MX2011010971A - Composiciones y metodos para tratar leucemia mielogena aguda. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con composiciones y métodos para el tratamiento o prevención de una malignidad hematológica, tal como AML, usando un anticuerpo anti-alfa4 en combinación con agentes quimioterapéuticos en una cantidad terapéuticamente efectiva. El método incluye administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que contiene un antagonista de una interacción entre una integrina con una subunidad alfa4 (vla-4) y un ligando para esta integrina (VCAM-1).

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA TRATAR LEUCEMIA MIELOGENA AGUDA ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las malignidades hematológicas son trastornos proliferativos que afectan la sangre, la médula ósea y los nodulos linfáticos. Éstas incluyen leucemias, tales como leucemia linfocitica crónica (CLL por sus siglas en inglés) y leucemia mielógena aguda (AML por sus siglas en inglés ) , linfornas y mieloma múltiple.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que los anticuerpos anti-alfa4 pueden bloquear la adhesión mediada por VLA-*4 de las lineas celulares hematológicas (que incluyen las lineas celulares de leucemia mielógena aguda (AML) ) a VCAM-1 y fibronectina, asi como a las células estromales de la médula ósea. Mientras que no se desea ser relacionado con la teoría, esta actividad puede interrumpir las rutas de señalización de la supervivencia celular y aumentar la sensibilidad de las células a los agentes citotóxicos. De esta manera, se proporcionan métodos para el tratamiento de las malignidades hematológicas, tales como AML, o para disminuir la resistencia a los agentes citotóxicos usando antagonistas de anti'-alfa4.

En un aspecto, se proporciona un método para el Ref . :224599 tratamiento de un paciente que tiene un trastorno hematológico, por ejemplo, una leucemia,' tal como leucemia mielógena aguda (AML) . El método incluye administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que contiene un antagonista de una interacción entre una integrina con una subunidad alfa4 (por ejemplo, VLA-4) y un ligando para esta integrina (por ejemplo, VCAM- 1) . Esta antagonista puede ser una integrina alfa4 qué une el 'agente o un agente de unión del ligando de integrina alfa . Los agentes típicos incluyen los anticuerpos anti-VLA-4 o anti-alfa4beta7 (por ejemplo, anticuerpos humanos, quiméricos y humanizados y fragmentos de los mismos); anticuerpos nti- VCAM-1 (por ejemplo, anticuerpos de humano, quiméricos y humanizados y fragmentos de los mismos); e inhibidores de moléculas pequeñas de interacciones de las integrinas que contienen la subunidad alfa4 con sus ligados.

En una modalidad, el antagonista es un anticuerpo de integrina anti-alfa4 o un fragmento de unión de antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo de unión de VLA-4 o un fragmento de unión de antígeno del mismo. La composición puede ser una composición farmacéutica que contiene por lo menos una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de unión de VLA-4, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra modalidad, el anticuerpo de unión anti-alfa4 o un fragmento de unión de antígeno del mismo, es un anticuerpo de unión de VLA-4 o un fragmento del mismo. En otra modalidad, el anticuerpo anti-alfa4, o un fragmento de unión de antigeno del mismo, por ejemplo, el anticuerpo de unión de VLA-4, es un anticuerpo de humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un fragmento de Fab, Fab', F(ab')2 o F(v) de unión de antigeno, o un anticuerpo de humano, quimérico o humanizado, o un anticuerpo modificado con más de dos sitios de unión de antigeno (por ejemplo, anticuerpo biespecifico) . En otras modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión de antigeno del mismo, es un anticuerpo monoclonal o monoespecifico, un anticuerpo de cadena simple (por ejemplo, un nanocuerpo, tal como un anticuerpo de camello o tiburón (un IgNAR) ) , o un fragmento de unión de antigeno de cualquiera de^ estos tipos de anticuerpos.

En una modalidad, el antagonista es un inhibidor de molécula pequeña, tal como un inhibidor descrito en O 06/131200 o US2007/0004775, las cuales se incorporan en la presente por referencia.

En otra modalidad, la composición se administra a una dosificación para proporcionar de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal del anticuerpo o fragmento de unión de antigeno del mismo.

En otra modalidad, el anticuerpo anti-alfa4 o fragmento de unión de antigeno del mismo, une la cadena alfa de VLA-4, y en aún otra modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión de antigeno del mismo es un anticuerpo de unión de VLA-4-específico del epítopo B o un fragmento de unión de antígeno del mismo. En otra modalidad, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es natalizumab, o un fragmento de unión de antígeno de natalizumab.

En una modalidad, el método para el tratamiento de la malignidad hematológica (por ejemplo AML) incluye administrar un segundo agente terapéutico, además del anticuerpo anti-alfa4. El segundo agente terapéutico puede ser, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, tal como (pero no se limita a) citarabina (Ara-C) , daunorubicina , idarubicina, etoposida, gemtuzumab ozogamicina, trióxido de arsénico o todos los ácidos trans retinoicos. El método para el tratamiento de la malignidad hematológica también puede incluir un . segundo régimen terapéutico, por ejemplo, radioterapia, además de la administración del antagonista de alfa4.

Algunas modalidades son apropiadas para la liberación a un paciente, tal como un humano, por ejemplo, un paciente humano, mediante liberación subcutánea (SC) o intramuscular (IM). Una composición que contiene un anticuerpo anti-alfa4 también puede ser apropiada para la administración intravenosa (IV), tal como, cuando se diluye en una matriz de infusión aceptable (tal como solución salina normal) . El anticuerpo anti-alfa4 puede ser, por ejemplo, natalizumab.

En una modalidad, el anticuerpo anti-alfa4 es un anticuerpo monoclonal humanizado, tal como natalizumab. En otra modalidad, el anticuerpo anti-alfa4 es una variante de natalizumab. Por ejemplo, en algunas modalidades, la región variable de cadena ligera del anticuerpo tiene una secuencia de aminoácido que difiere por uno o más residuos de aminoácidos, pero no mayor de 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de natalizumab, y/o la región variable de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácido que difiere por uno o más residuos de aminoácido, pero no mayor de 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de natalizumab. En algunas modalidades, algunas o todas las diferencias son cambios conservadores. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-alfa4 tiene CDRs equivalentes a las CDRs de natalizumab, o el anticuerpo une el mismo o un epitopo traslapado de natalizumab.

En otra modalidad, el anticuerpo anti-alfa4 tiene una o ambas de una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 7, en la patente U.S. No. 5, 840,299, que se incorpora en la presente por referencia, y una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 11 en la patente U.S. No. 5,840,299. En otras modalidades, el anticuerpo VLA-4 es una variante de una- de estas modalidades. Por ejemplo, en algunas modalidades, la región variable de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácido que difiere por uno o más residuos de aminoácidos, pero no mayor de 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos de aminoácidos de la secuencia en SEC ID NO: 7 en la patente U.S. No. 5,840,299, y/o la región variable de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácido que difiere por uno o más residuos de aminoácidos, pero no mayor de 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos de aminoácidos, como se define por la SEC ID NO: 11 en la patente U.S. No. 5,840,299.

En aún otra modalidad, el anticuerpo anti-alfa4 tiene uno o ambos de una secuencia de aminoácido de cadena ligera de la SEC ID NO: 1 en la Tabla 1-1, y una secuencia de aminoácido de cadena pesada de la SEC ID NO: 2 en la Tabla 1-2. En otras modalidades, el anticuerpo VLA-4 es una variante de uno de estos anticuerpos. Por ejemplo, en algunas modalidades, la cadena ligera del anticuerpo tiene una secuencia de aminoácido que difiere por uno o más residuos de aminoácidos, pero no mayor de 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos de aminoácidos de la secuencia de SEC ID NO: 1, y/o la cadena pesada del anticuerpo tiene una secuencia de aminoácido que difiere por uno o más residuos de aminoácidos, pero no mayor de 2, 3, 4, 5 ó 6 residuos de aminoácido de la secuencia de SEC ID NO:2.

Una "diferencia" en la secuencia de aminoácido, como se usa en este contexto, significa una diferencia en la identidad de un aminoácido (por ejemplo, una sustitución de un aminoácido diferente para un aminoácido en la en la SEC ID NO: 7 u 11 mencionada anteriormente) o una eliminación o inserción. Una diferencia puede ser, por ejemplo, en una región de marco, una COR, una región de bisagra o constante. Una diferencia puede ser interna o en un extremo de una secuencia de proteina. En algunas modalidades, algunas o todas las diferencias son cambios conservadores comparados con la secuencia mencionada.

En una modalidad, el método permite un aumento gradual en la dosificación de anticuerpo proporcionado (la dosificación como se usa en la presente se refiere a la cantidad de anticuerpo proporcionada en una, o en cada una de un pequeño número definido de administraciones, por ejemplo, 2) . Esto permite aumentar la dosificación y puede permitir monitorear al paciente en cuanto a tolerancia, reaccione.s adversas y similares, conforme la dosificación de aumenta. Por ejemplo, el método puede comenzar proporcionando natalizumab al paciente en una o más dosificaciones iniciales o relativamente bajas, seguido de proporcionar natalizumab al paciente en una dosificación final, superior. Las dosificaciones iniciales típicas pueden ser, por ejemplo, de 80%, 70%, 50%, 30%, 20% ó 10% o menos de la dosificación superior final. Las dosificaciones finales típicas variarán con base en la frecuencia de administración una vez que se ha alcanzado la administración de estado estacionario. Por ejemplo, algunas modalidades incluyen dosificaciones finales de entre 50 mg y 1200 mg por 28 días de administración IV. Algunas modalidades incluyen dosificaciones finales de entre 10 mg y 1000 mg (por ejemplo, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg) (estas dosificaciones pueden ser tipicas de la administración aproximadamente mensual) . Otras modalidades incluyen dosificaciones finales de entre 25 mg y 250 mg (por ejemplo, 50' mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg) (estas dosificaciones son tipicas de la administración cada dos semanas) . La dosificación terapéutica puede determinarse por la saturación del receptor.

En algunas modalidades, el paciente recibirá una o una pluralidad de administraciones, en una o una pluralidad de dosificaciones iniciales. Por ejemplo, en una modalidad, el paciente recibirá dosificaciones aumentadas durante un número de administraciones. En algunas modalidades, el paciente recibirá 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 administraciones en una o más dosificaciones iniciales antes de alcanzar la dosificación final. Por ejemplo, el paciente recibirá una o más administraciones en una primera dosificación inicial, y una o más administraciones en una segunda dosificación inicial mayor. En algunas modalidades, se valora al paciente después de una o más administraciones para los síntomas, incluyendo los síntomas adversos. En algunas modalidades, se administra al paciente una dosificación aumentada de natalizumab únicamente después de determinar que el paciente no tiene una reacción adversa inaceptable a la dosificación previa.

En algunas modalidades, el paciente recibirá una dosis superior inicial y luego dosis inferiores subsecuentes, por ejemplo, conforme mejoran los síntomas.

En una modalidad, se administra al paciente una dosis inicial del antagonista alfa4 (por ejemplo, un anticuerpo de unión alfa4) al mismo tiempo que recibe una dosis inicial de un agente quimioterapéutico o tratamiento de radioterapia. En otra modalidad, se administra al paciente una dosis inicial del antagonista alfa4 después de tener una recaída de una malignidad hematológica .

En otro aspecto, la invención caracteriza un método, por ejemplo, un método para instruir a un paciente en necesidad de una terapia de antagonista de alfa4, a administrar una composición de la presente para el tratamiento de una malignidad hematológica. El método incluye (i) proporcionar al paciente por lo menos una dosis unitaria de una formulación de un antagonista, por ejemplo, un anticuerpo anti-alfa4; y (ii) instruir al paciente a auto-administrar por lo menos una dosis unitaria intravenosamente. Otro método, por ejemplo, un método de tratamiento, incluye (i) proporcionar al paciente por lo menos dos dosis unitarias de una formulación de un antagonista alfa4; y (ii) instruir al paciente a auto-administrar las dosis unitarias intravenosamente, por ejemplo, una dosis a la vez.

En una modalidad, el paciente tiene un trastorno hematológico, tal como una leucemia, por ejemplo, leucemia mielógena aguda (AML) , leucemia linfoblástica aguda (ALL) , leucemia linfocitica crónica (CLL) , leucemia mielógena crónica (CML) o leucemia de células cabellosas (HCL) . En otra modalidad, el paciente tiene un linfoma, tal como enfermedad de Hodgkin o linfoma de no Hodgkin (ya sea de tipo células T o B) . En otra modalidad, el paciente tiene el síndrome mielodisplásico (MDS) , y en otra modalidad, el paciente tiene una enfermedad mieloproliferativa, tal como policitemia vera (también llamada PV, PCV o policitemia rubra vera (PRV)), trombocitosis esencial (ET por sus siglas en inglés) o mielofibrosis . En aún otra modalidad, el paciente tiene amiloide debido a la enfermedad de cadena ligera, macroglobulinemia de Waldenstrom, gamopatía monoclonal de significado desconocido (MGUS por sus siglas en inglés) o leucemia de células de plasma. En una modalidad típica, el paciente tiene AML.

