JP2023512991A - 抗ｌａｇ３抗体生成からの宿主細胞リパーゼの分離方法 - Google Patents
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Abstract
クロマトグラフィープロセスにおいて抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片から宿主細胞リパーゼを分離する方法、およびクロマトグラフィープロセスを使用して抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片から宿主細胞リパーゼを分離することによって、抗ＬＡＧ３抗体製剤におけるポリソルベート－８０安定性を改善する方法がここに提供される。抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、２ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む医薬組成物も提供される。【選択図】図３
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／９６７，３４７号の利益を主張し、参照によりその全体を本明細書に組み込む。
本出願は、２０２０年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／９６７，３４７号の利益を主張し、参照によりその全体を本明細書に組み込む。
電子的に提出された配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年１月１９日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、２４９５５ＷＯＰＣＴ－ＳＥＱＴＸＴ－１９ＪＡＮ２０２１．ｔｘｔと命名され、サイズは１４．２キロバイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年１月１９日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、２４９５５ＷＯＰＣＴ－ＳＥＱＴＸＴ－１９ＪＡＮ２０２１．ｔｘｔと命名され、サイズは１４．２キロバイトである。
本明細書では、クロマトグラフィープロセスにおいて抗ＬＡＧ３抗体から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）（例えばリパーゼ）を分離する方法が提供される。本明細書ではまた、クロマトグラフィープロセスを使用して抗ＬＡＧ３抗体（例えばモノクローナル抗体）からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離することによって、抗ＬＡＧ３抗体製剤（例えば、医薬物質製剤または医薬品製剤）におけるポリソルベート－８０（ＰＳ－８０）安定性を改善する方法も提供される。
ＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子３）は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および形質細胞様樹状細胞上に発現される細胞表面分子である。ＬＡＧ－３は、ＣＤ４と構造的に類似しており、阻害性受容体としてＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。ＬＡＧ－３は、Ｔ細胞の活性化および増殖を負に調節するほか、腫瘍浸潤リンパ球上で他の阻害性受容体と共発現することが示された。ＬＡＧ３の発現は、高度に疲弊したＴ細胞表現型を示す。Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ＭＶ１，Ｄｒａｋｅ ＣＧ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；３４４：２６９－７８を参照されたい。
抗体（例えばモノクローナル抗体）のバイオプロセスおよび製造では、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）（例えばリパーゼ）は、抗体から除去することが多くの場合困難な不純物の一部を構成する。そのような不純物は、バイオ医薬品の安全性および有効性に対して様々な問題を引き起こす可能性がある。世界中の規制当局は、バイオ医薬品が、不純物のレベル、ならびに不純物の検出および定量のための試験を含む特定の許容基準を満たすことを要求している。いくつかの抗ＬＡＧ３抗体が臨床開発中であり、これらの抗体からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を除去するための効率的かつ効果的なプロセスを開発することが望ましい。
Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ＭＶ１，Ｄｒａｋｅ ＣＧ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；３４４：２６９－７８
本開示は、クロマトグラフィープロセスによって抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離する方法、および疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィープロセスまたはカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィープロセスを使用して抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離することによって、抗ＬＡＧ３抗体製剤（例えば、医薬物質製剤または医薬品製剤）におけるＰＳ－８０安定性を改善する方法を提供する。本開示は、ＨＣＰ（例えばリパーゼ）と抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片とが、２つのタンパク質間の分離係数（α）および／またはＨＣＰ（例えばリパーゼ）の分配係数（Ｋｐ）が特定の数値範囲に達する操作条件下で十分に分離され得るという発見に少なくとも部分的に基づく。
一実施形態では、リパーゼはＰＬＢＬ２である。さらに別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。一実施形態では、ＨＣＰはクラスタリンである。
別の態様では、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、２ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む医薬組成物が本明細書で提供される。本開示はまた、製剤化された際に、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）またはポリソルベート２０（ＰＳ２０）とを含む医薬組成物であって、２～８℃で３ヶ月の時点で、ＰＳ８０またはＰＳ２０の濃度が、製剤化された際の濃度の９０％以上に維持されている医薬組成物を提供する。
定義
特定の技術用語および科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書の他の箇所で具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。
特定の技術用語および科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書の他の箇所で具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。
本明細書で交換可能に使用される用語「操作条件（ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」、「操作条件（ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」、「処理条件（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」または「処理条件（ｐｒｏｃｅｓｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」は、クロマトグラフィープロセスを操作するための条件を指す。操作条件は、平衡化条件、ローディング条件、洗浄条件および／または溶出条件などであり得る。操作条件には、限定するものではないが、クロマトグラフィー樹脂の種類、樹脂骨格、樹脂リガンド、操作溶液のｐＨ、操作溶液の組成、操作溶液の各成分の濃度、操作溶液の導電率、操作溶液のイオン強度、操作溶液のカチオン強度、操作溶液のアニオン強度、または２つ以上の上記因子の組合せが含まれる。
用語「操作溶液」は、クロマトグラフィープロセスを操作する際に使用される溶液を指す。操作溶液は、平衡化溶液、ローディング溶液もしくは供給溶液、洗浄溶液、および／または溶出溶液などであり得る。
本明細書で使用される用語「分配係数」または「Ｋｐ」は、クロマトグラフィー樹脂に結合したタンパク質の濃度（Ｑ）と、特定の操作条件下で平衡状態にある溶液中に残っているタンパク質の濃度（Ｃ）との比を指す。特定のタンパク質の分配係数は、以下のように計算することができる：Ｋｐ＝Ｑ／Ｃ。
本明細書で使用される用語「分離係数」または「α」は、第１のタンパク質の分配係数（Ｋｐ、タンパク質１）と、第２のタンパク質の分配係数（Ｋｐ、タンパク質２）との比を指す。分離係数は、特定の操作条件下で、２つのタンパク質間のクロマトグラフィー樹脂の選択性を定量する。これを使用して、その操作条件下でのクロマトグラフィー樹脂による２つのタンパク質の分離の程度を予測することができる。２つのタンパク質間の分離係数は、以下のように計算することができる：α＝Ｋｐ、タンパク質１／Ｋｐ、タンパク質２；またはｌｏｇ α＝ｌｏｇ Ｋｐ、タンパク質１－ｌｏｇ Ｋｐ、タンパク質２。
本明細書で使用される「溶出液」は、クロマトグラフィーを通過する液体を指す。いくつかの実施形態では、溶出液は、ローディング溶液のフロースルーである。他の実施形態では、溶出液は、クロマトグラフィーを通過する溶出溶液と、クロマトグラフィーから溶出される任意の追加の成分とを含む。
本明細書で使用される「ポリソルベート－８０安定性」または「ＰＳ－８０安定性」は、一定期間（例えば、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年など）にわたって一般的な貯蔵条件下（例えば、５℃±３℃、２５℃±３℃、相対湿度（ＲＨ）６０％±５％、４０℃±２℃、相対湿度（ＲＨ）７５％±５％）で、物理的、化学的および／または生物学的に安定なままであるＰＳ－８０の状態を指す。ＰＳ－８０安定性は、限定するものではないが、質量分析（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）、液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング（ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ）、または帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を有するＨＰＬＣシステムを用いた固相抽出（ＳＰＥ）を含む様々な方法を使用して、インタクトなＰＳ－８０分子の量および／または分解生成物の量によって測定され得る。
用語「約」は、物質もしくは組成物の量（例えば、ｍＭまたはＭ）、製剤成分の割合（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）、溶液／製剤のｐＨ、または方法の工程を特性評価するパラメータの値などを修飾する場合、例えば、物質または組成物の調製、特性評価および／または使用に関与する典型的な測定、取り扱いおよびサンプリング手順によって、これらの手順の手段的誤りによって、組成物を作製もしくは使用するために、または手順を行うために使用される成分の製造、供給源または純度の差などによって起こり得る数値量の変動を指す。ある特定の実施形態では、「約」は、その値の±０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％または１０％の変動を意味し得る。
ある期間後にＰＳ８０安定性またはＰＳ２０安定性を測定するという文脈で使用される場合、「製剤化された際の濃度の８０、８５、９０、９５または９９％以上に維持されている」という語句は、ＰＳ８０濃度またはＰＳ２０濃度の測定の±１０％のアッセイ変動性を考慮に入れる。
本明細書で使用される場合、「Ａｂ６変異体」は、軽鎖ＣＤＲの外側に位置する位置に３つ、２つまたは１つの保存的アミノ酸置換、および重鎖ＣＤＲの外側に位置する６つ、５つ、４つ、３つ、２つまたは１つの保存的アミノ酸置換を有することを除いて、抗体Ａｂ６のものと実質的に同一の重鎖配列および軽鎖配列を含むモノクローナル抗体を意味し（下記、および参照によりその全体が組み込まれる国際公開第２０１６０２８６７２号に記載されているように）、例えば、変異体位置は、（１または複数の）免疫グロブリン鎖のＦＲ領域または定常領域に位置し、重鎖のＣ末端リジン残基の欠失を有していてもよい。換言すれば、Ａｂ６とＡｂ６変異体とは、同一のＣＤＲ配列を含むが、それぞれ完全長軽鎖配列および完全長重鎖配列の３つまたは６つ以下の他のアミノ酸位置に保存的アミノ酸置換を有するために互いに異なる。Ａｂ６変異体は、以下の特性、すなわち、ヒトＬＡＧ３への結合親和性、およびヒトＭＨＣクラスＩＩへのヒトＬＡＧ３の結合を遮断する能力に関してＡｂ６と実質的に同じである。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、所望の生物学的活性または結合活性を示す抗体の任意の形態を指す。したがって、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、限定するものではないが、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ヒト化、完全ヒト抗体、キメラ抗体およびラクダ化単一ドメイン抗体を具体的に包含する。「親抗体」は、意図する用途のための抗体の改変、例えば、ヒト治療薬として使用するための抗体のヒト化の前に、免疫系を抗原に曝露することによって得られる抗体である。
一般に、基本的な抗体構造単位は四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を含み、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と、１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００～１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定し得る。典型的には、ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖として分類される。さらに、ヒト重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい。
各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、インタクトな抗体は２つの結合部位を有する。二機能性抗体または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は一般に同じである。
典型的には、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープへの結合を可能にする。一般に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方が、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割当ては、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ ｅｄ．；ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１－７５；Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７またはＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３の定義に従う。
本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「抗体断片」または「抗原結合断片」は、抗体の抗原結合断片、すなわち、完全長抗体によって結合された抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体断片、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域を保持する断片を指す。抗体結合断片の例には、限定するものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子、例えばｓｃ－Ｆｖ；抗体断片から形成されたナノボディおよび多重特異性抗体が挙げられる。
「キメラ抗体」は、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種（例えばヒト）に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるのに対して、（１または複数の）鎖の残りが、別の種（例えばマウス）に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である抗体、ならびにそのような抗体の断片を指す。
「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を指す。ヒト抗体は、マウス内で、マウス細胞内で、またはマウス細胞に由来するハイブリドーマ内で産生される場合、マウス炭水化物鎖を含み得る。同様に、「マウス抗体」または「ラット抗体」は、それぞれマウスもしくはラットの免疫グロブリン配列のみを含む抗体を指す。
