DE3701066C2 - Intravenös injizierbares Immunglobulin mit hohem Antikörpertiter gegenüber dem respiratorischen Syncytialvirus, Verfahren zu dessen Herstellung und pharmazeutische Zubereitung, welche dieses enthält - Google Patents
Intravenös injizierbares Immunglobulin mit hohem Antikörpertiter gegenüber dem respiratorischen Syncytialvirus, Verfahren zu dessen Herstellung und pharmazeutische Zubereitung, welche dieses enthältInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein neues Immunglobulin und neue
Methoden zu dessen Herstellung. Sie betrifft insbesondere
ein intravenös injizierbares Immunglobulin mit einem ho
hen Titer von natürlich vorkommen den Antikörpern gegen
über dem respiratorischen Syncytialvirus (RSV). Weitere
Ziele der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschrei
bung hervor, in welcher Teile und Prozentsätze, sofern
nicht anders angegeben, auf das Gewicht bezogen sind.
Der respiratorische Syncytialvirus wird als die häufigste
Ursache von schweren Erkrankungen der Atmungsorgane bei
Säuglingen und Kleinkindern angesehen. Er kann auch eine
wesentliche Ursache von Erkrankungen der unteren Atmungs
organe bei älteren Personen sein. Allein in den Vereinig
ten Staaten wird berichtet, daß dieser Virus Pneumonie,
Bronchitis und Krupp bei annähernd 4.000.000 Kindern
jährlich mit etwa 4.500 Todesfällen verursacht. In der
westlichen Welt ist er der Hauptgrund für einen Kranken
hausaufenthalt von Kindern (National Research Council
New Report, 35, 9 (1985), Stott, E.J. et al, Archives of
Virology, 84 : 1-52 (1985) und W.H.O. Scientific Group,
World Health Organziation Technical Report Series 642
(1980)).
In Industriegebieten, wie Großbritannien, beträgt die
jährliche Rate der Einweisungen von Kindern zwischen 1 und
3 Monaten in ein Krankenhaus aufgrund von RSV-Infektio
nen 24,5 pro 1.000 Kinder (Stott, E.J. et al, Archives
of Virology, 84 : 1-52 (1985)).
Derzeit gibt es zur Verhinderung dieser Erkrankungen noch
keinen Impfstoff. Ein nahezu vor 25 Jahren entwickelter
inaktivierter Impfstoff war nicht nur unwirksam, sondern
hat anscheinend sogar noch schwerwiegendere Erkrankungen
bei den geimpften Kindern im Vergleich zu Placebokontrol
len, hervorgerufen (Kapikian, A.Z. et al, American Journal
of Epidemiology, 89 : 405-21 (1969) und Kim, H.W. et al,
American Journal of Epidemiology, 89 : 422-34 (1969)).
Obwohl diese Erkrankung während der ersten Lebensmonate,
bei denen noch gewisse Niveaus an mütterlichen Antikör
pern vorliegen, äußerst schwer sind, haben kürzliche Un
tersuchungen am Tiermodell gezeigt, daß mütterliche
Antikörper unterhalb eines kritischen Niveaus unwirksam
sind (Prince, G.A. et al, Journal of Virology, 55 : 517-20
(1985)).
Hemming et al (J. Infectious Diseases, 152, 1033 (1985))
zeigen die Ergebnisse von Untersuchungen einer passiven
Immunotherapie bei respiratorischen Syncytialvirus-Infek
tionen im respiratorischen Trakt eines Menschenaffen,
welche zeigen, daß die Infusion von humanem, intravenö
sen Immunglobulin (hergestellt aus Plasma mit einem Anti
körpertiter gegenüber dem Virus im normalen Bereich) er
heblich die Mengen an Viren, die aus den Nasen und den
Luftwegen von RSV-infizierten Eulenaffen ausgeschieden wer
den, verringert.
