DE2508132C3

DE2508132C3 - Verfahren zur Herstellung von Humanimmunglobulin-Derivaten und parenteral applizierbare Lösung hiervon

Info

Publication number: DE2508132C3
Application number: DE2508132A
Authority: DE
Inventors: Tokio Hino; Sachio Tokio Ishimoto; Yasuhiko Masuho; Kimihiko Matsuzawa; Kazuo Kawasaki Kanagawa Satake; Katsuhiko Tomibe; Tsuneo Tokio Watanabe
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1974-03-08
Filing date: 1975-02-25
Publication date: 1980-10-16
Also published as: CH614426A5; DE2508132B2; NL7502745A; FR2262996A1; NO144111C; GB1497928A; NL167167B; DE2560155C2; FR2262996B1; SE403703B; IN138636B; DK93475A; DE2508132A1; AU7872975A; SE7502346L; DK141432B; DK141432C; NL167167C; DD118655A5; NO750768L

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Humanimmunglobulin-Derivaten mit niedriger Antikomplementaktivität durch Spalten von den Interkettendisulfidbindungen von nativem Humanimmunglobulin unter Ausbildung von S-sulfonierten Polypeptiden und Dialysieren des Reaktionsgemisches, sowie auf eine parenteral applizierbare Lösung hiervon.

Auf dem Gebiet der Proteinchemie wurde in letzter Zeit die Beziehung zwischen der Struktur und den Funktionen des Immunglobulins, welche eine wichtige Rolle für die medizinisch äußerst signifikante Humoral-Immunität spielt, näher untersucht.

Es wurde dabei festgestellt, daß das Immunglobulin in fünf Typen unterteilbar ist, d. h. IgG, IgA, IgM, IgD und IgE, wovon IgG (das Humanimmunglobulin G) nicht weniger als 70 Gew.-% einnimmt.

Die Humanimmunglobuline, ausgenommen IgM, sind jeweils hauptsächlich aus vier Peptidketten aufgebaut und es sind mehrere Disulfidbindungen in den Interketten und den Intraketten vorhanden. Beispielsweise kann das IgG, das typischste der Immunglobuline, falls es mit Papain digeriert wird, in zwei Fragmente »Fab« mit Antigenbindungsaktivität und einem Fragment »Fc« mit Komplement- und Gewebebindungsaktivität fraktioniert werden. Es wurde weiterhin festgestellt, daß das IgG aus zwei Polypeptidschwerketten (Η-Ketten) und zwei Polypeptidleichtketten (L-Ketten) aufgebaut ist, welche durch Disulfidbindungen und nichtkovalente Bindungen unter Bildung eines Proteinmoleküls mit einem Molekulargewicht von etwa 160 000 stark verbunden sind, und daß das Molekül durchschnittlich etwa 4,5 Interkettendisulfidbindungen und etwa 12 Intrakettendisulfidbindungen enthält (B. Frangione & C. Milstein; J. MoI. BioL, Band 33, Seite 893 (1968)).

Bezogen auf die vorstehenden empirisch festgestell-

1; ten Sachverhalte wurden verschiedene Untersuchungen hinsichtlich Immunglobulin für intravenöse Injektion ausgeführt. Die Verwendung des Inimunglobulins setzte sich nach der Beendigung der Cohn-Fraktionierung (E. G. Cohn und Mitarbeiter; J. Amer. Chem. Soa, Band 68, Seite 459 (1946)) rasch durch.

Cohn und Mitarbeiter fraktionierten eine große Menge Humanplasma durch Äthanolausfällung. Die Fraktion II ist überwiegend IgG, welches kleinere Mengen an IgA und IgM enthält, und zeigt Antikörper-

2i aktivität gegen verschiedene Mikroorganismen, die Infektionskrankheiten verursachen. Deshalb ist die Verabfolgung dti- Fraktion II wirksam für die Prophylaxe und die Therapie von Virusinfektionskrankheiten, wie Masern, Viralhepatitis und dgl., sowie

in Infektionskrankheiten von gegenüber Antibiotika beständigen Bakterien, wie Streptococcus aureus. Die einzige bisher zur Verabfolgung des auf diese Weise fraktionierten und rezeptierten Humanimmunglobulins angewandte Maßnahme war die intramuskuläre Injek-

r. tion. Jedoch kann die intramuskuläre Injektion lediglich Partialosmosen der Injektionsflüssigkeit in den Körper bewirken und kann nicht eine augenblickliche Wirkung zeigen. Weilerhin erlaubt die intramuskuläre Injektion nicht die Verabfolgiing großer Mc;.jren. Deshalb war das

in Auffinden eines Humanimmunglobulins, das für intravenöse InjeKtion geeignet ist, erwünscht.

Die intravenöse Injektion des bekannten Humanimmunglobulins verursacht heftige pyrogene und cardiovaskuläre Reaktionen, welche bei einem gammaglobuii-

n nämischen Patienten besonders auffällig sind. Diese ungünstigen Reaktionen der intravenösen Injektion werden durch Aggregate von Humanimmunglobulin, die in den Fraktionen des HumanimmungloSulins enthalten sind, verursacht. Das aggregierte Humanim-

V) munglobulin verbindet sich mit Komplement und Gewebe in ähnlicher Weise wie beim Antigen-Antikörper-Komplex, so daß sich nachteilige Reaktionen ergeben, die durch den im Körper ausgebildeten anaphylaktischen Faktor verursacht werden. Die

r, nachteiligen Reaktionen können dadurch verhindert werden, daß die von dem rezeptierten Immunglobulin durch Ultrazentrifugierung mit 100 000 xg abgetrennte überstehende Flüssigkeit verwendet wird, jedoch findet unvermeidlich eine langsame Reaggregierung in dem

mi auf diese Weise behandelten Immunglobulin statt.

Im Hinblick auf eine sichere intravenöse Injektion von Immunglobulin wurden zahlreiche Untersuchungen unternommen. In der Schweiz wurde verursacht, das Humanimmunglobulin einer pH 4-Behandlung zur

er, zeitweiligen Denaturierung seines »Fc«-Anteiles zu unterwerfen, so daß dieses für die intravenöse Injektion geeignet wird (S. Barandun und Mitarbeiter; Vox Sang, Band 7, Seite 157 (1962)). Jedoch ist die Behandlung

unvollkommen und die nachteiligen Reaktionen werden gelegentlich noch beobachtet

Pepsinbehandeltes Immunglobulin wird technisch Tür intravenöse Injektion geliefert (H. Koblet, S. Barandun und H. Diggelman; Vox Sang, Band 13, Seite 92 (1967)). Da 60 bis 80% des behandelten Immunglobulins aus dem Fragment F (ab')2 aufgebaut sind, wird in vivo die Injektionsfliissigkeit rasch verschlechtert, was sich durch ihre Halbwertszeit von einigen Stunden anzeigt, die einige Zehntel derjenigen des unbehandelten Immunglobulins ist (B. Jager; Arch. Intern. Med, Band ί 19, Seite 60 (1967)).

Eine weiterhin verbesserte Injektionsflüssigkeit kann erhalten werden, wenn das Pepsin durch Plasmin als Behandlungsmittel ersetzt wird, jedoch hat das Verfahren den Nachteil, daß das Plasmin später nicht entfernt werden kann (L A. Hanson & B. G. Johonson; Int. Arch. Allergy, Band 31, Seite 380 (1967)).

In letzter Zeit wurde vorgeschlagen, selektiv hauptsächlich die Interkettendisulfidbindungen des Humanimmungiobuiins zu spähen und die gebildeten Schwefelatome (S-) zu S-alkylieren und die Immunglobülinderivate mit verringerten unerwünschten Reaktionen für die intravenöse Injektion zu verwenden.

Beispielsweise ist als Versuch zur Spaltung der Interkettendisulfidbindungen des Humanimmunglobulins, um Polypeptidketten zu erhalten, das Verfahren von S. T. Stevenson und Mitarbeiter (Bio. Chem., J., Band 118, Seite 703 (I960)) bekannt, welches in der reduzierenden Spaltung der Interkettendisulfidbindungen von Humanimmunglobulin G in Dithiothreitol und der S-Alkylierung desselben in Jodacetamid besteht. Das Verfahren erfordert jedoch zweistufige Reaktionen und weiterhin besteht das Produkt aus S-alkylierten Polypeptiden, die eine potentielle Gefahr für eine neue Antigenizität darstellen.

Weiterhin ist es in keiner Weise einfach, den S-Teil in Thiolgruppen zu überführen. Deshalb ist es auch schwierig, hiervon ein brauchbares Reagens abzuleiten, indem dieses auf einem Träger, beispielsweise einem geeigneten Polymeren, unter Anwendung des aktiven Thiols getragen wird.

