JPH08508719A

JPH08508719A - インシュリン依存型糖尿病の治療

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Publication number: JPH08508719A
Application number: JP6518333A
Authority: JP
Inventors: シー．バークリー，リンダ
Original assignee: バイオジェンインコーポレイテッド
Priority date: 1993-02-09
Filing date: 1994-02-09
Publication date: 1996-09-17
Anticipated expiration: 2019-11-24
Also published as: JP3593343B2; CA2155303A1; AU687790B2; ATE161730T1; DE69407758T2; CA2155303C; EP0682529A1; WO1994017828A2; NZ262615A; AU6237994A; EP0682529B2; HK1008731A1; ES2114183T3; EP0682529B1; DK0682529T4; GR3026531T3; DE69407758D1; US5888507A; WO1994017828A3; US20050208053A1

Abstract

(57)【要約】インシュリン依存型（Ｉ型）糖尿病の予防のための方法。その方法は、ＶＬＡ４を認識する抗体、ポリペプチド又は他の分子の投与を含む。

Description

【発明の詳細な説明】インシュリン依存型糖尿病の治療技術の分野本発明は、インシュリン依存型（Ｉ型）糖尿病の治療に関するものである。特に、この発明は、糖尿病の予防における、インテグリンＶＬＡ４（very late an tigen4）を認識する抗体の利用に関するものである。発明の背景インシュリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病とも呼ばれ、以前は若年性糖尿病と呼ばれた）は、過去２０年の間に慢性自己免疫疾患として分類された。この病気においては、膵島内でインシュリンを産生する細胞（β細胞）が、膵臓の細胞性浸潤物により、選択的に標的とされ破壊される。この島に影響を与える炎症性浸潤は、インシュリン炎と呼ばれる。インシュリンを産生する細胞は、島細胞の大部分を含むが、全膵臓塊の２％未満である（Castano及びEisenbarth，1990，[1]； Fujita等、1982 [2]；Foulis等、1986 [3]）。Ｉ型糖尿病の発達は、概念的に、６段階に分けることが出来、遺伝的感受性にて始まり、完全なβ細胞破壊で終る（Eisenbarth，1986 [4]）。第Ｉ段階は、遺伝的感受性であり、これは、この病気の発達に必要な条件であるが十分ではない。仮説の引き金事象（第II段階）が、β細胞に対する活性な自己免疫へと導く（第III段階）。第III段階において、β細胞塊は減退するという仮説が立てられており、免疫異常例えばインシュリン及び島細胞質抗原に対する自己抗体等が見出される。刺激されたインシュリン分泌は、この段階で未だ保存されている。しかしながら、数年間にわたって、β細胞の進行性の喪失が、その個体が未だ血糖正常であるにもかかわらず、静脈内グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）で、減少したインシュリン分泌へと導く（第IV段階）。明白な糖尿病（即ち、糖尿病発症又は高血糖による病気の臨床的明示）は第Ｖ段階であり、数年後膵臓のβ細胞の９０％が破壊されたときに生じ得る。第Ｖ段階で明白な糖尿病が最初に認められたときに、幾らかの残存インシュリン産生は残っている（プロインシュリンの結合ペプチドであるＣペプチドの血清中での存在により示される）が、その個体は、通常、生きるために外来のインシュリンを必要とする。最終的に、第VI段階においては、残存β細胞さへ破壊され、もはや循環中にＣペプチドは検出し得ない。開始因子及び糖尿病へ導く特異的連鎖（種々の細胞型及びサイトカインの重要性を含む）は、未だ、広く議論されているが、鍵となる役割は、一般に、自己抗原反応性Ｔ細胞について認められている（Miller等、1988[5]；Harada及びMakin o，1986 [6]；Koike等、1987[7]；Makino等、1986[8]）。Ｔリンパ球に加えて、インシュリン炎は、マクロファージ、樹状細胞（Voorbij等、1989[9]）及びＢ細胞により特徴付けられ、これらは、専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）として働き得る。マクロファージは又、サイトカイン又はフリーラジカルの放出によって島β細胞自身をも破壊し得る（Nomikos等、1986 [10]）。従って、自己免疫糖尿病は、細胞移動及び新たに存在する細胞の免疫刺激の両方に依存する。炎症部位への細胞交通は、リンパ球（ＬＦＡ−１、ＶＬＡ４）及びマクロファージ（Ｍａｃ−１、ＶＬＡ４）の表面上の付属分子ＬＦＡ−１、ＭＡＣ−１及びＶＬＡ４（Larson及びSpringer，1990[11]；Hemler等、1990[12]）及びそれらと対となるリガンドＩＣＡＭ（ＬＦＡ−１及びＭＡＣ−１に対する）及びＶＣＡＭ（ＶＬＡ４に対する）により調節されるが、これらは、血管内皮においてサイトカインによって調節されない（Larson及びSpringer，1990 [11]；Lobb，1992 [1 3]；Osborn，1990，[14]）。更に、ＶＬＡ４は、細胞外マトリックス成分、フィブロネクチン（ＦＮ）のＣＳ−１ドメインに結合する（Wayner等、1989 [15]）。これらの経路例えばリンパ球におけるＬＦＡ−１及びＶＬＡ４又は単核球におけるＭＡＣ−１及びＶＬＡ４の細胞移動の制御における相対的重要性は、未だ研究の主題である。イン・ビトロのデータは、これらの経路の異なる利用が白血球及び内皮細胞の両方の活性化状態に依存するらしいことを示唆している（Shimiz u等、1991 [16]）。それらのイン・ビボでの炎症部位への細胞移動を制御する能力は、種々の動物疾患モデルを阻止するＩＣＡＭ、ＭＡＣ−１又はＶＬＡ４に対するモノクローナル抗体（ｍＡＢ）を用いて直接的に示された（Barton等、1989 [17]，ホルボールエステル誘導したウサギ肺炎症；Issekutz及びIssekutz，1991[18]，遅延型過敏症；Issekutz，1991 [ 19]，アジュバント誘導した関節炎；Yednock等、1992 [20]，実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の伝達；Lobb，1992 [21]，喘息）。ＩＣＡＭ及びＶＣＡＭは又、リンパ組織におけるマクロファージ及び樹状細胞の表面にも見出される（Dustin等、1986[22]；Rice等、1990[23]；Rice等、1991 [24]）。これらの専門のＡＰＣにおけるそれらの分布は、Ｔ細胞活性化におけるＬＦＡ−１及びＶＬＡ４の役割を示す機能データ（Shimuzu等、1990 [25]；Burk ly等、1991 [26]）と一致する。しかしながら、ＣＤ４／ＭＨＣクラスII及びＣＤ８／ＭＨＣクラスＩ（Rudd等、1989 [27]）、ＣＤ２／ＬＦＡ−３（Moingeon 等、1989[287]）、ＣＤ２８／Ｂ７（Harding等、1992 [29]）を含む多くの他のレセプター−リガンド対も又、Ｔ／ＡＰＣ又はＴ／標的細胞相互作用の間、接着を支持し且つＴ細胞を同時刺激し得る。糖尿病の発達におけるこれらの多くの経路の特異的寄与は、未解決である。細胞接着及びＴ細胞活性化のための多くの分子経路があるので、これらの経路の１つ以上における干渉が糖尿病の発症又は激烈さに影響するかどうか、特にこの病気過程に重要であるか又は関連するこれらの経路の干渉がその発症又は激烈さに影響するかどうかを予想することは不可能である。Ｔ細胞に対する抗体は、自発性糖尿病及び養子免疫伝達糖尿病のマウス又はラットモデルにおいてＴ細胞を枯渇させ、そうして病気を阻止するために用いられている（例えば、Harada及びMakino，1986 [6]，抗Ｔｈｙ１．２；Koike等、198 7 [7]，Miller等、1988 [5]及びShizuru等、1988 [30]，抗ＣＤ４；Barlow及びL ike，1992 [31]，抗ＣＤ２；Like等、1986 [32]，抗ＣＤ５及び抗ＣＤ８を参照されたい）。更に、マクロファージ上の３型補体レセプター（ＣＲ３）分子又はＭＡＣ−１に対する抗体は、病気のマウス養子免疫伝達モデルの膵臓組織のマクロファージ及びＴ細胞浸潤を阻止するために用いられている（Hutchings等、199 0 [33]）。ＶＬＡ４がインシュリン炎に又は膵臓内に位置させた後に島特異的細胞の活性に関連するのかどうかは知られていない。Ｉ型糖尿病に対して提案されている現在の治療プロトコールは、Federlin及び Becker［34］により要約されたある種の免疫調節剤を含み、本明細書中に参考として援用する。免疫異常及び進行性β細胞破壊を伴う長期の前糖尿病期は、免疫干渉によってβ細胞喪失を停止させることが可能であることを示唆する（Castan o及びEisenbarth）。示唆された薬剤／プロトコールは、ある種の免疫調節剤及び免疫抑制剤：レバミゾール、テオフィリン、胸腺ホルモン、シアメクソン、抗胸腺細胞グロブリン、インターフェロン、ニコチンアミド、ガンマーグロブリン輪液、血球返還採血法又は白血球輸血を含んでいる。Ｔ細胞活性化及びＴ細胞発生をそれぞれ害するシクロスポリンＡ、アザチオプリン等の薬剤が臨床的試みにおいて用いられてきた（Zielasek等、1989 [35]）。最も有望な結果は、シクロスポリンＡを用いて達成された（Castano及びEisenbarth，1990 [35]）。しかしながら、Federlin及びBecker，1990［34］は、シクロスポリンＡは、少なくとも高投与量で与えた場合には毒性の副作用のために、一般的又は長期の使用には勧められないということを示唆している。