを含むリポソームは、既知の方法により調製する。例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ８２：３６８８〜９２頁（１９８５）、Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ７７：４０３０〜４頁（１９８０）、米国特許第４４８５０４５号、第４５４４５４５号、第６１３９８６９号および第６０２７７２６号を参照のこと。通常、リポソームは小さく（約２００〜約８００オングストローム）、脂質含量が約３０モル％コレステロール以上である単層型であり、最適免疫グロブリン療法のために選択する割合を調節する。
本発明の免疫グロブリンは、有効成分の持続放出を可能にするように処方することができる徐放型、例えば、デボ注射剤、植込剤または浸透圧ポンプで投与することができる。徐放性製剤用の植込剤は、当技術分野でよく知られている。植込剤は、生分解性または非生分解性ポリマーを用いてマイクロスフェア、スラブ等として製剤化される。例えば、乳酸および／またはグリコール酸のポリマーは、宿主による忍容性が良好である侵食性ポリマーを形成する。植込剤は、当該部位における有効成分の局所濃度が身体の残部より高くなるように、タンパク質沈着の部位（例えば、神経変性障害に伴うアミロイド沈着の形成の部位）に近接して植え込む。
さらに、炎症性腸状態を診断かつ／または治療する免疫グロブリンは、全または部分抗体（例えば、単鎖Ｆｖ）をエンコードするポリヌクレオチドを対象に投与することにより提供することができる。ポリヌクレオチドは、対象における免疫グロブリンの治療上有効な量での発現を可能にするために適切な賦形剤に混入して対象に投与する。
免疫グロブリンの一般的な１日投与量は、本明細書で言及する因子によって約１μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ以上またはそれ以上までの範囲にある。一般的に、臨床医は所望の効果を達成する用量に達するまで免疫グロブリンを投与する。この治療の経過は、通常のアッセイにより容易にモニターされる。
「安定な」抗体または抗体フラグメント製剤は、製剤中のタンパク質が保存中にその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的安定性を保持しているものである。タンパク質の安定性を測定するための種々の分析技術は、当技術分野で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７〜３０１頁（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｐｕｂｓ．１９９１）およびＡ．Ｊｏｎｅｓ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９〜９０頁（１９９３）に総説されている。安定性は、選択した温度で選択した時間測定することができる。好ましくは、製剤は室温（約３０℃）もしくは４０℃で少なくとも１カ月間安定かつ／または約２〜８℃で少なくとも１年間、少なくとも約２年間安定である。さらに、製剤は、好ましくは製剤の凍結（例えば、−７０℃への）および解凍の後に安定である。
色および／または透明度の目視検査で、あるいはＵＶ光散乱またはサイズ排除クロマトグラフィーにより測定したとき、凝集、沈殿および／または変性の徴候を示さない場合、タンパク質は製剤中で「その物理的安定性を保持している」。
所定の時点の化学的安定性が、タンパク質が下で定義するようにその生物学的活性を依然として保持しているとみなされるようなものである場合、タンパク質は製剤中で「その化学的安定性を保持している」。化学的安定性は、タンパク質の化学的に変化した形態を検出し、定量化することによって評価することができる。化学的変化は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化法／飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ）を用いて評価することができるザイズ変化（例えば、クリッピング）を含む可能性がある。他の種類の化学的変化は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより評価することができる電荷変化（例えば、脱アミド化の結果として起こる）を含む。
例えば、抗原結合アッセイにより測定したとき、所定の時点の免疫グロブリンの生物学的活性が、製剤が調製された時点に示された生物学的活性の約１０％の範囲内（アッセイの誤差の範囲内）である場合、免疫グロブリンは「その生物学的安定性を保持している」。
５．７ 免疫グロブリン組成物の投与経路
上述の薬剤組成物は、炎症性腸疾患、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症の診断、予防および／または治療のために投与することができる。治療適用例において、疾患の疑いのある、または既に罹患している患者に組成物を治療を提供するに十分な量で投与する。これを達成するのに十分な量は、治療上または製薬上有効な量と定義される。
薬剤組成物は、予防および／または治療のために非経口、局所、静脈内、経口投与するか、または皮下、筋肉内局所投与、あるいはエアゾールまたは経皮などにより投与する。本発明のタンパク質性物質は経口投与（ｐ．ｏ．）の後に腸を通過して残存するが、デポ注射による皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内投与、あるいは植込製剤による投与が好ましい。
薬剤組成物は、投与方法によって様々な単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与に適する単位剤形は、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤およびトローチ剤などである。
上述の状態の治療用の本発明の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態および他の薬剤投与などの多くの因子によって異なる。したがって、安全性および有効性を最適化するために投与量を調節する必要がある。これらの組成物は、他の治療薬と同様な方法、すなわち、生理的に許容できる担体に混入して獣医使用のために哺乳類に、またヒトにおける臨床使用のために投与することができる。一般的に、投与量は約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常に０．０１〜０．５ｍ／ｋｇ宿主体重である。
好ましい投与法において、抗体は、患者の体重１ｋｇ当たり１〜５ｍｇの用量で静脈内注入または皮下注射により投与する。投与は２〜８週間の間隔で繰り返す。この範囲内では、好ましい投与法は、４週間間隔で体重１ｋｇ当たり３ｍｇ抗体の投与を繰り返すことである。
６．０ 薬剤の併用
他の薬剤は、炎症性腸疾患、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症の治療のために現在使用されている。これらおよび他の薬剤も本明細書に開示する化合物および組成物との併用が考慮される。本明細書に開示する化合物および組成物とのカクテルおよび／または組合せで用いる１つまたは複数の薬剤の選択は、疾患の管理に依存する。例えば、本明細書に開示する化合物および組成物は、クローン病をさらに治療し、症状を抑制するために免疫抑制薬とともに投与することができる。
本明細書に開示する化合物および組成物と併用する薬剤の剤形は、対象および用いる薬剤の組合せによって異なる。
７．０ 長期投与法
本発明の長期投与法は、必要とする患者における病的炎症を抑制するのに十分な受容体飽和を維持するレベルのα４インテグリン剤（例えば、小分子または免疫グロブリン）を供給する。本発明の方法は、２週間ごとに１回または１カ月に１回から２カ月ごとに１回投与することを必要とし、反復投与を少なくとも６カ月間にわたり、より好ましくは１年間またはそれ以上の期間にわたり行う。本発明の方法は、約６５％〜１００％、より好ましくは７５％〜１００％、より好ましくは８０〜１００％の範囲のα４インテグリンを含む二量体（例えば、ＶＬＡ−４）の患者における受容体飽和レベルを得て、維持することを含む。これらの受容体飽和レベルは、病的炎症の継続的抑制を可能にするためにこれらのレベルに長期に（例えば、６カ月間程度の期間にわたり）維持される。
特定の実施形態において、治療薬は抗体、好ましくはヒト化またはヒト抗体であり、投与は１カ月に１回である。受容体飽和度をモニターして投与法の有効性を判定し、生理学的マーカーを測定して投与法の成功を確認することができる。確認として、抗体の血清レベルをモニターして、抗体のクリアランスを確認し、治療の有効性に対する半減期の有望な影響を検討することができる。
他の特定の実施形態において、治療薬は小分子であり、投与は１カ月に１回である。飽和度をモニターして投与法の有効性を判定し、生理学的マーカーを測定して投与法の成功を確認することができる。
本発明の薬剤の投与については、用量範囲は、宿主体重に対して約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は０．０１〜５ｍｇ／ｋｇである。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。用量および頻度は、本発明の薬剤の半減期によって異なる。用量および投与頻度は、投与が予防的であるか、治療的であるかによって異なる。免疫グロブリン投与については、各投与注射は一般的に２．０〜８．０ｍｇ／ｋｇの投与である。化合物投与については、各投与注射は一般的に１．０〜５０．０ｍｇ／ｋｇの投与である。本明細書に記載した教示によれば、患者から体液試料を得ることによって有効量をモニターすることができる。このために、一般的に血清または脳脊髄液試料を採取し、インテグリン受容体飽和度を当技術分野でよく知られている方法を用いて測定する。理想的には、試料は最初の投与の前に採取し、その後の試料は毎回の投与の前および／または後に採取し、測定する。
反復個別投与からなる長期投与に代わるものとして、炎症性腸疾患、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、宿主対移植片病および種々の脊椎関節症の治療用薬剤は、用量が炎症を抑制するのに十分なレベルの受容体飽和度に維持されるようなものであるならば、徐放性製剤として投与することができる。例えば、放出制御システムは、本発明の範囲内の薬剤を長期に投与するために用いることができる。適切な放出制御剤形の考察は、Ｌｅｓｃｚｅｋ Ｋｒｏｗｃｚｙｎｓｋｉ、ＥＸＴＥＮＤＥＤ−ＲＥＬＥＡＳＥ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ、１９８７（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）に見いだすことができる。
種々の放出制御技術は、非常に広いスペクトルの薬剤剤形を対象として含む。放出制御技術は、物理的システムおよび化学的システムを含むが、これらに限定されない。物理的システムは、マイクロカプセル化、マクロカプセル化および膜システムのような速度制御膜を含むリザーバシステム、中空繊維、超微細孔セルローストリアセテートならびに多孔性ポリマー物質および発泡体のような速度制御膜を含まないリザーバシステム、無孔性ポリマーまたはエラストマーマトリックス（例えば、非侵食性、侵食性、環境物質移入および分解性）中に物理的に溶解したシステムおよび無孔性ポリマーまたはエラストマーマトリックス（例えば、非侵食性、侵食性、環境物質移入および分解性）中に物理的に分散した物質を含むモノリスシステム、外側制御層と化学的に類似または類似しないリザーバ層を含む積層構造、浸透圧ポンプまたはイオン交換樹脂上への吸着のような他の物理的方法を含むが、これらに限定されない。
化学的システムは、ポリマーマトリックスの化学的侵食（例えば、不均一もしくは均一侵食）またはポリマーマトリックスの生物学的侵食（例えば、不均一もしくは均一侵食）を含むが、これらに限定されない。放出制御のシステムのカテゴリーのさらなる考察は、Ａｇｉｓ Ｆ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ、ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ ＲＥＬＥＡＳＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ：ＭＥＴＨＯＤＳ、ＴＨＥＯＲＹ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、１９８０（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）に見いだすことができる。
本発明の方法は、病的炎症に伴う、または起因する障害に罹患している患者を治療するため、または特定の障害のリスクがある患者を予防的に治療するために用いることができる。予防的対治療的投与に必要な投与法は、それぞれ異なり、特定の使用および治療する障害についてデザインする必要がある。
一部の方法において、１つまたはそれ以上の薬剤（例えば、本明細書に開示する異なる結合特異性を有するモノクローナル抗体、モノクローナル抗体および化合物）を同時に投与する。この場合、投与する各薬剤の用量は、指示される範囲内に入る。所望の時間間隔が投与の期間である場合に、薬剤を患者に逐次的に投与する併用療法も発生し得る。受容体飽和度の測定により示されるとき、または疾患経過の他の徴候によって、間隔は不規則にもなり得る。
当業者は、用量レベルは特定の薬剤、症状の重症度および副作用に対する対象の感受性の関数として異なることがあることを容易に理解するであろう。一部の特定の薬剤は、他より有効性が高い。所定の薬剤の好ましい用量は、当業者が様々な手段によって容易に決定することができる。好ましい手段は、所定の薬剤の生理学的効力を測定することである。
予防的適用において、薬剤組成物を、特定の疾患に罹患しやすい、あるいはそのリスクがある患者に疾患のリスクを除去または低減あるいは疾患の発症を遅延させるのに十分な量で長期に投与する。そのような量は、予防的に有効な量と定義される。寛解状態にある多発性硬化症患者では、リスクは、ＮＭＲ撮像により、あるいは場合によって、患者により観察される前徴により評価することができる。
上記の状態の治療のための本発明の組成物の有効な投与法は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態および投与される他の薬剤を含む多くの因子によって異なる。したがって、投与量は、安全性および有効性を最適化するために調節する必要がある。一般的に、投与法の各投与量は、約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、通常約０．０１〜約５０、より通常約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇ宿主体重である。