Das Franek-Verfahren (F. Franek, Coll. Czech. Chem. Commun, Band 29, Seite 1401 (1964)) besteht in der Behandlung von Schweineimmunglobulin mit Natr'umsulfit und Kupfer(ll)-ionen zur Bildung von S-sulfonierten Polypeptiden.

Wiederholungsversuche des vorstehenden Verfahrens von Franek und Mitarbeitern zeigten die dem Verfahren anhaftenden Mangel auf, nämlich:

(i) die erhaltenen denaturierten Polypetide enthalten Kupfer oder Kupfer(ll)-ionen, wobei die Entfernung des Kupfers oder der Kupfer(II)-ionen aus dem Produkt äußerst schwierig oder praktisch unmöglich ist;

(ii) die denaturierten Polypeptide zeigen eine rasche Abnahme der Antigenbindungsaktivität, wenn sie die gewünschte niedrige Antikomplementaktivität haben, und

(iii) die ursprüngliche Gestalt des Immunglobulins wird verzerrt und geändert, wie durch optische Drehungsmessungen bestätigt und wie in den später angegebenen Vergleichen und Kontrollen gezeigt wird.

Die Tatsache, daß es praktisch unmöglich ist, den kleiiien RCsI ;'n KuDfer aus dem denaturierten Polypeptidprodukt nach dem Verfahren von Franek und Mitarbeitern zu entferren, belegt, daß dieses Produkt thermisch instabil ist, zur Bildung von Aggregaten neigt und offensichtlich physiologisch unerwünscht ist, wenn

-, es für intravenöse Injektion verwendet werden soll (D. A. Derber; Arthritis and Rheumatism, Band 17, Seite 85,(1974)).

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung eines neuen Humanim-

Hi munglobulin-Derivats, das weder Kupfer noch Kupfer(II)-ionen enthält, worin entweder die Interkettendisulfidbindungen, welche zwei Polypeptidschwerketten (Η-Ketten) und zwei Polypeptidleichtketten (L-Ketten) im Humanimmunglobulin verbinden, selektiv gespalten

ii sind oder außer den angegebenen Interkettendisulfidbindungen ein geringer Teil der Intrakettendisulfidbindungen gespalten ist und die gespaltenen Schwefelatome (-S) S-sulfoniert ( — S — SO3-) sind, und das eine niedrige Antikomplementaktivität hat und eine ausge-

jii zeichnete hohe Antikörperaktivilät '.-ihrend längerer Zeiträume im menschlichen Körper beibehalten kann, nur wenige nachteilige Reaktionen zeigt und das das native Humanimmunglobulin in vivo rekonstruieren kann.

j-, Insbesondere bezweckt die Erfindung die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung eines neuen Humanimmunglobulin G-Derivats, welches djrch selektive Spaltung von praktisch lediglich der Interkettendisulfidbindungen, die die schweren Ketten (H-Ketten) und die

»ι leichten Ketten (L-Ketten) des Humanimmunglobulins verbinden, und durch S-Sulfonierung der gebildeten Schwefelatome gebildet wird und eine gleichförmige Qualität besitzt.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt gemäß der

π Erfindung durch die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von Humanimmunglobulin-Derivaten mit niedriger Antikomplementaktivität durch Spalten von den Interkettendisulfidbindungen von nativem Hu₁ nanimmunglobulin unter Ausbildung von S-sulfonierten

in Polypeptiden und Dialysieren des Reaktionsgemisches, das cddurch gekennzeichnet ist, daß natives Hunianimmunglobulin mit

(A) Tetrathionsäure, deren Alkali- und anderen wasser-, - löslichen Salzen und

(B) mit schwefeliger Säure, deren Alkali- und anderen wasserlöslichen Salzen

in Wasser bei einer Temperatur von nicht höher als

-,Ii 50⁰C bei einem pH-Wert im Bereich von 3,5 bis 10 und in Abwesenheit von oxidierenden Metallionen, wie Kupfer(II)-ionen unter Spaltung von durchschnittlich 3 bis 5 Interkettendisulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulins und S-Sulfonierung (S-SOv) der

-,-, dabei gebildeten Schwefelatome umgesetzt wird.

Insbesondere werden gemäß der Erfindung neue Humanimmunglobulin-Derivate hergestellt, worin durchschnittlich 3 bis 4,5 der Interkettendisulfidbindungen des nativen Hu:,ianimmunglobulins selektiv gespal-

_hii ten sind und worin die dabei gespaltenen Schwefelato me S-sulfoniert sind, und worin weiterhin keine oxidierenden Metallionen, wie Kuper(l!)-ionen enthalten sind.
Unabhängig von den Stellen oder Plätzen der

_h-, gespaltenen Disulfidbindungen sind die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung hergestellten neuen Humanimmunglobulin-Derivate dadurch gekennzeichnet, daß

(1) sie durch Spaltung von durchschnittlich 3 bis 5 Interkettendisulfidbindungen und ggf. von lntrakettendisulfidbindungen in geringem Ausmaß als natives Humanimmunglobulin und S Sulfonierung ( —S-SOi ) der hierbei gespaltenen Schwefelatome gebildet wurden, und daß

(2) die Humanimmunglobulin-Derivate mindestens 1.0 I.E./ml des Antidiphtherie-Titers bei einer Konzentration von 10,0 Gew.-% aufweisen.

Das gemäß der Erfindung hergestellte Humanimmunglobulin-Dcrivat liefert eine wasserlösliche Zusammensetzung, die zur Bildung von Injektionsfliissigkciten brauchbar ist. wenn sie mit Löslichmachungsmitteln. die für Menschen ungefährlich sind, vermischt wird. Auch durch Auflösung der wasserlöslichen Zusammensetzung in Wasser können wäßrige Zus^mmensetzungen für intravenöse Injektion erhalten werden.

Vorzugsweise sind in dem gemäß der Erfindung hergestellten Humanimmunglobulin-Derivat im wesentlichen durchschnittlich 4,5 Interkettendisulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulins gespalten und die auf diese Weise gebildeten Schwefelatome (praktisch 9 Atome durchschnittlich) sind S-sulfoniert (S-SO i). Anhand von Untersuchungen wurde festgestellt, daß diese bevorzugten Humanimmunglobulin-Derivate gebildet werden, wenn im wesentlichen allein die Η-Ketten und L-Ketten des nativen Humanimmunglobulins verbindenden Interkettendisuiiidbindungen gespalten werden und die dabei gebildeten Schwefelatome S-sulfoniert werden.

Nach dem Verfahren gemäß der Erfindung ist es möglich, in erster Linie die Interkettendisulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulin vorwiegend zu spalten.

Deshalb können die Humanimmunglobulin-Derivate gemäß der Erfindung, worin durchschnittlich 3 bis 5 Disulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulins gespalten und die gebildeten Schwefelatome S-sulfoniert sind, als Produkte betrachtet werden, worin praktisch die Interkettendisulfidbindungen allein des nativen Humanimmunglobulins gespalten sind und die ei iiaiieiii-M Suiiwciciaiuiiic 3-Muiiuiiici ι Mini.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird im wesentlichen in Wasser ausgeführt, jedoch ist das Medium in keiner Weise auf Wasser begrenzt, sondern es können auch andere wäßrige Medien verwendet werden, sofern sie für die Reaktion gemäß der Erfindung zur Bildung des Humanimmunglobulins nicht schädlich sind.

Gemäß diesem Verfahren wird natives Humanimmunglobulin in Wasser mit

(A) einer Verbindung, die zur Bildung des Tetrathionations fähig ist, und

(B) einer Verbindung, die zur Bildung eines Sulfitions fähig ist,

zur Spaltung von durchschnittlich 3 bis 5 Interkettendisulfidbindungen oder zusätzlich zu d^n praktisch gesamten Interkettendisulfidbindungen von einer kleineren Menge der Intrakettendisulfidbindungen umgesetzt, wobei die Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen maximal durchschnittlich 5 nicht übersteigt, und wobei praktisch sämtliche der dabei gebildeten Schwefelatome S-sulfoniert sind.

Als Verbindung (A), welche zur Bildung des Tetrathionations in Wasser fähig ist, werden Tetrathionsäure, Alkalisalze hiervon, wie Natriumtetrathio nat. Kaliumtetrathionat und dgl., und wasserlösliche Salze hiervon, wie Ammoniumtetrathionat, bevorzugt obwohl auch andere Verbindungen verwendet werder können, sofern sie das Tetrathionation in Wasser bilder können.

Typische Beispiele für Verbindungen (B), welche da: Sulfition in Wasser liefern können, umfassen schwefligf Säure. Natriumsulfit, Kaliumsulfit und Natriumbisulfit wobei jedoch auch andere Verbindungen verwende werden können, sofern sie Sulfitionen in Wasser bilder können.