シクロスポリンＡの高投与量又は他の免疫抑制剤との組合せ或はその両方は、リンパ種の発生及び不可逆的な腎臓障害と関係している（Eise nbarth，1986[4]；Eisenbarth，1987［36］）。他の示唆された薬剤についての更なる研究が、安全性及び効果を評価するために必要である。シクロスポリンＡの研究でさへ、その糖尿病の緩解を維持する効力が、１年間で新たな糖尿病の発症の約３０〜６０％であることを示している。しかしながら、緩解は、３年以内に、殆ど常に失われる（Castano及びEisenbarth，1990[1]）。病気の発症後の治療プロトコールは、例えば、糖尿病が診断された時点で、インシュリン炎は、典型的には、既に進行していてβ細胞の８０％より多くが失われているので、特に問題である。従って、シクロスポリンＡはβ細胞の更なる破壊を阻止することは出来るが、糖尿病の発症の時点で僅かのβ細胞しか存在しえないのでそれらは長期にわたって非糖尿病状態を維持することが出来ないということはあり得る（Castan o及びEisenbarth，1990 [1]）。インシュリン炎の抑制及び／又は病気の予防は、治療をもっと初期の段階即ち病気の発症の前に間始することが出来れば一層上首尾に行なうことが出来る。如何なる糖尿病の予防処置を開発するためにも２つの主要な前提条件がある：（１）前糖尿病の個体を正確に同定する能力及び（２）安全で特異的且つ効果的な予防処置の開発。有意の進歩が前糖尿病の個体を同定することにおいて為されたが、Eisenbarthと共同研究者（例えば、Ziegler及びEisenbarth，1990 [37]； Ziegler等、1990 [38]；Ziegler等、1990［39］を参照されたい）により討論され総説されているように安全で特異的且つ効果的な予防処置については多くの仕事が残っている。Ｉ型糖尿病についてある種の危険因子及び危険状態にあるグループを同定し、それにより臨床的疾病へと進むことが最もありそうな個体を予想しこれらの個体における病気の発症の凡その割合を見積もることは可能となっている。遺伝学的（ＨＬＡ分類）、免疫学的（島及びインシュリン自己抗体）及び代謝的（高血糖の発達に先行する静脈内グルコースへの第１段階インシュリン分泌）マーカーの組合せによって、糖尿病に対する感受性を有する個体を同定し又は前臨床段階でＩ型糖尿病を予想する能力は、β細胞破壊が部分的であるならば、自己免疫病過程の発展中における予防免疫治療剤の同定及び利用を可能にする。しかしながら、今日まで、ヒトの糖尿病の治療は殆ど成功していない。一般に、ヒトの治療は、糖尿病の発症後にのみ為されるので、治療は、何人かの患者についてのみ一時的に完全な又は部分的な緩解を生じるだけであった。免疫抑制機構がインシュリン炎及び／又は糖尿病を阻止し得るので、前糖尿病段階における利用のための免疫抑制成分の要求がある。特に、一層安全で且つ特異的に作用する成分例えば、エフェクター細胞の膵臓への侵入を阻止し又は既にランゲルハンス島に侵入したこれらの細胞の機能を阻止するモノクローナル抗体の要求がある。この度、驚くべきことに、ゲッ歯類の糖尿病モデルにおいて、抗ＶＬＡ４抗体の投与が糖尿病の発病率を有意に減じることが発見された。ＮＯＤマウス糖尿病モデルは、ヒトのＩ型糖尿病に正に匹敵する十分確立されたモデルである。養子免疫伝達した病気の実験用プロトコールを用いて、照射した糖尿病でないＮＯＤマウスに、病気の急性伝達のために、自発的糖尿病のＮＯＤマウスから脾臓細胞を投与した。これらの脾臓細胞を投与前に抗ＶＬＡ４抗体で処理し且つレシピエントも伝達後に抗ＶＬＡ４抗体で様々な期間にわたって処理した。発明の要約従って、本発明は、前糖尿病における、インシュリン依存型（Ｉ型）糖尿病の治療のための新規な方法を提供する。特に、本発明は、抗ＶＬＡ４抗体例えば抗体ＨＰ１／２又はＨＰ１／２から誘導したヒト化抗ＶＬＡ４抗体を前糖尿病の個体に投与するステップを含むインシュリン依存型糖尿病の予防のための方法を提供する。糖尿病の治療における抗ＶＬＡ４抗体の作用を真似る類似の抗体、抗体断片、可溶性蛋白質及び低分子の利用も又企図する。更に、本発明は、ヒトを含む糖尿病に感受性の哺乳動物に、ＶＬＡ４のα４サブユニットに結合し得る抗体を糖尿病の発症を阻止するのに十分な量で投与することによる糖尿病の治療法法を提供する。更に、α４／ＶＬＡ４に結合することの出来る組換え及びキメラ抗体、かかる抗体の断片、ポリペプチド又は低分子の利用も又企図される。ＶＬＡ４に対する天然の可溶型結合蛋白質も又企図される（可溶性ＶＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１ペプチド又はＶＣＡＭ−１融合蛋白質並びにフィブロネクチン、別のスプライシングを受けた非III型結合セグメントを有するフィブロネクチン及びアミノ酸配列ＥＩＬＤＶ又は類似の保存的置換されたアミノ酸配列を含むフィブロネクチンペプチドを含む）。これらの薬剤は、ＶＬＡ４に対する細胞表面結合蛋白質と競争することによって作用する。図面の簡単な説明図１は、脾臓細胞の養子免疫伝達後の糖尿病の阻止についての抗ＶＬＡ４抗体（Ｒ１−２）及び対照の効果を描いたグラフであり、糖尿病になったレシピエントの頻度及び病気発症までの日を、処理してない（塗りつぶした丸）、非特異的ラットＩｇＧ２ｂ処理した（塗りつぶした三角形）及びＲ１−２抗ＶＬＡ４処理した（塗りつぶした菱形）糖尿病（Ｄ）のＮＯＤドナーからの２×１０⁷の脾臓細胞の移植について並びに糖尿病でない（Ｙ）ＮＯＤドナー（塗りつぶしてない正方形）からの脾臓細胞の移植について示してある。これらの脾臓細胞を、Ｒ１ −２若しくはラットＩｇＧ２ｂと共に又はｍＡｂを伴わずに移植し、次いで、Ｒ１−２若しくはラットＩｇＧ２ｂを移植後１２日間にわたって毎日注射した（全グループについてｎ＝８〜１０）。図２は、脾臓細胞の養子免疫伝達後の糖尿病の阻止についての抗ＶＬＡ４抗体（Ｒ１−２）及び対照の効果を描いたグラフであり、糖尿病になったレシピエントの頻度及び病気発症までの日を、処理してない（塗りつぶした丸）、非特異的ラットＩｇＧ２ｂ処理した（塗りつぶした三角形）及びＲ１−２抗ＶＬＡ４処理した（塗りつぶした菱形）糖尿病（Ｄ）のＮＯＤドナーからの３×１０⁷の脾臓細胞の移植について並びに糖尿病でない（Ｙ）ＮＯＤドナー（塗りつぶしてない正方形）からの脾臓細胞の移植について示してある。これらの脾臓細胞を、Ｒ１−２若しくはラットＩｇＧ２ｂと共に又はｍＡｂを伴わずに移植し、次いで、Ｒ１−２若しくはラットＩｇＧ２ｂを移植後２５日間にわたって３．５日毎に注射した（全グループについてｎ＝４〜５）。図３は、脾臓細胞の養子免疫伝達後の糖尿病の阻止についての抗ＶＬＡ４抗体（Ｒ１−２）及び対照の効果を描いたグラフであり、糖尿病になったレシピエントの頻度及び病気発症までの日を、処理してない（塗りつぶした丸）、非特異的ラットＩｇＧ２ｂ処理した（塗りつぶした三角形）及びＲ１−２抗ＶＬＡ４処理した（塗りつぶした菱形）糖尿病（Ｄ）のＮＯＤドナーからの２〜３×１０⁷の脾臓細胞の移植について並びに糖尿病でない（Ｙ）ＮＯＤドナー（塗りつぶしてない正方形）からの脾臓細胞の移植について又はＰＢＳ単独（塗りつぶしてない丸）について示してある。これらの脾臓細胞を、Ｒ１−２若しくはラットＩｇＧ２ｂと共に又はｍＡｂを伴わずに移植し、次いで、Ｒ１−２若しくはラットＩｇＧ２ｂを移植後２５日間にわたって３．５日毎に注射した（全グループについてｎ＝５）。図４は、脾臓細胞の養子免疫伝達後のインシュリン炎の程度についての抗ＶＬＡ４抗体（Ｒ１−２）及び対照の効果を描いた棒グラフであり、Ｒ１−２、ラットＩｇＧ２ｂで処理した又はｍＡｂを伴わない細胞を移植し、次いでＲ１−２若しくはラットＩｇＧ２ｂを２５日間にわたって３．５日毎にマウスに注射し、マウスが糖尿病になったとき又は移植後２６日目に殺して、浸潤されなかった島（０〜Ｉ級浸潤、点を付けた棒）及び浸潤された島（II〜IV 級インシュリン炎、塗りつぶした棒）の頻度を定量して示した。ｎ＝４〜５のマウスからの膵臓の切片を、各実験グループ、即ち、糖尿病でないレシピエント（Ｙ）へのＹ→Ｙ（糖尿病でないドナーの細胞の移植）又はＤ→Ｙ（糖尿病ドナーの細胞の移植）（ｍＡｂ処理をしないで、ラットＩｇＧ２ｂで処理して又はＲ１ −２で処理して）について評点した。図５は、脾臓細胞の養子免疫伝達後のインシュリン炎の程度についての抗ＶＬＡ４抗体（Ｒ１−２）及び対照の効果を描いた棒グラフであり、Ｒ１−２、ラットＩｇＧ２ｂで処理した又はｍＡｂを伴わない細胞を移植し、次いでＲ１−２若しくはラットＩｇＧ２ｂを移植後１２日間にわたって毎日注射し、その後は更なるｍＡｂ注射をせずに維持し、マウスが糖尿病になったとき又は移植後２９日目に殺して、浸潤されなかった島（０〜Ｉ級浸潤、点を付けた棒）及び浸潤された島（II〜IV級インシュリン炎、塗りつぶした棒）の頻度を定量して示した。ｎ＝４〜５のマウスからの膵臓の切片を、各実験グループ、即ち、糖尿病でないレシピエント（Ｙ）へのＹ→Ｙ（糖尿病でないドナーの細胞の移植）又はＤ→Ｙ（糖尿病ドナーの細胞の移植）（ｍＡｂ処理をしないで、ラットＩｇＧ２ｂで処理して又はＲ１−２で処理して）について評点した。図６は、自発的糖尿病モデルにおける病気の阻止についての抗ＶＬＡ４抗体（Ｒ１−２）及び対照の効果を描いたグラフであり、糖尿病になったレシピエントの頻度及び病気の発症までの日を、処理してない（塗りつぶした正方形）、非特異的ラットＩｇＧ２ｂ処理した（塗りつぶした丸）及びＲ１−２抗ＶＬＡ４処理した（塗りつぶした三角形）ＮＯＤマウスについて示してある。Ｒ１−２又はラットＩｇＧ２ｂを８週間にわたってＮＯＤマウスに注射し、４〜１２週齢では週２回注射した。図７は、脾臓細胞の養子免疫伝達後の糖尿病の阻止についてのＶＣＡＭ２Ｄ− ＩｇＧ融合蛋白質及び対照の効果を描いたグラフであり、糖尿病になったレシピエントの頻度及び病気の発症までの日を、無関係のラットＬＦＡ−３Ｉｇ融合蛋白質処理した（塗りつぶした正方形）及びＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧ処理した（塗りつぶしてない丸）糖尿病（Ｄ）のＮＯＤドナーからの２×１０⁷の脾臓細胞の移植について、或は細胞を移植せずＰＢＳだけを受けたレシピエント（塗りつぶした三角形）の発症頻度を示してある。