DE2508132A1

DE2508132A1 - Neue immunoglobulinderivate, verfahren zu deren herstellung und derartige massen enthaltende praeparate

Info

Publication number: DE2508132A1
Application number: DE19752508132
Authority: DE
Inventors: Tokio Hino; Sachio Ishimoto; Yasuhiko Masuho; Kimihiko Matsuzawa; Kazuo Satake; Katsuhiko Tomibe; Tsuneo Watanabe
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1974-03-08
Filing date: 1975-02-25
Publication date: 1975-09-11
Also published as: GB1497928A; NO750768L; FR2262996A1; SE403703B; FR2262996B1; US4059571A; DK141432C; CA1041997A; AU7872975A; DK93475A; IN138636B; NL167167C; DE2560155C2; DE2508132B2; DE2508132C3; CH614426A5; DK141432B; NO144111B; NL167167B; SE7502346L

Description

PATENTANWÄLTE

DR. E. WIEGAND DIPL-ING. W. .MIRAAANN DR. M. KÖHLER DIPL-ING. C GERNHARDT

Mönchen Hamburg 2508132

TELEFON: 555476 8000 M ö N CH E N 2,

TELEGRAMME: KARPATENT MATHI LDENSTRASSE 12

TELEX: 529 068 KARP D

V. 4-2 272/75 - Ko/Ne 25- Februar 1975

Teijin Limited Osaka (Japan)

Neue Immunoglobulinderivate, Verfahren zu deren Herstellung und derartige Massen enthaltende Präparate

Die Erfindung betrifft neue Immunoglοbulinderivate und wässrige Massen zur Injektion, die diese Globulinderivate enthalten. Die Erfindung befasst sich auch mit einem Verfahren zur Herstellung der neuen Immunoglobulxnderivate.

Mit den letzten Fortschritten auf dem Gebiet der Proteinchemie wurde die Beziehung der Struktur mit Funktionen des Immunoglobulins, welches eine wichtige Rolle für die medizinisch äusserst signifikante Humoralimmunität spielen, beleuchtet.

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Die letzten Studien ergaben, dass das Immunoglobulin in fünf Typen unterteilbar ist, d. h. IgG, IgA, IgM, IgD und IgE, wovon IgG nicht weniger als 70 Gew.% einnimmt.

Die Immunoglobuline, ausgenommen IgM, sind jeweils hauptsächlich aus vier Peptidketten aufgebaut und einige Disulfidbindungen sind in den Interketten und den Intraketten vorhanden. Beispielsweise kann das IgG, das typischste der Immunoglobuline, falls es mit Papain digeriert wird, in zwei Fragmente "Fab" mit Antigenbindungsaktivität und einem Fragment "Fc" mit Komplement- und Gewebebindungsaktivität fraktioniert werden. Es wurde weiterhin festgestellt, dass das IgG aus zwei Polypeptidschwerketten (Η-Ketten) und zwei Polypeptidleichtketten (L-Ketten) ausgebaut ist, welche stark durch Disulfidbindungen und nichtkovalente Bindungen unter Bildung eines Proteinmoleküls mit einem Molekulargewicht von etwa 160 000 verbunden sind, und dass das Molekül durchschnittlich etwa 4,5 Interkettendisulfidbindungen und etwa 12 Intrakettendisulfidbindungen enthält (B. Frangione & C. Milstein; J. Mol.Biol., Band 33, Seite 893 (1968)).

Bezogen auf die vorstehenden empirisch festgestellten Sachverhalte wurden verschiedene Untersuchungen hinsichtlich von Immunοglobulin für intravenöse Injektion unternommen. Die Verwendung des Immunoglobulins erreichte einen raschen Fortschritt nach der Beendigung der Cohn-Fraktionierung (E.G. Cohn und Mitarbeiter; J. Amer. Chem. Soc., Band 68, Seite 459 (1946)).

Cohn und Mitarbeiter fraktionierten eine grosse Menge menschlichen Plasmas durch Äthanolausfällung. Die Fraktion II war überwiegend IgG, welches kleinere Mengen an IgA und IgM enthielt, und zeigte Antikörperaktivität gegen verschiedene Mikroorganismen, die Infektionskrankheiten verursachen. Deshalb ist die Verabfolgung der Fraktion II

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wirksam für die Prophylaxis und die Therapie von Virusinfektionskrankheiten, wie Masern, Viia lhepatitis und dgl., sowie Infektionskrankheiten von gegenüber Antibiotika beständigen Bakterien, wie Streptococcus aureus.

Die einzige bisher zur Verabfolgung des auf diese Weise fraktionierten und abgepassten Immunoglobulins angewandte Massnahme war die intramuskuläre Injektion. Jedoch kann die intramuskuläre Injektion lediglich PartialOsmosen der Injektionsflüssigkeit in den Körper bewirken und ist unfähig, einen Zwischeneffekt zu zeigen. Weiterhin erlaubt die intramuskuläre Injektion nicht die Verabfolgung grosser Mengen. Deshalb ist das Auffinden eines Immunoglobulins, welches für intravenöse Injektion geeignet ist, nötig.

Die intravenöse Injektion des bekannten Immunoglobulins verursacht heftige pyrogene und cardiovaskuläre Reaktionen, welche besonders gefährlich bei agammaglubilinämisehen Patienten sind. Diese ungünstigen Reaktionen der intravenösen Injektion werden durch Aggregate von Immunoglobulin, die in der Fraktionen des Immunoglobulins enthalten sind, verursacht. Das aggregierte Immunoglobulin bindet mit Komplement und Gewebe, ähnlich zum Antigen-Antikörperkomplex, so dass sich unzulässige Reaktionen ergeben, die durch den im Körper ausgebildeten anaphylaktischen Faktor verursacht werden. Die unzulässigen Reaktionen können deshalb verhindert werden, wenn die von dem abgepassten Immunoglobulin durch Ultrazentrifugierung mit 100 000 g abgetrennte überstehende Flüssigkeit verwendet wird, Jedoch findet unvermeidlich eine langsame Reaggregierung in dem auf diese Weise behandelten Immunoglobulin statt.

Im Hinblick auf eine sichere intravenöse Injektion von Immunoglobulin wurden zahlreiche Untersuchungen unternommen. In der Schweiz wurde versucht, das Immunoglobulin

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einer pH 4-Behandlung zur zeitweiligen Denaturierung seines Fc-Teiles zu unterwerfen, so dass dieses für die intravenöse Injektion geeignet wird (S. Barandun und Mitarbeiter; Vox Sang, Band 7, Seite 157 (1962)). Jedoch ist die Behandlung unvollkommen und die unzulässigen Reaktionen werden gelegentlich noch beobachtet.

Pepsinbehandeltes Immunoglobulin wird technisch für intravenöse Injektion geliefert (H. Koblet, S. Barandun und H. Diggelman; Vox Sand, Band 13, Seite 92 (1967)). Da 60 bis 80 % des behandelten Immunoglobulins aus dem Fragment F(ab')p aufgebaut sind, wird in vivo die Injektionsflüssigkeit rasch geschädigt, wie sich durch ihre Halbwertslebenszeit von einigen Stunden zeigt, was einige Zehntel derjenigen des unbehandelten Immunoglobulins ist (B. Jager; Arch. Intern, Med., Band 119, Seite 60 (1967)). Eine weiterhin verbesserte Injektionsflüssigkeit kann erhalten werden, wenn das Papain durch Plasmin als Behandlungsmittel ersetzt wird, jedoch hat das Verfahren den Fehler, dass das Plasmin später nicht entfernt werden kann (L.S. Hanson & B.G. Johonson; Int. Arch. AHergy, Band 31, Seite 380 (1967)).

In letzter Zeit wurde vorgeschlagen, selektiv hauptsächlich die Interkettendisulfidbindungen des Immunoglobulins zu spalten und die gebildeten Schwefelatome (S-) zu S-alkylieren und Immunoglobulinderivate mit verringerten unerwünschten Reaktionen für die intravenöse Injektion zu verwenden.