「ヒト化抗体」は、非ヒト（例えばマウス）抗体およびヒト抗体由来の配列を含む抗体の形態を指す。そのような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、超可変ループの全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでいてもよい。ヒト化抗体を親齧歯類抗体と区別するために必要な場合、接頭辞「ｈｕｍ」、「ｈｕ」または「ｈ」が、抗体クローンの名称に付加される。齧歯類抗体のヒト化形態は、一般に、親齧歯類抗体の同じＣＤＲ配列を含むが、親和性を高めるため、ヒト化抗体の安定性を高めるため、または他の理由のために、ある特定のアミノ酸置換が含まれてもよい。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または変形例、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、本明細書および特許請求の範囲を通して包括的な意味で、すなわち、記載された特徴の存在を特定するが、本発明の実施形態のいずれかの動作または有用性を実質的に高めることができるさらなる特徴の存在または追加を排除しないように使用されるが、文脈上、明示的な文言または必要な含意のためにそうでないことが必要な場合は除く。
「保存的に改変された変異体」または「保存的置換」は、タンパク質の生物学的活性または他の所望の特性、例えば、抗原親和性および／または特異性を変化させることなく変化を頻繁に加えることができるような、類似の特徴（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、主鎖立体配座および剛性など）を有する他のアミノ酸によるタンパク質内のアミノ酸の置換を指す。当業者であれば、一般に、ポリペプチドの非必須領域内の単一アミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ Ｅｄ．）を参照）。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性が低い。例示的な保存的置換を以下の表１に示す。
本明細書および特許請求の範囲を通して使用される「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および変形例、例えば、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、指定された投与レジメン、方法または組成物の基本的または新規な特性を実質的に変化させない、任意の列挙された要素または要素群の包含、および列挙された要素と同様または異なる性質の他の要素の任意の包含を示す。非限定的な例として、列挙されたアミノ酸配列から本質的になる抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片はまた、結合化合物の特性に実質的に影響を及ぼさない、１つ以上のアミノ酸残基の置換を含む１つ以上のアミノ酸を含み得る。
本明細書で使用される「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、ＣＤＲ領域を除く免疫グロブリン可変領域を意味する。
本明細書で使用される「Ｋａｂａｔ」は、Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔ（（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）によって開発された免疫グロブリンのアライメントおよびナンバリングシステムを意味する。
ヒトＬＡＧ３は、以下のアミノ酸配列：
ＭＷＥＡＱＦＬＧＬＬ ＦＬＱＰＬＷＶＡＰＶ ＫＰＬＱＰＧＡＥＶＰ ＶＶＷＡＱＥＧＡＰＡ ＱＬＰＣＳＰＴＩＰＬ ＱＤＬＳＬＬＲＲＡＧ
ＶＴＷＱＨＱＰＤＳＧ ＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬ ＡＰＧＰＨＰＡＡＰＳ ＳＷＧＰＲＰＲＲＹＴ ＶＬＳＶＧＰＧＧＬＲ ＳＧＲＬＰＬＱＰＲＶ
ＱＬＤＥＲＧＲＱＲＧ ＤＦＳＬＷＬＲＰＡＲ ＲＡＤＡＧＥＹＲＡＡ ＶＨＬＲＤＲＡＬＳＣ ＲＬＲＬＲＬＧＱＡＳ ＭＴＡＳＰＰＧＳＬＲ
ＡＳＤＷＶＩＬＮＣＳ ＦＳＲＰＤＲＰＡＳＶ ＨＷＦＲＮＲＧＱＧＲ ＶＰＶＲＥＳＰＨＨＨ ＬＡＥＳＦＬＦＬＰＱ ＶＳＰＭＤＳＧＰＷＧ
ＣＩＬＴＹＲＤＧＦＮ ＶＳＩＭＹＮＬＴＶＬ ＧＬＥＰＰＴＰＬＴＶ ＹＡＧＡＧＳＲＶＧＬ ＰＣＲＬＰＡＧＶＧＴ ＲＳＦＬＴＡＫＷＴＰ
ＰＧＧＧＰＤＬＬＶＴ ＧＤＮＧＤＦＴＬＲＬ ＥＤＶＳＱＡＱＡＧＴ ＹＴＣＨＩＨＬＱＥＱ ＱＬＮＡＴＶＴＬＡＩ ＩＴＶＴＰＫＳＦＧＳ
ＰＧＳＬＧＫＬＬＣＥ ＶＴＰＶＳＧＱＥＲＦ ＶＷＳＳＬＤＴＰＳＱ ＲＳＦＳＧＰＷＬＥＡ ＱＥＡＱＬＬＳＱＰＷ ＱＣＱＬＹＱＧＥＲＬ
ＬＧＡＡＶＹＦＴＥＬ ＳＳＰＧＡＱＲＳＧＲ ＡＰＧＡＬＰＡＧＨＬ ＬＬＦＬＩＬＧＶＬＳ ＬＬＬＬＶＴＧＡＦＧ ＦＨＬＷＲＲＱＷＲＰ
ＲＲＦＳＡＬＥＱＧＩ ＨＰＰＱＡＱＳＫＩＥ ＥＬＥＱＥＰＥＰＥＰ ＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰ ＥＰＥＱＬ
（配列番号１）を含む；Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１８６２７も参照されたい。残基１～２２は、天然のリーダー配列である。
ＭＷＥＡＱＦＬＧＬＬ ＦＬＱＰＬＷＶＡＰＶ ＫＰＬＱＰＧＡＥＶＰ ＶＶＷＡＱＥＧＡＰＡ ＱＬＰＣＳＰＴＩＰＬ ＱＤＬＳＬＬＲＲＡＧ
ＶＴＷＱＨＱＰＤＳＧ ＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬ ＡＰＧＰＨＰＡＡＰＳ ＳＷＧＰＲＰＲＲＹＴ ＶＬＳＶＧＰＧＧＬＲ ＳＧＲＬＰＬＱＰＲＶ
ＱＬＤＥＲＧＲＱＲＧ ＤＦＳＬＷＬＲＰＡＲ ＲＡＤＡＧＥＹＲＡＡ ＶＨＬＲＤＲＡＬＳＣ ＲＬＲＬＲＬＧＱＡＳ ＭＴＡＳＰＰＧＳＬＲ
ＡＳＤＷＶＩＬＮＣＳ ＦＳＲＰＤＲＰＡＳＶ ＨＷＦＲＮＲＧＱＧＲ ＶＰＶＲＥＳＰＨＨＨ ＬＡＥＳＦＬＦＬＰＱ ＶＳＰＭＤＳＧＰＷＧ
ＣＩＬＴＹＲＤＧＦＮ ＶＳＩＭＹＮＬＴＶＬ ＧＬＥＰＰＴＰＬＴＶ ＹＡＧＡＧＳＲＶＧＬ ＰＣＲＬＰＡＧＶＧＴ ＲＳＦＬＴＡＫＷＴＰ
ＰＧＧＧＰＤＬＬＶＴ ＧＤＮＧＤＦＴＬＲＬ ＥＤＶＳＱＡＱＡＧＴ ＹＴＣＨＩＨＬＱＥＱ ＱＬＮＡＴＶＴＬＡＩ ＩＴＶＴＰＫＳＦＧＳ
ＰＧＳＬＧＫＬＬＣＥ ＶＴＰＶＳＧＱＥＲＦ ＶＷＳＳＬＤＴＰＳＱ ＲＳＦＳＧＰＷＬＥＡ ＱＥＡＱＬＬＳＱＰＷ ＱＣＱＬＹＱＧＥＲＬ
ＬＧＡＡＶＹＦＴＥＬ ＳＳＰＧＡＱＲＳＧＲ ＡＰＧＡＬＰＡＧＨＬ ＬＬＦＬＩＬＧＶＬＳ ＬＬＬＬＶＴＧＡＦＧ ＦＨＬＷＲＲＱＷＲＰ
ＲＲＦＳＡＬＥＱＧＩ ＨＰＰＱＡＱＳＫＩＥ ＥＬＥＱＥＰＥＰＥＰ ＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰ ＥＰＥＱＬ
（配列番号１）を含む；Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１８６２７も参照されたい。残基１～２２は、天然のリーダー配列である。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」もしくは「Ｍａｂ」は、実質的に均一な抗体の集団を指し、すなわち、その集団を含む抗体分子は、少量存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いてアミノ酸配列が同一である。対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体調製物は、典型的には、それらの可変ドメイン、特にそれらのＣＤＲに異なるアミノ酸配列を有する多数の異なる抗体を含み、これらは、様々なエピトープに特異的であることが多い。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離され得る。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１も参照されたい。
添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、単語の単数形、例えば、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、それらの対応する複数の言及を含む。文脈上他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
本明細書で使用される場合、用語「少なくとも１つの」項目または「１つ以上の」項目はそれぞれ、一覧から選択された単一の項目、および一覧から選択された２つ以上の項目の混合を含む。
用語「例えば（ｅ．ｇ．）」または「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」に続く任意の（１または複数の）例は、網羅的または限定的であることを意味しない。
そうではないと明示的に述べられていない限り、本明細書に引用されるすべての範囲は包括的である。すなわち、範囲は、範囲の上限および下限の値、ならびにその間のすべての値を含む。一例として、本明細書に記載の温度範囲、割合、等価物の範囲などは、範囲の上限および下限、ならびにそれらの間の連続体における任意の値を含む。すべての範囲はまた、含まれるすべての部分範囲を含むことが意図されているが、必ずしも明示的に記載されているわけではない。例えば、ｐＨ４．０～５．０の範囲は、ｐＨ４．０、４．１、４．１３、４．２、４．１～４．６、４．３～４．４、および５．０を含むことが意図される。さらに、本明細書で使用される用語「または」は、適切な場合には組み合わせることができる代替物を示す。すなわち、用語「または」は、別個に列挙された各代替物、およびそれらの組合せを含む。
本開示の態様または実施形態がマーカッシュグループ、または代替物の他のグループ分けに関して記載される場合、本開示は、全体として列挙されたグループ全体だけでなく、グループの各メンバーを個別に、およびメイングループのすべての可能なサブグループを包含するだけでなく、グループメンバーのうちの１つ以上が存在しないメイングループも包含する。本開示はまた、特許請求の範囲におけるグループメンバーのいずれかのうちの１つ以上の明示的な除外を想定する。
例示的な方法および材料が本明細書に記載されているが、本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料も、本開示の実施または試験に使用することができる。材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
抗ＬＡＧ３抗体
一実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体は、Ａｂ６またはＡｂ６変異体である。
一実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体は、Ａｂ６またはＡｂ６変異体である。
Ａｂ６は、以下の抗体成分を有する：
以下のアミノ酸配列を有する軽鎖免疫グロブリン：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＡＳＱＳＬＤＹＥＧＤＳＤＭＮＷＹＬＱＫＰＧＱＰＰＱＬＬＩＹＧＡＳＮＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＱＱＳＴＥＤＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
（配列番号２）；
以下のアミノ酸配列を有する重鎖免疫グロブリン：
ＱＭＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＮＶＤＷＶＲＱＡＲＧＱＲＬＥＷＩＧＤＩＮＰＮＤＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥＲＶＴＩＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＹＲＷＦＧＡＭＤＨＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
（配列番号３）；
以下のアミノ酸配列を有する軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＡＳＱＳＬＤＹＥＧＤＳＤＭＮＷＹＬＱＫＰＧＱＰＰＱＬＬＩＹＧＡＳＮＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＱＱＳＴＥＤＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
（配列番号４）；
以下のアミノ酸配列を有する重鎖免疫グロブリン可変ドメイン：
ＱＭＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＮＶＤＷＶＲＱＡＲＧＱＲＬＥＷＩＧＤＩＮＰＮＤＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥＲＶＴＩＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＹＲＷＦＧＡＭＤＨＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
（配列番号５）；ならびに以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ－Ｌ１：ＫＡＳＱＳＬＤＹＥＧＤＳＤＭＮ（配列番号６）；
ＣＤＲ－Ｌ２：ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号７）；
ＣＤＲ－Ｌ３：ＱＱＳＴＥＤＰＲＴ（配列番号８）；
ＣＤＲ－Ｈ１：ＤＹＮＶＤ（配列番号９）；
ＣＤＲ－Ｈ２：ＤＩＮＰＮＤＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥ（配列番号１０）；および
ＣＤＲ－Ｈ３：ＮＹＲＷＦＧＡＭＤＨ（配列番号１１）
本発明の方法のいくつかの好ましい実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）軽鎖ＣＤＲ、配列番号６、７および８と、（ｂ）重鎖ＣＤＲ、配列番号９、１０および１１とを含む。
以下のアミノ酸配列を有する軽鎖免疫グロブリン：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＡＳＱＳＬＤＹＥＧＤＳＤＭＮＷＹＬＱＫＰＧＱＰＰＱＬＬＩＹＧＡＳＮＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＱＱＳＴＥＤＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
（配列番号２）；
以下のアミノ酸配列を有する重鎖免疫グロブリン：
ＱＭＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＮＶＤＷＶＲＱＡＲＧＱＲＬＥＷＩＧＤＩＮＰＮＤＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥＲＶＴＩＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＹＲＷＦＧＡＭＤＨＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
（配列番号３）；
以下のアミノ酸配列を有する軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＡＳＱＳＬＤＹＥＧＤＳＤＭＮＷＹＬＱＫＰＧＱＰＰＱＬＬＩＹＧＡＳＮＬＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＱＱＳＴＥＤＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
（配列番号４）；
以下のアミノ酸配列を有する重鎖免疫グロブリン可変ドメイン：
ＱＭＱＬＶＱＳＧＰＥＶＫＫＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＮＶＤＷＶＲＱＡＲＧＱＲＬＥＷＩＧＤＩＮＰＮＤＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥＲＶＴＩＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＹＲＷＦＧＡＭＤＨＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
（配列番号５）；ならびに以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ－Ｌ１：ＫＡＳＱＳＬＤＹＥＧＤＳＤＭＮ（配列番号６）；
ＣＤＲ－Ｌ２：ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号７）；
ＣＤＲ－Ｌ３：ＱＱＳＴＥＤＰＲＴ（配列番号８）；
ＣＤＲ－Ｈ１：ＤＹＮＶＤ（配列番号９）；
ＣＤＲ－Ｈ２：ＤＩＮＰＮＤＧＧＴＩＹＡＱＫＦＱＥ（配列番号１０）；および
ＣＤＲ－Ｈ３：ＮＹＲＷＦＧＡＭＤＨ（配列番号１１）
本発明の方法のいくつかの好ましい実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）軽鎖ＣＤＲ、配列番号６、７および８と、（ｂ）重鎖ＣＤＲ、配列番号９、１０および１１とを含む。
本発明の方法の他の好ましい実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号５を含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号４を含む軽鎖可変領域とを含む。本発明の方法の別の好ましい実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体は、（ａ）配列番号３を含む重鎖と、（ｂ）配列番号２を含む軽鎖とを含む。本発明の方法の別の好ましい実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体は、２つの重鎖と２つの軽鎖とを有し、（ａ）重鎖は、配列番号３からなり、（ｂ）軽鎖は、配列番号２からなる。