En otro aspecto, la invención caracteriza un método de tratamiento de un paciente que tiene una malignidad hematológica, tal como AML, mediante la administración al paciente de una composición que contiene un antagonista de alfa4, por ejemplo, un anticuerpo anti-alfa4 en una formulación apropiada para la administración IV o SC o IM. En una modalidad, la composición se administra como un régimen. En otra modalidad, el método además incluye seleccionar un paciente apropiado para el tratamiento con la composición. Un paciente apropiado para el tratamiento, por ejemplo, ha demostrado un signo o síntoma indicativo de un inicio de enfermedad, tal como un signo o síntoma indicativo de AML. Un paciente apropiado para el tratamiento también puede expresar un nivel elevado de proteína VLA4 sobre la superficie de las células en una muestra de tejido (por ejemplo, células de un frotis sanguíneo o biopsia de la médula ósea) comparado con el nivel de la proteína VLA4 expresado en las células en un humano que no tiene una malignidad hematológica, tal como AML.

En aún otra modalidad, el método además incluye administrar al paciente un segundo agente terapéutico, tal como un agente quimioterapéutico, por ejemplo, citarabina (Ara-C) , daunorubicina, idarubicina, etoposida, gemtuzumab ozogamicina, trióxido de arsénico, o todos los ácidos trans retinoicos .

En otro aspecto, la invención caracteriza un método para evaluar un paciente determinando si el paciente satisface un criterio preseleccionado, y el paciente satisface el criterio preseleccionado aprobando, proporcionando, prescribiendo o administrando una formulación de anticuerpo anti-alfa4 descrita en la presente para el paciente. En alguna modalidad, el criterio preseleccionado es el fracaso del paciente a responder adecuadamente a un tratamiento o régimen terapéutico alternado, por ejemplo, para el tratamiento de una malignidad hematológica, tal como AML. En otra modalidad, el criterio preseleccionado es la ausencia de cualesquiera signos o síntomas de leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML), o la ausencia de cualquier diagnóstico de PML. En otra modalidad, el criterio es como se describe en PCT/US2007/075577 (publicada como WO/2008 /021954 ) , incorporada en la presente por referencia, la cual describe métodos y sistemas para la distribución de fármacos.

En otro aspecto, la invención caracteriza un método para instruir a un destinatario sobre la administración de una formulación de natalizumab. El método incluye instruir al destinatario (por ejemplo, un usuario terminal, paciente, médico, farmacia de venta o al por mayor, distribuidor, o departamento de farmacia en un hospital, clínica local de enfermería o HMO) que el fármaco debería administrarse a un paciente subcutánea o intramuscularmente .

En otro aspecto, se proporciona un método para distribuir una composición descrita en la presente. La composición contiene natalizumab y es apropiada para la administración subcutánea o intramuscular o intravenosa. El método incluye proporcionar a un destinatario (por ejemplo, un usuario terminal, paciente, médico, farmacia de venta o al por mayor, distribuidor, o departamento de farmacia en un hospital, clínica local de enfermería o HMO) con un paquete que contiene dosificaciones unitarias suficientes del fármaco para tratar a un paciente durante por lo menos 6, 12, 24 ó 36 meses .

En otro aspecto, la invención caracteriza el uso de un método o sistema descrito en PCT/US2007/075577 (publicada como O/2008/02195 ) con una formulación descrita en la presente. Las modalidades incluyen un método para distribuir una formulación descrita en la presente, monitorear o rastrear el suministro de una formulación descrita en la presente a una farmacia, centro de infusión, o paciente, monitorear uno o más pacientes, seleccionar los pacientes o compilar o reportar los datos sobre el uso de una formulación descrita en la presente. PCT/US2007/075577 (publicada como WO/2008/021954) se incorpora en la presente por referencia.

En otro aspecto, la invención caracteriza un método para seleccionar un paciente para el tratamiento con una composición que contiene un anticuerpo anti-alfa4. El método incluye seleccionar o proporcionar un paciente que tiene una malignidad hematológica, tal como AML; y proporcionar o administrar una composición que comprende un anticuerpo anti-alfa4, tratando de esta manera al paciente.

Una "malignidad hematológica" es un trastorno, tal como un cáncer, que afecta la sangre, la médula ósea o los nodulos linfáticos. Las malignidades hematológicas incluyen leucemias, tales como ALL, AML, CML, CLL y HCL; linfomas, tal como enfermedad de Hodgkxn y linfoma de no Hodgkin; y mieloma múltiple; síndrome mielodisplásico (MDS por sus sigla en inglés) (que puede culminar en AML) ; una enfermedad mieloproliferativa, tal como policitemia vera (también llamada PV, PCV o policitemia rubra vera (PRV) ) , trombocitosis esencial (ET) , mielofibrosis ; y amiloide debido a enfermedad de cadena ligera.

El término "tratamiento" se refiere a administrar una terapia en una cantidad, manera y/o modo efectivo para mejorar una afección, síntoma o parámetro asociado con un trastorno o para prevenir la progresión de un trastorno, ya sea a un grado estadísticamente significativo o a un grado detectable para un experimentado en la técnica. Una cantidad efectiva, manera o modo puede variar dependiendo del paciente y puede adecuarse para el paciente.

Un "anticuerpo anti-alfa4" se refiere a un anticuerpo que se una a una integrina alfa4, tal como la subunidad alfa4 de la integrina VLA-4, y por lo menos inhibe parcialmente una actividad de la integrina. Por ejemplo, un anticuerpo anti-alfa4 puede inhibir la unión de la integrina a un ligando cognado, por ejemplo, una proteína de superficie celular, tal como VCAM-1, o a un componente de matriz extracelular, tal como fibronectina u osteopontina . El efecto de la inhibición puede prevenir que una integrina anti-alfa4 se una a una célula, tal como una célula estromal de la médula ósea. Las integrinas alfa4 son integrinas cuya subunidad alfa4 se asocia con una u otra de las subunidades beta. De esta manera, el término "integrina alfa4" se refiere a VLA-4, asi como las integrinas que contienen betal, beta7 o cualquier otra subunidad beta (por ejemplo, alfa4beta7, alfa4betal) . De esta manera, los anticuerpos anti-alfa4 útiles para el tratamiento de una malignidad hematológica incluyen, por ejemplo, los anticuerpos de unión de VLA-4, asi como los anticuerpos alfa4beta7' y los fragmentos de unión de antigeno de los mismos. Un anticuerpo anti-alfa4 puede unir a la integrina alfa4 con una Kd menor de aproximadamente 10 —6, 10—7 , 10"8, 10"9 ó 10"10 M.

Un "anticuerpo de unión de VLA-4" se refiere a un anticuerpo que puede unir a una integrina VLA-4, tal como a la subunidad 4 de la integrina VLA-4, y por los menos inhibe parcialmente una actividad de una VLA-4, particularmente una actividad de unión de una integrina VLA-4 o una actividad de señalización, por ejemplo, capacidad para transducir una señal mediada por VLA-4. Por ejemplo, un anticuerpo.de unión de VLA-4 puede inhibir la unión de VLA-4 a un ligando cognado de VLA-4, por ejemplo, una proteina de superficie celular, tal como VCAM-1, o a un componente de matriz extracelular, tal como fibronectina u osteopontina . Un anticuerpo de unión de VLA-4 puede unir a la subunidad OÍ4 O la subunidad ß?, o a ambas. En una modalidad, el anticuerpo une al epitopo Bl de a . Un anticuerpo de unión de VLA-4 puede unir a VLA-4 con una Kd menor de aproximadamente 10~6, 10~7, 10~8, 10"9 ó 10"10 M. VLA-4 también se conoce como alfa4/betal y CD29/CD49b. En una modalidad, el anticuerpo de unión VLA-4 es natalizumab, o tiene una Kd dentro de 70%-130%, por ejemplo, dentro de 80%-125%, de la Kd de natalizumab.

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a una proteina que incluye por lo menos una región variable de inmunoglobulina, por ejemplo, una secuencia de aminoácido que proporciona un dominio variable de inmunoglobulina o secuencia de dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, un anticuerpo puede inducir una región variable de cadena pesada (H) (abreviada en la presente como VH) y una región variable de cadena ligera (L) (abreviada en la presente como VL) . En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regiones variables de cadena pesada (H) y dos regiones variables de cadena ligera '(L) . El término "anticuerpo" abarca los fragmentos de unión de antigeno de los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv y fragmentos dAb) asi como anticuerpos completos, por ejemplo, inmunoglobulinas intactas de los tipos IgA, IgG, IgE, IgD, Ig (así como los subtipos de las mismas) . Las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipos kappa o lambda. En una modalidad, el anticuerpo es glucosilado. Un anticuerpo puede ser funcional para la citotoxicidad dependiente del anticuerpo y/o la citotoxicidad mediada por complemento, o puede ser no funcional para una o ambas de estas actividades.

Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas "regiones de determinación de complementariedad "CDR") , interespaciadas con regiones que son más conservadas, llamadas "regiones de marco" (FR) . Se ha definido de forma precisa el grado de las FRs y CDRs (ver, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; y Chothia, C. et a (1987) J. Mol. Biol . 196:901-917). Las definiciones de Kabat se usan en la presente. Cada una de VH y VL está compuesta típicamente de tres CDRs y cuatro FRs, arregladas desde el término amino al término carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Un "dominio de inmunoglobulina" se refiere a un dominio del dominio variable o constante de las moléculas de inmunoglobulina. Los dominios de inmunoglobulina contienen típicamente dos películas ß formadas de aproximadamente siete hebras ß, y un enlace de disulfuro conservado (ver por ejemplo, A. F. Williams and A. N. Barclay 1988 Ann. Rev Immunol. 6: 381-405) .

Como se usa en la presente, una "secuencia de dominio variable de inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de aminoácido que puede formar la estructura de un dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, la secuencia puede incluir todo o parte de la secuencia de aminoácido de un dominio variable que se presénta naturalmente. Por ejemplo, la secuencia puede omitir uno, dos o más aminoácidos N o C terminales, aminoácidos internos, pueden incluir una o más inserciones o aminoácidos terminales adicionales, o puede incluir otras alteraciones. En una modalidad, un polipéptido que incluye una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina puede asociarse con otra secuencia de dominio variable de inmunoglobulina para formar una estructura de unión blanco (o "sitio de unión de antigeno") , por ejemplo, una estructura que interactúa con VLA- .

La cadena VH o VL del anticuerpo puede incluir además todo o parte de una región constante de cadena pesada o ligera, para formar de esta manera, una cadena de inmunoglobulina pesada o ligera, respectivamente. En una modalidad, el anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas de inmunoglobulina y dos cadenas de inmunoglobulina ligera. Las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera pueden conectarse por enlaces de disulfuro. La región constante de cadena pesada incluye típicamente tres dominios constantes, CH1, CH2 y CH3. La región constante de cadena ligera incluye típicamente un dominio CL. La región variable de las cadenas pesada y ligera contiene un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos mediante típicamente la unión del anticuerpo a los tejidos o factores- huéspedes, incluyendo diferentes células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.

Una o más regiones de un anticuerpo pueden ser humana, efectivamente humana o humanizada. Por ejemplo, una o más de las regiones variables puede ser humana o efectivamente humana. Por ejemplo, una o más de las CDRs, por ejemplo, HC CDR1, HC CDR2 , HC CDR3 , LC CDR1, LC CDR2, y LC CDR3, pueden ser humanas (HC, cadena pesada; LC, cadena ligera) . Cada una de las CDRs de cadena ligera puede ser humana. HC CDR3 puede ser humana. Una o más de las regiones de marco pueden ser humana, por ejemplo, FR1, FR2, FR3 y FR4 de HC o LC. En una modalidad, todas las regiones de marco son humanas, por ejemplo, derivadas de una célula somática humana, por ejemplo, una célula hematopoyética que produce inmunoglobulinas o una célula no hematopoyética. En una modalidad, las secuencias humanas son secuencias de la línea germinal, por ejemplo, codificadas por un ácido nucleico de la línea germinal. Una o más de las regiones constantes pueden ser humanas, efectivamente humanas o humanizadas. En otra modalidad, por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95 ó 98% de las regiones de marcó (por ejemplo, FR1, FR2 y FR3, colectivamente, o FRl, FR2, FR3 y FR4 , colectivamente) o el anticuerpo total puede ser humano, efectivamente humano o humanizado. Por ejemplo, FRl, FR2 y FR3 pueden ser colectivamente por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98 ó 99% idéntica a una secuencia de human codificada por un segmento de la línea germinal de humano.

Una región variable de inmunoglobulina "efectivamente humana" es una región variable de inmunoglobulina que incluye un número suficiente de posiciones del. aminoácido del marco de humano, de modo que la región variable de inmunoglobulina no provoque una respuesta inmunogénica en un humano normal. Un anticuerpo "efectivamente humano" es un anticuerpo que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácidos de humano, de modo que el anticuerpo no provoca una respuesta inmunogénica en un humano normal.