Die Verbindung (A), welche zur Bildung de Tetrathionations in Wasser fähig ist, wirkt al· Oxidationsmittel. Hingegen dient die Verbindung (B) die das Sulfition in Wasser bildet, als Reduktionsmittel sowie als S-Suifonierungsmittel.

Die Mengen von Sulfitionen und Tetrathionationer sollen jeweils nicht weniger als die 2fache molare Menge der zu spaltenden Disulfidbindungen (-S-S Bindungen) des als Ausgangsmaterial dienenden nativer Humanimmunglobulins sein. Sie können bis hinauf zi jeweils der 1 OOfachen molaren Menge der zu spaltender Bindungen oder sogar noch darüber liegen.

Es wird bevorzugt, daß die Verbindungen (A) und (B) insbesondere (B). in Wasser oder einer Pufferlösung voi ihrem Zusatz zu dem Reaktionsgemisch dieses Verfah rens gelöst werden.

Die Oei dem Verfahren gemäß der Erfindung stattfindende Reaktion kann so beschrieben werden daß die Interkeltendisulfidbindungen des nativei Humanimmunglobulins durch das Sulfition gespalter werden, eines der Schwefelatome in eine S-Sulfonat gruppe (-S-SO)) und das andere zur Thiolgruppc (-SH) gespalten werden und jeweils zwei der dabe gebildeten Thiolgruppen durch das Tetrathionation zui Bildung einer Disulfidbindung oxidiert werden oder da[ die Thiolgruppe mit dem Tetrathionation zur Überfüh rung in S Thiosulfat (-S-SjO)) reagiert und erneu¹ durch das Sulfition angegriffen wird. Dadurch wieder holt sich die Reaktion. Infolge dieser Reaktion werder die Interkettendisulfidbindungen des nativen Humanim mungiobuiins gespaiicn und die dadurch getrennter Schwefelatome werden in die S-Sulfonatgrupper ( — S — SOj) in den schweren Ketten und den leichter Ketten umgewandelt.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird be Temperaturen von nicht höher als 50°C, vorzugsweise 10 bis 50° C, u. a. 15 bis 48° C ausgeführt.

Normalerweise besteht bei hohen, 50°C übersteigen den Temperaturen, insbesondere oberhalb 55°Γ eine Neigung, daß das native Humanimmunglobulin denatu riert wird und eine Spaltung der Intrakettendisulfidbin düngen eintritt Deshalb sollten derartig hohe Tempera türen vermieden werden.

Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung soll die Anwesenheit von solchen proteinstörenden Mitteln, wie Harnstoff oder Guanidin, welche bei der S-Sulfitolyse von Insulin oder Ribonuclease (J. L Bailey und Mitarbeiter, L. BioL CherrL, Band 234, Seite 1733 (1959) ] verwendet werden, besser vermieden werden. Falls verwendet, sollte jedoch das quantitative Verhältnis dieser störenden Mittel nicht mehr als 2,0 Mol je Mol des nativen Humanimmunglobulins betragen.

Die Reaktionszeit variiert in Abhängigkeit vor solchen Faktoren, wie Menge der Reaktionsteilnehmer Reaktionstemperatur und Anwesenheit eines Denaturierungsmittels, wie Harnstoff und dgL Der pH-Wen

der Reaktionsflüssigkeit liegt im Bereich von 3,5 bis 10, vorzugsweise 6 bis 9. Bei einem pH-Wert niedriger als 3,5 zeigt sich eine Neigung zur Spaltung der Intrakettendisulfidbindung im Fc-Teil des nativen Humanimmungiobuiins. Hingegen wird bei eimern pH-Wert oberhalb 10 das globulinbildende Protein denaturiert, was zu solchen nachteiligen Ergebnissen, wie !'ämmung der Antikomplementaktivitätsverringerung und Verringerung der Antigenbindungsaktivität, führt.

Es besteht keine kritische Reihenfolge iLr den Zusatz der Reaktionsteilnehmer zu dem Reaktionssystem.

Nach der Reaktion wird das Reaktionsgemisch einer anschließenden Dialyse gegen Wasser oder eine geeignete Pufferlösung, wie Salzlösung mit einem Gehalt von O.OIm-Phosphatpuffer (pH 7,4) und 2,5% Glycin unterzogen, worauf die neuen Humanimmunglobulin-Derivate gemäß der Erfindung erhalten werden

Die neuen Humanimmunglobulin-Derivate können weiterhin in die L-Ketten und Η-Ketten durch Säulenchromatographie unter Anwendung einer mit geeigneten Harzen, beispielsweise Sephadex G-75® gefüllten Säule und einem Lösungsmittel, wie Im-Propionsäure, getrennt werden.

Die Anzahl der S-Sulfonatgruppen ( — S — SO ι) in den gemäß der Erfindung hergestellten neuen Hunianimmunglobulin-Derivaten kann beispielsweise bestimmt werden, indem das Herstellungsverfahren unter Anwendung von radioaktivem Natriumsulfit ausgeführt wird und die mit ³VS markierten S-Sulfonate in dem erhaltenen Humanimmunglobulin-Derivat mit einem Flüssigkeitsscintillationszähler gezählt werden, wie in den späteren Beispielen ausgeführt ist.

Die eine Hälfte der auf diese Weise bestimmten durchschnittlichen Anzahl der markierten S-Sulfonatgruppen je Molekül des Humanimmunglobulin-Derivats entspricht der durchschnittlichen Anzahl der gespaltenen intermolekularen Disulfidbindungen in dem als Ausgangsmaterial verwendeten nativen Humanimmunglobulin.

Andererseits können die Htimanimmunelonulin-Derivate, die durchschnittlich etwa 9 S-Sulfonatgruppen je Molekül enthalten, d. h. die durch Spaltung von durchschnittlich 4,5 Disuifidbindungen des nativen Humanimmungiobuiins und S-Sulfonierung der gebildeten Schwefelatome gemäß der Erfindung gebildet wurden, in Η-Ketten und L-Ketten fraktioniert werden, wobei beispielsweise Sephadex G-75® oder G-200® für die Säulenchromatographie, vorzugsweise in Gegenwart einer geringen Menge von Harnstoff oder Guanidin, beispielsweise mit Propionsäure als Lösungsmittel, wie vorstehend abgehandelt, verwendet werden.

Es kann somit jeder Satz von Bedingungen für die Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung angewandt werden, sofern sie die Herstellung von Humanimmunglobulin-Derivaten erlauben, welche durchschnittlich praktisch 9 S-Sulfonatgruppen je Molekül enthalten, die weiterhin in Η-Ketten und L-Ketten nach der angegebenen Säulenchromatographie fraktioniert werden können. Wenn ein derartiger Satz von Bedingungen empirisch einmal bestimmt wurde, kann die Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen in dem nativen Humanimmunglobulin in geeigneter Weise durch Einstellung der Reaktionszeit unter dem gewählten Satz von Bedingungen geregelt werden.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Arbeitsbeispielen weiter erläutert

Die in den Beispielen eingesetzten Reagenzien waren die folgenden:

Humanimmunglobulin I: 15%ige Lösung von Humanimmunglobulin G für intramuskuläre Injektion in gepufferter Salzlösung (pH neutral) mit einem Gehalt von 2,5% Glycin

y-Globulin-Human Fr, Il (Humanimmunglobulin G-Il)

Natriumtetrathionat: Unmittelbar vor dem Gebrauch aus Natriumthiosulfat (Na₂SaO) · 5H₂O) und Jod (J₂) in wäßrigem Äthanol hergestellt

Natriumsulfit spezieller chemischer Reinheit
Na₂SO) markiert mit "S*

Tris-HCI: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Chemikalie spezieller Qualität für biochemische

n_: «_ ι Ι/-Ί

Migci iii-iivi WlItCl 3UCIIUlIgClI Ulli CIMCIlI Ulli

verringerten pH-Wert.

Die Antikörperaktivitäts- und die Antikomplementaktivitätswerte wurden in folgender Weise bestimmt:

Bestimmung des Antidiphtherie-Titers

Reaktion:

Sensibilisierte positive Haem-Agglutinationsreaktion (Fußnote 1) wurde angewandt

Bestimmungsverfahren:
Mikroplattenverfahren

Blutzellen:

Menschliche rote Blutzellen vom O-Typ (Fußnote 2), welche mit Formalin und mit BDB (Bis-diazobenzidin) behandelt waren (Fußnote 3) und mit diphtheritischem Toxoid sensibilisiert waren.

Kontrolle:

Standard-Antikörper für Diphtherie (NIH Japan)

NIH-Japanverfahren: F. Murata, Nr. 21, Tokyo Veterinaian & Animal Husbandry (1975)

Fußnote 2)

W. T. Butler: J. Immunol, Band 90, Seite 663,1963)

Fußnote 3)

J. Dordon, B. Rose, A. H. Sehon: J. Exp. Med., Band 108, Seite 37,1958.

Bestimmung des Antikörpers für Masern, Röteln
und Mumps (Fußnoten 4 bis 9)

Reaktion:

Mikroplattenverfahren mit Ausnahme von Masern, wofür das Reagenzglasverfahren angewandt wurde.

