TR201808801T4 - İmmünoglobulin formülasyonu ve bunun hazırlanış yöntemi. - Google Patents

Abstract

Terapötik olarak etkili bir miktarda bir antikor, polisorbat oksidasyonunu inhibe eden bir tampon olan polisorbat 80 içeren stabil bir aköz farmasötik formülasyon, hazırlanışın yapılma yöntemleri ile birlikte açıklanır. Ayrıca, sabitlenmiş hacimleri koruyan ve değişken ağırlıklardaki hastalarda kullanılabilen yüksek antikor konsantrasyonlarına sahip formülasyonlar açıklanır.

Description

TARIFNAME IMMÜNOGLOBULIN FORMÜLASYONU VE BUNUN HAZIRLANIS YÖNTEMI BULUS SAHASI Bulus stabil, konsantre natalizumab formülasyonlari ile ilgilidir, burada antikor aktivitesi korunur ve ayrica küçük bir hacimde uygulanabilir` ve buna gereksinini duyan degisken agirlikli bir özneye uygulanabilir.

BULUSUN ALTYAPISI Antikor ve protein formülasyonlari teknikte bilinir. Ancak, kimyasal ve biyolojik olarak stabil olan antikor formülasyonlari gibi protein formülasyonlarinin hazirlanisi, sorunlar ile karsilasir. Ayrica stabil olmayan ancak, antikor gibi, artmis bir protein konsantrasyonu ile dahi küçük bir hacmi koruyabilen (diger bir deyisle, küçük hacimli bir enjeksiyon saglayan) formülasyonlarin hazirlanmasi ayrica zordur. Bu tür formülasyonlara yönelik ihtiyaç vardir. Örnegin, ayrica stabil olan sabitlenmis bir hacimde konsantre protein miktarlari, degisken agirlikli hastalara yönelik özellikle faydali olacaktir. Sivilarin degisken agirlikli hastalara uygulanmasi, örnegin, olumsuz bir reaksiyona sahiptir. Bu tür formülasyonlarin gelisimi, kümelenme ve çökelmeye yüksek bir egilime sahip olan proteinler ve antikorlarin kendisi tarafindan engellenmistir. - 274 hastalara intravenöz infüzyona yönelik polisorbat 80 ile histidin tampon içindeki natalizumabi açiklar.

BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Dolayisiyla, literatürde daha önce rapor edilene bagli olmaksizin, proteinler ve/veya antikorlarin formüle edilmesinin gelismis yöntemlerine yönelik bir ihtiyaç mevcuttur. Ayrica, antikor veya protein aktivitesinin korundugu, büyük antikor veya protein konsantrasyonlarina sahip stabil formülasyonlara yönelik bir ihtiyaç vardir.

Ayrica sabitlenmis bir hacmi koruyan, konsantre proteinin stabil formülasyonlarina ihtiyaç duyulur. Basvuru sahipleri burada, ayrica antikor formülasyonlari, özellikle tavsiye edilen sicakliklarda saklanmasi durumunda çökelmeyen ve stabil olan yüksek antikor konsantrasyonlarina sahip formülasyonlari hazirlamak üzere kullanilabilen stabil bilesimleri açiklar.

Oldukça konsantre ve stabil antikor formülasyonlari, degisken agirliklara sahip öznelerin tedavi edilmesinde hekimlere Burada kapsanan açiklamaya bagli olarak, mevcut bulus 20 mg/ml natalizumab, lO mM fosfat tampon, %0.02 (w/v) polisorbat 80 ve 140 mM sodyum klorid içeren stabil, aköz bir formülasyon saglar, burada formülasyon 6.0±O.5 bir pH'a sahiptir.

Açiklamanin bir açisi, bir immünoglobulin (veya diger protein), bir fosfat tampon, bir polisorbat ve sodyum klorid içeren stabil, aköz bir farmasötik formülasyon saglar.

Tercihen polisorbat, polisorbat 80'dir ve tercihen. yaklasik edildigi üzere polisorbat yaklasik %0.02 miktarinda mevcuttur.

Diger bir örnekte, immünoglobulin veya diger protein formülasyonda yaklasik 0.1 mg/mL ila yaklasik 200 mg/mL arsinda bir miktarda mevcuttur. Tercihen formülasyon yaklasik 3.0 ile yaklasik 7.0 arasinda bir pH'a tamponlanir ve en çok tercih edildigi üzere yaklasik 6.0 ± 0.5'tir. Formülasyon tercihen izotoniktir. Formülasyon ayrica histidin içerebilir.

Tercihen histidin, L-histidindir.

Açiklamanin diger bir açisinda, yukaridaki formülasyonun immünoglobulini, natalizumab veya diger bir insanlastirilmis antikor veya monoklonal antikor gibi bir anti-alfa-4 integrin antikordur. Bu antikor standart bir Iniktarda veya konsantre bir miktarda, örnegin yaklasik 15 mg/mL veya daha fazla mevcut olabilir. Tercihen, natalizumab yaklasik 20 mg/mL ila yaklasik 150 mg/mL arasinda bir miktarda mevcuttur. Formülasyonun yaklasik 15 mg/mL veya daha fazla bir konsantrasyonda mevcut oldugu örneklerde, bu formülasyon sabitlenmis bir hacimde, örnegin, 125 mL'de korunur.

Açiklamanin diger bir amaci, yukarida. ve burada açiklandigi üzere bir formülasyonun uygulanmasini içeren, degisken agirliga sahip bir hastanin bir duruma yönelik bir immünoglobulinin terapötik bir miktari ile tedavi edilmesinin bir yöntemini saglamaktir, burada durum formülasyonun uygulanmasi araciligiyla tedavi edilir. Açiklamanin diger bir açisi, durumun alfa-4 integrin aracili oldugudur~ ve bu tür durumlarda. immünoglobulin, natalizumab gibi alfa-4 integrini taniyan ve buna baglanandir.

Açiklamanin diger bir açisi, bir sodyum fosfat, bir polisorbat, bir protein ve 6.0±O.5 bir pH'a sahip NaCl içeren bir bilesim saglar, burada bilesim uzun bir süre dilimi boyunca 5°C ila 8°C'de saklanmasi durumunda stabildir.

Açiklamanin diger bir açisi, sodyum fosfat, sodyum klorid, bir polisorbat ve bir proteinin karistirilmasini ve fosforik asit ile karisim pH'inin yaklasik pH 6.0 ± 0.5' ayarlanmasini içeren, formulasyon içeren stabil bir proteinin hazirlanmasinin bir yöntemini saglar.

Protein mevcut bulusun formülasyonunda liyofilize edilebilir.

Polisorbat tercihen, yaklasik %0.02'lik (w/v) bir miktarda mevcut olan polisorbat 80k'dir ve protein tercihen natalizumabdir. Formülasyon ayrica histidin içerebilir.

Tercihen, protein bir pH 6'da 5 mM histidin, 20 mg/mL sakkaroz ve %0.02 polisorbat 80 içeren bir solüsyonda liyofilize edilir ve protein 20 mg/mL'lik bir konsantrasyonda natalizumabdir.

Açiklamanin diger bir amaci, yukarida ve burada açiklanan stabil formülasyonu barindiran bir kabi içeren bir üretim maddesi saglamaktir.

Açiklamanin diger bir açisi, eszamanli veya ardisik olarak hastaya yukarida ve burada açiklanan bir formülasyon ile duruma karsi etkili bir bilesik veya terapinin terapötik olarak etkili bir kombinasyonunun uygulanmasini içeren, bir duruma yönelik degisken agirliga sahip bir hastanin tedavi edilmesine yönelik bir yöntem saglar.

Açiklamanin diger* bir açisi, bir durumun tedavisine yönelik bir tibbi ilacin hazirlanisina yönelik burada açiklanan stabil formülasyonlarin herhangi birinin bir kullanimini saglamaktir, burada tibbi ilaç söz konusu durumu tedavi etmede etkilidir.

Bu tibbi ilaç ayrica durumu tedavi etmek üzere ikinci bir bilesik veya terapi içerebilir.

Mevcut bulus ve bunun düzenlemeleri ekli istemlerde belirtilir.