Una región variable de inmunoglobulina "humanizada" es una región variable de inmunoglobulina que está modificada, de modo que el forma modificada provoca menos de una respuesta inmune en un humano que lo hace la forma no modificada, por ejemplo, se modifica para incluir un número suficiente de posiciones de aminoácidos de marco de humano, de modo que la región variable de inmunoglobulina no provoca una respuesta inmunogénica en un humano normal. Las descripciones de las inmunoglobulinas "humanizadas" incluyen, por ejemplo,' la patente U.S. No. 6,407,213 y la patente U.S. No. 5,693,762. En algunos casos, las inmunoglobulinas humanizadas pueden incluir un aminoácido no humano en una o más posiciones del aminoácido del marco.

. Todo o parte de un anticuerpo puede codificarse por un gen de inmunoglobulina o un segmento del' mismo. Ejemplos de los genes de inmunoglobulina de humano incluyen genes de región constante kappa, lambda, alfa (IgAl e IgA2), gamma (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), delta, epsilon y mu, así como los genes de la región variable de inmunoglobulina miriad. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud total (aproximadamente 25 Kd ó 214 aminoácidos) se codifican por un gen de región variable en el término NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de región constante kappa o lambda en el término COOH. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud total (aproximadamente 50 Kd ó 446 aminoácidos) , se codifican similarmente por un gen de región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de región constante mencionados anteriormente, por ejemplo, gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos) .

El término "fragmento de unión de antígeno" de un anticuerpo de longitud total a uno o más fragmentos de un anticuerpo de longitud total que mantienen la capacidad de unir específicamente a un blanco de interés, por ejemplo, VLA-4. Ejemplos de los fragmentos de unión abarcados dentro del término "fragmento de unión de antígeno" de un anticuerpo de longitud total incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo simple de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al, (1989) Nature 341:544-546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región de determinación de la complementariedad aislada (CDR) que mantiene la funcionalidad. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, estos pueden unirse usando los métodos recombinantes , mediante un enlazador sintético que les permite ser hechos como una cadena de proteína simple en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes conocidos como cadena simple Fv (scFv). Ver, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.

Los detalles de una o más modalidades de la invención se establecen en las figuras anexas y la siguiente descripción.

Otras características, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción, las figuras y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A, IB y 1C son gráficas de barras que representan la cantidad de las integrinas alfa4 y betal sobre las líneas celulares hematológicas de leucemia mielógena aguda (AML) (FIG. ¦ 1A) , miéLoma múltiple (MM) (FIG. IB) y leucemia linfocítica crónica (CLL) (FIG. 1C) como se determina por la citometría de flujo.

La Figura 2 es una gráfica que representa la unión de natalizumab a VLA-4 en las líneas celulares tumorales medido por citometría de flujo.

Las Figuras 3A y 3B son gráficas que muestran el efecto de natalizumab sobre la adhesión de las células tumorales de HL60 y KG1 AML a la fibronectina de los ligandos VLA-4 (· FN) , proteína de fusión de Ig de la molécula 1 de adhesión vascular (¦ VCAM-Ig) o células estromales de la médula ósea ( A BMSC) , en presencia de natalizumab o un anticuerpo de control de isotipo en diluciones en serie comenzando con 20 pg/ml. Las Figuras 3C y 3D muestran la inhibición de la unión de células HL60 y KG1 AML a ligandos VLA-4 en presencia de niveles de saturación de natalizumab (20 µg/mL) (barras oscuras) o control de isotipo (barras claras) .

Las Figuras 4A y 4B son gráficas que muestran el efecto de natalizumab sobre la adhesión de células tumorales de MM H929 y U266 a fibronectina de los ligandos VLA-4 (· FN) , proteina de fusión de Ig de la molécula 1 de adhesión vascular (¦ VCAM-Ig) , o las células estromales de la médula ósea (A BMSC) . La adhesión se probó en presencia de natalizumab o un anticuerpo de control de isotipo en diluciones en serie partiendo de 20 µg/ml. La Figura 4C muestra la inhibición de la unión de las células de MM H929 a los ligandos de VLA-4 en presencia de niveles de saturación de natalizumab (20 µg/mL) (barras oscuras) o control de isotipo (barras claras) .

Las Figuras 5A y 5B son gráficas que muestran el efecto de natalizumab sobre Mecí y la adhesión de las células tumorales JM1 CLL a la fibronectina de los ligandos de VLA-4 (· FN) , proteina de fusión de Ig de la molécula 1 vascular (¦ VCAM-Ig) o células estromales de médula ósea (A BMSC) . La adhesión se probó en presencia de natalizumab o un anticuerpo de control de isotipo en diluciones en serie partiendo de 20 µg/ml. La Figura 5C muestra la inhibición de la unión de la células Mecí CLL a los ligandos VLA-4 en presencia de niveles de saturación de natalizumab (20 ug/mL) (barras oscuras) o el control de isotipo (barras claras) .

Las Figuras 6A-6D son gráficas que muestran los resultados- de natalizumab sobre la resistencia del fármaco mediado por la adhesión celular. La Figura 6A representa el porcentaje de las células HL60 viables que permanecen después de que las células se co-cultivaron durante 24 horas con (¦) o sin (D) BMSC, luego se expusieron al fármaco AraC (citarabina) por quimioterapia durante 24 horas. La Figura 6B representa el porcentaje de las células apoptóticas (Annexin V+, 7AAD) después de que las células HL60 co-cultivadas se incubaron con natalizumab o el anticuerpo de control de isotipo durante 4 horas, y después se expusieron a una dosis efectiva de AraC como se determina en la Figura 6A, durante 24 horas. Las Figuras 6C y 6D muestran los resultados de experimentos similares llevados a cabo con células U266 expuestas a melfalan.

La Figura 7 es un panel de Western blots para probar los niveles de P-STAT3, STAT3, P-JNK, JNK, P-MAPK y MAPK en células HL60, KG1 o U266 crecidas en suspensión o co-cultivadas con BMSCs y natalizumab, como se indica, durante 30 minutos (HL60) ó 4 horas (U266) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención¦ se relaciona con tratamientos para, entre otras cosas, que tratan o previenen una malignidad hematológica, tal como A L. Más particularmente, se proporcionan en la presente métodos que se relacionan con el uso de anticuerpos anti-alfa4 o fragmentos de unión de antigeno de los mismos-, que son capaces de bloquear una interacción entre una integrina que contiene una subunidad alfa4 y un ligando para esta integrina en el tratamiento de una malignidad hematológica .

La integrina VLA-4 (alfa4betal) es un receptor de superficie celular para VCAM-1, fibronectina y posiblemente otras moléculas que se unen con, o de otra manera interactúan con, VLA-4. En este aspecto, tales moléculas que unen con, u de otra manera interactúan con, una subunidad alfa4 que contiene integrina, se refieren individual y colectivamente como "ligandos alfa4". El término VLA-4 (también llamado integrina "a4ß1", "a4ß1", integrina "alfa4betal" y "alfa4betal") se refiere, de esta manera, a polipéptidos que son capaces de unir a VCAM-1 y los miembros de las proteínas de matriz extracelular, más particularmente fibronectina, u homólogos o fragmentos de los mismos, aunque será apreciado por los trabajadores experimentados en la técnica que pueden existir otros ligandos para VLA-4 y pueden analizarse usando los métodos convencionales .

Es conocido que la subunidad alfa4 se asociará con las subunidades beta diferentes de betal, de esta manera, el término "integrina alfa4" se refiere paras las integrinas cuya subunidad alfa4 se asocia con una u otra de las subunidades beta. Un ejemplo adicional de una integrina "alfa4" es alfa4beta7. Como se usa en la presente, el término "integrina alfa4" se refiere a VLA-4, así como las integrinas que contienen betal, beta7. o cualquier otra subunidad beta.

Los antagonistas apropiados para los métodos descritos en la presente no se limitan a un tipo o estructura particular de molécula, de modo que cualquier agente capaz de unir a cualquier integrina que contiene una subunidad alfa4 (por ejemplo, VLA-4) sobre la superficie de las células que portan -VLA4 o la integrina alfa4beta7 sobre la superficie de las células que portan alfa4beta7 [ver Lobb and Hemler, J. Clin. Invest., 94: 1722 1728 (1994)] o con sus ligandos alfa4 respectivos, tales como VCAM 1 y MadCAM, respectivamente, sobre la superficie de las células que portan VCAM-1 y MadCAM, y que bloquea o recubre efectivamente VLA-4 (o alfa4beta7) o VCAM-1 (o MadCAM) (es decir, un "agente de unión de integrina alfa4" y "agente de unión de ligando de integrina alfa4", respectivamente) , se considera que es un equivalente de los antagonistas descritos en la presente.

Un "antagonista" de integrina (también referido en la presente como un "antagonista de alfa4") incluye cualquier compuesto que inhibe una integrina alfa4 de la unión con un ligando y/o receptor de integrina alfa4. Son útiles las proteínas que contienen un anticuerpo de anti-integrina asi como otras moléculas, tales como las formas solubles de las proteínas de ligando para las integrinas. Las formas solubles de las proteínas de ligando para las integrinas alfa4 incluyen VCAM-1 soluble o péptidos de colágeno, proteínas de fusión de VCAM-1 o proteínas de fusión VCAM-l/Ig bifuncionales . Por ejemplo, una forma soluble de un ligando de integrina alfa4 o un fragmento del mismo, puede administrarse para unir a integrina, y en algunos casos, competir con sitio de unión de integrina en las células, por lo que conduce a efectos similares a la administración de los antagonistas, tales como integrina anti-alfa4 (por ejemplo, anticuerpos alfa4beta7 o anticuerpos VLA-4). En particular, las mutantes de integrina de alfá4 que unen el ligando de integrina alfa 4, pero no provocan una señalización dependiente de integrina, son apropiadas para el uso en los métodos descritos. Tales mutantes pueden actuar como inhibidores competitivos de la proteína de integrina de tipo silvestre y se consideran "antagonista". Otros antagonistas apropiados son "moléculas pequeñas", como se define a continuación.

Los agentes que antagonizan la acción de más de una integrina alfa4, tal como una molécula pequeña simple ? anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que antagoniza varias integrinas alfa4, por ejemplo, VLA-4 y alfa4 beta 7, u otras combinaciones de las integrinas alfa4, son apropiadas para el tratamiento de malignidades hematológicas . Las combinaciones de diferentes moléculas, de modo que la actividad combinada antagoniza la acción de más de una integrina alfa4, también son apropiadas para los métodos descritos en la presente.

En algunas modalidades, algunos antagonistas de integrina se fusionan o, de otra manera, se conjugan con, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, por ejemplo, una inmunoglobulina o fragmento de la misma, y no se limitan a tipos o estructuras particulares de una integrina o ligando u otra molécula. De esta manera, cualquier agente capaz de formar una proteina de fusión y capaz de unir a los ligandos de integrina alfa4, y que bloquea o recubre efectivamente la integrina alfa4beta7 o VLA-4, se considera que es un equivalente de los antagonistas usados en los presentes ejemplos.

Un "antagonista del ligando de la interacción de la integrina alfa4 /integrina alfa4" se refiere a un agente, por ejemplo, un polipéptido u otra molécula, que puede inhibir o bloquear el ligando alfa4 (por ejemplo VCA -1) o la unión mediada por la integrina alfa4 (por ejemplo, alfa4beta7 o VLA-4), o que puede modular de otra manera la función de la integrina del ligando alfa4 o integrina alfa4, tal como inhibiendo o bloqueando la transducción de señal de la integrina alfa4 mediada por el ligando alfa4 o la transducción de señal del ligando alfa4 mediado por el ligando alfa4, y que es efectiva en el tratamiento de una malignidad hematológica, tal como AML, de la misma manera que los anticuerpos de la integrina anti-alfa4.

Un antagonista de la interacción de VCA -l/VLA-4 es un agente que tiene una o más de las siguientes propiedades: (1) recubre o une a, VLA-4 sobre la superficie de una célula que porta VLA-4 (por ejemplo, una célula A L) con una especificidad suficiente para inhibir una interacción de un ligando VLA-4/VLA- , por ejemplo, la interacción VCAM-1 /VLA-4 entre las células estromales óseas y las células de mieloma; (2) recubre, o une a, VLA-4 sobre la superficie de una célula que porta VLA-4 (es decir, una célula de mieloma) con una especificidad suficiente para' modificar, por ejemplo, inhibir, la transducción de una señal mediada por VLA-4, por ejemplo, señalización mediada por VLA-4 /VCAM-1 ; (3) recubre, o une a, un ligando VLA-4, (por ejemplo, VCAM1) sobre las células estromales óseas con una especificidad suficiente para inhibir la interacción de VLA-4/VCAM; (4) recubre, o une a, un ligando VLA-4 (por ejemplo, VCAM-1) sobre las células estromales óseas con una especificidad suficiente para modificar, por ejemplo, inhibir, la transducción de la señalización de VLA-4 mediada por el ligando VLA-4, por ejemplo, la señalización de VLA-4 mediada por VCAM-1. En algunas modalidades, el antagonista tiene una o ambas de las propiedades 1 y 2. En otras modalidades, el antagonista tiene una o ambas de las propiedades 3 y 4. Además, puede administrarse más de un antagonista a un paciente, por ejemplo, un agente que une a VLA-4 puede combinarse con un agente que une a VCAM-1.