８．０ 試験試薬
試薬は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。当技術分野で知られているように、試薬がα４サブユニットに結合するかどうかを試験するための多くのｉｎ ｖｉｖｏモデルが存在する。試薬が炎症性腸状態ならびに他の炎症状態の診断および／または治療でｉｎ ｖｉｖｏ活性を有するかどうの試験は、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）動物モデルを用いて行うことができる。ＥＡＥは、多発性硬化症と類似性を有する脳神経系の炎症状態である（Ｐａｔｅｒｓｏｎ、ｉｎ ＴＥＸＴＢＯＯＫ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＰＡＴＨＯＬＯＧＹ、ｅｄｓ．Ｍｉｅｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ、１７９〜２１３頁、Ｇｒｕｎｅ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｔｏｎ、Ｎ．Ｙ．１９７６）。
ＥＡＥ脳の切片をそれらの白血球付着を支持する能力について、例えば、ＳｔａｍｐｅｒおよびＷｏｏｄｒｕｆｆ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４４：８２８〜８３３頁（１９７６）に記載されているｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイを用いて試験することができる。白血球付着受容体に対する試薬の阻害活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切片アッセイで検討することができる。Ｕ９３７細胞（ヒト単核細胞株）の付着は、ヒトＶＬＡ−４抗原に対する抗体によりほぼ完全に阻害された。該抗体は、他の接着分子に対する抗体と比較して有意に大きい阻害作用をもたらした。
驚くべきことに、α４インテグリン（Ｐ４Ｇ９およびＨＰ１／７）のフィブロネクチン結合活性を選択的に阻害する抗体がＥＡＥ血管へのＵ９３７の付着を促進した。これらの結果は、α４インテグリンのフィブロネクチン結合活性はｉｎ ｖｉｔｒｏでのＥＡＥ血管へのＵ９３７接着に直接関与しないことを示唆している。上記のα４β１試薬を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果を考慮すると、ＥＡＥの経過に対するこれらの抗体の効果は、麻痺の発症の遅延または麻痺の重症度の低下を測定することによりｉｎ ｖｉｖｏでも試験することができる。
炎症性腸状態の診断および／または治療に有効なさらなる試薬は、接着アッセイを用いて特定することができる。例えば、ＨＰ２／１またはＮ−［Ｎ−（３−ピリジンスルホニル）−Ｌ−３，３−ジメチル−４−チアプロピル］−Ｏ−［１−メチルピペラジン−４−イルカルボニル］−Ｌ−チロシンイソプロピルエーテルを対照として用いて、他の抗体または試薬をα４β１インテグリンに対する既知のリガンドに対するリンパ球の結合を阻害するそれらの能力についてスクリーニングすることができる。ＶＬＡ−４白血球細胞表面受容体のα４サブユニットを標的にすることにより、接着を阻害するいくつかのさらなる試薬を特定することができる。
本発明の方法および組成物に有用なモノクローナル抗体は、すべての目的のためにその全体を参照により本明細書に援用する米国特許第６０３３６６５号に述べられている例えば、ＨＰ２／１、ＴＹ２１．６、ＴＹ２１．１２およびＬ２５などである。これらの抗体は、ＶＬＡ−４のα鎖と反応し、ＶＣＡＭ−１、フィブロネクチンおよび炎症脳内皮細胞への結合を阻害するが、β１インテグリンファミリーの他のメンバーの活性に影響を及ぼさない。
ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１標的に対して選択的に反応する他の試薬も用いることができる。この試薬はさらに、マトリックス相互作用（β１インテグリンのすべてのメンバーによって媒介される）に影響を及ぼさず、正常な腸免疫（α４β７によって媒介される）にも影響を及ぼさない。これおよび他のそのような試薬の製造は、十分に当技術分野の技術の範囲内にある。
薬剤がα４β１および／またはα４β７活性を示すかどうかを検討するためのアッセイは、当業者に知られている。
例えば、あるアッセイにおいて、化合物は固体支持体およびそれに加えられたα４β７インテグリンに結合させることができる。試料中のα４β１またはα４β７の量は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの使用のような通常の方法により測定することができる。さらに、本発明の特定の化合物は、α４β１またはα４β７インテグリンによって媒介される粘膜器官の内皮細胞および上皮細胞への白血球の接着をｉｎ ｖｉｖｏで阻害し、したがって、α４β１またはα４β７インテグリンによって媒介される疾患の治療に用いることができる。
上で特定された化合物の生物学的活性は、様々なシステムで検定することができる。例えば、化合物を固体表面の固定化することができ、α４β１またはα４β７インテグリンを発現する細胞の接着を測定することができる。そのような方式を用いて、多数の化合物をスクリーニングすることができる。このアッセイに適する細胞としては、メモリーＴ細胞および好酸球のようなα４β１またはα４β７インテグリンを発現することが知られているあらゆる白血球などが挙げられる。多くの白血球細胞系を用いることができ、例としては細胞系ＰＲＭＩ−８８６６などがある。
化合物はまた、α４β１またはα４β７インテグリンとＭＡｄＣＡＭ−１との間、またはα４β１またはα４β７インテグリンと本発明の化合物もしくはα４β７インテグリンに対する抗体のようなα４β１またはα４β７インテグリンに結合することが知られている表示化合物との間の結合を競合的に阻害する能力について試験することができる。これらのアッセイでは、ＭＡｄＣＡＭ−１を固体表面上に固定化することができる。ＭＡｄＣＡＭ−１は、α４β７インテグリンへの結合をイムノアッセイで検出できるように、Ｉｇテイル（例えば、ＩｇＧＦｃ）を有する組換え融合タンパク質として発現させることもできる。あるいは、活性化内皮細胞またはＭＡｄＣＡＭ−１トランスフェクト線維芽細胞のようなＭＡｄＣＡＭ−１発現細胞を用いることができる。
α４β７およびα４β１は、ＶＣＡＭ−１およびフィブロネクチンに対する接着を媒介することができる。ＶＣＡＭ−１およびフィブロネクチンに対する接着を阻害する能力を測定するアッセイについては、国際特許出願公開番号ＷＯ ＵＳ９８／１５３２４に記述されているアッセイが特に好ましい。この出願は、その全体を参照により本明細書に合体する。
多くのアッセイ方式で標識アッセイコンポーネントを用いている。標識システムは、様々な形であり得る。標識は、当技術分野でよく知られている方法に従ってアッセイの所望のコンポーネントに直接または間接的に結合させることができる。様々な標識を用いることができる。コンポーネントは、いくつかの方法のうちのいずれかによって標識することができる。最も一般的な検出方法は、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ標識化合物等を用いるオートラジオグラフィーである。非放射性標識としては、標識リガンドの特異的結合対メンバーとしての役割を果たし得る、標識抗体、発蛍光団、化学発光剤、酵素および抗体に結合するリガンドなどがある。標識の選択は、要求される感度、化合物との共役の容易さ、安定性要件および利用可能な器具に依存する。
炎症反応の治療の有効性を実証するための適切なｉｎ ｖｉｖｏモデルは、マウス、ラット、モルモットまたは霊長類におけるＥＡＥ（実験的自己免疫脳脊髄炎）ならびにα４インテグリンに依存する他の炎症モデルなどである。
所望の生物学的活性を有する化合物は、薬理特性（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、生物学的利用能）の改善、または診断適用例において検出される可能性などの所望の特性を得るために、必要に応じて修飾してもよい。例えば、本発明のスルホンアミドに１つまたは複数のＤ−アミノ酸を含めることによって、一般的にｉｎ ｖｉｖｏ安定性が増大する。安定性は、ペプチダーゼまたはヒト血漿もしくは血清とのインキュベーション中のタンパク質の半減期を測定するなどの様々な方法で試験することができる。多くのそのようなタンパク質安定性試験が記載された（例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．、１９９０、１５（２）：８３〜９３頁を参照）。
以下の実施例は、本発明をどのようにしてなし、使用するかの完全な開示と説明を当業者に提供するように提示するものであり、発明者らがその発明として考えることの範囲を限定することを意図するものでも、また下の実験が実施したすべてまたは唯一の実験であることを示すことを意図するものでもない。用いた数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保するための努力は払ったが、ある程度の実験誤差および偏りは考慮すべきである。
［実施例１］
可溶性ＭａｄＣＡＭ−１ＦＡＣＳアッセイ
このアッセイは、懸濁液中の組換え可溶性ＭａｄＣＡＭ−１とＰＲＭＩ−８８６６細胞との相互作用を測定する。組換え可溶性ＭａｄＣＡＭ−１（「ｒｓＭａｄＣＡＭ−１」）はヒトＩｇＧＦｃテイルを有する融合タンパク質として発現する（Ｔｉｄｓｗｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５９（３）：１４９７〜１５０５頁）。可溶性ＭａｄＣＡＭ−１を小分子インヒビターの存在下および非存在下でＰＲＭＩ−８８６６細胞と混合する。α４β７インテグリンの活性を増大させ、それとＭａｄＣＡＭ−１構成体との相互作用を促進するために、１ｍＭ ＭｎＣｌ２をアッセイ緩衝液に含める。室温で３０分後に、細胞を１ｍＭ ＭｎＣｌ２を含む緩衝液で洗浄し、１ｍＭ ＭｎＣｌ２の存在下でＭａｄＣＡＭ−１融合タンパク質のＦｃテイルに対する蛍光標識抗体に４℃で３０分間曝露させる。細胞を洗浄し、ＭｎＣｌ２含有緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ分析により検査する。組換え可溶性ＶＣＡＭ−１とＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞系のようなα４β１を発現する細胞との相互作用を測定するために、同じアッセイを実施することができる。
［実施例２］
無細胞ＥＬＩＳＡアッセイ
このアッセイは、可溶化α４β７インテグリンとプラスチック上に固定化したＭａｄＣＡＭ−１との相互作用を測定する。ＲＰＭＩ−８８６６細胞を界面活性剤で溶解してα４β７インテグリンを可溶化する。β７インテグリンに対する抗体２Ｇ３（Ｔｉｄｓｗｅｌｌら、１９９７Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９（３）：１４９７〜１５０５頁）を溶解産物に加える。この抗体は、２つの目的に役立ち、第１は、アッセイでα４β７インテグリンを検出できる標識であり、第２は、２Ｇ３はβ７インテグリンのリガンド占有コンフォーメーションを安定化し、β７インテグリン依存性相互作用を促進する。細胞溶解産物、２Ｇ３および試験試薬を、ＭａｄＣＡＭ−１を被覆したマイクロタイターウエルに加える。混合物を室温で３０分間インキュベートする。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡでブロックし、アッセイウエル上でＭａｄＣＡＭ−１に結合したα４β７インテグリンに関連する２Ｇ３を認識するＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇに曝露させる。室温で３０分後に、ウエルを洗浄し、ＨＰＲの基質に曝露させて、ＭａｄＣＡＭ−１に結合したα４β７インテグリンの量を定量する。
［実施例３］
受容体占有に関するＦＡＣＳアッセイ
このアッセイは、抗体２Ｇ３とＲＰＭＩ−８８６６細胞またはリンパ球との相互作用を測定する。抗体は、ラットまたはヒトβ７インテグリンのリガンド占有エピトープを認識する。小分子リガンドの濃度を増加させることにより、β７インテグリン上の２Ｇ３エピトープが誘導され、細胞表面へのより高いレベルの抗体結合が可能になる。受容体占有に必要なリガンドの濃度は、α４β７インテグリンに対するリガンドの親和力に直接関連する。β１インテグリンのリガンド占有エピトープに対する類似抗体（抗体１５／７。Ｙｅｄｎｏｃｋら、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８７４０〜５０頁）を用いる、リガンドとα４β７インテグリンとの相互作用を検討するための同様なアッセイが記載された。β１インテグリンアッセイは、α４β７インテグリンでなく、α４β１インテグリンを発現する細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞のような）に依拠している。両アッセイにおいて、適切な細胞を小分子リガンドの存在下で２Ｇ３または１５／７と混合する。細胞を室温で３０分間インキュベートし、洗浄して非結合抗体を除去する。細胞を、細胞結合２Ｇ３または１５／７を検出するマウスＩｇＧに対する蛍光標識抗体に曝露させ、細胞をＦＡＣＳ分析により検査する。
［実施例４］
ｅｘ ｖｉｒｏ細胞接着アッセイ
このアッセイは、パイエル板（腸に関連するリンパ様組織）の組織切片中で曝露させた高内皮細静脈へのリンパ球またはＲＰＭＩ−８８６６の接着を測定する。これらの血管は高レベルのＭａｄＣＡＭ−１を発現する。このアッセイは、Ｙｅｄｎｏｃｋら、ＪＣＢ（１９８７）１０４：７２５〜７３１頁により記述された。
［実施例５］
ｉｎ ｖｉｔｒｏ移動アッセイ
１１１Ｉｎ標識または蛍光標識リンパ球のパイエル板へのｉｎ ｖｉｖｏ移動。このアッセイでは、リンパ球を１群の動物から分離し、放射性または蛍光とレーサーで標識する。細胞を第２群の動物に静脈内注射する。１〜２４時間後に、種々の組織に関連する放射能カウント数をガンマ線カウンターで測定するか、または組織からリンパ球を分離し、蛍光標識を運ぶ細胞数を測定すること（ＦＡＣＳ分析により測定）により、種々の組織への標識細胞の局在化をモニターすることができる。この種のアッセイは、Ｒｏｓｅｎら、１９８９ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：１８９５〜１９０２頁に記載されている。
［実施例６］