一実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片は、重鎖定常領域、例えばヒト定常領域、例えば、γ１、γ２、γ３もしくはγ４ヒト重鎖定常領域またはその変異体を含む。別の実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片は、軽鎖定常領域、例えばヒト軽鎖定常領域、例えば、ラムダもしくはカッパヒト軽鎖領域またはその変異体を含む。限定ではなく例として、ヒト重鎖定常領域はγ４であり得、ヒト軽鎖定常領域はカッパであり得る。代替的な実施形態では、抗体のＦｃ領域は、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ変異を有するγ４である（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｊ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１－８，２００１）。
いくつかの実施形態では、様々な定常ドメインが、本明細書に提供されるＣＤＲに由来するヒト化ＶＬ領域およびヒト化ＶＨ領域に付加され得る。例えば、本発明の抗体（または断片）の特定の意図された使用が、変更されたエフェクター機能を必要とする場合、ヒトＩｇＧ１以外の重鎖定常ドメインが使用され得るか、またはハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４が利用され得る。
クロマトグラフィープロセス
抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片から宿主細胞リパーゼを分離するためのクロマトグラフィープロセスは、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスであり得る。別の実施形態では、クロマトグラフィープロセスはＨＩＣクロマトグラフィープロセスである。前述のクロマトグラフィープロセスは、ＣＥＸ、ＡＥＸ、混合モードＩＥＸ、混合モードＡＥＸ、混合モードＣＥＸ、アフィニティークロマトグラフィープロセス、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィープロセス、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）プロセス、およびＨＡＣクロマトグラフィープロセスのうちの１つ以上によって進行または後続され得る。一実施形態では、ＣＥＸまたはＨＩＣクロマトグラフィープロセスの前に、プロテインＡクロマトグラフィー、続いてＡＥＸクロマトグラフィーが先行する。一実施形態では、ＣＥＸまたはＨＩＣクロマトグラフィープロセスの前に、結合および溶出モードで行われるプロテインＡクロマトグラフィー、続いてフロースルーモードで行われるＡＥＸクロマトグラフィーが先行する。
抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片から宿主細胞リパーゼを分離するためのクロマトグラフィープロセスは、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスであり得る。別の実施形態では、クロマトグラフィープロセスはＨＩＣクロマトグラフィープロセスである。前述のクロマトグラフィープロセスは、ＣＥＸ、ＡＥＸ、混合モードＩＥＸ、混合モードＡＥＸ、混合モードＣＥＸ、アフィニティークロマトグラフィープロセス、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィープロセス、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）プロセス、およびＨＡＣクロマトグラフィープロセスのうちの１つ以上によって進行または後続され得る。一実施形態では、ＣＥＸまたはＨＩＣクロマトグラフィープロセスの前に、プロテインＡクロマトグラフィー、続いてＡＥＸクロマトグラフィーが先行する。一実施形態では、ＣＥＸまたはＨＩＣクロマトグラフィープロセスの前に、結合および溶出モードで行われるプロテインＡクロマトグラフィー、続いてフロースルーモードで行われるＡＥＸクロマトグラフィーが先行する。
ＩＥＸクロマトグラフィーは、分子の正味電荷に基づいて分子を分離する。分離は、目的の荷電分子と、ＩＥＸクロマトグラフィー樹脂上の反対に荷電したリガンド基の対イオンとの間の競合の結果として起こる。ＩＥＸ樹脂への分子の結合の強度は、ｐＨおよびイオン強度などの操作条件によって影響を受ける、分子の正味電荷に依存する。ＩＥＸ樹脂には、ＡＥＸ樹脂およびＣＥＸ樹脂が含まれる。ＡＥＸ樹脂は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）基、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）基および第四級アミン（Ｏ）基などの置換基を含み得る。ＣＥＸ樹脂は、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）およびスルホネート（Ｓ）などの置換基を含み得る。ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＣＭ－２３、ＣＭ－３２およびＣＭ－５２などのセルロース系ＩＥＸ樹脂は、Ｗｈａｔｍａｎ Ｌｔｄ．Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｋｅｎｔ，Ｕ．Ｋ．から入手可能である。Ｓｅｐｈａｄｅｘ系ＩＥＸ樹脂および架橋ＩＥＸ樹脂も知られている。例えば、ＤＥＡＥ－、ＱＡＥ－、ＣＭ－およびＳＰ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ、およびＤＥＡＥ－、Ｑ－、ＣＭ－およびＳ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ならびにＳｅｐｈａｒｏｓｅはいずれも、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能である。さらに、ＤＥＡＥおよびＣＭの両方から誘導されるエチレングリコール－メタクリレートコポリマー、例えば、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＤＥＡＥ－６５０ＳまたはＭ、およびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＣＭ－６５０ＳまたはＭは、Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡから入手可能である。ＰＯＲＯＳ（商標）ＨＳ、ＰＯＲＯＳ（商標）ＨＱ、ＰＯＲＯＳ（商標）ＸＳは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡから入手可能である。
ＨＩＣクロマトグラフィーは、分子の疎水性に基づいて分子を分離する。目的の分子内の疎水性領域は、疎水性相互作用を介してＨＩＣ樹脂に結合する。相互作用の強度は、ｐＨ、イオン強度および塩濃度などの操作条件に依存する。一般に、ＨＩＣ樹脂は、疎水性リガンド（例えば、アルキル基またはアリール基）が結合したベースマトリックス（例えば、架橋アガロースまたは合成コポリマー材料）を含有する。ＨＩＣ樹脂の非限定的な例には、Ｐｈｅｎｙｌ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｐｈｅｎｙｌ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｏｃｔｙｌ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ ＰｒｏｐｙｌまたはＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（商標）ＥＭＤ Ｐｈｅｎｙｌ（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＭＡＣＲＯ－ＰＲＥＰ（商標）ＭｅｔｈｙｌまたはＭＡＣＲＯ－ＰＲＥＰ（商標）ｔ－Ｂｕｔｙｌ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＣＡ）；ＷＰ ＨＩ－Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（商標）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＮＪ）；ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）エーテル、フェニルまたはブチル（ＴｏｓｏＨａａｓ，ＰＡ）；およびＴｏｓｏｈ－Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）が挙げられる。
ＨＡＣクロマトグラフィーは、式［Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２］の不溶性ヒドロキシル化リン酸カルシウムをマトリックスおよびリガンドの両方として使用する。ＨＡＣ樹脂の官能基は、正に帯電したカルシウムイオン（Ｃ部位）と負に帯電したホスフェート基（Ｐ部位）との対を含む。Ｃ部位は、タンパク質表面上のカルボキシレート残基と相互作用することができるのに対して、Ｐ部位は、塩基性タンパク質残基と相互作用することができる。タンパク質とＨＡＣ樹脂との間の結合の強度は、ｐＨ、イオン強度、溶液の組成、組成物の各成分の濃度、ｐＨの勾配、成分濃度の勾配などを含む操作条件に依存する。ＣＨＴ（商標）Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅおよびＣＦＴ（商標）Ｃｅｒａｍｉｃ Ｆｌｕｏｒｏａｐａｔｉｔｅなどの様々なＨＡＣ樹脂が市販されている。
アフィニティークロマトグラフィーは、目的の分子と樹脂の官能基との間の高度に特異的な相互作用、例えば、抗原と抗体、酵素と基質、受容体とリガンド、またはタンパク質と核酸などとの間の相互作用に基づいて分子を分離する。いくつかの一般的に使用されるアフィニティークロマトグラフィー樹脂には、抗体を精製するためのプロテインＡ樹脂またはプロテインＧ樹脂、ビオチン／アビジンおよびそれらの誘導体を精製するためのアビジンビオチン樹脂、ＧＳＴタグ付き組換えタンパク質を精製するためのグルタチオン樹脂、血漿凝固タンパク質を分離するためのヘパリン樹脂、金属イオンと特異的に相互作用するタンパク質を精製するためのＩＭＡＣ樹脂などが含まれる。各アフィニティークロマトグラフィーの操作条件は、相互作用の機構、および相互作用に影響を及ぼす因子に依存する。市販のアフィニティークロマトグラフィー樹脂には、限定するものではないが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ ＳＵＰｒＡ（商標）、Ａｆｆｉ－Ｇｅｌ（登録商標）およびＡｆｆｉ－Ｐｒｅｐ（登録商標）が含まれる。
混合モードは、上記のまたは当業者によって理解される任意の２つ以上の機能または機構の組合せ、例えば、ＩＥＸとＨＩＣとの組合せ（例えば、ＡＥＸ／ＨＩＣまたはＣＥＸ／ＨＩＣ）、ＡＥＸとＣＥＸとの組合せ（ＡＥＸ／ＣＥＸ）、またはＨＩＣ、ＡＥＸおよびＣＥＸの組合せ（ＨＩＣ／ＡＥＸ／ＣＥＸ）などであり得る。例示的な混合モードクロマトグラフィー樹脂には、限定するものではないが、ＯｍｉｎＰａｃ ＰＣＸ－５００、Ｐｒｉｍｅｓｅｐ、Ｏｂｅｌｉｓｃ Ｒ、Ｏｂｌｉｓｃ Ｎ、Ａｃｃｌａｉｍ Ｔｒｉｎｉｔｙ Ｐ１、Ａｃｃｌａｉｍ Ｔｒｉｎｉｔｙ Ｐ２、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ Ｉｍｐｒｅｓ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ Ｉｍｐｒｅｓ、Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ７００、ＰＰＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ＨＥＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ＭＥＰ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、Ｅｓｈｍｕｎｏ ＨＣＸ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＭＸ－Ｔｒｐ－６５０Ｍ、Ｎｕｖｉａ Ｃ Ｐｒｉｍｅ、ＣＨＴ Ｔｙｐｅ ＩおよびＣＨＴ Ｔｙｐｅ ＩＩが含まれる。
分配係数（Ｋｐ）および分離係数（α）
分配係数（Ｋｐ）および分離係数（α）は、クロマトグラフィープロセスの操作条件に特有の２つの熱力学的パラメータであり、操作条件下でのプロセスを通して達成することができる分離を定量するために使用することができる。
分配係数（Ｋｐ）および分離係数（α）は、クロマトグラフィープロセスの操作条件に特有の２つの熱力学的パラメータであり、操作条件下でのプロセスを通して達成することができる分離を定量するために使用することができる。
分配係数ＫＰは、既知の液体濃度のタンパク質（または目的の他の分子）を既知の体積のクロマトグラフィー樹脂と混合し、樹脂に結合したタンパク質と平衡状態にある液体中に残っているタンパク質との比を計算することによって決定される：ＫＰ＝ｑ／ｃ＝［結合］／［遊離］。
分配は、一般に、ｌｏｇ ＫＰに関して報告されており、ｌｏｇ ＫＰは、本明細書に記載のＵＶ法を使用して約０～２まで正確に定量することができる。ｌｏｇ ＫＰスクリーニングの通則は、以下の通りである：
ｌｏｇ ＫＰ≧１．５、樹脂への強い結合；
ｌｏｇ ＫＰ＜１、結合溶出様式について溶出が予測される条件；
０．５＜ｌｏｇ ＫＰ＜１、いくらかの結合を示す弱い相互作用条件；
ｌｏｇ ＫＰ＜０．５、結合がほとんどまたは全くない。
ｌｏｇ ＫＰ≧１．５、樹脂への強い結合；
ｌｏｇ ＫＰ＜１、結合溶出様式について溶出が予測される条件；
０．５＜ｌｏｇ ＫＰ＜１、いくらかの結合を示す弱い相互作用条件；
ｌｏｇ ＫＰ＜０．５、結合がほとんどまたは全くない。
異なる種間のｌｏｇ Ｋｐ値の差を使用して、分離係数αを以下のように計算することによって、種の分離を予測することができる：α＝ＫＰ、タンパク質１／ＫＰ、タンパク質２；ｌｏｇ α＝ｌｏｇ ＫＰ、タンパク質１－ｌｏｇ ＫＰ、タンパク質２、ここで、ｌｏｇ αが０から遠いほど、さらに良好な分離を示す。ある特定の実施形態では、０．２よりも大きいｌｏｇ αの絶対値は、２つの種の間の良好な分離を示す。いくつかの実施形態では、０．３よりも大きいｌｏｇ αの絶対値は、２つの種の間の良好な分離を示す。他の実施形態では、０．５よりも大きいｌｏｇ αの絶対値は、２つの種の間の良好な分離を示す。他の実施形態では、１．０よりも大きいｌｏｇ αの絶対値は、２つの種の間の良好な分離を示す。
ＨＣＰ
本明細書に提供される様々な方法は、多種多様なＨＣＰに適用される。ＨＣＰは、宿主細胞内で発現される抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のバイオプロセス中の宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）に由来する任意の内因性タンパク質であり得る。ＨＣＰの非限定的な例には、構造タンパク質、機能性タンパク質、分泌タンパク質、酵素、例えば、リパーゼ、プロテイナーゼおよびキナーゼなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＨＣＰは構造タンパク質である。ある特定の実施形態では、ＨＣＰは機能性タンパク質である。他の実施形態では、ＨＣＰは分泌タンパク質である。さらに別の実施形態では、ＨＣＰは酵素である。一実施形態では、ＨＣＰはリパーゼである。別の実施形態では、ＨＣＰはプロテイナーゼである。さらに別の実施形態では、ＨＣＰはキナーゼである。一実施形態では、ＨＣＰはクラスタリンである。
本明細書に提供される様々な方法は、多種多様なＨＣＰに適用される。ＨＣＰは、宿主細胞内で発現される抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のバイオプロセス中の宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）に由来する任意の内因性タンパク質であり得る。ＨＣＰの非限定的な例には、構造タンパク質、機能性タンパク質、分泌タンパク質、酵素、例えば、リパーゼ、プロテイナーゼおよびキナーゼなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＨＣＰは構造タンパク質である。ある特定の実施形態では、ＨＣＰは機能性タンパク質である。他の実施形態では、ＨＣＰは分泌タンパク質である。さらに別の実施形態では、ＨＣＰは酵素である。一実施形態では、ＨＣＰはリパーゼである。別の実施形態では、ＨＣＰはプロテイナーゼである。さらに別の実施形態では、ＨＣＰはキナーゼである。一実施形態では、ＨＣＰはクラスタリンである。
ある特定の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるリパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるリパーゼを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