Por ejemplo, son útiles los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, así como las formas solubles de las proteínas de unión naturales para VLA-4 y VCAM-1. Las formas solubles de las proteínas de unión naturales para VLA-4 incluyen los péptidos VCAM-1 solubles, proteínas de fusión VCAM-1, proteínas de fusión de VCAM-1/Ig bifuncionales , fibronectina, fibronectina que tiene un segmento de conexión de no tipo m, cortado alternativamente y péptidos de fibronectina que contienen la secuencia de aminoácido EILDV o una secuencia de aminoácido sustituida conservadoramente similar. Las formas solubles de las proteínas de unión naturales para VCAM-1 incluyen los péptidos de VLA-4 solubles, proteínas de fusión VLAD, proteínas de fusión VLA-4/lg bifuncionales y similares. Como se usa en la presente, un "péptido de VLA-4 soluble" o un "péptido de VCAM-1 soluble" es un polipéptido de VLA-4 o VCAM-1 incapaz de anclar por sí mismo en una membrana. Tales polipéptidos apropiados incluyen, por ejemplo, los polipéptidos de VLA-4 y VCAM que carecen de una porción suficiente de su dominio de extensión de membrana para anclar el polipéptido, o se modifican de modo que el dominio de extensión de membrana no es funcional. Estos agentes de unióa pueden actuar compitiendo con la proteína de unión de la superficie celular para VLA-4 o mediante alterando de otra manera la función de VLA-4. Por ejemplo, una forma soluble de VCAM-1 (ver, por ejemplo, Osborn et al. 1989, CelJ, 59: 1203 1211) o un fragmento de la misma, pueden administrarse para unir VLA-4, tal como para competir con un sitio de unió de VLA-4 o células de mieloma, conduciendo de esta manera a efectos similares para la administración de antagonistas, tal como moléculas pequeñas o anticuerpos anti-VLA-4.

En otro ejemplo, VCA -1, o un fragmento del mismo, el cual es capaz de unir a VLA-4 sobre la superficie - de las células de mieloma que portan VLA-4, por ejemplo, un fragmento que contiene los dos dominios N terminales de VCAM-1, pueden fusionarse a un segundo péptido,' por ejemplo, un péptido que aumenta la solubilidad o el tiempo de vida in vivo del radical VCAM-1. El segundo péptido puede ser un fragmento de un péptido soluble, tal como un péptido · de humano o una proteína de plasma o un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina . Típicamente, el segundo péptido es IgG o una, porción o fragmento del mismo, por ejemplo, la región constante de cadena pesada de IgGl de humano e incluye, por lo menos los dominios de bisagra, CH2 y CH3.

Los agentes que imitan la acción de los péptidos (por ejemplo, moléculas orgánicas llamadas "moléculas pequeñas") capaces de interrumpir la interacción de la integrina alfa4/ligando de integrina alfa4 mediante, por ejemplo, el bloqueo de VLA-4, uniendo los receptores de VLA-4 sobre la superficie de las células o bloqueando VCAM-1 mediante la unión de los receptores VCAM-1 sobre la superficie de las células. Estas "moléculas pequeñas" pueden ser péptidos pequeños o compuestos orgánicos que contienen péptidos más grandes o compuestos orgánicos no peptídicos. Una "molécula pequeña" no se pretende que abarque un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Aunque el peso molecular de tales moléculas "pequeñas" en general no es menor de 2000, esta cifra no se destina como un límite superior absoluto sobre el peso molecular.

Por ejemplo, pueden emplearse las moléculas pequeñas, tales como oligosacáridos que imitan el dominio de unión de un ligando VLA-4 y ajustan el dominio del receptor de VLA-4. (Ver, J. J. Devlin et.al., 1990, Science 249: 400406 (1990), J. K. Scott and G. P. Smith, 1990, Science 249: 386 390, y la patente U.S. No. 4,833,092 (Geysen) , todas incorporadas por referencia en la presente. Por el contrario, pueden emplearse las moléculas pequeñas que imitan el dominio de unión de un ligando VCAM-1 y ajustan el dominio del receptor de VCAM-1.

Las moléculas pequeñas descritas en WO 06/131200 y en US2007/0004775 , las cuales se incorporan en la presente por referencia, también son apropiadas para el uso en el tratamiento de malignidades hematologicas.

Ejemplos de otras moléculas pequeñas útiles en la invención pueden encontrarse en Komoriya et al. ("The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-Specific Adhesión Site (CS1) Within the Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronectin Is Leucine-Aspartic Acid-Valine", J. Biol. Chem., 266 (23), pp. 15075 79 (1991)). Éstas identifican la secuencia de aminoácido activa mínima necesaria para unir VLA-4 y sintetizarse una variedad de péptidos traslapados a base de la secuencia de aminoácido de la región CS-1 (el dominio de unión VLA-4) de una especie particular de fibronectina . Éstas identificaron un péptido de 8 aminoácidos, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr , así como dos pentapéptidos traslapados más pequeños, Glu-Ile-Leu-Asp-Val y Leu-Asp-Val-Pro-Ser , que poseen actividad inhibidora contra la adhesión celular dependiente de fibronectina . Algunos péptidos más grandes que contienen la secuencia LDV se mostraron subsecuentemente que eran activos in vivo (T. A. Ferguson et al., "T o Integrin Binding Peptides Abrógate T-cell-Mediated Immune Responses In Vivo", Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88, pp. 8072 76 (1991); y S. M. Wahl et al., "Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesión and Recruitment", J. Clin. Invest., 94, pp. 655 62 (1994)). También se ha descrito un pentapéptido cíclico, Arg-Cys-Asp-TPro-Cys (en donde TPro representa 4-tioprolina) , que puede inhibir la adhesión de VLA-4 y VLA-5 a fibronectina . (Ver, por ejemplo, D. M. Nowlin et al. "A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits Alpha4Betal Integrin-mediated Cell Adhesión", J. Biol. Chem., 268(27), pp. 20352 59' (1993); y la publicación del PCT PCT/US91/04862) .

Ejemplos de otros inhibidores de VLA de moléculas pequeñas se han reportado, por ejemplo, en Adams et al "Cell Adhesión Inhibitors", PCT US97/13013, que describe compuestos de peptidilo lineales que contienen aminoácidos beta que tienen actividad inhibidora de la adhesión celular. Las solicitudes de patente internacional WO 94/15958 y WO 92/00995 describen compuestos peptidicos y peptidomiméticos cíclicos con actividad inhibidora de la adhesión celular. Las solicitudes de patente internacional WO 93/08823 y WO 92108464 describen compuestos inhibidores de la adhesión celular que contienen guanidinilo, urea y tiourea. La patente U.S. No. 5,260,277 describe compuestos de modulación de la adhesión celular de guanidinilo.

Tales agentes miméticos de moléculas pequeñas pueden producirse sintetizando una pluralidad de compuestos semi— peptidicos de péptidos, compuestos orgánicos -y después seleccionar estos compuestos por su capacidad para inhibir la interacción de integrina alfa4/ligando de integrina alfa4. Ver, en general, la patente U.S. No. 4,833,092, Scott and Smith, "Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library", Science, 249, pp. 386 90 (1990), y Devlin et al.r "Random Peptide Librarles: A Source of Specific Protein Binding Molecules", Science, 249, pp. 40407 (1990) .

En otras modalidades, un agente que se usa para unir a, que incluye bloquear o recubrir, la integrina alfa4 de superficie celular y/o el ligando de integrina alfa4 es un anticuerpo raonoclonal anti-VLA-4 y/o anti-alfa4beta7 o fragmento de anticuerpo. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos para el tratamiento, en particular para el tratamiento humano, incluyen los anticuerpos humanos, humanizados y quiméricos y los fragmentos de anticuerpos, Fab, Fab' , F(ab')2 y F(v), y monómeros o dimeros de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpos o mezclas de los mismos. Típicamente, el agente de unión es un anticuerpo monoclonal que une VLA-4.

Malignidades hematológicas Se proporcionan métodos para el tratamiento de un paciente que tiene un trastorno hematológico con una composición que contiene un anticuerpo de unión VLA- . Las malignidades hematológicas son trastornos, tal como un cáncer que afecta la sangre, médula ósea y/o nodulos linfáticos..Las malignidades hematológicas incluyen leucemias, tales como ALL, AML, CML, CLL y HCL; linfomas, tales como enfermedad de Hodgkin y linfoma de no Hodgkin; y mieloma múltiple; síndrome mielodisplásico (MDS) (que puede culminar en AML) ; una enfermedad mieloproliferativa, tal como policitemia vera (también llamada PV, PCV o policitemia rubra vera (PRV) ) , trombocitosis esencial (ET) , mielofibrosis ; y amiloide debido a enfermedad de cadena ligera.

Los pacientes que tienen una malignidad hematológica pueden identificarse por análisis del conteo sanguíneo y la película sanguínea mediante, por ejemplo, microscopía luminosa, la cual es útil para identificar células malignas. Una biopsia, tal como de la médula ósea, también puede usarse para identificar células malignas, y una biopsia de un nodulo linfático puede ser útil para identificar una linfadenopatía .

Leucemia mielógena aguda (AML) Un anticuerpo de unión VLA-4 es útil para el tratamiento de una leucemia, tal como AML. Las leucemias son cánceres que se originan en la médula ósea, en donde las células malignas son los glóbulos blancos (leucocitos). La leucemia mielógena aguda (también llamada leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia granulocítica aguda y leucemia no linfocítica aguda) es una malignidad que surge en los granulocitos o monocitos . La AML se caracteriza por el crecimiento descontrolado, exagerado y la acumulación de células llamadas blastos leucémicos, los cuales no funcionan como las células sanguíneas normales, y el bloqueo de la producción de las células de la médula ósea normales, lo que conduce a una deficiencia de los glóbulos rojos (anemia) y plaquetas ( trombocitopenia) y los glóbulos blancos normales (especialmente neutrófilos, es decir, neutropenia) en la sangre .

Todos los subtipos de AML son apropiados para el tratamiento con un anticuerpo de unión de VLA-4. Los subtipos de AML se clasifican con base en la etapa que ha alcanzado el desarrollo de los mieloblastos en el momento del diagnóstico. Las categorías y subgrupos permiten que el médico decida que tratamiento funciona mejor, para el tipo de célula y que tan rápidamente se puede desarrollar la enfermedad. Los subgrupos son: MU, mieloblástico, en análisis especial; Mi, mieloblástico , sin maduración; M2, mieloblástico, con maduración; M3, promielocítico; M4, mielomonocítico; M5, monocítico; M6, eritroleucemia y M7, Megacariocito . Un anticuerpo VLA-4 puede administrarse con un agente secundario que es particularmente conveniente para el subtipo de AML. Por ejemplo, la leucemia promielocítica aguda (APL por sus sigla en inglés) y la leucemia monocítica aguda son subtipos de AML que necesitan un tratamiento diferente que otros subtipos de AML. Un segundo agente para el tratamiento de APL puede incluir todos los ácidos trans retinoicos (ATRA) o un antimetabolito, tal como citarabina. Un segundo agente para el tratamiento de leucemia monocítica aguda puede incluir un análogo de desoxiadenosina, tal como 2-cloro-2'-desoxiadenosina (2-CDA) .

Los factores de riesgo de AML incluyen la presencia de algunos trastornos genéticos, tales como síndrome de Down, anemia de Fanconi, síndrome de Shwachman-Diamond y otros. Un paciente que tiene AML y un trastorno genético puede administrarse un anticuerpo de unión de VLA-4 y un segundo agente para tratar un síntoma del trastorno genético. Por ejemplo, un paciente con AML y anemia de Fanconi, puede administrarse un anticuerpo de unión de VLA-4 y un antibiótico.

Otros'' factores de riesgo para AML incluyen quimioterapia o radioterapia para el tratamiento de un cáncer diferente, humo de tabaco y exposición a grandes cantidades de benceno.

La terapia puede considerarse que es efectiva si hay una diferencia estadísticamente significativa en la tasa o proporción de células malignas en la corriente sanguínea o la médula ósea. La terapia se considera que es efectiva, por ejemplo, cuando se logra la remisión, lo cual es cuando no hay signos de células malignas.

La eficacia para administrar un primer agente y, opcionalmente, un segundo agente, también puede evaluarse con base en, por ejemplo, la disminución del número de células malignas encontradas en la corriente sanguínea, una disminución en la frecuencia o gravedad de la infección bacteriana o viral, aumento de la velocidad de curación de heridas y la sensación general del paciente, incluyendo un aumento en' el nivel de energía y una disminución de dolor en los huesos y articulaciones.

Además de, o antes de los estudios humanos, puede usarse un modelo animal para evaluar la eficacia de usar los dos agentes. Por ejemplo, los ratones pueden ser administrados con un primer y segundo agente descrito en la presente, y luego se evalúan los ratones para los criterios característicos para determinar la eficacia de usar los dos agentes en el modelo. Estos modelos se conocen en la técnica, por ejemplo, ver Drug Discovery Today: Disease Models 3(2): 137-142 (2006); Blood, online March 30, 2009; DOI 10.1182/blood-2009-01-198937; y en la red mundial en emice . nci . nih . gov/emice/mouse_models/organ_models/hema_models /hema_mouse_ tools.