Hyperimmunglobuline, d. h. Immunglobuline mit höheren als
normalen Titern von speziellen Antikörpern, sind therapeu
tisch für die Behandlung von Patienten, die den speziel
len Antikörper nicht aufweisen oder diesen brauchen, ge
eignet. Beispielsweise kann man Tetanus-Hyperimmunglobulin
für die Behandlung von Tetanus verwenden und Tollwut-
Hyperimmunglobulin für die Behandlung von Tollwut. Es ist
bekannt, daß man Hyperimmunglobuline aus Plasma oder
Serum herstellen kann, welches von ausgewählten Donoren,
die merklich höhere Titer für einen speziellen Antikörper
als er normalerweise bei der Durchschnittsbevölkerung
gefunden wird, aufweisen, stammt. Solche Donoren sind ent
weder kürzlich mit einem speziellen Impfstoff immunisiert
worden (US-PS 4 174 388) oder sie sind erst kürzlich von
einem von einer Infektion oder Erkrankung Genesenen ge
wonnen worden (Stiehm, Pediatrics, Bd. 63, Nr. 1, 301-319
(1979)).
Es besteht infolgedessen ein Bedürfnis nach einem RSV-
Immunglobulin-Produkt mit einem höheren als normalen
Antikörpertiter gegenüber RSV, insbesondere einem sol
chen, welches intravenös verabreicht werden kann.
Es wurde nun gefunden, daß normales frisches Plasma von
normalen Donoren, die nicht unbedingt vorher mit einem
RSV-Impfstoff geimpft worden sein müssen, erfolgreich
auf höhere als normale Antikörper gegenüber RSV gescreent
werden kann. Solche Plasmen mit Antikörpertitern von
mehr als etwa 1 : 110.000, bestimmt durch enzymverbunde
ne Immunosorbens-Assay (ELISA) kann man poolen und dann
Fraktionieren unter Erhalt eines Hyperimmunglobulins oder
genauer gesagt eines antirespiratorischen Syncytial
immunglobulins mit hohem Titer, das durch weitere Verar
beitung intravenös verabreicht werden kann. Dieses Ergeb
nis ist überraschend, weil man nicht erwarten konnte,
daß Plasma von normalen, nicht-geimpften Donoren einen
Antikörpertiter gegenüber RSV aufweist, der hoch genug ist,
um ein RSV-Hyperimmunglobulin zu ergeben, welches wirk
sam für die Behandlung von RSV-Infektionen bei intravenö
ser Verabreichung eingesetzt werden kann.
Ein offensichtlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung
besteht darin, daß normale Donoren nicht mit einem RSV-
Impfstoff behandelt werden müssen. Infolgedessen kann man
die bei einer solchen Verfahrensweise inhärenten Risiken
vermeiden. Ein weiterer erfindungsgemäßer Vorteil be
steht darin, daß das Hyperimmunglobulin bei intravenöser
Verabreichung die Antikörper gegenüber RSV unmittelbar
zur Verfügung stellt. Ein weiterer Vorteil besteht darin,
daß die Unannehmlichkeiten, die bei einer intramuskularen
Verabreichung vorliegen, bei den Patienten vermieden werden
können. Weitere Vorteile sind auch der Wegfall einer Ver
zögerung von einigen Tagen, bis die RSV-Antikörper eine
Spitze in ihrer Zirkulation erreichen und die Eliminierung
eines lokalen Abbaus. Darüber hinaus muß nur weniger
Produkt intravenös verabreicht werden, um das gleiche Ni
veau an Antikörpern zu erzielen, welches man mit einem
intramuskular verabreichten Produkt erhält oder man kann
höhere Dosen intravenös verabreichen, um höhere Titer zu
erzielen, wie sie andererseits nur schwierig bei intra
muskularen Verabreichungen erhalten werden können.
Diese und weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung kön
nen in der nachfolgenden Weise erhalten werden:
Normales Plasma von einem Donor wird auf natürlich vor
kommende Antikörper gegen RSV unter Verwendung einer
ELISA oder einer anderen, gleich empfindlichen Screening-
Methode (z. B. RIA) bei einem äquivalenten Titer geprüft.
