DE3701066C2 - Intravenös injizierbares Immunglobulin mit hohem Antikörpertiter gegenüber dem respiratorischen Syncytialvirus, Verfahren zu dessen Herstellung und pharmazeutische Zubereitung, welche dieses enthält - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Immunglobulin und neue Methoden zu dessen Herstellung. Sie betrifft insbesondere ein intravenös injizierbares Immunglobulin mit einem ho­ hen Titer von natürlich vorkommen den Antikörpern gegen­ über dem respiratorischen Syncytialvirus (RSV). Weitere Ziele der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschrei­ bung hervor, in welcher Teile und Prozentsätze, sofern nicht anders angegeben, auf das Gewicht bezogen sind.

Der respiratorische Syncytialvirus wird als die häufigste Ursache von schweren Erkrankungen der Atmungsorgane bei Säuglingen und Kleinkindern angesehen. Er kann auch eine wesentliche Ursache von Erkrankungen der unteren Atmungs­ organe bei älteren Personen sein. Allein in den Vereinig­ ten Staaten wird berichtet, daß dieser Virus Pneumonie, Bronchitis und Krupp bei annähernd 4.000.000 Kindern jährlich mit etwa 4.500 Todesfällen verursacht. In der westlichen Welt ist er der Hauptgrund für einen Kranken­ hausaufenthalt von Kindern (National Research Council New Report, 35, 9 (1985), Stott, E.J. et al, Archives of Virology, 84 : 1-52 (1985) und W.H.O. Scientific Group, World Health Organziation Technical Report Series 642 (1980)).

In Industriegebieten, wie Großbritannien, beträgt die jährliche Rate der Einweisungen von Kindern zwischen 1 und 3 Monaten in ein Krankenhaus aufgrund von RSV-Infektio­ nen 24,5 pro 1.000 Kinder (Stott, E.J. et al, Archives of Virology, 84 : 1-52 (1985)).

Derzeit gibt es zur Verhinderung dieser Erkrankungen noch keinen Impfstoff. Ein nahezu vor 25 Jahren entwickelter inaktivierter Impfstoff war nicht nur unwirksam, sondern hat anscheinend sogar noch schwerwiegendere Erkrankungen bei den geimpften Kindern im Vergleich zu Placebokontrol­ len, hervorgerufen (Kapikian, A.Z. et al, American Journal of Epidemiology, 89 : 405-21 (1969) und Kim, H.W. et al, American Journal of Epidemiology, 89 : 422-34 (1969)).

Obwohl diese Erkrankung während der ersten Lebensmonate, bei denen noch gewisse Niveaus an mütterlichen Antikör­ pern vorliegen, äußerst schwer sind, haben kürzliche Un­ tersuchungen am Tiermodell gezeigt, daß mütterliche Antikörper unterhalb eines kritischen Niveaus unwirksam sind (Prince, G.A. et al, Journal of Virology, 55 : 517-20 (1985)).

Hemming et al (J. Infectious Diseases, 152, 1033 (1985)) zeigen die Ergebnisse von Untersuchungen einer passiven Immunotherapie bei respiratorischen Syncytialvirus-Infek­ tionen im respiratorischen Trakt eines Menschenaffen, welche zeigen, daß die Infusion von humanem, intravenö­ sen Immunglobulin (hergestellt aus Plasma mit einem Anti­ körpertiter gegenüber dem Virus im normalen Bereich) er­ heblich die Mengen an Viren, die aus den Nasen und den Luftwegen von RSV-infizierten Eulenaffen ausgeschieden wer­ den, verringert.