Natalizumab y otros anticuerpos de unión de VLA-4 Los anticuerpos apropiados para el uso en el tratamiento de una malignidad hematológica, tal como AML, incluyen natalizumab, un anticuerpo de unión de integrina OÍ4. Natalizumab (nombre USAN) tiene el número de código de anticuerpo AN 100226, y también se llama "TYSABRI™" . Se muestra en la Tabla 1-1 y la Tabla 1-2 la secuencia de aminoácido de la cadena ligera y la cadena . pesada de natalizumab, antes de cualesquiera modificaciones in vivo (por ejemplo, sujeción de los aminoácidos).

Tabla 1-1: Secuencia de la cadena ligera de Natalizumab (SEC ID NO: 1) 10 20 30 40 50 1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQDIN KYMAWYQQTP GKAPRLLIHY 51 TSALQPGIPS RFSGSGSGRD YTFTISSLQP EDIATYYCLQ YDNLWTFGQG 101 TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD 151 NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL 201 SSPVTKSFNR GEC Tabla 1-2: Secuencia de la cadena pesada de Natalizumab (SEC ID NO: 2) 10 20 30 40 50 Q1VQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFNIK DTYIHWVRQA PGQRLEWMGR IDPANGYTKY DPKFQGRVTI TADTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCAREG YYGNYGVYAM DYWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP SCPAPEFLGG PSVFLFPPKP KDTL ISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW' YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNG EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSR QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLGK 2 """Glutamina ciclizada al ácido piroGlutámico 2La Lisina se remueve de forma de post-traducción El natalizumab inhibe la migración de leucocitos de. la sangre al sistema nervioso central. Natalizumab une' a VLA-4 (también llamado a4ß1) sobre la superficie de las células T activadas y otros leucocitos mononucleares. Puede interrumpir la adhesión entre las células T y las células endoteliales, y de esta manera, prevenir la migración de leucocitos mononucleares a través del endotelio y en el parénquima. Como resultado, también pueden reducirse los niveles de citosinas pro-inflamatorias .

Natalizumab y los anticuerpos de unión de VLA-4 relacionados se describen, por ejemplo, en la patente U.S. No. 5,840,299. Los anticuerpos monoclonales 21.6 y HP1/2 son. ejemplos de los anticuerpos monoclonales de murino que unen VLA-4. Natalizumab es una versión humanizada del anticuerpo monoclonal de murino 21.6 (ver, por ejemplo, la patente U.S. Pat . No. 5, 840, 299). También se ha descrito una versión humanizada de HP1/2 (ver, por ejemplo, patente U.S. Pat. No. 6,602,503). Se describen varios anticuerpos monoclonales de unión de VLA-4 adicionales, tales como HP2/1, HP2/4, L25 y P4C2, por ejemplo, en la patente U.S. No. 6,602,503; Sánchez-Madrid et al., 1986 Eur. J. Inmuno1, 16:1343-1349; Hemler et al., 1987 J. Biol. Chem. 2:11478-11485; Issekutz and Wykretowicz, 1991, J. Immunol, 147: 109 (TA-2 mab) ; Pulido et al., 1991 J. Biol. Chem., 266:10241-10245; y la patente U.S. No. 5, 888, 507) .

Algunos anticuerpos de unión de VLA-4 reconocen epitopos de la subunidad a4 que están involucrados en la unión a un ligando cognado, ¦ por ejemplo, VCAM-1 o fibronectina . Mochos de estos anticuerpos inhiben la unión de VLA-4 a ligandos cognados (por ejemplo, VCAM-1 y fibronectina) .

Algunos anticuerpos de unión 'de VLA-4 pueden interactuar con VLA-4 sobre las -células por ejemplo, linfocitos, pero no causan agregación celular. Sin embargo, otros anticuerpos de unión de VLA-4 se han observado que causan tal agregación. HP1/2 no causa agregación celular. El anticuerpo monoclonal HP1/2 (Sánchez-Madrid et al., 1986) tiene una potencia extremadamente alta, bloquea la interacción de VLA-4 con. VCAM1 y fibronectina, y tiene la especificidad para el epitopo B en VLA-4. Este anticuerpo y otros anticuerpos específicos del epitopo B (tales como los anticuerpos de unión de epitopo Bl o B2; Pulido et al., 1991, supra) representan una clase de anticuerpos de unión de VLA- que puede usarse en las formulaciones y métodos descritos en la presente .

Un anticuerpo VLA-4 ejemplar tiene una o más CDRs, por ejemplo, las tres CDRs de HC y/o las tres CDRs de LC de un anticuerpo particular descrito en la presente, o las CDRs que son, en suma, por lo menos 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% idénticas a tal anticuerpo, por ejemplo, natalizumab. En una modalidad, las espiras hipervariables Hl y H2 tienen la misma estructura canónica que las de un anticuerpo descrito en la presente. En una modalidad, las espiras hipervariables Ll y L2 tienen la misma estructura canónica que las de un anticuerpo descrito en la presente.

En una modalidad, la secuencia de aminoácido de la secuencia de dominio variable HC y/o LC es de por lo menos 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 ó 100% idéntica a la secuencia de aminoácido del dominio variable HC y/o LC de un anticuerpo descrito en la presente, por ejemplo, natalizumab. La secuencia de aminoácido de la secuencia de dominio variable HC y/o LC puede diferir en por lo menos un aminoácido, pero no más de diez, ocho, seis, cinco, cuatro,, tres o dos aminoácidos de la secuencia correspondiente de un anticuerpo descrito en la presente, por ejemplo, natalizumab. Por ejemplo, las diferencias pueden ser principal o completamente en las regiones de marco.

Las secuencias de aminoácido de las secuencias de dominio variable HC y LC pueden codificarse por una secuencia de ácido nucleico que híbrida, bajo condiciones de alta severidad, a una secuencia de ácido nucleico descrita en la presente o una que codifica un dominio variable o una secuencia ' de aminoácido descrita en la presente. En una modalidad, las secuencias de aminoácido de una o más regiones de marco (por ejemplo, FRl, FR2, FR3 y/o FR4) del dominio variable HC y/o LC son por lo menos 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 ó 100% idénticas a las regiones de marco correspondientes de los dominios variables HC y LC de un anticuerpo descrito en la presente. En una modalidad, una o más regiones de marco de cadena pesada o ligera (por ejemplo, HC FR1, FR2 y FR3) son por lo menos 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ó 100% idénticas a la secuencia de las regiones de marco correspondientes de un anticuerpo de la línea germinal de humano .

Los cálculos de la "homología" o la "identidad de secuencia" entre dos secuencias (los términos se usan intercambiablemente en la presente) se realizan como sigue. Las secuencias se alinean para .propósitos de comparación-óptimos (por ejemplo, los espacios pueden introducirse en uno o ambos de una primera y una segunda secuencia de aminoácido o ácido nucleico para la alineación óptima, y puede hacerse caso omiso de las secuencias no homologas para propósitos de comparación). La alineación óptima se determina como · el mejor registro, usando un programa GAP en el paquete de software GCG con una matriz de registro Blossum 62 con una penalidad de espacio de 12, una penalidad de extensión de espacio de 4 y una penalidad de espacio de cambio de marco de 5. Después se comparan los residuos de la secuencia de aminoácido o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido como la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en tal posición (como sé usa en la presente, la "identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a la "homología" del aminoácido o ácido nucleico) . La identidad porcentual entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias.

Como se usa en la presente, el término "híbrida bajo condiciones de alta severidad" describe las condiciones para la hibridación y lavado. La guía para realizar las reacciones de hibridación pueden encontrarse en Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, que se incorpora en la presente por referencia. Los métodos acuosos y no acuosos se describen en tal referencia y pueden encontrarse. Las condiciones de hibridación de alta severidad incluyen la hibridación en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en SSC 0.2X, SDS al 0.1% a 65°C, o condiciones sustancialmente similares.

Ej emplos de los segundos agentes En algunos casos, un método para el tratamiento de un trastorno hematológico incluye administrar un anticuerpo de unión de VLA-4 y un segundo agente terapéutico.

En una implementación, el anticuerpo de unión de VLA-4 y el segundo agente se proporcionan como una co-formulación, y la co-formulación se administra al paciente. Además es posible, por ejemplo, por lo menos 24 horas antes o después de la administración de la co-formulación, administrar separadamente una dosis de la formulación de anticuerpo y luego una dosis de una formulación que contiene el segundo agente. En otra implementación, el anticuerpo y el segundo agente se proporcionan como formulaciones separadas, y la etapa de administración incluye administrar secuencialmente el anticuerpo y el segundo agente. Las administraciones secuenciales pueden proporcionarse el mismo día (por ejemplo, dentro de una hora de uno con respecto a otro, o por lo menos 3, 6 ó 12 horas de separación) o en dias diferentes.

En una modalidad, el anticuerpo y el segundo agente se administran cada uno como una pluralidad de dosis separadas con el tiempo. En general, 1 anticuerpo y el segundo agente se administran cada uno de acuerdo con un régimen. El régimen para uno o ambos puede tener una periodicidad regular. El régimen para el anticuerpo puede tener una periodicidad diferente del régimen para el segundo agente, por ejemplo, se puede administrar más frecuentemente que el otro. En una implementación, uno del anticuerpo y el segundo agente se administra una vez a la semana y el otro una vez al mes. En otra implementación, uno del anticuerpo y el segundo agente se administra continuamente, por ejemplo, durante un periodo de más de 30 minutos, pero menor de 1, 2, 4 ó 12 horas, y el otro se administra como un bolo. El anticuerpo y el segundo agente pueden administrarse mediante cualquier método apropiado, por ejemplo, subcutánea, intramuscular o intravenosamente .

En algunas modalidades, cada uno del anticuerpo y el segundo agente se administra a la misma dosis como cada uno se prescribe para la monoterapia. En otras modalidades, el anticuerpo se administra a una dosificación que es igual a, o menor que, una cantidad requerida para la eficacia si se administra sola. Asimismo, el segundo agente puede administrarse a una dosificación que es igual a, o menor que, una cantidad requerida para la eficacia si se administra sola .

Los ejemplos no limitantes de los segundos agentes para el tratamiento de una malignidad hematológica , tal como AML en combinación con un anticuerpo de unión de VLA-4 incluyen: citarabina (también llamada AraC o citosina arabinosida) , daunorubicina (Daunomicina) , doxorubicina, temozolomida, daunomicina, dactinomicina, epirubicina, idarubicina, esorubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, gemtuzumab ozogamicina, rituximab, ofatumumab, tositumomab, ibritumomab tiuxetan, epratuzumab, alemtuzumab, fludarabina, bis-cloroetilnitrosurea, busulfan, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona , tamoxifen, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostazas de nitrógeno, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina (pentostatina) , 2-clorodesoxiadenosina (cladribina) , 4-hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodesoxiuridina (5-FUdR), melfalan, metotrexato (MTX), colquicina, taxol, vincristina, vinblastina, etoposida (VP-16) , trimetrexato, irinotecano, topotecano, gemcitabina, teniposida, cisplatina, carboplatina y dietilstilbestrol (DES) . Ver, en general, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15ta. Ed. 1987, pp. 1206-1228, Berkow et al., eds. , Rah ay, NJ. Cuando se usan con los dsRNAs caracterizados en la invención, tales agentes quimioterapéuticos pueden usarse individualmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleotido) , secuencialmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleotido, durante un periodo de tiempo seguido por MTX y oligonucleotido) o en combinación con uno o más de otros agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, 5-FU, MTX y oligonucleotido o 5-FU, radioterapia y oligonucleotido) . Los fármacos antiinflamatorios, que incluyen, pero no se limitan a fármacos anti-inflamatorios no esteroideos y corticosteroides y fármacos antivirales, que incluyen, pero no se limitan a: ribavirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, también pueden combinarse en las composiciones caracterizadas en la invención. Ver, en general, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15ta. Ed. , Berkow et et al., eds., 1987, Rahway, N.

J. , páginas 2499-2506 y 46-49, respectivamente).

Un segundo agente terapéutico también puede ser un inhibidor de proteasoma, tal como bortezomib; un inhibidor de Flt3, tal como sorafenib; o un agente de movilización de las células del tallo, tal como plerixafor.

Otros agentes quimiotefapéuticos no ARNi también están dentro del alcance de esta invención.

Dos o más compuestos combinados pueden usarse juntos o secuencialmente.

En algunas modalidades, a un paciente que tiene una malignidad hematológica se administra una terapia además de la administración del anticuerpo de unión VLA-4. Por ejemplo, al paciente se administra una transfusión sanguínea, radioterapia, inmunoterapia o transplante de médula ósea. En una modalidad, el paciente tiene AML y el paciente recibe un transplante de células del tallo sanguíneas, además de un tratamiento de anticuerpo VLA-4.