これらの脾臓細胞は、ＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧ又はラットＬＦＡ−３Ｉｇと共に移植し、その後ＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧ又はラットＬＦＡ−３Ｉｇを移植後１７日間にわたって毎日注射した（すべてのグループについてｎ＝５）。図８は、実施例５に記載したＶＣＡＭ２ＤＩｇＧ融合蛋白質の構造を描いた図式表示である。ＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧは、ＶＬＡ４に対するリガンド（ＶＣＡＭ１）の可溶性形態であり、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域配列（ヒンジ、Ｃ_H２及びＣ_H３）に融合した２つのＶＣＡＭ１のＮ末端ドメインからなる。発明の詳細な説明この発明は、インシュリン依存型（Ｉ型）糖尿病の予防を含む治療に関するものである。特に、この発明は、前糖尿病の個体における糖尿病の治療におけるＶＬＡ４に対する抗体の利用に関係する。用語「前糖尿病」は、明白な糖尿病又は糖尿病の発症前の病気過程の如何なる段階であっても糖尿病の発達の危険にある（例えば、遺伝的に病気にかかり易い）個体を意味することを意図している。用語「糖尿病」は、明白な高血糖（即ち、空腹時血糖レベル≧２５０ｍｇ／ｄＬ）を有する個体を意味することを意図している。用語「明白な糖尿病」又は「糖尿病の発症」は、膵臓島細胞が破壊され明白な高血糖（即ち、空腹時血糖レベル≧ ２５０ｍｇ／ｄＬ）により臨床的に明白である病気状態を意味することを意図する。第１の面において、この発明は、リンパ球及びマクロファージを含むＶＬＡ４陽性細胞の表面上のＶＬＡ４抗原に結合する（ブロックし又は被覆することを含む）ことの出来る組成物を投与するステップを含む糖尿病の治療方法を提供する。この発明の目的に関して、用語「ＶＬＡ４抗原に結合する」は、細胞上のＶＬＡ４抗原と反応性であり、それにより、ＶＬＡ４抗原と他の細胞表面上のＶＣＡＭ−１又はフィブロネクチンの何れかとの相互作用を妨害し、又はそれによりＶＬＡ４陽性細胞の機能変化を誘導することを意味することを意図している。ここに示すように、ＶＬＡ４抗原のかかる結合（ブロック又は被覆することを含む）は、糖尿病の発生に対する予防又は防護を生じる。この例示は、ＶＬＡ４に対するモノクローナル抗体をＶＬＡ４抗原を効果的にブロックし又は被覆する結合剤として利用した。当業者は、この例示を与えられれば、ＶＬＡ４抗原に結合し得る薬剤（ブロック又は被覆し得るものも含む）が、この発明の方法において上首尾に利用し得ることを認識するであろう。従って、この発明の目的に関して、ＶＬＡ４を有する細胞の表面上のＶＬＡ４抗原に結合し得る任意の薬剤及びＶＬＡ４抗原を効果的にブロックし又は被覆することの出来る任意の薬剤は、本明細書の実施例で用いられているモノクローナル抗体の同等物であると考えられる。例えば、この発明は、少なくとも、ＶＬＡ４を有する細胞の表面上のＶＬＡ４抗原に結合することの出来るペプチド、ペプチド類似物、炭水化物及び低分子を、結合性同等物として企図する。好適具体例において、細胞表面ＶＬＡ４抗原に結合する（ブロック及び被覆を含む）この発明の方法において利用する薬剤は、モノクローナル抗体又は抗体誘導体である。治療特にヒトの治療のための好適な抗体誘導体は、ヒト化組換え抗体、キメラ組換え抗体、Ｆab、Fab'、Ｆ(ab')₂及びＦ（v）抗体断片、並びに抗体重鎖若しくは軽鎖のモノマー若しくはダイマー又はこれらの混合物を含む。従って、ＶＬＡ４に対するモノクローナル抗体は、この発明による方法における好適結合剤である。モノクローナル抗体を生成するための技術は、周知である。簡単に言えば、不滅化細胞系統（典型的には、ミエローマ細胞）を、所定の抗原例えばＶＬＡ４を発現している全細胞で免疫した哺乳動物からのリンパ球（典型的には、脾臓細胞）と融合させ、その結果生成したハイブリドーマ細胞の培養上清をその抗原に対する抗体についてスクリーニングする（一般的には、Kohler等、1975[40]を参照されたい）。免疫化は、標準的手順を用いて達成することが出来る。単位投与量及び免疫化管理は、免疫化する哺乳動物種、その免疫状態、その哺乳動物の体重等に依存する。典型的には、免疫した哺乳動物から採血し、各血液試料からの血清を適当なスクリーニング用アッセイを用いて特定の抗体についてアッセイする。例えば、抗ＶＬＡ４抗体は、ＶＬＡ４発現細胞からの¹²⁵Ｉ標識した細胞溶解物の免疫沈降によって同定することが出来る（Sanchez-Madrid等、1986［41］及びHemler等、1987[42]を参照されたい）。抗ＶＬＡ４抗体は又、フローサイトメトリーにより例えばＶＬＡ４を認識すると考えられる抗体と共にインキュベートしたRamos 細胞の蛍光染色を測定することにより同定することも出来る（Elices等、(1990) [43]を参照されたい）。ハイブリドーマ細胞の生成に典型的に利用されるリンパ球は、抗ＶＬＡ４抗体の存在について陽性であることをかかるスクリーニングアッセイを用いて既に試験してある免疫化哺乳動物の血清から単離される。典型的には、不滅化細胞系統（例えば、ミエローマ細胞系統）を、リンパ球と同じ哺乳動物種から誘導する。好適不滅化細胞系統は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性のマウスミエローマ細胞系統である。典型的には、ＨＡＴ感受性マウスミエローマ細胞を、分子量１５００のポリエチレングリコール（「PEG1500」）を用いて、マウス脾臓細胞と融合させる。この融合から生成したハイブリドーマ細胞を、次いで、未融合の又は非産生的に融合したミエローマ細胞を殺すＨＡＴ培地を用いて選択する（未融合の脾臓細胞は、トランスフォームされていないので数日後に死ぬ）。所望の抗体を産生するハイブリドーマを、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出する。例えば、抗ＶＬＡ４抗体を産生するために調製したハイブリドーマを、組換えα₄サブユニット発現細胞系統例えばトランスフェクトしたＫ−５６２細胞に結合する能力を有する分泌された抗体についてハイブリドーマ培養上清を試験することによってスクリーニングすることが出来る（Elices等、［43］を参照されたい）。抗ＶＬＡ４抗体を生成するために、かかるスクリーニングアッセイで試験して陽性のハイブリドーマ細胞を、栄養培地中で、ハイブリドーマ細胞がモノクローナル抗体を培養培地中に分泌するのに十分な条件及び時間で培養した。これらのハイブリドーマ細胞に適した培養技術及び培養培地は、周知である。調整したハイブリドーマ培養上清を集め、抗ＶＬＡ４抗体を適宜更に周知の方法によって精製することが出来る。或は、所望の抗体を、ハイブリドーマ細胞を非免疫化マウスの腹膜腔に注入することによって生成することが出来る。これらのハイブリドーマ細胞は、腹膜腔内で増殖して抗体を分泌し、それは腹水液として蓄積する。注射器で腹膜腔から腹水液を回収することにより抗体を採取することが出来る。幾つかのマウス抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体が以前に記載された（例えば、 Sanchez-Madrid等、1986 [41]；Hemler等、1987 [42]；Pulido等、1991［44］を参照されたい）。これらのＶＬＡ４のα鎖を認識することの出来る抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体例えばＨＰ１／２及び他の抗ＶＬＡ４抗体（例えば、ｍＡｂＨＰ２／１、ＨＰ２／４、Ｌ２５、Ｐ４Ｃ２、Ｐ４Ｇ９）は、本発明による治療方法において有用である。ＶＣＡＭ−１及びフィブロネクチンリガンドへの結合に関与するＶＬＡ−α₄鎖エピトープを認識する抗ＶＬＡ４抗体（即ち、リガンド認識に関与する部位でＶＬＡ４に結合してＶＣＡＭ−１及びフィブロネクチン結合をブロックすることの出来る抗体）は、好適である。かかる抗体は、Ｂエピトープ特異的抗体（Ｂ１又はＢ２）として規定されており（Pulido等、(1991)［36］を参照されたい）、本発明による好適抗ＶＬＡ４抗体である。ここに記載のように利用したＲ１−２抗体は、Ｂエピトープ型抗体である。ＶＬＡ４に対するヒトモノクローナル抗体は、この発明の方法においてＶＬＡ４抗原をブロック又は被覆することの出来る他の好適結合剤である。これらは、 Boerner等、1991［45］により記載されたように、イン・ビトロでプライムしたヒト脾臓細胞を用いて調製することが出来る。或は、それらを、Persson等、199 1［46］又はHuang及びStollar,1991［47］により記載されたようにレパートリークローニングによって調製することが出来る。この発明の方法においてＶＬＡ４抗原をブロック若しくは被覆し得る他の好適結合剤は、抗ＶＬＡ４特異性とヒト抗体定常領域とを有するキメラ組換え抗体である。この発明の方法においてＶＬＡ４抗原をブロック若しくは被覆することの出来る更に他の好適結合剤は、抗ＶＬＡ４特異性を有するヒト化組換え抗体である。ヒト化抗体は、Jones等、1989 [48]；Riechmann，1988，[49]；Queen等、1989 [50]；及びOrlandi等、1989［51 ］に例示されたようにして調製することが出来る。Ｂエピトープ特異性を有するキメラ組換え抗体及びヒト化組換え抗体を含む好適結合剤は、同時継続中の同時譲渡された米国特許出願第０８／００４，７９８号（１９９３年１月１２日出願）［52］にて調製され且つ説明されている。キメラ（マウスＶ−ヒトＣ）及びヒト化抗ＶＬＡ４抗体の調製のための出発物質は、以前に記載されたようなマウスモノクローナル抗ＶＬＡ４抗体、市販のモノクローナル抗ＶＬＡ４抗体（例えば、ＨＰ２／１、メイン、Westbrook，Amac Inte rnational，Inc．）