CN115023276A - 从抗-lag3抗体生产中分离宿主细胞脂肪酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供在色谱方法中从抗‑LAG3抗体或抗原结合片段分离宿主细胞脂肪酶的方法，以及通过使用色谱方法从抗‑LAG3抗体或抗原结合片段分离宿主细胞脂肪酶来改善抗‑LAG3抗体制剂中的聚山梨酯‑80稳定性的方法。还提供了包含抗‑LAG3抗体或抗原结合片段和小于2ppm的宿主细胞脂肪酶的药物组合物。

Description

从抗-LAG3抗体生产中分离宿主细胞脂肪酶的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年1月29日提交的的美国临时专利申请号62/967,347的权益，将其整体引入本文作为参考。
电子提交的序列表的引用
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。所述ASCII拷贝创建于2021年1月19日，命名为24955WOPCT-SEQTXT-19JAN2021.txt，大小为14.2千字节。发明领域
本文提供在色谱方法中从抗-LAG3抗体分离宿主细胞蛋白(HCP)(例如，脂肪酶)的方法。本文还提供通过使用色谱方法从抗-LAG3抗体(例如，单克隆抗体)分离HCP(例如，脂肪酶)来改善抗LAG3抗体制剂(例如，药物物质制剂或药物产品制剂)中的聚山梨醇酯-80(PS-80)稳定性的方法。
发明背景
LAG-3(淋巴细胞活化基因-3)是一种在活化的T细胞、B细胞、NK细胞和浆细胞样树突细胞上表达的细胞表面分子。LAG-3在结构上与CD4类似，并且作为抑制受体与MHC II类分子结合。LAG-3显示负调节T细胞活化和增殖，以及在肿瘤浸润淋巴细胞上与其他抑制受体共表达。LAG3的表达指示高度耗竭的T细胞表型。参见Goldberg MV1,Drake CG.Curr.Top.Microbiol.Immunol.2011；344:269-78。
在抗体(例如单克隆抗体)的生物加工和制备中，宿主细胞蛋白(HCP)(例如脂肪酶)构成通常难以从抗体中除去的杂质的一部分。这样的杂质可以在生物药物的安全性和功效方面引起各种问题。全世界的监管机构要求生物制药产品满足某些验收标准，包括杂质水平和用于检测和定量杂质的测试。几种抗-LAG3抗体处于临床开发中，并且期望开发从这些抗体中去除HCP(例如，脂肪酶)的有效且高效的方法。
发明简述
本公开内容提供通过色谱方法从抗-LAG3抗体或抗原结合片段分离HCP(例如，脂肪酶)的方法，以及通过使用疏水相互作用(HIC)或阳离子交换(CEX)色谱方法从抗-LAG3抗体或抗原结合片段分离HCP(例如，脂肪酶)来改善抗-LAG3抗体制剂(例如，药物物质制剂或药物产品制剂)中PS-80稳定性的方法。本公开内容至少部分地基于以下发现：在两种蛋白质之间的分离因子(α)和/或HCP(例如，脂肪酶)的分配系数(Kp)达到某些数值范围的操作条件下，HCP(例如，脂肪酶)和抗-LAG3抗体或抗原结合片段可以充分分离。
在一个实施方案中，脂肪酶是PLBL2。在又另一个实施方案中，脂肪酶是LPLA2。在一个实施方案中，脂肪酶是LP-PLA2。在一个实施方案中，HCP是簇蛋白。
在另一个方面，本文提供药物组合物，其包含抗LAG3抗体或抗原结合片段和小于2ppm的宿主细胞脂肪酶。本公开内容还提供一种药物组合物，其在配制时包含抗LAG3抗体或抗原结合片段和聚山梨酯80(PS80)或聚山梨酯20(PS20)，其中在2-8℃下3个月时，PS80或PS20的浓度维持在配制时浓度的≥90％。
附图简述
图1显示对于通过盐浓度调节结合而言典型的一系列HIC条件，PLBL2或LPLA2 logKp值。
图2显示PLBL2、LPLA2和两种不同mAb mAb2(Ab6)和mAb3在HIC树脂上的log Kp值的比较。当与PLBL2和LPLA2比较时，mAb3具有非常类似的与HIC结合，但mAb2的结合比mAb3、PLBL2和LPLA2更弱，提供了PLBL2和LPLA2与mAb2的分离潜力比与mAb3的分离潜力更大。
图3显示在5±3℃下，在2、4、6和14周间隔下，Ab6 AEX池药物物质(AEX DS)和Ab6HIC结合和洗脱池药物物质(HIC B&E DS)或Ab6 HIC流过物药物物质(HIC FT DS)的PS-80浓度。
图4显示在5℃±3℃(倒置)、25℃的加速条件(25℃±2℃，60％相对湿度，倒置)和40℃的应激条件(40℃±2℃，75％相对湿度，倒置)下3个月，实施例6的Ab6a药物产品的PS-80浓度。
发明详述
定义
下面具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文件中其他地方特别地定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
如本文中可互换地使用的术语“操作条件”、“运行条件”、“加工条件”或“工艺条件”指用于操作色谱方法的条件。操作条件可以是平衡条件、加载条件、洗涤条件和/或洗脱条件等。操作条件包括但不限于色谱树脂的类型、树脂骨架、树脂配体、操作溶液的pH、操作溶液的组成、操作溶液的每种成分的浓度、操作溶液的电导率、操作溶液的离子强度、操作溶液的阳离子强度、操作溶液的阴离子强度或两种或多种上述因素的组合。
术语“操作溶液”指用于操作色谱方法的溶液。操作溶液可以是平衡溶液、加载或进料溶液、洗涤溶液和/或洗脱溶液等。
如本文使用的术语“分配系数”或“Kp”指在特定操作条件下平衡时与色谱树脂结合的蛋白质的浓度(Q)与保留在溶液(C)中的蛋白质的浓度的比率。特定蛋白质的分配系数可以如下计算：Kp＝Q/C。
如本文使用的术语“分离因子”或“α”指第一蛋白质的分配系数(Kp，蛋白质1)和第二蛋白质的分配系数(Kp，蛋白质2)之比。分离因子量化了在特定操作条件下色谱树脂在两种蛋白质之间的选择性。其可以用于预测在操作条件下，两种蛋白质通过色谱树脂的分离程度。两种蛋白质之间的分离因子可以如下计算：α＝Kp,蛋白质1/Kp,蛋白质2；或logα＝log Kp,蛋白质1–logKp,蛋白质2。
如本文使用的“洗脱液”指通过色谱的液体。在一些实施方案中，洗脱液是加载溶液的流过物。在其它实施方案中，洗脱液包含通过色谱的洗脱溶液和从色谱洗脱的任何另外的组分。
如本文使用的“聚山梨酯-80稳定性”或“PS-80稳定性”指PS-80在常规储存条件(例如，5℃±3℃、25℃±3℃、60％±5％相对湿度(RH)、40℃±2℃、75％±5％相对湿度(RH))下在一段时间(例如，1周、1个月、6个月、1年、2年等)内保持物理、化学和/或生物学稳定的状态。PS-80稳定性可以使用各种方法通过完整PS-80分子的量和/或降解产物的量来测量，所述方法包括但不限于质谱(MS)、液相色谱-质谱(LCMS)、液相色谱-多反应监测(LC-MRM-MS)或在具有带电气溶胶检测器(CAD)的HPLC系统上的固相萃取(SPE)。
当修饰物质或组合物的量(例如，mM或m)、制剂组分的百分比(v/v或w/v)、溶液/制剂的pH、或表征方法中的步骤的参数值等时，术语“约”指数值量的变化，其可以在例如通过物质或组合物的制备、表征和/或使用中涉及的典型测量、处理和取样程序；通过这些程序中的仪器误差；通过用于制备或使用组合物或进行所述程序的成分的制备、来源或纯度的差异；等中出现。在某些实施方案中，“约”可以指所述值的±0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％的变化。
当在一段时间后测量PS80或PS20稳定性的上下文中使用时，短语“当配制时保持在≥80％、85％、90％、95％或99％的浓度”考虑了PS80或PS20浓度测量中±10％的测定变异性。
如本文使用的“Ab6变体”指包含重链和轻链序列的单克隆抗体，所述重链和轻链序列与抗体Ab6中的那些序列基本上相同(如下所述和WO2016028672中所述，通过引用整体并入)，除了在位于轻链CDR外部的位置处具有三个、两个或一个保守氨基酸取代和位于重链CDR外部的六个、五个、四个、三个、两个或一个保守氨基酸取代，例如，变体位置位于免疫球蛋白链的FR区或恒定区中，并且任选地具有重链的C末端赖氨酸残基的缺失。换句话说，Ab6和Ab6变体包含相同的CDR序列，但由于在全长轻链和重链序列中分别在不超过三个或六个其它氨基酸位置处具有保守氨基酸取代而彼此不同。Ab6变体就以下特性而言与Ab6基本上相同：对人LAG3的结合亲和力和阻断人LAG3与人MHC II类分子结合的能力。
如本文使用的术语“抗体”指显示出期望的生物学或结合活性的任何形式的抗体。因此，其以最广义使用，并且具体地涵盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人源化抗体、完全人抗体、嵌合抗体和骆驼化单结构域抗体。“亲本抗体”是通过在修饰抗体用于预定用途(例如将抗体的人源化以用作人治疗剂)之前将免疫系统暴露于抗原而获得的抗体。
通常，基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。重链的羧基末端部分可以限定主要负责效应子功能的恒定区。通常，人轻链被分类为κ和λ轻链。此外，人重链通常分类为μ、δ、γ、α或ε，并分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链之内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。一般参见，Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.RavenPress,N.Y.(1989)。
每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，通常，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点通常是相同的。
通常，重链和轻链两者的可变结构域都包含三个高变区，也称为互补决定区(CDR)，其位于相对保守的框架区(FR)内。CDR通常通过框架区进行比对，使得能够结合特定表位。通常，从N-末端到C-末端，轻链和重链可变结构域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。根据Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat,et al.；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；5th ed.；NIH Publ.No.91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat,et al.,(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616；Chothia,et al.,(1987)J Mol.Biol.196:901-917or Chothia,et al.,(1989)Nature 342:878-883的定义，将氨基酸分配给每个结构域。
如本文使用的，除非另有说明，否则“抗体片段”或“抗原结合片段”指抗体的抗原结合片段，即保留与全长抗体所结合的抗原特异性结合的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗体结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；由抗体片段形成的纳米抗体和多特异性抗体。
“嵌合抗体”指其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种(例如人)或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种(例如小鼠)或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的抗体，以及这样的抗体的片段，只要它们表现出期望的生物活性。
“人抗体”指仅包含人免疫球蛋白序列的抗体。如果在小鼠、小鼠细胞或源自小鼠细胞的杂交瘤中产生，则人抗体可含有鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”分别指仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。
“人源化抗体”指含有来自非人(例如鼠)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。这样的抗体含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。当需要区分人源化抗体与亲本啮齿动物抗体时，将前缀“hum”、“hu”或“h”加入到抗体克隆名称中。啮齿类动物抗体的人源化形式通常将包含亲本啮齿动物抗体的相同CDR序列，尽管可以包括某些氨基酸序列取代以增加亲和力、增加人源化抗体的稳定性或出于其他原因。
在整个说明书和权利要求书中以包容性的意义使用“包含”或例如“包括”、“包含”或“由……组成”的变体，即，指定所述特征的存在，但不排除可以实质上增强本发明的任何实施方案的操作或效用的其他特征的存在或添加，除非上下文由于明确的语言或必要的暗示而另外要求。
“保守修饰的变体”或“保守取代”指用具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、骨架构象和刚性等)的其他氨基酸取代蛋白质中的氨基酸，使得可以频繁地变化而不改变蛋白质的生物活性或其他期望性质，例如抗原亲和力和/或特异性。本领域技术人员认识到，通常，多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不会改变生物活性(参见例如Watson et al.(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/CummingsPub.Co.,p.224(4th Ed.))。此外，结构上或功能上类似的氨基酸的取代不太可能破坏生物活性。示例性的保守取代在下表1中列出。