En algunas modalidades, puede usarse un segundo agente para tratar uno o más síntomas o efectos secundarios de la malignidad. Los efectos secundarios incluyen, por ejemplo, anemia (que puede causar fatiga y falta de respiración) , aumento de infecciones, dolor en los huesos y articulaciones, fiebre moderada, herida o sangrado más fácilmente (por ejemplo, sangrado de encías o nariz o cortes que cicatrizan lentamente) . Tales agentes incluyen, por ejemplo, anticuerpos o suplementos de hierro. Los antibióticos ejemplares incluyen, por ejemplo, aclacinomicinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliquemicina , carabicina, caminomicina , carzinofilina, cromomicinas , dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina anti-metabolitos , tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifiuridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol , mepitiostano, testolactona ; anti-adrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reemplazante de ácido fólico, tal como ácido frolinico; aceglatona;. aldofosfamida glucósido; ácido aminolevulinico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; duocarmicina, maitansina, auristatina, elfomitina; acetato de eliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona ; mitoxantrona (Novantrona) ; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina ; ácido podofilinico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK™; razoxana; \ sizofirano; · espirogermanio; ácido tenuazónico ; triazicuona; 2, 2 ' , 2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosida (también llamada "Ara-C", citarabina y citosina arabinosida) ; ciclofosfamida ; tiotepa; taxanos, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ. ) y docetaxel (TAXOTERE™, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6- ioguanina; mercaptopurina ; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina; platino; etoposida (VP-16) ; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona (Novantrona) ; vincristina; vinorelbina (Navelbina) ; novantrona; teniposida; daunorubicina ( Daunomicina ) ; aminopterina; capecitabina (Xeloda) ; ibandronato; camptotecina-11 (CPT-1) ; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. También se incluyen como acondicionadores celulares quimioterapéuticos apropiados los agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores, tales como anti-estrógenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifen, raloxifeno, 4 ( 5 ) -imidazoles que inhiben aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y anti-andrógenos , tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, goserelina, doxorubicina, daunorubicina, duocarmicina, vincristina y vinblastina.

En algunas modalidades, el segundo agente es un segundo anticuerpo de unión de anti-alfa4 o un anticuerpo biespecífico . Por ejemplo, un anticuerpo de unión de VLA-4 y un anticuerpo de unión alfa4beta7 (o fragmento del mismo) puede administrarse para el tratamiento de una malignidad hematológica .

Además de un segundo agente, también es posible liberar aún otros agentes al paciente. Sin embargo, en algunas modalidades, el anticuerpo no proteinico o no biológico, además del anticuerpo de unión de VLA-4 y el segundo agente, se administran al paciente como una composición farmacéutica. El anticuerpo de unión de VLA-4 y el segundo agente pueden ser solamente agentes que se liberan por inyección. En las modalidades en las que el anticuerpo de unión de VLA-4 y el segundo agente son proteínas recombinantes , el anticuerpo de unión de VLA-4 y el segundo agente pueden ser solamente agentes recombinantes administrados al paciente, o por lo menos sólo los agentes recombinantes que ·¦ modulan las respuestas inmunes o inflamatorias. En aún otras modalidades, el anticuerpo de unión de VLA-4 sólo es el único agente recombinante o el único biológico administrado al paciente.

Composiciones farmacéuticas Las composiciones descritas en la presente se formulan como composiciones farmacéuticas. Típicamente, una composición farmacéutica incluye un vehículo farmacéuticamente- aceptable. Como se usa en la presente, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes de retraso isotónicos y absorción, y similares, que son fisiológicamente compatibles .

Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que mantiene la actividad biológica deseada del anticuerpo y no imparte ningunos efectos toxicológicos indeseados (ver, por ejemplo, Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición ácida y las sales de adición de bases. Las sales de adición ácida incluyen las derivadas de los ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico y similares, así como los ácidos orgánicos no tóxicos, tales como ácidos mono y dicarboxílieos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, aminoácidos libres y similares. Las sales de adición de bases incluyen los derivados de los metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, asi como de las aminas orgánicas no tóxicas, tales como ?,?'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaina, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaina y similares.

Típicamente, los agentes fisiológicamente compatibles, tales como los aminoácidos libres, las sales de clorhidrato, sales de sodio o sales de potasio de los aminoácidos libres, se usan como excipientes en las formulaciones farmacéuticas para promover la estabilidad del anticuerpo. Las formulaciones en la presente pueden incluir aditivos, tales como glicerol, manitol, sorbitol y otros polioles, así como azúcares (por ejemplo sucrosa), para promover la estabilidad.

Las composiciones farmacéuticas que contienen anticuerpos de unión de VLA-4 pueden estar en la forma de una solución líquida (por ejemplo, soluciones inyectables o por infusión) , Tales composiciones pueden administrarse mediante un modo parenteral (por ejemplo, subcutáneo, intraperitoneal o intramuscular) . Las frases " administración parenteral" y "administrado parenteralmente" como se usan en la' presente, significan los modos de administración diferentes de la administración enteral o tópica, usualmenté por inyección, e incluyen, la administración subcutánea o intramuscular, asi como inyección ¦ e infusión intravenosa, intracapsular, intraorbital , intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcuticular , subcapsular, subaracnoide, intraspinal, epidural, intrahepática, intrarticular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intralinfática, intracraneal e intrasternal . En algunas modalidades, una sustancia, tal como hialuronidasa puede administrarse antes del anticuerpo para permitir que grandes cantidades del anticuerpo sean administradas subcutáneamente. En una modalidad, las formulaciones descritas en la presente se administran subcutáneamente.

Las composiciones farmacéuticas son estériles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento. Una composición farmacéutica también puede probarse para asegurar que satisfaga los estándares reguladores e industriales para la administración.

Una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo de unión VLA-4 puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada apropiada para una concentración de anticuerpo alta. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando un agente descrito en la presente, en la cantidad requerida en un solvente apropiado con una o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente., conforme se requiera, seguido de esterilización filtrada. En general, las dispersiones se preparan incorporando un agente descrito en la presente, en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos . La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Métodos para elaborar las formulaciones de anticuerpos Las formulaciones que contienen las formulaciones . del anticuerpo de unión de VLA-4 pueden elaborarse como se describe en la Solicitud Publicada U.S. 2005/0053598, o en WO2008157356. Los contenidos de ambas solicitudes se incorporan en la presente por referencia.

Administración Una composición que contiene un anticuerpo de unión de VLA-4 puede administrarse a un paciente, por ejempld, un paciente humano, que tiene una malignidad hematológica , tal como AML, mediante una variedad de métodos. Típicamente, el anticuerpo de unión de VLA-4 se administra parenteralmente, tal como mediante técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular , intrasinovial, intrasternal , intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal. En algunas modalidades, se administra intranasalmente una composición que contiene el anticuerpo.

La dosificación y la tasa de la dosis de una composición que contiene un anticuerpo de unión de VLA-4 o un fragmento de anticuerpo efectivo para prevenir, suprimir o inhibir la adhesión celular, dependerá de una variedad de factores, tales como la naturaleza del anticuerpo o fragmento, el tamaño del paciente, el objetivo del tratamiento, la naturaleza de la patología a ser tratada, la composición farmacéutica específica usada y el juicio del médico tratante. Son útiles los niveles de dosificación de entre aproximadamente 0.001 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día, por ejemplo, entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal por día del compuesto de ingrediente activo. Típicamente, el anticuerpo VLA-4 y fragmento de anticuerpo, será administrado a una dosis que oscila entre aproximadamente 0.1 mg/kg de peso corporal/día y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal/día, por ejemplo, entre aproximadamente 0.1 mg/kg de peso corporal/día y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, en intervalos de cada 1-90 dias. Una composición de anticuerpo puede administrarse en una cantidad efectiva para proporcionar un nivel de plasma de anticuerpo de por lo menos 1 mg/ml. La optimización de las dosificaciones puede determinarse mediante la administración de los agentes de unión, seguido de la valoración del recubrimiento de las células VLA-4 positivas por el agente, durante un tiempo después de administrarse a una dosis dada in vivo.

La composición puede administrarse como una dosis fija, o en una dosis de mg/kg. Típicamente, la administración es en una dosis fijada. Por ejemplo, la formulación puede administrarse a una dosis unitaria fijada de entre 1 mg y 500 mg (por ejemplo, 1 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg) cada 4 semanas (por ejemplo, al mes), o entre 50 mg y 250 mg (por ejemplo, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg) cada dos semanas, o entre 25 mg y 150 mg (por ejemplo, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 125 mg) una vez a la semana. La formulación también puede administrase en un bolo a una dosis de entre 1 y 8 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 6.0, 4.0, 3.0, 2.0, 1.0 mg/kg. Los intervalos de dosis modificada incluyen una dosis que es menor de 500, 400, 300, 250, 200, 150 ó 100 mg/paciente, típicamente para la administración cada cuarta semana o una vez al mes. En una modalidad, la dosificación total es de 50 a 1200 mg (por ejemplo, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1000 mg ó 1100 mg) cada 28 días. El anticuerpo de unión de VLA-4 puede administrarse, por ejemplo, cada tres a nueve semanas, por ejemplo, cada cuarta semana, cada quinta semana, cada sexta semana, cada séptima semana o cada octava semana.

Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada, por ejemplo, una respuesta terapéutica. La dosis también puede elegirse para reducir o evitar la producción de los anticuerpos contra el anticuerpo de unión de VLA-4, para lograr una saturación mayor de 40, 50, 70, 75 u 80% de la subunidad OÍ4, para lograr una saturación menor de 80%, 70%, 60%, 50% ó 40% de la subunidad a4, o para evitar un aumento del nivel de circulación de los glóbulos blancos .

La toxicidad y la eficacia terapéutica del anticuerpo de unión de VLA-4 pueden determinarse por los procedimientos farmacéu icos estándares en los cultivos celulares o los animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal a 50% de la población) y ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) . La relación de dosis entre los efectos tóxico y terapéutico en el índice terapéutico como expresarse como la relación LD50/ED50. Son- típicos los compuestos que exhiben índices terapéuticos altos.

Los datos obtenidos de las pruebas de cultiVo celular y los estudios en animales- pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para el uso en humanos. La dosificación de la composición, en general, se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones de circulación, que incluyen ED50 con poca o sin toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración usada. Para cualquier compuesto usado en los métodos caracterizados en la invención, -la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente de las pruebas de cultivo celular. Una dosis puede formularse en modelos animales para alcanzar un intervalo de concentración en plasma de circulación del compuesto o, cuando sea apropiado, del producto polipeptidico de una secuencia blanco (por ejemplo, alcanzar una concentración disminuida del polipéptido) que incluye la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza una inhibición máxima media de los síntomas) como se determina en el cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar exactamente las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución.

En algunas modalidades, el agente activo ¦ puede prepararse con un vehículo que protegerá el anticuerpo contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de liberación microencapsulados . Pueden usarse polímeros biodegradables , biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados, o en general, son conocidos. Ver, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada, por ejemplo, una respuesta terapéutica. Una "respuesta terapéutica" es un mejoramiento en una afección, síntoma o parámetro asociado con un trastorno, ya sea a un grado estadísticamente significativo o a un grado detectable por un experimentado en la técnica.

La forma de dosificación unitaria o "dosis fijada" como se usa en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas apropiadas como dosificaciones unitarias para los pacientes que van a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de un anticuerpo activo, calculada para produ'cir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido y, opcionalmente, en asociación con otro agente.

Una composición farmacéutica puede incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo de unión de VLA-4, por ejemplo, natalizumab, descrito en la presente. Tales cantidades efectivas pueden determinarse con base en el efecto del agente administrado o el efecto combinatorio de un agente y un agente secundario si se usa más de un agente. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente también puede variar de acuerdo con factores, tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo, por ejemplo, mejoramiento de por lo menos un parámetro de trastorno, por ejemplo, un parámetro de AML, o mejoramiento de por lo menos un síntoma del trastorno, por ejemplo, AML. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la que cualquiera de los efectos tóxicos o perjudiciales de la composición se sobrepasan por los efectos terapéuticamente benéficos.

Dispositivos y kits Las composiciones que contienen un anticuerpo de unión de VLA-4 (por ejemplo, natalizumab) para el tratamiento de una malignidad hematológica, tal como AML, pueden administrarse con un dispositivo médico. El dispositivo puede diseñarse con, o tener las características, tales como capacidad portátil, almacenamiento a temperatura ambiente y facilidad de uso, de modo que pueda usarse en situaciones de emergencia, por ejemplo, por un paciente no entrenado o por personal de emergencia en el campo, removido de las instalaciones médicas y otro equipo médico. El dispositivo puede incluir, por ejemplo, uno o más alojamientos para almacenar las preparaciones farmacéuticas que incluyen un anticuerpo de unión de VLA-4 (por ejemplo, natalizumab) y puede configurarse para liberar una o más dosis unitarias del agente .