Hyperimmunglobuline, d. h. Immunglobuline mit höheren als normalen Titern von speziellen Antikörpern, sind therapeu­ tisch für die Behandlung von Patienten, die den speziel­ len Antikörper nicht aufweisen oder diesen brauchen, ge­ eignet. Beispielsweise kann man Tetanus-Hyperimmunglobulin für die Behandlung von Tetanus verwenden und Tollwut- Hyperimmunglobulin für die Behandlung von Tollwut. Es ist bekannt, daß man Hyperimmunglobuline aus Plasma oder Serum herstellen kann, welches von ausgewählten Donoren, die merklich höhere Titer für einen speziellen Antikörper als er normalerweise bei der Durchschnittsbevölkerung gefunden wird, aufweisen, stammt. Solche Donoren sind ent­ weder kürzlich mit einem speziellen Impfstoff immunisiert worden (US-PS 4 174 388) oder sie sind erst kürzlich von einem von einer Infektion oder Erkrankung Genesenen ge­ wonnen worden (Stiehm, Pediatrics, Bd. 63, Nr. 1, 301-319 (1979)).

Es besteht infolgedessen ein Bedürfnis nach einem RSV- Immunglobulin-Produkt mit einem höheren als normalen Antikörpertiter gegenüber RSV, insbesondere einem sol­ chen, welches intravenös verabreicht werden kann.

Es wurde nun gefunden, daß normales frisches Plasma von normalen Donoren, die nicht unbedingt vorher mit einem RSV-Impfstoff geimpft worden sein müssen, erfolgreich auf höhere als normale Antikörper gegenüber RSV gescreent werden kann. Solche Plasmen mit Antikörpertitern von mehr als etwa 1 : 110.000, bestimmt durch enzymverbunde­ ne Immunosorbens-Assay (ELISA) kann man poolen und dann Fraktionieren unter Erhalt eines Hyperimmunglobulins oder genauer gesagt eines antirespiratorischen Syncytial­ immunglobulins mit hohem Titer, das durch weitere Verar­ beitung intravenös verabreicht werden kann. Dieses Ergeb­ nis ist überraschend, weil man nicht erwarten konnte, daß Plasma von normalen, nicht-geimpften Donoren einen Antikörpertiter gegenüber RSV aufweist, der hoch genug ist, um ein RSV-Hyperimmunglobulin zu ergeben, welches wirk­ sam für die Behandlung von RSV-Infektionen bei intravenö­ ser Verabreichung eingesetzt werden kann.

Ein offensichtlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß normale Donoren nicht mit einem RSV- Impfstoff behandelt werden müssen. Infolgedessen kann man die bei einer solchen Verfahrensweise inhärenten Risiken vermeiden. Ein weiterer erfindungsgemäßer Vorteil be­ steht darin, daß das Hyperimmunglobulin bei intravenöser Verabreichung die Antikörper gegenüber RSV unmittelbar zur Verfügung stellt. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die Unannehmlichkeiten, die bei einer intramuskularen Verabreichung vorliegen, bei den Patienten vermieden werden können. Weitere Vorteile sind auch der Wegfall einer Ver­ zögerung von einigen Tagen, bis die RSV-Antikörper eine Spitze in ihrer Zirkulation erreichen und die Eliminierung eines lokalen Abbaus. Darüber hinaus muß nur weniger Produkt intravenös verabreicht werden, um das gleiche Ni­ veau an Antikörpern zu erzielen, welches man mit einem intramuskular verabreichten Produkt erhält oder man kann höhere Dosen intravenös verabreichen, um höhere Titer zu erzielen, wie sie andererseits nur schwierig bei intra­ muskularen Verabreichungen erhalten werden können.

Diese und weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung kön­ nen in der nachfolgenden Weise erhalten werden:

Normales Plasma von einem Donor wird auf natürlich vor­ kommende Antikörper gegen RSV unter Verwendung einer ELISA oder einer anderen, gleich empfindlichen Screening- Methode (z. B. RIA) bei einem äquivalenten Titer geprüft. Um bei der Methode und dem Produkt gemäß der Erfindung wirksam zu sein, sollte das "ausgewählte" Plasma von den Donoren ein Antikörpertiter gegen RSV haben, der etwa 5 mal so groß ist wie der Antikörpertiter gegenüber RSV, den man bei "normalen" Donoren findet (Clin. Exp. Immunol., 52, 412-422 (1983)).