宿主細胞は、外因性タンパク質を発現させるために使用される任意の細胞であり得る。バイオ医薬品の製造に使用される一般的な宿主細胞には、限定するものではないが、ＣＨＯ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ２１）細胞、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞、マウス骨髄腫Ｓｐ２／０細胞、ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨＫＢ－１１細胞、ＣＡＰ細胞、ＨｕＨ－７細胞、マウスＣ１２７細胞およびその天然に生成された変異体または遺伝子改変変異体が含まれる。ある特定の実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ２１）細胞である。他の実施形態では、宿主細胞はマウス骨髄腫ＮＳ０細胞である。さらに他の実施形態では、宿主細胞はマウス骨髄腫Ｓｐ２／０細胞である。また他の実施形態では、宿主細胞は、ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。他の実施形態では、宿主細胞はＨＫＢ－１１細胞である。さらに他の実施形態では、宿主細胞はＣＡＰ細胞である。また他の実施形態では、宿主細胞はＨｕＨ－７細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞はマウスＣ１２７細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、上記宿主細胞の天然に生成された変異体である。他の実施形態では、宿主細胞は、上記宿主細胞の遺伝子改変変異体である。
ある特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
抗ＬＡＧ３抗体から宿主細胞リパーゼを分離するための操作条件をスクリーニングする方法
本開示は、本発明のクロマトグラフィープロセスによって抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離するための操作条件をスクリーニングする方法を提供する。
本開示は、本発明のクロマトグラフィープロセスによって抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離するための操作条件をスクリーニングする方法を提供する。
塩、塩の種類、塩濃度、溶液中の他の成分（例えば対イオン）、各成分の濃度、またはロードタンパク質濃度などの有無にかかわらず、ｐＨを含む多数の操作条件を設計し、ＨＣＰ（例えばリパーゼ）または抗ＬＡＧ３抗体もしくは抗原結合断片について検討することができる。スクリーニングされる操作条件は、選択された樹脂について一般的に使用される処理条件、例えば、平衡化条件、ローディング条件、洗浄条件、溶出条件またはストリッピング条件などであり得る。
ＨＣＰ（例えばリパーゼ）および抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のＫｐ値は、本明細書に開示される方法、または当業者によって一般的に理解される方法によって決定される。ＨＣＰ（例えばリパーゼ）と抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片との間のｌｏｇ α値は、本明細書に記載の方法を使用して計算される。一般に、ＨＣＰ（例えばリパーゼ）と抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片との間の良好な分離のために、０．５よりも大きいｌｏｇ αの絶対値が望ましい。
一実施形態では、スクリーニングは、Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．３０（３）：６２６－６３５（２０１４）に開示されているように、樹脂スラリープレート法を使用して行われる。例えば、ｐＨ、塩および供給物の異なる組合せの混合物を９６ウェルフィルタープレート（例えば、Ｐ／Ｎ ＭＳＢＶＮ１２５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に加える。クロマトグラフィー樹脂体積は２～５０μＬであり、液体供給体積は２００μＬである。いくつかの実施形態では、各樹脂について１６～３２の条件が試験される。他の実施形態では、各樹脂について２４～９６の条件が試験される。真空濾過によって、樹脂と液体との分離を達成した。まず、樹脂を平衡化緩衝液と１０分間インキュベートし、平衡化工程を３回繰り返す。次に、樹脂を供給物とともに６０分間インキュベートする。次いで、樹脂をストリップ状態で１０分間インキュベートし、２回繰り返す。平衡化工程は、初期樹脂スラリー緩衝液からの緩衝液交換を可能にする。供給物混合のための６０分の時間は、所与の条件セットで樹脂リガンドとタンパク質との間の擬似平衡化を可能にする。供給工程からの濾液を２８０～３２０ｎｍでのＵＶ吸光度によって測定して、タンパク質の最終液体濃度ｃを決定した。ｃと既知の供給物濃度ｃ０との物質収支によって、タンパク質の結合濃度ｑを決定した。
別の実施形態では、スクリーニングは、Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．３０（３）：６２６－６３５（２０１４）またはＰｅｔｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ．１１３（６）：１２７３－１２８３（２０１５）に開示されているように、ミニカラム法を使用して行われる。例えば、ｐＨ、塩および供給物の異なる組合せの混合物を、３ｃｍのベッド高さを有する０．６ｍＬカラムフォーマットでスクリーニングする。最大８本のカラムを並行してスクリーニングする。ミニチュアカラムでは、典型的なカラムの約３００ｃｍ／ｈからミニチュアカラムフォーマットの約４５ｃｍ／ｈまで線形流速を減少させることによって、約４分の典型的な滞留時間が維持される。クロマトグラフィースクリーニングのための他のあらゆる典型的なパラメータが保存される。溶出液画分を９６ウェルプレートに収集することによって、プールとして、または画分として収集して、実験室規模の試験と同様のクロマトグラムを生成することができる。
抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離するための操作条件が決定されると、それに応じてロード流体（ｌｏａｄ ｆｌｕｉｄ）および／または樹脂の条件を調整することができる。例えば、必要な操作条件にする溶液を用いて樹脂を洗浄することによって、樹脂を平衡化することができる。
抗ＬＡＧ３抗体から宿主細胞リパーゼを分離する方法
本開示はさらに、クロマトグラフィープロセスによって抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離する方法を提供する。
本開示はさらに、クロマトグラフィープロセスによって抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離する方法を提供する。
一態様では、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）プロセスによって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と宿主細胞リパーゼとを含む組成物から宿主細胞リパーゼを分離する方法であって、
（ａ）ローディング操作条件下で、組成物を含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、および
（ｂ）抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片をフロースルー中に集めることを含み、
分離係数（α）が、リパーゼの分配係数（Ｋｐ）の抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のＫｐに対する比であり、ｌｏｇ αが、ローディング操作条件下で０．５よりも大きく、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法が本明細書で提供される。
（ａ）ローディング操作条件下で、組成物を含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、および
（ｂ）抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片をフロースルー中に集めることを含み、
分離係数（α）が、リパーゼの分配係数（Ｋｐ）の抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のＫｐに対する比であり、ｌｏｇ αが、ローディング操作条件下で０．５よりも大きく、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法が本明細書で提供される。
別の態様では、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）プロセスによって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と宿主細胞リパーゼとを含む組成物から宿主細胞リパーゼを分離する方法であって、
（ａ）組成物を含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出操作条件下で溶出溶液を用いて、クロマトグラフィー樹脂から抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片を溶出することを含み、
分離係数（α）が、リパーゼの分配係数（Ｋｐ）の抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のＫｐに対する比であり、ｌｏｇ αが、溶出操作条件下で０．５よりも大きく、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法が本明細書で提供される。
（ａ）組成物を含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出操作条件下で溶出溶液を用いて、クロマトグラフィー樹脂から抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片を溶出することを含み、
分離係数（α）が、リパーゼの分配係数（Ｋｐ）の抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のＫｐに対する比であり、ｌｏｇ αが、溶出操作条件下で０．５よりも大きく、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法が本明細書で提供される。
さらなる態様では、カチオン交換（ＣＥＸ）プロセスによって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と宿主細胞リパーゼとを含む組成物から宿主細胞リパーゼを分離する方法であって、
（ａ）組成物を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出操作条件下で溶出溶液を用いて、クロマトグラフィー樹脂から抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片を溶出することを含み、
分離係数（α）が、リパーゼの分配係数（Ｋｐ）の抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のＫｐに対する比であり、ｌｏｇ αが、溶出操作条件下で０．５よりも大きく、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法が本明細書で提供される。
（ａ）組成物を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出操作条件下で溶出溶液を用いて、クロマトグラフィー樹脂から抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片を溶出することを含み、
分離係数（α）が、リパーゼの分配係数（Ｋｐ）の抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のＫｐに対する比であり、ｌｏｇ αが、溶出操作条件下で０．５よりも大きく、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法が本明細書で提供される。
ある特定の実施形態では、ｌｏｇ αは、ローディング操作条件下で１．０よりも大きい。
いくつかの実施形態では、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは、ローディング操作条件下で１．０よりも大きい。他の実施形態では、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは、ローディング操作条件下で１．５よりも大きい。
ある特定の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは１．０よりも大きい。いくつかの実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは１．５よりも大きい。他の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは１．０よりも大きい。さらに他の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは１．５よりも大きい。
ある特定の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるリパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるリパーゼを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施形態では、リパーゼはＣＨＯ細胞リパーゼである。ある特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
本明細書に提供される様々な方法のある特定の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによってイオン強度および／または導電率を調節することをさらに含む。いくつかの実施形態では、塩を加える効果は、所望のｌｏｇ αを達成することである。他の実施形態では、塩を加える効果は、リパーゼの所望のｌｏｇ Ｋｐを達成することである。さらに他の実施形態では、塩を加える効果は、所望のｌｏｇ αと、リパーゼの所望のｌｏｇ Ｋｐとを達成することである。したがって、一実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって所望のｌｏｇ αを達成することをさらに含む。別の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによってリパーゼの所望のｌｏｇ Ｋｐを達成することをさらに含む。さらに別の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって所望のｌｏｇ αと、リパーゼの所望のｌｏｇ Ｋｐとを達成することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、操作溶液中の塩は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムおよびＴｒｉｓ－ＨＣｌからなる群から選択される。一実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。別の実施形態では、塩は酢酸ナトリウムである。さらに別の実施形態では、塩はリン酸ナトリウムである。また別の実施形態では、塩は硫酸アンモニウムである。一実施形態では、塩は硫酸ナトリウムである。別の実施形態では、塩はＴｒｉｓ－ＨＣｌである。
一実施形態では、操作溶液中の塩化ナトリウムの濃度は約１００ｍＭ～約２２５ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＣＥＸであり、操作条件のｐＨは約４．５～約８．０である。別の実施形態では、操作溶液中の塩化ナトリウムの濃度は約１５０ｍＭ～約１８０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＣＥＸであり、操作条件のｐＨは約５．０～約８．０である。一実施形態では、操作溶液中の塩化ナトリウムの濃度は約１００ｍＭ～約２２５ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＣＥＸであり、操作条件のｐＨは約５．０～約６．０である。別の実施形態では、操作溶液中の塩化ナトリウムの濃度は約１５０ｍＭ～約１８０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＣＥＸであり、操作条件のｐＨは約５．０～約６．０である。
さらなる態様では、疎水性相互作用クロマトグラフィープロセスによって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片とＰＬＢＬ２またはＬＰＬＡ２とを含む組成物からＰＬＢＬ２またはＬＰＬＡ２を分離する方法であって、
（ａ）組成物を含むロード流体を疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に通過させること、および
（ｂ）抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片をフロースルー中に集めることを含み、
ロード流体が、約２５～８０ｍＳ／ｃｍの導電率を有し、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法が本明細書で提供される。
（ａ）組成物を含むロード流体を疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に通過させること、および
（ｂ）抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片をフロースルー中に集めることを含み、