Um bei der Methode und dem Produkt gemäß der Erfindung
wirksam zu sein, sollte das "ausgewählte" Plasma von den
Donoren ein Antikörpertiter gegen RSV haben, der etwa
5 mal so groß ist wie der Antikörpertiter gegenüber RSV,
den man bei "normalen" Donoren findet (Clin. Exp. Immunol.,
52, 412-422 (1983)).
Der Ausdruck "etwa 5 mal so groß wie der Antikörpertiter
gegen RSV" bedeutet, daß er Niveaus einschließt, die
etwas unterhalb des 5-fachen oder etwas größer als das
5-fache liegen und einen Durchschnitt von etwa dem 5-fachen
gegenüber RSV, wie er bei normalen Donoren gefunden wird,
ergeben. Es wurde festgestellt, daß das geometrische Mittel
des Antikörpertiters gegen RSV bei den meisten Donoren
etwa 1 : 25.000 beträgt (nachfolgend als "Normal"-Titer
bezeichnet) und daß etwa 2 bis 4% der Plasmadonoren
einen Antikörpertiter gegen RSV haben, der etwa 5 mal
dem normalen Titer ("ausgewählten" Titer) entspricht.
Es wurde weiterhin gefunden, daß ein geometrischer mitt
lerer Titer von 39 "ausgewählten" Plasmaproben etwa
1 : 110.000 beträgt. Infolgedessen soll, damit es bei
der Methode und dem Produkt der vorliegenden Erfindung
wirksam ist, das "ausgewählte" Plasma von Donoren einen
Antikörpertiter gegen RSV haben, der gleich oder größer
als etwa 1 : 110.000 ist.
Im allgemeinen wurde festgestellt, daß das aus Plasma
gebildete Immunglobulin als Ergebnis des Herstellungs
verfahrens einen Antikörpertiter aufweist, der etwa dem
5-fachen des Antikörpertiters entspricht, der in dem
Ausgangsplasma gefunden wurde. Man kann deshalb erwarten,
daß der Antikörpertiter gegen RSV in dem aus Normalplasma
gebildeten Immunglobulin, nachfolgend als normales Immun
globulin bezeichnet, etwa 1 : 125.000 ist. Es wurde je
doch festgestellt, daß ein geometrisches Mittel aus
23 normalen Immunglobulinen tatsächlich etwa 1 : 165.000
betrug. Infolgedessen kann man erwarten, daß RSV-Immun
globulin, das aus den ausgewählten Plasmaproben hergestellt
wurde, basierend auf den obigen Feststellungen, einen
Titer von etwa 1 : 600.000 hat. Das nach dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung hergestellte RSV-Immunglobulin
kann somit einen Antikörpertiter gegen RSV von wenigstens
etwa 1 : 250.000 bei einer Globulinkonzentration von etwa
5% und noch bevorzugter von wenigstens etwa 1 : 400.000
und ganz besonders bevorzugt von wenigstens etwa 1 : 600.000
haben. Dabei bleibt festzuhalten, daß von den obigen
Begrenzungen die niedrigste Begrenzung kritisch ist für
die Definition des erfindungsgemäßen Anti-RSV-Immunglo
bulins mit hohem Titer. Obwohl eine obere Begrenzung von
1 : 1.000.000 für die Praxis annehmbar ist, ist es möglich,
daß man höhere Titer erhalten könnte, wenn man eine
weitere Auswahl vornimmt oder das Globulin weiter konzen
triert.
Die vorerwähnten minimalen Antikörpertiter gegen RSV-
Immunglobulin, hergestellt aus ausgewähltem Plasma nach
der erfindungsgemäßen Methode, basieren auf einer übli
chen Konzentration, d. h. einer 5%-igen Lösung des Anti-
RSV-Immunglobulins mit hohem Titer. Für den Fachmann liegt
es aber auf der Hand, daß durch Konzentrieren der
5%-igen Lösung, z. B. auf eine 10%-ige oder 15%-ige
Lösung, die erwähnten Titer proportional höher sein wür
den.