又は本明細書の教示に従って調製したモノクローナル抗ＶＬＡ４抗体であってよい。例えば、抗ＶＬＡ４抗体ＨＰ１／２の重鎖及び軽鎖の可変領域が、クローン化され、配列決定され且つヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の定常領域と組合せて発現された。かかるキメラＨＰ１／２抗体は、マウスＨＰ１／２抗体に対して特異性及び効力において類似しており、本発明による治療方法において有用であり得る。ＨＰ１／２Ｖ_HＤＮＡ配列及び翻訳されたアミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:１及びSEQ ID NO:２に示す。ＨＰ１／２Ｖ_KＤＮＡ配列及びその翻訳されたアミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:３及びSEQ ID NO:４に示す。同様に、ヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体は、これらの方法において有用であり得る。好適なヒト化組換え抗ＶＬＡ４抗体は、ＡＳ／ＳＶＭＤＹ抗体であり、例えば、１９９２年１１月３日にＡＴＣＣに寄託して受託番号ＣＲＬ１１１７５を受けた細胞系統により産生されるＡＳ／ＳＶＭＤＹ抗体である。ＡＳ／ＳＶＭＤＹヒト化抗体は、少なくとも、マウスＨＰ１／２抗体と同じ効力を有するか又は恐らくは一層強力である。ＡＳＶ_HＤＮＡ配列及びその翻訳されたアミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:５及びSEQ ID N0:６。ＳＶＭＤＹＶ_KＤＮＡ配列及びその翻訳されたアミノ酸配列を、それぞれ、SEQ ID NO:７及びSEQ ID NO:８に示す。当業者は、任意の上記の抗体又は抗体誘導体結合剤がこの発明の方法においてＶＬＡ４のレセプターに結合することによっても作用することが出来、細胞表面ＶＬＡ４抗原をブロック若しくは被覆することが出来ることを認めるであろう。従って、この発明による抗体及び抗体誘導体結合剤は、ＶＣＡＭ−１若しくはフィブロネクチンに対する結合特性を有する具体例を含み得る（何故なら、これらの分子は、粘着細胞若しくは細胞外マトリックスにおいて重要であるか又は細胞の組織及び血液中の交通を妨害するかの何れかであるらしいから）。或は、この発明による方法において用いられるこれらの結合剤は、抗体若しくは抗体誘導体ではなくて、ＶＬＡ４に対する天然の結合蛋白質の可溶性形態であってよい。これらの結合剤は、可溶性ＶＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１ペプチド又はＶＣＡＭ−１融合蛋白質並びにフィブロネクチン、別のスプライシングを受けた非III型結合セグメントを有するフィブロネクチン及びアミノ酸配列ＥＩＬＤＶ若しくは類似の保存的に置換されたアミノ酸配列を含むフィブロネクチンペプチドを含む。これらの結合剤は、ＶＬＡ４に対する細胞表面結合蛋白質と競争することによって作用する。この発明の第１の面によるこの方法において、ＶＬＡ４結合剤は、好ましくは、非経口的に投与する。これらのＶＬＡ４結合剤は、好ましくは、製薬上許容し得るキャリアーを含む無菌の製薬組成物として投与する（該キャリアーは、多くの周知のキャリアー例えば水、塩類溶液、リン酸緩衝塩溶液、デキストロース、グリセロール、エタノール等、又はこれらの組合せの何れであってもよい）。好ましくは、ＶＬＡ４結合剤は、抗体若しくは抗体誘導体であるならば、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲、好ましくは、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲の投与量及び各１〜１４日の間隔で投与する。抗体若しくは抗体誘導体でない結合剤については、投与量範囲は、好ましくは、これらの抗体量に対するモル当量の範囲である。好ましくは、抗体組成物を少なくとも１μｇ／ｍｌの血漿レベルの抗体を与えるのに有効な量で投与する。投与量の最適化は、結合剤の投与及び、その後の、所定投与量をイン・ビボ投与した後の長期間にわたる薬剤によるＶＬＡ４陽性細胞の被覆の評価によって決定することが出来る。個体の末梢血液試料に含まれる末梢血液単核細胞は、この薬剤の存在について、イン・ビトロ（又はex vivo）で、投与した薬剤を検出するための第２の試薬を用いてプローブ検出されるはずである。例えば、これは、投与した薬剤に特異的な蛍光色素標識した抗体であってよく、次いで、それを標準的ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）分析により測定する。或は、投与した薬剤の存在は、個体の細胞の標識（例えば、蛍光色素標識）した同じ薬剤に対する結合不能又は結合能力の減少によって、イン・ビトロ（又はex vivo）で検出することが出来る。好適な投与量は、大多数のＶＬＡ４陽性細胞の検出可能な被覆を被覆を生成するはずである。好ましくは、被覆は、モノクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体誘導体の場合には、１〜１４日間にわたって維持される。この発明の実施において、ＶＬＡ４結合剤での治療は、好ましくは、上記のような多くの公知のマーカーにより反映されるような前糖尿病患者が安定な血糖正常の血漿レベル及び安定な前糖尿病状態を維持する限り継続する。後述の実施例において、抗ＶＬＡ４ｍＡｂ例えばＲ１−２ｍＡｂの投与は、治療中の糖尿病の発症を阻止し且つ治療の残留の有益な結果がＲ１−２治療を停止した後２か月間に及ぶということが見出された。しかしながら、糖尿病発症に対するＶＬＡ４結合剤の完全な防御効果を維持するためには、これらの結合剤での連続的治療が好ましい。本発明の方法は、前糖尿病の個体に抗ＶＬＡ４抗体を含む組成物を投与することを含む。後述の実施例は、ゲッ歯動物病気モデルにおいて観察された結果を示す。これらの結果は、この病気の急性伝達モデルにおける病気の発症における抗ＶＬＡ４抗体の防御効果を示している。非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスは、Ma kino等、1980［7］により導入されて以来、Ｉ型即ちインシュリン依存型糖尿病の重要なモデルとなっており、ヒトの糖尿病と特に関連するモデルとして記載された（例えば、Castano及びEisenbarth [1]，Miller等、1988 [5] ，Hutchings等、1990［33］及び本明細書中で引用している文献を参照されたい）。ＮＯＤマウス及びヒトにおいて示された糖尿病の症状が類似していることが、幾つかの系統の証拠によって示された。例えば、ＮＯＤマウス及びヒトの両者において［1］、糖尿病と主要組織適合性複合体の遺伝子座とは強い遺伝的関係がある。更に、例えば、両種において、自己免疫病因論は、（i）β細胞の選択的破壊を媒介する膵臓の島におけるリンパ球性炎症（即ち、インシュリン炎）の存在、（ii）抗島細胞抗体の存在、及び（iii）シクロスポリンＡの調節効果によって明示されている。糖尿病の自己免疫病因論についてのＮＯＤマウスにおける更なる証拠は、（i）糖尿病ドナーからの脾臓細胞（精製脾臓Ｔ細胞を含む）を用いて糖尿病を伝達する能力、（ii）Ｔ細胞に対して特異的な抗体を用いるイン・ビボ治療による糖尿病の阻止、及び（iii）ＮＯＤ遺伝的バックグラウンドを有する胸腺ヌードマウスでは糖尿病を発達させることが出来ないことである（例えば、Miller等、1988 [5]，Hutchings等、1990［33］及び本明細書中で引用されている文献を参照されたい）。糖尿病を生じる正確な事象は不明なままであるが、ＮＯＤマウスにおいては、膵臓の進行性炎症応答が、脈管周囲の単核細胞浸潤として３〜４週齢で始まる最初の組織的病変であるらしい。約４〜６週齢において、インシュリン炎が観察され得、約１２週齢での明白な糖尿病の開始（即ち、糖尿のアッセイ用のTestape（インジアナ、Indianapolis在、El i Lilly）を用いて首尾一貫した１＋以上の値、又は、血漿グルコースをモニターした際に２５０ｍｇ／ｄＬを超える値）が起きる。動物の免疫状態の変動を避けるために、ＮＯＤマウスを病原体を有しない特別の集団から得、それらは、安定な、高発病率の糖尿病を、雌の約８０％及び雄の約２０％で示す（典型的には、約２０週齢で糖尿病になる）。ここに記載した実験で用いるＮＯＤマウスの好ましい供給源は、Taconic Farms（ニューヨーク、Germantown在）である。特にＢＢラット及びＮＯＤマウスの研究からの多くのデータは、Ｉ型糖尿病がＴ細胞媒介の病気であることを示した。今日までの証拠は、両主要Ｔ細胞サブポピュレーション（ＣＤ４／Ｌ３Ｔ４及びＣＤ８／Ｌｙ２）の、ヒト及びＮＯＤマウスにおける糖尿病の発達における重要な役割を示唆している。糖尿病におけるＴ細胞の本質的役割を支持するデータは、Ｔリンパ球が他の細胞（例えば、マクロファージ）をβ細胞破壊に対する最終的エフェクターとして補充するという可能性を排除しない。マクロファージは、浸潤された島に存在していること及び長期のシリカ治療の病気を阻止する能力に基づいて病気過程に関係付けられている（例えば、Hu tchings等、 1990［33］及び本明細書中で引用されている文献を参照されたい）。ＮＯＤ系統のマウスを用いて、研究者は、自発的な病気モデルに匹敵する病気の急性伝達モデルを開発したが、該モデルにおいては、糖尿病誘発性ＮＯＤマウスから誘導した伝達された細胞が病気過程を媒介し、それは、インシュリン炎及び島β細胞特異的な破壊を媒介する免疫反応性細胞により特徴付けられる。更に、このモデルにおいて、Ｔ細胞に対するある種のモノクローナル抗体（例えば、 Miller等、1988［5］参照）及びマクロファージ（例えば、Hutchings等、1990［ 33］参照）は、病気の発症を排除することが示された。