表1.示例性的保守氨基酸取代
Figure BDA0003770073440000071
Figure BDA0003770073440000081
在整个说明书和权利要求书中使用的“基本上由......组成(consistsessentially of)”和变体如“基本上由......组成(consisting essentially of)”或“基本上由......组成(consisting essentially of)”表示包括任何所列举要素或要素组，并且任选地包括与所述要素具有类似或不同性质的其他要素，其不会实质上改变指定给药方案、方法或组合物的基本性质或新颖性质。作为非限制性实例，基本上由所列举氨基酸序列组成的抗-LAG3抗体或抗原结合片段还可以包括一个或多个氨基酸，包括一个或多个氨基酸残基的取代，其实质上不影响结合化合物的性质。
如本文使用的“框架区”或“FR”指除CDR区之外的免疫球蛋白可变区。
如本文使用的“Kabat”指Elvin A.Kabat((1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.)开创的免疫球蛋白比对和编号系统。
人LAG3包含氨基酸序列：
MWEAQFLGLL FLQPLWVAPV KPLQPGAEVP VVWAQEGAPA QLPCSPTIPL QDLSLLRRAGVTWQHQPDSG PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYT VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGRQRGDFSLWLRPAR RADAGEYRAA VHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASVHWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTYRDGFN VSIMYNLTVL GLEPPTPLTVYAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEQQLNATVTLAI ITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSQ RSFSGPWLEA QEAQLLSQPWQCQLYQGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL LLFLILGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRPRRFSALEQGI HPPQAQSKIE ELEQEPEPEP EPEPEPEPEP EPEQL
(SEQ ID NO:1)；还参见Uniprot登录号P18627。残基1-22是天然前导序列。
如本文使用的“单克隆抗体”或“MAH”或“mAb”指基本上同源的抗体群，即构成该群的抗体分子除了可能以少量存在的天然存在的突变外，在氨基酸序列上是相同的。相反，常规(多克隆)抗体制备物通常包括大量不同的抗体，这些抗体在其可变区，特别是其CDR中具有不同的氨基酸序列，这些抗体通常对不同的表位具有特异性。修饰语“单克隆”指示抗体的特征为从基本上同质的抗体群获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过Kohler等(1975)Nature 256：495首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利号4,816，567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson et al.(1991)Nature 352:624-628和Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。还参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731。
如本文(包括所附权利要求书)使用的，除非上下文另有明确规定，否则词语的单数形式例如“一”、“一个”和“所述”包括其相应的复数指代。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应当包括单数。
如本文使用的术语“至少一个”项目或“一个或多个”项目各自包括选自清单的单个项目以及选自清单的两个或更多个项目的混合物。
术语“比如”或“例如”之后的任何示例并不意味着穷举或限制。
除非有相反的明确说明，否则本文引用的所有范围都是包括性的；即，该范围包括该范围的上限和下限的值以及其间的所有值。作为一个实例，本文所述的温度范围、百分比、等同物范围等包括该范围的上限和下限以及其间的连续体中的任何值。所有范围也旨在包括所有包括的子范围，尽管不一定明确阐述。例如，pH 4.0-5.0的范围旨在包括pH4.0、4.1、4.13、4.2、4.1-4.6、4.3-4.4和5.0。另外，如本文使用的术语“或”表示在适当的情况下可以组合的替代方案；也就是说，术语“或”包括单独列出的每个替代方案以及它们的组合。
在根据马库什组或其他替代分组描述本公开内容的方面或实施方案的情况下，本公开内容不仅包括作为整体列出的整个组，而且包括单独的组的每个成员和主组的所有可能的亚组，而且还包括缺少一个或多个组成员的主组。本公开内容还预期明确排除权利要求中的任何组成员中的一个或多个。
本文描述了示例性方法和材料，但是与本文描述的那些类似或等同的方法和材料也可以用于本公开内容的实践或测试。材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。
抗-LAG3抗体
在一个实施方案中，抗-LAG3抗体是Ab6或Ab6变体。
Ab6具有以下抗体组分：
具有以下氨基酸序列的轻链免疫球蛋白：
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO:2)；
具有以下氨基酸序列的重链免疫球蛋白：
QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNDGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO:3)；
具有以下氨基酸序列的轻链免疫球蛋白可变结构域：DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKpGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:4)；
具有以下氨基酸序列的重链免疫球蛋白可变结构域：QMQLVQSGPEVKKpGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNDGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:5)；和以下CDR：
CDR-L1:KASQSLDYEGDSDMN(SEQ ID NO:6)；
CDR-L2:GASNLES(SEQ ID NO:7)；
CDR-L3:QQSTEDPRT(SEQ ID NO:8)；
CDR-H1:DYNVD(SEQ ID NO:9)；
CDR-H2:DINPNDGGTIYAQKFQE(SEQ ID NO:10)；和
CDR-H3:NYRWFGAMDH(SEQ ID NO:11)。
在本发明方法的一些优选实施方案中，抗-LAG3抗体或其抗原结合片段包含：(a)轻链CDR SEQ ID NO:6、7和8，和(b)重链CDR SEQ ID NO:9、10和11。
在本发明方法的其它优选实施方案中，抗-LAG3抗体或其抗原结合片段包含(a)包含SEQ ID NO:5的重链可变区，和(b)包含SEQ ID NO:4的轻链可变区。在本发明方法的另一个优选实施方案中，抗LAG3抗体包含(a)包含SEQ ID NO:3的重链，和(b)包含SEQ ID NO:2的轻链。在本发明方法的另一个优选实施方案中，抗LAG3抗体具有两条重链和两条轻链，其中(a)所述重链由SEQ ID NO:3组成，和(b)所述轻链由SEQ ID NO:2组成。
在一个实施方案中，抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如人恒定区，例如γ1、γ2、γ3或γ4人重链恒定区或其变体。在另一个实施方案中，抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，例如人轻链恒定区，例如λ或κ人轻链区或其变体。例如但不限于，人重链恒定区可以是γ4，人轻链恒定区可以是κ。在一个替代实施方案中，抗体的Fc区是具有Ser228Pro突变的γ4(Schuurman,J et.al.,Mol.Immunol.38:1-8,2001)。
在一些实施方案中，可以将不同的恒定结构域附加至来源于本文提供的CDR的人源化VL和VH区。例如，如果本发明的抗体(或片段)的特定预期用途是需要改变的效应子功能，则可以使用除人IgG1之外的重链恒定结构域，或者可以使用杂合IgG1/IgG4。
色谱方法
用于将从抗-LAG3抗体或抗原结合片段分离宿主细胞脂肪酶的色谱方法可以是CEX色谱方法。在另一个实施方案中，色谱方法是HIC色谱方法。前述色谱方法可以进行或随后进行CEX、AEX、混合模式IEX、混合模式AEX、混合模式CEX、亲和色谱方法、蛋白A或蛋白G亲和色谱方法、固定化金属亲和色谱(IMAC)方法和HAC色谱方法中的一种或多种。在一个实施方案中，CEX或HIC色谱方法之前是蛋白A色谱，然后是AEX色谱。色谱法。在一个实施方案中，CEX或HIC色谱方法之前是以结合和洗脱模式进行的蛋白A色谱，然后是以流过模式进行的AEX色谱。
IEX色谱基于分子的净电荷分离分子。分离作为目标带电分子与抗衡离子之间竞争在IEX色谱树脂上的带相反电荷的配体基团的结果而发生。分子与IEX树脂的结合强度取决于分子的净电荷，其受操作条件(例如pH和离子强度)的影响。IEX树脂包括AEX树脂和CEX树脂。AEX树脂可含有取代基，如二乙基氨基乙基(DEAE)、三甲基氨基乙基(TMAE)、季氨基乙基(QAE)和季胺(QA)基团。CEX树脂可含有取代基，如羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸酯(P)和磺酸酯(S)。纤维素IEX树脂，如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32和CM-52，可从Whatman Ltd.Maidstone，Kent，U.K.获得。基于Sephadex的和交联的IEX树脂也是已知的。例如，DEAE-、QAE-、CM-和SP-Sephadex，以及DEAE-、Q-、CM-和S-Sepharose，以及Sepharose均可从GE Healthcare，Piscataway，NJ获得。此外，DEAE和CM衍生的乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物，如TOYOPEARLTM DEAE-650S或M和TOYOPEARLTM CM-650S或M均可从Toso Haas Co.,Philadelphia,PA获得。POROSTM HS、POROSTM HQ、POROSTM XS均可从Thermo FisherScientific,Waltham,MA获得。
HIC色谱基于分子的疏水性分离分子。目标分子中的疏水区通过疏水相互作用与HIC树脂结合。相互作用的强度取决于操作条件，如pH、离子强度和盐浓度。通常，HIC树脂含有与疏水性配体(例如，烷基或芳基)偶联的基础基质(例如，交联的琼脂糖或合成的共聚物材料)。HIC树脂的非限制性实例包括Phenyl SEPHAROSETM 6FAST FLOWTM(Pharmacia LKBBiotechnology,AB,Sweden)；Phenyl SEPHAROSETM High Performance(Pharmacia LKBBiotechnology,AB,Sweden)；Octyl SEPHAROSETM High Performance(Pharmacia LKBBiotechnology,AB,Sweden)；FractogelTM EMD Propyl或FRACTOGELTM EMD Phenyl(E.Merck,Germany)；MACRO-PREPTM Methyl或MACRO-PREPTM t-Butyl Supports(Bio-Rad,CA)；WP HI-Propyl(C3)TM(J.T.Baker,NJ)；TOYOPEARLTM醚，苯基或丁基(TosoHaas,PA)；和Tosoh-Butyl-650M(Tosoh Corp.,Tokyo,Japan)。
HAC色谱使用式[Ca10(PO4)6(OH)2]的不溶性羟基化磷酸钙作为基质和配体两者。HAC树脂的官能团包括成对的带正电荷的钙离子(C-位点)和带负电荷的磷酸根离子(P-位点)。C-位点可以与蛋白质表面上的羧酸残基相互作用，而P-位点可以与碱性蛋白质残基相互作用。蛋白质和HAC树脂之间的结合强度取决于操作条件，包括pH、离子强度、溶液组成、组合物中每种组分的浓度、pH梯度、组分浓度梯度等。各种HAC树脂，例如CHTTM陶瓷羟基磷灰石和CFTTM陶瓷氟磷灰石，是可商购的。
亲和色谱基于目标分子与树脂的官能团之间的高度特异性相互作用来分离分子，例如抗原与抗体、酶与底物、受体与配体或蛋白质与核酸等之间的相互作用。一些常用的亲和色谱树脂包括用于纯化抗体的蛋白A或蛋白G树脂、用于纯化生物素/亲和素及其衍生物的亲和素生物素树脂、用于纯化GST标记的重组蛋白的谷胱甘肽树脂、用于分离血浆凝固蛋白的肝素树脂、用于纯化与金属离子特异性相互作用的蛋白质的IMAC树脂等。每种亲和色谱的操作条件取决于相互作用的机制和影响相互作用的因素。商业亲和色谱树脂包括但不限于MabSelect Sure、UNOsphere SUPrATM、