Die Methode, mit welcher das Plasma gescreent wird, d. h.
die ELISA-Methode, wird im wesentlichen von Engvall und
Perlmann, J. Immunol., 109, 129-135 (1972), Engvall et
al, Biochemica Et Biophysica Acta, 251, 427-434 (1971),
Engvall et al, Immunochemistry, 8, 871-874 (1971), be
schrieben, die alle in die vorliegende Offenbarung einge
schlossen werden. Das Assay ist eine einfache Methode
für die quantitative Bestimmung von Antikörpern. Mikro
titerplatten, die mit dem Antigen beschichtet sind, werden
mit Antiserum inkubiert und anschließend erfolgt eine
enzymmarkierte Herstellung des Antiglobulins. Das in den
Vertiefungen nach dem Auswaschen zurückbleibende enzym
markierte Antiglobulin, welches durch die Addition einer
chromogenen Substanz quantifiziert wird, ergibt ein Maß
für die Menge des spezifischen Antikörpers im Serum.
Plasma mit einem ausreichend hohen Antikörpertiter (einem
ELISA-Titer von wenigstens etwa 1 : 110.000) wird gepoolt
und fraktioniert unter Erhalt eines Immunglobulins mit
einem hohen Antikörpertiter gegenüber RSV. Man kann jede
Methode zur Herstellung von intravenös injizierbarem
Immunglobulin aus dem gepoolten Plasma anwenden. Beispiels
weise kann man die Cohn-Fraktionierungsmethode (in den
nachfolgend angegebenen Druckschriften beschrieben, die
alle hier eingeschlossen werden), eine Ammoniumsulfat-
Fraktionierung, eine Polyethylenglykol-Ausfällung oder
dergleichen anwenden. Das vorerwähnte Immunglobulin umfaßt
IgG, im allgemeinen zumindest 90% IgG-Monomer. Das Ma
terial enthält im allgemeinen weitere Globuline, wie IgA,
IgM und dergleichen.
Diese Plasmas mit hohem Titer werden gepoolt und einer
Cohn-Fraktionierungsmethode unterworfen, unter Erhalt
einer Fraktion II (Cohn et al, J. Am. Chem. Soc., 68,
459 (1946) und Oncley et al, ibid. 71, 541 (1949)).
Das so erhaltene Hyperimmunglobulin kann intravenös in
jizierbar gemacht werden, indem man es nach der Methode
von Tenold "Intravenously Injectable Immune Serum Glo
bulin", US-PS3n 4 396 608 und 4 489 073 oder von Pappen
hagen et al, "Pharmaceutical Compositions Comprising
Intravenously Injectable Modified Serum Globulins, Its
Production and Use", US-PS 3 903 262 (die alle hiermit
in die Offenbarung einbezogen werden), behandelt. Bei
der Methode gemäß US-PS 3 903 262 erfolgt eine Modifi
zierung des Immunglobulins durch Reduktion und Alkylie
rung, wodurch es intravenös injizierbar wird. Bei den
Methoden gemäß US-PSen 4 396 608 und 4 499 073 werden der
pH-Wert und die Ionenstärke einer Lösung des Immunglobulins
eingestellt, um es intravenös injizierbar zu machen.
Die erfindungsgemäße Hyperimmunglobulin-Zubereitung kann
auch Maltose als Stabilisator gemäß der Lehre von
US-PS 4 186 192 enthalten. Infolgedessen kann die vor
liegende Zubereitung etwa 1 bis 20% Maltose auf einer
Gewicht-zu-Volumen-Basis enthalten.
Das Hyperimmunprodukt gemäß der Erfindung kann als
pharmazeutische Zubereitung hergestellt werden, indem
man im allgemeinen wäßrige Lösungen des Hyperimmunglo
bulins anwendet und die dann für die Prophylaxe oder
Therapie verwendet werden können. Die Produkte werden
in geeigneter Weise sterilisiert, im allgemeinen durch
Sterilfiltration durch ein geeignetes übliches Medium
zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen.