かかるモノクローナル抗体は、自発的病気及び養子免疫伝達された病気の治療に利用された。例えば、抗ＣＤ４抗体は、両モデルにおいて病気を排除することが示された（Miller等、19 88[5]及びShizuru等、1988[30]）。養子免疫伝達モデル又は自発的病気モデルにおける治療結果は、ヒトの病気過程を調節する薬剤の能力を暗示する。実施例１病気の養子免疫伝達に対する抗ＶＬＡ４抗体処理の効果糖尿病実験の養子免疫伝達のために、ＮＯＤマウスをTaconic Farms（ニューヨーク、Germantown）又はJoslinDiabetes Center（マサチューセッツ、Boston）から入手した。最近発症した自発性糖尿病（Ｄ）の雌（１３〜２０週齢）を脾臓細胞ドナーとして用い、８週齢の糖尿病でない（Ｙ）雌をレシピエントとして供した。病気を伝達し得ない４週齢の糖尿病でない（Ｙ）雌ドナーからの脾臓細胞を負の対照として用いた。高線量照射（Gamma Cell 1000 Cesium¹³⁷線源、カナダ国、Ontario在、Nordio n International，Inc．）後の腸内感染の発病率を最小にするために、レシピエントマウスを１週間酸性水（濃ＨＣｌを水で１：８４００に稀釈したもの）中に置いてから準致死的照射（７７５ラド）を分割線量（３００ラド、３００ラド及び１７５ラド）にて３日間（−２日、−１日及び伝達の日）で行なった。脾臓を糖尿病のドナー及び糖尿病でない対照から採取し、細胞懸濁液を作成し、Hemoly tic Geys溶液を用いて赤血球を溶解させた。脾臓細胞を、７５μｇのＲ１−２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、７５μｇのラットＩｇＧ２ｂで予備処理し又はしないで静脈注射した（０．２ｍｌＰＢＳ中２〜３×１０⁷）。抗体処理のために、細胞を単に３７５μｇ／ｍｌのｍＡｂと懸濁して１〜１．５×１０⁸細胞／ｍｌとし、注射まで氷上に置いた。注射のタイミングは、最後の照射の後３時間以内であった。何匹かのレシピエントは、ＰＢＳだけを受けた。抗ＶＬＡ４ｍＡｂＲ１−２及びイソタイプ適合のラットＩｇＧ２ｂをPharmingen（カリフォルニア、La Jo lla在）から購入した。Ｒ１−２（ラット抗マウス）抗ＶＬＡ４ｍＡｂは、最初、Holzmann等、1989［53］により記載された。Ｒ１−２抗ＶＬＡ４ｍＡｂは、ＶＬＡ４のそのリガンドへの結合をブロックし（Hession等、1992[54]）、それ故、定義によりＢグループに属する（P ulido等、1991[44]）即ち、Ｂグループの抗ヒトＶＬＡ４ｍＡｂ（例えば、ＨＰ１／２又はＨＰ２／１）と同等である。Ｒ１−２ｍＡｂ又はラットＩｇＧ２ｂを、２〜３日毎に、７５μｇ／０．２ｍｌの投与量で腹腔内投与した。投与用管理（regimen）は、末梢血液、リンパ様器官及び骨髄においてＶＬＡ４陽性細胞の最大被覆（末梢血液細胞及びこれらの器官から調製した単一細胞懸濁のＲ１−２ｍＡｂに特異的な蛍光色素標識したｍＡｂでの染色及び蛍光色素陽性細胞を測定するＦＡＣＳ分析により検出）を維持するように決めた。注射を、伝達の後、１２日又は２４日間続けた。マウスを、 TesTape（インディアナ、Indianapolis在、Eli Lilly）を用いて糖尿について試験することにより及び血漿グルコースレベル（Glucometer，3 Blood Glucose Meter，インディアナ、Elkhart在、Miles，Inc．）により糖尿病についてモニターし、２回連続尿試験陽性［Testape値［＋１］以上］又は血漿グルコースレベル＞２５０ｍｇ／ｄＬの後で糖尿病と見なした。ＮＯＤ糖尿病ドナーから単離した脾臓細胞を飽和量の抗ＶＬＡ４ｍＡｂＲ１− ２で処理し、その後、上記のように、糖尿病でない照射した宿主に移植し、次いで、末梢血液及びリンパ様器官中のすべてのＶＬＡ４陽性細胞の最大被覆を２週間維持するために、Ｒ１−２ｍＡｂを１２日間毎日投与した場合に、抗ＶＬＡ４ｍＡｂの糖尿病発症に対する予防効果が示された。図１は、糖尿病になったレシピエントの頻度及びＮＯＤドナー（Ｄ→Ｙ）からの２×１０⁷の脾臓細胞を、（i）処理なし（塗りつぶした丸）で；（ii）ラットＩｇＧ２ｂ処理して（塗りつぶした三角形）及び（iii）Ｒ１−２抗ＶＬＡ４処理（塗りつぶした菱形）して移植した場合、並びに糖尿病でないＮＯＤドナー（Ｙ→Ｙ）からの脾臓細胞（塗りつぶしてない正方形）の移植後の病気発症までの日数を示している。ＰＢＳだけの注射は、０％の発病率を与えた。これらの条件下で、８匹のＲ１−２ｍＡｂ処理した各レシピエントの内、１匹だけが移植後２９日に糖尿病を発症した。対照してみると、ｍＡｂで処理しなかった又は非特異的なラットＩｇＧ２ｂで処理した糖尿病ドナーからの脾臓細胞を受けた個体は、それぞれ、６／１０及び５／９が糖尿病になった。図１に示したように、無関係のラットＩｇＧ２ｂの移植は発症を幾らか遅らせはしたが、移植後１４日という早さで糖尿病の発症が起きた。これらのデータは、Ｒ１−２ｍＡｂのＶＬＡ４に対する特異性に依存した防護効果を示している。糖尿病でないマウスからの脾臓細胞又はＰＢＳのみのレシピエントは糖尿病にならなかった。従って、抗ＶＬＡ４抗体での処理は、移植後３０日間における糖尿病の頻度を減少させた。図１に示した結果は臨床的糖尿病が抗ＶＬＡ４処理した動物８匹中１匹にのみ生じたことを示しているが、抗ＶＬＡ４抗体が単に糖尿病の発症を少し遅らせたに過ぎないということはあり得た。如何なる血糖レベルの増加をも定量しそれにより臨床的糖尿病への進行を検出するために、血漿グルコースレベルを尿中グルコースと並行して監視した。図１に示した抗ＶＬＡ４抗体処理したグループの内、すべてのマウスは、２９日目において未だ平均血漿グルコース値１００±７ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝７）を有して血糖正常であった（但し、１個体は、尿試験及び５００ｍｇ／ｄＬを超える血漿グルコースにより臨床的糖尿病として評点された）。従って、病気の進行は、移植後２９日、最後の抗ＶＬＡ４抗体注射の丸２週間後にて図１に示した他の抗ＶＬＡ４抗体処理したレシピエントの何れにおいても明らかではなかった。これらのマウスからの血清の分析は、抗ＶＬＡ４ｍＡｂが移植後１８〜２１日までに低レベル又は検出不能なレベルにまで低下することを確実にした。抗ＶＬＡ４ｍＡｂが糖尿病の移植に対して防護となることを確認するために更なる細胞移植を行なった。これらの実験において、抗ＶＬＡ４抗体処理を、移植後２５日まで延長したが、３．５日毎に投与しそれによりＲ１−２ｍＡｂ又はラットＩｇＧ２ｂの飽和レベルを膵臓組織を取るためにマウスを殺す２６日目まで維持した。これらの条件下で、糖尿病の発症に対する抗ＶＬＡ４ｍＡｂの阻止効果は又、脾臓細胞移植及びＲ１−２処理に対しても示された。図２は、糖尿病になったレシピエント（各グループについてｎ＝４〜５）の頻度及び糖尿病ＮＯＤドナー（Ｄ→ Ｙ）からの３×１０⁷の脾臓細胞を（i）処理しないで（塗りつぶした丸）、（ii ）ＩｇＧ２ｂ処理（塗りつぶした三角形）して及びＲ１−２抗ＶＬＡ４処理（塗りつぶした菱形）して移植した場合、並びに糖尿病でないＮＯＤドナー（塗りつぶしてない正方形）からの脾臓細胞の移植後の病気の発症までの日数を示している。ＰＢＳだけの注射は、０％の発病率を与えた。図２は、５匹のＲ１−２ｍＡｂ処理したマウスの内の１匹だけが移植後２２日までに糖尿病になったが、Ｒ１ −２ｍＡｂ処理しなかったレシピエントの４／４及びラットＩｇＧ２ｂで処理したレシピエントの５／５において糖尿病が伝達された。病気の発症は、移植後１３日の早さで起きた。これらの実験は、個別に及び集合的に、抗ＶＬＡ４ｍＡｂが再現性をもって急性伝達病気モデルにおける糖尿病の発達に対する防護を与えることを示している。更なる実験を行なって、抗ＶＬＡ４ｍＡｂが単に処理期間中病気の発症を遅らせただけなのか或は長期の防護効果を達成し得るのかを決定した。図３は、Ｒ１ −２注射（３．５日毎に２５日まで）後の長期にわたるマウスの糖尿病の発症を示しているが、移植後３５日及び３８日（最後のＲ１−２注射後１０〜１３日）に２／５のマウスが糖尿病になっただけである。対照してみると、未処理及びＩｇＧ２ｂ処理したグループにおいては、移植後１１日の早さで、１８〜２１日目までに１００％の発病率で糖尿病が起きた。驚くべきことに、Ｒ１−２処理したグループにおける発病率は、最後のＲ１−２注射の後２か月の長期間においてさえ増加しなかった。この期間中並行して監視した血漿グルコース値は、これらの３匹の個体が一貫して血糖正常であったことを示している。この時点（即ち、移植後約３か月）の後は、ＰＢＳのみ又は糖尿病でない細胞を受けた負の対照グループでさえ自発的な病気の発達が始まる。要約すると、ＶＬＡ４特異的ｍＡｂは、糖尿病伝達の発病率を減少させる。更に、病気に対するその防護効果は、更なるｍＡｂ処理がなくても維持される。実施例２膵臓インシュリン炎に対する抗ＶＬＡ４ｍＡｂの効果組織学的分析のために、この実施例では、上記のように移植後２〜４週にてマウスを殺して、１０％ホルマリン緩衝塩溶液中で膵臓を採取してパラフィン包埋切片用とし、該切片を、組織学用にヘマトキシリン及びエオシン（H&E）で染色した。インシュリン炎の程度を次のように評点した：等級０：インシュリン炎なし［全く炎症のない島］；等級Ｉ：周囲インシュリン炎［島の周辺に位置する炎症性単核細胞］；等級II：２５％未満の浸潤［２５％の島内部がリンパ球性炎症性細胞を含む］；等級III：２５〜５０％の浸潤［リンパ球性の浸潤］；等級IV：５０％を超える浸潤。次いで、各等級の島の試験した島の総数に対する相対的パーセントを計算した。組織学的切片を試験して、抗ＶＬＡ４ｍＡｂ処理を伴う又は伴わないＮＯＤ脾臓細胞の養子免疫伝達後のインシュリン炎の程度を評点して結果を表にした。特に、浸潤されてない島（等級０〜Ｉの浸潤）及び等級II〜IVのインシュリン炎（上記の通り）を有する島を計量した。各実験グループについて、ｎ＝４〜５のマウスからの膵臓切片を評点した。様々な期間にわたって抗ＶＬＡ４ｍＡｂで処理したレシピエントから、島特異的な細胞性浸潤の確立に対するその効果の問題を扱うために、膵臓組織を回収した。