Antigen:

Antigene für die Haem-Agglutination

Kontrollserum: Standard-Antiserum

mit Ausnahme für Masern, für die Standard-Antiserum (NIH Japan) verwendet wurde.

Fußnote 4)

Duide por Hemagglutinations Inhibition-Test für Masern nach dem Mikrotiterverfahren: NIH Japan

Fußnote 5)

Sequenze zur Bestimmung des Humanimmunglobulins ist die Antikörperaktivität gegenüber Masern (NIH Japan)

Fußnote 6)

T. Toyama, Clinical Examinations, Band 16 Nr. 29 (1972)

Fußnote 7)

An Introduction to Virus Empirical Science herausgeg. von NIH Japan Alumni, Maruzen Bookstore (1973)

Fußnote 8)

Empfohlene Vorschriften für Mikrobiologische Reagenzien, US-Dept. of HEW, April 1965

Fußnote 9)

Mumps-HI-Reaktionsverfahren:(NIH Japan).

Bestimmung der Antikomplementaktivität

Das von Rabat & Mayer »Experimental Immunochemistry« Seite 225 (1961) beschriebene Verfahren wurde angewandt. Eine l%ige Immunglobulinlösung mit einem Gehalt von Meerschweinchenseruni, 20 CHso/ml, wurde auf 5 ml mit GVB⁺ + gebracht, auf 37°C während 1 Stunde erwärmt und das verbrauchte Antikomplement wurde nach diesem Verfahren bestimmt. Die Antikomplementaktivitätswerte sind durch die Prozentsätze des Verbrauchs, bezogen auf 20 CH₅₀/ml, angegeben.

Beispiel 1

(A) Beziehung der Reaktionsbedingungen zur Anzahl
der Spaltungen der Disulfidbindungen

Bedingung I

Zu 51 mg des vorstehend angegebenen Humanimmunglobulins G-II wurden 36 mg mit ^J5S-markiertes Na2SOj* und 22 mg Na2S4O6, sowie wäßrige 0,1m-Tris-HCL (pH 8,2) zur Rildung einer Probe von 5,0 ml zugesetzt, welche auf 45"C erhitzt wurde, wobei die anschließende Reaktion bei dieser Temperatur ausgeführt wurde. Jeweils 0,5 ml des Reaktionsgemisches wurden unmittelbar nach Beginn und nach 30 Minuten, 1

Tabelle I

Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 7,4 Stunden und 24 Stunden der Reaktion als Probe genommen. Jede Probe wurde mit 10 rr.l einer 50%igen gesättigten Ammoniumsulfatlösung unter Eiskühlung vermischt, während 15 Minuten unter Eiskühlung stehengelassen und der erhaltene Niederschlag zentrifugal abgetrennt. Nach der Wäsche, wiederum mit 50%iger gesättigter Ammoniumsulfatlösung, wurde der Niederschlag hinsichtlich Radioaktivität mit einem Flüssigkeitsscintillationszählgerät gemessen und aus dem Ergebnis die Anzahl der darin enthaltenen -S-SOi-Gruppen berechnet.

Bedingung Il

Die Umsetzung wurde unter identischen Bedingungen wie der vorstehenden Bedingung I ausgeführt, jedoch wurde während der Reaktion keine Probe genommen. 4 Stunden, nachdem die Reaktion begonnen hatte, wurde eine wäßrige 10-m-Harnstofflösung zu dem Reaktionssystem zugesetzt, so daß die Harnstoffkonzentration darin 4m betrug. Nach einer Umsetzung während 5 und 6 Stunden (bzw. 1 oder 2 Stunden Reaktion nach der Harnstoffzugabe) wurden jeweils 0,5 ml der Reaktionsflüssigkeit als Probe genommen und in gleicher Weise wie die unter Bedingung I genommenen Proben behandelt.

Bedingung III

Reaktion und Probebehandlung unter der Bedingung I wurden wiederholt, wobei jedoch die Reaktionstemperatur 0⁰C betrug.

Bedingung IV

j-, Reaktion und Probebehandlung gemäß Bedingung I wurden wiederholt, wobei jedoch die Reaktionstemperatur 25° C betrug.

Bedingung V

Reaktion und Probebehandlung gemäß Bedingung I wurden wiederholt, wobei jedoch kein Na254Ü6 · ί Η2Ο verwendet wurde.

Die Ergebnisse der Umsetzungen unter den vorstehenden Bedingungen I, II, III, IV und V sind in der

4-, nachfolgenden Tabelle I zusammengefaßt.

Beziehung der Reaktionsbedingungen zur Anzahl der gebildeten -S-SOj-Gruppen

Reaktionsbedingung	Reaktionszeit	0,5	(Stunder.)	2	4	5	6	7,4	24
	0	6,1	1	8,9	9,4	-	-	8,9	10,4
I (45 C)	0	-	9,0	-	-	10,9	13,9	-	-
II (45 C, HarnstofTzusatz nach	-		-
4 Std.)		0,5		2,5	2,9	-	-	3,4	5,0
III ( C)	0	1,6	1,6	5,0	4,5	-	-	7,0	8,5
IV (25 C)	0,2	0,5	4,1	1,1	0,8	-	-	-	4,5
V (frei von Na₂S₄O,, · 2 H₂O)	0	0,8

Die Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen entspricht der Hälfte der Anzahl der -S-SO₃-GrUppen.

Aus den in Tabelle I angegebenen Ergebnissen der Reaktion läßt sich folgendes schließen. Wenn das Verfahren gemäß der Erfindung in Gegenwart von Tetrathionat und Natriumsulfit bei 45° C unter der Bedingung I durchgeführt wird, werden etwa 3 Disulfidbindungen im Verlauf einer halben Stunde gespalten, wobei der Durchschnitt etwa 4,5 im Verlauf von 1 bis 7 Stunden Reaktion und etwa 5,2 nach 24 Stunden Reaktion erreichte. Wenn die Reaktion in-

identischer Weise, abgesehen von der Temperatur, bei 25⁰C (Bedingung IV) durchgeführt wurde, wurde die Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen verringert, wobei die Anzahl der gespaltenen Bindungen einen durchschnittlichen Wert von etwa 4,3 nach einer so langen Reaktionszeit wie 24 Stunden erreichte. Wenn die Reaktionstemperatur 0⁰C betrug (Bedingung III), nahm die durchschnittliche Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen noch weiter ab. Jedoch in Abwesenheit von Natriumtetrathionat (Bedingung V) konnte die Spaltung der Disulfidbindungen nicht glatt fortschreiten. Wenn hingegen Harnstoff zu dem Reaktionssystem zugegeben wurde (Bedingung II), nahm die durchschnittliche \nzahl der gespalteten Disulfidbindungen nach der Harnstoffzugabe rasch zu.

(B) Vergleich der Verschlechterung der physikalischen EiTrischaitcn '.Vctim Na SiO cdcrCii* *■ al;
Oxidationsmittel verwendet wurden

Bedingung I

Zu 2,0 g des vorstehend angegebenen Humanimmunglobulins G-II wurden 1,42 g Na₂SOj und 0,86 g Na₂S₄O₆ · 2 H₂O, O,lm-Tris-HCl (pH 8,2) zugsetzt, um ein Gemisch von 200 ml zu erhalten, welches dann bei einer Anfangstemperatur von 45⁰C umgesetzt wurde. Unmittelbar nach Beginn der Reaktion und bei 30 Minuten, 1 Stunde, 2 Stundet, und 4 Stunden danach wurden jeweils 15 ml der Reaktionsflüssigkeit als Probe genommen. Unmittelbar anschließend an die fünfte Probenahme wurde eine lOm-Harnstofflösung zu dem Rest der Reaktionsflüssigkeit zugegeben, um die Harnstoffkonzentration darin auf 4m zu bringen, und die Reaktion wurde fortgesetzt. Nach 5 und 6 Stunden der Reaktion (bzw. 1 und 2 Stunden nach der Harnstoffzugabe) wurden jeweils 22,5 ml der Reaktionsflüssigkeit als Probe genommen und hierzu 22,5 ml einer eisgekühlten gesättigten Ammoniumsulfatlösung zugegeben, worauf 30 Minuten unter Kühlung mit Eis stehengelassen wurde. Der erhaltene Niederschlag wuruc zentrifugal a'ugcucum, rini jOvuigci gcsäiiigici Ammoniumsulfatlösung gewaschen und während 24 Stunden gegen gepufferte Salzlösung von pH 7,4 durch ein Visking-Rohr dialysiert. Nach der Dialyse wurden Proben in der jeweilig erforderlichen Menge für bestimmte Analysen genommen, welche mit gepufferter Salzlösung von pH 7,4, die 2,5% Glycin enthielt, verdünnt und analysiert wurden.