Figure BDA0003770073440000144
和
Figure BDA0003770073440000145
混合模式可以是上述或本领域普通技术人员理解的任何两种或更多种功能或机制的组合，例如IEX和HIC的组合(例如AEX/HIC或CEX/HIC)，AEX和CEX的组合(AEX/CEX)，或HIC、AEX和CEX的组合(HIC/AEX/CEX)等。示例性的混合模式色谱树脂包括但不限于OminPacPCX-500,
Figure BDA0003770073440000146
Obelisc R,Oblisc N,Acclaim Trinity P1,Acclaim Trinity P2,Capto Adhere,Capto Adhere Impres,Capto MMC,Capto MMC Impres,Capto Core 700,PPA Hypercel,HEA Hypercel,MEP Hypercel,Eshmuno HCX,Toyopearl MX-Trp-650M,Nuvia C Prime,CHT I型和CHT II型。
分配系数(Kp)和分离因子(α)
分配系数(Kp)和分离因子(α)是色谱方法的操作条件特有的两个热力学参数，其可用于量化可在操作条件下通过所述方法实现的分离。
通过将已知液体浓度的蛋白质(或其他目标分子)与已知体积的色谱树脂混合，并计算平衡时与树脂结合的蛋白质和保留在液体中的蛋白质的比率来确定分配系数Kp：Kp＝q/c＝[结合的]/[游离的]。
分配通常以log Kp报告，其可以使用本文所述的UV方法从约0至2精确定量。log Kp筛选的一般规则如下：
log Kp≥1.5，与树脂强结合；
log Kp<1，预期将用于结合-和-洗脱模式的洗脱的条件；
0.5<log Kp<1，将显示一些结合的弱相互作用条件；
log Kp<0.5，非常少或没有结合。
不同物质之间的log Kp值的差异可用于通过计算分离因子α来预测物质的分离，如下：α＝Kp，蛋白质1/Kp，蛋白质2；logα＝log Kp，蛋白质1–log Kp，蛋白质2，其中logα远离0表示更好的分离。在某些实施方案中，logα的绝对值大于0.2指示两种物质之间的良好分离。在一些实施方案中，logα的绝对值大于0.3指示两种物质之间的良好分离。在其他实施方案中，logα的绝对值大于0.5指示两种物质之间的良好分离。在其它实施方案中，logα的绝对值大于1.0指示两种物质之间的良好分离。
HCP
本文提供的各种方法适用于多种HCP。HCP可以是在宿主细胞中表达的抗-LAG3抗体或抗原结合片段的生物加工期间源自宿主细胞(例如CHO细胞)的任何内源蛋白。HCP的非限制性实例包括结构蛋白、功能蛋白、分泌蛋白、酶(如脂肪酶、蛋白酶和激酶等)。在一些实施方案中，HCP是结构蛋白。在某些实施方案中，HCP是功能性蛋白。在其它实施方案中，HCP是分泌蛋白。在又另一个实施方案中，HCP是酶。在一个实施方案中，HCP是脂肪酶。在另一个实施方案中，HCP是蛋白酶。在又另一个实施方案中，HCP是激酶。在一个实施方案中，HCP是簇蛋白。
在某些实施方案中，脂肪酶选自PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶是PLBL2。在另一个实施方案中，脂肪酶是LPL。在又另一个实施方案中，脂肪酶是LPLA2。在一个实施方案中，脂肪酶是LP-PLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶是LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的脂肪酶。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括选自PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL的两种、三种、四种或五种不同的脂肪酶。在一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LPL。在另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LPLA2。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LP-PLA2。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶包括LPL和LPLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶包括LPL和LP-PLA2。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括LPL和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括LPLA2和LP-PLA2。在一个实施方案中，脂肪酶包括LPLA2和LAL。在另一个实施方案中，脂肪酶包括LP-PLA2和LAL。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL和LPLA2。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL和LP-PLA2。在一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL和LAL。在另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPLA2和LP-PLA2。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶包括LPL、LPLA2和LP-PLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶包括LPL、LPLA2和LP-PLA2。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括LPL、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括LPLA2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2和LP-PLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2和LAL。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPLA2、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL。
宿主细胞可以是用于表达外源蛋白的任何细胞。用于制备生物药物的常见宿主细胞包括，但不限于CHO细胞、幼仓鼠肾(BHK21)细胞、鼠骨髓瘤NS0细胞、鼠骨髓瘤Sp2/0细胞、人胚肾293(HEK293)细胞、纤维肉瘤HT-1080细胞、PER.C6细胞、HKB-11细胞、CAP细胞、HuH-7细胞、鼠C127细胞及其天然产生或遗传修饰的变体。在某些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是幼仓鼠肾(BHK21)细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是鼠骨髓瘤NS0细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是鼠骨髓瘤Sp2/0细胞。在仍然其他实施方案中，宿主细胞是人胚肾293(HEK293)细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是纤维肉瘤HT-1080细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是PER.C6细胞。在其它实施方案中，宿主细胞是HKB-11细胞。在仍然其他实施方案中，宿主细胞是CAP细胞。在仍然其他实施方案中，宿主细胞是HuH-7细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是鼠C127细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是上述宿主细胞的天然产生的变体。在其他实施方案中，宿主细胞是上述宿主细胞的遗传修饰变体。
在某些实施方案中，CHO细胞脂肪酶选自PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶是PLBL2。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶是LPL。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶是LPLA2。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶是LP-PLA2。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶是LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的CHO细胞脂肪酶。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括选自PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL的两种、三种、四种或五种不同的CHO细胞脂肪酶。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2和LPL。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2和LPLA2。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2和LP-PLA2。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2和LAL。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL和LPLA2。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL和LP-PLA2。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL和LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPLA2和LP-PLA2。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPLA2和LAL。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LP-PLA2和LAL。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL和LPLA2。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL和LP-PLA2。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL和LAL。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPLA2和LP-PLA2。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL、LPLA2和LP-PLA2。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL、LPLA2和LAL。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPLA2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2和LP-PLA2。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2和LAL。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPLA2、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL。
筛选用于从抗-LAG3抗体分离宿主细胞脂肪酶的操作条件的方法
本公开内容提供筛选用于通过本发明的色谱方法从抗-LAG3抗体或抗原结合片段分离HCP(例如脂肪酶)的操作条件的方法。
对于HCP(例如，脂肪酶)或抗-LAG3抗体或抗原结合片段，可以设计和检查操作条件((包括pH、有或没有盐、盐类型、盐浓度、溶液中的其他组分(例如，抗衡离子)、每种组分的浓度或加载蛋白浓度等)的众多组合。待筛选的操作条件可以是所选树脂的常用工艺条件，例如平衡条件、加载条件、洗涤条件、洗脱条件或汽提条件等。
HCP(例如，脂肪酶)和抗-LAG3抗体或抗原结合片段的Kp值通过本文公开的或本领域普通技术人员通常理解的方法测定。使用本文所述的方法计算HCP(例如，脂肪酶)和抗-LAG3抗体或抗原结合片段之间的Logα值。通常，logα的绝对值大于0.5对于HCP(例如，脂肪酶)和抗-LAG3抗体或抗原结合片段之间的良好分离是期望的。