ＶＬＡ−４に対する候補試薬の結合を測定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、候補試薬のα４β１インテグリンへの結合を評価した。このアッセイで結合する試薬は、通常のアッセイ（例えば、競合的結合アッセイ）により生物学的試料中のＶＣＡＭ−１のレベルを評価するのに用いることができる。このアッセイは、約１ｎＭ程度の低いＩＣ５０値に対して感度が良い。
α４β１インテグリンの活性は、可溶性ＶＣＡＭ−１と、高レベルのα４β１インテグリンを発現するヒトＴ細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎｏｓ．ＴＩＢ１５２、ＴＩＢ１５３およびＣＲＬ８１６３）との相互作用により測定した。ＶＣＡＭ−１は、細胞表面とα４β１インテグリン依存的に相互作用する（Ｙｅｄｎｏｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、１９９５、２７０：２８７４０頁）。
組換え可溶性ＶＣＡＭ−１は、Ｎ末端上のＶＣＡＭ−１の７つの細胞外ドメインを含むキメラ融合タンパク質およびＣ末端上のヒトＩｇＧ１重鎖定常領域として発現した。ＶＣＡＭ−１融合タンパク質は、Ｙｅｄｎｏｃｋ（前出）によって記載された方法により調製し、精製した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞は、Ｙｅｄｎｏｃｋ（前出）によって記載されたように１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。
Ｊｕｒｋａｔ細胞を１．５ｍＭ ＭｎＣｌ２および５μｇ／ｍＬ １５／７抗体とともに氷上で３０分間インキュベートした。Ｍｎ＋２は、受容体を活性化してリガンド結合を促進し、１５／７は、α４β１インテグリンの活性化／リガンド占有コンフォーメーションを認識し、分子をこのコンフォーメーションに固定し、それによりＶＣＡＭ−１／α４β１インテグリン相互作用を安定化する。Ｙｅｄｎｏｃｋ（前出）。１５／７抗体に類似した抗体が他の研究者ら（Ｌｕｑｕｅら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：１１０６７頁）によって調製されたので、このアッセイに用いてもよい。
次いで、細胞を、標準５ポイント連続希釈を用いた６６μｇ／ｍＬ〜０．０１μｇ／ｍＬの濃度の候補試薬とともに室温で３０分間インキュベートした。次いで、１５μＬの溶性組換えＶＣＡＭ−１融合タンパク質をＪｕｒｋａｔ細胞に加え、氷上で３０分間インキュベートした（Ｙｅｄｎｏｃｋ、前出）。
次いで、細胞を２回洗浄し、ＰＥ結合ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｉｍｍｎｏｔｅｃｈ、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ）に１：２００で再懸濁し、氷上、暗所で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、Ｙｅｄｎｏｃｋ（前出）によって記載されたように標準蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）分析により分析した。
約１５μＭ未満のＩＣ５０を有する細胞は、α４β１に対する結合親和力を有する。
［実施例７］
α４β１に対する候補試薬の結合を測定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ飽和アッセイ
以下に試薬が、次の実施例で述べる実験的自己免疫脳脊髄炎（「ＥＡＥ」）または他のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて活性であるために必要な血漿中濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを述べる。
対数増殖Ｊｕｒｋａｔ細胞を洗浄し、２０μｇ／ｍＬの１５／７抗体（上の実施例で述べた）を含む正常動物血漿に再懸濁する。
Ｊｕｒｋａｔ細胞を２倍に希釈し、標準曲線のための標準１２ポイント連続希釈を用いた６６μｇ／ｍＬ〜０．０１μｇ／ｍＬの種々の濃度の既知の量の候補試薬を含む正常血漿試料、または試薬投与動物の末梢血から得た血漿試料に入れる。
次いで、細胞を室温で３０分間インキュベートし、２％ウシ胎児血清ならびに各々１ｍＭの塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）（アッセイ培地）で２回洗浄して、非結合１５／７抗体を除去する。
次いで、細胞を、試験する動物種からの５％血清とともにインキュベートすることにより非特異的交差反応性のために吸着させたフィコエリトリン結合ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｉｍｍｎｏｔｅｃｈ、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ）に１：２００で曝露し、暗所で４℃で３０分間インキュベートする。
細胞をアッセイ培地で２回洗浄し、同じものに再懸濁した。次いで、Ｙｅｄｎｏｃｋら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２７０：２８７４０頁に記載されているように、細胞を標準蛍光活性化細胞選別分析により分析する。
次いで、データを蛍光対用量として、例えば、通常の用量−反応表示方式でグラフにする。曲線の上部プラトーを生じさせる用量レベルがｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて有効性を得るために必要なレベルである。
このアッセイは、α４β１インテグリンに最も密接に関連するα９β１インテグリン（Ｐａｌｍｅｒら、１９９３、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．、１２３：１２８９頁）のような他のインテグリンの結合部位を飽和させるために必要な血漿中濃度を決定するのに用いることもできる。
したがって、上記のアッセイは、α９β１インテグリンの結合を測定するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞の代わりにα９インテグリンをエンコードするｃＤＮＡをトランスフェクトしたヒト結腸癌細胞株（ＡＴＴＣ番号ＣＣＬ２２８）（Ｙｏｋｏｓａｋｉら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２６９：２６６９１頁）を用いて実施することができる。対照として、他のαおよびβ１サブユニットを発現するＳＷ４８０細胞を用いることができる。
このアッセイを用いて、このアッセイで試験した本発明の試薬についてα４β１およびα９β１のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて有効性を得るのに必要な血漿中濃度が確定された。
［実施例８］
ヒト化２１．６抗体の構築
ヒト定常領域にマウス２１．６ＶＬおよびＶＨ領域のＰＣＲクローン化ｃＤＮＡｓを結合させて、キメラ軽および重鎖を構築した。特別に設計したＰＣＲプライマーを用いて、マウスｃＤＮＡ配列の５’および３’末端を修飾した。リーダー配列の開始をコードするＤＮＡ配列とハイブリッド形成する５’末端ＰＣＲプライマー（表１）を設計して、効率の良い翻訳に必須のＤＮＡ配列を形成させ（Ｋｏｚａｋ、１９８７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７〜９５０頁）、発現ベクターにクローニングするためのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を形成させた。Ｊ領域の末端をコードするＤＮＡ配列とハイブリッド形成する３’末端プライマーを設計して、定常領域へのスプライシングに必須のＤＮＡ配列を形成させ、発現ベクターにクローニングするためのＢａｍＨＩ制限部位を形成させた。ＰＣＲ増幅の生成物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＵＣ１９ベクターにクローンし、配列決定してＰＣＲ増幅時に過誤が発生しなかったことを確認した。次いで、適応マウス２１．６可変領域をヒトカッパまたはラムダ−１定常領域を含む哺乳類細胞発現ベクターにサブクローンした。
Figure 2013166765
マウス２１．６可変領域の構造のモデリング。マウス２１．６抗体のＶＬおよびＶＨ領域の分子モデルを構築した。モデルは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムのもとで動作し、分子モデリングパッケージＱＵＡＮＴＡ（Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐ、ＵＳＡ）を用いたＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ＩＲＩＳ ４Ｄワークステーションで構築した。マウス２１．６ＶＬ領域のＦＲｓの構造は、ヒトＢｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓ免疫グロブリンＲＥＩの構造解析に基づくものであった（Ｅｐｐら、１９７５ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４：４９４３〜４９５２頁）。マウス２１．６ＶＨ領域のＦＲｓの構造は、マウス抗体Ｇｌｏｏｐ２の構造解析に基づくものであった。ＦＲｓにおける同一の残基は保持され、同一でない残基はＱＵＡＮＴＡ内の機能を用いて置換した。マウス２１．６ＶＬ領域のＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、それぞれ規定構造群２および１に属すると同定された（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９７８、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁）。ＲＥ１のＣＤＲ１およびＣＤＲ２は同じ規定群に属しているので、マウス２１．６ＶＬ領域のＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、ＲＥ１のＣＤＲ１およびＣＤＲ２の構造に基づいてモデル化した。マウス２１．６ＶＬ領域のＣＤＲ３は、ＶＬ領域のＣＤＲ３ｓの規定構造群いずれにも対応していないように思われた。しかし、データベース検索により、マウス２１．６ＶＬ領域のＣＤＲ３はマウスＨｙＨＥＬ−５ＶＬ領域と同様であることが明らかになった（Ｓｈｅｒｉｆｆら、１９８７、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：８０７５〜８０７９頁）。したがって、マウス２１．６ＶＬ領域のＣＤＲ３は、マウスＨｙＨＥＬ−５ＶＬ領域におけるＣＤＲ３の構造に基づいてモデル化した。マウス２１．６ＶＨ領域のＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、それぞれ規定構造群１および２に属すると同定された。マウス２１．６ＶＨ領域のＣＤＲ１は、ＶＨ領域のＣＤＲ１ｓｂの規定群１のメンバーに非常に類似しているＧｌｏｏｐ２ＶＨ領域のＣＤＲ１に基づいてモデル化した。マウス２１．６ＶＨ領域のＣＤＲ２は、ＶＨ領域のＣＤＲ２の規定群２のメンバーでもあるマウスＨｙＨＥＬ−５（Ｓｈｅｒｉｆｆら、前出）のＣＤＲ２に基づいてモデル化した。ＶＬ領域のＣＤＲ３ｓについては、規定構造は存在しない。しかし、マウス２１．６ＶＨ領域のＣＤＲ３は、マウスＲ１９．９ＶＨ領域におけるＣＤＲ３に類似しており（Ｌａｓｃｏｍｂｅら、１９８９、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：６０７〜６１１頁）、マウスＲ１９．９ＶＨ領域のＣＲＤ３ループの頂端に存在する余分のセリン残基を除去し、アニールし、ギャップをリファインして、このＣＤＲ３に基づいてモデル化した。好ましくない原子接触を除去し、ファンデルワールスおよび静電相互作用を最適化するために、ＱＵＡＮＴＡにおいて実施されたようにＣＨＡＲＭＭポテンシャルを用いて、モデルを最終的に最も急な降下および複合体勾配エネルギー最小化に供した（Ｂｒｏｏｋｓら、１９８３、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．４：１８７〜２１７頁）。
再構築ヒト２１．６可変領域の設計−フレームワーク配列のための均一ヒト抗体の選択。ＦＲｓがマウス２１．６のそれと高い割合の同一性を示したヒト可変領域がアミノ酸配列の比較により特定された。表３および４ではマウス２１．６可変領域をすべての既知マウス可変領域と、次にすべての既知ヒト可変領域と比較した。マウス２１．６ＶＬ領域は、Ｋａｂａｔにより定義されたマウスカッパＶＬ領域サブグループ１に属することが確認された。個々のマウスカッパＶＬ領域は、マウス２１．６カッパＶＬ領域と９３．４％と高い同一性を有していたことが確認された（３８Ｃ１３Ｖ’ＣＬおよびＰＣ６１３’ＣＬ）。マウス２１．６ＶＬ領域は、Ｋａｂａｔにより定義されたサブグループ１のヒトカッパＶＬ領域と最も類似していた。個々のヒトカッパＶＬ領域は、マウス２１．６カッパＶＬ領域と７２．４％と高い同一性を有していたことが確認された。最も類似したヒト可変領域の１つであるＲＥ１のフレームワーク領域（ＦＲｓ）を再構築ヒト２１．６ＶＬ領域の設計に用いた。マウス２１．６ＶＨ領域は、Ｋａｂａｔにより定義されたマウスＶＨ領域サブグループ２ｃに属することが確認された。個々のマウス重鎖可変領域は、マウス２１．６ＶＨ領域と９３．３％と高い同一性を有していたことが確認された（１７．２．２５’ＣＬおよび８７．９２．６’ＣＬ）。マウス２１．６ＶＨ領域は、Ｋａｂａｔら、前出により定義されたサブグループ１のヒトＶＨ領域と最も類似していた。個々のヒトＶＨ領域は、マウス２１．６ＶＨ領域と６４．７％と高い同一性を有していたことが確認された。最も類似したヒト可変領域の１つである２１／２８’ＣＬのＦＳｓを再構築ヒト２１．６ＶＨ領域の設計に用いた。
フレームワーク領域におけるアミノ酸の置換
（Ａ）軽鎖。再構築ヒト２１．６ＶＬ領域の設計過程の次の段階は、マウス２１．６ＶＬ領域のＣＤＲｓをヒトＲＥ１のＦＲｓに結合させることであった（Ｐａｌｍら、１９７５、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５６：１６７〜１９１頁）。再構築ヒト２１．６ＶＬ領域の最初のバージョン（Ｌａ）において、ヒトＦＲｓにおける７つの交換を行った。ＦＲ４の位置１０４、１０５および１０７において、ＲＥ１のアミノ酸を他のヒトカッパ軽鎖のより一般的なヒトＪ領域アミノ酸で置換した（Ｒｉｅｃｈｍｅｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３〜３２７頁）。