Die für eine therapeutische Anwendung beabsichtigte
pharmazeutische Zusammensetzung sollte eine therapeuti
sche Menge des hyperimmunen Globulins freigeben, d. h.
eine Menge die erforderlich ist, um präventiv oder hei
lend bei der Behandlung von RSV-Infektionen zu wirken.
Die Erfindung wird weiterhin in den nachfolgenden, beschrei
benden Beispielen erläutert.
Die ELISA-Methode war im wesentlichen die gleiche, wie
sie von Engvall und Perlman beschrieben wird und von
Carlsson et al, Inf. Imm., 6, (5) 703-708 (1972) für
die Titrierung von Anti-Salmonella-Immunoglobulinen
verwendet wird. Die Methode wurde zuvor für Mikrotiter
platten angepaßt (Voller et al, Manual of Clinical
Immunology, 1976, 506-512), bei dem man visuelle Endpunk
te mit einer guten Empfindlichkeit bestimmen kann (Pox
ton, J. Clin. Path., 32, 294-295 (1975), Voller et al,
supra).
Vertiefungen in Polystyrol-Mikrotiterplatten mit rundem
Boden wurden durch Zugabe von 0,1 ml der optimalen Ver
dünnung von RSV-Antigen in Carbonat-Bicarbonat-Puffer
(pH-Wert 9,5) sensibilisiert und für annähernd 18 Stunden
bei 4°C inkubiert. RSV-Antigen wurde von MA Bioproducts
(Walkersville, Maryland, USA) als rohes, komplement
fixierendes Antigen erhalten. Die Platten wurden einmal
mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend
0,05% Tween 20 und 0,02% Natriumazid (PBSTA) gewaschen.
5% Rinderserumalbumin (BSA), 0,1 ml, wurden zu jeder
Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden dann weiter 4
bis 5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann einmal
gewaschen. Die Platten wurden nach dem letzten Waschen
trockengeschüttelt. Verdünnungen von Antisera wurden zu
jeder Vertiefung (0,1 ml) zugegeben und über Nacht bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal
wie vorher beschrieben gewaschen und 0,1 ml eines Ziegen-
Antihuman-IgG, konjugiert gegenüber alkalischer Phospha
tase (Miles Laboratories Inc.) wurde zu jeder Vertiefung
gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach
nochmaligem Waschen der Vertiefungen wurden 0,1 ml einer
1,0%-igen (G/V) Lösung von Enzymsubstrat, p-Nitrophenyl
phosphat (Sigma Chemical Co.) in 10%-igem Diethanolamin
puffer (pH 8,0) mit 0,02% Natriumazid und 1 mM MgCl₂ zu
gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Umsetzung wurde durch die Zugabe von 0,05 ml 3 N NaOH zu
jeder Vertiefung abgebrochen. Die Absorption wurde bei
405 nm mit einem Dynatech Modell 580 Mikro-ELISA-Ableser
abgelesen. Der Endpunkt wurde festgelegt als die höchste
Verdünnung bei einer Absorption von 0,010.
Plasmaspenden, die von Donoren erhalten wurden, wurden
auf Antikörper gegen RSV durch die ELISA-Methode gescreent.
Die Plasmaspenden mit einem durchschnittlichen RSV-Anti
körpertiter von etwa 1 : 25.272 ("nicht ausgewählt") wur
den gepoolt und nach der Methode von Pappenhagen et al,
US-PS 3 903 262 fraktioniert, unter Erhalt eines intravenös
injizierbaren "normalen" Immunglobulins. Die Antikörper
titerdes "nicht-ausgewählten" Plasmapools und des "normalen"
Immunglobulins, welches daraus hergestellt wurde, wer
den in Tabelle 1 gezeigt.
Proben von Plasmaspenden mit einem geometrischen Mittel
an RSV-Antikörpertiter von etwa 1 : 106.738 wurden aus
gewählt ("ausgewählte Plasmaproben"). Der geometrische
Mittel-Titer wird in Tabelle 1 zum Vergleich gezeigt.