マウスを非特異的なラットＩｇＧ２ｂ又はＲ１−２ｍＡｂで３．５日毎に、殺した１４日目まで処理した。同様に、マウスを２５日目まで処理して、糖尿病と診断されるか又は移植の２６日後に殺した。移植後１４日間にわたってＲ１− ２ｍＡｂで連続的に処理したマウスは、高頻度（７６％）の未浸潤の島を維持し、等級II〜IVのインシュリン炎に進行したのは２４％だけであった。対照してみると、非特異的なラットＩｇＧ２ｂで処理したものは、７４％の重症のインシュリン炎を有して、逆のパターンを示している。同様に、２５日目までＲ１−２で処理したマウス（２０％糖尿病、図２で示したマウスから単離した膵臓）において、図４に示したように、若いＮＯＤ脾臓細胞の糖尿病でないレシピエントにおける頻度（５５％）と類似して、高頻度（５８％）の未浸潤の島が保存された。対照してみると、未処理の又はＩｇＧ２ｂ処理したマウスの両者は、２８％の未浸潤の島を有するだけであり、逆に、増加したインシュリン炎（７２％）を有した。従って、抗ＶＬＡ４ｍＡｂ処理は、糖尿病誘発性脾臓細胞の養子免疫伝達によるインシュリン炎の発達を特異的に阻止し、或は遅延させるらしい。これらの選択肢を区別するために、移植の４週間後のインシュリン炎パターンを、マウスをラットＩｇＧ２ｂ又はＲ１−２ｍＡｂで１２日目まで処理し、その後は更なる処理をしないで維持した場合について測定した。糖尿病が診断されるか又は移植後２９日目にマウスを殺した。これらのマウスからの血清の分析は、循環抗ＶＬＡ４ｍＡｂが移植後１８〜２１日までに検出不能なレベルまで低下することを確実にした。このプロトコールを用いて、Ｒ１−２処理したグループのインシュリン炎の程度（６９％インシュリン炎、２５％糖尿病）は、図５に示したように、ラットＩｇＧ２ｂ処理したマウスのそれ（９６％インシュリン炎、７５％糖尿病）よりは低いが、未処理のレシピエントのそれ（７３％インシュリン炎、６０％糖尿病）と類似していた。有意に、インシュリン炎の激烈さは、Ｒ１ −２処理、未処理及びラットＩｇＧ２ｂ処理したグループ間で類似しており、それぞれ、平均５７％、４７％、６４％の等級III／IVの浸潤を有した。糖尿病でないＲ１−２処理した個体だけを考えても、やはりそれらは、５２％の等級III／IV浸潤を伴う５９％のインシュリン炎を示した。糖尿病誘発性でないＮＯＤ脾臓細胞のレシピエントは、７％の等級III／IV浸潤を有しただけであった。逆に、図５は、塩溶液又は非糖尿病誘発性脾臓細胞のレシピエントと比較して、浸潤されてない島の頻度がＲ１− ２処理したマウスにおいて減少したことを示している。従って、インシュリン炎の程度は、Ｒ１−２処理を維持したマウス（図４）に比較して、これらのＲ１− ２処理したマウスにおいて進行して（図５）、未処理又はラットＩｇＧ２ｂ処理した対照グループのそれに近づいた。ひとまとめにして考えると、これらのデータは、抗ＶＬＡ４ｍＡｂ投与が病気の急性伝達モデルにおいてインシュリン炎の進行を遅延させることが出来ることを示している。実施例３糖尿病の養子免疫伝達に対する種々の抗ＶＬＡ４抗体処理の比較この実施例は、実施例１に記載の養子免疫伝達モデル及び手順を用いて、ＰＳ／２、抗ＶＬＡ４抗体とＲ１−２の比較用の効果の結果を提供する。ＮＯＤマウスを（ａ）無関係の対照用抗体（Ｄ／ラットＩｇＧ２ｂ、ｎ＝１９マウス）；（ｂ）Ｒ１−２抗体（Ｄ／Ｒ１−２ｍＡｂ、ｎ＝２４マウス）；（ｃ）ＰＳ／２ｍＡｂ（Ｄ／ＰＳ／２ｍＡｂ、ｎ＝５マウス）で処理し、又は（ｄ）処理しなかった（ＮＯＮＥ、ｎ＝２６マウス）。脾臓細胞を静脈注射し（０．２ｍｌのＰＢＳ中の２〜３×１０⁷）、７５μｇのＲ１−２ｍＡｂ、７５ μｇのＰＳ／２ｍＡｂ、７５μｇのラットＩｇＧ２ｂの何れかで予備処理し又は処理しなかった。ＰＳ／２抗ＶＬＡ４ｍＡｂの単離精製は、最初に、Miyake等、 1991［55］により記載された。Ｒ１−２ｍＡｂ、ＰＳ／２ｍＡｂ又はラットＩｇＧ２ｂを、７５μｇ／０．２ｍｌの投与量で２〜３日毎に腹腔内投与した。投与用管理は、末梢血液、リンパ様器官及び骨髄においてＶＬＡ４陽性細胞の最大被覆（末梢血液細胞及びこれらの器官から調製した単一細胞懸濁のＲ１−２及びＰＳ／２ｍＡｂに特異的な蛍光色素標識したｍＡｂでの染色及び蛍光色素陽性細胞を測定するＦＡＣＳ分析により検出）を維持するように決めた。注射を、伝達の後、２２〜２５日間続けた。マウスを、TesTape（インディアナ、Indianapolis在、Eli Lilly）を用いて糖尿について試験することにより及び血漿グルコースレベル（Glucometer，3 Blood Glucos e Meter，インディアナ、Elkhart在、Miles，Inc．）により糖尿病についてモニターし、２回連続尿試験陽性［Testape値［＋１］以上］又は血漿グルコースレベル＞２５０ｍｇ／ｄＬの後で糖尿病と見なした。ＮＯＤ糖尿病ドナーから単離した脾臓細胞を飽和量の抗ＶＬＡ４ｍＡｂＲ１− ２又はＰＳ／２で処理し、その後、上記のように、糖尿病でない照射した宿主に伝達し、次いで、末梢血液及びリンパ様器官中のすべてのＶＬＡ４陽性細胞の最大被覆を約２週間維持するために、Ｒ１−２ｍＡｂ又はＰＳ／２を２２〜２５日間毎日投与した場合に、抗ＶＬＡ４ｍＡｂの糖尿病発症に対する予防効果が示された。表１は、糖尿病になったレシピエントの頻度及びＮＯＤドナーからの脾臓細胞を、（i）処理なし（Ｄ）で；（ii）ラットＩｇＧ２ｂ処理して（Ｄ／非特異的なラットＩｇＧ２ｂ）；（iii）Ｒ１−２抗ＶＬＡ４処理（Ｄ／Ｒ１−２ｍＡｂ）して；（iv）ＰＳ／２処理（Ｄ／ＰＳ／２ｍＡｂ）して移植した場合、並びに糖尿病でないＮＯＤドナーからの脾臓細胞（ｎｏｎ−Ｄ）の移植後の病気発症までの日数を示している。ＰＢＳを受けて脾臓細胞を受けてない糖尿病でないマウスを対照として含めた。ＰＢＳだけの注射は、４％の発病率を与えた。これらの条件下で、２４匹のＲ１−２ｍＡｂ処理した各レシピエントの内、１匹だけが移植後２２日に糖尿病を発症し、他方、５匹のＰＳ／２ｍＡｂ処理したレシピエントは何れも糖尿病にならなかった。対照してみると、ｍＡｂで処理しなかった又は非特異的なラットＩｇＧ２ｂで処理した糖尿病ドナーからの脾臓細胞を受けた個体は、１６／１９が糖尿病になった。表１に示したように、無関係のラットＩｇＧ２ｂの移植は発症を１日だけ遅らせはしたが、移植後１４日という早さで糖尿病の発症が起きた。これらのデータは、Ｒ１−２ｍＡｂ及びＰＳ／２のＶＬＡ４に対する特異性に依存した防護効果を示している。糖尿病でないマウスからの脾臓細胞又はＰＢＳのみのレシピエントは糖尿病にならなかった。従って、抗ＶＬＡ４抗体での処理は、移植後３０日間における糖尿病の頻度を減少させた。これらのマウスからの血清の分析は、Ｒ１−２及びＰＳ／２抗ＶＬＡ４ｍＡｂのレベルが移植後２６〜３４日で検出不能になることを確実にした。実施例４自発的糖尿病モデルに対する抗ＶＬＡ４抗体処理の効果この実施例には、ＮＯＤマウスを用いた自発的糖尿病モデルにおけるＲ１−２ｍＡｂを用いた効果の結果を記載した。ＮＯＤマウスを８週間にわたって（ａ）無関係の対照用抗体（ＮＯＤ／ラットＩｇＧ２ｂ、ｎ＝１０マウス）；（ｂ）Ｒ１−２抗体（ＮＯＤ／Ｒ１−２、ｎ＝２０マウス）で処理し；又は（ｃ）は処理しなかった（ＮＯＤ、ｎ＝１０マウス）（４週齢で始めて１２週齢まで行なった）。ｍＡｂを０．２ｍｌＰＢＳ中の７５μｇの投与量にて、週２回静脈投与した。マウスを、前記のように、糖尿用のTesTapeによって、糖尿病事象について監視した。図６は、２つの対照用グループと比較して、Ｒ１−２投与後に糖尿病発症の顕著な遅延（１２〜１６週間の遅延）を示している。無関係なＩｇＧ２ｂｍＡｂを受けたか又は処理を受けてないＮＯＤマウスは、１３週の早さで糖尿病が発達した。これらの自発的病気モデルの結果は、図１に説明したＲ１−２を伴う養子免疫伝達の結果と同様であり、抗ＶＬＡ４抗体が糖尿病の発症に対する防護となることを直接的に示している。実施例５糖尿病の養子免疫伝達に対するＶＣＡＭ−Ｉｇ融合蛋白質の効果実施例１に記載した養子免疫伝達実験を、抗ＶＬＡ４ｍＡｂの代わりにＶＣＡＭ−Ｉｇ融合蛋白質（ＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧ）を用いて繰り返した。ＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧは、ＶＬＡ４に対するリガンド（ＶＣＡＭ１）の可溶性形態であって、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域配列（ヒンジ、Ｃ_H２及びＣ_H３）に融合したＶＣＡＭ１の２つのＮ末端ドメインからなる。ＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧＤＮＡ配列及びその翻訳アミノ酸配列をSEQ ID NO:９に示す。図８は、融合蛋白質構造を説明するものである。この融合蛋白質を、下記の組換え技術によって構築した。ヒトＩｇＧ重鎖領域のｃＤＮＡの単離とプラスミッドｐＳＡＢ１４４の構築ヒトＩｇＧ１重鎖領域のｃＤＮＡコピーを単離するために、プラスミッドＶＣＡＭ１−ＩｇＧ１（ｐＳＡＢ１３３としても知られる）によって一時的にトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞からＲＮＡを調製した。プラスミッドＶＣＡＭ１− ＩｇＧ１の構築は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／１３３００に記載されている。このＲＮＡを、逆転写酵素及びランダムヘキサマー（プライマーとして）を用いて逆転写してｃＤＮＡを生成した。４２℃で３０分経過後、逆転写反応を、反応物を９５℃で５分間のインキュベーションにより停止させた。次いで、このｃＤＮＡを、次のキナーゼ処理したプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、例えば、Sambrook等、Molecular Cloning，Vol.3，pp.14.1-14.35(Cold Spring Harbor；1989）を参照）により増幅した：３７０−３１（SEQ ID NO:１０）：これは、ＳａｌＩ部位を含む、及び３７０−３２（SEQ ID NO:１１）：これは、ＩｇＧ１重鎖定常領域のカルボキシ末端リジンをコードし、ＮｏｔＩ部位が続く。