Bedingung II

Die Reaktion und die Behandlung gemäß Bedingung I wurden wiederholt, wobei jedoch Na₂S₄O₆ · 2 H₂O durch 50 mg CuSO₄ · 5 HO ersetzt wurde, und die Reaktion wurde am Ende der 4. Stunde beendet

Die dabei erhaltenen Lösungen der verschiedenen Humanimmunglobuiin G-Derivate wurden den folgenden Testen und Bestimmungen unterzogen.

(a) Beziehung von Reaktionszeit und Anzahl
der — S — SO3-Gruppen

Die Anzahl der - S - SO₃-Gruppen in den mit Tetrathionat (Na₂S₄O₆ · 2 H₂O) oxidierten Proben sind in der F i g. 1 durch »o« zusammen mit den entsprechenden Werten, die unter den Bedingungen I und II von Beispiel 1 erhalten wurden, aufgetragen. Die Werte der anderen mit Cu⁺ + oxidierten Proben, die in identischer Weise mit der Bedingung I der Arbeitsweise (A) umgesetzt und behandelt wurden, wobei jedoch Na₂S₄O₆ · 2 H₂O durch 50 mg CuSO₄ · 5 H₂O ersetzt -) wurde, sind in F i g. 1 mit schwarzen Punkten »·« aufgetragen.

(b) Beziehung der Reaktionszeit zur
Antikomplementaktivität

Die Antikomplementaktivitäten der durch Oxidation mit Na₂SiOo ■ 2 H₂O unter der Bedingung I der

ι -, Arbeitsweise (B) erhaltenen Proben, bestimmt nach dem bereits angegebenen Verfahren, sind in F i g. 2 aufgetragen. Auch die Antikomplementaktivitäten der mit Cu * ^l unter der Bedingung Il oxidierten Proben sind aus H i g. 2 ersichtlich. Es ergibt sich aus F i g. 2, daß die

2i) Antikomplementaktivitäten sämtlicher Proben auf nicht höher als 30% nach einer Reaktion von 30 Minuten verringert waren.

_>-, (c) Beziehung der Reaktionszeit zum

Antidiphtherie-Titer

Die gleichen vorstehend unter (b) angewandten Proben wurden 3mal hinsichtlich des Antidiphtherie-Ti-

JO ters nach dem bereits angegebenen Verfahren untersucht. Die Abweichung und die Mittelwerte ergeben sich aus Fig.3. Aus der graphischen Darstellung ist ersichtlich, daß die mit Cu⁺+ oxidierten Proben einen bereits nicht höher als 0,3 IE liegenden Titer nach einer

j-, Reaktion von 30 Minuten zeigen.

(d) Beziehung der Reaktionszeit zur optischen
Drehung

iriiCpCCn luv

nach (b) vorstehend verwendeten Proben (Pr Aeinkonzentration 2,5%) wurden hinsichtlich der optischen

4-, Drehung untersucht, wobei die Ergebnisse in Fig.4 gezeigt sind. Aus den gezeigten Werten ergibt es sich, daß die Anwesenheit von Kupfer(II)-ionen im Reaktionssystem eine fortschreitende Denaturierung während der Reaktion verursacht, und daß die Anwesenheit

-,o von Harnstoff die Denaturierung begünstigt, wie sich durch die erhebliche Zunahme der optischen Drehung zeigt.

Die optische Drehung wurde dabei bei 25° C unter Anwendung einer l-cm-Zelle bestimmt

(e) Beziehung der Reaktionszeit zur Trübung
nach der Wärmebehandlung

_b0 Die gleichen für die Antikomplementektivitätsbestimmung gemäß (b) angewandten Proben wurden bei einer Konzentration von 2,5% in Luft während A Stunden bei 50⁰C wärmebehandelt wobei die in F i g. 5 aufgeführten Ergebnisse (optische Dichte OD) erhalten wurden. Wie sich aus F i g. 5 ergibt verursacht die Anwesenheit von bereits einer sehr geringen Menge an Kupfer(II)-ionen eine Verschlechterung der Wärmestabilität und begünstigt die Neigung zur Aggregation.

(0 Beziehung der Reaktionszeit zum Kupfergehalt

Die gleichen für die Antikomplementaktivitätsbestimmung gemäß (b) angewandten Proben wurden auf ihren Kupfer(HVionengehalt durch Atomabsorptionsanalyse untersucht, wobei die Ergebnisse in Fig.6 aufgeführt sind. Aus den Werten zeigt es sich, daß, falls Kupfer(II)-ionen angewandt werden, selbst durch Wäsche und Dialyse der Probe der Kupfer(II)-ionengehalt nicht entfernt werden kann.

(g) Trennung der schweren Ketten von den
leichten Ketten

Die gleiche Probe, wie sie nach 2 Stunden Reaktion unter Bedingung I der Arbeitsweise (B) erhalten wurde, wurde während 24 Stunden mit ln-Propionsäure mit einem Gehalt von 6m-Harnstoff dialysiert und einer Säulenchromatographie mit Sephadex G 200® (1,5 cm Durchmesser χ 80 cm), das mit der angegebenen wäßrigen Lösung ins Gleichgewicht gesetzt worden war, unterzogen, wobei die in Fig.7 aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden. Die erste Spitze von links der Zeichnung bezeichnet nicht getrennte HjL₂-Ketten, die zweite Spitze bezeichnet Η-Ketten und die dritte Spitze bezeichnet L-Ketten. Die Ergebnisse belegen, daß die Probe in Η-Ketten und L-Ketten getrennt war.

Bei einer Zusammenfassung der in den F i g. 1 bis 7 aufgeführten Ergebnisse werden die nachstehenden Folgerungen erhalten:

(1) Wie sich aus den Ergebnissen der Versuche unter Bedingung I in Beispiel 1 (A) ergibt, beträgt, wenn das Verfahren gemäß der Erfindung in Gegenwart von Tetrathionat- und Sulfitionen durchgeführt wird, bei jeder Reaktionsdauer im Bereich von 1 bis 4 Stunden die durchschnittliche Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen etwa 4,5 und die dabei gebildeten Schwefelatome sind S-sulfoniert (durchschnittliche Anzahl der S-Sulfonatgruppen etwa 9), so daß das S-sulfonierte Immunglobulin G erhalten wird (Fig. 1), welches in Η-Ketten und L-Ketten beispielsweise mittels Säulenchromatographie mit Sephadex G 200® (Fig.7) trennbar ist und eine praktisch identische optische Drehung zu derjenigen des nativen Humanimmunglobulins G hat (Fig.4). Aufgrund der vorstehenden Ergebnisse kann für das neue Humanimmunglobulin G-Derivat mit Sicherheit angenommen werden, daß es praktisch durch Spaltung lediglich der Interkettendisulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulin G und S-Sulfonierung der gespaltenen Schwefelatome erhalten wurde, und zwar im Hinblick auf die Tatsache, daß die Anzahl der Interkettendisulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulin G durchschnittlich 4,5 beträgt.

Dieses Humanimmunglobulin G-Derivat hat eine auf nicht höher als 10% verringerte Antikomplementaktivität, d. h. eine weit niedrigere als diejenige des nativen Humanimmunglobulins G (Fig.2), zeigt jedoch einen nicht merklich schlechteren Antidiphtherie-Titer gegenüber nativem Humanimmunglobulin G, wie sich durch die nahezu äquivalente Äntigenbindungsaktiv'ität zeigt. Wie aus Fig.3 ersichtlich, behält bei einer Konzentration von 10 Gew.-% das Humanimmunglobulin G-Derivat eine Antigenbindungsaktivität von mindestens Ι,ΟΙΕ/mlbei.

(2) Durch durch Spaltung von weniger oder mehr als durchschnittlich 4,5 der Disulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulin G, beispielsweise durchschnittlich nicht weniger als 3 oder bis hinauf zu 5, und S-Sulfonierung der Schwefelatome erhaltenen S-sulfonierten Immunglobulinderivate zeigen eine etwas niedrigere Verringerung ihrer Antikomplementaktivitäten und eine schlechtere Antigenbindungsaktivität im Vergleich zu den bevorzugten ImmunglobuHnderivaten, die vorstehend unter (1) angegeben sind (F i g. 2 und 3), zeigen jedoch eine noch merklich verbesserte Antikomplementaktivität gegenüber derjenigen von nativem

ίο Humanimmunglobulin G.