ＦＲ２の位置４５において、ＲＥ１に通常存在するリシンを、マウス２１．６ＶＬ領域におけるその位置に認められたアルギニンに交換した。この位置のアミノ酸残基は、マウス２１．６ＶＬ領域のＣＤＲ２ループを支持するのに重要であると考えられた。
ＦＲ２の位置４９において、ＲＥ１に通常存在するチロシンを、マウス２１．６ＶＬ領域のその位置に認められたヒスチジンに交換した。マウス２１．６ＶＬ領域におけるこの位置のヒスチジンは、このモデルにおいて結合部位の中間部に位置することが認められ、抗体抗原結合時におそらく抗原と接触していた可能性がある。
ＦＲ３の位置５８において、ＲＥ１に通常存在するバリンを、マウス２１．６ＶＬ領域のその位置に認められたイソロイシンに交換した。この位置のアミノ酸残基は、マウス２１．６ＶＬ領域のＣＤＲ２ループを支持するのに重要であると考えられた。
ＦＲ３の位置６９において、ＲＥ１に通常存在するトレオニンを、マウス２１．６ＶＬ領域のその位置に認められたアルギニンに交換した。マウス２１．６ＶＬ領域におけるこの位置のアルギニンは、このモデルにおいてマウス２１．６ＶＬ領域のＣＤＲ１ループに隣接して位置することが認められ、抗体抗原結合時におそらく抗原と接触していた可能性がある。
再構築ヒト２１．６ＶＬ領域の第２のバージョン（Ｌｂと呼ぶ）は、ＲＥ１のＦＲ２の位置４９における交換を行わなかったことを除いて、上と同じ置換を含むように設計した。
（Ｂ）重鎖。再構築ヒト２１．６ＶＨ領域の設計過程の次の段階は、マウス２１．６ＶＨ領域のＣＤＲｓを２１／２８’ＣＬのＦＲｓに結合させることであった（Ｄｅｒｓｉｍｏｎｉａｎら、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２４９６〜２５０１頁）。再構築ヒト２１．６Ｖ領域の最初のバージョン（Ｈａ）において、ヒトフレームワーク領域における５つの交換を行った。ヒトＦＲｓにおける５つの交換は、位置２７、２８、２９、３０および７１におけるものであった。
ＦＲ１の位置２７、２８、２９および３０において、ヒト２１／２８’ＣＬに存在するアミノ酸を、マウス２１．６ＶＨ領域のそれらの位置に認められたアミノ酸に交換した。これらの位置はＦＲＩ内にある（Ｋａｂａｔら、前出）ように設計されているが、位置２６〜３０は、ＶＨ領域のＣＤＲ１ループを形成する構造ループの一部である。したがって、これらの位置のアミノ酸は抗原への結合に直接関与している。実際、位置２７〜３０は、Ｃｈｏｔｈｉａら、前出により定義されたようなＶＨ領域のＣＤＲ１の規定構造の一部である。
ＦＲ３の位置７１において、ヒト２１／２８’ＣＬに存在するアルギニンを、マウス２１．６ＶＨ領域のそれらの位置に認められたアラニンに交換した。位置７１は、Ｃｈｏｔｈｉａら、前出により定義されたようなＶＨ領域のＣＤＲ２の規定構造の一部である。マウス２１．６可変領域のモデルから、位置７１のアラニンはＶＨ領域のＣＤＲ２ループを支持するのに重要であると思われる。この位置のアラニンをアルギニンに置換することは、ＣＤＲ２ループの配置を妨害する可能性が非常に高いと思われる。
再構築ヒト２１．６ＶＨ領域の第２のバージョン（Ｈｂ）は、バージョンＨａについて上述した５つの交換とＦＲ２における１つの追加の交換を含む。
ＦＲ２の位置４４において、ヒト２１／２８’ＣＬに存在するアルギニンを、マウス２１．６ＶＨ領域のそれらの位置に認められたグリシンに交換した。ＶＬ−ＶＨのパッキングに関する公表情報およびマウス２１．６可変領域のモデルに基づいて、位置４４のアミノ酸残基はＶＬ−ＶＨのパッキングに重要であると思われる。
ＣＤＲ３ループがヒトＶＣＡＭ−１により類似して見えるようにするために、再構築ヒト２１．６Ｖ領域バージョンＨｃを設計した。マウス２１．６抗体およびヒトＶＣＡＭ−１は両者とも、α４β１インテグリンに結合する。抗体のＶＨ領域のＣＤＲ３ループは、６つのＣＤＲループのうちの最も異なるものであり、抗体抗原相互作用における抗体の一般的に最も重要な１成分である（Ｃｈｏｔｈｉａら、前出、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＆Ｗｉｎｔｅｒ、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１〜３８８頁、Ｂａｒｂａｓら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４４５７〜４４６１頁）。マウス２１．６ＶＨ領域のＣＤＲ３とヒトＶＣＡＭ−１のアミノ酸８６〜９４との間、特に、ＣＤＲ３ループにおけるＹＧＮ（チロシン−グリシン−アスパラギン）配列とＶＣＡＭ−１におけるＦＧＮ（すなわち、フェニルアラニン−グリシン−アスパラギン）との間にある程度の配列類似性が確認された。これらの配列は、種々の細胞接着事象において重要なＲＧＤ（すなわち、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列に関連していると考えられる（Ｍａｉｎら、１９９２、Ｃｅｌｌ７１：６７１〜６７８頁）。したがって、ＣＤＲ３の位置９８において、マウス２１．６ＶＨ領域に存在するチロシンをヒトＶＣＡＭ−１の配列に認められるフェニルアラニンに交換した。
ＦＲ２の位置３６における可能な置換も考慮した。マウス２１．６ＶＨ鎖は、ＦＲ２における異常なシステイン残基を含む。ＦＲ２におけるこの位置は、関連マウスおよびヒト配列では通常トリプトファンである。システイン残基は抗体のコンフォーメーションにしばしば重要であるが、マウス２１．６可変領域のモデルは、このシステイン残基が抗原結合に直接または間接的に関連することを示しておらず、したがって、ヒト２１／２８’ＣＬ ＶＨ領域のＦＲ２に存在するトリプトファンは、ヒト化２１．６抗体の３つのバージョンすべてにおいて非置換のままであった。
再構築ヒト２１．６抗体の構築。再構築ヒト２１．６ＶＬバージョン（ｒｅｓｈ２１．６Ｌａ）の最初のバージョンは、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：２４７１〜２４７６頁により記述されたとおりに本質的にオーバーラップＰＣＲフラグメントから構築した。上記のように適応させ、ｐＵＣ１９に挿入した２１．６ＶＨ領域を鋳型として用いた。４対のプライマーＡＰＣＲ１−ｖｌａ１、ｖｌａ２−ｖｌａ３、ｖｌａ４−ｖｌａ５およびｖｌａ６−ｖｌａ７を合成した。隣接した対は、少なくとも２１塩基重複している。ＡＰＣＲ１プライマーは、ｐＵＣ１９ベクターと相補的である。１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２００μＭｄＮＴＰｓおよび１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む５０μＬのＰＣＲ緩衝液中適切なプライマー対（０．２μｍｏｌ）を１０ｎｇの鋳型ＤＮＡおよび１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）と合わせた。各反応は、２５サイクル行わせた。９４℃で５分間の最初の融解の後に、反応を９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間サイクルさせ、最後に７２℃でさらに１０分間インキュベートした。プライマーアニーリングと延長段階との間のランプ時間は、２．５分であった。ＰＣＲ反応の最初のラウンドの４反応（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）の生成物をフェノールで抽出し、エタノールで沈殿させた。
Figure 2013166765
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ＰＣＲ生成物ＡとＢ、およびＣとＤを第２ラウンドのＰＣＲ反応で結合させる。ＰＣＲ生成物ＡとＢ、およびＣとＤ（それぞれ５０ｎｇ）を５０μＬのＰＣＲ反応物（上記のような）に加え、アニーリング温度を６０℃に上昇させたこと以外は、上記のように２０サイクルにより増幅した。これらの反応の生成物をＥおよびＦと呼ぶ。用いたＰＣＲプライマーの対は、それぞれＡＰＣＲ１−ｖｌａ３およびｖｌａ４−ｖｌａ７であった。ＰＣＲ生成物ＥおよびＦをフェノールで抽出し、エタノールで沈殿させ、次いで、末端プライマーとしてＡＰＣＲ１およびｖａｌ７を用いて上記と同様に２段階ＰＣＲ反応でそれら自体の相補性により第３ラウンドのＰＣＲ反応で結合させる。リーダー配列を含む全再構築ヒト２１．６ＶＬ領域を表す完全に結合したフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、配列決定のためにｐＵＣ１９にクローンした。正しい配列を有するクローンをｒｅｓｈ２１．６ＶＬａと呼ぶ。
Ｋａｍｍａｎら、１９８９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５４０４頁の方法により再構築ヒト２１．６ＶＬ領域の最初のバージョン（Ｌａ）におけるわずかな修正を行うためにＰＣＲプライマーを用いて再構築ヒト２１．６ＶＬ領域の第２のバージョン（Ｌｂ）を構築した。２組のプライマーを合成した。基本的には各ＰＣＲ反応を上記と同じ条件下で行わせた。最初のＰＣＲ反応では、突然変異誘発性プライマー２１．６ＶＬｂ２を用いてＳｔｙＩ部位（Ｔｈｒ−ＡＣＣ−９７〜Ｔｈｒ−ＡＣＡ−９７）を破壊してｒｅｓｈ２１．６ＶＬａ２を得た。次いで、２回目のＰＣＲで、突然変異誘発性プライマー２１．６ＶＬｂ１（Ｈｉｓ−４９〜Ｔｒｙ−４９）をｐＵＣ−ｒｅｓｈ２１．６ＶＬａ２とともに鋳型ＤＮＡとして用いた。ＰＣＲ生成物をＳｔｙＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｐＵＣ−ｒｅｓｈ２１．６ＶＬａ２にサブクローンし、同じ制限酵素で切断した。正しい配列を有するクローンをｐＵＣ−ｒｅｓｈ２１．６ＶＬｂと呼ぶ。
再構築ヒト２１．６ＶＨ領域のバージョン「ａ」は、再構築ヒト２１．６ＶＬ領域のバージョン「ａ」の構築について述べたのと同じＰＣＲ法を用いて構築した。再構築ヒト４２５ＶＨ領域のバージョン「ｇ」をコードするＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメント（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、前出）および再構築ヒトＡＵＫ１２−２０ＶＨ領域のバージョン「ｂ」をｐＵＣ１９ベクターにサブクローンして、それぞれｐＵＣ−ｒｅｓｈ４２５ｇおよびｐＵＣ−ｒｅｓｈＡＵＫ１２−２０ｂを得た。（ＡＵＫ１２−２０のバージョン「ｂ」は、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、前出により記載されたフラグメントＶＨａ４２５のＰＣＲ突然変異誘発によって得たものであり、以下のアミノ酸配列をエンコードする。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴ ＳＹＹＩＨ ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＶＧ ＹＩＤＰＦＮＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧ ＫＶＴＭＴＶＤＴＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ ＧＧＮ−ＲＦＡＹ ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（スペースはＦＲ領域とＣＤＲ領域を分別する）
プラスミドｐＵＣ−ｒｅｓｈ４２５ｇおよびｐＵＣ−ｒｅｓｈＡＵＫ１２−２０ｂならびにキメラ２１．６重鎖（ｐＵＣ−ｃｈｉｍ２１．６ＶＨ）の構築に用いるために修飾したマウス２１．６ＶＨ領域を含むｐＵＣベクターを、後のＰＣＲ反応における鋳型ＤＮＡｓとして用いた。再構築ヒト２１．６ＶＨ領域のバージョン「ａ」の構築のために、ＰＣＲプライマーを設計し、合成した。ＰＣＲ生成物Ａは、ＤＮＡ鋳型としてのｐＵＣ−ｒｅｓｈＡＵＫ１２−２０ｂおよびＰＣＲプライマー対としてのＡＰＣＲ１−ｖｈａ１を用いて得た。ＰＣＲ生成物ＢおよびＤは、ＤＮＡ鋳型としてのｐＵＣ−ｃｈｉｍ２１．６ＶＨおよびＰＣＲプライマー対としてのそれぞれｖｈａ２−ｖｈａ３およびｖｈａ６−ＡＰＣＲ４を用いて得た。最後に、ＰＣＲ生成物ＣをＤＮＡ鋳型としてのｐＵＣ−ｒｅｓｈ４２５ｇおよびＰＣＲプライマー対としてのｖｌａ４−ｖｌａ５用いて得た。最終ＰＣＲ生成物を、ＤＮＡ配列決定のためにＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＵＣ１９にサブクローンした。正しい配列を有するクローンをｐＵＣ−ｒｅｓｈ２１．６ＶＨａと呼ぶ。
再構築ヒト２１．６ＶＨ領域の残りのバージョンは、基本的には再構築ヒト２１．６ＶＬ領域のバージョン「ｂ」の構築について上述したように構築した。２組のプライマーを合成した。第２（Ｈｂ）および第３（Ｈｃ）バージョンについては、突然変異誘発性プライマー２１．６ＶＨｂ（Ａｒｇ−４４〜Ｇｌｙ−４４）および２１．６ＶＨｃ（Ｔｙｒ−９８〜Ｐｈｅ−９８）をそれぞれｐＵＣ−ｒｅｓｈ２１．６ＶＨａを鋳型ＤＮＡとしたＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ生成物ＶＨｂおよびＶＨｃを制限酵素で切断し、それぞれＭｓｃＩ−ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＵＣベクターｐＵＣ−ｒｅｓｈ２１．６ＶＨａにサブクローンして、ｐＵＣ−ｒｅｓｈ２１．６ＶＨｂおよびｐＵＣ−ｒｅｓｈ２１．６ＶＨｃを得た。
再構築ヒト２１．６ＶＨ領域の最初のバージョン（Ｈａ）は、再構築ヒト２１．６ＶＬ領域の最初のバージョン（Ｌａ）の構築に用いたのと同様な方法で構築した。しかし、この場合、ＰＣＲプライマーは、キメラ２１．６重鎖、ヒト化４２５ＶＨ領域バージョン「ｇ」（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、前出）およびヒト化ＡＵＫ１２−２０バージョン「ｂ」ＶＨ領域の発現のために既に適応されたマウス２１．６ＶＨ領域である３種の鋳型ＤＮＡｓとともに用いた。ヒト化２１．６ＶＨ領域の第２および第３バージョン（ＨｂおよびＨｃ）は、ヒト化２１．６ＶＨ領域の最初のバージョン（Ｈａ）におけるわずかな修正を行うためにＰＣＲプライマーを用いて構築した。
Figure 2013166765
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［実施例９］
ナタリズマブ
ナタリズマブは、α４インテグリン分子に対する組換えヒト化抗体（ｒｈＡｂ）であり、α４β１（ＶＬＡ−４）およびα４β７インテグリンによって媒介される細胞結合を阻害する。ナタリズマブは、白血球、主としてリンパ球上に発現するα４サブコンポーネントに結合する。α４インテグリンへのマウスモノクローナル抗体の結合は、これらの白血球上のα４β１と内皮細胞上のその対応する受容体ＶＣＡＭ−１との相互作用を阻害する。これらの細胞接着分子相互作用の阻害は、血管内皮にわたる、そして続く実質組織内へのこれらの白血球の移動を妨げると考えられている。