在一个实施方案中，使用树脂浆料平板法进行筛选，如Welsh et al.,BiotechnolProg.30(3):626-635(2014)中公开的。例如，将pH、盐和进料的不同组合的混合物加入96孔过滤板(例如，P/N MSBVN1250，Millipore Sigma，Burlington，MA)中。色谱树脂体积为2-50μL，并且液体进料体积为200μL。在一些实施方案中，对每种树脂测试16-32个条件。在其他实施方案中，对每种树脂测试24-96个条件。通过真空过滤完成树脂和液体的分离。首先，将树脂与平衡缓冲剂一起孵育10分钟，并将平衡步骤重复三次。接着，将树脂与进料一起孵育60分钟。然后，将树脂在汽提条件下孵育10分钟并重复两次。平衡步骤允许从初始树脂浆料缓冲剂交换缓冲剂。进料混合的60min时间允许在给定的一组条件下树脂配体和蛋白质之间的假平衡。通过280-320nm处的UV吸光度对来自进料步骤的滤液进行测量，以确定蛋白质的最终液体浓度，c。蛋白质的结合浓度q由c和已知进料浓度c0的质量平衡来确定。
在另一个实施方案中，使用微柱方法进行筛选，如Welsh et al.,BiotechnolProg.30(3):626-635(2014)或Petroff et al.,Biotech Bioeng.113(6):1273-1283(2015)中公开的。例如，将不同组合的pH、盐和进料的混合物在具有3cm柱床高度的0.6mL柱形式中筛选。平行筛选多达8个柱。通过将线性流速从典型柱的约300cm/h降低至微型柱形式的约45cm/h，在微型柱中保持约4min的典型停留时间。保留用于色谱筛选的所有其他典型参数。通过收集在96孔板中以产生类似于实验室规模研究的色谱图，可以将洗脱液级分收集为池或级分。
一旦确定了用于从抗-LAG3抗体或抗原结合片段分离HCP(例如，脂肪酶)的操作条件，就可以相应地调节加载流体和/或树脂的条件。例如，可以通过用将使其达到必要操作条件的溶液洗涤树脂来平衡树脂。
从抗-LAG3抗体分离宿主细胞脂肪酶的方法本公开内容进一步提供通过色谱方法从抗-LAG3抗体或抗原结合片段分离HCP(例如，脂肪酶)的方法。
在一个方面，本文提供一种通过疏水相互作用色谱(HIC)方法从包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和宿主细胞脂肪酶的组合物中分离宿主细胞脂肪酶的方法，其包括：
(a)在加载操作条件下，使包含所述组合物的加载流体通过HIC树脂；和
(b)收集流过物中的所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段；
其中分离因子(α)是所述脂肪酶的分配系数(Kp)与所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段的Kp的比率，并且其中在所述加载操作条件下，logα大于0.5；其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO:9、10和11的重链CDR。
在另一个方面，本文提供一种通过疏水相互作用色谱(HIC)方法从包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和宿主细胞脂肪酶的组合物中分离宿主细胞脂肪酶的方法，其包括：
(a)使包含所述组合物的加载流体通过HIC树脂；和
(b)在洗脱操作条件下，用洗脱溶液从色谱树脂洗脱所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段；
其中分离因子(α)是所述脂肪酶的分配系数(Kp)与所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段的Kp的比率，并且其中在所述洗脱操作条件下，logα大于0.5；其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO:9、10和11的重链CDR。
在一个进一步的方面，本文提供一种通过阳离子交换(CEX)方法从包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和宿主细胞脂肪酶的组合物中分离宿主细胞脂肪酶的方法，其包括：
(a)使包含所述组合物的加载流体通过CEX树脂；和
(b)在洗脱操作条件下，用洗脱溶液从色谱树脂洗脱所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段；
其中分离因子(α)是所述脂肪酶的分配系数(Kp)与所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段的Kp的比率，并且其中在所述洗脱操作条件下，logα大于0.5；其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO:9、10和11的重链CDR。
在某些实施方案中，在加载操作条件下，logα大于1.0。在一些实施方案中，在加载操作条件下，脂肪酶的log Kp大于1.0。在其他实施方案中，在加载操作条件下，脂肪酶的log Kp大于1.5。在某些实施方案中，在加载操作条件下，logα大于0.5，且脂肪酶的log Kp大于1.0。在一些实施方案中，在加载操作条件下，logα大于0.5，且脂肪酶的log Kp大于1.5。在其他实施方案中，在加载操作条件下，logα大于1.0，且脂肪酶的log Kp大于1.0。在仍然其他实施方案中，在加载操作条件下，logα大于1.0，且脂肪酶的log Kp大于1.5。在某些实施方案中，脂肪酶选自PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶是PLBL2。在另一个实施方案中，脂肪酶是LPL。在又另一个实施方案中，脂肪酶是LPLA2。在一个实施方案中，脂肪酶是LP-PLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶是LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的脂肪酶。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括选自PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL的两种、三种、四种或五种不同脂肪酶。在一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LPL。在另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LPLA2。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LP-PLA2。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶包括LPL和LPLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶包括LPL和LP-PLA2。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括LPL和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括LPLA2和LP-PLA2。在一个实施方案中，脂肪酶包括LPLA2和LAL。在另一个实施方案中，脂肪酶包括LP-PLA2和LAL。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL和LPLA2。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL和LP-PLA2。在一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL和LAL。在另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPLA2和LP-PLA2。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶包括LPL、LPLA2和LP-PLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶包括LPL、LPLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括LPL、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括LPLA2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2和LP-PLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2和LAL。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPLA2、LP-PLA2和LAL。在还仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，脂肪酶是CHO细胞脂肪酶。在某些实施方案中，CHO细胞脂肪酶选自PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶是PLBL2。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶是LPL。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶是LPLA2。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶是LP-PLA2。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶是LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的CHO细胞脂肪酶。在还仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括选自PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL的两种、三种、四种或五种不同的CHO细胞脂肪酶。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2和LPL。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2和LPLA2。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2和LP-PLA2。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2和LAL。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL和LPLA2。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL和LP-PLA2。在还仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL和LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPLA2和LP-PLA2。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPLA2和LAL。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LP-PLA2和LAL。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL和LPLA2。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL和LP-PLA2。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL和LAL。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPLA2和LP-PLA2。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPLA2和LAL。在仍然CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL、LPLA2和LP-PLA2。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL、LPLA2和LAL。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPLA2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2和LP-PLA2。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2和LAL。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPLA2、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL。在本文提供的各种方法的某些实施方案中，操作条件还包括通过加入盐来调节离子强度和/或电导率。在一些实施方案中，加入盐的作用是达到期望的logα。在其它实施方案中，加入盐的作用是达到脂肪酶的期望的log Kp。在仍然其他实施方案中，加入盐的作用是达到脂肪酶的期望的logα和期望的logKp。因此，在一个实施方案中，操作条件进一步包括通过加入盐来达到期望的logα。在另一个实施方案中，操作条件进一步包括通过加入盐来达到脂肪酶的期望log Kp。在又另一个实施方案中，操作条件进一步包括通过加入盐来达到脂肪酶的期望的logα和期望的logKp。在一些实施方案中，操作溶液中的盐选自氯化钠、乙酸钠、磷酸钠、硫酸铵、硫酸钠和Tris-HCl。在一个实施方案中，盐是氯化钠。在另一个实施方案中，盐是乙酸钠。在又另一个实施方案中，盐是磷酸钠。在仍然另一个实施方案中，盐是硫酸铵。在一个实施方案中中，盐是硫酸钠。在另一个实施方案中，盐是Tris-HCl。在一个实施方案中，操作溶液中氯化钠的浓度为约100mM至约225mM，色谱树脂为CEX，操作条件的pH为约4.5至约8.0。在另一个实施方案中，操作溶液中氯化钠的浓度为约150mM至约180mM，色谱树脂为CEX，操作条件的pH为约5.0至约8.0。在一个实施方案中，操作溶液中氯化钠的浓度为约100mM至约225mM，色谱树脂为CEX，操作条件的pH为约5.0至约6.0。在另一个实施方案中，操作溶液中氯化钠的浓度为约150mM至约180mM，色谱树脂为CEX，操作条件的pH为约5.0至约6.0。在一个进一步的方面，本文提供一种通过疏水相互作用色谱方法从包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和PLBL2或LPLA2的组合物中分离PLBL2或LPLA2的方法，其包括：(a)使包含所述组合物的加载流体通过疏水相互作用色谱树脂；和