(3) Wenn hingegen das Tetrathionation als Oxidationsmittel durch das Kupfer(II)-ion ersetzt wird, enthalten die sich ergebenden Humanimmung'obulin G-Gerivate Kupfer(II)-ionen, wenn auch nur h sehr geringen Konzentrationen, die jedoch mit Zunahme der Reaktionszeit erhöht werden (F i g. 6). Auch die Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulin G nehmen bei einer Verlängerung der Reaktionszeit zu (Fig. 1), und infolgedessen ist es schwierig, die gewünschten Humanimmunglobulin G-Derivate durch Spaltung von durchschnittlich praktisch 4,5 Disulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulin G in stabiler Weise herzustellen.
Darüber hinaus zeigen die unter Anwendung von Kupfer(II)-ionen erhaltenen Humanimmunglobulin G-Derivate eine verringerte Antikomplementaktivität (F i g. 2), jedoch ist auch gleichzeitig ihr Antidiphtherie-Titer beträchtlich gesenkt im Vergleich zu demjenigen des nativen Humanimmunglobulin G. Somit ist auch ihre

in Antigenbindungsaktivität äußerst verringert (Fig. 3). Die Humanimmunglobulin G-Derivate zeigen wiederum, falls die Reaktionszeit 1 Stunde überschreitet, unterschiedliche optische Drehungen gegenüber derjenigen des nativen Humanimmunglobulin G, was belegt,

ji daß Strukturänderungen im Aufbau-Protein aufgetreten sind.

(4) Ähnliche Änderungen der optischen Drehungen sind gleichfalls bei Humanimmunglobulin G-Derivaten feststellbar, welche nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhalten wurden, wobei jedoch Harnstoff im Reaktionsverlauf zugegeben wurde. Aus diesem Grund ist auch die Abwesenheit von Harnstoff, Guanidin und dgl. im Reaktionssystem erwünscht.

(C) Selektive Spaltung der Interkettendisulfidbindungen

2 ml einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von 20 mg Humanimmunglobulin I, 80 mg ³⁵S-Na₂SOj* (8,22 χ 10"dpm/Mol) und 40 mg Na₂S^O₆ · 2 H₂O wurden auf einen pH von 7,2 mit AcOH eingestellt und bei 39⁰C während 2 Stunden umgesetzt. Anschließend wurde die Reaktionsflüssigkeit gegen 51 Wasser während 24 Stunden dialysiert. Dann wirden Harnstoff

« und Propionsäure langsam zu dem System bis zu Endkonzentrationen von 4m bzw. Im zugefügt. Vor der Einbringung in die Chromatographiesäule wurde als Probe 0,1 ml Lösung abgenommen, deren Werte auf der linken Seite der Ordinate in F i g. 8 angegeben sind. Der

bo Rest des Systems wurde der Säulenchromatographie unter Anwendung von Sephadex G 200* (1,5 cm Durchmesser χ 100cm), welche mit ln-Propionsäure mit einem Gehalt von 4m-Harnstoff ins Gleichgewicht gesetzt worden war, unterworfen.

hi Die Radioaktivität der Proben wurde durch OD₂₈O jeder Fraktion und mit dem Flüssigkeitsscintillationszählgerät gemessen; die Ergebnisse sind in Fig. 8 enthalten.

Beispiel 2

Fraktionierung der schweren Ketten
und leichten Ketten

Zu einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von 100 mg Human-y-Globulin G-II wurden 0,4 g Na₂SOi und 0,2 g Na₂S₄Ob · 2 H₂O zugesetzt und der pH-Wert des Systems wurde auf 9,0 mit In-HCI eingestellt, worauf während 48 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt wurde. Nach der Umsetzung wurde eine kleine Menge des im System gebildeten unlöslichen Materials zentrifugal entfernt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde dann unter Anwendung eines Visking-Rohres gegen 2,51 Wasser bei 5°C während 15 Stunden dialysiert und weiterhin gegen 2,51 einer wäßrigen Lösung von In-Propionsäure bei 5⁰C während 28 Stunden dialysiert.

Das Dialysat wurde der Säulenchromatographie unter Anwendung von Sephadex G-75^e (3,5 cm Durchmesser χ iilcm), die mit in-Propionsäure ins Gleichgewicht gesetzt war, unterzogen und dabei wurden die Polypeptidketten fraktioniert. Wie aus der in Fig. 9 gezeigten graphischen Darstellung ersichtlich, waren drei Spitzen feststellbar, welche 'n der Reihenfolge des größeren Molekulargewichts als unfraktioniertes S-sulfoniertes ImmunglobulinG.S-sulfonierte H-Ketten und S-sulfonierte L-Ketten identifiziert wurden. Die Identifizierung wurde durch immunologische Maßnahmen, beispielsweise dem Ouchterlony-Verfahren und der Immuno-Elektrophorese, sowie durch chemische Analyse, wie Aminosäureanalyse, Hexosegehaltbestimmung und dgl. durchgeführt.

Aus den in den Fig.8 und 9 aufgeführten Werten lassen sich die nachstehenden Folgerungen ableiten:

(1) Da die erste Spitze als unfraktioniertes S-sulfoniertes Immuiiglobulin G, die zweite Spitze als S-sulfonierte Η-Ketten und die dritte Spitze als S-sulfonierte L-Ketten aufgrund immunologischer und chemischer Methoden entsprechend Fig.9 von links nach rechts identifiziert wurden, ist es logisch zu folgern, daß in gleicher Weise die drei Spitzen in der F i g. 8 von links nach rechts zu dem unfraktionierten S-sulfonierten Immunglobulin G, S-sulfonierten Η-Ketten und S-sulfonierten L-Ketten zuzuordnen sind. Die Unterschiede zwischen den Chromatographiemustern werden durch die Anwesenheit von Harnstoff im ersteren Reaktionssystem verursacht.

(2) Gemäß F i g. 8 wurde aus der Menge des Proteins in den die dritte Spitze bildenden L-Ketten die molare Konzentration berechnet und aus der molaren Konzentration und dem Radioaktivitätswert wurde festgestellt, daß die die dritte Spitze bildenden L-Ketten 1,0 —S-SOj*-Gruppen enthielten. In der gleichen Weise wurden die Anzahl der -S-SOj'-Gruppen in den Η-Ketten der zweiten Spitze zu 3,4, diejenigen im unfraktionierten S-sulfonierten Immunglobulin G zu 8,8 und diejenigen in dem Gemisch vor der Einbringung in die Chromatographiesäule zu 8,6 berechnet. Wie bereits erläutert, ist eine Disulfidbindung zur Verbindung der L-Kette und der Η-Kette vorhanden, während durchschnittlich 2,5 Disulfidbindungen zwischen zwei H-Ketten vorhanden sind. Infolgedessen enthält das native Humanimmunglobulin G durchschnittlich 4,5 Interkettendisulfidbindungen.

(3) Nach dem Chromatographiemuster der F i g. 8 ist der größte Teil des S-sulfonierten Immunglobulin G, welches durchschnittlich 8,6 S-SOi'-Gruppen enthält,

in Η-Ketten und L-Ketten auftrennbar. Daraus ist ersichtlich, daß die Interkettendisulfidbindungen selektiv gespalten sind, während die Intrakettendisulfidbindungen praktisch unversehrt geblieben sind.

Beispiel 3
Ausführungsformen der Reaktionsbedingungen

133 ml Human-y-globulin I wurden in 1667 ml eines O.Oom-Phosphatpuffers (pH 8,2) mit einem Gt halt von 2,5% Glycin gelöst Zu der Lösung wurden 7,0 g Ma₂SOj, gelöst in 100 ml des gleichen Puffers, und 4,4 g Na₂S₄O₆ · 2 H₂O, gelöst in 100 ml des gleichen Puffers, zugesetzt und bei 45° C während 3 Stunden umgesetzt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde während 6 Stunden gegen 20 Liter Puffersalzlösung, gebildet aut .'Jatriumsalz, unter Anwendung eines Dow Chemical Bechers, Ultrafilter b/HFU-1, dialysiert. Die Außenflüssigkeit der Dialyse wurde alle 2 Stunden ausgetauscht. Das Dialysat wurde auf ein Volumen von 180 ml durch das gleiche Filter konzentriert und hierzu wurden 50 g Glycin zugesetzt.

Die Lösung wurde steril durch eine 0,25-μΓη-Μεπν bran filtriert, in 10-ml-Ampullen zu jeweils 5,0 ml gegossen und lyophilisiert. Die Antikomplementaktivität CH50 der sterilen Lösung bei 50%iger Konzentration betrug 4,3%.