Der Ausdruck "etwa 5 mal so groß wie der Antikörpertiter gegen RSV" bedeutet, daß er Niveaus einschließt, die etwas unterhalb des 5-fachen oder etwas größer als das 5-fache liegen und einen Durchschnitt von etwa dem 5-fachen gegenüber RSV, wie er bei normalen Donoren gefunden wird, ergeben. Es wurde festgestellt, daß das geometrische Mittel des Antikörpertiters gegen RSV bei den meisten Donoren etwa 1 : 25.000 beträgt (nachfolgend als "Normal"-Titer bezeichnet) und daß etwa 2 bis 4% der Plasmadonoren einen Antikörpertiter gegen RSV haben, der etwa 5 mal dem normalen Titer ("ausgewählten" Titer) entspricht.

Es wurde weiterhin gefunden, daß ein geometrischer mitt­ lerer Titer von 39 "ausgewählten" Plasmaproben etwa 1 : 110.000 beträgt. Infolgedessen soll, damit es bei der Methode und dem Produkt der vorliegenden Erfindung wirksam ist, das "ausgewählte" Plasma von Donoren einen Antikörpertiter gegen RSV haben, der gleich oder größer als etwa 1 : 110.000 ist.

Im allgemeinen wurde festgestellt, daß das aus Plasma gebildete Immunglobulin als Ergebnis des Herstellungs­ verfahrens einen Antikörpertiter aufweist, der etwa dem 5-fachen des Antikörpertiters entspricht, der in dem Ausgangsplasma gefunden wurde. Man kann deshalb erwarten, daß der Antikörpertiter gegen RSV in dem aus Normalplasma gebildeten Immunglobulin, nachfolgend als normales Immun­ globulin bezeichnet, etwa 1 : 125.000 ist. Es wurde je­ doch festgestellt, daß ein geometrisches Mittel aus 23 normalen Immunglobulinen tatsächlich etwa 1 : 165.000 betrug. Infolgedessen kann man erwarten, daß RSV-Immun­ globulin, das aus den ausgewählten Plasmaproben hergestellt wurde, basierend auf den obigen Feststellungen, einen Titer von etwa 1 : 600.000 hat. Das nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte RSV-Immunglobulin kann somit einen Antikörpertiter gegen RSV von wenigstens etwa 1 : 250.000 bei einer Globulinkonzentration von etwa 5% und noch bevorzugter von wenigstens etwa 1 : 400.000 und ganz besonders bevorzugt von wenigstens etwa 1 : 600.000 haben. Dabei bleibt festzuhalten, daß von den obigen Begrenzungen die niedrigste Begrenzung kritisch ist für die Definition des erfindungsgemäßen Anti-RSV-Immunglo­ bulins mit hohem Titer. Obwohl eine obere Begrenzung von 1 : 1.000.000 für die Praxis annehmbar ist, ist es möglich, daß man höhere Titer erhalten könnte, wenn man eine weitere Auswahl vornimmt oder das Globulin weiter konzen­ triert.

Die vorerwähnten minimalen Antikörpertiter gegen RSV- Immunglobulin, hergestellt aus ausgewähltem Plasma nach der erfindungsgemäßen Methode, basieren auf einer übli­ chen Konzentration, d. h. einer 5%-igen Lösung des Anti- RSV-Immunglobulins mit hohem Titer. Für den Fachmann liegt es aber auf der Hand, daß durch Konzentrieren der 5%-igen Lösung, z. B. auf eine 10%-ige oder 15%-ige Lösung, die erwähnten Titer proportional höher sein wür­ den.