BULUSUN TERCIH EDILEN DÜZENLEMELERININ DETAYLI AÇIKLAMASI 1. Tanimlar enzimler, reseptör ve bunun fragmanlarini içerdigi ifade edilir. Formülasyon açiklamasinin baslica bir antikor veya immünoglobuline referans olarak saglanmasina ragmen, diger proteinler açiklanan formülasyonlarda birbiri ile degistirilebilir olarak tasarlanir. veya antikor fragmani (örnegin scFv, Fab, FC, F(ab')2) ve antikorlarin genetigi degistirilmis diger kisimlarini içerdigi ifade edilir. Bunlarin agir zincirlerinin sabit bölgesinin amino asit dizisine bagli olarak, immünoglobulinler farkli siniflara ayrilabilir. Immünoglobulinlerin baslica bes sinifi vardir: lgA, lgD, IgE, IgG ve IgM. Bunlarin birkaçi ayrica alt siniflara (izotoplara), örnegin, IgGl, IgG2, IgG3, ve IgG4; siniflarina karsilik gelen agir zincir sabit bölgeleri, sirasiyla alfa (d), delta (ö), epsilon (s), gama (y) ve mu (u) olarak adlandirilir. Immünoglobulinlerin farkli siniflarinin alt birini yapilari ve üç-boyutlu konfigürasyonlari iyi bilinir. Tercihen, immünoglobulin alfa-4 integrini tanir ve buna baglanir. olarak, istenen biyolojik aktiviteyi sergiledikleri sürece monoklonal antikorlari (agonist ve antagonist antikorlar dahil), poliepitopik özgüllüge sahip antikor bilesimleri ve antikor fragmanlarini (örnegin, Fab, F(ab')2, scFV ve FV) kapsar. “Antikorun” poliklonal antikorlari, monoklonal antikorlari, insanlastirilmis antikorlari, insan antikorlari, primatized® antikorlari ve genetik mühendisligi vasitasiyla üretilen diger antikorlari içerdigi ifade edilir.

Burada kullanildigi üzere “monoklonal antikor” ifadesi, büyük oranda homojen antikorlarin bir popülasyonundan elde edilen bir antikora refere eder, diger bir deyisle, popülasyonu içeren ayri antikorlar, küçük miktarlarda bulunabilen muhtemelen dogal olarak olusan Hmtasyonlar disinda özdestir.

Monoklonal antikorlar oldukça özgüldür, tek bir antijenik alana karsi yönlendirilir. Ayrica, tipik olarak farkli belirleyicilere (epitoplar) karsi farkli antikorlari içeren geleneksel (poliklonal) antikor hazirlanislarinin aksine, her bir monoklonal antikor antijen üzerinde tek bir belirleyiciye karsi yönlendirilir. Özgüllüklerine ek olarak, monoklonal antikorlar, diger immünoglobulinler tarafindan kontamine olmayan memeli hücre ekspresyon sistemleri veya transjenik teknoloji tarafindan sentezlenmeleri bakimindan avantajlidir. Örnegin, mevcut bulus dogrultusunda kullanilacak monoklonal antikorlar, Behboodi, et al. (2002) Transgenic cloned. goats and the production of therapeutic proteins. In Principles of Cloning. Elsevier Science (USA); ve Meade et al. (1999).

Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals in Gene expression systems: using nature for the art of expression. J. M. Fernandez ve J. P. Hoeffler ed., Academic Press tarafindan açiklandigi üzere keçilerde ifade edilebilir.

Modifiye edici “monoklonal”, antikor karakterini, antikorlarin büyük oranda homojen bir popülasyonundan elde edilmis olarak gösterir ve belirli herhangi bir yöntem araciligiyla antikor üretimini gerektirir olarak yorumlanmayacaktir. Örnegin, mevcut bulus dogrultusunda kullanilacak monoklonal antikorlar, Shepherd et al., Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (Oxford University Press, 2000) tarafindan açiklanan yöntemler araciligiyla yapilabilir. zincirinin bir parçasi belirli bir türden derive edilen veya belirli bir antikor sinifi veya alt sinifina ait olan antikorlarda karsilik gelen diziler ile özdes veya homolog olurken, zincirin geri kalaninin diger bir türden derive edilen veya diger* bir antikor sinifi veya alt sinifina. ait olan antikorlarda karsilik gelen diziler ile özdes veya homolog oldugu “kimerik” antikorlari (immünoglobulinleri), ayrica istenen biyolojik aktiviteyi sergiledikleri sürece bu tür antikorlarin fragmanlarini içerir. Örnegin, alfa-4 integrine baglanma yetenegi. “Monoklonal antikorlar” ayrica, teknikler kullanilarak faj antikor kütüphanelerinden izole edilebilir. Insan-olmayan (örnegin, murin, tavsan, sigir, at, domuz ve benzeri) antikorlarin “insanlastirilmis” formlari, insan-olmayan immünoglobulinden derive edilen minimum diziyi içeren kimerik immünoglobulinler, immünoglobulin zincirleri veya bunun fragmanlaridir (örnegin Fv, Fab, Fab', F(ab')2 veya antikorlarin diger antijen-baglayici alt dizileri). Çogunlukla, insanlastirilmis antikorlar, alicinin bir tamamlayicilik belirleme bölgesinden (CDR) gelen kalintilarin, istenen özgüllük, afinite ve kapasiteye sahip olan fare, siçan veya tavsan gibi insan-olmayan bir türün (donör antikor) bir CDR'sinden gelen kalintilar ile yer degistirildigi insan immünoglobulinlerdir (alici antikor). Bazi örneklerde, insan immünoglobulinin Fv çerçeve kalintilari, karsilik gelen insan- olmayan kalintilar ile yer degistirilir. Ayrica, insanlastirilmis antikor, alici antikorda veya disaridan alinan CDR veya çerçeve dizilerinde bulunmayan kalintilari içerebilir. Bu modifikasyonlar antikor performansini daha fazla düzenlemek ve optimize etmek üzere yapilir. Genellikle, insanlastirilmis antikor, CDR bölgelerinin tümü veya büyük ölçüde tümünün bir insan-olmayan immünoglobulininkine karsilik geldigi veya FR bölgelerinin tümü veya büyük oranda tümünün bir insan immünoglobulin konsensus dizisininkiler oldugu degisken bölgelerin en az biri ve tipik olarak ikisinin büyük oranda tümünü içerecektir. Insanlastirilmis antikor en uygun sekilde ayrica, bir immünoglobulin sabit bölgesinin (Fc) en az bir parçasini, tipik olarak bir insan immünoglobulininkini içerecektir. tarafindan kapsanir ve bir çift antijen baglayici bölgeyi olusturan bir çift tandem Fd segmentidir (VH-CHl-VH-CHl).

Dogrusal antikorlar bispesifik veya monospesifik olabilir.

Bir “degisken antikor” (ayrica genel “antikor” ifadesi tarafindan kapsanir) ana antikor dizisindeki bir veya daha fazla amino asit kalintisinin eklenmesi, delesyonu ve/Veya sübstitüsyonunun sonucu olarak bir “ana antikor amino asit dizisinden amino asit dizisinde farklilasan bir moleküldür.

Tercih edilen bir örnekte, degisken, ana antikorun bir veya daha fazla hiper degisken bölgesinde bir veya daha fazla amino asit sübstitüsyonu içerir. Örnegin, degisken, ana antikorun bir veya daha fazla hiper degisken bölgesinden en az bir, örnegin, yaklasik bir ila yaklasik on ve tercihen yaklasik iki ila yaklasik bes sübstitüsyon içerebilir. Genellikle, degisken, ana antikorun agir veya hafif zincir degisken bölge dizileri ile en az %75, daha çok tercih edildigi üzere en az edildigi üzere en az %90 ve en çok tercih edildigi üzere en az dizisine sahip olacaktir. Bu diziye göre özdeslik veya homoloji burada, maksimum› yüzdede dizi özdesligi elde etmek üzere, gerekli olmasi halinde, dizileri hizalanmasi ve bosluklarin yerlestirilmesi akabinde, ana antikor kalintilari ile özdes olan aday dizideki amino asit kalintilarinin yüzdesi olarak tanimlanir. N-terminali, C-terminali veya antikor dizisindeki iç uzatmalar, delesyonlar veya eklentilerin herhangi biri dizi özdesligini veya homolojisini etkiliyor olarak yorumlanmamalidir.

Bu tür özellikleri analiz etmek üzere, örnegin, antikor formatinin burada açiklanan biyolojik aktivite analizlerindeki aktivitesini etkilediginin bulunmasi nedeniyle, degiskenin bir Fab formunun, ana antikorunun bir Fab formu ile veya degiskenin tam uzunluklu bir formunun, ana antikorun tam uzunluklu bir formu ile karsilastirilmasi gerekir. Söz konusu degisken antikor, ana antikor ile karsilastirildiginda biyolojik aktivitede en az 10 kat, tercihen en az yaklasik 20 kat ve en çok tercih, edildigi üzere en az yaklasik 50 kat artma gösterendir. “Ana” antikor, degiskenin hazirlanisina yönelik kullanilan bir amino asit dizisi tarafindan kodlanandir. Tercihen, ana antikor bir insan çerçeve bölgesine sahiptir ve insan antikor sabit bölgeye sahiptir. Örnegin, ana antikor bir insanlastirilmis veya bir insan antikor olabilir.