ロード流体が、約２５～８０ｍＳ／ｃｍの導電率を有し、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法が本明細書で提供される。
さらなる態様では、疎水性相互作用クロマトグラフィープロセスによって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片とＰＬＢＬ２またはＬＰＬＡ２とを含む組成物からＰＬＢＬ２またはＬＰＬＡ２を分離する方法であって、
（ａ）組成物を含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＨＩＣ樹脂から抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片を溶出することを含み、溶出溶液が、約２５～８０ｍＳ／ｃｍの導電率を有し、
抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法が本明細書で提供される。
（ａ）組成物を含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＨＩＣ樹脂から抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片を溶出することを含み、溶出溶液が、約２５～８０ｍＳ／ｃｍの導電率を有し、
抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法が本明細書で提供される。
また別の具体的な実施形態では、操作溶液中の硫酸ナトリウムの濃度は約５００ｍＭ～約６２０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＨＩＣであり、操作条件のｐＨは約７である。またさらに別の具体的な実施形態では、操作溶液中の硫酸ナトリウムの濃度は約５１０ｍＭ～約５６０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＨＩＣであり、操作条件のｐＨは約７である。
ＨＩＣクロマトグラフィープロセスの一態様では、ロード流体または溶出溶液は、約５０～７０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。別の実施形態では、ロード流体または溶出溶液は、約３００ｍＭ～約６５０ｍＭの一価塩または二価塩を含む。別の実施形態では、ロード流体または溶出溶液は、約３００ｍＭ～約６５０ｍＭの一価塩または二価塩を含み、ｐＨは４．５～７．５である。別の実施形態では、塩は約５００～６２０ｍＭの硫酸ナトリウムであり、ｐＨは約５～７．５である。さらなる実施形態では、塩は５６０ｍＭの硫酸ナトリウムであり、ロード流体または溶出溶液のｐＨは約７である。
本明細書で提供される分離方法は、本明細書に記載されるまたは当技術分野で一般的に使用される１つ以上の分離工程と組み合わせて使用され得る。一実施形態では、１つ以上の分離工程は、本明細書に記載の方法に先行する。別の実施形態では、１つ以上の分離工程は、本明細書に記載の方法に続く。さらに別の実施形態では、１つ以上の分離工程は、本明細書に記載の２つの方法の合間に行われる。また他の実施形態では、１つ以上の分離工程は、本明細書に記載の方法の前、後および／または合間に行われる。いくつの分離工程もしくは方法を組み合わせることができるか、または組み合わせる分離工程もしくは方法の順序に制限はない。
本明細書に提供される様々な方法のさらなる実施形態では、ロード流体は、事前のクロマトグラフィープロセスから得られた溶出液である。一実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、アフィニティークロマトグラフィーを含む。別の実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、アフィニティークロマトグラフィー、それに続くイオン交換クロマトグラフィーを含む。さらに別の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインＡクロマトグラフィーである。また別の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーはＡＥＸクロマトグラフィーである。またさらに別の実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、プロテインＡクロマトグラフィー、それに続くＡＥＸクロマトグラフィーを含む。
抗ＬＡＧ３抗体製剤におけるＰＳ－８０安定性を改善する方法
本開示はさらに、クロマトグラフィープロセスを使用して抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離することによって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片製剤（例えば、医薬物質製剤または医薬品製剤）におけるＰＳ－８０安定性を改善する方法を提供する。
本開示はさらに、クロマトグラフィープロセスを使用して抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離することによって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片製剤（例えば、医薬物質製剤または医薬品製剤）におけるＰＳ－８０安定性を改善する方法を提供する。
またさらに別の態様では、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片製剤におけるポリソルベート－８０（ＰＳ－８０）安定性を改善する方法であって、
（ａ）ローディング操作条件下で、宿主細胞リパーゼと抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片とを含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、
（ｂ）抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片をフロースルー中に集めること、および
（ｃ）抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片製剤がＰＳ－８０含有溶液であるように、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片を製剤化することを含み、
分離係数（α）が、リパーゼの分配係数（Ｋｐ）の抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のＫｐに対する比であり、ｌｏｇ αが、ローディング操作条件下で０．５よりも大きく、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法が本明細書で提供される。ＰＳ－８０安定性の改善は、工程（ｃ）単独と比較して、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に対するものである。
（ａ）ローディング操作条件下で、宿主細胞リパーゼと抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片とを含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、
（ｂ）抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片をフロースルー中に集めること、および
（ｃ）抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片製剤がＰＳ－８０含有溶液であるように、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片を製剤化することを含み、
分離係数（α）が、リパーゼの分配係数（Ｋｐ）の抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のＫｐに対する比であり、ｌｏｇ αが、ローディング操作条件下で０．５よりも大きく、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法が本明細書で提供される。ＰＳ－８０安定性の改善は、工程（ｃ）単独と比較して、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に対するものである。
またさらに別の態様では、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片製剤を製剤化する方法であって、
（ａ）ローディング操作条件下で、宿主細胞リパーゼと抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片とを含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、
（ｂ）抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片をフロースルー中に集めること、および
（ｃ）ＰＳ－８０を製剤に加えることによって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片を製剤化することを含み、
分離係数（α）が、リパーゼの分配係数（Ｋｐ）の抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のＫｐに対する比であり、ｌｏｇ αが、ローディング操作条件下で０．５よりも大きく、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法が本明細書で提供される。
（ａ）ローディング操作条件下で、宿主細胞リパーゼと抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片とを含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、
（ｂ）抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片をフロースルー中に集めること、および
（ｃ）ＰＳ－８０を製剤に加えることによって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片を製剤化することを含み、
分離係数（α）が、リパーゼの分配係数（Ｋｐ）の抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のＫｐに対する比であり、ｌｏｇ αが、ローディング操作条件下で０．５よりも大きく、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法が本明細書で提供される。
ある特定の実施形態では、ｌｏｇ αは、ローディング操作条件下で１．０よりも大きい。
いくつかの実施形態では、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは、ローディング操作条件下で１．０よりも大きい。他の実施形態では、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは、ローディング操作条件下で１．５よりも大きい。
ある特定の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは１．０よりも大きい。いくつかの実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは１．５よりも大きい。他の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは１．０よりも大きい。さらに他の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは１．５よりも大きい。
別の態様では、抗ＬＡＧ３抗体製剤におけるＰＳ－８０安定性を改善する方法であって、
（ａ）宿主細胞リパーゼと抗ＬＡＧ３抗体とを含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出操作条件下で溶出溶液を用いて、クロマトグラフィー樹脂から抗ＬＡＧ３抗体を溶出すること、および
（ｃ）抗ＬＡＧ３抗体製剤がＰＳ－８０含有溶液であるように抗ＬＡＧ３抗体を製剤化することを含み、
αが、リパーゼのＫｐの抗ＬＡＧ３抗体のＫｐに対する比であり、ｌｏｇ αが、溶出操作条件下で０．５よりも大きい方法が本明細書で提供される。ＰＳ－８０安定性の改善は、工程（ｃ）単独と比較して、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に対するものである。
（ａ）宿主細胞リパーゼと抗ＬＡＧ３抗体とを含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出操作条件下で溶出溶液を用いて、クロマトグラフィー樹脂から抗ＬＡＧ３抗体を溶出すること、および
（ｃ）抗ＬＡＧ３抗体製剤がＰＳ－８０含有溶液であるように抗ＬＡＧ３抗体を製剤化することを含み、
αが、リパーゼのＫｐの抗ＬＡＧ３抗体のＫｐに対する比であり、ｌｏｇ αが、溶出操作条件下で０．５よりも大きい方法が本明細書で提供される。ＰＳ－８０安定性の改善は、工程（ｃ）単独と比較して、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に対するものである。
別の態様では、抗ＬＡＧ３抗体製剤を製剤化する方法であって、
（ａ）宿主細胞リパーゼと抗ＬＡＧ３抗体とを含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出操作条件下で溶出溶液を用いて、クロマトグラフィー樹脂から抗ＬＡＧ３抗体を溶出すること、および
（ｃ）ＰＳ－８０を製剤に加えることによって、抗ＬＡＧ３抗体を製剤化することを含み、
αが、リパーゼのＫｐの抗ＬＡＧ３抗体のＫｐに対する比であり、ｌｏｇ αが、溶出操作条件下で０．５よりも大きい方法が本明細書で提供される。
（ａ）宿主細胞リパーゼと抗ＬＡＧ３抗体とを含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出操作条件下で溶出溶液を用いて、クロマトグラフィー樹脂から抗ＬＡＧ３抗体を溶出すること、および
（ｃ）ＰＳ－８０を製剤に加えることによって、抗ＬＡＧ３抗体を製剤化することを含み、
αが、リパーゼのＫｐの抗ＬＡＧ３抗体のＫｐに対する比であり、ｌｏｇ αが、溶出操作条件下で０．５よりも大きい方法が本明細書で提供される。
ある特定の実施形態では、ｌｏｇ αは、溶出操作条件下で１．０よりも大きい。
いくつかの実施形態では、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは、溶出操作条件下で１．０よりも大きい。他の実施形態では、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは、溶出操作条件下で１．５よりも大きい。
ある特定の実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは１．０よりも大きい。いくつかの実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは１．５よりも大きい。他の実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは１．０よりも大きい。さらに他の実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ Ｋｐは１．５よりも大きい。
ある特定の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるリパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるリパーゼを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施形態では、リパーゼは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞リパーゼである。ある特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
本明細書に提供される様々な方法のある特定の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液のイオン強度および／または導電率を調節することをさらに含む。一実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液のイオン強度を調節することをさらに含む。別の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液の導電率を調節することをさらに含む。さらに別の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液のイオン強度および導電率を調節することをさらに含む。いくつかの実施形態では、塩を加える効果は、所望のｌｏｇ αを達成することである。他の実施形態では、塩を加える効果は、リパーゼの所望のｌｏｇ Ｋｐを達成することである。さらに他の実施形態では、塩を加える効果は、所望のｌｏｇ αと、リパーゼの所望のｌｏｇ Ｋｐとを達成することである。
いくつかの実施形態では、操作溶液中の塩は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムおよびＴｒｉｓ－ＨＣｌからなる群から選択される。一実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。別の実施形態では、塩は酢酸ナトリウムである。さらに別の実施形態では、塩はリン酸ナトリウムである。また別の実施形態では、塩は硫酸アンモニウムである。一実施形態では、塩は硫酸ナトリウムである。別の実施形態では、塩はＴｒｉｓ－ＨＣｌである。