α４インテグリンは、ステオポンチンおよびフィブロネクチンのエピトープなどの組織におけるその他のリガンドに結合する。ナタリズマブのさらなるメカニズムは、これらのリガンドを有するα４陽性白血球の阻害により、罹患組織における持続性炎症を抑制することなどである。したがって、ナタリズマブは、ＶＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１との相互作用により炎症組織への免疫細胞のさらなるリクルートメントを阻害することに加えて、罹患部位に存在する既存の炎症活性を抑制するように作用する。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）における作用は、ＩＢＤ対象の炎症および非炎症腸における炎症の活動性部位の血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）および粘膜アドレシン細胞接着分子（ＭａｄＣＡＭ−１）の発現を示した。これは、粘膜への白血球のリクルートメントがＩＢＤに特有の炎症反応に寄与することを示唆している。したがって、ＶＣＡＭ−１／α４β１およびＭａｄＣＡＭ−１／α４β７相互作用を阻害する薬剤は、白血球の移動の減少と組織の損傷を引き起こすサイトカインおよび他の物質の放出の減少をもたらす可能性がある。炎症腸組織における重要な接着分子の同様な発現パターンを有する１つの形の慢性ＩＢＤを経験する霊長類の種であるコットントップタマリン（ＣＴＴ）における抗α４インテグリン抗体の試験で、プラセボと比較して高度に有意な改善が示された。
単回および反復投与毒性試験がマウス、モルモットおよびサルにおいて実施された。すべての毒性試験は、ナタリズマブを用いて実施されたものであり、モルモットにおける急性試験、マウスおよびカニクイザルにおける亜急性試験、ならびに変異原性および組織交差反応性試験を含んでいた。これらの試験は、有意な毒性の臨床または死後証拠を示さなかった。
マウスでは、α４インテグリンおよびＶＣＡＭ−１が胎盤および心臓の発達に役割を果たすという証拠が存在し、それらが胎児の発達にもより広い役割を果たしている可能性がある。したがって、α４インテグリンがナタリズマブにより阻害される場合、流産を起こさせる作用または催奇形性のリスクがある。予備繁殖毒性試験で、５匹の妊娠カニクイザルの群に０．０６、０．３または３０ｍｇ／ｋｇの用量のナタリズマブを反復静脈内投与した。３０ｍｇ／ｋｇ群の５匹の妊娠雌のうちの１匹が、ナタリズマブの５回の投与を受けた後に妊娠３１日目に流産した。流産の総発生率がこの動物種における自然流産の発生率の範囲内にあったので、この事象はナタリズマブに関連したものとは考えられなかった。進行中のフォローアップ生殖毒性試験で、１０〜１５匹の妊娠カニクイザルの群に３、１０または３０ｍｇ／ｋｇの用量で反復静脈内投与した、胚死亡がすべての投与群で同様な率で発生した。すなわち、胚死亡例はそれぞれ対照群で２例、３ｍｇ／ｋｇ群で１例、１０ｍｇ／ｋｇ群で２例、３０ｍｇ／ｋｇ群で２例であった。予防措置として、妊娠の可能性のある女性は、試験中および被験薬の最終注射後少なくとも３カ月間は有効な避妊法を用いなければならず、毎回のナタリズマブの投与時の妊娠テストが陰性でなければならない。
霊長類における６カ月間の反復投与試験において、盲腸、結腸および／または直腸のリンパ形質細胞炎症がすべての用量群のナタリズマブ投与動物の約半数に認められ、賦形剤群には認められなかった。炎症は、固有層内のリンパ球および形質細胞の数の増加と時折の陰窩膿瘍によって特徴付けられた。３０．０および６０．０ｍｇ／ｋｇ／週群の動物の結腸および直腸における変化の発生率および大きさのわずかな増加があり、用量反応関係があることが示唆された。しかし、用量反応関係があることが推定されたが、炎症の発生率はナタリズマブの血清濃度と関連していなかった。これらの変化は罹患動物における腸管の基礎感染を反映している可能性があるが、２最高ナタリズマブ用量群の動物における炎症の発生率および程度がわずかに高かったことと、対照群にその存在が欠如していたことを合わせると、ナタリズマブはおそらくこの過程に役割を果たしている可能性があることがわかる。
クローン病および潰瘍性大腸炎における初期の試験を以下に要約する。１つの試験は、慢性活動性クローン病と診断された男女対象における３ｍｇ／ｋｇのナタリズマブの単回静脈内注入の無作為化二重盲検プラセボ対照安全性、忍容性および有効性試験であった。３０例の対象を登録し、１８例にはナタリズマブ（３ｍｇ／ｋｇ）を、１２例にはプラセボを投与した。投与後２週目に、７例のナタリズマブ投与対象（３９％）と１例のプラセボ投与対象（８％）が臨床的寛解状態にあった（クローン病活動度指数（ＣＤＡＩ）＜１５０）（ｐ＝０．１）。さらに、投与後２週目に、プラセボ投与対象（３３％）と比較して少数のナタリズマブ投与対象（１１％）が救助療法を必要とした。平均ＣＤＡＩスコアは、平均ベースラインＣＤＡＩスコアと比較して、ナタリズマブ群においてのみ投与後２および４週目に有意に低下した。これらの効果は、投与後４週目を超えて持続せず、４週目の時点に認められたナタリズマブの低い血清濃度と相関している。
ナタリズマブの３ｍｇ／ｋｇの用量の単回静脈内投与は、ＣＤを有する対象において安全かつ忍容性が良好であった。いずれの対象も有害事象の発生が理由で試験を中止しなかった。６例の対象が１件の重篤な有害事象を報告したが、すべての対象がナタリズマブ投与群に属していた。これらの事象のいずれも致命的でなかった。６件の有害事象のうちの５件は、対象のクローン病の再発または悪化の徴候であり、他の重篤な有害事象は貧血の徴候であった。最も頻繁に報告された有害事象（頭痛、クローン病および腹痛）の発生率にはナタリズマブ群とプラセボ群との間の有意な差はなかった。
第２の初期の試験は、活動性潰瘍性大腸炎を有する男女対象における３ｍｇ／ｋｇのナタリズマブの単回静脈内注入の安全性、忍容性および有効性試験であった。１０例の対象を募集し、ナタリズマブ（３ｍｇ／ｋｇ）を投与した。投与後２および４週目に、５例の対象（５０％）が、Ｐｏｗｅｌｌ−Ｔｕｃｋ活動度指数（ＰＴＡＩ）スコアが≦５と定義された良好な臨床的反応を示し、平均ＰＴＡＩスコアが０週目の９．７から投与後１、２および４週目のそれぞれ６．９、５．７および４．９に低下した。平均ＰＴＡＩスコアは、１２週間の試験期間にわたり抑制されたままであった。対象の７０％は０週目から４週目まで救助薬投与を受けなかった。
この試験における最も頻繁に報告された有害事象は、潰瘍性大腸炎の悪化、頭痛、嘔吐、嗜眠および咽頭痛であった。この試験で報告された３０件の有害事象のうち、３件のみが被験薬に関連するとみなされた。頭痛、潰瘍性大腸炎の悪化および嗜眠のそれぞれ１件の発生があった。重度と特徴付けられた２件の事象が存在し、両事象は、投与に関連するとみなされなかった潰瘍性大腸炎の悪化の報告であった。３例の対象が重篤な有害事象を報告した。これらの事象のいずれも致命的でなかった。これらの事象は、キャンピロバクター腸炎、対象の試験中止をもたらさなかった潰瘍性大腸炎の悪化、ならびに硬直、発熱、頭痛および嘔吐のエピソードであった。
他の初期の試験は、中等度から重度の活動性クローン病を有する対象におけるプラセボ、３または６ｍｇ／ｋｇのナタリズマブの１または２回静脈内注入の二重盲検プラセボ対照並行群多施設有効性、安全性および忍容性試験であった。合計２４８例の対象が無作為化され、そのうちの２４４例が少なくとも１回の被験薬の投与を受けた。６８例の対象が３ｍｇ／ｋｇの単回注入に、６６例が４週間間隔での３ｍｇ／ｋｇの２回の注入に、５１例が４週間間隔での６ｍｇ／ｋｇの２回の注入に、６３例がプラセボ投与に無作為化された。ナタリズマブは、４、６、８および１２週目に３実薬投与群の少なくとも１つにおいて寛解（ＣＤＡＩ＜１５０）を誘発する点でプラセボより優れていた。４６％の最高の寛解率が３ｍｇ／ｋｇの２回の注入を受けた群で６週目に認められ、４１〜４３％の寛解率がこの群および６ｍｇ／ｋｇの２回の注入を受けた群で８および１２週目に認められた。ナタリズマブは、２、４、６、８および１２週目に３実薬投与群の少なくとも１つにおいて反応（ＣＤＡＩの７０ポイント以上または１００ポイント以上の低下）を誘発する点でプラセボより優れていた。７３％（７０ポイント以上の低下）および５６％（１００ポイント以上の低下）の最高反応率が３ｍｇ／ｋｇの２回の注入を受けた群で６週目に認められた。炎症性腸疾患質問票により評価した生活の質の統計的に有意な改善およびＣ反応性タンパク質の減少も達成された。
ナタリズマブの投与は、活動性ＣＤを有する対象において安全かつ忍容性が良好であった。各投与群の同様な例数の対象が有害事象のため試験を中止した。すなわち、プラセボ、１回３．０ｍｇ／ｋｇ、２回３ｍｇ／ｋｇおよび２回６ｍｇ／ｋｇ注入投与群でそれぞれ２、１、２および３例の対象が中止した。合計３２例の対象が試験の主段階において重篤な有害事象を報告した（プラセボ、１回３．０ｍｇ／ｋｇ、２回３ｍｇ／ｋｇおよび２回６ｍｇ／ｋｇ注入投与群でそれぞれ９、８、８および７例の対象）。これらの事象のいずれも致命的でなく、いずれも被験薬に関連すると評価されなかった。これらの事象の大部分は、合併症またはＣＤの症状の治療を容認するものであった。少なくとも２つのナタリズマブ投与群でより大きい頻度で報告された疾患に関連しない事象は、胸痛、発熱、かぜ症状、めまいおよび結膜炎などであった。
クローン病の治療におけるナタリズマブの使用
ＣＤを有する大多数の対象が、最初に５−ＡＳＡ製剤（スルファサラジン、メサラジン、オルサラジン）、経口ステロイド（例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ブデソニド）を含む入手可能な薬剤に反応する。より最近、重症難治性ＣＤおよび難治性瘻孔形成性疾患の治療用の腫瘍壊死因子に対する薬剤（抗ＴＮＦα抗体、インフリキシマブ）が開発された。しかし、一部の患者は衰弱性疾患を有し続けており、疾患が現行の療法により十分にコントロールされない対象の治療の改善の必要がある。
ＩＢＤを有する対象におけるＭａｄＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１のアップレギュレーションの証拠、およびＭａｄＣＡＭ−１／α４β７相互作用が腸へのリンパ球のホーミングを媒介するという証拠がある。ＩＢＤにおける抗α４インテグリン抗体の有望な役割は、コットントップタマリンにおける試験の所見により最初に、またより最近、臨床試験におけるナタリズマブの結果により裏付けられた。
下に詳細に述べる２つのさらなる試験は、初期の結果を確認するために計画されたものであり、中等度から重度の活動性ＣＤ対象（ＣＤＡＩ≧２２０、≦４５０）の集団における反応および／または寛解を誘発するようにデザインされている。反応し、その後、中等度の活動性疾患（ＣＤＡＩスコア＜２２０および≧７０の低下）を有していた最初の試験の対象を、ナタリズマブの反復投与が反応および／または寛解を維持することができるかどうかを検討するためにデザインされた、その後の試験に登録した。ＣＤが慢性であることを考慮すると、新たな薬剤を、長期間にわたり疾患の活動性を低減または除去する能力について評価することは明らかに重要である。さらに、達成されたならば、改善を維持するアプローチも現在の診療の目的を反映している。
有効性の評価のための主要なツールは、クローン病活動度指数（ＣＤＡＩ）である。ＣＤＡＩは、１９７９年に全米共同クローン病研究（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｃｒｏｈｎ’ｓ Ｓｔｕｄｙ）（ＮＣＣＤＳ）のために開発され、既知のＣＤ臨床スコアの最善のものである。これは、新規の療法の臨床試験に広く用いられており、臨床試験のエンドポイントとして一般的に受け入れられている。＜１５０のＣＤＡＩスコアは寛解として一般的に受け入れられており、≧１５０〜＜２２０のスコアは中等度の活動度の疾患とみなされ、一方、≧２２０〜＜４５０のスコアは高度の活動度の疾患とみなされている。
したがって、反応の喪失は≧２２０のＣＤＡＩスコアと定義され、寛解の喪失は≧１５０のＣＤＡＩスコアと定義される。これらの定義は、救助インターベンションの使用と合わせて、この試験における反応および寛解の解析の維持に用いた。
この試験のさらなるエンドポイントは、炎症性腸疾患質問票、ＩＢＤ集団用に開発された生活の質ツール、ならびに生活の質のより一般的な評価を可能にし、一部の規制当局により支持されているＳＦ−３６１２などである。経口ステロイドの投与を受ける対象のサブグループにおける併用経口ステロイドを中止させる能力としてのＣ反応性タンパク質のような炎症マーカーの変化も評価した。
臨床的評価に選択したナタリズマブの初期の用量は、モルモット実験的アレルギー性脳炎（ＥＡＥ）モデルにおける非臨床試験に基づくものであった。これらの試験で、３ｍｇ／ｋｇの用量のナタリズマブはＥＡＥの徴候および症状の発現の有意な遅延および逆転をもたらし、より低用量のナタリズマブは有効でなかったことが示された。３ｍｇ／ｋｇの単回投与は約３週間までのα４インテグリン受容体遮断を伴うナタリズマブの血清濃度をもたらし、６ｍｇ／ｋｇ投与では約６週間であった。
ナタリズマブは、すべての臨床試験において体重について調整した用量を投与することによって評価した。健常志願者ならびにＭＳおよびＩＢＤを有する対象における完了した試験の単回投与薬物動態データは、ナタリズマブの３ｍｇ／ｋｇの注入が３〜４週間にわたり十分な程度の受容体飽和および細胞接着の阻害を伴うレベルである２．５〜３．０μｇ／ｍＬのナタリズマブの血清濃度を維持することを示した。６ｍｇ／ｋｇナタリズマブというより高用量の単回注入は、わずかに高く、より長期間（約６週間）持続したα４インテグリン飽和レベルをもたらした。
これらの第ＩＩ相試験で認められた薬力学的効果および治療反応は、ナタリズマブの用量および血清中ナタリズマブ濃度に関連していることがみとめられた。これらの所見とナタリズマブのクリアランスが主として体重に依存するという知識に基づいて、固定用量の投与が体重により調節する投与の代わりになり得るかどうかを判断するために、３００ｍｇの固定用量によってもたらされる曝露の範囲を検討した。
薬物動態モデリングとＡＵＣが総用量に比例するという仮定により、３００ｍｇの固定用量は、第ＩＩ相試験に用いた３ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇの用量で認められた曝露と重複するナタリズマブ曝露をもたらすことが示された。したがって、３ｍｇ／ｋｇの用量はＣＤおよびＭＳ適応に有効であり、６ｍｇ／ｋｇ用量は用量限定的毒性の証拠をもたらさず、３ｍｇ／ｋｇ用量と比べて６ｍｇ／ｋｇ用量のさらなる利益はなかったので、３００ｍｇの固定用量は第ＩＩＩ相試験のための適切な選択である。