Bir “izole antikor”, tanimlanmis ve dogal ortaminin bir bileseninden ayrilmis ve/veya geri kazanilmis olandir. Bunun dogal ortaminin kontaminant bilesenleri antikora yönelik tanisal veya terapötik kullanimlari engelleyen materyallerdir ve enzimler, hormonlar ve diger proteinli veya proteinsiz çözünen maddeler içerebilir. Tercih edilen düzenlemelerde, antikor (l) Lowry yöntemi araciligiyla belirlendigi üzere antikorun agirlikça %95'inden fazlasina ve en çok tercih edildigi üzere agirlikça %99'undan fazlasina, (2) bir döner hazneli dizi analizörünün kullanimi araciligiyla N-terminal veya iç amino asit dizisinin en az 15 kalintisini elde etmek üzere yeterli bir dereceye veya (3) Coomassie mavisi veya tercihen gümüs boya kullanilarak azaltici veya azaltici olmayan kosullar altinda SDS-PAGE araciligiyla homojeniteye saflastirilacaktir. Izole antikor, antikorun dogal ortaminin en az bir bileseninin mevcut olmayacagindan dolayi, rekombinant hücreler içinde yerinde antikor içerir.

Genellikle, ancak, izole antikor en az bir saflastirma adimi araciligiyla hazirlanacaktir. genellikle intakt antikorun antijen baglayici veya degisken bölgesini içerir. Antikor fragmanlarinin örnekleri Fab, Fab', F(ab')2 ve FV fragmanlarini; ikili antikorlari; dogrusal antikorlari; tek-Zincirli antikor molekülleri; ve antikor fragmanlarin olusturulan multispesifik antikorlari içerir. ve VL bölgelerini içerir, burada bu bölgeler tek bir polipeptit zincirinde mevcuttur. Genellikle, FV polipeptit ayrica VH ile VH bölgeleri arasinda, sFV'nin antijen baglamaya yönelik istenen yapiyi olusturmasini saglayan bir polipeptit baglayici içerir. sahip küçük antikor fragmanlarina refere eder, bu fragmanlar ayni polipeptit zincirinde (VH-VL) bir hafif zincir degisken bölgeye (VL) bagli bir agir zincir degisken bölge(VH) içerir.

Ayni zincir üzerinde iki bölge arasinda eslesmeye izin vermeyecek kadar kisa olan bir baglayici kullanilmasi araciligiyla, bölgeler diger bir zincirin tamamlayici bölgeleri ile eslesmeye zorlanir ve iki antijen-baglayici bölge olusturur. Antikor uygulama yolu, bilinen yöntemlere uygundur ve iyi bilinir ve örnegin, intravenöz, intraperitoneal, intraserebral, intramüsküler, intraoküler, intraarteriyel veya intralezyonel yollar araciligiyla veya sürekli salim sistemleri araciligiyla enjeksiyon veya infüzyonu içerebilir. Antikor, infüzyon veya bolus enjeksiyon araciligiyla sürekli olarak uygulanabilir. Terapötik antikor bilesimleri genellikle steril bir erisim açikligina sahip bir kap, örnegin hipodermik bir enjeksiyon ignesi ile delinebilen bir tipaya sahip intravenöz bir solüsyon torbasi veya viyale yerlestirilir. “Farmasötik olarak kabul edilebilir” eksipiyanlar (örnegin, araçlar, katki maddeleri), kullanilan aktif içerik maddesinin etkili bir dozunu saglamak üzere bir memeli özneye uygun bir sekilde uygulanabilenlerdir. “Stabil” bir formülasyon, buradaki proteinin saklama akabinde baslica fiziksel stabilitesini ve/veya kimyasal stabilitesini ve/veya biyolojik aktivitesini koruyandir. “Stabil” ile, ayrica agregasyon ve/veya deamidasyon dahil, az veya sifir instabilite belirtisi gösteren bir formülasyon ifade edilir. Örnegin, mevcut bulus araciligiyla saglanan formülasyonlar, 5- 8°C'lik bir sicaklikta gösterildigi üzere saklanmasi durumunda en az iki yil boyunca stabil kalabilir.

Protein stabilitesinin ölçülmesine yönelik çesitli analitik teknikler, teknikte mevcuttur ve örnegin, Peptide and Protein Drug Delivery, incelenir. Stabilite, saglanan örnekler araciligiyla örneklendirildigi üzere seçilen bir süre dilimi boyunca seçilen bir sicaklikta ölçülebilir. Stabil formülasyonlarin saklanmasi, tercihen en az 6 ay, daha çok tercih edildigi üzere 12 ay, daha çok tercih edildigi üzere 12-18 ay ve daha çok tercih edildigi üzere 2 veya daha fazla yil boyuncadir.

Bir antikor veya bunun fragmani gibi bir protein, renk ve/veya berrakligin görsel incelenmesi üzerine veya UV isik saçilimi araciligiyla veya boyut dislama kromatografisi araciligiyla ölçüldügü üzere herhangi bir agregasyon, çökelme, deamidasyon ve/veya denatürasyon göstermemesi halinde farmasötik bir formülasyonda “fiziksel stabilitesini korur”.

Bir protein, belirli bir sürede kimyasal stabilitenin, proteinin biyolojik aktivitesini korumaya devam ettigi düsünülecegi sekilde olmasi halinde farmasötik bir formülasyonda “kimyasal stabilitesini korur”. Kimyasal stabilite, proteinin kimyasal olarak degismis formlarinin saptanmasi ve miktarinin belirlenmesi araciligiyla degerlendirilebilir. Kimyasal degisim, örnegin boyut dislama kromatografisi, SDS-PAGE ve/Veya matriks-yardimli lazer desorpsiyon iyonizasyonu/uçus zamanli kütle spektrometresi (MALDI/TOF MS) kullanilarak degerlendirilebilen boyut modifikasyonunu (örnegin, kirpma) içerebilir. Kimyasal degisimin diger türleri, örnegin iyon degisimi kromatografisi araciligiyla degerlendirilebilen yük degisimini (Örnegin, deamidasyon sonucu meydana gelir) içerir. Bir antikor, örnegin, farmasötik formülasyonun bir antijen baglama analizinde belirlendigi üzere hazirlandigi zamanda, antikorun biyolojik aktivitesinin belirli bir sürede sergilenen biyolojik aktivitenin yaklasik %10 içinde (analiz hatalari içinde) olmasi halinde, farmasötik bir formülasyonda ayni oztomik basinca sahip olmasini ifade eder. Izotonik formülasyonlar genellikle yaklasik 250 ila 350 mOsm arasinda bir ozmotik basinca sahip olacaktir. Izotonisite, örnegin bir buhar basinci veya buzla-dondurma tipli ozmometre kullanilarak ölçülebilir.

Burada kullanildigi üzere, “tampon” asit-baz konjugat bilesenlerinin etkisi araciligiyla pH'taki degisikliklere direnen tamponlanmis bir solüsyona refere eder. Bu açiklamanin tamponu, yaklasik 3.0 ila yaklasik 7.5, tercihen yaklasik 4.0 ila yaklasik 7.0; daha çok tercih edildigi üzere yaklasik 5.0 ila yaklasik 6.5 araliginda bir pH'a sahiptir; ve en çok tercih edildigi üzere yaklasik 6.0±0.5'te bir pH'a sahiptir.

Yukaridaki araliklar arasinda herhangi bir noktadaki bir` pH ayrica tasarlanir.

Farmakolojik bir anlamda, mevcut bulus dahil mevcut açiklama baglaminda, bir antikorun bir “terapötik olarak etkili miktari” antikorun etkili oldugu bir tedaviye yönelik bir rahatsizligin önlenmesi veya tedavisindeki etkili bir miktara refere eder. Bir “rahatsizlik”, antikor veya protein ile tedaviden faydalanacak herhangi bir durumdur. Bu, memeliyi söz konusu rahatsizliga önceden hazirlayan bu patolojik kosullar dahil olarak, kronik ve akut rahatsizliklar veya hastaliklari önlemlerin her ikisine refere eder. Tedaviye gereksinim duyanlar, rahatsizligin önlenecegi kisilerin yanisira halihazirda rahatsizliga sahip olanlari içerir.