Beispielsweise ist als ein Versuch zur Spaltung der Interkettendisulfidbindungen des Immunoglobulins, um Polypeptidketten zu erhalten, das Verfahren von S. T. Stevenson und Mitarbeiter (Bio. Chein., J., Band 118, Seite 703 (1960)) bekannt, welches in der reduzierenden Spaltung der Interkettendisulfidbindungen von menschlichen Immuno-

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globulin G in Dithiothreitol und der S-Alkylierung desselben in Jodacetamid besteht. Das Verfahren erfordert jedoch zweistufige Reaktionen und weiterhin besteht das Produkt aus S-alkylierten Polypeptiden, die eine potentielle Gefahr für eine neue Antigenizität darstellen. Weiterhin ist es in keiner Weise einfach, den S-Teil in Thiolgruppen zu überführen. Deshalb ist es auch schwierig, hiervon ein brauchbares Mittel abzuleiten, indem dieses auf einem Träger beispielsweise einem geeigneten Polymeren, unter Anwendung des aktiven Thiols getragen wird.

Das Franek-Verfahren (F. Franek, Coil. Azeck. Chem. Commun., Band 29, Seite 1401 (1964) besteht in der Behandlung von Schweineimmunoglobulin mit Natriumsulfit und Kupfer(II)-ionen zur Bildung von S-sulfoniert en Polypeptiden,

Jedoch ergaben wiederholende Versuche des vorstehenden Verfahren von Franek und Mitarbeiter, Schwierigkeiten auf Grund des Verfahrens

(i) dass die erhaltenen denaturierten Polypeptide Kupfer oder Kupfer(II)-ionen enthalten* wobei die Entfernung des Kupfers oder der Kupfer(II)-ionen aus dem Produkt äusserst schwierig oder praktisch unmöglich ist;

(ii) dass die denaturierten Polypeptide rasch eine verringerte Antigenbindungsaktivität zeigen, wenn sie die gewünschte niedrige Antikompiementaktivität haben könnten, und

(iii) dass die ursprüngliche Konformation des Immunoglobulins gestört und geändert wird, wie durch optische Drehungsmessungen bestätigt, wie in den später angegebenen Vergleichen und Kontrollen gezeigt.

Die Tatsache, dass es praktisch unmöglich ist, den kleinen Rest an Kupfer aus dem denaturierten Polypeptidprodukt von Pranek und Mitarbeitern zu entfernen, belegt, dass dieses. Produkt thermisch unstabil ist, zur Bildung von

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. Aggregaten fähig ist und offensichtlich physiologisch unerwünscht ist, wenn es für intravenöse Injektion verwendet wird (D. A. Derber; Arthritis and Rheumatism, Band 17, Seite 85 0974)).

Eine Aufgabe der Erfindimg besteht deshalb in neuen Iffiisunoglobulinderivaten, die weder Kupfer noch Kupfer(II)-ionen enthalten, worin entweder die Interkettendisulfidbindungen, welche zwei Polypeptidschwerketten (H-Ketten) und zwei Polypeptidleichtketten (L-Ketten) im Immunoglobulin verbinden, selektiv gespalten sind oder ausser den angegebenen Interkettendisulfiabindungen einen Teil der Intrakettendisulfidbindungeii gespalten sind und die gespaltenen Schwefelatome (-S) S-sulfoiiiert sind, sowie in neuen wässrigen Wasser sur Injektion, die die neuen Immunoglobulinderivate enthalten, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.

Eice weitere Aufgabe der Erfindung besteht in neuen I^Lüiüoglobulinderivaten, welche eine verringerte Antikasplemeßtaktivität haben und eine ausgezeichnete hohe Antikorperaktivität während längerer Zeiträume im menschlischen Körper beibehalten können, sowie ±n einem Verfahren zu deren Herstellung.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in neuen Isaaunoglobulinderivaten, die nur wenige nachteilige Reaktionen zeigen und eine ausgezeichnete Antikörpsraktivität haben und die das native Immunoglobulin in vivo rekonstruieren können., intravenös injizierbaren Massen, die die neuen Derivate enthalten sowie Verfahren zu deren Herstellung.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in neuen Iffiisunoglobulinderivaten, welche durch selektive Spaltung praktisch lediglich der Interkettendisulfidbindungen, welche die schweren Ketten (Η-Ketten) und die leichten l&bten (L-Ketten) des Immunoglobulins verbinden_$ und praktische

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S-SuIfonierung der gebildeten Schwefelatome gebildet wurden, wässrige Massen für die intravenöse Injektion, die diese enthalten, sowie Verfahren zu deren Herstellung.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung der vorstehend aufgeführten Immunoglobulinderivate von einheitlicher Qualität und Stabilität.

Gemäss der Erfindung werden die vorstehenden Aufgaben und Vorteile durch neue Immunoglobulinderivate erreicht, worin die Interkettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins überwiegend gespalten sind, so dass eine Spaltung vor durchschnittlich 3 bis 5 Interkettendisulfidbindungen verursacht wird, oder die Interketten- und Intrakettendisulfidbindungen gespalten sind, wobei die gebildeten Schwefelatome (-S) S-sulfoniert sind (-S-SO^).

Insbesondere sind die neuen Immunoglobulinderivate gemäss der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass durchschnittlich etwa 3 bis 4,5, insbesondere etwa 4,5 der Interkettendisulfidbindungen des natürlichen Immunoglobulins selektiv gespalten sind, und dass die dabei gespaltenen Schwefelatome S-sulfoniert sind und dass sie weiterhin praktisch keine oxidierenden Metallionen, wie Kupfer(II)-ionen, enthalten.

Weiterhin, falls irrelevant für die Stellen der gespaltenen Disulfidbindungen spezifiziert, sind die neuen Immunoglobulinderivate dadurch gekennzeichnet, dass:

(1) sie durch Spaltung durchschnittlich von 3 bis 5 Interketten- oder 3 bis 5 Interketten- und Intrakettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins und S-Sulfonierung (-S-SO^) der hierbei gespaltenen Schwefelatome gebildet wurden und dass

(2) die Immunoglobulinderivate mindestens 1,0 I.E./ml des Titers von Anti-Diphtherie bei ihrer Konzentration von 10,0 Gew.% enthalten.

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Die Immunoglobulinderivate geinäss der Erfindung liefern wasserlösliche Massen, die zur Herstellung von Injektionsflüssigkeiten brauchbar sind, wenn sie mit Löslichmachungsmitteln, -die für Menschen ungefährlich sind, vermischt werden. Auch durch Auflösung der wasserlöslichen Massen in Wasser können wässrige Massen für intravenöse Injektion erhalten werden.

Besonders bevorzugte Immunoglobulinderivate gemäss der Erfindung sind solche, worin durchschnittlich praktisch 4,5 Interkettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins gespalten sind und deren auf diese Weise gebildeten Schwefelatome (praktisch 9 Atome durchschnittlich) S-sulfoniert (-S-SO,) sind. Gemäss den vorliegenden Untersuchungen werden diese bevorzugten Immunoglobulinderivate gebildet, wenn die allein die Η-Ketten und L-Ketten des nativen Immunoglobulins verbindenden Interkettendisulfidbindungen praktisch gespalten sind und die dabei gebildeten Schwefelatome S-sulfoniert sind.

Die neuen Immunoglobulinderivate gemäss der Erfindung können durch Umsetzung von nativem Immunoglobulin mit

(A) einer zur Bildung des Tetrathionations fähigen Verbindung und

(B) einer zur Bildung von Sulfitionen in Wasser fähigen Verbindung zur Spaltung von durchschnittlich 3 bis 5 der Interkettendisulfidbindungen oder deren Inter- und Intrakettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins und gleichlaufende S-Sulfonierung (-S-SO^) der auf diese Weise gebildeten Schwefelatome hergestellt werden.

Nach dem vorliegenden Verfahren ist es möglich, in erster Linie die Interkettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins überwiegend zu spalten.

Deshalb können die Immunoglobulinderivate gemäss der Erfindung, worin durchschnittlich 3 bis 4,5 intramolekulare

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Disulfidbindungen des nativen Immunoglobulins gespalten sind und die gebildeten Schwefelatome S-sulfoniert sind, als Produkte betrachtet werden, worin praktisch die Interkettendisulfidbindungen allein des nativen Immunoglobulins gespalten sind und die erhaltenen Schwefelatome S-sulfoniert sind.