(b)收集流过物中的所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段；
和其中所述加载流体具有约25至80mS/cm的电导率；其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO:9、10和11的重链CDR。
在一个进一步的方面，本文提供一种通过疏水相互作用色谱方法从包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和PLBL2或LPLA2的组合物中分离PLBL2或LPLA2的方法，其包括：
(a)使包含所述组合物的加载流体通过HIC树脂；和
(b)用洗脱溶液从HIC树脂洗脱所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段；其中所述洗脱溶液具有约25至80mS/cm的电导率；
其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO:9、10和11的重链CDR。
在仍然另一个特定的实施方案中，操作溶液中硫酸钠的浓度为约500mM至约620mM，色谱树脂为HIC，并且操作条件的pH为约7。在仍然另一个特定的实施方案中，操作溶液中硫酸钠的浓度为约510mM至约560mM，色谱树脂为HIC，并且操作条件的pH为约7。
在HIC色谱方法的一个方面，加载流体或洗脱溶液具有约50至70mS/cm的电导率。在另一个实施方案中，加载流体或洗脱溶液包含约300mM至约650mM的一价盐或二价盐。在另一个实施方案中，加载流体或洗脱溶液包含约300mM至约650mM的一价盐或二价盐，并且pH为4.5-7.5。在另一个实施方案中，盐为约500-620mM的硫酸钠，并且pH为约5-7.5。在一个进一步的实施方案中，盐是560mM的硫酸钠，并且加载流体或洗脱溶液的pH为约7。
本文提供的分离方法可以与本文所述或本领域常用的一个或多个分离步骤组合使用。在一个实施方案中，一个或多个分离步骤在本文所述的方法之前。在另一个实施方案中，一个或多个分离步骤遵循本文所述的方法。在又另一个实施方案中，在本文所述的两种方法之间进行一个或多个分离步骤。在还仍然其他实施方案中，在本文所述的方法之前、之后和/或之间进行一个或多个分离步骤。对于可以组合多少个分离步骤或方法或者待组合的分离步骤或方法的顺序没有限制。
在本文提供的各种方法的更多实施方案中，加载流体是来自先前色谱方法的洗脱液。在一个实施方案中，先前的色谱方法包括亲和色谱。在另一个实施方案中，先前的色谱方法包括亲和色谱，接着是离子交换色谱。在又另一个实施方案中，亲和色谱是蛋白A色谱。在仍然另一个实施方案中，离子交换色谱法是AEX色谱。在仍然另一个实施方案中，先前的色谱方法包括蛋白A色谱，接着是AEX色谱。
改善抗-LAG3抗体制剂中PS-80稳定性的方法
本公开内容进一步提供通过使用色谱方法从抗-LAG3抗体或抗原结合片段分离HCP(例如，脂肪酶)来改善抗-LAG3抗体或抗原结合片段制剂(例如，药物物质制剂或药物产品制剂)中PS-80稳定性的方法。
在仍然另一个方面中，本文提供一种改善抗-LAG3抗体或抗原结合片段制剂中聚山梨酯-80(PS-80)稳定性的方法，其包括：
(a)在加载操作条件下，使包含宿主细胞脂肪酶和抗-LAG3抗体或抗原结合片段的加载流体通过HIC树脂；
(b)收集流过物中的所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段；和
(c)配制所述抗-LAG3抗体或其抗原结合片段，使得抗-LAG3抗体或其抗原结合片段制剂为含有PS-80的溶液；
其中分离因子(α)是所述脂肪酶的分配系数(Kp)与所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段的Kp的比率，并且其中在所述加载操作条件下，logα大于0.5；其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO:9、10和11的重链CDR。与单独的步骤(c)相比，步骤(a)、(b)和(c)的PS-80稳定性得到改善。
在仍然另一个方面中，本文提供一种配制抗-LAG3抗体或抗原结合片段制剂的方法，其包括：
(a)在加载操作条件下，使包含宿主细胞脂肪酶和抗-LAG3抗体或抗原结合片段的加载流体通过HIC树脂；
(b)收集流过物中的所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段；和
(c)通过向该制剂中加入PS-80来配制所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段；
其中分离因子(α)是所述脂肪酶的分配系数(Kp)与所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段的Kp的比率，并且其中在所述加载操作条件下，logα大于0.5；其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO:9、10和11的重链CDR。
在某些实施方案中，在加载操作条件下，logα大于1.0。
在一些实施方案中，在加载操作条件下，脂肪酶的log Kp大于1.0。在其他实施方案中，在加载操作条件下，脂肪酶的log Kp大于1.5。
在某些实施方案中，在加载操作条件下，logα大于0.5，且脂肪酶的log Kp大于1.0。在一些实施方案中，在加载操作条件下，logα大于0.5，且脂肪酶的log Kp大于1.5。在其他实施方案中，在加载操作条件下，logα大于1.0，且脂肪酶的log Kp大于1.0。在仍然其他实施方案中，在加载操作条件下，logα大于1.0，且脂肪酶的log Kp大于1.5。
在另一个方面，本文提供一种改善抗-LAG3抗体制剂中PS-80稳定性的方法，其包括：
(a)使包含宿主细胞脂肪酶和所述抗-LAG3抗体的加载流体通过HIC树脂；
(b)在洗脱操作条件下，用洗脱溶液从色谱树脂洗脱所述抗-LAG3抗体；和
(c)配制所述抗-LAG3抗体，使得所述抗-LAG3抗体制剂为含有PS-80的溶液；
其中α是所述脂肪酶的Kp与所述抗-LAG3抗体的Kp的比率，并且其中在所述洗脱操作条件下，logα大于0.5。与单独的步骤(c)相比，步骤(a)、(b)和(c)的PS-80稳定性得到改善。
在另一个方面，本文提供一种配制抗-LAG3抗体制剂的方法，其包括：
(a)使包含宿主细胞脂肪酶和所述抗-CTLA4抗体的加载流体通过HIC树脂；
(b)在洗脱操作条件下，用洗脱溶液从色谱树脂洗脱所述抗-LAG3抗体；和
(c)通过向该制剂中加入PS-80来配制所述抗-LAG3抗体；
其中α是脂肪酶的Kp与抗-LAG3抗体的Kp的比率，并且其中在洗脱操作条件下logα大于0.5。在某些实施方案中，在洗脱操作条件下，logα大于1.0。
在一些实施方案中，在洗脱操作条件下，脂肪酶的log Kp大于1.0。在其他实施方案中，在洗脱操作条件下，脂肪酶的log Kp大于1.5。
在某些实施方案中，在洗脱操作条件下，logα大于0.5，且脂肪酶的log Kp大于1.0。在一些实施方案中，在洗脱操作条件下，logα大于0.5，且脂肪酶的log Kp大于1.5。在其他实施方案中，在洗脱操作条件下，logα大于1.0，且脂肪酶的log Kp大于1.0。在仍然其他实施方案中，在洗脱操作条件下，logα大于1.0，且脂肪酶的log Kp大于1.5。
在某些实施方案中，脂肪酶选自PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶是PLBL2。在另一个实施方案中，脂肪酶是LPL。在又另一个实施方案中，脂肪酶是LPLA2。在一个实施方案中，脂肪酶是LP-PLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶是LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的脂肪酶。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括选自PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL的两种、三种、四种或五种不同的脂肪酶。在一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LPL。在另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LPLA2。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LP-PLA2。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶包括LPL和LPLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶包括LPL和LP-PLA2。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括LPL和LAL。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括LPLA2和LP-PLA2。在一个实施方案中，脂肪酶包括LPLA2和LAL。在另一个实施方案中，脂肪酶包括LP-PLA2和LAL。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL和LPLA2。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL和LP-PLA2。在一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL和LAL。在另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPLA2和LP-PLA2。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶包括LPL、LPLA2和LP-PLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶包括LPL、LPLA2和LAL。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括LPL、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括LPLA2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2和LP-PLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2和LAL。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPLA2、LP-PLA2和LAL。在还仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，脂肪酶是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞脂肪酶。在某些实施方案中，CHO细胞脂肪酶选自PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶是PLBL2。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶是LPL。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶是LPLA2。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶是LP-PLA2。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶是LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的CHO细胞脂肪酶。在还仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括选自PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL的两种、三种、四种或五种不同的CHO细胞脂肪酶。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2和LPL。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2和LPLA2。