Bir “koruyucu", baslica buradaki bakteriyel etkiyi azaltmak, örnegin böylece çok-kullanimli bir formülasyonun üretimini kolaylastirmak üzere formülasyona dahil edebilen bir bilesiktir. Olasi koruyucularin örnekleri, oktadesildimetilbenzil amonyum, klorid, hekzametonyum klorid, benzalkonyum klorid (alkil gruplarin uzun-Zincirli bilesikler oldugu alkilbenzildimetilamonyum kloridlerin bir karisimi) ve benzetonyum kloridi içerir. Koruyucularin diger türleri, fenol, bütil ve benzil alkol gibi aromatik alkolleri, metil veya propil paraben, katekol, resorsinol, siklohekzanol, 3- pentanol ve m-krezol gibi alkil parabenleri içerir. edilir. Tedavi amaçlarina yönelik bir “memeli”, bunlarla sinirlandirilmaksizin insanlar, domestik veya çiftlik hayvanlari ve hayvanat bahçesi, spor veya evcil hayvanlar, Örnegin, köpekler, atlar, kediler, inekler ve benzeri dahil, bir memeli olarak siniflandirilan herhangi bir hayvana refere eder. Tercihen memeli, insandir. natalizumab (USAN adi) olarak bilinen antikoru içerdigi ifade edilir. Natalizumab, bir rekombinant, insanlastirilmis anti- alfa-4 integrin antikordur. Tercihen memelide tedavi edilen hastalik veya durum, natalizumabin terapötik olarak etkili bir dozunun uygulanmasi durumunda modüle edilendir. sifir instabilite belirtisi gösteren bir formülasyon ifade edilir. Ek olarak, “stabil” ayrica gösterildigi üzere saklanmasi durumunda iki yildan fazla veya buna esit bir süre boyunca herhangi bir instabilite belirtisi göstermeyen bir formülasyona refere eder. 2. Genel Açiklama Asagidaki açiklama ve takip eden örneklerde, stabil antikor formülasyonlarina yönelik formülasyonlar açiklanir. Açiklanan belirli stabil formülasyonlar yüksek konsantrasyonlarda antikora sahiptir ancak sabitlenmis bir hacmi korur, burada bu formülasyonlardaki antikorlar stabildir ve antikor solüsyondan çökelmez veya birikmez. Antikorlar disindaki proteinler ayrica yüksek konsantrasyon formülasyonlarina yönelik tasarlanir.

Antikorlar tipik olarak bir özneye (örnegin, bir insana) yaklasik 0.01 mg/mL ila yaklasik 200 mg/mL arasinda bir konsantrasyonda uygulanir. Daha tipik olarak, antikorlar yaklasik 0.1 mg/mL ila yaklasik 150 mg/mL arasindaki konsantrasyonda degisir. Ancak, bir hastaya daha fazla, örnegin, yaklasik 15 ila yaklasik 200 mg/mL, daha çok tercih edildigi üzere yaklasik 15 mg/mL ila 150 mg/mL, daha çok tercih edildigi üzere yaklasik 20 ila yaklasik 50 mg/mL ve en çok tercih edildigi üzere yaklasik 20 mg/HEJ ve aralarindaki herhangi bir tam sayida konsantrasyonlarin uygulanmasinin gerekli oldugu örnekler mevcuttur.

Antikor formülasyonu, bilinen yöntemlere göre protein ile tedaviye gereksinim duyan bir memeliye uygulanabilir. Bu yöntemler, bunlarla sinirlandirilmaksizin bir bolus olarak veya intramüsküler, intraperitoneal, intraserebrospinal, subkütanöz, intra-artiküler, intrasinovyal, intratekal, oral, topikal veya inhalasyon yollari araciligiyla bir süre dilimi boyunca sürekli infüzyon araciligiyla intravenöz uygulamayi içerir. Tercih edilen örneklerde, antikor formülasyonu memeliye intravenöz uygulama araciligiyla uygulanir.

Uygun protein dozaji, örnegin, tedavi edilecek durum, durumun siddeti ve gidisati, proteinin önleyici veya terapötik amaçlara yönelik uygulanip uygulanmadigi, önceki terapi, hastanin klinik geçmisi ve proteine tepkisi, kullanilan protein türü ve uzman hekimin takdirine bagli olacaktir.

Protein, uygun bir sekilde tek seferde veya bir dizi tedavi boyunca hastaya uygulanir ve tani sonrasi herhangi bir zamanda hastaya uygulanabilir. Protein tek tedavi olarak veya söz konusu durumun tedavi edilmesinde faydali diger ilaçlar veya terapiler ile birlikte uygulanabilir. Burada kullanildigi üzere, ajanlarin eszamanli olarak islev gösterecegi bir sekilde iki ajanin eszamanli uygulanmasi veya bagimsiz olarak uygulanmasi durumunda, iki (veya daha fazla) ajanin kombinasyon halinde uygulandigi söylenir.

Bu açiklamanin yöntemlerinin uygulanmasinda, bu bulusun bilesikleri tek basina veya kombinasyon halinde veya diger terapötik ajanlar ile kombinasyon halinde uygulanabilir.

Tercih edilen belirli örneklerde, bu bulusun bilesikleri genel olarak kabul edilen tibbi uygulamaya göre bu durumlara yönelik tipik olarak reçete edilen diger bilesikler ile birlikte uygulanabilir. Örnegin, bu bulusun formülasyonlari romatoid artrit, multipl skleroz ve Crohn Hastaliginin tedavisine yönelik diger terapötik ajanlar` veya fiziksel terapiler ile kombinasyon halinde uygulanabilir. 2.1 Antikor Formülasyonu Olusturulmasinin Yöntemi Proses, teknikte uzman kisi tarafindan bilenecegi üzere degistirilebilir ancak genellikle asagidaki gibi bir prosedürü izleyecektir. Söz konusu antikor veya proteini olusturan hücreleri içeren bir çalisma hücre bankasindan bir ampül elde edilmesi. Inokülümün hazirlanmasi. Gerektigi sekilde ek beslemeler ile hücrelerin kültürlenmesi veya fermente edilmesi. Santrifüjleme ve/veya filtrasyon araciligiyla hücrelerin toplanmasi/berraklastirilmasi. Bu, örnegin spiral sarili filtrasyon araciligiyla hücrelerin 10 kat konsantre edilmesi araciligiyla yapilabilir. 0.2 um'lik bir ara ürün filtrasyonu araciligiyla filtrelenir, akabinde protein A Sepharose Fast Flow® (diger bir deyisle, afinite kromatografisi) araciligiyla saflastirma ve ters elüsyon gerçeklestirilir. Antikor içeren bilesim akabinde pH 3.6- 3.7'de bir isleme ugrar. Karisim, akabinde bir Viral filtrasyon, akabinde bir konsantrasyon/diyafiltrasyon adimina ugrar. Bilesim akabinde DEAE Sepharose Fast Flow® (anyon degisimi) araciligiyla saflastirilabilir. Bu adim birçok kere gerçeklestirilebilir. Bu noktadan sonra, bilesim akabinde ayrica konsantre edilir, akabinde Sephacryl SBOOHR® (diger bir deyisle, jel filtrasyon kromatografisi) kullanilarak bir saflastirma adimi gerçeklestirilir, burada kullanilan yürütme tamponu fosfat/NaCl'dir. Antikor içeren bilesim akabinde istenmesi halinde yüksek konsantrasyon formülasyonlarina (örnegin, 20 mg/mL veya daha fazla) yönelik konsantre edilebilir. Antikor içeren bilesim akabinde ayrica tamponlanir ve konsantrasyon %0.02 (w/V) polisorbat 80 eklenmesi araciligiyla ayarlanir. Bu bilesim akabinde 0.2 pm'lik bir filtre kullanilarak bir nihai filtrasyona ugrar ve bu noktada 100 mL ila 10 L'lik polipropilen siselere dagitilabilir. Bu sekilde elde edilen antikor veya immünoglobulin akabinde QC ile test edilir ve QA ile salinir.

Asagidakiler, örnegin natalizumaba yönelik, asagida diyagram ile gösterildigi üzere gerçeklestirilebilir: Çalisma Hücre Bankasindan Çalisma Hücre Bankasindan 200L Materyal (5.0 mg/mL) Inokülüm Hazirlanisi Fermantasyon Filtrasyon araciligiyla Toplama/Berraklastirma: Spiral sarili filtrasyon araciligiyla lOx konsantrasyon 0.2 pm Ara Ürün Filtrasyonu Protein A Sepharose Fast Flow® (Afinite Kromatografisi) (Ileri Elüsyon) araciligiyla saflastirma pH 3.7-3.8 islemi Konsantrasyon/Diyafiltrasyon 2000L Materyal (5.0, 20 Inokülüm, Hazirlanis Fermantasyon (Ek Ortam Beslemesi) Santrifüjleme & filtrasyon araciligiyla Toplama/Berraklastirma: Spiral sarili filtrasyon araciligiyla 10x konsantrasyon 0.2 pm Ara Ürün Filtrasyonu Protein A Sepharose Fast Flow® (Afinite Kromatografisi) (Ters Elüsyon) araciligiyla saflastirma pH 3.6-3.7 islemi Viral filtrasyon Konsantrasyon/Diyafiltrasyon DEAE Sepharose Fast Flow® DEAE Sepharose Fast Flow® (Anyon Degisimi (Anyon Degisimi Kromatografisi) (Tek. Döngü) Kromatografisi) (Birçok araciligiyla saflastirma Döngü) araciligiyla saflastirma Konsantrasyon Konsantrasyon Sephacryl S3OOHR® (Jel Sephacryl S3OOHR® (Jel Filtrasyon Kromatografisi) Filtrasyon Kromatografisi) (Yürütme Tamponü: (Yürütme Tamponu: histidin/NaCl) araciligiyla fosfat/NaCl) araciligiyla saflastirma saflastirma konsantrasyon) Tampon & Konsantrasyon Tampon & Konsantrasyon Ayarlamasi Fosfat/NaCl, Ayarlamasi (%0.02 (w/V) 0.2 (nn Nihai Filtrasyon XM30.2 (nn Nihai Filtrasyon ve Yigin saflastirilmis Yigin saflastirilmis AN100226'nin QC ile test ANlOOZZG'nin QC ile test edilmedi ve QA ile salimi edilmedi ve QA ile salimi 2.2 Antikor Formülasyonu Açiklamanin bir açisinda, bir immünoglobulin, 10 mM sodyum fosfat, ve %0.02 polisorbat 80 veya 50.0 mg/mL'lik konsantrasyonlarda formüle edilir. Gerekli olmasi halinde, pH, fosforik asit ile 6.0 ± 0.5'e ayarlanir.