Das Verfahren gemäss der Erfindung wird im wesentlichen in Wasser ausgeführt, jedoch ist das Medium in keiner Weise auf Wasser begrenzt, sondern es können auch andere wässrige Medien verwendet werden, sofern sie für die Reaktion gemäss der Erfindung nicht schädlich sind.

Gemäss der Erfindung wird natives Immunoglobulin mit

(A) einer Verbindung, die zur Bildung des Tetrathionations fähig ist, und

(B) einer Verbindung, die zur Bildung eines Sulfitions in Wasser fähig ist, zur Spaltung von durchschnittlich 3 bis 4,5 Interkettendisulfidbindungen oder zusätzlich zu den praktisch gesamten Interkettendisulfidbindungen eines kleineren Betrages an Intrakettendisulfidbindungen umgesetzt, wobei die Anzahl der gespaltenen intramolekularen Disulfidbindungen maximal durchschnittlich 5 nicht übersteigen, wobei praktisch sämtliche der dabei gebildeten Schwefelatome S-sulionisiert sind.

Als Verbindung (A), welche zur Bildung des Tetrathionations in Wasser fähig ist, werden Tetrathionsäure, Alkalisalze hiervon, wie Natriumtetrathionat, Kaliuiatetrathionat und dgl., und wasserlösliche Salze hiervon, wie Ammoniumtetrathionat, bevorzugt, obwohl auch andere Verbindungen verwendet werden können, sofern sie das Tetrathionation in Wasser bilden können.

Typische Beispiele für Verbindungen (B), welche des Sulfition in Wasser liefern können, umfassen schweflige Säure, Natriumsulfit, Kaliumsulfit und Natriumbisulfit,

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wobei jedoch, auch andere Verbindungen verwendet werden können ,sofern sie Sulfitionen in Wasser bilden können.

Die Verbindung (A), welche zur Bildung des Tetrathionations in Wasser fähig ist, wirkt als Oxidationsmittel. Hingegen dient die Verbindung (B)₁ die das Sulfition in Wasser bildet, als Reduzierungsmittel, sowie als S-rSulf onierungsmittel.

Die Mengen von Sulfitionen und Totrathionation sollten jeweils nicht weniger als die2fache molare Menge der Interketten- oder Inter- und Intrakettendisulfidbindungen (-S-S-Bindungen) des als Ausgangsmaterial dienenden, zu spaltenden nativen Immunoglobulins sein» Sie können bis hinauf zu jeweils der 100fachen molaren Menge der zu spaltenden Bindungen oder sogar noch, höher liegen.

Es wird bevorzugt, dass die Verbindungen (A) und (B), insbesondere (B), in Wasser oder einer Pufferlösung vor Ihren Zusatz zu dem Reaktionssystem gemäss der Erfindung gelöst werden.

Die nach dem vorliegenden Verfahren stattfindende Reaktion kann so beschrieben werden, dass die Interkettendißülfidbindungen des nativen Immunoglobulin durch das Sulfition gespalten werden, eines der Schwefelatome in eine S-Sulfonatgruppe (-S-SO^) und das andere zur Thiolgruppe (-SH) gespalten werden und jeweils zwei der dabei gebildeten ihiolgruppen durch das Tetrathionation zur Bildung eines Disulfidbindung oxidiert werden oder dass die Thiol-Gruppe mit dem Tetrathionation sur Überführung in S-Thiosulfat (-8-S₀O-) reagiert und erneut durch das Sulfition angegriffen wird. Dadurch wiederholt sich die Reaktion. Infolge dieser Reaktion werden die Interkettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins gespalten und die dadurch getrennten Schwefelatome werden in die S-Sulfonatgruppe (-S-SO^) in den schweren Ketten und den leichten

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Ketten umgewandelt.

Das Verfahren gemäss der Erfindung wird vorzugsweise bei Temperaturen nicht höher als 50° C, insbesondere 10 bis 50° C, speziell 15"bis 48° C, ausgeführt, wobei es auch möglich ist, das erfindungsgemässe Verfahren bei niedrigeren Temperaturen durchzuführen.

Normalerweise besteht bei hohen,50° C übersteigenden Temperaturen, insbesondere oberhalb 55 G» eine Neigung, dass das native Immunoglubolin denaturiert wird und eine Spaltung der Intrakettendisulfidbindungen stattzufinden beginnt. Deshalb sollten derartig hohe Temperaturen verii^eden werden.

Beim vorliegenden Verfahren sollte die Anwesenheit von solchen proteinstörenden Mitteln, wie Harnstoff oder Guanidin, welche bei der S-SuIfitolyse von Insulin oder Ribonuclease (J. L. Bailey und Mitarbeiter, L. Biol. Chem., Band 234, Seite 1733 (1959)) eher vermieden werden. Falls verwendet, sollte jedoch das quantative Verhältnis dieses Störungsmittels (perturbing agent) nicht mehr als 2,0 Mol je Mol des nativen Immunoglobulins betragen.

Die Reaktionszeit unterscheidet sich in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie Art des Immunoglobulins, Menge der Reaktionsteilnehmer, Reaktionstemperatur und Anwesenheit eines Denaturierungsmittels, wie Harnstoff und dgl. Der bevorzugte pH-Wert der Reaktionsflüssigkeit liegt im Bereich von etwa 3»5 bis 10, insbesondere 6 bis 9. Bei einem pH-Wert niedriger als 3»5 zeigt sich eine Neigung zur Spaltung der Intrakettendisulfidbindung im Fc-Teil des nativen Immunoglobulins. Hingegen wird bei einem pH-Wert oberhalb 10 das globulinbildende Protein denaturiert, was zu solchen nachteiligen Ergebnissen, wie Hemmung der Antikomplementaktivitätsverringerung und Verringerung der Antigenbindungsaktivität, führte

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Es bestellt keine kritische Reihenfolge für den Zusatz der Reaktionsteilnehmer zu dem Reaktionssystem gemäss der Erfindung.

NaQh der Reaktion wird das Reaktionsgemisch einer anschliessenden Dialyse gegen Wasser oder eine geeignete Pufferlösung, wie Salzlösung mit einem Gehalt von 0,01m-Phosphatpuffer (pH 7,4-) und 2,5 % Glycin unterzogen, worauf die neuen Immunoglobulinderivate gemäss der Erfindung erhalten werden können.

Die neuen Immunoglobulinderivate gemäss der Erfindung können weiterhin in die L-Ketten und Η-Ketten durch Säulenchromatographie unter Anwendung einer mit geeigneten Harzen, beispielsweise Sephadex G-75 gefüllten Säulen, und einem Lösungsmittels, wie 1m-Propionsäure, als Beispiel, getrennt werden.

Die bevorzugten Bedingungen zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens wurden soweit angegeben, wobei das Verfahren jedoch in keiner Weise durch die vorstehenden Vorschriften beschränkt ist.

Es liegt kurz innerhalb des Rahmens des vorliegenden Verfahrens, dass das native Immunoglobulin mit

(A) Tetrathionationen und

(B) Sulfitionen in Wasser in der vorstehenden Weise kontaktiert wird und die Reaktion zur Spaltung überwiegend der Interkettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins und zur S-Sulfonierung der bei der Spaltung freigesetzten Schwefelatome fortgeführt wird.

Die Anzahl der S-SuIfonatgruppen (-S-SO,) in den neuen Immunoglobulinderivaten gemäss der Erfindung kann beispielsweise bestimmt werden, indem das vorliegende Verfahren unter Anwendung von radioaktivem Natriumsulfit ausgeführt wird und die mit S markierten S-Sulfonate in den erhaltenen Immunoglobulinderivaten mit einem Flüssigkeitsscintillationszähler gezählt werden, wie in den späteren Beispielen aisgeführt.

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Die eine Hälfte der durchschnittlichen Anzahl der markierten S-SuIfonatgruppen je Molekül des auf diese Weise bestimmten Immunoglobulinderivates entspricht der durchschnittlichen Anzahl der gespaltenen intramolekularen Disulfidbindungen in dem als Ausgangsmaterial dienenden nativen Immunoglobulin.