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2和LP-PLA2。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2和LAL。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL和LPLA2。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL和LP-PLA2。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL和LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPLA2和LP-PLA2。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPLA2和LAL。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LP-PLA2和LAL。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL和LPLA2。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL和LP-PLA2。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL和LAL。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPLA2和LP-PLA2。在又一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL、LPLA2和LP-PLA2。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL、LPLA2和LAL。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPL、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括LPLA2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2和LP-PLA2。在另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2和LAL。在又另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPLA2、LP-PLA2和LAL。在还仍然另一个实施方案中，CHO细胞脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL。
在本文提供的各种方法的某些实施方案中，操作条件进一步包括通过加入盐来调节操作溶液的离子强度和/或电导率。在一个实施方案中，操作条件还包括通过加入盐来调节操作溶液的离子强度。在另一个实施方案中，操作条件还包括通过加入盐来调节操作溶液的电导率。在又另一个实施方案中，操作条件进一步包括通过加入盐来调节操作溶液的离子强度和电导率。在一些实施方案中，加入盐的作用是获得期望的logα。在其它实施方案中，加入盐的作用是获得期望的脂肪酶的log Kp。在又其他实施方案中，加入盐的作用是获得期望的logα和期望的脂肪酶的log Kp。
在一些实施方案中，操作溶液中的盐选自氯化钠、乙酸钠、磷酸钠、硫酸铵、硫酸钠和Tris-HCl。在一个实施方案中，盐是氯化钠。在另一个实施方案中，盐是乙酸钠。在又另一个实施方案中，盐是磷酸钠。在仍然另一个实施方案中，盐是硫酸铵。在一个实施方案中中，盐是硫酸钠。在另一个实施方案中，盐是Tris-HCl。
在仍然另一个特定实施方案中，操作溶液中氯化钠的浓度为约100mM至约225mM，色谱树脂是HIC，并且操作条件的pH为约7。
在还仍然另一个特定实施方案中，操作溶液中氯化钠的浓度为约510mM至约560mM，色谱树脂是HIC，并且操作条件的pH为约7。
在本文提供的各种方法的更多实施方案中，加载流体是来自先前色谱方法的洗脱液。在一个实施方案中，先前的色谱方法包括亲和色谱。在另一个实施方案中，先前的色谱方法包括亲和色谱，接着是非亲和色谱。在又另一个实施方案中，亲和色谱是蛋白A色谱。在仍然另一个实施方案中，非亲和色谱是AEX色谱。在还仍然另一个实施方案中，先前色谱方法包含蛋白A色谱，接着是AEX色谱。在一个实施方案中，加载流体是来自以结合和洗脱模式进行的蛋白A色谱，接着是以流过模式进行的AEX色谱的洗脱液。
药物组合物
本公开内容还提供包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和小于2ppm的宿主细胞脂肪酶的药物组合物，其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO：6.7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO：9，10和11的重链CDR。
在某些实施方案中，药物组合物包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和小于1ppm的宿主细胞脂肪酶。在其它实施方案中，药物组合物包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和小于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9ppm的宿主细胞脂肪酶。在一个实施方案中，药物组合物包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和小于0.1ppm的宿主细胞脂肪酶。在另一个实施方案中，药物组合物包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和小于0.2ppm的宿主细胞脂肪酶。在又另一个实施方案中，药物组合物包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和小于0.3ppm的宿主细胞脂肪酶。在仍然在另一个实施方案中，药物组合物包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和小于0.4ppm的宿主细胞脂肪酶。在还仍然另一个实施方案中，药物组合物包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和小于0.5ppm的宿主细胞脂肪酶。在一个实施方案中，药物组合物包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和小于0.6ppm的宿主细胞脂肪酶。在另一个实施方案中，药物组合物包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和小于0.7ppm的宿主细胞脂肪酶。在又另一个实施方案中，药物组合物包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和小于0.8ppm的宿主细胞脂肪酶。在仍然另一个实施方案中，药物组合物包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和小于0.9ppm的宿主细胞脂肪酶。
在药物组合物的某些实施方案中，脂肪酶选自PLBL2、LPL、LPLA2、Lp-PLA2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶是PLBL2。在另一个实施方案中，脂肪酶是LPL。在又另一个实施方案中，脂肪酶是LPLA2。在一个实施方案中，脂肪酶是LP-PLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶是LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的脂肪酶。在还仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括选自PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL的两种、三种、四种或五种不同的脂肪酶。在一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LPL。在另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LPLA2。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LP-PLA2。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶包括LPL和LPLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶包括LPL和LP-PLA2。在又一个实施方案中，脂肪酶包括LPL和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括LPLA2和LP-PLA2。在一个实施方案中，脂肪酶包括LPLA2和LAL。在另一个实施方案中，脂肪酶包括LP-PLA2和LAL。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL和LPLA2。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL和LP-PLA2。在一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPLA2和LP-PLA2。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶包括LPL、LPLA2和LP-PLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶包括LPL、LPLA2和LAL。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括LPL、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括LPLA2、LP-PLA2和LAL。在一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2和LP-PLA2。在另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2和LAL。在又另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPLA2、LP-PLA2和LAL。在仍然另一个实施方案中，脂肪酶包括PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL。
本公开内容还提供一种包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和聚山梨酯80(PS80)或聚山梨酯20(PS20)的药物组合物，其中在2-8℃下1、3、6、9或12个月时，PS80或PS20的浓度维持在配制时浓度的≥90％、95％或99％，其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO:9、10和11的重链CDR。在一个实施方案中，当配制时，所述药物组合物包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和约0.2mg/mL的聚山梨酯80(PS80)或聚山梨酯20(PS20)，其中在2-8℃下1、3、6、9或12个月时，PS80或PS20的浓度维持在至少约0.18mg/mL。在一个实施方案中，在制剂中使用PS80。在一个实施方案中，在2-8℃下1、3、6、9或12个月时，PS80维持在配制时浓度的≥95％。在一个实施方案中，当配制时，PS80维持在配制时浓度的≥99％。
本公开内容还提供药物组合物，当配制时其包含约20.0mg/ml的抗-LAG3抗体或抗原结合片段、约5.0mg/ml的派姆单抗、约54mg/ml的蔗糖；约0.2mg/mL的聚山梨酯80，约10mM的pH为约5.8的组氨酸缓冲剂；约56mM的L-精氨酸；和约8mM的L-甲硫氨酸；或药物组合物，当配制时其包含约25.0mg/ml的抗-LAG3抗体或抗原结合片段；约50mg/mL的蔗糖；约0.2mg/mL的聚山梨酯80；约10mM的pH为约5.8的组氨酸缓冲剂；约70mM的L-精氨酸-HCl；和任选地约10mM的L-甲硫氨酸，其中在2-8℃下1、3、6、9或12个月时，PS80的浓度维持在配制时浓度的至少90％、95％、99％、85％或80％。
在本文所述药物组合物的多个实施方案中，通过液相色谱-质谱(LC-MS)或液相色谱-多反应监测(LC-MRM-MS)测量宿主细胞脂肪酶的水平。
在一些实施方案中，药物组合物可以通过HIC色谱方法获得，所述方法包括以下步骤：
(a)使包含所述组合物的加载流体通过HIC树脂；和
(b)用具有pH为约5至约7.5且电导率为约25-80mS/cm的洗脱溶液洗脱抗-LAG3抗体或其抗原结合片段；或
(c)使用具有pH为约5至约7.5且电导率为约25-80mS/cm的加载操作条件，收集流过物中的所述抗-LAG3抗体或其抗原结合片段。
在其它实施方案中，药物组合物可以通过HIC色谱方法获得，所述方法包括以下步骤：
(a)使包含所述组合物的加载流体通过HIC树脂；和
(b)用具有pH为约5至约7.5且电导率为约50-70mS/cm的洗脱溶液洗脱抗-LAG3抗体或其抗原结合片段；或