Farkli formülasyonlarin bir örnegin asagidaki gösterilir.

NICEL BILESIM FOSFAT TAMPON FORMÜLASYONU Bilesen Fonksiyon Birini Birini Birim Formül Formül Formül 1.7 5.0 20 Aktif Içerik Maddesi: Anti-d4 integrin.Aktif 1.7 mg 5.0 mg 20 mg insanlastirilmis monoklonal antikor Diger Içerik Maddeleri: Sodyum Fosfat, Tampon ve 1.4 mg 1.4 mg 1.4 mg USP tonisite Sodyum klorid, Tampon ve 8.2 mg 8.2 mg 8.2 mg USP tonisite fosforik asit, pH'in 6.0 ± QS QS QS ayarlanmasi Polisorbat 80, Protein 0.2 mg 0.2 mg 0.2 mg NF agregasyonunun Bilesen Fonksiyon Birini Birini Birim Formül Formül Formül 1.7 5.0 20 Aktif Içerik Maddesi: edilmesi Enjeksiyona Seyreltici QS ila QS ila 08 ila Yukaridaki formülasyonlarin herhangi biri aseptik bir Viyal içinde en uygun sekilde siselenir. Bu Viyaller, örnegin, alüminyum sizdirmazlik elemanlarina sahip Helvoet Pharma V9145/FM 157/1 gri bütil kauçuk tipalar ile Tip I EP nötr cam viyaller (örnegin, 5.0 veya 20 mL dolumluk viyaller) olabilir.

Ancak, uygun diger aseptik Viyaller ayrica tasarlanir. Örnegin, formülasyonlar asagidaki sekilde siselenebilir: Gerekli olmasi halinde, fosfat/sodyum klorid/polisorbat 80 tamponun birlestirilmesi Viyaller, tipalar ve üretim ekipmaninin sterilizasyonu Istendigi sekilde, 1.7 veya 50 mg/mL'ye fosfat/sodyum klorid/polisorbat 80 tampon antikor ile dilüsyon Steril filtrasyon Viyallerin aseptik doldurulmasi ve tipalanmasi Baslik geçirme Salim Testi Daha spesifik olarak, örnegin yukarida açiklanan prosedürler araciligiyla elde edilen natalizumab, asagidaki sekilde siselenebilir; Natalizumab 200 L ve 2000 L ilaç ürünü, bir Viyal yikama, sterilizasyon ve depirojenizasyon tüneli ile donatilmis tam otomatik bir dolum hatti üzerinde doldurulabilir. Tipalar, sizdirmazlik elemanlari ve ekipman kullanimdan önce yikanir ve steril hale getirilir. Bu proses, 2000 L fermantasyondan üretilen hacimler ile tutarli genis ölçekli doldurma islemlerine olanak saglar.

Gerekli olmasi durumunda, formülasyon tamponu, yaklasik 10 mM polisorbat 80 bir Class 10,000 oda içinde birlestirilebilir ve yigin ilaç ürününü nihai konsantrasyona seyreltmek üzere kullanilabilir. Konsantrasyon, pH ve yogunlugun proses sirasindaki spesifikasyonlarina tercihen filtrasyon öncesinde ulasilir.

Formüle edilen natalizumab veya diger immünoglobulin 0.2 um'lik bir Millipak filtresi araciligiyla steril çekirdek içinde paslanmaz çelik bir denge bacasina steril olarak filtrelenebilir. Natalizumabin doldurulmasi, tipalanmasi ve baslik geçirilmesi tam. otomatiktir. Yigin sterilitesine yönelik proses sirasindaki numuneler toplanir; dolum agirligi ve tepe boslugu testi doldurma islemi boyunca yürütülür.

Doldurulan ilaç ürünü yaklasik 2-8°C'de sogutma altinda saklanir.

Doldurma tam onaylanmis bir Class lOO steril çekirdek içinde gerçeklesir. Doluni hatti, 5.0 mL ve 20 mL'lik dolum hacimlerine yönelik beklenen toleranslar içinde dolum hacimleri saglamak üzere dogrulanir. Kapsamli çevre gözlemleme doldurma islemi boyunca yürütülür ve bu standarda sürekli uygunlugu dogrulamak üzere incelenir. Ortam dolumlari aseptik doldurma islemlerini desteklemek üzere çeyrek bazli yürütülür.

Alternatif olarak, üretilen 200 L ilaç maddesi materyal asagidaki örnek akabinde siselenebilir. Viyaller, doldurma igneleri, filtrasyon düzenegi ve boru sistemi, kullanimdan önce hazirlanir ve sterilize edilir. Tipalar, tedarikçi tarafindan hazirlanabilir. Tipalar akabinde doldurma öncesinde sterilize edilir.

Natalizumab ilaç ürünü veya diger protein, bilesenlerin yigin hazirlanisi, otomatik doldurma, aninda tipalanmasi ve akabinde bir baslik geçirme islemi ile yari-otomatik bir doldurma hatti üzerinde doldurulur. Bu islem, küçük yigin ölçekli islemlere yönelik uygundur.

Nihai yigin solüsyon. akabinde bir Class 1000 ortami içinde steril cam bir alici hazneye 0.2 üm'lik bir Millipak filtre araciligiyla steril olarak filtrelenir. Düzenli kalibrasyon ve proses sirasindaki kontroller, doldurma toleransinin ± %2 içinde kalmasini saglar. Viyaller tipalanir` ve aninda kapak geçirilir. Doldurulan ilaç ürünü tercihen 2-8°C'de sogutularak saklanir.

Cam alici hazne herhangi bir sayida Viyal olabilir, ancak, örnegin Epsom Glass veya AMILCO tarafindan tedarik edilen örnegin 5.0 veya 20 mL'lik bir nötr cam Viyal Tip I (EP) veya örnegin Kimble veya Wheaton tarafindan tedarik edilen 5.0 mL veya 20 mL'lik bir USP Tip I borosilikat cam viyal olabilir.

Bu Viyaller uygun herhangi bir kapatma araci kullanabilir.

Viyal kapatmalari, bunlarla sinirlandirilmaksizin bir 13 mm Helvoet Pharma V9l45/FM 157/l gri bütil kauçuk tipa veya bir l3 mm ve 20 mm Helvoet Pharma V9l45/FM 157/l gri bütil kauçuk tipa veya bir l3 mm veya 20 mm West 4432/50 gri bütil kauçuk tipa içerir. Kauçuk- tipali sise akabinde en tipik sekilde West tarafindan üretilen gibi bir alüminyum sizdirmazlik elemani kullanilarak kapatilir.

Mevcut bulusun asagidaki örneklere referans ile detayli olarak açiklanmis olmasina ragmen, çesitli modifikasyonlarin yapilabilecegi ve teknik uzman kisi tarafindan kolay bir sekilde bilinecegi anlasilir. ÖRNEKLER Polisorbat 80'in Seçimi Tipik natalizumab uygulama yöntemi, intravenözdür. Intravenöz uygulama, nihai formülasyonun izotonik olmasini gerektirir. 50 mM L-histidin, 150 mM NaCl içinde pH 6.0'da. 5 mg/mL bir AN100226 (natalizumab) formülasyonu baslangiçta seçilmistir (Formülasyon #l). Bir Faz II çalismasi boyunca, antikorun protein çökelmesi dilüsyon ve natalizumabin klinik dozlama aparatina. yerlestirilmesi boyunca. gözlemlenmistir. Polisorbat 80 gözlemlenen protein çökelmesini ortadan kaldirmak üzere formülasyona (Formülasyon #2) yerlestirilmistir. Tercihen, mevcut açiklama ile kullanima yönelik polisorbat peroksitte, diger bir deyisle, Sigma'dan, Ürün numarasi ?6479, Parti Numarasi O71K7283 olan polisorbatta düsüktür.10 ANl 00226 antikorunun çökelmesini hizlandirdigi gösterilen iki faktör, silikon yagin eser seviyelerinin varligi ve hava-sivi arayüzündeki denatürasyondur. Silikol yag, silikonlanmis kauçuk tipalar ile donatilmis standart yaglanmis polipropilen siringalarin kullanimi üzerine ürüne eklenmistir. Silikon yagin eklenmesi, hafif çalkalama ve oda sicakliginda saklama akabinde Formülasyon # 1'de görülebilir~ antikor çökelmesine neden olmaya yeterlidir. Hava-sivi arayüzündeki denatürasyon araciligiyla neden olunan agregasyon, deamidasyon ve akabindeki çökelme, ilacin daha fazla klinik alana gönderilmesi ile daha fazla görülebilir sekilde sorunlu hale gelmistir. Protein çökelmesinin her iki nedeni %0.02'lik (w/V) bir konsantrasyon polisorbat 80 eklenmesi araciligiyla ortadan kaldirilmistir.