Por ejemplo, la composición farmacéutica puede administrarse con un dispositivo de liberación transcutáneo, tal como una jeringa,- incluyendo una jeringa hipodérmica o multicámara. En una modalidad, el dispositivo es una jeringa prellenada con una aguja unida o integral. En otras modalidades, el dispositivo es una jeringa prellenada que no tiene una aguja anexada. La aguja puede envasarse con una jeringa prellenada. En una modalidad, el dispositivo es un dispositivo de auto-inyección, por ejemplo, una jeringa de auto-inyector. En otra modalidad, el dispositivo de inyección es un inyector de pluma. En otra modalidad, la jeringa es una jeringa con aguja sujetada, jeringa de cierre luer o jeringa de deslizamiento luer. Otros dispositivos de liberación apropiados incluyen stents, catéteres, microagujas y dispositivos de liberación controlados, implantables . La composición puede administrarse intravenosamente con el equipo IV estándar, incluyendo, por ejemplo, tubos IV, con o sin filtros en linea. En ciertas modalidades, el dispositivo será una jeringa para el uso en la administración SC o IM.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmico sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las patentes U.S. Nos. 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824, o 4,596,556. Ejemplos de los implantes y módulos bien conocidos incluyen: Patente U.S. No. 4,487,603, que describe una bomba de micro-infusión implantable para repartir el medicamento a una velocidad controlada; patente U.S. No. 4,486,194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar los medicamentos a través de la piel; patente U.S. No. 4,447,233, que describe una bomba de infusión de medicación para liberar la medicación a una velocidad de infusión precisa; patente U.S. No. 4,447,224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para la liberación continua del fármaco; patente U.S. No. 4,439,196, que describe un sistema de liberación osmótica del fármaco que tiene un compartimiento multi-cámara; y la patente U.S. No. 4,475,196, que describe un sistema de liberación osmótica del fármaco. La composición terapéutica también puede estar en la forma de una formulación de liberación prolongada biodegradable o no biodegradable para la administración subcutánea o intramuscular. Ver, por ejemplo, la patente U.S. Nos. 3,773,919 y 4,767,628 y la solicitud del PCT No. WO 94/15587.

La administración continua también puede lograrse usando una bomba implantable o externa. La administración también puede llevarse a cabo intermitentemente, por ejemplo, inyección diaria simple, o continuamente a una baja dosis, por ejemplo, formulación de liberación prolongada. El dispositivo de liberación puede modificarse para adecuarse óptimamente para la administración del anticuerpo de unión de VLA-4. Por ejemplo, una jeringa puede siliconizarse a un grado que sea óptima para el almacenamiento y liberación del anticuerpo anti-VLA-4. Por supuesto, también son conocidos muchos otros de estos implantes, sistemas de liberación y módulos.

La invención también caracteriza un dispositivo para administrar un primer y segundo agente. El dispositivo puede incluir, por ejemplo, uno o más alojamientos para almacenar preparaciones farmacéuticas, y puede configurarse para liberar las dosis unitarias del primer y segundo agente. El primer y segundo agentes pueden almacenarse en el mismo o en compartimientos separados. Por ejemplo, el dispositivo puede combinar los agentes antes de la administración. También es posible usar diferentes dispositivos para administrar el primer y segundo agente.

Un anticuerpo . de unión de VLA-4 (por ejemplo, natalizumab) puede proporcionarse en un kit. En una modalidad, el kit incluye (a) un recipiente que contiene una composición que incluye una alta concentración del anticuerpo de unión de VLA-4, opcionalmente (b) un recipiente que contiene una composición que incluye un segundo agente y opcionalmente (c) material de información. El material de información puede ser descriptivo, instruccional , comercialización u otro material que se relaciona con los métodos descritos en la presente y/o el uso de los agentes para el beneficio terapéutico.. En una modalidad, el kit también incluye un segundo agente, por ejemplo, un agente quimioterapéutico . Por ejemplo, el kit incluye un primer recipiente que contiene una composición que incluye el anticuerpo de unión de VLA-4 y un segundo recipiente que incluye el segundo agente. En una modalidad, el kit incluye uno o más jeringas de un sólo uso, pre-llenadas con una formulación de anticuerpo liquido de alta concentración descrita en la presente.

El material de información de los kits no se limita en su forma. En una modalidad, el material de información puede incluir información acerca de la producción del anticuerpo, concentración, fecha de expiración, lote o información del sitio de producción, etcétera. En una modalidad, el material de información se relaciona con métodos para administrar el anticuerpo de unión de VLA-4 (por ejemplo, natalizumab) , por ejemplo en una dosis apropiada, forma de dosificación o modo de administración (por ejemplo, una dosis, forma de dosificación o modo de administración descrito en la presente) , para tratar a un paciente que tiene una malignidad hematológica (por ejemplo, AML) o que está en riesgo de experimentar un . episodio asociado con una malignidad hematológica. La información puede proporcionarse en una variedad de formatos, que incluyen texto impreso, material legible por computadora, video grabación o grabación de audio, o información que proporciona un enlace o dirección al material sustantivo.

•Además del agente, la composición en el kit puede incluir otros ingredientes, tales como un solvente o amortiguador o un conservador. El agente puede proporcionarse en cualquier , forma, por ejemplo, forma liquida, seca o liofilizada, y en la forma sustancialmente pura y/o estéril. Cuando los agentes se proporcionan en una solución liquida, la solución liquida es, por ejemplo, una solución acuosa. Cuando se proporcionan los agentes como una forma seca, en general, la reconstitución es mediante la adición de un solvente apropiado. El solvente, por ejemplo, agua estéril o amortiguador, puede proporcionarse opcionalmente en el kit.

El kit puede incluir uno o más recipientes . para la composición o composiciones que contiene los agentes. En algunas modalidades, el kit contiene recipientes separados, divisores o compartimientos para la composición y material de información. Por ejemplo, la composición puede estar contenida en una botella, ampolla o jeringa, y el material de información puede estar contenido en un manguito o empaque de plástico. En otras modalidades, los elementos separados del kit están contenidos dentro . de un recipiente simple, no dividido. Por ejemplo, la composición está contenida en una botella, ampolla o jeringa, que tiene anexada a la misma el material de información en la forma de una etiqueta. En algunas modalidades, el kit incluye una pluralidad (por ejemplo, un empaque) de recipientes individuales, conteniendo cada uno, una o más formas de dosificación unitaria (por ejemplo, una forma de dosificación descrita en la presente) de los agentes. Los recipientes pueden incluir una combinación de dosificación unitaria, por ejemplo, una unidad que incluye el anticuerpo de unión de VLA-4 (por ejemplo, natalizumab) y el segundo agente, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, en una relación deseada. Por ejemplo, el kit incluye una pluralidad de jeringas, ampollas, empaques de lámina, empaques de burbuja o dispositivos médicos, por ejemplo, que contiene cada uno una combinación simple de dosis unitaria. Los recipientes de los kits pueden ser herméticos al aire (por ejemplo, impermeables a los cambios en la humedad o evaporación) y/o herméticos a la luz.

Opcionalmente, el kit incluye un dispositivo apropiado para la administración de la composición, por ejemplo, una jeringa u otro dispositivo de liberación apropiado. El dispositivo puede proporcionarse pre-cargado con uno o ambos de los agentes o puede estar vacio, pero apropiado para la carga .

Generación de anticuerpos Los anticuerpos que unen a VLA-4 pueden generarse por inmunización, por ejemplo, usando un animal, o mediante los métodos in vitro, tal como exhibición del fago. Todo o parte de VLA-4 puede usarse como un inmunógeno. Por ejemplo, la región extracelular de la subunidad A puede usarse como un inmunógeno. En una modalidad, el animal inmunizado contiene células que producen inmunoglobulina con locus de inmunoglobulina natural, humana o parcialmente humana. En una modalidad, el animal no humano incluye por lo menos una parte de un gen de inmunoglobulina de humano. Por ejemplo, es posible diseñar cepas de ratón deficientes en la producción del anticuerpo de ratón, con grandes fragmentos del locus de Ig humano. Usando la tecnología de hibridoma, pueden producirse y seleccionarse los anticuerpos monoclonales específicos del antígeno derivados de los genes con . la especificidad deseada. Ver, por ejemplo, XenoMouse™, Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994), U.S. 2003-0070185, patente U.S. No. 5,789,650 y O 96/34096.

También pueden producirse anticuerpos no humanos a VLA-4, por ejemplo, en un roedor. El anticuerpo no humano puede ser humanizado, por ejemplo, como se describe en la patente U.S. No. 6,602,503, EP 239 400, patente U.S. No. 5,693,761, y patente U.S. No. 6,407,213.

EP 239 400 (Winter et al.) describe alterar los anticuerpos por sustitución (dentro de una región variable dada) de sus regiones de determinación de complementariedad (CDRs) para una especie con las de otra. Los anticuerpos sustituidos de CRD pueden ser menos probables para provocar una respuesta inmune en los humanos, comparado con los anticuerpos quiméricos reales, debido a que los anticuerpos sustituidos de CDR contienen considerablemente menos componentes no humanos. (Riechmann et al, 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536).

Típicamente, las CDRs de ' un anticuerpo de murino sustituido en las regiones correspondientes en un anticuerpo humano, usando la tecnología de ácidos nucleicos recombinantes para producir las secuencias que codifican el anticuerpo sustituido deseado. Los segmentos del gen de región constante de humano del isotipo deseado (a menudo gamma I para CH y kappa para CL) pueden adicionarse, y los genes de cadena pesada y ligera humanizados pueden coexpresarse en células de mamíferos para producir un anticuerpo humanizado soluble.

Queen et al., 1989 y WO 90/07861 han descrito un proceso que incluye la elección de las regiones de marco V de humano por análisis de¦ computadora para la homología de secuencia proteínico óptima al marco de la región V del anticuerpo de murino, y modelar la estructura terciaria de la región V de murino para visualizar los residuos de aminoácido del marco que son probables que interactúen con las CDRs de murino. Estos residuos de aminoácidos de murino después se superimponen en el marco de humano homólogo. Ver también las patentes U.S. Nos. 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089 y 5,530,101. Tempest et al., 1991, Biotechnology 9, 266-271, usan, como estándar, los marcos de la región V derivados de NEWM y cadenas pesada ligera de REI, respectivamente, para injerto de CDR sin la introducción de radical de residuos de ratón. Una ventaja de usar el método de Tempest et al. para construir los anticuerpos humanizados a base de NEWM y REI, es que las estructuras tridimensionales de las regiones variables de NEWM y REI son conocidas de la cristalografía de rayos X y, de esta manera, pueden modelarse las interacciones especificas entre las CDRs y los residuos de marco de región V. Los anticuerpos de no humano pueden modificarse para incluir las sustituciones que insertan las secuencias de inmunoglobulina de humano, por ejemplo, los residuos de aminoácido de consenso en las posiciones particulares, por ejemplo, en una o más (tales como por lo menos cinco, diez, doce o todas) de las siguientes posiciones: (en el FR del dominio variable de la cadena ligera) 4L, 35L, 36L, 38L, '43L, 44L, 58L, 46L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L, 67L, 68L, 69L, 70L, 71L, 73L, 85L, 87L, 98L y/o (en la FR del dominio variable de la cadena pesada) 2H, 4H, 24H, 36H, 37H, 39H, 43H, 45H, 49H, 58H, 60H, 67H, 68H, 69H, 70H, 73H, 74H, 75H, 78H, 91H, 92H, 93H y/o 103H (de acuerdo con la numeración de Kabat) . Ver, por ejemplo, la patente U.S. No. 6,407,213.

Los anticuerpos monoclonales completamente de humano que unen a VLA-4 pueden proporcionarse, por ejemplo, usando los esplenocitos de humano cebados in vitro, como se describe por Boerner et al., 1991, J. Immunol . , 147, 86-95. Pueden prepararse por el repertorio de clonación como se describe por Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432-2436 o por Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236; también la patente U.S. No. 5,798,230. Las grandes bibliotecas de exhibición del fago de humano no humanizadas también pueden usarse para aislar los anticuerpos de alta afinidad que pueden desarrollarse como terapéuticos humanos usando la tecnología de fago estándar (ver, por ejemplo, Vaughan et al, 1996; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4: 1-20; and Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8; U.S. 2003-0232333).

Producción de anticuerpos Los anticuerpos pueden producirse en células procariotas y eucariotas. En una modalidad, los anticuerpos (por ejemplo, scFvs) se expresan en una célula de levadura, tal como Pichia (ver, por ejemplo, Powers et al. (2001) J Immunol Methods. 251: 123-35), Hanseula o Saccharomyces .

En una modalidad, los anticuerpos, particularmente los anticuerpos de longitud total, por ejemplo, IgGs, se producen en células de mamífero. Ejemplos de las células huésped de mamíferos para la expresión recombinante incluyen células de ovario de hámster Chino (células CHO) (que incluyen las células dhfr-CHO, descritas en Urlaub and Chasin (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usados con un marcador seleccionado DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), líneas de células linfocíticas , por ejemplo, células de mieloma NSO y células SP2, células COS, K562 y una célula de un animal transgénico, por ejemplo, un mamífero transgénico. Por ejemplo, la célula es una célula epitelial de mamífero.