Anwendungsbeispiel 1

Vergleich der Antikörperaktivitäten gegenüber Antigenen in Versuchen unter Anwendung von Na₂S₄O₆ oder r, Cu + + als Oxidationsmittel

Bedingung I

Zu 67 ml Human-y-globulin I wurden 7,1 g Na₂SOj 4t) und 0,43 g Na₂S₄O₆ · 2 H₂O sowie eine O.lm-Tris-HCl-Pufferlösung mit einem Gehalt von 2,5% Glycin zu einem Gesamtvolumen von 1,01 zugesetzt. Nach 3 Stunden Umsetzung bei 45°C wurde die Reaktionsflüssigkeit unter Anwendung eines Dow Chemical Bechers, Ultrafilter b/HFU-1, dialysiert und das Dialysat auf ein Volumen von 200 ml konzentriert, durch einen Seitz-O,25^m-Filter steril filtriert, unter Zusatz von 2,5 g Glycin lyophilisiert und mit Wasser auf eine 5,0%ige Lösung verdünnt. Die Antikörperaktiviti» der Probelö-,0 sung ergibt sich aus Tabelle II.

Bedingung Il

Die Reaktion und die Behandlung unter der ·-,-, Bedingung I wurden wiederholt, wobei jedoch Reaktionstemperatur und Reaktionszeit auf 25⁰C bzw. 24 Stunden geändert wurden.

Bedingung III

Reaktion und Behandlung unter der Bedingung I wurde wiederholt, wobei jedoch Na₂S₄O₆ · 2 H₂O durch 0,16 g CuSO₄ · 5 H₂O ersetzt wurde.

Die unter den vorstehenden Bedingungen I bis III (,-, erhaltenen Lösungen der Humanimmunglobulin G-Derivate wurden hinsichtlich Antikörperaktivitäten gegenüber verschiedenen Antigenen untersucht, wobei die Ergebnisse in Tabelle Il aufgeführt sind.

Tabelle II

Antikörperaktivitüten für verschiedene Antigene

Reaktionsbedingung	3 Std.)	Antigen	Musern	Röteln	Mumps
	- 24 Std.)	Diphtherie	(Einheiten/ml)	(relativ)	(relativ)
	Std.)	(Einheiten/ml)	6,7	171	11
Intakt	0,8	5,0	170	-
I (Na₂S₄O₆, 45 C-	0,8	4,4	-	10
II (Na₃S₄O,,, 25 C-	-	<2	-	_
IH(Cu++, 45 C-3	<0,l

Aus den Werten der vorstehenden Tabelle II lassen sich nachstehende Folgerungen ableiten:

(1) Wenn Tetrathionat verwendet wurde (Bedingung

I), war der Diphtherie-Titer des S-sulfonierten ,,, Immungloüulin G praktisch äquivalent mit demjenigen des nativen Humanimrnunglobulin G, während, wenn Kupfer(II)-ionen verwendet wurden, (Bedingung III), die Immunglobulinderivate G praktisch keine Aktivität zeigten. ,-,

(2) Hinsichtlich des Titers für Masern behielt das S-sulfonierte Immunglobulin G, welches mit Tetrathionat oxidiert worden war, (Bedingung I und II) mehr als 60% desjenigen des nativen Humanimmunglobulin G bei, während das mit Kupfer(II)- m ionen (Bedingung III) oxidierte einen Aktivitätsabfall auf wer.;ger als 30% zeigte.

Hieraus ist ersichtlich, daß bei Verwendung von Kupfer(II)-ionen die Verringerung 4er Antikörperakti- r> vität größer ist als bei Verwendung von Tetrathionat.

Anwendungsbeispiel 2

Antikomplementtest in vivo des S-sulfonierten w

Humanimmunglobulins

In gleicher Weise wie bei Bedingung I woa Anwendungsbeispiel I wurde S-sulfoniertes Humanimmunglobulin G erhalten. 4>

3 ml der 5%igen, gepufferten Salzlösung mit einem Gehalt von 2,5% Glycin, pH 7,4, 3 ml der gepufferten Salzlösung allein als Kontrolle und 1 ml eines 15%igen unbehandelten Humanimmunglobulin I in gepufferter Salzlösung mit einem Gehalt von 2,5% Glycin, ebenfalls als Kontrolle, wurden intravenös an weibliche Meerschweinchen mit einem Körpergewicht von 200 bis 300 g verabreicht und die Serumkomplementwerte der Testkörper mit den Seren von jeweils 1,0 ml bestimmt, die jeweils durch Cardio-Punktur in regelmäßigen Abständen abgenommen wurden.

Die Ergebnisse sind in Fig. 10 aufgeführt. Aus Fig. 10 ist ersichtlich, daß ein abrupter Abfall des Serumkomplementwertes in den Testkörpern nach der intravenösen Injektion von intaktem Humanimmunglobulin G beobachtet wurde, der bei der gleichen Verabreichung von S-sulfoniertem Humanimmunglobulin G null betrug. Auch wurde ein gelegentliches Zittern bei den Meerschweinchen nach der Injektion des ersteren beobachtet, das andererseits bei Meerschweinchen nicht auftrat, an die das S-sulfonierte Humanimmunglobulin G intravenös injiziert worden war. Aus diesem Sachverhalt läßt sich mit Sicherheit erwarten, daß die Humanimmunglobulin-G-Derivate gemäß der Erfindung auch in vivo frei von ungünstigen Reaktionen sind.

Anwendungsbeispiel 3

Beständigkeit von S-sulfonierten Kaninchen-

Immunglobuün G und Rückbildung der Disulfid-

bindungen in vivo

(a) Herstellung von
Kaninchen-Anti-BSA-DHP-Antikörper

Rinderserumalbumin (BSA) wurde mit Dinitrofluorphenol zur Bildung einer Verbindung umgesetzt, welche nachfolgend mit der Abkürzung BSA-DNP bezeichnet wird. BSA-DNP wurde an Kaninchen (Species New Zealand White, weiblich) an den Fußpolstern zusammen mit vollständigem Adjuvans nach Freund injiziert und immunisiert. Am 30. Tag nach der Injektion wurden die Kaninchen aus der Corotidarterie ausgeblutet. Das dabei erhaltene Antiserum wurde in an sich bekannter Weise nach dem Ausfällungsverfahren mit 45%iger gesättigter Ammoniumsulfallösung behandelt und Kaninchen-Anti-BSA-DNP-Immunglobulin wurde erhalten.

(b) Herstellung der Proben
Bedingung t

Das Anti-BSA-DNP-Immunglobulin wurde bei 37°C während 24 Stunden zusammen mit 1 Gew.-% Pepsin bezogen auf Immunglobulin gemäß dem A. Nisonoff-Verfahren (Arch. Biochem. Biophys., 89, Seite 230 1960) hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde der Säulenchromatographie mit Sephadex G 150* unterworfen und das F (ub')₂-Fragment wurde erhalten.

Bedingung 2

250 ml des Anti-BSA-DNP-Immunglobulins, 180 mg Na₂SO₃ und 79 mg Na₂S₄O₆ · 2 H₂O wurden in 25 ml O.lm-Tris-HCI mit einem Gehalt von 2,5% Glycin (pH 8,2) gelöst und bei 37°C während 4 Stunden umgesetzt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde während 24 Stunden gegen gepufferte Salzlösung (pH 7,4) dialysiert und ergab S-sulfoniertes Kaninchen-Immunglobulin.

Bedingung 3

Das vorstehend aufgeführte BSA-DNP-Immunglobulin wurde als solches verwendet.

(c) Bestimmung des Umwandlungsausmaßes und der
Haltbarkeit

Die in der vorstehenden Weise hergestellten Proben wurden jeweils zu Lösungen mit einer Konzentration von 5% verarbeitet.

Die Probelösungen wurden intravenös an Kaninchen (Species New Zealand White S ; Probe 1 an drei Kaninchen, Probe 2 an drei Kaninchen und Probe 3 an zwei Kaninchen) mit einer Dosierung von etwa 3 ml injiziert. Die Versuchstiere wurden in bestimmten Zeitabständen ausgeblutet und ihr Plasma wurde extrahiert Die Anti-BSA-DNP-Aktivität im Plasma wurde durch passive Haem-Agglutinationsreaktion bestimmt (T. Matsuhashi, Chemistry & Biology, 9, 396, 1971), wobei BSA-DNP auf roten Blutzellen der Schafe unter Anwendung von Glutaraldehyd fixiert wurde und das Mikrotiterverfahren angewandt wurde, wobei die in Fig. 11 aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden.

Wie sich klar aus F i g. 11 ergibt, ist das Umwandlungsausmaß in vivo äußerst kurz für das handelsübliche F(ab')₂, was eine kurze Dauer der pharmazeutischen Wirksamkeit anzeigt Im Gegensatz hierzu zeigt das S-sulfonierte Immunglobulin G praktisch die gleiche Halbwertszeit wie diejenige des nativen Humanimmunglobulin G, woraus sich eine beständige pharmazeutische Wirksamkeit ergibt

(d) Bestimmung der hämolytischen Aktivität
der Antikörper

Das angegebene native Anti-BSA-DNP-Immunglobulin G wurde intravenös an Kaninchen injiziert und deren Plasma 10 Minuten nach der Injektion gesammelt, welches auf das lOOfache Volumen verdünnt wurde und mit Meerschweinchenkomplement und roten Blutzellen der Schafe, auf welche BSA-DNP durch Gerbsäure adsorbiert worden war, bei 37°C während 1 Stunde umgesetzt.