Formülasyon #2, ürün gönderme ve klinik ortamda kullanma sirasinda artmis stabilite saglarken, tüm protein karakterizasyonu analizlerinde histidin/NaCl formülasyonu (Formülasyon #1) ile karsilastirilabilir stabilite gösterir.

Formülasyona polisorbat 80'in eklenmesi ayrica daha yüksek protein içerigi ile formülasyonlar hazirlanmasi durumunda çökelen veya biriken antikor sorununu ortadan kaldirir.

Baslangiç çalismasi 50 mg/mL dahil yüksek protein konsantrasyonlarinda çalkalanma-indüklü agresyona odaklanmistir. Bir vorteks-tipi karistirici kullanilarak materyalin çalkalamaya tabi tutulmasi araciligiyla, biriken türler boyut dislama-yüksek› performansli sivi kromatografisi (SEÇ-HPLC) araciligiyla saptanmistir. Sakkaroz ve diger tamponlama. bilesenleri az faydali etkiye sahipken, bu model polisorbat 80'i etkili bir agregasyon inhibitörü olarak tanimlamistir. mg/mL'lik bir protein konsantrasyonunda çalkalanma-indüklü çökelmenin önlenmesinde %0.02'lik (w/v) polisorbat 80 eklenmesinin etkililigi, natalizumab viyallerine (Parti No. eklenmesi akabinde degerlendirilmistir. Viyaller yatay bir düzlemde dakika basina 150 dönüste Formülasyon # 1'de birkaç natalizumab viyali ile birlikte yan taraflarinda çalkalanmistir. Oda sicakliginda bu islemin 3 saati içinde, partikül içermezken Formülasyon # JJjii viyalleri partiküller ile doludur ve bulanik görülmüstür.

Gözlemlenen agregasyona, polisorbat 80 yoklugunda AN100226 ile tamamen dolu viyallerin, ek partikül olusumu indüklenmeden uzatilmis zaman dilimleri boyunca çalkalanmasi nedeniyle hava- sivi ara yüzü tarafindan neden olundugu düsünülür. tarafindan kolaylastirilan protein çökelmesini inhibe etme yeteneginin bir degerlendirilmesi gerçeklestirilmistir. Bir polisorbat 80'e ayarlanmistir ve ticari olarak temin edilebilen, yaglanmis 60 mL'lik polipropilen siringaya çekilmistir. Materyal oda sicakliginda birkaç saat boyunca bekletilmistir. Görsel inceleme herhangi bir çökelmenin meydana gelmedigini onaylamistir. Materyal akabinde 0.2 um'lik bir filtre araciligiyla 5 mL'lik bir viyale filtrelenmistir ve incelenmistir ve birkaç gün akabinde büyük oranda partikül içermedigi bulunurken, ayni sekilde polisorbat 80 (Formülasyon olmustur.

Fosfat Tamponun Seçimi Histidin plasebosunun (%0.02 w/v polisorbat 80 içerir) salim testi sirasinda, yeni eser safsizliklar saptanmistir. Bu safsizliklar, görünür bir sekilde metal iyonlar ve histidini kapsayan bir oksidasyon reaksiyonu araciligiyla, polisorbat 80 degradasyonundan kaynaklanmistir. Aktif natalizumab ilaç ürününe yönelik, bu eser safsizliklar yüksek sicakliklarda (örnegin, 25°C ve 40°C) saklamanin hemen akabinde saptanmistir. Böylece, plaseboyu modifiye etme ve tampondaki histidini degistirmek üzere fosfat kullanma karari alinmistir. Ürün plasebosunda kullanilan histidin partisi, aktif yönelik kullanilandan farkli olmustur. Polisorbat 80 degradasyonu üzerinde histidin kaynagi etkisi, asagida daha detayli olarak açiklanir.

Plasebonun test edilmesi sirasinda, eser safsizliklar histidin/NaCl/%0.02 (w/v) polisorbat 80 plasebosunda (Formülasyon #2) saptanmistir. Bu safsizliklar, düsük dalga boylu ultraviyole bölgedeki sogurganliklari araciligiyla saptanmistir. Bir ay boyunca 5°C, 25°C ve 40°C'de saklanan plaseboya yönelik 200 ila 400 nm arasindaki sogurganlik profilleri belirlenmistir. Bu veriler, safsizliklarin bir sicaklik fonksiyonu olarak arttigini gösterir.

Antikor agregasyonunu gözlemlemek üzere kullanilan boyut dislama HPLC yöntemi, kolon yükünün 5-kat ila 100 uL arttirilmasi araciligiyla eser safsizliklarin saptanmasina yönelik duyarliligi arttirmak üzere modifiye edilmistir ve numune lO-kat seyreltilmis yerine seyreltilmemis olarak uygulanir. Ek olarak, sogurganlik, safsizliklarin maksimum sogurganligini yansitmak üzere 260 nm'de gözlemlenir. Yöntem, antikorun elüsyon profilinden daha erken ortaya çikmasi nedeniyle bu eser safsizliklarin plasebo ve ürünün her ikisindeki varligi degerlendirmek üzere bir araç saglar.

Plasebo ve Formülasyonlar #1 ve #2'de formüle edilen natalizumab nihai ilaç ürünü yukarida açiklanan SEÇ-HPLC yöntemi araciligiyla analiz edilmistir. Polisorbat 80 ile analizi, kromatografinin hemen öncesinde gerçeklestirilmistir.

Bu, eser safsizliklarin yoklugunda polisorbat 80, histidin ve tuzun UV sogurganligini gösterir. l6'nci dakikadaki genis pik polisorbat 80 ile iliskilendirilirken, yaklasik olarak 26- 27'nci dakikalardaki pikler* histidin. ve tuza. baglaniru 2 ay boyunca 5°C'de saklanan histidin/NaCl/%0.02 (w/V) polisorbat 80 plasebOSu (Formülasyon #2), bu safsizliklarin üretiminde polisorbat 80'i içeren geç ayristirma piklerinde göze çarpan bir artis gösterir. Ek olarak, l6'nci dakikada ayristirma, polisorbat 80'in çözündügünü göstererek ortadan kaybolmustur.

Formülasyon #1'de 5°C'de yaklasik olarak 55 ay boyunca yigin ilaç maddesi olarak saklanan AN100226 kromatografinin hemen öncesinde polisorbat 80 ile %0.02'ye (w/v) aniden artmasi akabinde analiz edilmistir. Antikor bu asiri yük kosullarini kullanarak 16-18'inci dakikalarda ayristirilir. Profilin geri kalani, polisorbat 80 artisi ile plaseboya benzerlik gösterir. numuneleri ayrica bu yöntem araciligiyla analiz edilmistir.

°C'lik natalizumab numunesine yönelik elüsyon profili, herhangi bir ek pik yoklugunu ve 26-27'nci dakikalarda histidin/tuz piklerinin karsilastirilabilir seviyelerini gösterir. Bu eser safsizliklar 25°C'lik numuneye yönelik iki ayda saptanir ve yüksek seviyeler iki aylik 40°C'ilk numuneye yönelik mevcuttur. Böylece, bu safsizliklar 5°C'de saklanan klinik malzemelerde saptanmamistir. Bu eser safsizliklarin görünüsü, plaseboda natalizumabda oldugundan daha hizli meydana gelir.

Plaseboda bu safsizliklarin olusumundan kaçinmak üzere, histidin, plasebo formülasyonundaki inorganik tamponlama bilesenleri ile degistirilmistir. Klinik deneylere yönelik plasebo ürün, pH 6.0'da %0.02 (w/V) polisorbat 80 ile steril bir izotonik fosfat tamponlu solüsyondur. Fosfat ile hisitidin sübstitüsyonunun, polisorbat 80 degradasyonu oranini büyük oranda azalttigi gösterilmistir. lOO uL fosfat/NaCl/%0.02 (w/v) polisorbat 80 plasebo formülasyonu 60°C'de sifir zamaninda ve 3 gün akabinde 260 nm'de gözlemlenen boyut dislama HPLC'si araciligiyla analiz edilmistir. Bu inkübasyon sonucu olarak SEÇ-HPLC profilinde az degisim görülür. 60°C'de yalnizca iki gün akabinde histidin/NaCl/%0.02 (w/V) polisorbat 80 formülasyonuna yönelik SEÇ-HPLC profili, polisorbat 80 degradasyonuna iliskin eser safsizliklarin kaydadeger seviyelerini gösterir. Bu 'veriler, plasebo formülasyonundaki fosfat ile histidinin degistirilmesi araciligiyla polisorbat 80 degradasyonunun büyük oranda engellendigini gösterir.