また別の具体的な実施形態では、操作溶液中の硫酸ナトリウムの濃度は約５００ｍＭ～約６２０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＨＩＣであり、操作条件のｐＨは約７である。
またさらに別の具体的な実施形態では、操作溶液中の硫酸ナトリウムの濃度は約５１０ｍＭ～約５６０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＨＩＣであり、操作条件のｐＨは約７である。
本明細書に提供される様々な方法のさらなる実施形態では、ロード流体は、事前のクロマトグラフィープロセスから得られた溶出液である。一実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、アフィニティークロマトグラフィーを含む。別の実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、アフィニティークロマトグラフィー、それに続く非アフィニティークロマトグラフィーを含む。さらに別の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインＡクロマトグラフィーである。また別の実施形態では、非アフィニティークロマトグラフィーはＡＥＸクロマトグラフィーである。またさらに別の実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、プロテインＡクロマトグラフィー、それに続くＡＥＸクロマトグラフィーを含む。一実施形態では、ロード流体は、結合および溶出モードで行われるプロテインＡクロマトグラフィー、続いてフロースルーモードで行われるＡＥＸクロマトグラフィーからの溶出液である。
医薬組成物
本開示はまた、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、２ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む医薬組成物であって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、２ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む医薬組成物であって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、１ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８または０．９ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。一実施形態では、医薬組成物は、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、０．１ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、０．２ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、０．３ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。また別の実施形態では、医薬組成物は、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、０．４ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。またさらに別の実施形態では、医薬組成物は、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、０．５ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。一実施形態では、医薬組成物は、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、０．６ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、０．７ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、０．８ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。また別の実施形態では、医薬組成物は、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、０．９ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。
医薬組成物のある特定の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるリパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるリパーゼを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
本開示はまた、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）またはポリソルベート２０（ＰＳ２０）とを含む医薬組成物であって、２～８℃で１、３、６、９または１２ヶ月の時点で、ＰＳ８０またはＰＳ２０の濃度が、製剤化された際の濃度の９０％、９５％または９９％以上に維持されており、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、製剤化された際に、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、約０．２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０（ＰＳ８０）またはポリソルベート２０（ＰＳ２０）とを含み、２～８℃で１、３、６、９または１２ヶ月の時点で、ＰＳ８０またはＰＳ２０の濃度は、少なくとも約０．１８ｍｇ／ｍｌに維持されている。一実施形態では、ＰＳ８０が製剤に使用される。一実施形態では、２～８℃で１、３、６、９または１２ヶ月の時点で、ＰＳ８０は、製剤化された際の濃度の９５％以上に維持されている。一実施形態では、ＰＳ８０は、製剤化された際の濃度の９９％以上に維持されている。
本開示はまた、製剤化された際に、約２０．０ｍｇ／ｍＬの抗ＬＡＧ３抗体もしくは抗原結合断片、約５．０ｍｇ／ｍＬのペンブロリズマブ、約５４ｍｇ／ｍＬのスクロース；約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ約５．８の、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝液；約５６ｍＭのＬ－アルギニン；および約８ｍＭのＬ－メチオニンを含む医薬組成物、または製剤化された際に、約２５．０ｍｇ／ｍＬの抗ＬＡＧ３抗体もしくは抗原結合断片；約５０ｍｇ／ｍＬのスクロース；約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０；ｐＨ約５．８の、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝液；約７０ｍＭのＬ－アルギニン－ＨＣｌ；および場合により約１０ｍＭのＬ－メチオニンを含む医薬組成物であって、２～８℃で１、３、６、９または１２ヶ月の時点で、ＰＳ８０の濃度が、製剤化された際の濃度の少なくとも９０％、９５％、９９％、８５％または８０％に維持されている医薬組成物を提供する。
本明細書に記載される医薬組成物の様々な実施形態では、宿主細胞リパーゼのレベルは、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）または液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング（ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ）によって測定される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、以下の工程を含むＨＩＣクロマトグラフィープロセスによって得ることができる：
（ａ）組成物を含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させる工程、および
（ｂ）約５～約７．５のｐＨと、約２５～８０ｍＳ／ｃｍの導電率とを有する溶出溶液を用いて、抗ＬＡＧ３抗体もしくはその抗原結合断片を溶出する工程、または
（ｃ）約５～約７．５のｐＨと、約２５～８０ｍＳ／ｃｍの導電率とを有するローディング操作条件を使用して、抗ＬＡＧ３抗体もしくはその抗原結合断片をフロースルー中に集める工程。
（ａ）組成物を含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させる工程、および
（ｂ）約５～約７．５のｐＨと、約２５～８０ｍＳ／ｃｍの導電率とを有する溶出溶液を用いて、抗ＬＡＧ３抗体もしくはその抗原結合断片を溶出する工程、または
（ｃ）約５～約７．５のｐＨと、約２５～８０ｍＳ／ｃｍの導電率とを有するローディング操作条件を使用して、抗ＬＡＧ３抗体もしくはその抗原結合断片をフロースルー中に集める工程。
他の実施形態では、医薬組成物は、以下の工程を含むＨＩＣクロマトグラフィープロセスによって得ることができる：
（ａ）組成物を含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させる工程、および
（ｂ）約５～約７．５のｐＨと、約５０～７０ｍＳ／ｃｍの導電率とを有する溶出溶液を用いて、抗ＬＡＧ３抗体もしくはその抗原結合断片を溶出する工程、または
（ｃ）約５～約７．５のｐＨと、約５０～７０ｍＳ／ｃｍの導電率とを有するローディング操作条件を使用して、抗ＬＡＧ３抗体もしくはその抗原結合断片をフロースルー中に集める工程。
（ａ）組成物を含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させる工程、および
（ｂ）約５～約７．５のｐＨと、約５０～７０ｍＳ／ｃｍの導電率とを有する溶出溶液を用いて、抗ＬＡＧ３抗体もしくはその抗原結合断片を溶出する工程、または
（ｃ）約５～約７．５のｐＨと、約５０～７０ｍＳ／ｃｍの導電率とを有するローディング操作条件を使用して、抗ＬＡＧ３抗体もしくはその抗原結合断片をフロースルー中に集める工程。
他の実施形態では、ＨＩＣクロマトグラフィーの前に、結合および溶出モードで操作されるプロテインＡクロマトグラフィー、およびフロースルーモードで操作されるＡＥＸクロマトグラフィーが先行する。
［実施例］
このセクション（セクションＶＩ）の例は、限定ではなく例示として提供されている。
このセクション（セクションＶＩ）の例は、限定ではなく例示として提供されている。
［実施例１］
異なる種のＫＰを決定する方法
分配係数ＫＰは、既知の液体濃度のタンパク質（または目的の他の分子）を既知の体積のクロマトグラフィー樹脂と混合し、樹脂に結合したタンパク質と液体中に残っているタンパク質との比を計算することによって決定される：
ＫＰ＝ｑ／ｃ＝［結合］／［遊離］。
異なる種のＫＰを決定する方法
分配係数ＫＰは、既知の液体濃度のタンパク質（または目的の他の分子）を既知の体積のクロマトグラフィー樹脂と混合し、樹脂に結合したタンパク質と液体中に残っているタンパク質との比を計算することによって決定される：
ＫＰ＝ｑ／ｃ＝［結合］／［遊離］。
その後の実施例２～３では、クロマトグラフィー体積は２０μＬであり、液体体積は２００μＬであり、タンパク質濃度は０．５ｍｇ／ｍＬであった。これらの体積は、５ｍｇ／ｍＬの有効樹脂ローディングに対して１０：１の相比を提供する。
スクリーニングは、９６ウェルフィルタープレート（Ｐ／Ｎ ＭＳＢＶＮ１２５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）内で樹脂と液体とを激しく混合し、真空濾過によって樹脂と液体とを分離することによって行った。工程の順序は以下の通りであった：
（ａ）３回の平衡化（供給物を含有しない緩衝液）、各工程１０分間のインキュベーション；
（ｂ）１回の供給物混合、６０分間のインキュベーション；および
（ｃ）２回のストリップ条件、各工程１０分間のインキュベーション
平衡化工程は、初期樹脂スラリー緩衝液からの緩衝液交換を可能にする。供給物混合のための６０分の時間は、所与の条件セットで樹脂リガンドとタンパク質との間の擬似平衡化を可能にする。供給工程からの濾液を２８０～３２０ｎｍでのＵＶ吸光度によって測定して、タンパク質の最終液体濃度ｃを決定した。タンパク質の結合濃度ｑは、ｃ付近と、既知の供給物濃度ｃ０（０．５ｍｇ／ｍＬ）との物質収支によって決定した。
（ａ）３回の平衡化（供給物を含有しない緩衝液）、各工程１０分間のインキュベーション；
（ｂ）１回の供給物混合、６０分間のインキュベーション；および
（ｃ）２回のストリップ条件、各工程１０分間のインキュベーション
平衡化工程は、初期樹脂スラリー緩衝液からの緩衝液交換を可能にする。供給物混合のための６０分の時間は、所与の条件セットで樹脂リガンドとタンパク質との間の擬似平衡化を可能にする。供給工程からの濾液を２８０～３２０ｎｍでのＵＶ吸光度によって測定して、タンパク質の最終液体濃度ｃを決定した。タンパク質の結合濃度ｑは、ｃ付近と、既知の供給物濃度ｃ０（０．５ｍｇ／ｍＬ）との物質収支によって決定した。
分配は、一般に、ｌｏｇ ＫＰに関して報告されており、ｌｏｇ ＫＰは、本明細書に記載のＵＶ法を使用して約０～２まで正確に定量することができる。ｌｏｇ ＫＰスクリーニングの通則は、以下の通りである：
ｌｏｇ ＫＰ≧１．５、樹脂への強い結合；
ｌｏｇ ＫＰ＜１、結合溶出様式について溶出が予測される条件；
０．５＜ｌｏｇ ＫＰ＜１、いくらかの結合を示す弱い相互作用条件；
ｌｏｇ ＫＰ＜０．５、結合がほとんどまたは全くない。
ｌｏｇ ＫＰ≧１．５、樹脂への強い結合；
ｌｏｇ ＫＰ＜１、結合溶出様式について溶出が予測される条件；
０．５＜ｌｏｇ ＫＰ＜１、いくらかの結合を示す弱い相互作用条件；
ｌｏｇ ＫＰ＜０．５、結合がほとんどまたは全くない。
異なる種のｌｏｇ Ｋｐはまた、分離係数αを以下のように計算することによって、異なる種の分離を予測するために使用される：α＝ＫＰ、タンパク質１／ＫＰ、タンパク質２；ｌｏｇ α＝ｌｏｇ ＫＰ、タンパク質１－ｌｏｇ ＫＰ、タンパク質２、ここで、ｌｏｇ αが０から遠いほど、さらに良好な分離を示す。以下の実施例では、α＝ＫＰ、リパーゼ／ＫＰ、ｍＡｂ；ｌｏｇ α＝ｌｏｇ ＫＰ、リパーゼ－ｌｏｇ ＫＰ、ｍＡｂである。ｌｏｇ αが０．５よりも大きいことは、リパーゼとモノクローナル抗体との分離が良好であることを示す。ｌｏｇ αが－０．５未満であることも、リパーゼとモノクローナル抗体との分離が良好であることを示す。
［実施例２］
典型的な処理条件でのＰＬＢＬ２およびｍＡｂのＫＰ値の比較
ＫＰおよびαを決定するための方法を使用して、抗ＬＡＧ３抗体Ａｂ６のための操作条件で、様々なクロマトグラフィープロセスによって、既知のリパーゼ不純物ＰＬＢＬ２を分離する能力を評価した。
典型的な処理条件でのＰＬＢＬ２およびｍＡｂのＫＰ値の比較
ＫＰおよびαを決定するための方法を使用して、抗ＬＡＧ３抗体Ａｂ６のための操作条件で、様々なクロマトグラフィープロセスによって、既知のリパーゼ不純物ＰＬＢＬ２を分離する能力を評価した。
表２は、Ａｂ６のためのいくつかの処理条件でのＡｂ６およびＰＬＢＬ２のｌｏｇ Ｋｐ値およびｌｏｇ α値を要約している。
プロテインＡプロセスでは、ＰＬＢＬ２は親和性を有しないため、ＰＬＢＬ２の大部分は、ローディング工程または洗浄工程中にプロテインＡ樹脂を通って流れると予測される。プールに存在する唯一のＰＬＢＬ２は、不十分な洗浄によるものであるか、またはＡｂ６と関連している可能性が高い。
ＣＥＸプロセスでは、Ａｂ６の方が、低い塩で低い結合を有するため、塩範囲全体にわたって堅牢なｌｏｇ αを有する。ＡＥＸプロセスでは、Ａｂ６の方がＰＬＢＬ２よりも強く樹脂に結合し、ロード条件および洗浄条件で負のｌｏｇ αをもたらす。これは、フロースルーモードで操作している場合には分離ポテンシャルがないことを示し、Ａｂ６の比較的強い結合に起因したフロースルー中のＰＬＢＬ２の濃縮をも示し得る。
Ａｂ６について、追加のＨＩＣプロセスも試験した。このプロセスでは、ＰＬＢＬ２は、ロード条件および溶出条件を通して比較的高いｌｏｇ ＫＰを有し、溶出塩濃度の比較的低い範囲で比較的大きいｌｏｇ α値を有した。これは、これらの比較的低い塩条件では、Ａｂ６回収およびＰＬＢＬ２分離がともにさらに好ましいことを示している。
［実施例３］
ＨＩＣ樹脂のための様々な条件でのＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２のＫＰ値のマッピング
Ａｂ６（ｍＡｂ２）およびｍＡｂ３の下流処理に使用される可能性がある様々な緩衝液および条件を有するＨＩＣ樹脂について、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２の分配係数を行った（表３）。
ＨＩＣ樹脂のための様々な条件でのＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２のＫＰ値のマッピング
Ａｂ６（ｍＡｂ２）およびｍＡｂ３の下流処理に使用される可能性がある様々な緩衝液および条件を有するＨＩＣ樹脂について、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２の分配係数を行った（表３）。
２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の緩衝条件で硫酸ナトリウム濃度を調節することによって、ＨＩＣ樹脂、Ｔｏｓｏｈ Ｂｕｔｙｌ－６５０ＭへのＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２の分配試験を行った（表３、図１）。両リパーゼは、高塩では強い結合を有する典型的なＨＩＣ挙動を示し（ｌｏｇ ＫＰ＞１．５、ＰＬＢＬ２については２５０ｍＭを超える硫酸ナトリウム、およびＬＰＬＡ２については４００ｍＭ硫酸ナトリウム）、低塩では分配を減少させた（ｌｏｇ ＫＰ＜１、ＰＬＢＬ２については１５０ｍＭ未満の硫酸ナトリウム、およびＬＰＬＡ２については２００ｍＭ硫酸ナトリウム）。