Andererseits können die Immunoglobulinderivate, die durchschnittlich etwa 9 S-SuIfo.natgruppen je Molekül enthalten, d. h. die durch Spaltung von durchschnittlich 4-, 5 Disulfidbindungen des nativen Immunoglobulins und S-Sulfonierung der gebildeten Schwefelatome gemäss der Erfindung gebildet wurden, in Η-Ketten und L-Ketten fraktioniert werden, wobei beispielsweise Sephadex G-75 oder G-200 für die Säulenchromatographie, vorzugsweise in Gegenwart einer geringen Menge von Harnstoff oder Guanidin, beispielsweise mit Propionsäure als Lösungsmittel, wie vorstehend abgehandelt, verwendet werden.

Es kann somit jeder Satz von Bedingungen für das vorliegende Verfahren angewandt werden, sofern sie die Herstellung von Immunoglobulinderivaten erlauben, welche durchschnittlich praktisch 9-S-Sulfonatgruppen je Molekül enthalten, die weiterhin in Η-Ketten und L-Ketten bei der angegebenen Säulenchromatographie fraktioniert werden können. Ein derartiger Satz von Bedingungen wurde empirisch bestimmt, wobei die Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen in dem nativen Immunoglobulin in geeigneter Weise durch Einstellung der Reaktionszeit unter den gewählten Bedingungssätzen gesteuert werden kann.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand der Arbeitsbeispiele weiter erläutert, ohne dass die Erfindung auf diese speziellen Ausführungsformen begrenzt ist.

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Die in den Beispielen eingesetzten Reagenzien waren die folgenden:

Menscnlich.es Immunoglobulin I: 15%ige Lösung von menschlichem Immunoglobulin für intramuskuläre Injektion in gepufferter Salzlösung (pH neutral) mit einem Gehalt von 2,5 % Glycin, Produkt der Chems-Sero-Therapeutic Research Institute.

γ-Globulin-Human Fr, II (Human-Immunoglobulin II), Produkt der.Nutritional Biochemicals Corporation (U.S.A.),

Natriumtetrathionat: Unmittelbar vor dem Gebrauch aus Natriumthiosulfat (Na₂S₂Cu*5H₂0) und Jod (J₂) in wässrigem Äthanol hergestellt.

Natriumsulfit: Chemisches Produkt der speziellen Qualität der Komune Kagaku Yakuhin, Co.

Na₂SO₅, markiert mit ^S*: Produkt der New England Nuclear (U.S.A.).

Tris-HCl: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Produkt der Nakarai Kagaku Yakuhin Co., Chemikalie spezieller Qualität für biochemische Untersuchungen mit einem mit wässriger In-HCl reduzierten pH-Wert«

Die Antikörperaktivität und die Antikomplementaktivitätswerte wurden in folgender Weise bestimmt:

Bestimmung des Titers von Anti-Diphtherie

Reaktion: Sensibilisierte positive Hemagglutinationsreaktion (Fussnote 1) wurde angewandt

Bestimmungsverfahren: Mikroplattenverfahren Blutzellen: Menschliche rote Blutzellen vom O-Typ

(Fussnote 2), welche '.mit Formalin und mit BDB (Bis-diazobenzidin) behandelt waren (Fussnote 3) und mit Diphtherintoxoid sensibilisiert waren.

Eontrolle: Standard-Antikörper für Diphtherie (NIH Japan).

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Fussnote 1) NIH-Japanverfahren: R. Murata, Nr. 21 Tokyo Veterinaian & Animal Husbandry (^!75)

Fussnote 2) V. T. Butler: J. Immunol, Band 90, S.eite

C63).
Fussnote 3) J· Dordon, B. Rose, A.H. Sehon: J. Exp.

Med. Band 108, Seite 37 058).

Bestimmung des Antikörpers für Masern, Rubella und Mumps (Fussnoten 4 bis 9)

Reaktion: Mikroplattenverfahren unter Ausnahme von

Masern, wofür das Reagensglasverfahren angewandt wurde.

Antigen: Antigene für die Hemagglutination wurden von Toshiba Chemicals hergestellt.

Kontrollserum: Standard-Antiserum der Toshiba Chemicals, ausgenommen Masern, für die Standard-Antiserum (NIH Japan) verwendet wurde.

Fussnote 4·) Duide por Hemagglutinations Inhibition-Test für Masern nach dem Mikrotiterverfahren: NIH Japan

Fussnote 5) Vorschrift zur Bestimmung des Human Immunoglobulins hinsichtlicht Antikörperaktivität für · Masen: NIH Japan

Fussnote 6) T. Toyama, Clinical Examinations, Band 16, Nr. 2 ο (»72)

Fussnote 7) An Introduction to Virus Empirical Science:

es by NIH Japan Alumni, Maruzen Bookstore ('73)·

Fussnote 8) Empfohlene Vorschriften für Mikrobiologische Reagenzien, US-Dept. of HEW, April 1965.

Fussnote 9) Mumps-HI-Reaktionsverfahren: NIH Japan. Bestimmung der Antikomplementaktivität: Das von Kabat & Mayer "Experimental Immunochemistry" Seite 225 ('61) beschriebene Verfahren wurde angewandt. Eine 1%ige Immunoglobulinlösung mit einem Gehalt vo£ Me,erschweinchenserum, 20 CHc-_n/ml wurde auf

^eöracht . 50 /

mit GVB /auf 37 C während 1 Stunde erwärmt und das ver-

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brauchte Antikomplernent wurde nach diesem Yerfahren bestimmt. Die Antikomplementaktivitätswerte sind durch die Prozentsätze des Verbrauchers für 20 GHcq/πιΙ angegeben.

Beispiel 1

Besiehung der Seaktionsbeäiagungen sur Anzahl der Spaltungen der Bisulfidbindungen
Bedingung I

Zu 51 mg des vorstehend angegebenen menschlichen Immunoglobulins II wurden 36 mg mit^S-markierten NaoSO * und 22 mg Na₂S^p₆, sowie wässrige O,1m-Tris-HCl (pH 8,2) sur Bildung einer Probe von 5,0 ml zugesetzt, welche auf 45 G erhitzt wurde, wobei die anschliessende Reaktion bei dieser Temperatur ausgeführt wurde. Jeweils 0,5 des Heaktionsgeaisches wurden unmittelbar nach Beginn und nach 30 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 7,4 Stunden und 24 Stunden der Reaktion als Probe genommen. •Jede Probe wurde mit 10 ml einer 50%igen gesättigten Ammoniumsulfatlösung unter Eiskühlung vermischt, während 15 Hinuten unter Eiskühlung stehengelassen und der erhaltene Niederschlag zentrifugal abgetrennt. Nach der Wäsche wiederum mit >0%iger gesättigter Ammoniumsulfatlösung wurde der Niederschlag hinsichtlich Hadioaktivität mit sinem Flüssigkeitsscintillationssählgerät gemessen und aus dem Ergebnis die Anzahl der darin enthaltenen -S-SO-;-Gruppen berechnet.
Bedingung II

Bie Umsetzung wurde unter identischen Bedingungen wie der vorstehenden Bedingung I ausgeführt, jedoch während der Reaktion keine Probe genommen* 4 Stunden, nachdem die Reaktion begonnen war, wurde eine wässrige 10m-Harnstoff-

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lösung zu dem Reaktionssystem zugesetzt, so dass die Harnstoffkonzentration darin 4m betrug. Nach einer Umsetzung wahrend 5 und 6 Stunden (bzw. 1 oder 2 Stunden Reaktion nach der Harnstoffzugabe) wurden jeweils 0,5 ml der Reaktionsflüssigkeit als Probe genommen und in gleicher Weise wie die unter Bedingung I genommenen Proben behandelt. Bedingung III

Reaktion und Probebehandlung unter der Bedingung I wurden wiederholt, wobei jedoch die Reaktionstemperatur 0° C betrug. Bedingung IV

Reaktion und Probebehandlung gemäss Bedingung I wurde wiederholt, wobei jedoch die Reaktionstemperatur 25° C betrug. Bedingung V

Reaktion und Probebehandlung gemäss Bedingung I wurde wiederholt, wobei jedoch kein N&2^i\Pß'^2^ verwendet wurde.