Kombine Polisorbat 80 ve Histidin ile Natalizumab Formülasyonu Bu eser safsizliklarin üretildigi mekanizmanin, polisorbatin bir metal katalizli oksidasyonu araciligiyla oldugu düsünülür (bakiniz Donbrow et al., 1978 J. Pharmaceutical Sciences, 67(12): 28). Donbrow, saklama boyunca. otooksidasyonun farkli polisorbat türlerine (örnegin, polisorbat 20) yönelik gerçeklestigini açiklar. Isik, sicakliklar ve metal iyonlar ayrica otooksidasyonu etkiler. Donbrow et al. (1978). histidin ve polisorbat 80'in her ikisinin, bu reaksiyonunün kaydadeger bir oranda ilerlemesi için gerekli oldugu dogrulanmistir.

Ajinomoto, bu formülasyona yönelik kullanilan tek histidin kaynagidir. Ancak Ajinomoto tarafindan tedarik edilen partiler arasinda reaksiyon oraninda kaydadeger farkliliklar gözlemlenmistir.

Reaksiyonu hizlandirma bir rol oynayan ek bir faktör, metal varligidir. Bu, 50 mM histidin (Parti No. ROl6AOO8) ve %2 (w/v) polisorbat 80 ile bir cam haznede bes gün boyunca 60°C'de bir reaksiyonun yürütülmesi araciligiyla gösterilmistir. Bu kosullar altinda, eser safsizliklarin minimum seviyeleri bu histidin partisine yönelik üretilir.

Reaksiyon akabinde üç hazneye ayrilmistir: (l) birinci hazne kontrol olarak kalmistir; (2) bir gri bütil kap kapatma (tipa) ikinci hazneye eklenmistir; ve (3) paslanmaz çelik bir igne üçüncü hazneye eklenmistir. Bu reaksiyonlar akabinde 60°C'de dört gün boyunca yürütülmüstür ve 200 ila 400 nm arasinda bir UV taramasi araciligiyla analiz edilmistir. Reaksiyon igne varliginda bu zaman dilimi boyunca daha fazla ilerlemistir.

Safsizliklarin Degerlendirilmesi - Farede Tek-Dozlu Sinir Bu safsizliklarin potansiyel toksisitesi bir farede tek-dozlu sinir testinde degerlendirilmistir. Alti hafta boyunca 40°C'de saklanan Formülasyon #2'deki histidin plasebosu ve natalizumab numuneleri, bu numunelerin safsizliklarin en `büyük Iniktarini saglamasi nedeniyle kullanilmistir. Safsizliklar nedeniyle herhangi bir toksisite belirtisi olmamistir. Ön veriler, sunumun klinik olmayan kisminda saglanir.

Farede tek-dozlu sinir testinde kullanilan numunelerin lOO uL'lik enjeksiyonlarina yönelik SEÇ-HPLC profilleri belirlenmistir. Analiz öncesinde polisorbat 80 ile aniden artan Formülasyon #l'deki natalizumab numunesi, 20 dakika akabinde ayrisan 260 nm'de sogurgan materyale az miktarda sahiptir. 34'üncü dakikada ayrisan pik polisorbat 80 eklemesi olmadan bu natalizumab ;partisinde bulunmustur` ve dolayisiyla polisorbat 80 degradasyonu göstermez. Aksine, alti hafta boyunca 40°C'de saklanan Formülasyon #2'deki plasebo, egri altindaki toplam alanin 12.8 milyon uV°saniye olmasi nedeniyle tam degradasyon göstermistir. Formülasyon #2'de olan ve alti hafta boyunca 40°C'de saklanan natalizumab numunesi daha az tam degradasyona sahip olmustur. Analiz, 40°C'de saklanan ve farede tek-dozlu sinir testinde test edilen numunelerin çözünmüs polisorbat 80 ile dolu oldugunu dogrular.

Safsizlik Spesifikasyonlarinin Olusturulmasi Kismen çözünmüs polisorbat 80'in antikor agregasyonunu önleyebilip önleyemedigini degerlendirmek üzere, Formülasyon dönüstürmek 4üzere bir igne varliginda. 3 gün 'boyunca 60°C'ye isitilmistir. Reaksiyonun, SEC ve ters faz HPLC'sinin her ikisi araciligiyla tüm polisorbat 80'i çözdügü dogrulanmistir.

Bu materyal, %0.0l (w/V) polisorbat 80 ve çözünmüs polisorbat 80'in maksimum seviyesinin %50'sini içeren bir solüsyon ile sonuçlanarak, Formülasyon #2'de lO mg/mL'lik bir AN100226 solüsyonu ile bire bir seyreltilmistir. Bu antikor solüsyonlari birkaç saat boyunca çalkalama ve silikonlanmis siringalarin her ikisine maruz birakilmistir; antikor agregasyonu önlenmistir. Kontrol numuneleri ayni kosullara maruz kalmistir ancak polisorbat 80 kaydadeger çökelme göstermemistir.

Bu çalismadan, polisorbati 80'in en fazla yüzde ellisi çözündükçe, bu materyalin antikor agregasyonunu önlemek üzere uygun ortam saglayabilecegi sonucuna varilir.

Aktif ilaç ürününde oldukça az polisorbat degradasyonunun meydana gelmesi nedeniyle, izoelektrik odaklama (IEF) modelinin gözlemlenmesi, bu formülasyonun antikoru tehlike atmadigini dogrulamak. üzere gerçeklestiriliri 5 °C, 25°C ve 40°C saklama kosullarina yönelik alti haftalik stabilite zaman noktalarina yönelik IEF profilleri belirlenmistir. 5°C ve 25°C numunelerinin her ikisi, toplam protein yükünde herhangi bir degisiklik göstergesi olmadan referans standart ile karsilastirilabilir. 40°C numunesi, polisorbat 80 varliginda veya yoklugunda bir sivi formülasyonda bu ürüne tipik daha asidik türlere kayma göstermistir.

Polisorbat 80 degradasyonunun derecesi ile SEC-HPLC'den pik alani arasinda bir iliski olusturmak üzere, %0 ila 50 arasinda çözünmüs polisorbat 80'in alti konsantrasyonuna yönelik. bir dilüsyon serisi degerlendirilmistir. Formülasyon #2 bir igne ile 3 gün boyunca 60°C'ye isitilmistir ve SEC ve ters faz HPLC'si tarafindan %100 çözündügü dogrulanmistir. Reaksiyon karisim akabinde Formülasyon #l'de ANlOO226 saflastirilmis yigin ile seyreltilmistir, %0.02 (w/v) polisorbat 80 ile henüz artmistir ve SEÇ-HPLC araciligiyla analiz edilmistir. SEC profilleri 260 nm'de gözlemlenmistir.

Bu dilüsyon serilerden veriler, Çözünmüs polisorbat 80'in oraninin bir fonksiyonu olarak yaklasik olarak 24 dakika akabinde sogurganlik profiline yönelik entegre edilen (uV°saniye) toplam pik alani araciligiyla grafik haline getirilmistir. Bul grafikr 5 milyon uV°saniyeden daha az bir alanin, çözünme ürünlerine polisorbat 80'in yaklasik %50'lik bir kaybini temsil ettigini gösterir. Eklenen oksitlenmis polisorbat 80 ile kromatogramda geç ayrisan piklere yönelik pik alani arasinda dogrudan bir iliski vardir.

Natalizumab içindeki bu eser safsizlara yönelik bir ön sinir, faredeki tek-dozlu sinir testi, %50 çözünmüs polisorbat 80 ile antikor çözünürlük verisi ve polisorbat 80 degradasyonunun derecesinin tahminlerine bagli olarak olusturulmustur. Yöntem devam eden stabilite programina dahil edilmistir ve bir sinir belirlenmistir. Histidin tampon ile ek partiler üretilmesi halinde, bu sinirlar ayrica salim zamaninda uygulanacaktir.