表３に列挙した条件でＨＩＣ樹脂、Ｔｏｓｏｈ Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ（図２）を用いて、抗体およびリパーゼの分配も比較した。硫酸ナトリウム濃度を変化させても、ｍＡｂ３とＰＬＢＬ２との間の分離はほとんどもたらされず、この条件では、３００ｍＭの硫酸ナトリウムのみが約０．３のｌｏｇ αで何らかの分離をもたらす。ＬＰＬＡ２は、３００～４００ｍＭの硫酸ナトリウムで約０．５のｌｏｇ αで幾分良好な分離をもたらす。対照的に、Ａｂ６は、ｍＡｂ３、ＰＬＢＬ２またはＬＰＬＡ２よりもはるかに疎水性が低く、したがって、硫酸ナトリウムが６００ｍＭを超えるまで、１．５のｌｏｇ ＫＰを超えるＨＩＣ樹脂への強い結合に移行しない。Ａｂ６およびＰＬＢＬ２の場合、１．５～２．０のｌｏｇ α値が３００～５００ｍＭの硫酸ナトリウムで達成され得、これは、その中で操作するための有望な分離能力を有する非常に広い塩範囲である。ＬＰＬＡ２についても同様に、この同じ塩範囲では、１よりも大きいｌｏｇ α値が見られる。
［実施例４］
フロースルー法による抗ＬＡＧ３抗体調製物の疎水性相互作用クロマトグラフィー精製
Ａｂ６を含有する回収細胞培養液を、実施例２に記載のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびアニオンイオン交換クロマトグラフィー、ならびに疎水性相互作用クロマトグラフィーに供した。疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｔｏｓｏｈ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ）工程は、１５０ｇ／Ｌ樹脂の目標ローディングで、室温でフロースルーモードで操作した。抗ＬＡＧ３抗体Ａｂ６を含有するウイルス濾過生成物を、１．４Ｍ Ｎａ２ＳＯ４を用いて５６０ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４に調整し、１ｋｇのウイルス濾過生成物を０．７７ｋｇの１．４Ｍ Ｎａ２ＳＯ４に調整した。１．４ＭのＮａ２ＳＯ４を加えた後、供給物を１ＭのＴｒｉｓ塩基を用いて７．０の目標ｐＨまで滴定し、ＨＩＣロードを得る。表４は、ＨＩＣクロマトグラフィー：カラム平衡化、ＨＩＣクロマトグラフィープロセスの操作工程およびパラメータを詳述している。カラム流出液の吸光度を２８０ｎｍの波長でオンラインでモニタリングし、未調整のＨＩＣ生成物を回収するために使用した。未調整のＨＩＣ生成物を１Ｍ酢酸溶液を用いて５．８の目標ｐＨまで滴定した。ｐＨ調整後、１ｋｇのＨＩＣ生成物を２ｋｇの１０ｍＭヒスチジン、７０ｍＭアルギニンｐＨ５．８を用いて希釈し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＨＣ ０．５／０．２μｍフィルターを通して濾過し、限外濾過ジフィルトレーションした（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅｄ Ｄｉｆｉｌｔｒａｔｅｄ）（ＵＦＤＦ）ロードを得た。
フロースルー法による抗ＬＡＧ３抗体調製物の疎水性相互作用クロマトグラフィー精製
Ａｂ６を含有する回収細胞培養液を、実施例２に記載のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびアニオンイオン交換クロマトグラフィー、ならびに疎水性相互作用クロマトグラフィーに供した。疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｔｏｓｏｈ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ）工程は、１５０ｇ／Ｌ樹脂の目標ローディングで、室温でフロースルーモードで操作した。抗ＬＡＧ３抗体Ａｂ６を含有するウイルス濾過生成物を、１．４Ｍ Ｎａ２ＳＯ４を用いて５６０ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４に調整し、１ｋｇのウイルス濾過生成物を０．７７ｋｇの１．４Ｍ Ｎａ２ＳＯ４に調整した。１．４ＭのＮａ２ＳＯ４を加えた後、供給物を１ＭのＴｒｉｓ塩基を用いて７．０の目標ｐＨまで滴定し、ＨＩＣロードを得る。表４は、ＨＩＣクロマトグラフィー：カラム平衡化、ＨＩＣクロマトグラフィープロセスの操作工程およびパラメータを詳述している。カラム流出液の吸光度を２８０ｎｍの波長でオンラインでモニタリングし、未調整のＨＩＣ生成物を回収するために使用した。未調整のＨＩＣ生成物を１Ｍ酢酸溶液を用いて５．８の目標ｐＨまで滴定した。ｐＨ調整後、１ｋｇのＨＩＣ生成物を２ｋｇの１０ｍＭヒスチジン、７０ｍＭアルギニンｐＨ５．８を用いて希釈し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＨＣ ０．５／０．２μｍフィルターを通して濾過し、限外濾過ジフィルトレーションした（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅｄ Ｄｉｆｉｌｔｒａｔｅｄ）（ＵＦＤＦ）ロードを得た。
以下に記載されるように液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング（ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ）によるリパーゼ同定について、対応するクロマトグラフィーストリップ試料とともに上記バッチのインプロセス中間体を試験した（表５）。ＰＬＢＬ２は、ロード試料中には見出されたが、ＨＩＣフロースルー試料には存在しなかった。
Ｗａｔｅｒｓ ＴＱＳトリプル四重極ＭＳを用いて、多重反応モニタリング質量分析（ＲＰ－ＵＰＬＣ－ＭＲＭ ＭＳ）法と組み合わせた逆相超高速液体クロマトグラフィーを開発して、ＣＨＯリパーゼＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を定量した。８分ＬＣ－ＭＲＭ ＭＳ法は、バイオプロセス中間体および／または生物製剤医薬物質（ｎｇ／ｍｇまたはｐｐｍ）中の２つのリパーゼの絶対定量を提供するリパーゼ特異的定量アッセイである。各リパーゼの１～５００ｎｇ／ｍｇのアッセイ定量範囲は、ＣＨＯ組換えＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）をタンパク質標準としてＡｂ６医薬物質に、ならびにＰＬＢＬ２（Ｈ２Ｎ－ＬＴＦＰＴＧＲ（１３Ｃ６、１５Ｎ４－ＯＨ））配列番号１２およびＬＰＬＡ２（Ｈ２Ｎ－ＩＰＶＩＧＰＬＫ（１３Ｃ６、１５Ｎ２）－ＯＨ配列番号１３）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ）のＣ１３－およびＮ１５－重標識ペプチドを内部標準（ＩＳ）として添加することによって達成される。試料およびタンパク質標準を変性させ、Ｓ－Ｓ結合を還元およびアルキル化し、ＬＣ－ＭＳ分析の前にトリプシンによって消化した。消化した試料をＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（５０×２．１ ｍｍ、１．７μｍ）にロードし、０．２ｍＬ／分の流速で１０から３５％の移動相Ｂ（アセトニトリル中０．１％ギ酸）の勾配によって分離した。移動相Ａは０．１％ギ酸の水溶液であった。それぞれの較正曲線（ピーク面積比（分析物／ＩＳ）対分析物濃度）、および線形回帰のための１／ｘ２の重み係数）によるＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２の定量に、トリプシン消化によって生成された代理ペプチドのＭＲＭトランジション、ＰＬＢＬ２ペプチドＬＴＦＰＴＧＲ（配列番号１２）のｍ／ｚ ３９６．５（前駆イオン）－＞ｍ／ｚ ４３０．３（フラグメントイオン）、およびＬＰＬＡ２ペプチドＩＰＶＩＧＰＬＫ（配列番号１３）のｍ／ｚ ４１９．１（前駆イオン）－＞ｍ／ｚ ３６２．３（フラグメントイオン）を使用した。
［実施例５］
結合および溶出法による抗ＬＡＧ３抗体調製物の疎水性相互作用クロマトグラフィー精製
Ａｂ６を含有する採取した細胞培養液を、実施例２に記載のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびアニオンイオン交換クロマトグラフィー、ならびに疎水性相互作用クロマトグラフィーに供した。３０ｇ／Ｌ樹脂の目標ローディングで、室温で結合および溶出モードで、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程（Ｔｏｓｏｈ（商標）製のＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ樹脂）を操作した。Ａｂ６を含有するウイルス濾過生成物を、１．４Ｍ Ｎａ２ＳＯ４を用いて調整し、１ｋｇのウイルス濾過生成物を２ｋｇの１．４Ｍ Ｎａ２ＳＯ４に調整する。１．４ＭのＮａ２ＳＯ４を加えた後、供給物を１ＭのＴｒｉｓ塩基を用いて７．０の目標ｐＨまで滴定し、ＨＩＣロードを得る。ＨＩＣロードをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＨＣ ０．５／０．２μｍフィルターを通して濾過し、カラムにローディングした。表６は、ＨＩＣクロマトグラフィー：カラム平衡化、およびＨＩＣクロマトグラフィープロセスの操作工程およびパラメータを詳述している。カラム流出液の吸光度を２８０ｎｍの波長でオンラインでモニタリングし、未調整のＨＩＣ生成物を回収するために使用した。未調整のＨＩＣ生成物を１Ｍ酢酸溶液を用いて５．８の目標ｐＨまで滴定した。ｐＨ調整後、１ｋｇのＨＩＣ生成物を２ｋｇの１０ｍＭヒスチジン、７０ｍＭアルギニンｐＨ５．８を用いて希釈し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＨＣ ０．５／０．２μｍフィルターを通して濾過し、限外濾過ジフィルトレーションした（ＵＦＤＦ）ロードを得た。
結合および溶出法による抗ＬＡＧ３抗体調製物の疎水性相互作用クロマトグラフィー精製
Ａｂ６を含有する採取した細胞培養液を、実施例２に記載のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびアニオンイオン交換クロマトグラフィー、ならびに疎水性相互作用クロマトグラフィーに供した。３０ｇ／Ｌ樹脂の目標ローディングで、室温で結合および溶出モードで、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程（Ｔｏｓｏｈ（商標）製のＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ樹脂）を操作した。Ａｂ６を含有するウイルス濾過生成物を、１．４Ｍ Ｎａ２ＳＯ４を用いて調整し、１ｋｇのウイルス濾過生成物を２ｋｇの１．４Ｍ Ｎａ２ＳＯ４に調整する。１．４ＭのＮａ２ＳＯ４を加えた後、供給物を１ＭのＴｒｉｓ塩基を用いて７．０の目標ｐＨまで滴定し、ＨＩＣロードを得る。ＨＩＣロードをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＨＣ ０．５／０．２μｍフィルターを通して濾過し、カラムにローディングした。表６は、ＨＩＣクロマトグラフィー：カラム平衡化、およびＨＩＣクロマトグラフィープロセスの操作工程およびパラメータを詳述している。カラム流出液の吸光度を２８０ｎｍの波長でオンラインでモニタリングし、未調整のＨＩＣ生成物を回収するために使用した。未調整のＨＩＣ生成物を１Ｍ酢酸溶液を用いて５．８の目標ｐＨまで滴定した。ｐＨ調整後、１ｋｇのＨＩＣ生成物を２ｋｇの１０ｍＭヒスチジン、７０ｍＭアルギニンｐＨ５．８を用いて希釈し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＨＣ ０．５／０．２μｍフィルターを通して濾過し、限外濾過ジフィルトレーションした（ＵＦＤＦ）ロードを得た。
液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によるリパーゼ同定について、対応するクロマトグラフィーストリップ試料とともに、上記バッチのインプロセス中間体を試験した（表７）。ＰＬＢＬ２およびクラスタリンは、ロード試料およびストリップ試料中には見出されたが、ＨＩＣ溶出プール試料には存在しなかった。
バイオプロセス中間体および医薬物質（ＤＳ）のＨＣＰ同定および相対定量を含むＨＣＰプロファイリングを提供するために、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるＨＣＰプロテオミクス（タンデムＭＳデータはデータ依存型取得またはＤＤＡモードで取得される）が開発されている。変性、ＤＴＴ還元、ＩＡＡアルキル化およびトリプシン消化に、ＨＩＣカラムロード溶液、ＨＩＣカラム溶出プールおよびＨＩＣカラムストリップ試料を含む試料を供した。次いで、Ｗａｔｅｒｓ ＨクラスＵＰＬＣ－Ｔｈｅｒｍｏ ＱＥオービトラップシステムを用いて行ったＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（ＤＤＡ）によって、消化した試料を分析した。Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＰＥＰＴＩＤＥ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（１３０Å、１．７μｍ、１×１５０ｍｍ）を分離に使用し、０．１％ＦＡの水溶液と、０．１％ＦＡのＡＣＮ溶液とを移動相ＡおよびＢとして使用した。タンパク質同定のために、Ｔｈｅｒｍｏ ＰＤ ２．２によってＣＨＯデータベースを検索した（ＭＳでは質量精度≦１０ｐｐｍ、およびＭＳ／ＭＳでは≦０．０２ Ｄａ；≦１％ＦＤＲ；１タンパク質当たり≧２の固有のペプチドＩＤ）。ＨＣＰの相対定量は、ＰＤ ２．２によって抽出されたその固有のペプチドの（１または複数の）Σ ＸＩＣ ＭＳ１ピーク面積によって達成される。
［実施例６］
宿主細胞リパーゼが除去されるにつれてＰＳ－８０安定性が増加した
Ａｂ６Ａ注射は、静脈内注入のための希釈を必要とする無菌の防腐剤不含溶液である。Ａｂ６Ａは、抗ＬＡＧ３抗体Ａｂ６と抗ＰＤ－１抗体ＭＫ－３４７５（ペンブロリズマブ）との固定用量の組合せであり、各単回使用バイアルは、２．０ｍＬ充填物中に４０ｍｇのＡｂ６と１０ｍｇのＭＫ－３４７５とを含有する。医薬品組成は、２０．０ｍｇ／ｍＬのＡｂ６、５．０ｍｇ／ｍＬのＭＫ－３４７５、５４ｍｇ／ｍＬのスクロース；０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ５．８の、１０ｍＭのヒスチジン緩衝液；５６ｍＭのＬ－アルギニン；および８ｍＭのＬ－メチオニンである。実施例４からのＡｂ６医薬物質を使用して、Ａｂ６Ａ医薬品を製剤化した。
宿主細胞リパーゼが除去されるにつれてＰＳ－８０安定性が増加した
Ａｂ６Ａ注射は、静脈内注入のための希釈を必要とする無菌の防腐剤不含溶液である。Ａｂ６Ａは、抗ＬＡＧ３抗体Ａｂ６と抗ＰＤ－１抗体ＭＫ－３４７５（ペンブロリズマブ）との固定用量の組合せであり、各単回使用バイアルは、２．０ｍＬ充填物中に４０ｍｇのＡｂ６と１０ｍｇのＭＫ－３４７５とを含有する。医薬品組成は、２０．０ｍｇ／ｍＬのＡｂ６、５．０ｍｇ／ｍＬのＭＫ－３４７５、５４ｍｇ／ｍＬのスクロース；０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ５．８の、１０ｍＭのヒスチジン緩衝液；５６ｍＭのＬ－アルギニン；および８ｍＭのＬ－メチオニンである。実施例４からのＡｂ６医薬物質を使用して、Ａｂ６Ａ医薬品を製剤化した。
Ａｂ６Ａ医薬品のために、安定性に関して３ヶ月までポリソルベート８０（ＰＳ－８０）を実験した（図４）。５℃では、３ヶ月の時点でＰＳ－８０含有量（％）にほとんど変化が見られなかった（０．１９ｍｇ／ｍｌ）。２５℃では、３ヶ月の時点でＰＳ－８０のわずかな減少が見られ（０．１８ｍｇ／ｍｌ）、４０℃条件では同じ間隔でわずかにさらに顕著な減少が見られた（０．１６ｍｇ／ｍｌ）。
ポストカラムスイッチ（ｐｏｓｔ ｃｏｌｕｍｎ ｓｗｉｔｃｈ）および帯電エアロゾル検出（ＣＡＤ）と組み合わせた混合モードカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｏａｓｉｓ Ｍａｘカラム、２．１×２０ｍｍ、３０μｍ）を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、ポリソルベート８０を決定した。Ｃｏｒｏｎａ ＣＡＤは、カラムから溶出する試料中の本質的にあらゆる不揮発性化合物および一部の半揮発性化合物に応答する質量感受性検出器である。流速１ｍＬ／分の勾配設定で、移動相Ａ：０．５％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液、および移動相Ｂ：０．５％（ｖ／ｖ）酢酸のイソプロピルアルコール溶液を使用した。ポリソルベート８０濃度の計算は、ＰＳ－８０標準に対する二次適合検定線（ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｆｉｔ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｌｉｎｅ）を用いて行い、試料溶液中のポリソルベート８０濃度（ｍｇ／ｍＬ）として報告する。
ＰＳ－８０安定性を、２カラムおよび３カラム精製スキームから生成した２つのＡｂ６医薬物質（ＤＳ）試料の間で比較した。２カラム精製スキームには、プロテインＡおよびＡＥＸを含めた。得られたＡＥＸプール（ＡＥＸ）を、２５ｍｇ／ｍＬのＡｂ６；５０ｍｇ／ｍＬのスクロース；０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０；ｐＨ５．８の、１０ｍＭのヒスチジン緩衝液；および７０ｍＭのＬ－アルギニン－ＨＣｌに配合し、「ＡＥＸ ＤＳ」と呼ぶ。３カラム精製スキームには、プロテインＡ、ＡＥＸ、ならびにＨＩＣ結合および溶出、またはフロースルー（ＨＩＣ Ｂ＆Ｅ ＤＳまたはＨＩＣ ＦＴ ＤＳ）を含めた。得られたＨＩＣプールを、２５ｍｇ／ｍＬのＡｂ６；５０ｍｇ／ｍＬのスクロース；０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０；ｐＨ５．８の、１０ｍＭのＬ－ヒスチジン緩衝液；７０ｍＭのＬ－アルギニンおよび１０ｍＭのＬ－メチオニンに配合した。バイアルを相対湿度（ＲＨ）５℃±３℃；２５℃±３℃、６０％±５％の安定性チャンバーに入れた。試料を取り出し、２、４、６、１４週間隔でＰＳ－８０濃度について試験した。