Die Ergebnisse der Umsetzungen unter den vorstehenden Bedingungen I, II, III, IV und V sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengefasst.

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Tabelle

Beziehung der Reaktionsbedingun^eiz zur Anzahl der gebildeten

-S-SO₇-Gruppen

Reaktionszeit 0 0,5 1 2 4 5 £ 7,4 24 (Stunden)

Reaktionsbedingung

) 0 6,": 9,0 8,9 9,4 - - 8,9 10,4

II (45⁰C, Harnstoffzusatz - - - ~ -■ 10,9 13,3 nach 4 Std.)

III (O⁰C) 0 0,5 1,6 2,5 2,9 - - 3,4 5,0

IV (25°C) 0,2 1,6 4_Ϋ·: 3,0 4,5 - - 7,0 8,5

V (frei vcs _Q ^- _%Q ^₁ ^₈ _ _ " _ ^₅

Anzahl der gespaltenen Bisulfi(lbindungen entspricht- einer Hälfte der Anzahl der -S-SO,-Gruppen.

Aus den in Tabelle I angegebenen Ergebnissen der Eeaktion lässt sich das Folgende schliessen. Falls das vorliegende Verfahren in Gegenwart von Tetrathionat und Natriumsulfit bei 45° C unter der Bedingung I durchgeführt wird, werden etwa 3 Idsuifidbinaimgen gespalten, wobei der Durcikseimicj etwa 4,5 während 1 bis 7 Stunden Reaktion und etwa 5*2 nach 24 Stunden Reaktion erreicht.

Falls die Reaktion in identisolv/si* Weise, ausgenommen bei 25° G (Bedingung IV) durchgeführt wird, wurde die Anzahl der gespaltenen Eisulfidbindungen verringert, wobei die Anzahl der gespelteüen Bindungen einen durchschnittlichen Wert von etwa 4,3 nach ©insr hohen Reaktionszeit von 24 Stunden erreichte. Falls die Reaktionstemperatur 0° C betrug (Bedingung III), nahm die durchschnitt- ,

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liehe Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen stets ab. Jedoch in Abwesenheit von Hatriumtetrathionat (Bedingung V) zeigte sich ein Versagen der Spaltung der Disulfidbindungen hinsichtlich des glatten Ablaufes. Palis hingegen Harnstoff zu dem Reaktionssystem zugegeben wurde (Bedingung II), nahm die durchschnittliche Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen nach der Harnstoffzugabe rasch zu.

Beispiel 2

■χτ

Vergleich der Beschädigung der physikalischen Eigenschaften, falls NapS^O,- oder Gu⁺⁺ als Oxidationsmittel verwendet wurden

Bedingung I

Zu 2,0 g des vorstehend angegebenen menschlichen Immunoglobulins II wurden 1,4-2 g Na₂SO, und 0,86 g Na₂S₄0₆"2H₂0, 0,1m-Tris-HCl (pH S,2) zugesetzt, um ein Gemisch von 200 ml zu erhalten, welches dann bei einer Anfangstemperatur von 45 C umgesetzt wurde. Unmittelbar nach Beginn der Reaktion und bei 30 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden und 4 Stunden anschliessend wurden jeweils 15 ml der Reaktionsflüssigkeit als Probe genommen. Unmittelbar folgend an die fünfte Probenahme wurde eine 10m-Harnstofflösung zu dem Rest der Reaktionsflüssigkeit zugegeben, um die Harnstoffkonzentration darin auf 4m zu bringen und die Reaktion wurde fortgesetzt. Nach 5 und 6 Stunden der Reaktion ( bzw. 1 und 2 Stunden nach der Harnstoffzugabe) wurden jeweils 22,5 ml der Reaktionsflüssigkeit als Probe genommen und hierzu 22,5 ml einer eiskalten gesättigten Ammoniumsulfatlösung zugsgeben, worauf 30 Kinuten unter Kühlung mit Eis stehengelassen wurde. Der erhaltene Niederschlag wurde zentrifugal abgetrennt,

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mit 50%iger gesättigter Ammoniumsulfatlösung gewaschen und während 24- Stunden gegen gepufferte Salzlösung von pH 7 »4· durch ein Visking-Rohr dialysiert. Nach der Dialyse wurden Proben in der Jeweilig erforderlichen Menge für die spezifische Analyse genommen, welche mit gepufferter Salzlösung von pH 7 »4-, die 2,5 % Glycin enthielt, verdünnt und analysiert wurden.
Bedingung II

Die Reaktion und die Behandlungen gemäss Bedingung I wurden wiederholt, wobei jedoch Na₂S₄Og*2H₂O durch 50 m CuSO.·5H₂O ersetzt wurde, und die Reaktion wurde am Ende der 4. Stunde beendet.

Die dabei erhaltenen Lösungen der verschiedenen Immunoglobulinderivate wurden den folgenden Testen und Bestimmungen unterzogen:

(a) Beziehung von Reaktionszeit und Anzahl der -S-SO,-Gruppen:

Die Anzahl der -S-SO,-Gruppen in den mit Tetrathionat (Na₂S₄Og* 2H₂O) oxidierten Proben sind in der Fig. 1 durch die Leerkreise (o) gleichzeitig mit den entsprechenden Daten, die unter den Bedingungen I und II von Beispiel 1 erhalten wurden, aufgetragen. Die Werte der anderen mit Cu⁺⁺ oxidierten Proben, die in identischer Weise mit der Bedingung I von Beispiel 1 umgesetzt und behandelt wurden, wobei jedoch Na₂S₄O₆*2H₂O durch 50 m CuSO₄*5H₃O ersetzt wurde, sind in Fig. 1 mit schwarzen Punkten (—·—·) aufgetragen.

(b) Beziehung der Reaktinszeit zur Antikomplementaktivität:

Die Antikomplementaktivitäten der durch Oxidation mit Na₂S₄Og*2H₂O unter der Bedingung I von Beispiel 2 erhaltenen Proben, bestimmt nach dem bereits angegebenen Ver-

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fahren, sind in Fig. 2 aufgetragen. Auch, die Antikomplement aktivität en der mit Cu⁺⁺ unter der Bedingung II oxidierten Proben sind aus Fig. 2 ersichtlich. Es ergibt sich aus Fig. 2, dass die Antikomplementaktivitäten sämtlicher Proben auch nicht höher als 30 % nach einer Reaktion von 30 Minuten verringert war.

(c) Beziehung der Reaktionszeit zum Titer von Anti-Diphtherie:

Die gleichen vorstehend unter (b) angewandten Proben wurden 3mal hinsichtlich des Titers der Anti-Diphtherie nach dem bereits angegebenen Verfahren untersucht. Die Abweichung und die Mittelwerte ergeben sich aus Fig. 3. Aus der graphischen Darstellung ist ersichtlich, dass die mit Cu⁺⁺ oxidierten Proben einen bereits nicht höher als 0,3 IE liegenden Titer nach einer Reaktion von 30 Minuten zeigen.

(d) Beziehung der Reaktionszeit und optischen Drehung Die für die Antikomplementaktivitätsbestimmungen nach

(b) vorstehend verwendeten Proben (Proteinkonzentration 2,5 %) wurden hinsichtlich der optischen Drehung untersucht, wobei die Ergebnisse in Fig. 4- enthalten sind. Aus den gezeigten Werten ergibt es sich, dass die Anwesenheit von Kupfer(II)-ionen im Reaktionssystem eine fortschreitende Denaturierung während der Reaktion ergibt und dass die Anwesenheit von Harnstoff die Denaturierung begünstigt, wie sich durch die erhebliche Zunahme der optischen Drehung zeigt.

Die optische Drehung wurde dabei bei 25° C unter Anwendung einer 1 cm-Zelle bestimmt.

(e) Beziehung der Reaktionszeit zur Trübung nach der Wärmebehandlung:

Die gleichen für die Antikomplementaktivitätsbestimmung gemäss (b) angewandten Proben wurden in Luft während 4 Stunden bei 50° G mit einer Konzentration von 2,5 % wärmebehandelt, wobei die in Fig. 5 aufgeführten Ergebnisse

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erhalten wurden. Wie sich aus Fig. 5 ergibt, verursacht die Anwesenheit lediglich einer sehr geringen Menge an Kupfer(II)-ionen eine Schädigung der Wärmestabilität und begünstigt die Neigung zur Aggregation.