ＰＣＲ増幅したｃＤＮＡを、プラスミッドｐＮＮＯ３でのクローン化のためにアガロースゲル電気泳動及びガラスビーズ溶出により精製した。プラスミッドｐＮＮＯ３を、市販のプラスミッドｐＵＣ８（ニュージャージー、Piscataway在、Pharmaci a）から、制限エンドヌクレアーゼ消化によって合成ポリリンカー配列を除去し、下記の新規な配列（SEQ ID NO:１２）を有する合成ポリリンカー配列により置換することによって構築した：精製したＰＣＲ増幅したｃＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＶで開裂して脱リン酸化したｐＮＮＯ３にライゲートし、低融点アガロースゲル電気泳動により精製した。ライゲーション反応を用いて大腸菌ＪＡ２２１をトランスフォームし、生じたコロニーを、約７００ｂｐの挿入物を含むプラスミッドについてスクリーニングした。正しい挿入物の同一性をＤＮＡ配列分析により確認し、このプラスミッドをｐＳＡＢ１４４と呼んだ。プラスミッドｐＳＡＢ１４２の構築プラスミッドｐＳＡＢ１４２を次のようにして構築した。ｐＳＡＢ１３３でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞から（前節に記載のようにして）調製したｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチド３７０−０１及び３７０−２９を用いるＰＣＲ増幅にかけた。オリゴヌクレオチド３７０−０１は、ＮｏｔＩ部位及びＶＣＡＭ−１シグナル配列のアミノ酸１〜７に対応するヌクレオチド（SEQ ID NO:１３）を含む：オリゴヌクレオチド３７０−２９は、ＶＣＡＭ−１アミノ酸２１４〜２１９に対応し且つＳａｌＩ部位（SEQ ID NO:１４）を含む：増幅したＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＶにより開裂したｐＮＮＯ３のベクター断片にライゲートした。ｐＳＡＢ１３２の構築ｐＪＯＤ−Ｓ（Barsoum，J.，DNA and Cell Biol.，9，pp.293-300(1990)）を、アデノウイルス主要後期プロモーターからのユニークなＮｏｔＩ部位下流を挿入するように改変し、ＮｏｔＩ断片が発現ベクター中に挿入され得るようにした。ｐＪＯＤ−Ｓを、プラスミッドＤＮＡのＮｏｔＩ開裂によって線状化した。突き出ている５’末端を、ヤエナリ（Mung Bean）ヌクレアーゼを用いて鈍端化し、この線状化ＤＮＡ断片を低融点アガロースゲル電気泳動により精製した。ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて再結合した。このライゲートした分子を、次いで、大腸菌ＪＡ２２１中にトランスフォームした。コロニーをＮｏｔＩ部位の不在についてスクリーニングした。その結果のベクターをｐＪＯＤ−ＳデルタＮｏｔＩと呼んだ。ｐＪＯＤ−８デルタＮｏｔＩを、ＳａｌＩを用いて線状化し、５’末端を仔ウシアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した。線状化ＤＮＡ断片を低融点アガロースゲル電気泳動により精製し、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＣＥ１７５の存在にてライゲートした。該オリゴヌクレオチドは、次の配列（SEQ ID NO:１５）を有する：ライゲーション混合物を大腸菌ＪＡ２２１中にトランスフォームし、コロニーをＮｏｔＩ部位を有するプラスミッドの存在についてスクリーニングした。所望のプラスミッドをｐＭＤＲ９０１と命名した。ＤＨＦＲｃＤＮＡ、ｐＭＤＲ９０１及びｐＪＯＤΔｅ−ｔＰＡ（Barsoum，DNA and Cell Biol. ，9,pp.239-300(1990)）の転写を制御するＳＶ４０プロモーター中の２つのＳＶ４０エンハンサー反復を削除するために、両者をＡａｔＩＩ及びＤｒａＩＩＩで開裂した。ｐＭＤＲ９０１からの２５７８ｂｐのＡａｔＩＩ−ＤｒａＩＩＩ断片及びｐＪＯＤΔｅ−ｔＰＡからの５４２４ｂｐのＡａｔＩＩ−ＤｒａＩＩＩ断片を、低融点アガロースゲル電気泳動により単離して、１つにライゲートした。大腸菌ＪＡ２２１へのトランスフォーメーションの後に、生成したプラスミッドｐＭＤＲ９０２を単離した。次いで、ｐＳＡＢ１３２を、アデノウイルス主要後期プロモーターを含むｐＭＤＲ９０２のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片を除去し、それを、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター及びエンハンサーを含むプラスミッドｐＣＭＶ−Ｂ（カリフォルニア、Palo Alto在、Clontech）からの８３９ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片で置換することによって形成した。ｐＳＡＢ１４６の構築ｐＳＡＢ１４４をＳａｌＩ及びＮｏｔＩで開裂し、６９３ｂｐ断片を単離した。ｐＳＡＢ１４２をＮｏｔＩ及びＳａｌＩで開裂させて６６４ｂｐ断片を単離した。これらの２つの断片を、ＮｏｔＩで開裂し且つ仔牛アルカリホスファターゼにより脱リン酸化したｐＳＡＢ１３２にライゲートした。その結果生成したプラスミッドｐＳＡＢ１４６は、ＶＣＡＭ−１シグナル配列、成熟ＶＣＡＭ−１のアミノ末端の２１９アミノ酸、ＩｇＧ１のヒンジ領域の１０アミノ酸並びにＩｇＧ１のＣ_H２及びＣ_H３定常ドメインをコードするＤＮＡ配列を含んだ。安定にトランスフォームしたＣＨＯ細胞系統からのＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧの産生組換えＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧ発現ベクターを下記のようにして構築し、ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトしてＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧを連続的に分泌する細胞系統を生成した。ｐＳＡＢ１４６のＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧコード配列を含む１．３５７ｋｂのＮｏｔＩ断片を、アガロースゲル電気泳動によって精製した。この断片を、発現ベクターｐＭＤＲ９０１のＮｏｔＩクローニング部位にライゲートした（該ベクターは、異種遺伝子発現のためのアデノウイルス２主要後期プロモーター及び選択可能で増幅可能なジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）マーカーを利用する）。このライゲートしたＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５をトランスフォームした。所望の正しい向きの挿入物を有するプラスミッドを含むコロニーを、ＨｉｎｄＩＩＩでの消化における５８５３及び３７３４ｂｐ断片の存在、及びＢｇｌＩＩでの消化における４３０１、２５５５、２２９３及び４３８ｂｐ断片の存在により同定した。その結果生成した組換えＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧ発現ベクターをｐＥＡＧ１００と呼んだ。この正しい挿入物の同一性をＤＮＡ配列分析により確認した。組換え発現プラスミッドｐＥＡＧ１００をJ.Barsoumの公表されたプロトコール（DNA Cell Biol 9:293-300, 1990）に従って、dhfr−欠乏ＣＨＯ細胞中に電気穿孔法で導入した（但し、２００μｇのＰｖｕＩ線状化ｐＥＡＧ１００プラスミッド及び２００μｇの超音波処理したサケ精子ＤＮＡをこの電気穿孔法プロトコールにおいて用いた）。更に、細胞を、２００ｎＭメトトレキセートを補ったアルファ完全培地にて選択した。分泌されたＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧの発現レベルを測定するために、クローンを平底の９６ウェルミクロ滴定プレートに移して、集密になるまで生育させ、下記のようにＥＬＩＳＡによりアッセイした。 Immulon 2 プレート（バージニア、Chantilly在、Dynatech）の各ウェルを、１００ μｌの抗ＶＣＡＭ４Ｂ９ＭＡｂ（０．０５Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で１０μｇ／ｍｌに稀釈したもの）を用いて抗ＶＣＡＭＭＡｂ４Ｂ９（Carlos等、1990［56］により記載されたようにしてプロテインＡセファロース上で単離精製したもの）で被覆し、パラフィルムでカバーして４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートの中身を落として、２μのフィルターを通して濾過した２００μｌ／ウェルのブロック用緩衝液（１×ＰＢＳ中の５％ウシ胎児血清）でブロックした。室温で１時間のインキュベーションの後に緩衝液を除去し、プレートを１×ＰＢＳ中の０．０５％Tween-20溶液で２回洗った。調整培地を種々の稀釈にて加えた。陽性対照として、抗マウスＩｇも又含めた。ブロック用緩衝液及びＬＦＡ− ３ＴＩＰは、陰性対照を構成した。試料及び対照を室温で２時間インキュベートした。次いで、これらのプレートを１×ＰＢＳ中の０．０５％Tween-20溶液で２回洗った。次いで、陽性対照のウェルを除いて、各ウェルを５０μｌのブロック用緩衝液中の１：２０００稀釈のＨＲＰ−ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ペンシルベニア、W est Grove在、Jackson Immune Research Laboratories）で満たした。