図３に示すように、ＡＥＸ ＤＳ中のＰＳ－８０濃度は、５℃で０．２０（０週）から０．１７ｍｇ／ｍＬ（６週間）まで低下した。ＰＳ－８０の分解は、貯蔵温度が高くなるにつれて増加した。例えば、２５℃では、ＡＥＸ ＤＳ中のＰＳ－８０濃度は、０．２０（０週）から０．１２ｍｇ／ｍＬ（６週間）まで低下した。一方、ＨＩＣ Ｂ＆Ｅ ＤＳおよびＨＩＣ ＦＴ ＤＳの両方では、ＰＳ－８０濃度は、両温度で経時的に顕著に変化しなかった。ＰＳ－８０安定性法のアッセイ変動性は±１０％である。データを評価する場合、初期時点の報告値から≦±１０％のドリフトは、値が類似していると見なすことができる。したがって、ＡＥＸプール中のＰＬＢＬ２の存在は、ＡＥＸ ＤＳ中の５～２５℃でのＰＳ－８０濃度低下の１つの潜在的原因であり得ると仮定される。第３のＨＩＣカラムを加えることにより、リパーゼを効果的に除去し、ＨＩＣ ＤＳ中のＰＳ－８０安定性を改善することができる。
実施例４を通して精製し、２５ｍｇ／ｍＬのＡｂ６；５０ｍｇ／ｍＬのスクロース；０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０；ｐＨ５．８の、１０ｍＭのＬ－ヒスチジン緩衝液；７０ｍＭのＬ－アルギニンおよび１０ｍＭのＬ－メチオニンに配合したＡｂ６医薬物質について、追加のＰＳ８０安定性を試験した。バイアルを５℃±３℃の安定性チャンバーに入れた。試料を取り出し、１、３、６、９および１２ヶ月間隔でＰＳ－８０濃度について試験した（表９）。ＰＳ－８０濃度は経時的に顕著に変化せず、ＰＳ－８０安定性法のアッセイ変動性±１０％以内であった。
Claims (37)
- 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）プロセスによって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と宿主細胞リパーゼとを含む組成物から宿主細胞リパーゼを分離する方法であって、
（ａ）ローディング操作条件下で、前記組成物を含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、および
（ｂ）前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片をフロースルー中に集めることを含み、
分離係数（α）が、前記リパーゼの分配係数（Ｋｐ）の前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のＫｐに対する比であり、ｌｏｇαが、前記ローディング操作条件下で０．５よりも大きく、前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法。 - 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）プロセスによって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と宿主細胞リパーゼとを含む組成物から宿主細胞リパーゼを分離する方法であって、
（ａ）ローディング操作条件下で、前記組成物を含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出操作条件下で溶出溶液を用いて、クロマトグラフィー樹脂から前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片を溶出することを含み、
分離係数（α）が、前記リパーゼの分配係数（Ｋｐ）の前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のＫｐに対する比であり、ｌｏｇαが、前記溶出操作条件下で０．５よりも大きく、前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法。 - カチオン交換（ＣＥＸ）プロセスによって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と宿主細胞リパーゼとを含む組成物から宿主細胞リパーゼを分離する方法であって、
（ａ）ローディング操作条件下で、前記組成物を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出操作条件下で溶出溶液を用いて、クロマトグラフィー樹脂から前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片を溶出することを含み、
分離係数（α）が、前記リパーゼの分配係数（Ｋｐ）の前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のＫｐに対する比であり、ｌｏｇαが、前記溶出操作条件下で０．５よりも大きく、前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法。 - 抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片製剤におけるポリソルベート－８０（ＰＳ－８０）安定性を改善する方法であって、
（ａ）ローディング操作条件下で、宿主細胞リパーゼと抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片とを含むロード流体をＨＩＣクロマトグラフィー樹脂に通過させること、
（ｂ）前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片をフロースルー中に集めること、および
（ｃ）前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片製剤がＰＳ－８０含有溶液であるように、前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片を製剤化することを含み、
分離係数（α）が、前記リパーゼの分配係数（Ｋｐ）の前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片のＫｐに対する比であり、ｌｏｇαが、前記ローディング操作条件下で０．５よりも大きく、前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法。 - ｌｏｇαが、溶出操作条件下で１．０よりも大きい、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リパーゼのｌｏｇＫｐが１．０よりも大きい、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リパーゼのｌｏｇＫｐが１．５よりも大きい、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リパーゼがＣＨＯ細胞リパーゼである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リパーゼが、ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、リソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）、ホスホリパーゼＡ２ ＶＩＩ（ＬＰ－ＰＬＡ２）およびリソソーム酸リパーゼＡ（ＬＡＬ）からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リパーゼがＰＬＢＬ２である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リパーゼがＬＰＬＡ２である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- ローディング操作条件または溶出溶液が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムおよびＴｒｉｓ－ＨＣｌからなる群から選択される塩を含み、ｐＨが約５～７．５である、請求項１～２および４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記塩が、塩化カリウムまたは塩化ナトリウムである、請求項１２に記載の方法。
- 操作溶液中の塩化ナトリウムの濃度が約１００ｍＭ～約２２５ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂がＣＥＸであり、操作条件のｐＨが約５．０～約６．０である、請求項１３に記載の方法。
- 操作溶液中の塩化ナトリウムの濃度が約１５０ｍＭ～約１８０ｍＭであり、前記クロマトグラフィー樹脂がＣＥＸであり、操作条件のｐＨが約５．０～約６．０である、請求項１３に記載の方法。
- 疎水性相互作用クロマトグラフィープロセスによって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片とＰＬＢＬ２またはＬＰＬＡ２とを含む組成物からＰＬＢＬ２またはＬＰＬＡ２を分離する方法であって、
（ａ）前記組成物を含むロード流体を疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に通過させること、および
（ｂ）前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片をフロースルー中に集めることを含み、
前記ロード流体が、約２５～８０ｍＳ／ｃｍの導電率を有し、前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法。 - 疎水性相互作用クロマトグラフィープロセスによって、抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片とＰＬＢＬ２またはＬＰＬＡ２とを含む組成物からＰＬＢＬ２またはＬＰＬＡ２を分離する方法であって、
（ａ）前記組成物を含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、前記ＨＩＣ樹脂から前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片を溶出することを含み、前記溶出溶液が、約２５～８０ｍＳ／ｃｍの導電率を有し、
前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む方法。 - ロード流体または溶出溶液が、約５０～７０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項１６または１７に記載の方法。
- ロード流体または溶出溶液が、約３００ｍＭ～約６５０ｍＭの一価または二価の塩を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
- 前記塩が約５００～６２０ｍＭの硫酸ナトリウムであり、ｐＨが約５～７．５である、請求項１９に記載の方法。
- 前記塩が５６０ｍＭの硫酸ナトリウムであり、前記ロード流体または溶出溶液のｐＨが約７である、請求項２０に記載の方法。
- 前記ロード流体が、結合および溶出モードで行われるプロテインＡクロマトグラフィー、続いてフロースルーモードで行われるＡＥＸクロマトグラフィーからの溶出液である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
- 抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、２ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む組成物であって、前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む組成物。
- １ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼを含む、請求項２３に記載の組成物。
- 前記リパーゼが、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される、請求項２３～２４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記リパーゼがＰＬＢＬ２である、請求項２３～２４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記宿主細胞リパーゼのレベルが、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）または液体クロマトグラフィー－多重反応（ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ）によって測定される、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の組成物。
- （ａ）ローディング操作条件下で、抗ＬＡＧ３抗体もしくは抗原結合断片と宿主細胞リパーゼとを含む組成物を含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させる工程、および
（ｂ）約５～約７．５のｐＨと、約２５～８０ｍＳ／ｃｍの導電率とを有する溶出溶液を用いて、前記抗ＬＡＧ３抗体もしくはその抗原結合断片を溶出する工程、または
（ｃ）約５～約７．５のｐＨと、約２５～８０ｍＳ／ｃｍの導電率とを有するローディング操作条件を使用して、前記抗ＬＡＧ３抗体もしくはその抗原結合断片をフロースルー中に集める工程
を含むＨＩＣプロセスによって得ることができる、請求項２３～２７のいずれか一項に記載の組成物。 - （ａ）ローディング操作条件下で、前記抗ＬＡＧ３抗体もしくは抗原結合断片と宿主細胞リパーゼとを含む組成物を含むロード流体をＨＩＣ樹脂に通過させる工程、および
（ｂ）約５～約７．５のｐＨと、約５０～７０ｍＳ／ｃｍの導電率とを有する溶出溶液を用いて、前記抗ＬＡＧ３抗体もしくはその抗原結合断片を溶出する工程、または
（ｃ）約５～約７．５のｐＨと、約５０～７０ｍＳ／ｃｍの導電率とを有するローディング操作条件を使用して、前記抗ＬＡＧ３抗体もしくはその抗原結合断片をフロースルー中に集める工程
を含むＨＩＣプロセスによって得ることができる、請求項２３～２７のいずれか一項に記載の組成物。 - ＨＩＣクロマトグラフィーの前に、結合および溶出モードで操作されるプロテインＡクロマトグラフィー、およびフロースルーモードで操作されるＡＥＸクロマトグラフィーが先行する、請求項２８または２９に記載の組成物。
- 抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片と、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）またはポリソルベート２０（ＰＳ２０）とを含む医薬組成物であって、２～８℃で１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月または１２ヶ月の時点で、ＰＳ８０またはＰＳ２０の濃度が、製剤化された際の濃度の９０％以上に維持されており、前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号６、７および８の軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）配列番号９、１０および１１の重鎖ＣＤＲとを含む医薬組成物。
- 製剤化された際に約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む、請求項３１に記載の医薬組成物。
- 製剤化された際に約２０．０ｍｇ／ｍＬの前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片、約５．０ｍｇ／ｍＬのペンブロリズマブ、約５４ｍｇ／ｍＬのスクロース；約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ約５．８の、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝液；約５６ｍＭのＬ－アルギニン；および約８ｍＭのＬ－メチオニンを含む、請求項３１に記載の医薬組成物。
- 約２５．０ｍｇ／ｍＬの前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片；約５０ｍｇ／ｍＬのスクロース；約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０；ｐＨ約５．８の、約１０ｍＭのヒスチジン緩衝液；約７０ｍＭのＬ－アルギニン－ＨＣｌを含み、約１０ｍＭのＬ－メチオニンを含んでいてもよい、請求項３１に記載の医薬組成物。
- 前記抗ＬＡＧ３抗体または抗原結合断片が、配列番号５を含む重鎖可変領域を含み、軽鎖が、配列番号４を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法、組成物または医薬組成物。
- 前記抗ＬＡＧ３抗体が重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号３を含み、前記軽鎖が配列番号２を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法、組成物または医薬組成物。
- 前記抗ＬＡＧ３抗体がＡｂ６変異体である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法、組成物または医薬組成物。
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