Die Methode, mit welcher das Plasma gescreent wird, d. h. die ELISA-Methode, wird im wesentlichen von Engvall und Perlmann, J. Immunol., 109, 129-135 (1972), Engvall et al, Biochemica Et Biophysica Acta, 251, 427-434 (1971), Engvall et al, Immunochemistry, 8, 871-874 (1971), be­ schrieben, die alle in die vorliegende Offenbarung einge­ schlossen werden. Das Assay ist eine einfache Methode für die quantitative Bestimmung von Antikörpern. Mikro­ titerplatten, die mit dem Antigen beschichtet sind, werden mit Antiserum inkubiert und anschließend erfolgt eine enzymmarkierte Herstellung des Antiglobulins. Das in den Vertiefungen nach dem Auswaschen zurückbleibende enzym­ markierte Antiglobulin, welches durch die Addition einer chromogenen Substanz quantifiziert wird, ergibt ein Maß für die Menge des spezifischen Antikörpers im Serum.

Plasma mit einem ausreichend hohen Antikörpertiter (einem ELISA-Titer von wenigstens etwa 1 : 110.000) wird gepoolt und fraktioniert unter Erhalt eines Immunglobulins mit einem hohen Antikörpertiter gegenüber RSV. Man kann jede Methode zur Herstellung von intravenös injizierbarem Immunglobulin aus dem gepoolten Plasma anwenden. Beispiels­ weise kann man die Cohn-Fraktionierungsmethode (in den nachfolgend angegebenen Druckschriften beschrieben, die alle hier eingeschlossen werden), eine Ammoniumsulfat- Fraktionierung, eine Polyethylenglykol-Ausfällung oder dergleichen anwenden. Das vorerwähnte Immunglobulin umfaßt IgG, im allgemeinen zumindest 90% IgG-Monomer. Das Ma­ terial enthält im allgemeinen weitere Globuline, wie IgA, IgM und dergleichen.

Diese Plasmas mit hohem Titer werden gepoolt und einer Cohn-Fraktionierungsmethode unterworfen, unter Erhalt einer Fraktion II (Cohn et al, J. Am. Chem. Soc., 68, 459 (1946) und Oncley et al, ibid. 71, 541 (1949)).

Das so erhaltene Hyperimmunglobulin kann intravenös in­ jizierbar gemacht werden, indem man es nach der Methode von Tenold "Intravenously Injectable Immune Serum Glo­ bulin", US-PS3n 4 396 608 und 4 489 073 oder von Pappen­ hagen et al, "Pharmaceutical Compositions Comprising Intravenously Injectable Modified Serum Globulins, Its Production and Use", US-PS 3 903 262 (die alle hiermit in die Offenbarung einbezogen werden), behandelt. Bei der Methode gemäß US-PS 3 903 262 erfolgt eine Modifi­ zierung des Immunglobulins durch Reduktion und Alkylie­ rung, wodurch es intravenös injizierbar wird. Bei den Methoden gemäß US-PSen 4 396 608 und 4 499 073 werden der pH-Wert und die Ionenstärke einer Lösung des Immunglobulins eingestellt, um es intravenös injizierbar zu machen.

Die erfindungsgemäße Hyperimmunglobulin-Zubereitung kann auch Maltose als Stabilisator gemäß der Lehre von US-PS 4 186 192 enthalten. Infolgedessen kann die vor­ liegende Zubereitung etwa 1 bis 20% Maltose auf einer Gewicht-zu-Volumen-Basis enthalten.

Das Hyperimmunprodukt gemäß der Erfindung kann als pharmazeutische Zubereitung hergestellt werden, indem man im allgemeinen wäßrige Lösungen des Hyperimmunglo­ bulins anwendet und die dann für die Prophylaxe oder Therapie verwendet werden können. Die Produkte werden in geeigneter Weise sterilisiert, im allgemeinen durch Sterilfiltration durch ein geeignetes übliches Medium zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen.