(c)使用具有pH为约5至约7.5且电导率为约25-70mS/cm的加载操作条件，收集流过物中的所述抗-LAG3抗体或其抗原结合片段。
在其他实施方案中，HIC色谱之前是以结合和洗脱模式操作的蛋白A色谱和以流过模式操作的AEX色谱。
实施例
本节(第VI节)中的实施例是作为说明而非限制提供的。
实施例1：用于确定不同物质的Kp的方法
通过将已知液体浓度的蛋白质(或其他目标分子)与已知体积的色谱树脂混合，并计算与树脂结合的蛋白质和保留在液体中的蛋白质的比率来确定分配系数Kp：Kp＝q/c＝[结合的]/[游离的]。
对于随后的实施例2-3，色谱体积为20μL，液体体积为200μL，蛋白质浓度为0.5mg/mL。对于5mg/mL的有效树脂加载量，这些体积提供10:1的相比率。
通过在96-孔滤板(P/N MSBVN1250，Millipore Sigma，Burlington，MA)中强力混合树脂和液体进行筛选，并通过真空过滤分离树脂和液体。步骤顺序如下：
(a)3×平衡(不含进料的缓冲剂)，每个步骤孵育10min；
(b)1×进料混合，孵育60min；和
(c)2×汽提条件，每个步骤孵育10min。
平衡步骤允许从初始树脂浆料缓冲剂交换缓冲剂。进料混合的60min时间允许在给定的一组条件下树脂配体和蛋白质之间的假平衡。通过在280-320nm处的UV吸光度对来自进料步骤的滤液进行测量，以确定蛋白质的最终液体浓度，c。通过大约c的质量平衡和已知的进料浓度C0(0.5mg/mL)确定蛋白质的结合浓度q。
分配通常以log Kp报告，其可以使用本文所述的UV方法从约0至2精确定量。log Kp筛选的一般规则如下：
log Kp≥1.5，与树脂强结合；
log Kp<1，预期将用于结合-和-洗脱模式的洗脱的条件；
0.5<log Kp<1，将显示一些结合的弱相互作用条件；
log Kp<0.5，非常少或没有结合。不同物质之间的log Kp值也用于通过计算分离因子α来预测不同物质的分离，如下：α＝Kp，蛋白质1/Kp，蛋白质2；logα＝log Kp，蛋白质1–log Kp，蛋白质2，其中logα远离0表示更好的分离。在以下实施例中，α＝Kp,脂肪酶/Kp,mAb；logα＝log Kp,脂肪酶-logKp,mAb。Logα大于0.5指示脂肪酶和单克隆抗体之间的良好分离。Logα小于-0.5也指示脂肪酶和单克隆抗体之间的良好分离。
实施例2：在典型操作条件下PLBL2和mAb Kp值的比较
使用测定Kp和α的方法来评估在针对抗-LAG3抗体Ab6的操作条件下，通过各种色谱方法分离已知的脂肪酶杂质PLBL2的能力。
表2总结了在针对Ab6的几种操作条件下Ab6和PLBL2的log Kp和logα值。
表2.在针对Ab6的操作条件下Ab6和PLBL2的log Kp和logα值
Figure BDA0003770073440000351
Figure BDA0003770073440000361
对于蛋白A方法，PLBL2没有亲和力，因此预期大多数PLBL2在加载或洗涤步骤期间流过蛋白A树脂。池中存在的唯一PLBL2可能来自洗涤不足或与Ab6缔合。
对于CEX方法，Ab6在较低盐下具有较低的结合，因此在整个盐范围内具有更稳健的logα。对于AEX方法，Ab6与树脂的结合比与PLBL2更强，导致在加载和洗涤条件下的负logα。这表明如果以流过模式操作则没有分离潜力，并且甚至可以指示由于Ab6的更强结合导致在流过物中富集PLBL2。
还对AB6测试了另外的HIC方法。对于该方法，PLBL2在整个加载和洗脱条件下具有较高的log Kp，并且在较低范围的洗脱盐浓度下具有较大的logα值。这表明在这些较低盐条件下，Ab6回收和PLBL2分离都将更有利。
实施例3：对于HIC树脂在一系列条件下PLBL2和LPLA2 Kp值的作图
进行了PLBL2和LPLA2对具有可能潜在用于Ab6(mAb2)和mAb3的下游加工的不同缓冲剂和条件的HIC树脂的分配系数(表3)。
表3.针对绘制PLBL2或LPLA2 logKp筛选的条件。
Figure BDA0003770073440000371
通过在20mM的磷酸钠(pH7.0)的缓冲条件下调节硫酸钠浓度，进行PLBL2和LPLA2分配到HIC树脂Tosoh Butyl-650M中的测试(表3，图1)。两种脂肪酶都显示出典型的HIC行为，在高盐下具有强结合(对于PLBL2在250mM的硫酸钠以上和对于LPLA2在400mM的硫酸钠以上log Kp>1.5)，在较低盐下分配减少(对于PLBL2在150mM硫酸钠以下和对于LPLA2在200mM硫酸钠以下log Kp<1)。
还在表3中列出的条件下，在HIC树脂Tosoh Butyl-650M(图2)上比较了抗体和脂肪酶的分配。改变硫酸钠的浓度在mAb3和PLBL2之间提供很少的分离，其中仅300mM的硫酸钠在该条件下提供任何分离，logα为约0.3。LPLA2提供了稍微更好的分离，在300-400mM的硫酸钠之间logα为约0.5。相反，Ab6的疏水性比mAb3、PLBL2或LPLA2小得多，因此直到大于600mM的硫酸钠才转变为高于log Kp为1.5的与HIC树脂的强结合。对于Ab6和PLBL2，在300-500mM的硫酸钠之间可以获得1.5-2.0的logα值，这是一种非常宽的盐范围，具有在其中操作的有希望的分离能力。类似地，对于LPLA2，在该相同的盐范围内可以看到logα值大于1。
实施例4：用流过方法进行抗LAG3抗体制剂的疏水相互作用色谱纯化
使含有Ab6的收获细胞培养液进行如实施例2中所述的蛋白A亲和色谱和阴离子离子交换色谱，以及疏水相互作用色谱。在室温下，以流过模式操作疏水相互作用色谱(TosohToyopearl Butyl-650M)步骤，靶标加载量为150g/L树脂。用1.4M的Na2SO4将含有抗-LAG3抗体Ab6的病毒过滤产物调节至560mM的Na2SO4，将1kg的病毒过滤产物调节至0.77kg的1.4MNa2SO4。在加入1.4M的Na2SO4之后，用1M Tris碱将进料滴定至7.0的靶标pH，得到HIC加载量。表4详细列出了HIC色谱的操作步骤和参数：柱平衡，HIC色谱方法。柱流出物吸光度在280nm的波长处在线监测，并用于收集未调节的HIC产物。用1M乙酸溶液将未调节的HIC产物滴定至5.8的靶标pH。在pH调节之后，用2kg的10mM组氨酸、70mM精氨酸pH5.8稀释1kg的HIC产物，并通过Millipore SHC 0.5/0.2μm过滤器过滤，得到超滤的透滤(UFDF)加载。
Figure BDA0003770073440000381
通过如下所述的液相色谱-多反应监测(LC-MRM-MS)测试上述批次的过程中间体以及相应的色谱条样品的脂肪酶鉴定(表5)。在加载样品中发现PLBL2，但在HIC流过样品中不存在。
在Waters TQS三联四极MS上开发了与多重反应监测质谱(RP-UPLC-MRM MS)方法偶联的反相超高效液相色谱，以定量CHO脂肪酶PLBL2和LPLA2。8-min LC-MRM MS方法是脂肪酶特异性定量测定法，其提供两种脂肪酶在生物过程中间体和/或生物药物物质中的绝对定量(ng/mg或ppm)。通过将CHO重组PLBL2和LPLA2(MyBioSource)掺入Ab6药物物质中作为蛋白标准物，并将PLBL2的C13-和N15-重标记肽(H2N-LTFPTGR(13C6，15N4-OH))SEQ ID NO：12和LPLA2(H2N-IPVIGPLK(13C6，15N2)-OH SEQ ID NO：13)(New England肽)作为内标准(IS)，获得1-500ng/mg每种脂肪酶的测定定量范围。使样品和蛋白标准品变性，S-S键还原和烷基化，并在LC-MS分析之前用胰蛋白酶消化。将消化的样品加载到Waters AcquityUPLC BEH C18柱(50×2.1mm，1.7μm)上，并通过10至35％的流动相B(0.1％甲酸的乙腈溶液)的梯度以0.2mL/min的流速分离。流动相A是0.1％甲酸的水溶液。使用通过胰蛋白酶消化产生的替代肽的MRM跃迁、PLBL2肽LTFPTGR(SEQ ID NO：12)的m/z396.5(前体离子)-＞m/z430.3(碎片离子)和LPLA2肽IPVIGPLK(SEQ ID NO：13)的m/z 419.1(前体离子)-＞m/z362.3(碎片离子)，通过各自的校准曲线(峰面积比(分析物/IS)相对于分析物浓度)和用于线性回归的1/x2的加权因子进行PLBL2和LPLA2定量。
表5.Ab6过程中间体中内源性PLBL2的相对定量
样品 PLBL2(ng/mg)
在HIC加载之前的病毒过滤产物 183.2
HIC池(510、560、610mM的硫酸钠) 未检出
实施例5：用结合和洗脱方法进行疏水相互作用色谱纯化抗LAG3抗体制剂
使含有Ab6的收获细胞培养液进行如实施例2中所述的蛋白A亲和色谱和阴离子离子交换色谱，以及疏水相互作用色谱。在室温下，以结合和洗脱模式操作疏水相互作用色谱步骤(Toyopearl Butyl-650M树脂，来自TosohTM)，靶标加载量为30g/L树脂。用1.4M的Na2SO4调节含有Ab6的病毒过滤产物，将1kg的病毒过滤产物调节至2kg 1.4M Na2SO4。在加入1.4M的Na2SO4之后，用1M Tris碱将进料滴定至7.0的靶标pH，得到HIC加载量。通过Millipore SHC0.5/0.2μm过滤器过滤HIC加载物，并加载到柱上。表6详细描述了HIC色谱的操作步骤和参数：柱平衡和HIC色谱方法。在280nm波长处在线监测柱流出物吸光度，并用于收集未调节的HIC产物。用1M的乙酸溶液将未调节的HIC产物滴定至5.8的靶标pH。在pH调节之后，用2kg的10mM组氨酸、70mM的精氨酸pH5.8稀释1kg的HIC产物，并通过MilliporeSHC0.5/0.2μm过滤器过滤，产生超滤的透滤(UFDF)加载。
Figure BDA0003770073440000391
Figure BDA0003770073440000401
通过如下所述的液相色谱-质谱学(LC-MS)测试上述批次的过程中间体以及相应的色谱条样品的脂肪酶鉴定(表7)。在加载样品和汽提样品中发现PLBL2和簇蛋白，但在HIC洗脱池样品中不存在。
开发了通过LC-MS/MS(串联MS数据以数据依赖性采集或DDA模式获取)的HCP蛋白质组学，以提供生物过程中间体和药物物质(DS)的HCP谱，包括HCP鉴定和相对定量。对包括HIC柱加载溶液、HIC柱洗脱合并液和HIC柱-汽提样品的样品进行变性、DTT还原、IAA烷基化和胰蛋白酶消化。然后，通过在Waters H-class UPLC-Thermo QE Orbitrap系统上进行的LC-MS/MS(DDA)分析消化的样品。使用Waters ACQUITY UPLC PEPTIDE CSH C18柱(
Figure BDA0003770073440000402
1.7μm，1×150mm)进行分离，使用0.1％FA水溶液和0.1％FA的ACN溶液作为流动相A和B。通过Thermo PD2.2搜索CHO数据库，进行蛋白质鉴定(MS的质量准确度≤10ppm，MS/MS的质量准确度≤0.02Da；≤1％FDR；≥2个独特的肽ID/蛋白质)。通过由PD 2.2提取的其独特肽的∑XIC MS1峰面积获得HCP的相对定量。
表7.Ab6过程中间体中内源性PLBL2的相对定量
样品 PLBL2(ppm)
HIC加载 147.5
HIC池 未检出
HIC汽提 1253.0
实施例6：随宿主细胞脂肪酶的去除，PS-80的稳定性增加
Ab6a注射液是一种无菌、无防腐剂的溶液，其需要稀释用于静脉内输注。Ab6a是抗-LAG3抗体Ab6和抗-PD-1抗体MK-3475(派姆单抗)的固定剂量组合，每个单次使用的小瓶在2.0mL填充物中含有40mg的Ab6和10mg的MK-3475。药物产品组成为20.0mg/mL的Ab6、5.0mg/mL的MK-3475、54mg/mL的蔗糖；0.2mg/ml的聚山梨酯80，10mM的pH 5.8的组氨酸缓冲剂；56mM的L-精氨酸；和8mM的L-甲硫氨酸。使用来自实施例4的Ab6药物物质配制Ab6a药物产品。
对于Ab6a药物产品，聚山梨酯80(PS-80)的稳定性运行多至3个月(图4)。在5℃下，在3个月时间点观察到％PS-80含量的变化很小(0.19mg/mL)。在3个月时，观察到PS-80在25℃下的轻微降低(0.18mg/ml)，并且在40℃条件下以相同间隔观察到略微更显著的降低(0.16mg/ml)。
使用高效液相色谱(HPLC)，用混合模式柱(Waters Oasis Max柱，2.1×20mm，30μm)与柱后开关(post column switch)和带电气溶胶检测(CAD)的组合测定聚山梨酯80。CoronaCAD是质量敏感检测器，其对从柱洗脱的样品中基本上所有非挥发性化合物和一些半挥发性化合物作出响应。流动相A：0.5％(v/v)的乙酸水溶液和流动相B：异丙醇中的0.5％(v/v)乙酸以1mL/min的流速的梯度设置使用。用PS-80标准品上的二次拟合校准线进行聚山梨酯80浓度的计算，并报告为样品溶液中聚山梨酯80的浓度(mg/mL)。
在由双柱和三柱纯化方案产生的两种Ab6药物物质(DS)样品之间比较PS-80稳定性。双柱纯化方案包括蛋白A和AEX。将得到的AEX池(AEX)配制成：25mg/mL的Ab6；50mg/mL的蔗糖；0.2mg/mL的聚山梨酯80；10mM的pH为5.8的组氨酸缓冲剂；和70mM的L-精氨酸-HCl，且称为“AEX DS”。三柱纯化方案包括蛋白A、AEX及HIC结合和洗脱或流过(HIC B&E DS或HICFT DS)。将得到的HIC池配制成25mg/mL的Ab6；50mg/ml的蔗糖；0.2mg/mL的聚山梨酯80；10mM的pH为5.8的L-组氨酸缓冲剂；70mM的L-精氨酸和10mM的L-甲硫氨酸。将小瓶置于5℃±3℃；25℃±3℃，60％±5％相对湿度(RH)的稳定性室中。以2、4、6、14周的间隔取样并测试PS-80的浓度。