クローン病（ＣＤ）患者における臨床的反応および寛解の維持におけるチサブリ（Ｔｙｓａｂｒｉ）（ナタリズマブ、３００ｍｇ１カ月１回）の有効性、安全性および忍容性の二重盲検プラセボ対照試験を実施した。目的は、ＣＤを有する対象における臨床的反応を維持するナタリズマブの能力をプラセボと比較すること、ＣＤを有する対象における臨床的寛解を維持するナタリズマブの能力をプラセボと比較すること、炎症性腸疾患質問票（ＩＢＤＱ）により測定される生活の質に対するナタリズマブの影響をプラセボと比較すること、および対象が経口ステロイドの使用を中止することを可能にするナタリズマブの能力をプラセボと比較することであった。
試験デザイン
最初の試験において１０週目に治療に反応し、その反応を１２週目まで維持し（ベースラインＣＤＡＩの７０ポイント以上の低下と定義）、疾患が中等度に活動性である（＜２２０のＣＤＡＩスコアと定義）以前に活動性のクローン病（ＣＤ）（中等度から重度の活動性と定義、ＣＤＡＩ≧２２０、＜４５０）を有していた対象の第ＩＩＩ相国際多施設無作為化二重盲検プラセボ対照並行群試験を実施した。
この群内に、最初の試験の１０週目に寛解（＜１５０のＣＤＡＩスコアと定義）を達成した亜集団が存在した。１０週目から１２週目まで反応を維持しなかった対象は、第２の試験に適格でなく、最初の試験の安全性フォローアップ相に参加し続けた。ＣＤのための併用薬の投与を受けた対象は、登録を許可し、最初の試験への参加中に安定に維持した当該用量を提供した。固定アルゴリズムに従って節約した経口ステロイドを除いて、ＣＤ用のすべての併用薬は、１２カ月間の治療相（１５カ月目まで）の期間中に安定のままであった。本願書の提出時に、９カ月のデータのみが入手可能であった。
ナタリズマブは、月１回３００ｍｇを１２回注入投与した。プラセボは、月１回で１２回注入投与した。対象はその疾患状態（寛解対寛解なし、すなわち、ＣＤＡＩ＜１５０または≧１５０）、経口ステロイドの併用および免疫抑制剤の併用に従って層別化した。
無作為化後、対象はその初回注入を受けた。その後、対象は、評価および注入のために月１回（１カ月を４週間と定義する）診療所に戻った。ＣＤ用の新規薬剤の導入またはＣＤ用の既存の併用薬の用量の変更（固定アルゴリズムに従った経口ステロイドの使用中止を除く）は、救助インターベンションのために必要と考えられない限り、許可した。救助が行われたならば、そのような対象は治療失敗とみなした。
対象は、この試験で１２回までの注入を受け、最終注入後１カ月目（すなわち、１５カ月目）に最終治療相評価のために戻る予定である。
約３８０例の対象が治療に対して反応し、最初の試験の１０週目に中等度の活動性の疾患（ＣＤＡＩスコアの≧７０ポイントの低下、＜２２０のＣＤＡＩスコアかつ救助インターベンションを使用せずと定義）を有し、１２週目／３カ月目まで維持したと予想された。２８５例の対象が第２の試験に登録されると予想され、２つの試験の間の適格対象の脱落率は２５％と仮定した。これらのうち、２００例の対象が寛解（＜１５０のＣＤＡＩスコアと定義）を達成したと予想された。
無作為化し、投与した２８５例の対象（投与群当たり１４２例、比１：１）のサンプルサイズは、ナタリズマブに対する６５％の反応率およびプラセボに対する４４％の反応率を仮定し、１０％の脱落率を考慮したとき、反応率の維持（＜２２０のＣＤＡＩスコアかつ救助インターベンションを使用せずと定義）についてのナタリズマブ投与群とプラセボ群との間の差を検出する５％の有意水準での９０％の検出力を与えられた。
したがって、無作為化し、投与した寛解状態にある２００例の対象のサブグループは、ナタリズマブに対する５５％の反応率およびプラセボに対する３０％の反応率を仮定し、１０％の脱落率を考慮したとき、反応率の維持（＜１５０のＣＤＡＩスコアかつ救助インターベンションを使用せずと定義）についてのナタリズマブ投与群とプラセボ群との間の差を検出する５％の有意水準での９０％の検出力を与えられた。
併用経口ステロイドを服用している対象がステロイドの漸減を開始することを可能にするために、最初の試験の１０週目に適格な対象を同意させ、第２の試験に登録された。１２週目／３カ月目に適格性基準を満たし続けていた、すなわち、対象の次の月１回の注入に間に合った対象を再無作為化し、１２カ月間まで（すなわち、１５カ月目まで）継続される予定の治療相に参加した。対象は、男性または女性で、１８歳以上であった。
薬剤の用量および製剤
静脈内ナタリズマブを３００ｍｇの用量で投与した。ナタリズマブは、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で５ｍＬバイアル入りで供給された。すべての注入液は、０．９％食塩水の入った１００ｍＬバッグ中で調製した。ナタリズマブバイアルは、リン酸でｐＨ６．０に調整した１０ｍＭリン酸緩衝液、１４０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０２％ポリソルベート８０中２０ｍｇ／ｍｌのナタリズマブを含んでいた。
対照群のために、プラセボが対応した５ｍＬバイアル入りで供給され、リン酸でｐＨ６．０に調整した１０ｍＭリン酸緩衝液、１４０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０２％ポリソルベート８０からなっていた。
投与経路
ナタリズマブまたはプラセボを２ｍＬ／分の流量で約６０分間にわたって静脈内注入により投与した。すべての対象を各注入の開始後２時間観察した。
手順
手順は、身体的検査、バイタルサイン、体重、ＣＤＡＬ、ＩＢＤＱ、ＳＦ−３６、対象包括的評価、血液学、生化学、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、抗核抗体（ＡＮＡ）、血清中ナタリズマブ濃度、抗ナタリズマブ抗体および妊娠テストの評価のための血液試料、尿検査および妊娠テスト用尿試料、有害事象、併用薬および救助インターベンションの評価などであった。
主要、副次的および第３次的エンドポイント
主要エンドポイント
主要エンドポイントは、１２週目に反応した状態の対象の反応の喪失（ＣＤＡＩスコア２２０または救助インターベンションの使用と定義）までの時間であった。
副次的エンドポイント
１．付随主要エンドポイント：１２週目に寛解した状態（＜１５０のＣＤＡＩスコアと定義）の対象の寛解の喪失（ＣＤＡＩスコア１５０または救助インターベンションの使用と定義）までの時間
２．１２カ月後（すなわち、１５カ月目）に寛解した状態のまま（＜１５０のＣＤＡＩスコアかつ救助インターベンションを使用せずと定義）であった１２週目に寛解した状態（＜１５０のＣＤＡＩスコアと定義）の対象の割合（％）
３．９カ月目のＣＤ３０１におけるベースラインからのＩＢＤＱの平均変化
４．９カ月目に経口ステロイドを服用していない例数（％）。９カ月目に寛解した状態（＜１５０のＣＤＡＩスコアかつ救助インターベンションを使用せずと定義）にあり、経口ステロイドを服用していない対象の例数（％）
第３次的エンドポイント
１．３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５カ月目に中等度の活動性の疾患＜２２０のＣＤＡＩスコアかつ救助インターベンションを使用せずと定義）を有する対象の例数（％）
２．３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５カ月目に寛解状態にある（＜１５０のＣＤＡＩスコアかつ救助インターベンションを使用せずと定義）対象の例数（％）
３．３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５カ月目に＜２００のＣＤＡＩスコアを有し、かつ救助インターベンションを使用しない対象の例数（％）
４．３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５カ月目の平均ＣＤＡＩスコア
５．３、６、１２および１５カ月目のＣＤ３０１におけるベースラインからのＩＢＤＱの平均変化
６．３、６、９、１２および１５カ月目のＣＤ３０１におけるベースラインからのＳＦ３６の平均変化
７．３、６、９、１２および１５カ月目のＣＤ３０１におけるベースラインからの対象包括的評価の平均変化
８．３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４および１５カ月目に経口ステロイドを服用していない対象の例数（％）
９．３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４および１５カ月目に寛解した状態（＜１５０のＣＤＡＩスコアかつ救助インターベンションを使用せずと定義）にあり、経口ステロイドを服用していない対象の例数（％）
１０．救助インターベンション（外科的インターベンションを含む）を最初に使用するまでの時間
１１．３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５カ月目に救助インターベンション（外科的インターベンションを含む）を必要とする対象の例数（％）
１２．３、６、９、１２および１５カ月目のＣＤ３０１におけるベースラインからのＣ反応性タンパク質の平均変化（ＣＤ３０１におけるベースラインでのＣＲＰの上昇を有していた対象における）
１３．３、６、９、１２および１５カ月目のＣＤ３０１におけるスクリーニングからの血清アルブミンの平均変化
統計的考察
有効性解析は、ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ集団に基づくものとした。ｐｅｒ ｐｔｏｔｏｃｏｌ集団について主要なエンドポイントの解析を繰り返した。カテゴリデータは、計数および百分率として表した。連続データは、要約統計量として表した。行ったすべての比較は、両側とし、有意水準を５％とした。
主たる解析は、層別化に用いた因子ならびに地理上の位置および他のあらかじめ指定された共変量について調整した。主要な有効性エンドポイントが５％の水準で統計的に有意であった場合、付随主要エンドポイントである寛解の喪失までの時間のみを解析した。
第１および第２の試験を合わせて４００患者年のデータが得られ、すべての対象が最小限３カ月間のデータを有するとき（すなわち、１２週目までの最初の試験を最小限として完了したか、または第２の試験で１２週目／３カ月目を完了した）、管理解析を行うものとする。
被験薬
被験薬は、２０ｍｇ／ｍＬナタリズマブまたはプラセボの栓付きの透明な個別５ｍＬバイアル入りで供給された（ナタリズマブまたはプラセボ）。バイアルは、遮光するために３バイアルずつ箱に包装されていた。各箱は、固有の６桁の箱番号が表示され、１回の注入用の十分な被験薬を含むものとする。
ナタリズマブバイアルは、リン酸でｐＨ６．０に調整した１０ｍＭリン酸緩衝液、１４０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０２％ポリソルベート８０中２０ｍｇ／ｍＬのナタリズマブを含んでいた。プラセボは、リン酸でｐＨ６．０に調整した１０ｍＭリン酸緩衝液、１４０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０２％ポリソルベート８０を含む対応する５ｍＬバイアル入りで供給された。
被験薬の用量
ナタリズマブに無作為化された対象は、静脈内注入により月１回（すなわち、４週間ごとに）３００ｍｇの投与を最大１２回受けた。
被験薬の準備
加える被験薬と等量である１５ｍｌの生理食塩水を０．９％食塩水の１００ｍＬバッグから抜き取り、捨てた。次いで、合計１５ｍｌの被験薬を３つのバイアルから１８または１９ゲージ針により５０ｍＬ注射器に吸引し、２０〜２３ゲージ針により、薬剤ポートダイヤフラムを通して生理食塩水バッグ中に緩やかに加えた。希釈は、無菌的方法を用いて行った。
被験薬の投与
被験薬の投与は、静脈内注入により４週間ごとに行った。各注入は、約６０分間を必要とした。注入は、約２ｍＬ／分の流量で行った。被験薬の１００ｍＬバッグが空になったならば、同じ速度で注入ラインをフラッシュするために、生理食塩水の５０ｍＬバッグと交換した。
経口ステロイドの漸減
経口ステロイドの投与を受けていたすべての対象は、第２の試験への参加直後に次のアルゴリズムを用いた漸減を受けることが要求された。＞１０ｍｇのプレドニゾロンに相当する用量の投与を受けていた対象は、１０ｍｇの用量に達するまで、７日ごとに５ｍｇの割合でその漸減を開始する。１０ｍｇのプレドニゾロンに相当する用量の投与を受けていた対象は、対象が完全に使用を中止するまで、７日ごとに２．５ｍｇの割合で漸減した。ブデソニドを服用していた対象は、３週間ごとに３ｍｇの割合で漸減した。
身体的検査
完全な身体的検査を６カ月目、９カ月目、１２カ月目および１５カ月目に、また１５カ月目の前に試験を中止した対象における早期中止来院の一部として実施し、また実施する予定である。体重は、ＣＤＡＩスコアの評価の一部としてすべての来院時に記録した。バイタルサインは、すべての来院時に記録した。注入液を投与した来院時には、注入直前（０分）と注入の終了時にバイタルサインを記録した。
生活の質の評価
対象包括的評価、炎症性腸疾患質問票（ＩＢＤＱ）および健康調査からなる生活の質の評価は、３カ月目、６カ月目、９カ月目、１２カ月目および１５カ月目来院時、ならびに早期中止来院の一部として対象が完了した。対象は、来院の開始時（すなわち、他の評価または注入の前）に最初に対象包括的評価を完了し、評価を完了しなければならなかった。対象包括的評価は、対象が被験薬の最初の投与を受ける直前の気分と比較した気分の包括的な印象を評価した視覚アナログスケールである。
ナタリズマブの濃度
ナタリズマブの濃度の測定のための血液試料を３カ月目、６カ月目、９カ月目、１２ヶおよび１５カ月目に採取した。注入液を投与した来院時には、注入直前（０分）に試料を採取した。さらに、６カ月目および１２カ月目のみに、注入を終了してから少なくとも１時間目に第２の試料を採取した。
統計手法
ナタリズマブがＣＤを有する対象における軽度の活動性の疾患（＜２２０のＣＤＡＩスコアかつ救助インターベンションを使用せずと定義）および寛解（＜１５０のＣＤＡＩスコアかつ救助インターベンションを使用せずと定義）を維持する能力を評価した。問題の主たる比較は、治療群間の反応の喪失までの時間であった（反応の喪失をＣＤＡＩスコア２２０または救助インターベンションの使用と定義するとき）。付随逐次解析は、１２週目に寛解状態（ＣＤＡＩ＜１５０）にあった対象のサブグループにおける治療群間の寛解の喪失（ＣＤＡＩスコア１５０または救助インターベンションの使用と定義）までの時間に対する治療の効果について行った。
約３８０例の対象が投与に反応し、１２週目／３カ月目まで維持される最初の試験の１０週目に軽度の活動性の疾患（ＣＤＡＩスコアの≧７０ポイントの低下、＜２２０のＣＤＡＩスコアかつ救助インターベンションを使用せずと定義）を有すると予想された。２つの試験の間の適格対象の脱落率を２５％と仮定して、そのうちの２８５例は第２の試験に登録すると予想された。これらのうち、２００例の対象は寛解（＜１５０のＣＤＡＩスコアと定義）を達成したと予想された。