(f) Beziehung der Reaktionszeit zum Kupfergehalt: Die gleichen für die Antikomplementaktivitätsbe-

stimmung gemäss (b) angewandten Proben wurden auf ihren Kupfer(II)-ionen-GehaIt durch Atomabsorptionsanalyse bestimmt, wobei die Ergebnisse in Fig. 6 aufgeführt sind. Aus den Werten zeigt es sich, dass, falls Kupfer(II)-ionen angewandt werden, selbst durch Wäsche und Dialyse der Probe der Kupfer(II)-ionen-Gehalt nicht entfernt werden kann.

(g) Trennung der schweren Setten von den leichten Katten:

Die gleiche Probe, wis sie nach 2 Stunden Reaktion unter Bedingimg I von Beispiel 2 erhalten wurde, wurde während 24- Stunden mit In-Propionsäure mit einem Gehalt von 6a-Eernstoff dialysiert und einer Säulanchromatographie mit Sephadex G 200 (1,5 Durchmesser cm χ 80 cm), das mit der angegebßüen wässrigen Lösung ins Gleichgewicht gesetzt worden war, unterzogen, wobei die in Fig. 7 aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden» Die erste Spitze von links der Zeichnung bezeichnet nicht getrennte H^I^-Ketten, die zweite Spitze bezeichnet Η-Ketten und die dritte Spitze bezeichnet L-Ketten. Die Zeichnung belegt, dass die Probe in Η-Ketten und L-Ketten getrennt waren.

Bei einer Zusammenfassung der in den Fig. 1 bis 7 aufgeführten Ergebnisse werden die folgenden Folgerungen erhalten:

(1) Wie sich aus den Ergebnissen der Versuche unter Bedingung I in Beispiel 1 ergibt, beträgt, falls das vorliegende Verfahren in Gegenwart von £etrathionat und Sulfitionen durchgeführt wird, bei jeder Länge der Zeitdauer ia ,

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Bereich von 1 bis 4 Stunden die durchschnittliche Anzahl der gespaltenen Disulfidbindungen etwa 4,5 und die dabei gebildeten Schwefelatome werden S-sulfoniert (durchschnittliche Anzahl der StSuIfonatgruppen etwa 9)» so dass das S-sulfonierte Immunoglobulin erhalten wird (Fig. 1), welches in Η-Ketten und L-Ketteh beispielsweise mittels Chromatographie mit Sephadex G 200-Kolonne (Fig. 7) trennbar ist und eine praktisch identische optische Drehung zu demjenigen des nativen Immunoglobulins hat (Fig. 4).

Auf Grund der vorstehenden Ergebnisse kann für das neue Immunoglobulinderivat mit Sicherheit angenommen werden, dass es praktisch durch Spaltung lediglich der Interkettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins und S-SuIfonierung der gespaltenen Schwefelatome erhalten wurde, und zwar im Hinblick auf die Tatsache, dass die Anzahl der Interkettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins durchschnittlich 4,5 beträgt.

Dieses Immunoglobulinderivat hat eine um nicht mehr als 10 % verringerte Antikomplementaktivität, weit niedriger als diejenige des nativen Immunoglobulins (Fig. 2), zeigt jedoch einen nicht merklich schlechteren Titer der Anti-Diphtherie gegenüber nativem Immunoglobulins, wie sich durch die nahezu äquivalente Antigenbindungsaktivität zeigt. Wie aus Fig. 3 ersichtlich, behält bei einer Konzentration von 10 Gew.% das Immunoglobulinderivat der Antigenbindungsaktivität von mindestens 1,0 ΙΕ/ml bei.

(2) Die durch Spaltung von weniger oder mehr als 4,5 durchschnittlich der Disulfidbindungen des nativen Immunoglobulins, beispielsweise durchschnittlich nicht weniger als 3 oder bis hinauf zu 5i und S-SuIfonierung der Schwefelatome erhaltenen S-sulfonierten Immunoglobulinderivate zeigen eine etwas niedrigere Verringerung ihrer Antikomplementaktivitäten und eine schlechtere Antigenbindungsaktivität im Vergleich zu denjenigen der

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■bevorzugten ImmunoglobulinaeriT-£.ts₅ die Torstsksnä unter

(1) angegeben sind (Fig, 2 und 3)? seigea, gsdoch eine noch merklich verbesserte Antikomplsaientaktivität gegenüber derjenigen von nativea Immunoglobulin.

(3) wenn hingegen 5as Tetratfeicnation als Oxidationsmittel aurch das Kupfer(II)-ion srsetst wird, enthalten die erhaltenen IsmimaglöDiilinaeri-jate aaa Eupfer(II)-ion, wenn auch nur mit sehr gsringen Soils antrat ionen, die erhöht werden, wenn die Esaktiocsaelt länger wird (Fig. 6). Auch die Anzahl der gespaltenen Ii sul fielt indungen des natives. Immunoglobulins nehmen fcei siner Verlängerung der Seaktionsseit zu (Fig. 2), uad infolgedessen ist es schwierig, die gewünschtsn Iiomunoglcbuliiiderivate durch Spaltung von. durchschnittlich praktisch 4,5 Msulfidbindungen des natives. Imrüusoglobulias in stabiler Weise herzustellen.

Darüberhinaus zeigen die uater Anwendung von Kupfer-(Il)-ionen erhaltenen Isnnunoglobulindsrivate eine verringerte AntikOMplesaentaktivität (Fig. 2), jedoch ist ausli glsiciiseitig ihr Anti-»Sipttii-sri5titsr beträchtlich gssenkt i" ¥erglsich su deageEig^E, des ηεχ,±Ύβη Inmunoglobulins, Somit ist aücii ±hre Ajroigeisoifiduiigsaktivitat BMSBBTBi verringert ^fß±s^ 3)=· Dis Ij-Mimoglobulinderivate •^SiCC'*" .r,*;:^ ,jj-i-h fa¹ "^ C -^i-- ^«.?Vt·?:*?-"'" ist,--Ί ·ϊ" '] S^U^d*⁰

fiass

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haiL Sreiiniigsa

glaichfalls mit JsimufiogiobttliiifieriTc/asz- feststellbar, ¥8iöhe gesiäss ässa vcrlisgsndsn Ti^/Jai^^ii srfialten wurden, wobsi 4®£öcJa Harnstoff in Esa]£i;iüi.Sn^;3i; cagegsben eurds« Aus diesem Grund ist aucii die i.bw®es2:liei^ ?on Harnstoff,

is ο ^ *:

Guanidin und dgl. im Reaktionssystem empfehlenswert.

Beispiel 3

Selektive Spaltung der Interkettsndisulfidbindungen 2 ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 20 mg menschlichem Iinmunoglobulin I, 80 mg ^S ¹¹

g ^^

(8,22 χ 10¹¹ dpm/Mol) und 40 mg Na₂S₄Og-2E₂O wurden auf einen pH von 7»2 mit AcOH eingestellt und bei 39° G während 2 Stunden umgesetzt, Anschliessend wurde die Reaktionsflüssigkeit gegen 5 1 Wasser während 24 Stunden dialysiert« Dann wurden Harnstoff und Propionsäure langsam zu dem System zur abschliessenden Konzentrationen von 4m baw, 1n zugefügt. Von der vor der Einbringung La ctls ob Jiat-ο graph:* sehe Kolonne entnommenen Probe wurden O₁I ml Losung &bg 3inaan, deren Verte in der linken Seite dsr Achse der Ordinatea in Fig. 8 angegeben sind«. Der Rest des Systeme wurde der Chromatographie unter Anwendung der Sephadsx G- 200-Ko\cun& (1,5 Durchmesser cm % 100 cm), weicht mit Ia-Pr-^picssäiire mit einem Gehalt vod ^ΐ-Hfernstoff ins Gleichgewicht gesetst worden war, unterworfen.