陽性対照のウェルは、５０μｌのブロック用緩衝液中の１：２０００稀釈のＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ペンシルベニア、West Grove在、Jackson Immune Research Laboratories）を満たした。次いで、これらのプレートを１時間室温でインキュベートした。ＨＲＰ結合Ａｂ溶液を除去して、これらのウェルを１×ＰＢＳ中の０．０５％ Tween-20溶液で２回洗った。次いで、１００μｌのＨＲＰ基質緩衝液を各ウェルに室温で加えた。ＨＲＰ基質緩衝液を次のように調製した：０．５ｍｌのＤＭＳＯ（Aldrich）中の４２ｍＭ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（サウスカロライナ、Lisle在、ICN Immunobiologicals，カタログ番号980501）を５０ｍｌの基質緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム／クエン酸、ｐＨ４．９）にゆっくりと加え、その後、７．５μｌの３０％過酸化水素（Sigma，カタログ番号H-1009）を加えた。各ウェル内の青色の発色を、ミクロ滴定プレートリーダーで６５０ｎｍにてモニターした。７〜１０分後に、１００μｌの２Ｎ硫酸の添加によって発色を停止させた。その結果生じた黄色をミクロ滴定プレートリーダーで４５０ｎｍにて読んだ。陰性対照用ウェルをこの機械用のブランクとして用いた。ＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧの精製ＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧを発現しているＣＨＯ細胞を、ローラーボトル中でコラーゲンビーズ上で生育させた。調整培地（５リットル）を、Amicon S1Y10らせん限外濾過カートリッジ（マサチューセッツ、Danvers在、Amicon）を用いて５００ｍｌに濃縮した。濃縮物を、１リットルのPierceプロテインＡ結合用緩衝液（イリノイ、Ro ckford在、Pierce）で稀釈し、重力により１０ｍｌのプロテインＡカラム（Seph arose 4 Fast Flow，ニュージャージー、Piscataway在、Pharmacia）に載せた。このカラムを、１０ｍｌのプロテインＡ結合用緩衝液で９回洗い、次いで、１０ｍｌのＰＢＳで７回洗った。２５ｍＭＨ₃ＰＯ₄（ｐＨ２．８）、１００ｍＭＮａＣｌを含む１２の５ｍｌステップでＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧを溶出した。溶出した試料を、０．５ＭＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ８．６）を２５ｍＭまで加えることによって中和した。画分を、２８０ｎｍの吸光度及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。最高純度の３つのピーク画分をプールして濾過し、アリコートを取って−７０℃ に保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、生成物は９５％より高い純度であった。幾つかの例においては、プロテインＡ溶出生成物を更にQ-Sepharose FF（Pharma cia）にて生成することが必要であった。プロテインＡ溶出物を、３倍容の２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）で稀釈し、樹脂１ｍｌ当り１０ｍｇのＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧにてQ-Sepharose FFカラムに載せた。次いで、ＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧをＰＢＳでQ-Sepharoseから溶出した。ＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧの評価脾臓細胞懸濁液を、上記のように、糖尿病のドナー又は糖尿病でない対照から調製した。脾臓細胞を静脈注射（０．２ｍｌＰＢＳ中の２〜３×１０⁷）し且つ１００μｇのＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧ又は１００μｇの無関係のＬＦＡ−３Ｉｇ融合蛋白質対照で予備処理した。他のグループは、ＰＢＳのみを受け、細胞の移植はしなかった。融合蛋白質ＬＦＡ−３Ｉｇ（ＬＦＡ−３ＴＩＰ）を、ＰＣＴＵＳ９２／０２０５０及びMiller等、1993［57］に記載のようにして単離精製した。ＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧ融合蛋白質又は無関係のＬＦＡ−３Ｉｇ蛋白質を１００ μｇ／０．２ｍｌの投与量で１７日目まで週２回腹腔内投与した。この濃度は、ＶＬＡ４陽性細胞を飽和させるのに十分な融合蛋白質の血清レベルを与えるのに十分であった（血清レベルは、上記のようにＥＬＩＳＡによって測定した）。糖尿病の発症を、上記のようにして監視した。評価の結果を図７に示す。この図に示したように、ＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧ融合蛋白質（Ｄ／ＶＣＡＭ−Ｉｇ、塗りつぶしてない丸）は、糖尿病ドナー（データは示さない）からの細胞とＬＦＡ−３Ｉｇ無関係対照Ｉｇ融合蛋白質（Ｄ／ＬＦＡ−３Ｉｇ）とを受けたマウスが移植後１５日目で既に６０％の発病率に達したのに比べて、糖尿病ドナーマウスからの細胞のレシピエントにおける糖尿病の発症を有意に阻止し、移植後３０日目までで６０％の発病率である。細胞を受けなかったマウス（ＰＢＳのみ）は、病気を起こさなかった。実験グループ当りのマウス数は、ｎ＝５であった。要約すると、ヒトの糖尿病に対するマウスモデルを用いて、ＶＬＡ４結合剤例えば抗ＶＬＡ４抗体は、糖尿病の発症に対して防御力があり（実施例１、３及び４）、インシュリン炎の進行を遅らせるのに有効であった（実施例２）。他のＶＬＡ４結合剤例えば可溶性ＶＣＡＭ誘導体（ＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧ）も又、糖尿病発症に対する防御において有用であった（実施例５）。上記の実施例は、本発明の方法を説明することを意図しており、後記の請求の範囲に記載の発明の制限として提供するものではない。上記の開示から、この発明の多くの変法及び更なる具体例が当業者には明らかとなるであろう。例えば、実際に用いる投与量、使用する抗体若しくは抗体断片の型、投与形式、正確な組成、治療用の投与の時間及び方法、並びに他の多くのすべての特徴は、上記の説明から離れずに変更することが出来る。かかるすべての変法及び更なる具体例は、この発明の企図する内にあり、添付の請求の範囲の内にある。上記の文献を全体として本明細書中に参考として援用する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．前糖尿病の個体におけるインシュリン依存型（Ｉ型）糖尿病の予防において使用するための医薬の製造のための抗ＶＬＡ４抗体の利用。２．抗ＶＬＡ４抗体をＨＰ１／２、ＨＰ２／１、ＨＰ２／４、Ｌ２５及びＰ４Ｃ２からなる群より選択する、請求項１に記載の利用。３．抗ＶＬＡ４抗体がＨＰ１／２、又はＶＬＡ４に結合し得るその断片である、請求項１に記載の利用。４．抗ＶＬＡ４抗体がヒト化ＨＰ１／２抗体、又はＶＬＡ４に結合し得るその断片である、請求項１に記載の利用。５．医薬を、前糖尿病の個体の重量に基づいて約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇで与えるような投与量で投与する、請求項１に記載の利用。６．医薬を、１〜１４日の期間にわたって末梢血液中のＶＬＡ４陽性細胞を被覆するのに有効な量で投与する、請求項１に記載の利用。７．医薬を、前糖尿病の個体における血漿中の抗体レベル少なくとも１μｇ／ｍｌを与えるのに有効な量で投与する、請求項１に記載の利用。８．医薬を、約２５０ｍｇ／ｄＬ未満の血清グルコースレベルの測定により明白な糖尿病の発達の前に投与する、請求項１に記載の利用。９．前糖尿病の個体がヒトである、請求項１に記載の利用。１０．糖尿病の治療において使用するための医薬の製造のための、抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ＶＬＡ４のα₄サブユニットに結合し得るかかる抗体の断片、ポリペプチド若しくは低分子、又は前記のものの任意の組合せの利用。１１．抗体、ポリペプチド又は分子を、モノクローナル抗体ＨＰ１／２、かかる抗体のＦab、Ｆab'、Ｆ(ab')₂若しくはＦ（v）断片、可溶性ＶＣＡＭ−１若しくはフィブロネクチンポリペプチド、又はＶＬＡ４のＶＣＡＭ−１若しくはフィブロネクチン結合ドメインに結合する低分子から選択する、請求項１０に記載の利用。１２．医薬が複数の抗ＶＬＡ４モノクローナル抗体又はそのＶＬＡ４結合性断片を含む、請求項１０に記載の利用。１３．医薬を、感受性の哺乳動物の重量に基づいて、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの抗体、抗体断片、ポリペプチド又は低分子を与えるような投与量で投与する、請求項１０に記載の利用。１４．医薬を、１〜１４日の期間にわたって、末梢血液中のＶＬＡ４陽性細胞を被覆するのに有効な量で投与する、請求項１０に記載の利用。１５．医薬を、１〜１４日の期間にわたって、哺乳動物の血漿中の抗体レベル少なくとも１μｇ／ｍｌを与えるのに有効な量で投与する、請求項１０に記載の利用。１６．可溶性ＶＣＡＭ−１ポリペプチドがＶＣＡＭ２Ｄ−ＩｇＧを含む、請求項１１に記載の利用。１７．本質的に、製薬上許容し得るキャリアー中のＶＬＡ４を認識するモノクローナル抗体からなる、糖尿病の発症の予防を与えるのに有効な製薬組成物。