如图3所示，在5℃下，AEX DS中的PS-80的浓度从0.20(0周)降至约0.17mg/mL(6周)。PS-80的降解随着储存温度的升高而增加。例如，在25℃下，AEX DS中的PS-80浓度从0.20(0周)降至0.12mg/mL(6周)。另一方面，HIC B&E DS和HIC FT DS两者中的PS-80浓度在两种温度下均未随时间推移显著变化。PS-80稳定性方法的测定法可变性为±10％。当评估数据时，从初始时间点报告值≤±10％的任何变化均可以被视为值相似。假设AEX池中PLBL2的存在可能是AEX DS中在5-25℃下PS-80浓度下降的一个潜在原因。增加第三个HIC柱可以有效地去除脂肪酶，并改善HIC DS中的PS-80稳定性。
表8
Figure BDA0003770073440000421
测试通过实施例4纯化并配制成25mg/mL的Ab6；50mg/mL的蔗糖；0.2mg/mL的聚山梨酯80；10mM的pH为5.8的L-组氨酸缓冲剂；70mM的L-精氨酸和10mM的L-甲硫氨酸的Ab6药物的另外的PS80稳定性。将小瓶置于5℃±3℃的稳定性室中。以1、3、6、9和12个月的间隔取样并测试PS-80的浓度(表9)。PS-80的浓度没有随时间推移显著变化，并且在PS-80稳定性方法的测定可变性±10％内。
表9
Figure BDA0003770073440000422
Figure IDA0003770073500000011
Figure IDA0003770073500000021
Figure IDA0003770073500000031
Figure IDA0003770073500000041
Figure IDA0003770073500000051
Figure IDA0003770073500000061
Figure IDA0003770073500000071
Figure IDA0003770073500000081
Figure IDA0003770073500000091
Figure IDA0003770073500000101
Figure IDA0003770073500000111

Claims (37)

1.一种通过疏水相互作用色谱(HIC)方法从包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和宿主细胞脂肪酶的组合物中分离宿主细胞脂肪酶的方法，其包括：
(a)在加载操作条件下，使包含所述组合物的加载流体通过HIC树脂；和
(b)收集流过物中的所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段；
其中分离因子(α)是所述脂肪酶的分配系数(Kp)与所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段的Kp的比率，并且其中在所述加载操作条件下，logα大于0.5；其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO:9、10和11的重链CDR。
2.一种通过疏水相互作用色谱(HIC)方法从包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和宿主细胞脂肪酶的组合物中分离宿主细胞脂肪酶的方法，其包括：
(a)在加载操作条件下，使包含所述组合物的加载流体通过HIC树脂；和
(b)在洗脱操作条件下，用洗脱溶液从色谱树脂洗脱所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段；
其中分离因子(α)是所述脂肪酶的分配系数(Kp)与所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段的Kp的比率，并且其中在所述洗脱操作条件下，logα大于0.5；其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO:9、10和11的重链CDR。
3.一种通过阳离子交换(CEX)方法从包含抗LAG3抗体或抗原结合片段和宿主细胞脂肪酶的组合物中分离宿主细胞脂肪酶的方法，其包括：
(a)在加载操作条件下，使包含所述组合物的加载流体通过CEX树脂；和
(b)在洗脱操作条件下，用洗脱溶液从色谱树脂洗脱所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段；
其中分离因子(α)是所述脂肪酶的分配系数(Kp)与所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段的Kp的比率，并且其中在所述洗脱操作条件下，logα大于0.5；其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO:9、10和11的重链CDR。
4.一种改善抗-LAG3抗体或抗原结合片段制剂中的聚山梨酯-80(PS-80)稳定性的方法，其包括：
(a)在加载操作条件下，使包含宿主细胞脂肪酶和抗-LAG3抗体或抗原结合片段的加载流体通过HIC色谱树脂；
(b)收集流过物中的所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段；和
(c)配制所述抗-LAG3抗体或其抗原结合片段，使得所述抗-LAG3抗体或其抗原结合片段制剂为含有PS-80的溶液；
其中分离因子(α)是所述脂肪酶的分配系数(Kp)与所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段的Kp的比率，并且其中在所述加载操作条件下，logα大于0.5；其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO:9、10和11的重链CDR。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中在洗脱操作条件下，log a大于1.0。
6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述脂肪酶的log Kp大于1.0。
7.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述脂肪酶的log Kp大于1.5。
8.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述脂肪酶是CHO细胞脂肪酶。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述脂肪酶选自磷脂酶B样2(PLBL2)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、溶酶体磷脂酶A2(LPLA2)、磷脂酶A2 VII(LP-PLA2)和溶酶体酸性脂肪酶A(LAL)。
10.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述脂肪酶是PLBL2。
11.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述脂肪酶是LPLA2。
12.权利要求1-2和4中任一项的方法，其中所述加载操作条件或洗脱溶液包含选自氯化钠、乙酸钠、磷酸钠、硫酸铵、硫酸钠和Tris-HCl的盐，并且pH为约5-7.5。
13.权利要求12的方法，其中所述盐为氯化钾或氯化钠。
14.权利要求13的方法，其中所述操作溶液中氯化钠的浓度为约100mM至约225mM，所述色谱树脂为CEX，所述操作条件的pH为约5.0至约6.0。
15.权利要求13的方法，其中所述操作溶液中氯化钠的浓度为约150mM至约180mM，所述色谱树脂为CEX，所述操作条件的pH为约5.0至约6.0。
16.一种通过疏水相互作用色谱方法从包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和PLBL2或LPLA2的组合物中分离PLBL2或LPLA2的方法，其包括：(a)使包含所述组合物的加载流体通过疏水相互作用色谱树脂；和
(b)收集流过物中的所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段；
并且，其中所述加载流体具有约25至80mS/cm的电导率；其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO:9、10和11的重链CDR。
17.一种通过疏水相互作用色谱方法从包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和PLBL2或LPLA2的组合物中分离PLBL2或LPLA2的方法，其包括：
(a)使包含所述组合物的加载流体通过HIC树脂；和
(b)用洗脱溶液从HIC树脂洗脱所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段；其中所述洗脱溶液具有约25至80mS/cm的电导率；
其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO:9、10和11的重链CDR。
18.权利要求16或17的方法，其中所述加载流体或洗脱溶液具有约50至70mS/cm的电导率。
19.权利要求16或17的方法，其中所述加载流体或洗脱溶液包含约300mM至约650mM的一价盐或二价盐。
20.权利要求19的方法，其中所述盐为约500-620mM的硫酸钠，并且所述pH为约5-7.5。
21.权利要求20的方法，其中所述盐为约560mM的硫酸钠，并且所述加载溶液或洗脱溶液的pH为约7。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述加载流体为来自以结合和洗脱模式进行的蛋白A色谱，接着是以流过模式进行的AEX色谱的洗脱液。
23.一种组合物，其包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和小于2ppm的宿主细胞脂肪酶，其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQID NO:9、10和11的重链CDR。
24.权利要求23的组合物，其包含小于1ppm的宿主细胞脂肪酶。
25.权利要求23-24中任一项的组合物，其中所述脂肪酶选自PLBL2、LPL、LPLA2、LP-PLA2和LAL。
26.权利要求23-24中任一项的组合物，其中所述脂肪酶是PLBL2。
27.权利要求23至26中任一项的组合物，其中通过液相色谱-质谱(LC-MS)或液相色谱-多反应(LC-MRM-MS)测量所述宿主细胞脂肪酶的水平。
28.权利要求23-27中任一项的组合物，其中所述组合物是通过包括以下步骤的HIC方法可获得的：
(a)在加载操作条件下，使包含所述组合物的加载流体通过HIC树脂，所述组合物包含所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段和所述宿主细胞脂肪酶；和
(b)用具有pH为约5至约7.5且电导率为约25-80mS/cm的洗脱溶液洗脱所述抗-LAG3抗体或其抗原结合片段；或
(c)使用具有pH为约5至约7.5且电导率为约25-80mS/cm的加载操作条件，收集流过物中的所述抗-LAG3抗体或其抗原结合片段。
29.权利要求23-27中任一项的组合物，其中所述组合物是通过包括以下步骤的HIC方法可获得的：
(a)在加载操作条件下，使包含所述组合物的加载流体通过HIC树脂，所述组合物包含所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段和所述宿主细胞脂肪酶；和
(b)用具有pH为约5至约7.5且电导率为约50-70mS/cm的洗脱溶液洗脱所述抗-LAG3抗体或其抗原结合片段；或
(c)使用具有pH为约5至约7.5且电导率为约50-70mS/cm的加载操作条件，收集流过物中的所述抗-LAG3抗体或其抗原结合片段。
30.权利要求28或29的组合物，其中所述HIC色谱之前是以结合和洗脱模式操作的蛋白A色谱和以流过模式操作的AEX色谱。
31.一种包含抗-LAG3抗体或抗原结合片段和聚山梨酯80(PS80)或聚山梨酯20(PS20)的药物组合物，其中在2-8℃下1、3、6、9或12个月时，PS80或PS20的浓度维持在配制时浓度的≥90％，其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:6、7和8的轻链CDR，和(b)SEQ ID NO:9、10和11的重链CDR。
32.权利要求31的药物组合物，其在配制时包含约0.2mg/mL的聚山梨酯80。
33.权利要求31的药物组合物，当配制时，其包含约20.0mg/mL的所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段、约5.0mg/mL的派姆单抗、约54mg/mL的蔗糖；约0.2mg/mL的聚山梨酯80，约10mM的pH为约5.8的组氨酸缓冲剂；约56mM的L-精氨酸；和约8mM的L-甲硫氨酸。
34.权利要求31的药物组合物，其包含约25.0mg/mL的所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段；约50mg/mL的蔗糖；约0.2mg/mL的聚山梨酯80；约10mM的pH为约5.8的组氨酸缓冲剂；约70mM的L-精氨酸-HCl；和任选的约10mM的L-甲硫氨酸。
35.权利要求1至34中任一项的方法、组合物或药物组合物，其中所述抗-LAG3抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:5的重链可变区，并且所述轻链包含含有SEQ ID NO:4的轻链可变区。
36.权利要求1至34中任一项的方法、组合物或药物组合物，其中所述抗-LAG3抗体包含重链和轻链，并且其中所述重链包含SEQ ID NO:3和所述轻链包含SEQ ID NO:2。
37.权利要求1至34中任一项的方法、组合物或药物组合物，其中所述抗-LAG3抗体是Ab6变体。
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