Die Radioaktivität der Proben wurde durch OD20Q Eaktion und mit dem F

gemessen; die Ergebnisse sind, in I¹Ig^ 8 enthalten,,

Fraktionierung der schweren Ketten und leichten Ketten

Zu einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 100 mg menschlichem γ-Globulir II wurden 0_t4 g Na₂SOx und 0,2 g Na₂S^Og*2H₂O zugesetzt und der pH-Wert des Systems auf 9,0 mit In-HCl eingestellt, worauf während 48 Stunden bei

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E&umteiiperatur umgesetzt wurde_ε lash tier Umsetzung wurde eine kleine Menge des im System gebildeten unlöslichen Materials zentrifugal entfernt« Die Eeaktionsflüssigkeit wurde dann unter Anwendung eines ?isking-Eohres gegen 2,5 I Vasser von 5° C während 15 Stusden dialjsiert und weiterhin gegen 2,5 Liter ein®.? wässriger: Lösung von In-Propionsäure bei 5° 0 während 2S Stunden dialysisrt. 2as Bial^s&t Murds ö,e^ Oferom&togrKpiiii-. i&iter Anwendung eines Sepfesde:.: G-y'S-Kolöims ^3?5 es. Svi^ctdüesser s 111 cm)_s die mit 1n-PxOpioß.säur3 ins Gleichgewicht gesetzt war, untersogen und aa'bei die Po.lvpeptidketten fraktion'.ert₀ ¥ie aus Ils« 9 ersiGb.tlisa₅ waren in de.?¹ grapiiisshen S^rstellimg drei Spitzen festste". 3 -J^_a ^slcb.^ in isr Reihenfolge des grösseren Molefculargewiciitss εαε dem imfraktiGiäiertsn £-- sulfonierten Immunoglobalis^ den S-siilfönierten E-Eettea und äezi S-culfonisrteL· L«l-etten bestanden.« Big Identifizierung wurde ü.urcfe. imm.unolosi^che Massnahmen₀ beispielsweise fi.'pz. Ouciiterior'j-YerZahreii und äer Immuco-Elektro-Q₄ soMie d'JTste. chemische Analyse« wie Amino säur e-Gj He^osssehritbestirnffitiög: und dgl., ausgeführt. Aus den. in αβκ ^is^ 8 miü 9 aufgefülirten Werten lassen sich dis folgenden Folge-rongen ableiten:

(1) Da die erste Spitze als unfraktioniertes S-sul~ foniertes Imiiunoglotulin. die zweites Spitae als S-sulfoniert e E-Hetten und die dritte Spitze als S-sulfonierte L-£etten auf Grund immunologischer und chemischer Methoden Bntsprechend Fig. 9 voi: liacs nacfc. rechts identifiziert wurden, ist es lediglich logisch, zu folgern-, dass in gleicher Weise die drei ßpitsen in dsr fig. 8 von links nach rechts su dem unfraktionierten 3-sulfonierten Immunoglobuline S-sulfonierten H-Kstten unä S-sulfonierten L-Eetten gehören. Bie Unterschiedlichkeiten zwischen den Chromatographieinustern werden durch die Anwesenheit von

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Harnstoff im ersteren Reaktionssystem verursacht.

(2) Gemäss Pig. 8 wurden aus der Meng3 des Proteins in dem die dritte Spitze "bildenden L-Ketten die molare Konzentration berechnet und aus der molaren Konzentration und dem Radioaktivitätswert wurde festgestellt, dass die die dritte Spitze bildenden L-Ketten 1,0-S-SO-*-Gruppen enthalten. In der gleichen Weise wurde die Anzahl der S-SO,*-Gruppen in den Η-Ketten des zweiten Gipfels su 3»4, diejenigen im unfraktionierteii S-Ei-.lfoniertsn Ismunoglobulin zu 8,8 und diejenigen in dem Gemisch vor der Einbringung in die Chromatographiekolonne zu 8,5 berechnet. Wie bereits erläutert, besteht eine Msalfiabindung in der Bindung der L-Kette und der Η-Kette, während durchschnittlich 2,5 Disulfidbindungen zwischen zwei E-»Ketten bestehen. Infolgedessen enthält das menschliche Immunoglobulia durchschnittlich 4,5 Interkettendisulfidbindungen«

(3) Nach dem Chromatographiemuster· der Fig. 3 ist der grösste Teil des S-sulfonierten Immunoglobulins, welches durchschnittlich 8,6 S-SO,*-Gruppen enthält, in H-Ketten und L-Ketten auftrennbar. Daraus verstehe es siali, dass die Interkettendisulfidbindungers selektiv gespalten sind, während die Intrakettendisulfiäbindungea. praktisch intakt geblieben sind.

Beispiel ^

Ausbildungsform der Seaktionsbedingangen

133 ml menschliches γ-Globulin I wureUn in 165? ml eines O,06m-Phosphatpuffers (pE 8.Γ) mit einem Gehalt von 2,5 % Glycin gelöst. Zu der Lösung -wurden 7_SC g 17a_?S0-, gelöst in 100 m3. des gleichen Pufiers. und 4,4 g ^23^0^*21120, gelöst in 100 ml des gleichen Pu/fere, zugesetzt und bei 45° C während 3 Stunden umgesstsrfc. Di« Heak-

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tionsfliissigkeit wurde während 6 Stunden gegen 20 Liter

Puffersalzlösung, aufgebaut aus Natriumsalz, unter Anwendung eines Dow Chemicals-Bechers, Ultrafilter b/HFU-1, dialysiert. Die äussere Flüssigkeit der Dialyse wurde alle 2 Stunden ausgetauscht. Das Dialysat wurde auf ein Volumen von 180 ml durch das gleiche Filter konzentriert und hierzu 50 g Glycin zugesetzt.

Die Lösung wurde steril durch eine 0,25 Mikron-Membrane filtriert, in 10 ml-Ampullen zu jeweils 5»0 ml gegossen und lyophilisiert. Die Antikomplementaktivitat CHj-q der sterilen Lösung bei 50%iger Konzentration betrug 4,3 %·

Beispiel 6

Vergleich der Antikörperaktivitäten gegenüber Antigenen in Versuchen unter Anwendung von Na₂S^Og oder Cu⁺⁺ als Oxidationsmittel
Bedingung I

Zu 67 ml menschlichem γ-Globulin I wurden 7*1 6 ₂ und 0,43 g Na₂S₄O₆.2H₂O, sowie eine O,1m-Tris-HCl-Pufferlösung mit einem Gehalt von 2,5 % Glycin zu einem Gesamtvolumen von 1,0 Liter zugesetzt. Nach 3 Stunden Umsetzung bei 45⁰ C wurde die Reaktionsflüssigkeit unter Anwendung eines Dow Chemicals-Bechers, Ultrafilter b/HFU-1, dialysiert und das Dialysat auf ein Volumen von 200 ml konzentriert, durch ein Seitz-0,25 Mikron-Filter steril filtriert, unter Zusatz von 2,5 g Glycin lyophilisiert und mit Wasser auf eine 5*0%ige Lösung verdünnt. Die Antikörperaktivität der Probelösung ergeben sich aus Tabelle II. Bedingung II

Die Reaktion und die Behandlungen unter der Bedingung I wurden wiederholt, wobei jedoch Reaktionstemperatur und

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Reaktionszeit auf 25° C bzw. 24 Stunden geändert wurden. Bedingung III

Reaktion und Behandlungen unter der Bedingung I wurden wiederholt, wobei jedoch Na₂S₄O₆^H₂O durch 0,16 g CuSO₄*5HpO ersetzt wurde.

Die unter den vorstehenden Bedingungen I bis III erhaltenen Lösungen der Immunoglobulinderivate wurden hin sichtlich Antikörperaktivitäten gegenüber verschiedenen Antigenen untersucht, wobei die Ergebnisse in Tabelle II aufgeführt sind.

Tabelle II
Antikörperaktivitäten für verschiedene Antigene

Antigen Diphtherie Masern Rubella Mumps Reaktions- (Einheiten/ (Einhei- (relativ) (relativ) bedingung ml) ten/ml)

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Intakt	)	Q	,8	6	,7	171
I (Na₂S₄O₆,
45°C - 3 Std.	.)	O	,8	5		170
II (Na₂S₄O₆,
25°C - 24 Std	)		—	4	,4	-
III (Cu⁺⁺
45⁰C - 3 Std.	<o		<2		_

10

Aus den Werten der vorstehenden Tabelle II lassen sich folgende Folgerungen ableiten:

(1) Falls Tetrathionat verwendet wurde (Bedingung I), war der Titer für Diphtherie des S-sulfonierten Immunoglobulins praktischääquivalent mit demjenigen des nativen Immunoglobulins, während, falls Kupfer(II)-ion verwendet wurden (Bedingung III), die Immunoglobulinderivate praktisch keine Aktivität zeigten.