無作為化し、投与した２８５例の対象（投与群当たり１４２例、比１：１）のサンプルサイズは、ナタリズマブに対する６５％の反応率およびプラセボに対する４４％の反応率を仮定し、１０％の脱落率を考慮したとき、反応率の維持（＜２２０のＣＤＡＩスコアかつ救助インターベンションを使用せずと定義）についてのナタリズマブ投与群とプラセボ群との間の差を検出する５％の有意水準での９０％の検出力を与えられた。
したがって、無作為化し、投与した寛解状態にある２００例の対象のサブグループは、ナタリズマブに対する５５％の反応率およびプラセボに対する３０％の反応率を仮定し、１０％の脱落率を考慮したとき、寛解の維持（＜１５０のＣＤＡＩスコアかつ救助インターベンションを使用せずと定義）についてのナタリズマブ投与群とプラセボ群との間の差を検出する５％の有意水準での９０％の検出力を与えられた。
有効性解析
すべての有効性解析および要約は、ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ集団に基づくものであった。主要な有効性パラメーターの確認解析は、ｐｅｒ ｐｔｏｔｏｃｏｌ集団を用いて行った。感度分析は、最初の試験でナタリズマブの投与を受けるように無作為化された最初の試験のレスポンダーからなるｉｎｔｅｎｔｉｏｎ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ集団のサブセットを用いて主要および副次的エンドポイントに関して行った。
結果
第２の試験で、９カ月目にステロイドを服用していなかった対象（最初の試験ベースラインにおいてステロイドを服用していた対象のうちの）は、以下の結果を示した。
Figure 2013166765
両群における最も一般的な副作用は、頭痛、悪心および腹痛であった。重篤な有害事象（ＳＡＥ）については、８％対７％がプラセボ対ナタリズマブであった。
図１にクローン病試験において患者に投与したときのナタリズマブに対する反応のグラフを示す。試験に参加してから３カ月目のナタリズマブレスポンダー集団のうち、６１．３％の患者が９ヵ月後に反応を維持していたが、プラセボ群では２８．８％のみが反応を維持していた。
図２にクローン病試験において患者に投与したときナタリズマブに反応した寛解のレベルのグラフを示す。試験に参加してから３カ月目のナタリズマブ寛解集団のうち、４３．８％の患者が９ヵ月後に反応を維持していたが、プラセボ群では２５．８％のみが反応を維持していた。
図３に様々な集団、すなわち、ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ集団（ＩＴＴ）、Ｃ反応性タンパク質上昇集団（ＣＲＰ）、免疫抑制剤に対して無応答性または不耐性の集団（ｉｍｍｕｎｏＵＩ）およびステロイドに無応答性、不耐性または依存性の集団（ｓｔｅｒｏｉｄＵＩＤ）におけるクローン病試験において患者に投与したときナタリズマブに反応した寛解のレベルのグラフを示す。これらのカテゴリーは、患者のこれらの薬剤の以前の使用歴に基づいていた。
有効性の要約
問題の集団において、最初の試験でプラセボと比較してナタリズマブで寛解および反応率の臨床的に意味のある差が認められた。第２の試験（最初の試験のレスポンダーの二重盲検中止試験）で、最初の試験において認められた誘導効果が確認されている。有望な維持データが第２の試験における６ヵ月後に認められた。第２の試験では、ナタリズマブは対象がステロイドを漸減させるに成功することを可能にした。
Figure 2013166765
他のすべての指数は、医師が外来で以下のように評価する。
Figure 2013166765
実施例１０
この実験は、クローン病における臨床的反応および寛解の維持におけるナタリズマブの有効性、安全性および忍容性の二重盲検プラセボ対照試験であった。
α４インテグリンに対するヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体であるナタリズマブを、第ＩＩＩ相反応／寛解誘導試験でナタリズマブ投与対象において達成された臨床的反応および寛解を維持する６カ月療法の能力を検討するために無作為化対照試験で評価した。
方法
最初の試験でナタリズマブの３回の注入を受けた後に反応（ベースラインクローン病活動度指数（ＣＤＡＩ）の≧７０ポイントの低下と定義）および／または寛解（ＣＤＡＩ＜１５０）を達成し、ＣＤＡＩスコア＜２００を有していたクローン病（ＣＤ）を有していた３３９例の対象を、さらなる１２回の月１回の注入のためにナタリズマブ（３００ｍｇ）（ｎ＝１６８）またはプラセボ（ｎ＝１７１）に１：１の比率で再無作為化した。主要なエンドポイントは、第２の試験におけるさらなる連続６カ月間にわたるすべての時点に最初の試験での反応を喪失しなかった対象の割合であった。反応の喪失は、ＣＤＡＩ≧２２０および第２の試験のベースラインＣＤＡＩからの≧７０ポイントの増加または救助インターベンションの使用と定義した。寛解の維持も評価した。
結果
６カ月目に、ナタリズマブ投与対象（ＩＴＴ集団）の６１％（１０３／１６８）が臨床的反応に関する基準を満たしていたのに対して、プラセセボ投与を受けるように再無作為化された対象の２９％（４９／１７０）が満たしていた（ｐ＜０．００１）。ナタリズマブ投与群における４４％（５７／１３０）が臨床的寛解を維持していたのに対して、プラセセボ群では２６％（３１／１２０）であった（ｐ＝０．００３）。さらに、第２の試験でナタリズマブに再無作為化された、最初の試験でステロイドを服用したナタリズマブ投与対象の５５％（３７／６７）がステロイドを中止したのに対して、プラセセボに再無作為化された２５％（１９／７６）が中止した（ｐ＜０．００１）。治療群間で重篤および非重篤有害事象の発生率の注目すべき差は認められなかった。
第２の試験で、ナタリズマブは、最初の試験でのナタリズマブレスポンダーにおける６カ月間にわたるすべての連続する時点に反応および寛解を持続させるその能力の点でプラセボと比べて有意な優位性を示した。６カ月間にわたるナタリズマブの月１回の投与は、忍容性が良好であり、対象がステロイドを中止することに成功することを可能にした。
上の刊行物、特許および特許出願のすべては、個々の刊行物、特許および特許出願がすべての目的のためにその全体を参照により援用すると明確かつ個別に示された場合と同じ程度にそれらの全体を参照により本明細書に援用する。本願書は、すべての目的のためにその全体を参照により本明細書に援用する２００４年４月１日に提出された米国仮出願番号６０／５５８１２０の恩典を主張する。

Claims (83)

  1. 炎症性腸疾患、喘息、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、宿主対移植片病、脊椎関節症およびその組合せからなる群から選択される疾患を有する対象におけるステロイド療法に対する必要性を減少および／または排除するために、ステロイド節約剤を使って前記対象を治療するための薬剤を調製するステロイド節約剤の使用方法であって、
    ステロイドの節約に有効な量となるだけの前記薬剤を前記対象に投与する工程を含むことを特徴とするステロイド節約剤の使用方法。
  2. 前記対象がヒトであることを特徴とする請求項１に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  3. 前記ステロイド節約剤がモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の免疫学的に活性なフラグメントであることを特徴とする請求項１に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  4. 前記モノクローナル抗体がキメラ抗体、ヒト抗体、遺伝子工学的に処理された抗体または二重特異性抗体であることを特徴とする請求項３に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  5. 前記抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントがα４β１インテグリンに結合していることを特徴とする請求項４に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  6. 前記抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントがα４β７インテグリンに結合していることを特徴とする請求項４に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  7. 前記抗体がヒト化抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントであることを特徴とする請求項５に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  8. 前記ヒト化抗体がナタリズマブまたはその免疫学的に活性なフラグメントであることを特徴とする請求項７に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  9. 前記ナタリズマブをそれを必要とする前記対象に非経口的に投与することを特徴とする請求項８に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  10. 前記薬剤がそれを必要とする前記対象に長期的に投与されることを特徴とする請求項８に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  11. 前記非経口の投与により、前記対象におけるナタリズマブの有効血中濃度が少なくとも約１ｎｇ／ｍＬとなることを特徴とする請求項９に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  12. ナタリズマブの有効血中濃度が前記対象において約１ｎｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項９に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  13. 前記薬剤を前記対象に長期に投与することを特徴とする請求項１に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  14. 前記薬剤の前記長期の投与が少なくとも１年間の期間にわたり週１回または月１回であることを特徴とする請求項１３に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  15. 前記疾患が炎症性腸疾患であり、前記ステロイド節約剤がα４−免疫グロブリンまたはα４リガンドに対する免疫グロブリンであり、
    前記対象のステロイド療法を漸減することを可能にするのに有効な量の前記薬剤が投与されることを特徴とする請求項１に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  16. 前記炎症性腸疾患がクローン病または潰瘍性大腸炎であることを特徴とする請求項１５に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  17. 前記抗α４免疫グロブリンを約２ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇの量で前記対象に投与することを特徴とする請求項１５に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  18. 前記対象がステロイドに対して不応性、不耐性または依存性であることを特徴とする請求項１５に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  19. 前記対象が必要とするステロイドの治療に有効な量は、前記薬剤の投与がない場合に必要とされる量より少ないことを特徴とする請求項１８に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  20. 前記対象が、
    ａ）免疫抑制剤による治療に対して無応答性または不耐性である患者、
    ｂ）ステロイドによる治療に対して無応答性、不耐性または依存性である患者、
    または、
    ｃ）ａ）およびｂ）の組合せである患者、であることを特徴とする請求項１８に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  21. ステロイドの節約に有効な量の抗α４インテグリン免疫グロブリンまたはα４インテグリンリガンドに対する免疫グロブリンと、
    （ｉ）ステロイドでない免疫抑制剤と、（ｉｉ）抗ＴＮＦ組成物と、（ｉｉｉ）５−ＡＳＡ組成物と、（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の組合せと、からなる群から選択される第２の薬剤と、
    を含むことを特徴とする炎症性腸疾患の治療のための併用療法。
  22. 治療上有効な量の第２のステロイド節約剤をさらに含むことを特徴とする請求項２１に記載の炎症性腸疾患の治療のための併用療法。
  23. 前記抗α４免疫グロブリンが、抗α４β７インテグリン抗体であることを特徴とする請求項２１に記載の炎症性腸疾患の治療のための併用療法。
  24. 前記抗α４免疫グロブリンが、ナタリズマブであることを特徴とする請求項２１に記載の炎症性腸疾患の治療のための併用療法。
  25. 前記免疫抑制剤が、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサートおよびミコフェノレートからなる群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の炎症性腸疾患の治療のための併用療法。
  26. 前記抗ＴＮＦ組成物が、インフリキシマブであることを特徴とする請求項２１に記載の炎症性腸疾患の治療のための併用療法。
  27. 前記５−ＡＳＡ剤が、スルファサラジン、メサラジンおよびオサラジンからなる群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の炎症性腸疾患の治療のための併用療法。
  28. 前記疾患が、多発性硬化症であり、前記ステロイド節約剤がα４−免疫グロブリンまたはα４リガンドに対する免疫グロブリンであり、前記薬剤が前記対象のステロイド療法を漸減することを可能にする量で投与されることを特徴とする請求項１に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  29. 前記治療量が前記対象のステロイド療法を漸減することを可能にするものであり、前記対象がステロイドに対して不応性、不耐性または依存性であることを特徴とする請求項２８に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  30. 前記対象が必要とするステロイドの治療に有効な量は、前記薬剤の投与がない場合に必要とされる量より少ないことを特徴とする請求項２９に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  31. 前記対象が、