Die für eine therapeutische Anwendung beabsichtigte pharmazeutische Zusammensetzung sollte eine therapeuti­ sche Menge des hyperimmunen Globulins freigeben, d. h. eine Menge die erforderlich ist, um präventiv oder hei­ lend bei der Behandlung von RSV-Infektionen zu wirken.

Die Erfindung wird weiterhin in den nachfolgenden, beschrei­ benden Beispielen erläutert.

ASSAY-METHODE

Die ELISA-Methode war im wesentlichen die gleiche, wie sie von Engvall und Perlman beschrieben wird und von Carlsson et al, Inf. Imm., 6, (5) 703-708 (1972) für die Titrierung von Anti-Salmonella-Immunoglobulinen verwendet wird. Die Methode wurde zuvor für Mikrotiter­ platten angepaßt (Voller et al, Manual of Clinical Immunology, 1976, 506-512), bei dem man visuelle Endpunk­ te mit einer guten Empfindlichkeit bestimmen kann (Pox­ ton, J. Clin. Path., 32, 294-295 (1975), Voller et al, supra).

Vertiefungen in Polystyrol-Mikrotiterplatten mit rundem Boden wurden durch Zugabe von 0,1 ml der optimalen Ver­ dünnung von RSV-Antigen in Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH-Wert 9,5) sensibilisiert und für annähernd 18 Stunden bei 4°C inkubiert. RSV-Antigen wurde von MA Bioproducts (Walkersville, Maryland, USA) als rohes, komplement­ fixierendes Antigen erhalten. Die Platten wurden einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 0,05% Tween 20 und 0,02% Natriumazid (PBSTA) gewaschen. 5% Rinderserumalbumin (BSA), 0,1 ml, wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden dann weiter 4 bis 5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann einmal gewaschen. Die Platten wurden nach dem letzten Waschen trockengeschüttelt. Verdünnungen von Antisera wurden zu jeder Vertiefung (0,1 ml) zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal wie vorher beschrieben gewaschen und 0,1 ml eines Ziegen- Antihuman-IgG, konjugiert gegenüber alkalischer Phospha­ tase (Miles Laboratories Inc.) wurde zu jeder Vertiefung gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach nochmaligem Waschen der Vertiefungen wurden 0,1 ml einer 1,0%-igen (G/V) Lösung von Enzymsubstrat, p-Nitrophenyl­ phosphat (Sigma Chemical Co.) in 10%-igem Diethanolamin­ puffer (pH 8,0) mit 0,02% Natriumazid und 1 mM MgCl₂ zu­ gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von 0,05 ml 3 N NaOH zu jeder Vertiefung abgebrochen. Die Absorption wurde bei 405 nm mit einem Dynatech Modell 580 Mikro-ELISA-Ableser abgelesen. Der Endpunkt wurde festgelegt als die höchste Verdünnung bei einer Absorption von 0,010.

Beispiel 1

Plasmaspenden, die von Donoren erhalten wurden, wurden auf Antikörper gegen RSV durch die ELISA-Methode gescreent.

Die Plasmaspenden mit einem durchschnittlichen RSV-Anti­ körpertiter von etwa 1 : 25.272 ("nicht ausgewählt") wur­ den gepoolt und nach der Methode von Pappenhagen et al, US-PS 3 903 262 fraktioniert, unter Erhalt eines intravenös injizierbaren "normalen" Immunglobulins. Die Antikörper­ titerdes "nicht-ausgewählten" Plasmapools und des "normalen" Immunglobulins, welches daraus hergestellt wurde, wer­ den in Tabelle 1 gezeigt.

Proben von Plasmaspenden mit einem geometrischen Mittel an RSV-Antikörpertiter von etwa 1 : 106.738 wurden aus­ gewählt ("ausgewählte Plasmaproben"). Der geometrische Mittel-Titer wird in Tabelle 1 zum Vergleich gezeigt.