Die Fraktionierungsmethode von Pappenhagen et al gemäß
US-PS 3 903 262 oder die von Tenold, US-PSen 4 396 608
und 4 499 073, können zur Herstellung des erfindungsgemäßen
Produktes verwendet werden. Obwohl die Antikörper
titer des RSV-Hyperimmunglobulins, welches nach der Me
thode von Pappenhagen et al gebildet wurde oder nach
der Methode von Tenold nicht zur Verfügung stehen, kann
man erwarten, daß die mittels ELISA gemessenen Antikör
pertiter im wesentlichen die gleichen sind, unabhängig
davon, welche Methode angewendet wurde. Man kann vorher
sehen, daß der geometrische Mitteltiter des Antikörpers
gegenüber RSV etwa 1 : 533.690 sein sollte, d. h. etwa
das 5-fache des Antikörpertiters gegen RSV bei der "aus
gewählten" Plasmaprobe.
Unter Berücksichtigung der vorhergehenden Offenbarung
liegt es auf der Hand, daß Veränderungen für den Fach
mann offensichtlich sind. Beispielsweise kann man durch
Verwendung von Anti-RSV-monoklonalen Antikörpern es er
möglichen, solche Hochtiterprodukte herzustellen. Im
Falle eines Immunglobulins mit sehr hohem Titer kann es
praktisch sein, das Produkt intramuskular zu verabrei
chen. Deshalb sollen die vorhergehenden Beispiele nur
beschreibend sein und der Umfang der Erfindung sollte
lediglich durch die Patentansprüche beschränkt werden.
Claims (8)
1. Verfahren zur Herstellung von intravenös injizier
barem Immunglobulin mit einem Antikörpertiter ge
genüber dem respiratorischen Syncytialvirus von we
nigstens etwa 1 : 250.000 bei einer Globulinkonzen
tration von etwa 5 Gew.%, bestimmt durch eine enzym
verbundene Immunosorbens-Assay, welche die folgenden
Stufen umfaßt:
- (a) Screening-Plasma von Donoren für einen Antikörpertiter gegenüber dem respiratorischen Syn cytialvirus von wenigstens etwa 1 : 110.000, bestimmt durch enzymverbundene Immunosorbens-Assay,
- (b) Poolen des gemäß Stufe (a) ausgewählten Donorplasmas,
- (c) Herstellen eines Immunglobulins aus dem gemäß Stufe (b) gepoolten Plasma, und
- (d) Zubereiten des gemäß Stufe (c) erhaltenen Immunoglobulins zum intravenös Injizierbarmachen.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem in Stufe (c)
das Immunglobulin nach der Cohn-Fraktionierungsmetho
de hergestellt wurde.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem in Stufe (d)
das Immunglobulin reduziert und alkyliert wird, um
es intravenös injizierbar zu machen.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem in Stufe (d)
das Immunoglobulin in Form einer Lösung zur Verfü
gung gestellt wird, und der pH und die Ionenstärke
der Lösung so eingestellt werden, daß es intrave
nös injizierbar ist.
5. Intravenös injizierbares Immunglobulin mit einem
Antikörpertiter gegenüber dem respiratorischen Syn
cytialvirus von wenigstens etwa 1 : 250.000 bei
einer Globulinkonzentration von etwa 5 Gew.%, bestimmt
durch enzymverbundene Immunosorbens-Assay.
6. Pharmazeutische Zubereitung, umfassend eine Menge
an einem intravenös injizierbaren Immunglobulin gemäß
Anspruch 5, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger
dafür.
7. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 6, die
weiterhin Maltose einschließt.
8. Globulin gemäß Anspruch 5, bei welcher der Titer bei
einer Globulinkonzentration von etwa 5 Gew.% in Was
ser im Bereich von etwa 1 : 250.000 bis 1 : 1.000.000,
bestimmt durch eine enzymverbundene Immunosorbens-
Assay, liegt.
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