Sinir: yaklasik olarak 24 dakika akabinde pikler toplam alan, 4 x 106 uv-saniyeyi geçmeyecektir. 1.7 mg/mL Natalizumab Formülasyonu mg Natalizumab mg Sodyum fosfat, USP mg Sodyum klorid, USP mg Polisorbat 80, NF Fosforik asit ile pH'in 6.0 ± 0.5'e ayarlanmasi, NF. mL. 5-8°C'de tercih edilen saklama ile. .0 mg/mL Natalizumab Formülasyonu mg Natalizumab mg Sodyum fosfat, USP mg Sodyum klorid, USP mg Polisorbat 80, NF Fosforik asit ile pH'in 6.0 i 0.5'e ayarlanmasi, NF. mL. 5-8°C'de tercih edilen saklama ile. mg/mL Natalizumab Formülasyonu altindaki .0 mg Natalizumab 1.4 mg Sodyum fosfat, USP 8.2 mg Sodyum klorid, USP 0.2 mg Polisorbat 80, NF Fosforik asit ile pH'in 6.0 ± 0.5'e ayarlanmasi, NF. mL. 5-8°C'de tercih edilen saklama ile. 50.0 mg/mL Natalizumab Formülasyonu 50.0 mg Natalizumab 1.4 mg Sodyum fosfat, USP 8.2 mg Sodyum klorid, USP 0.2 mg Polisorbat 80, NF Fosforik asit ile pH'in 6.0 ± 0.5'e ayarlanmasi, NF. mL. 5-8°C'de tercih edilen saklama ile. .0 mg/mL Natalizumab Formülasyonu .0 mg/mL natalizumab l4O mM NaCl l0 mM sodyum fosfat Fosforik. asit ile pH'in 6.0 ± 0.5'e ayarlanmasi. biçimde yaklasik 5°C ila yaklasik 8°C'de formülasyonun saklanmasi. mg/mL Natalizumab Formülasyonu .0 mg Natalizumab 1.4 mg Sodyum fosfat, USP 8.2 mg Sodyum klorid, USP 0.2 mg Polisorbat 80, NF Fosforik asit ile pH'in 6.0 ± 0.5'e ayarlanmasi, NF. mL. 5-8°C'de tercih edilen saklama ile. mg/mL Natalizumab Formülasyonu .0 mg Natalizumab 1.4 mg Sodyum fosfat, USP 8.2 mg Sodyum klorid, USP 0.1 mg Polisorbat 80, NF Fosforik asit ile pH'in 6.0 ± 0.5'e ayarlanmasi, NF. mL. 5-8°C'de tercih edilen saklama ile. mg/mL Natalizumab Formülasyonu .0 mg/mL Natalizumab 140 mM NaCl mM sodyum fosfat Fosforik asit ile pH'in 6.0 ± 0.5'e ayarlanmasi ve hacmin 125 mL'ye getirilmesi. En uygun biçimde yaklasik 5°C ila yaklasik 8°C'de formülasyonun saklanmasi.

Liyofolize Natalizumab Formülasyonu -200 mg/mL arasinda, yüksek konsantrasyonda antikorun ek sivi formülasyonlari, 3.0 ila 7.0 araligindaki pH'ta tamponlama saglamak üzere 2 ila 50 nM araligindaki konsantrasyonda fosfat veya diger uygun tampondan (örnegin histidin, sitrat, asetat veya süksinat) olusabilir. En çok tercih edildigi üzere, pH 6.0, +/- 0.5'tir. Poliollerin (örnegin sorbitol ve manitol), disakkaritlerin (örnegin sakkaroz veya trehaloz ve amino asitlerin (örnegin glisin) eklenmesi, stabiliteyi sürdürmek ve izotonik bir solüsyonu saglamak üzere sodyum klorid ile degisen miktarlarda eklenebilir. Bunlarla sinirlandirilmaksizin polisorbatlar gibi sürfaktanlarin kullanimi, %0.00l ila 2 araliginda kullanilmasi durumunda stabilite ekler. Bir sivi formülasyon hazirlamak üzere, natalizumab yaklasik %0.06 polisorbat 80 ile 10 mM sodyum fosfat, 140 mM sodyum klorid içinde, pH 6'da 65 mg/mL'ye konsantre edilmistir. Ortaya çikan solüsyon partikülatlar olmadan nispeten bulaniktir. Numune, SEC araciligiyla herhangi bir yüksek nwleküler agirlikli agregat veya düsük. moleküler agirlikli türler olmadan %99'dan fazla monomer içermistir.

Stabil bir liyofilize farmasötik formülasyon saglanir. Fosfat tamponun dondurma sirasinda bir pH degisimine ugramasi nedeniyle, fosfati farkli bir tampon ile degistirmek gereklidir. Bu tampon, 3.0 ila 7.0 pH araliginda, en çok tercih edildigi üzere 6.0 +/- 0.5 araliginda etkili bir sekilde tamponlama yetenegine sahip histidin, sitrat veya süksinattan olusabilir.

Polioller (örnegin nmnitol) ve sekerlerin (örnegin sakkaroz) kullanimi kriyo- ve liyo-koruma saglamak üzere gereklidir. Bu polioller, tonisitenin stabilitesi ve ayarlanmasini saglamak üzere tek basina veya kombinasyon halinde kullanilabilir. Ek olarak, lO-lOOO mM'lik› seviyelerde amino asitlerin (örnegin glisin) kullanimi agregasyonu önlemek üzere kullanilabilir.

Polisorbatlar veya poloksamerler gibi sürfaktanlar, liyofilizasyon öncesi ve yeniden olusturma sonrasi stabilite saglamak ve daha hizli yeniden olusturma süreleri saglamak üzere %0.001 ila %2.0 arasindaki seviyelerde kullanilabilir.

Nihai saflastirma adimi akabinde, protein, konsantrasyona yönelik ultrafiltrasyon ve tampon degisimine yönelik diyafiltrasyon kullanilarak formüle edilebilir. Protein ayrica tampon degisimine yönelik kolon kromatografisi kullanilarak formüle edilebilir. Bu tekniklerin bir kombinasyonu ayrica kullanilabilir.

Ek olarak, istenen nihai protein konsantrasyonu, istenenden düsük bir protein ve eksipiyan konsantrasyonunda doldurma ve daha küçük bir hacimde yeniden olusturma araciligiyla elde edilebilir. Örnegin, lOO mg/mL'lik bir solüsyon elde etmek üzere ]_ mL ile yeniden olusturma akabinde, 40 mg/mL'lik bir solüsyonun 2.5 mL'lik bir dolum hacmi kullanilabilir. Örnegin, 20 mg/mL'lik bir konsantrasyondaki natalizumab, 5 mM histidin, 20 mg/mL sakkaroz ve %0.02 polisorbat 80, pH 6 içeren bir solüsyonda liyofilize edilmistir. Solüsyon Viyal basina 5ml'de lO mL'lik borosilikat cam Viyallere doldurulmustur ve gri bütil kauçuk liyofilizasyon tipalar ile donatilmistir. Liyofilizasyon bir Virtis Gensis model liyofilizasyon araci kullanilarak gerçeklestirilmistir. Ürün saat boyunca -60°C'lik bir raf sicakliginda dondurulmustur ve akabinde raf sicakligi -40°C'ye çikartilmistir. Birincil kurutma 20 saat boyunca -lO°C'lik bir raf sicakliginda ve 100 mTorr'luk bir hazne basincinda gerçeklestirilmistir. Ikincil kurutma 10 saat boyunca 25°C'lik bir raf sicakliginda ve 100 mTorr'luk bir hazne basincinda elde edilmistir. Viyaller vakum altinda tipalanmistir.

Viyaller akabinde lOO mg/mL natalizumab içeren bir formülasyon vermek üzere 1 mL steril WFI kullanilarak yeniden olusturulmustur. Numuneler liyofilizasyonun hemen akabinde ve 40 derecede liyofilize formda 2 haftalik saklama akabinde analiz edilmistir. Her iki durumda yeniden olusturma süreleri çabuktur. Yeniden olusturulan solüsyonlar partikülat materyal yoklugu ile berrak ve renksiz olmustur. Numune, SEC araciligiyla herhangi bir yüksek moleküler agirlikli agregat , veya düsük moleküler agirlikli türler` olmadan %99'dan fazla monomer içermistir. 40 derecede 2 haftalik saklama akabinde, numune referansa göre %94 potansi göstermistir (spesifikasyon

Claims (6)

1. ISTEMLER
2. .20 mg/ml natalizumab, 10 mM fosfat tampon, %0.02 (w/v)
3. polisorbat 80 ve 140 mM sodyum klorid içeren stabil, aköz
4. bir formülasyon olup, özelligi formülasyonun 6.0±O.
5. 5 bir

   pH'a sahip olmasidir.

   .Istem l'in formülasyonu olup, özelligi formülasyonun en az
6. 6 ay boyunca 5-8°C arasinda bir sicaklikta stabil

   olmasidir.

   . Istem 1'in formülasyonu olup, özelligi fosfat tamponun

   sodyum fosfat olmasidir.

   . Istemler l-3'ten herhangi birinin stabil formülasyonunu

   barindiran bir kabi içeren bir üretim maddesidir.