    ａ）免疫抑制剤による治療に対して無応答性または不耐性である患者、
    ｂ）ステロイドによる治療に対して無応答性、不耐性または依存性である患者、
    あるいは、
    ｃ）ａ）およびｂ）の組合せである患者、であることを特徴とする請求項２８に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  32. ステロイドの節約に有効な量の抗α４インテグリン免疫グロブリンまたはα４インテグリンリガンドに対する免疫グロブリンと、
    （ｉ）ステロイドでない免疫抑制剤と、（ｉｉ）抗ＴＮＦ組成物と、（ｉｉｉ）５−ＡＳＡ組成物と、（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の組合せと、からなる群から選択される第２の薬剤と、
    を含むことを特徴とする多発性硬化症の治療のための併用療法。
  33. 治療上有効な量の第２のステロイド節約剤を更に含むことを特徴とする請求項３２に記載の多発性硬化症の治療のための併用療法。
  34. 前記抗α４免疫グロブリンが、抗α４β１インテグリン抗体であることを特徴とする請求項３２に記載の多発性硬化症の治療のための併用療法。
  35. 前記抗α４免疫グロブリンが、ナタリズマブであることを特徴とする請求項３２に記載の多発性硬化症の治療のための併用療法。
  36. 前記免疫抑制剤が、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサートおよびミコフェノレートからなる群から選択されることを特徴とする請求項３２に記載の多発性硬化症の治療のための併用療法。
  37. 前記抗ＴＮＦ組成物が、インフリキシマブであることを特徴とする請求項３２に記載の多発性硬化症の治療のための併用療法。
  38. 前記５−ＡＳＡ剤が、スルファサラジン、メサラジンおよびオサラジンからなる群から選択されることを特徴とする請求項３２に記載の多発性硬化症の治療のための併用療法。
  39. 前記疾患が、慢性関節リウマチであり、前記ステロイド節約剤がα４−免疫グロブリンまたはα４リガンドに対する免疫グロブリンであり、前記薬剤が前記対象のステロイド療法を漸減することを可能にするのに十分な量で投与されることを特徴とする請求項１に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  40. 前記量が前記対象のステロイド療法を漸減することを可能にするものであり、前記対象がステロイドに対して不応性、不耐性または依存性であることを特徴とする請求項３９に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  41. 前記対象が必要とするステロイドの治療に有効な量が、前記薬剤の投与がない場合に必要とされる量より少ないことを特徴とする請求項４０に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  42. 前記対象が、
    ａ）免疫抑制剤による治療に対して無応答性または不耐性である患者、
    ｂ）ステロイドによる治療に対して無応答性、不耐性または依存性である患者、
    あるいは、
    ｃ）ａ）およびｂ）の組合せである患者、であることを特徴とする請求項３９に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  43. ステロイドの節約に有効な量の抗α４インテグリン免疫グロブリンまたはα４インテグリンリガンドに対する免疫グロブリンと、
    （ｉ）ステロイドでない免疫抑制剤と、（ｉｉ）抗ＴＮＦ組成物と、（ｉｉｉ）５−ＡＳＡ組成物と、（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の組合せと、からなる群から選択される第２の薬剤と、
    を含むことを特徴とする慢性関節リウマチの治療のための併用療法。
  44. 治療上有効な量の第２のステロイド節約剤を更に含むことを特徴とする請求項４３に記載の慢性関節リウマチの治療のための併用療法。
  45. 前記抗α４免疫グロブリンが、抗α４β１インテグリン抗体であることを特徴とする請求項４３に記載の慢性関節リウマチの治療のための併用療法。
  46. 前記抗α４免疫グロブリンが、ナタリズマブであることを特徴とする請求項４３に記載の慢性関節リウマチの治療のための併用療法。
  47. 前記免疫抑制剤が、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサートおよびミコフェノレートからなる群から選択されることを特徴とする請求項４３に記載の慢性関節リウマチの治療のための併用療法。
  48. 前記抗ＴＮＦ組成物がインフリキシマブであることを特徴とする請求項４３に記載の慢性関節リウマチの治療のための併用療法。
  49. 前記５−ＡＳＡ剤が、スルファサラジン、メサラジンおよびオサラジンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４３に記載の慢性関節リウマチの治療のための併用療法。
  50. 前記疾患が、宿主対移植片病または移植片対宿主病であり、前記ステロイド節約剤がα４−免疫グロブリンまたはα４リガンドに対する免疫グロブリンであり、前記薬剤が前記対象のステロイド療法を漸減することを可能にする量で投与されることを特徴とする請求項１に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  51. 前記量が前記対象のステロイド療法を漸減することを可能にするものであり、前記対象がステロイドに対して不応性、不耐性または依存性であることを特徴とする請求項５０に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  52. 前記対象が必要とするステロイドの治療に有効な量が、前記薬剤の投与がない場合に必要とされる量より少ないことを特徴とする請求項５１に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  53. 前記対象が、
    ａ）免疫抑制剤による治療に対して無応答性または不耐性である患者、
    ｂ）ステロイドによる治療に対して無応答性、不耐性または依存性である患者、
    あるいは、
    ｃ）ａ）およびｂ）の組合せである患者、であることを特徴とする請求項５１に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  54. ステロイドの節約に有効な量の抗α４インテグリン免疫グロブリンまたはα４インテグリンリガンドに対する免疫グロブリンと、
    （ｉ）ステロイドでない免疫抑制剤と、（ｉｉ）抗ＴＮＦ組成物と、（ｉｉｉ）５−ＡＳＡ組成物と、（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の組合せと、からなる群から選択される第２の薬剤と、
    を含むことを特徴とする宿主対移植片病または移植片対宿主病の治療のための併用療法。
  55. 治療上有効な量の第２のステロイド節約剤を更に含むことを特徴とする請求項５４に記載の宿主対移植片病または移植片対宿主病の治療のための併用療法。
  56. 前記抗α４免疫グロブリンが、抗α４β１インテグリン抗体であることを特徴とする請求項５４に記載の宿主対移植片病または移植片対宿主病の治療のための併用療法。
  57. 前記抗α４免疫グロブリンが、ナタリズマブであることを特徴とする請求項５４に記載の宿主対移植片病または移植片対宿主病の治療のための併用療法。
  58. 前記免疫抑制剤が、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサートおよびミコフェノレートからなる群から選択されることを特徴とする請求項５４に記載の宿主対移植片病または移植片対宿主病の治療のための併用療法。
  59. 前記抗ＴＮＦ組成物が、インフリキシマブであることを特徴とする請求項５４に記載の宿主対移植片病または移植片対宿主病の治療のための併用療法。
  60. 前記５−ＡＳＡ剤が、スルファサラジン、メサラジンおよびオサラジンからなる群から選択されることを特徴とする請求項５４に記載の宿主対移植片病または移植片対宿主病の治療のための併用療法。
  61. 前記疾患が喘息であり、前記ステロイド節約剤がα４−免疫グロブリンまたはα４リガンドに対する免疫グロブリンであり、前記薬剤が対象のステロイド療法を漸減することを可能にする量で投与されることを特徴とする請求項１に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  62. 前記量が前記対象のステロイド療法を漸減することを可能にするものであり、前記対象がステロイドに対して不応性、不耐性または依存性であることを特徴とする請求項６１に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  63. 前記対象が必要とするステロイドの治療に有効な量は、前記薬剤の投与がない場合に必要とされる量より少ないことを特徴とする請求項６２に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  64. 前記対象が、
    ａ）免疫抑制剤による治療に対して無応答性または不耐性である患者、
    ｂ）ステロイドによる治療に対して無応答性、不耐性または依存性である患者、
    あるいは、
    ｃ）ａ）およびｂ）の組合せである患者、であることを特徴とする請求項６１に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  65. ステロイドの節約に有効な量の抗α４インテグリン免疫グロブリンまたはα４インテグリンリガンドに対する免疫グロブリンと、
    （ｉ）ステロイドでない免疫抑制剤と、（ｉｉ）抗ＴＮＦ組成物と、（ｉｉｉ）５−ＡＳＡ組成物と、（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の組合せと、からなる群から選択される第２の薬剤と、
    を含むことを特徴とする喘息の治療のための併用療法。
  66. 治療上有効な量の第２のステロイド節約剤を更に含むことを特徴とする請求項６５に記載の喘息の治療のための併用療法。
  67. 前記抗α４免疫グロブリンが、抗α４β１インテグリン抗体であることを特徴とする請求項６５に記載の喘息の治療のための併用療法。
  68. 前記抗α４免疫グロブリンが、ナタリズマブであることを特徴とする請求項６５に記載の喘息の治療のための併用療法。
  69. 前記免疫抑制剤が、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサートおよびミコフェノレートからなる群から選択されることを特徴とする請求項６５に記載の喘息の治療のための併用療法。
  70. 前記抗ＴＮＦ組成物が、インフリキシマブであることを特徴とする請求項６５に記載の喘息の治療のための併用療法。
  71. 前記５−ＡＳＡ剤が、スルファサラジン、メサラジンおよびオサラジンからなる群から選択されることを特徴とする請求項６５に記載の喘息の治療のための併用療法。
  72. 前記疾患が、脊椎関節症であり、前記ステロイド節約剤がα４−免疫グロブリンまたはα４リガンドに対する免疫グロブリンであり、前記薬剤が前記対象のステロイド療法を漸減することを可能にする量で投与されることを特徴とする請求項１に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  73. 前記脊椎関節症が、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、ライター症候群、炎症性腸疾患の脊椎炎、未分化脊椎関節症および若年性脊椎関節症からなる群から選択されることを特徴とする請求項７２に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  74. 前記対象がステロイドに対して不応性、不耐性または依存性であることを特徴とする請求項７３に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  75. 前記対象が必要とするステロイドの治療に有効な量は、前記薬剤の投与がない場合に必要とされる量より少ないことを特徴とする請求項７４に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  76. 前記対象が、
    ａ）免疫抑制剤による治療に対して無応答性または不耐性である患者、
    ｂ）ステロイドによる治療に対して無応答性、不耐性または依存性である患者、
    あるいは、
    ｃ）ａ）およびｂ）の組合せである患者、であることを特徴とする請求項７３に記載のステロイド節約剤の使用方法。
  77. ステロイドの節約に有効な量の抗α４インテグリン免疫グロブリンまたはα４インテグリンリガンドに対する免疫グロブリンと、
    （ｉ）ステロイドでない免疫抑制剤と、（ｉｉ）抗ＴＮＦ組成物と、（ｉｉｉ）５−ＡＳＡ組成物と、（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の組合せと、からなる群から選択される第２の薬剤と、
    を含むことを特徴とする脊椎関節症の治療のための併用療法。
  78. 治療上有効な量の第２のステロイド節約剤を更に含むことを特徴とする請求項７７に記載の脊椎関節症の治療のための併用療法。
  79. 前記抗α４免疫グロブリンが、抗α４β１インテグリン抗体であることを特徴とする請求項７７に記載の脊椎関節症の治療のための併用療法。
  80. 前記抗α４免疫グロブリンが、ナタリズマブであることを特徴とする請求項７７に記載の脊椎関節症の治療のための併用療法。
  81. 前記免疫抑制剤が、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサートおよびミコフェノレートからなる群から選択されることを特徴とする請求項７７に記載の脊椎関節症の治療のための併用療法。
  82. 前記抗ＴＮＦ組成物が、インフリキシマブであることを特徴とする請求項７７に記載の脊椎関節症の治療のための併用療法。
  83. 前記５−ＡＳＡ剤が、スルファサラジン、メサラジンおよびオサラジンからなる群から選択されることを特徴とする請求項７７に記載の脊椎関節症の治療のための併用療法。
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