Además de la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de inmunoglobulina, los vectores de expresión recombinante pueden portar secuencias de ácido nucleicos adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en las células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionados. El gen marcador seleccionado facilita la selección de las células huésped en las que el vector se ha introducido (ver, por ejemplo, las patentes - U.S. Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017). Ejemplos de los genes marcadores seleccionados incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para el uso en las células huésped dhfr con la selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para la selección de G418) .

En un sistema ejemplar para la expresión recombinante de · un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de longitud total o una porción de unión del antígeno del mismo) , un vector de expresión recombinante que codifica la cadena pesada de anticuerpo y la cadena ligera de anticuerpo se introduce en las células CHO dhfr por la transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo sé enlazan cada uno operativamente a elementos reguladores de mejorador/promotor (por ejemplo, derivados de adenovirus SV40, CMV y similares, tales "como un elemento regulador mejorador de CMV/promotor de AdMLP o un elemento regulador de mejorador de SV40/promotor de AdMLP) para accionar los niveles altos de la transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando la selección/amplificación de metotrexato. Las células transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Las técnicas estándares de la biología molecular se usan para preparar el vector de expresión recombinante, para transfectar las células huésped, para seleccionar transformantes, para cultivar las células huésped y para recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Por ejemplo, algunos anticuerpos pueden aislarse por cromatografía de afinidad con una proteína A o proteína G. Por ejemplo, los anticuerpos de unión de VLa-4, por ejemplo, natalizumab, pueden concentrarse . de aproximadamente 100 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL usando las técnicas de concentración de proteínas estándares.

Los anticuerpos también pueden incluir modificaciones, por ejemplo, modificaciones que alteran la función de Fe, por ejemplo, para disminuir o remover la interacción con un receptor de Fe o con Clq, o ambos. Por ejemplo, la región constante de IgGl puede mutarse en uno o más residuos, por ejemplo, uno o más de los residuos 234 y 237, por ejemplo, de acuerdo con la numeración en la patente U.S. No. 5,648,260. Otras modificaciones ejemplares incluyen las descritas en la patente U.S. No. 5,648,260.

Para algunos anticuerpos que incluyen un dominio Fe, el sistema de producción del anticuerpo puede diseñarse para sintetizar anticuerpos en los que la región Fe está glucosilada. Por ejemplo, el dominio Fe de las moléculas de IgG está glucosilado en asparagina 297 en el dominio CH2. Esta asparagina es el sitio de modificación con oligosacáridos de tipo bi-antenarios . Esta glucosilación participa en las funciones efectoras mediadas por los recetores de Fcy y Clq de complemento (Burton and oof (1992) Adv. Immunol. 51:1-84; Jefferis et al. (1998) Immunol . Rev. 163: 59-76) . El dominio Fe puede producirse en un sistema de expresión de mamífero que glucosila apropiadamente el residuo que corresponde a asparagina 297. El dominio Fe también puede incluir otras modificaciones post-traducción eucariotas.

Los anticuerpos también pueden producirse por un animal transgénico. Por ejemplo, la patente - U.S. No. 5,849,992 describe un método para expresar un anticuerpo en la glándula mamaria de un mamífero transgénico. Un transgen se construye de forma que incluye un promotor específico de leche y secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo de interés, por ejemplo, un anticuerpo descrito en la presente, y una secuencia de señal para la secreción. La leche producida por las hembras de tales mamíferos transgénicos incluye, secretado en la presente, el anticuerpo de interés, por ejemplo, un anticuerpo descrito en la presente. El anticuerpo puede ser purificado de la leche, o para algunas aplicaciones, usado directamente.

Los ??^? e^?ß pueden ser modificados, por ejemplo, con un radical que mejora su estabilización y/o retención en circulación, en la sangre, suero, linfa, lavado broncoalveolar u otros tejidos, por ejemplo, en por lo menos 1.5, 2, 5, 10 ó 50 veces.

Por ejemplo, el anticuerpo de unión de VLA-4 puede asociarse con un polímero, por ejemplo, un polímero sustancialmente no antigénico, tal como un óxido de polialquileno o un óxido de polietileno. Los polímeros apropiados variarán sustancialmente con el peso. Pueden usarse los polímeros que tienen pesos moleculares promedios ponderales que oscilan de aproximadamente 200 a aproximadamente 35,000 daltons (o aproximadamente 1,000 a aproximadamente 15,000 y 2,000 a ' aproximadamente 12,500).

Por ejemplo, un anticuerpo de unión de VLA-4 puede conjugarse a un polímero soluble en agua, por ejemplo, un polímero de polivinilo hidrofílico, por ejemplo, alcohol polivinílico o polivinilpirrolidona . Una lista no limitante de tales polímeros incluye homopolímeros de óxido de polialquileno, tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros de bloque de los mismos, con la condición de que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros de bloque. Los polímeros útiles adicionales incluyen polioxialquilenos , tales como polioxietileno, polioxipropileno y copolímeros de bloque de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics) ; polimetacrilatos ; carbómeros; polisacáridos ramificados d lineales que comprenden los monómeros de sacáridos D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido : D-glucurónico, ácido siélico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (por ejemplo, ácido polimanurónico o ácido alginico) , D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico, incluyendo homopolisacáridos y heteropolisacáridos , tales como lactosa, amilopectina, almidón, hidroxietil almidón, amilosa, sulfato de déxtrano, dextrano, dextrinas, glucógeno o la subunidad de polisacárido de los monopolisacáridos ácidos, por ejemplo, ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar, tales como polisorbitol y polimanitol; heparina o heparon. Todas las referencias y publicaciones incluidas en la presente se incorporan por referencia.

Los siguientes ejemplos no se pretende que sean limitantes.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos demuestran que el anticuerpo de unión de VLA-4, natalizumab, bloquea la adhesión mediada por VLA-4 de las lineas celulares de mieloma y leucemia a los ligandos VCAM-1 y fibronectina, así como a las células estromales de la médula ósea en los experimentos de co-cultivo. El tratamiento de estas líneas celulares con natalizumab se muestra que interrumpe las rutas de señalización de la supervivencia y aumenta la sensibilidad de las células a agentes citotóxicos. De esta manera, La adhesión de VLA-4 está involucrada en la supervivencia y la quimiorresistencia de las malignidades hematologicas, y tal interrupción de estas interacciones con un anticuerpo de unión de VLA-4, tal como natalizumab, es un método terapéutico válido.

Ejemplo 1. VLA-4 se expresa en las líneas de células tumorales hematologicas El microambiente de la médula ósea está involucrado en el desarrollo de células progenitoras linfoides y mieloides, y también confiere un ambiente protector a las malignidades que surgen de estos tipos de células. Las interacciones de adhesión mediada por integrina entre las células estromales de la médula ósea y las células tumorales, confieren una ventaja citoprotectora en los modelos de co-cultivo.

Como se muestra a continuación, VLA-4 de -integrina se expresa ampliamente en las malignidades hematologicas. VLA-4 se acopla con fibronectina en la matriz de la médula ósea y la molécula 1 de adhesión celular vascular (VCAM-1 o CD106) sobre la superficie de las células estromales de la médula ósea y activa una variedad de rutas de señalización de prosupervivencia en la célula tumoral.

Se observó la expresión de VLA-4 en las lineas celulares tumorales hematologicas para AML, MM y CML (Figuras 1A, IB y 1C) .

Los experimentos de la citometria de flujo se realizaron para verificar el nivel de la expresión de VLA-4 sobre las lineas de células tumorales, y se observó la expresión de VLA-4 sobre todas las líneas celulares probadas (Figura 1) . La unión de natalizumab a las líneas celulares de AML, CLL y MM se determinó por citometría de flujo como se muestra en la Figura 2. En todos los casos, se observó una unión saturable y las afinidades calculadas de natalizumab (valores EC50) se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Cuantificación de la unión de natalizumab a las líneas celulares EC50 (nM) IC50 (nM) FN VCAM BMSC AML HL60 0.19 0.50 0.92 13.70 KG1 0.22 0.1 0.19 nd MM U266 0.30 0.4 0.26 0.53 H929 0.80 0.4 0.45 1.74 CLL Mecí 0.11 0.39 0.22 nd JM1 0.28 11.56 0.19 nd Ejemplo 2. Unión inhibida de natalizumab de las células tumorales a los ligandos de VLA-4.

Los experimentos se realizaron para probar si un antagonista de VLA-4 puede inhibir la unión de las células tumorales a un ligando de VLA-4. Las líneas celulares se dejaron adherir a las paredes recubiertas con fibronectina (· FN) , proteína de fusión de Ig de la molécula 1 de adhesión vascular (¦ VCAM-Ig) o células estromales de la médula ósea ( A ABMSC) , en presencia de cantidades aumentadas de natalizumab o el anticuerpo de control de isotipo. Los resultados demostraron la capacidad de natalizumab para inhibir la adhesión de diferentes tipos de células tumorales a los ligandos de VLA-4 de una manera dependiente de la dosis (Figuras 3A, 3B, 4A, 4B, 5A y 5C) . Los valores IC5o calculados para la inhibición de natalizumab de la adhesión se muestran en la Tabla 2. También se probó el nivel obtenido de forma máxima de la inhibición de la unión de células tumorales a los ligandos de VLA-4 en presencia de niveles de saturación de natalizumab (barras oscuras) o el control de isotipo (barras claras), y los resultados se muestran en las Figuras 3C, 3D, 4C y 5C. Natalizumab se mostró que inhibe la unión en todos los tipos celulares probados. Tomados juntos, los datos anteriores demuestran claramente la capacidad de natalizumab de unir con una afinidad alta a las células tumorales que expresan VLA-4, e inhibir efectivamente las interacciones de adhesión mediadas por VLA-4 en estas células .

Ejemplo 3. Resistencia del fármaco mediada por la adhesión abrogada de natalizumab de células HL60 de A L .

El cultivo de la línea celular HL60 de AML en presencia de BMSC confirió una ventaja protectora a las células cuando se trataron con el agente quimioterapéutico ara-C, como se muestra en la Figura 6A. Las células se cultivaron durante 24 horas con (¦) o sin (°) BMSC, luego se expusieron al fármaco de quimioterapia AraC (citarabina) durante 24 horas (Figura 6A) . La viabilidad celular se mejoró por la presencia de BMSC. Cuando se combinó natalizumab con ara-C a una concentración mostrada que era efectiva a una viabilidad disminuida en el co-cultivo en esta prueba (10 µ?) , hubo un aumento en el porcentaje de las células que experimentan apoptosis, como se muestra en la Figura 6B . Estos- datos indican que natalizumab puede superar el efecto citoprotector de BMSC, sugiriendo que podría ser efectivo para superar la resistencia del fármaco mediada por la adhesión de VLA-4.

Experimentos similares con la línea celular U226 de MM indicaron que natalizumab no tuvo un efecto citoprotector contra el fármaco melfalan (Figuras 6C y 6D) .

Ejemplo 4. Tratamiento de natalizumab inhibido por la señalización de la supervivencia inducida por co-cultivo a través de P-STAT3.

Las células' HL60, KG1 o U266 se crecieron en suspensión o co-cultivo con BMSCs y natalizumab, como se indica, durante 30 minutos (HL60) ó 4 horas (U266) , y luego las células se separaron de BMSCs, y se procesaron para el análisis de Western blot, para determinar los niveles de P-STAT3, STAT3, P-JNK, JNK, P-MAPK y MAPK (Figura 7) .

Los resultados indicaron que la señalización de supervivencia inducida por el co-cultivo a través de P-STAT3 puede ser inhibida por el tratamiento con natalizumab.

Los resultados de los experimentos anteriores indicaron que los anticuerpos de VLA-4, tales como natalizumab, pueden ser terapéuticos efectivos en las malignidades hematologicas.

Otras modalidades se encuentran en las reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Método para el tratamiento de leucemia mielógena aguda (AML) en un paciente, caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un anticuerpo de integrina anti-alfa4 o un fragmento de unión de antigeno del mismo.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo de integrina anti-alfa4 o fragmento de unión de antigeno del mismo es un anticuerpo de unión de VLA-4 o un fragmento de unión de VLA-4 del mismo.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión de antigeno del mismo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo de humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un fragmento Fab, Fab' , F(ab')2 o F(v) de unión de antigeno de un anticuerpo humano, quimérico o humanizado.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición se administra a una dosificación para proporcionar de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal del anticuerpo o fragmento de unión de antigeno del mismo.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión de antigeno del mismo es un anticuerpo humano o fragmento de unión de antigeno del mismo o un anticuerpo humanizado o fragmento de unión de antigeno del mismo.

6. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión de antigeno del mismo es un anticuerpo humano o fragmento de unión de antigeno del mismo o un anticuerpo humanizado o fragmento de unión de antigeno del mismo.

7. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión de antigeno del mismo es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión de antigeno del mismo.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión de antigeno, del mismo es un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión de antigeno del mismo.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión de antigeno del mismo es un anticuerpo de unión de VLA-4 especifico del epitopo B o un fragmento de unión de antigeno del mismo.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es natalizumab .

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende administrar un segundo agente terapéutico.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el . segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico .

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el segundo agente terapéutico es citarabina (Ara-C) .

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición se administra subcutánea o intramuscularmente .