Die Fraktionierungsmethode von Pappenhagen et al gemäß US-PS 3 903 262 oder die von Tenold, US-PSen 4 396 608 und 4 499 073, können zur Herstellung des erfindungsgemäßen Produktes verwendet werden. Obwohl die Antikörper­ titer des RSV-Hyperimmunglobulins, welches nach der Me­ thode von Pappenhagen et al gebildet wurde oder nach der Methode von Tenold nicht zur Verfügung stehen, kann man erwarten, daß die mittels ELISA gemessenen Antikör­ pertiter im wesentlichen die gleichen sind, unabhängig davon, welche Methode angewendet wurde. Man kann vorher­ sehen, daß der geometrische Mitteltiter des Antikörpers gegenüber RSV etwa 1 : 533.690 sein sollte, d. h. etwa das 5-fache des Antikörpertiters gegen RSV bei der "aus­ gewählten" Plasmaprobe.

TABELLE 1

RSV-Antikörpertiter, bestimmt durch ELISA

Unter Berücksichtigung der vorhergehenden Offenbarung liegt es auf der Hand, daß Veränderungen für den Fach­ mann offensichtlich sind. Beispielsweise kann man durch Verwendung von Anti-RSV-monoklonalen Antikörpern es er­ möglichen, solche Hochtiterprodukte herzustellen. Im Falle eines Immunglobulins mit sehr hohem Titer kann es praktisch sein, das Produkt intramuskular zu verabrei­ chen. Deshalb sollen die vorhergehenden Beispiele nur beschreibend sein und der Umfang der Erfindung sollte lediglich durch die Patentansprüche beschränkt werden.

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung von intravenös injizier­ barem Immunglobulin mit einem Antikörpertiter ge­ genüber dem respiratorischen Syncytialvirus von we­ nigstens etwa 1 : 250.000 bei einer Globulinkonzen­ tration von etwa 5 Gew.%, bestimmt durch eine enzym­ verbundene Immunosorbens-Assay, welche die folgenden Stufen umfaßt:

• (a) Screening-Plasma von Donoren für einen Antikörpertiter gegenüber dem respiratorischen Syn­ cytialvirus von wenigstens etwa 1 : 110.000, bestimmt durch enzymverbundene Immunosorbens-Assay,
• (b) Poolen des gemäß Stufe (a) ausgewählten Donorplasmas,
• (c) Herstellen eines Immunglobulins aus dem gemäß Stufe (b) gepoolten Plasma, und
• (d) Zubereiten des gemäß Stufe (c) erhaltenen Immunoglobulins zum intravenös Injizierbarmachen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem in Stufe (c) das Immunglobulin nach der Cohn-Fraktionierungsmetho­ de hergestellt wurde.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem in Stufe (d) das Immunglobulin reduziert und alkyliert wird, um es intravenös injizierbar zu machen.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem in Stufe (d) das Immunoglobulin in Form einer Lösung zur Verfü­ gung gestellt wird, und der pH und die Ionenstärke der Lösung so eingestellt werden, daß es intrave­ nös injizierbar ist.

5. Intravenös injizierbares Immunglobulin mit einem Antikörpertiter gegenüber dem respiratorischen Syn­ cytialvirus von wenigstens etwa 1 : 250.000 bei einer Globulinkonzentration von etwa 5 Gew.%, bestimmt durch enzymverbundene Immunosorbens-Assay.

6. Pharmazeutische Zubereitung, umfassend eine Menge an einem intravenös injizierbaren Immunglobulin gemäß Anspruch 5, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür.

7. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 6, die weiterhin Maltose einschließt.

8. Globulin gemäß Anspruch 5, bei welcher der Titer bei einer Globulinkonzentration von etwa 5 Gew.% in Was­ ser im Bereich von etwa 1 : 250.000 bis 1 : 1.000.000, bestimmt durch eine enzymverbundene Immunosorbens- Assay, liegt.