Der intakte Antikörper gemäß Bedingung 3 verursachte eine iOO°/oige Hämolyse, während F (ab')₂ gemäß Bedingung 1 und die S-sulfonierte Probe gemäß Bedingung 2 keine hämolytische Aktivität zeigten.

Von dem aus den Kaninchen 24 Stunden nach der Injektion genommenen Plasma verursacht das Produkt unter Bedingung 2 bei dem gleichen Test, wie vorstehend angegeben, eine 100%ige Hämolyse.

Diese Erscheinung ist vermutlich auf die Rückwandlung des S-sulfonierten Immunglobulin G in natives Humanimmunglobulin G in vivo zurückzuführen, d. h. die Reduktion von — S — SOj in -SH und die Wiederbildung der Disulfidbindungen.

(e) Bestimmung der Verringerung der Markierungskonzentration in vivo

30 mg Kaninchen-Immunglobulin, 21 mg ³⁵S-Na2SOj und 13 mg Na₂S₄O₆ · 2 H₂O wurden in 3 ml 0,1m-Tris-HCI mit einem Gehalt von 2,5% Glycin (pH 8,2) gelöst und bei 45°C während 3 Stunden umgesetzt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde während 24 Stunden gegen gepufferte Salzlösung (pH 7,4) dialysiert und auf diese Weise Wurde das ⁾⁵S-markierte S-sulfonierte Kaninchen-Immunglobulin hergestellt.

Die vorstehende, auf eine 5%ige Konzentration verdünnte Probe wurde intravenös an zwei Kaninchen (New Zealand White, 4 ) mit jeweils 1,5 ml injiziert und das Kaninchenplasma in bestimmten Zeitabständen in einer Menge von 0,5 ml je Kaninchen abgenommen. Die Radioaktivitäten des Plasmas wurden durch einen Flüssigkeusscintillationszähler gemessen, wobei die in Tabelle III aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden.

Tabelle III

Verbliebene Radioaktivität im Blut

Blutentnahme-Zeit	Restradioaktivität	im Blut
nach der intravenösen
Injektion	Kaninchen A	Kaninchen B
15 Minuten	100%	100%
3 Stunden	64	64
7 Stunden	34	36
24 Stunden	9,5	8,0
48 Stunden	2,2	1,0
72 Stunden	0,7	0

Aus den vorstehenden Werten ergibt as sich, daß die — S — SO3*-Gruppen in dem S-sulfonierten Immunglobulin im Blut gespalten werden.

Wie sich aus den vorstehenden Beispielen zeigt, ist es gemäD der Erfindung möglich, selektiv die Disulfidbindungen, welche die Η-Ketten und die L-Ketten im nativen Immunglobulin G verbinden, zu spalten und die dabei gebildeten Schwefelatome einer S-Sulfonierung zu unterziehen. Die Anzahl der Spaltung kann weiterhin auf einen durchschnittlichen Bereich von 3 bis 5, etwa 4,5, geregelt werden, was die durchschnittliche Anzahl der Interkettendisulfidbindungen von nativem Humanimmunglobulin G ist, und die bei der Spaltung gebildeten Schwefelatome können S-sulfoniert werden.

Diese nach dem Verfahren gemäß der Erfindung hergestellten neuen Humanimmunglobulin-G-Derivate besitzen eine weit niedrigere Antikoroplementaktivität als natives Humanimmunglobulin G, wie sich kus den Beispielen ergibt, und verursachen infolgedessen weit weniger ungünstige Reaktionen der anaphylaktischen Faktoren. Deshalb sind die Derivate nicht nur intramuskulär injizierbar, sondern auch intravenös. Darüber hinaus zeigen die neuen Humanimmunglobulin-G-Derivate gemäß der Erfindung praktisch eine äquivalente Antigenbindungsaktivität wie natives Humanimmunglobulin G und besitzen deshalb ausgezeichnete Bindungsaktivitäten gegenüber verschiedenen Antigenen.

Es ist bereits bekannt, Aggregate aus dem durch Fraktionierung hergestellten nativen Humanimmunglobulin G durch Absorption oder Sedimentation mit Aktivkohle oder Poiymersubstanzen zu entfernen, ledcc-h verursacht das auf diese Weise behandelte Immunglobulin G nicht selten ungünstige Reaktionen beim Empfänger der Injektion. Darüber hinaus wird eine Reaggregation des auf diese Weise behandelten Immunglobulin G während der Lagerung beobachtet. Das Produkt ist somit für eine sicher injizierbare Zusammensetzung noch nicht zufriedenstellend (L. Ä. Hanson & B. G. Johanson; Int. Arch. Allergy, 31, 380, 1967). Es wurde bereits erwähnt und gezeigt, daß die gemäß der Erfindung hergestellten Humanimmunglobu linderivate weit weniger ungünstige Reaktionen zeigen und in dieser Hinsicht ganz ausgezeichnet sind, wozu auf F i g. 2 verwiesen wird.

Die gemäß der Erfindung hergestellten Humanimmunglobulin-G-Derivate behalten auch die Antigenbin-

dungsaktivität während eines langen Zeitraumes bei, wie in Beispiel 3 belegt ist. Weiterhin werden die S-Sulfonatgruppen in den Derivaten in Disulfidbindungen in vivo zurückgewandelt, während die Sulfonatgruppen aus dem Körper ausgeschieden werden. Somit werden schließlich die Derivate in natives Humanimmunglobulin G zurückverwandelt. Auch aus diesem Grund hat das gemäß der [Erfindung hergestellte S-sulfoniertc Immunglobulin G ganz augenscheinliche Vorteile gegenüber den bekannten S-alkylicrtcn Immunglobulinen.

Wie bereits gezeigt, sind die gemäß der Krfinilung hergestellten neuen Humanimnuinglobulin-G-Derivate als pharmazeutisch wirksame Bestandteile nicht nur für

die intramuskuläre Injektion sondern auch für die intravenöse Injektion geeignet.

Die neuen Immunglobulin-G-Derivate ergeben was serlöslichc Zusammensetzungen für injizierbare Flüssigkeiten, wenn Injektion, mit l.öslichmachungsmitteln, wie Glycin, Natriumphosphat, Citrat, Natriumchlorid iincl dgl. in pceignetcn Konzentrationen vermischt werden Weiterhin können die Zusammensetzungen in Wasser bei Konzentrationen von beispielsweise I bis 2C Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 10 Gew.-%. gelöst werden wobei sich intravenös injizicrbarc Präparate ergeben.

Das S-sulfonicrte gemäß der Erfindung hergestellte lmmiinglobiilin-(i-Derivat ist offensichtlich für die Therapie beim Menschen brauchbar.

I Iki/ii

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Humanimmunglobulin-Derivaten mit niedriger Antikomplementaktivität durch Spalten von den Interkettendisulfidbindungen von nativem Humanimmunglobulin unter Ausbildung von S-sulfonierten Polypeptiden und Dialysieren des Reaktionsgemisches, dadurch gekennzeichnet, daß natives Humanimmunglobulin mit

(A) Tetrathionsäure, deren Alkali- und anderen wasserlöslichen Salzen und

(B) mit schwefeliger Säure, deren Alkali- und anderen wasserlöslichen Salzen

in Wasser bei einer Temperatur von nicht höher als 50⁰C bei einem pH-Wert im Bereich von 3,5 bis 10 und in Abwesenheit von oxidierenden Metallionen, wie Kupfer(II)-ionen unter Spaltung von durchschnittlieh 3 bis 5 Interkettendisulfidbindungen des native« Humanimmunglobuüns und S-Su!fonierung (S-SO3-) der dabei gebildeten Schwefelatome umgesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man natives Humanimmunglobulin der Umsetzung unter Spaltung von durchschnittlich 3 bis 4,5 Interkettendisulfidbindungen des nativen Humanimmunglobulins und S-Sulfonierung (S-SOj-) der dabei gebildeten Schwefelatome unterwirft.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunglobulinderivate durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex P 75 oder P 200® als Harz und in Gegenwart von Lösungsmkteln in die L- und Η-Ketten aufgeteilt werden.

4. Parenteral applizierbare Lösung, enthaltend das nach Anspruch 1 bis 3 hergestellte Humanimmunglobulinderivat als wirksame Substanz, die einen Antidiphtherie-Titer von mindestens 1,0 ΙΕ/ml bei einer Konzentration von 10,0 Gew.-°/o aufweist, zusammen mit den üblichen Lösungsvermittlern.