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(2) Hinsichtlich des Titers bei Masern behielten die S-sulfonierten Immunoglobuline, welche mit Tetrathionat oxidiert waren (Bedingungen I und II), mehr als 60 % derjenigen des nativen Immunoglobulins bei, während die'mit Kupfer(II)-ionen (Bedingung III) oxidierten einen Aktivität sabf all auf weniger als 30 % hatten.

Aus diesen Sachverhalten ergibt es sich, dass, falls Kupfer(II)-ionen verwendet werden, die Verringerung der Antikörperaktivität grosser als in dem Fall" ist, wo Tetrathionat verwendet wird.

Beispiel 7

Antikomplementest in vivo des S-sulfonierten Globulins

In gleicher Weise wie bei Bedingung I von Beispiel 6 wurde menschliches S-sulfoniertes Immunoglobulin erhalten.

3 ml der 5%igen, gepufferten Salzlösung mit einem Gehalt, von 2,5 % Glycin, pH 7,4, 3 ml der gepufferten Salzlösung allein als Kontrolle und 1 ml eines 15%igen unbehandelten menschlichen Immunoglobulins I in gepufferter Salzlösung mit einem Gehalt von 2,5 % Glycin ebenfalls als Kontrolle wurden intravenös an weibliche Meerschweinchen mit einem Körpergewicht von 200 bis 300 g verabfolgt und die Serumkomplementwerte für Testkörper mit den Seren von jeweils 1,0 ml bestimmt, die jeweils durch Cardio-Punktur in regelmässigen Abständen abgenommen wurden.

Die Ergebnisse sind in Fig. 10 aufgeführt. Aus Fig. 10 ist ersichtlich, dass ein abrupter Abfall des Serumkomplementwertes in den Testkörpern nach der intravenösen Injektion von intaktem menschlichen Immunoglobulin beobachtet wurde, der Null bei der gleichen Verabfolgung von menschlichem S-sulfonierten Immunoglobulin betrug. Auch

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wurde ein gelegentliches Zittern bei den Meerschweinchen nach der Injektion der ersteren beobachtet, die erneut nicht mit Meerschweinchen auftrat, an die das S-sulfonierte Immunoglobulin intravenös injiziert wurde. Aus diesem Sachverhalt lässt sich mit Sicherheit erwarten, dass die Immunoglobulinderivate gemäss der Erfindung auch frei von unzulässigen Reaktionen in vivo sind.

Beispiel 8

Beständigkeit von S-sulfonierten Immunoglobulin der Kaninchen in vivo und Viederbildung der Disulfidbindungen

(a) Herstellung von Anti-BSA-DNP-Antikörper der Kaninchen :

Ochsenserumalbumin (BSA) wurde mit Dinitrofluorphenol zur Bildung einer Verbindung umgesetzt, welche nachfolgend mit der Abkürzung BSA-DNP bezeichnet wird. BSA-DHP wurde an Kaninchen (Species Hew Zealand White, ο) an den 3?usspolstern zusammen mit vollständigen Adjuvans nach Freund injiziert und immunisiert. Am 30. Tag nach der Injektion wurden die Kaninchen aus der Corotidarterie ausgeblutet. Das dabei erhaltene Antiserum wurde in an sich bekannter Weise nach dem Ausfällungsverfahren mit 4f?%iger gesättigter Ammoniumsulfatlösung behandelt und Anti-BSA-DKP-Immunoglobulin der Kaninchen wurde erhalten.

(b) Herstellung der Proben:
Bedingung 1

Das Anti-BSA-DHP-Immunoglobulin wurde bei 37° C während 24- Stunden zusammen mit 1 Gew.% zu Immunoglobulin von Pepsin gemäss dem A. Nisonoff-Verfahren (Arch. Biochem. Biophys., 8°/,, Seite 230 (1960)) hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde der Chromatographie mit einer Sephadex G 150-Kolonne unterworfen und das F (ab¹)₂-Fragment wurde erhalten.

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Bedingung 2

25O ml des Anti-BSA-DNP-Immunoglobulins, 180 mg Na₂SO₅ und 79 mg Na₂S^Og'2H₂O wurden in 25 ml 0,1m-Tris-HCl mit einem Gehalt von 2,5 % Glycin (pH 8,2) gelöst und bei 37° C während 4 Stunden umgesetzt. Die Eeaktionsflüssigkeit wurde während 24- Stunden gegen gepufferte Salzlösung (pH 7*4·) dialysiert und ergab S-sulfonierte s Kaninchen-Immunoglobulin. Bedingung 3

Das vorstehend aufgeführte BSA-DHP-Immunoglobulin wurde so verwendet, wie es war.
(C) Bestimmung der Überlebensrate und der Beständigkeit

Die in der vorstehenden Weise hergestellten Proben wurden jeweils zu Lösungen mit einer Konzentration von 5 % verarbeitet.

Die Probelösungen wurden intravenös an Kaninchen (Species New Zealand White, ο, Probe 1 an drei Kaninchen, Probe 2 an drei Kaninchen und Probe 3 soa. zwei Kaninchen) mit einer Dosierung von etwa 3 ml injiziert. Die Versuchstiere wurden in bestimmten Abständen ausgeblutet und ihr Plasma wurde extrahiert. Die Anti-ESA-DNP-Aktivität im Plasma wurde durch passive Hemagglutinationsreaktion bestimmt (T. Matsuhashi, Chemistry & Biology, J^, 396 071)), wobei BSA-DNP auf roten Blutzellen der Schafe unter Anwendung von Glutaraldehyd fixiert wurde und das Mikrotiterverfahren angewandt wurde, wobei die in Pig. 11 aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden.

Wie sich klar aus Fig. 11 zeigt, ist die Überlebensrate in vivo äusserst kurz für das handelsübliche E¹ (ab')₂, was eine kurze Dauer der pharmazeutischen Wirksamkeit ergibt. Im Gegensatz hierzu zeigt das S-sulfonierte Immunoglobulin praktisch die gleiche Halbwertslebensdauer mit derjenigen des nativen Immunoglobulins, woraus sich

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eine bestäxdige pharmazeutische Wirksamkeit ergibt.

(d) Bestimmung der hämolytischen Aktivität der Antikörper

Das angegebene native Anti-BSA-DNP-Immunoglobulin wurde intravenös an Kaninchen injiziert und deren Plasma 10 Minuten nach der Injektion gesammelt, welches auf das lOOfache verdünnt wurde und mit Meerschweinchen-Komplement und roten Blutzellen der Schafe, worauf BSA-DHP durch Tanninsäure adsorbiert war, bei 37° C während 1 Stunde umgesetzt.

Der intakte Antikörper gemäss Bedingung 3 verursachte eine 1OO%ige Hämolyse, während !!"(ab¹^ gemäss Bedingung 1 und die S-sulfonierte Probe gemäss Bedingung keine hämolytische Aktivität zeigten.

Von dem aus den Kaninchen 24 Stunden nach der Injektion genommenen Plasma verursacht das Produkt unter Bedingung 2 100%ige Hämolyse bei dem gleichen Test wie vorstehend.

Diese Erscheinung ist vermutlich auf die erneute Umwandlung des S-sulfonierten Immunoglobulins in natives Iamunoglobulin in vivo zurückzuführen, d. h. die Reduktion von -S-SO, in -SH und die Wiederbildung der Disulfidbindungen.

(e) Bestimmung der Verringerung der Markierungskonzentration in vivo:

30 mg Kaninchen-Immunoglobulin, 21 mg -^S-K^SO, und 13 mg Na2S^0g*2E20 wurden in 3 ml an O,1m-Tris-HCl mit einem Gehalt von 2,5 ^Glycin (pH 8,2) gelöst und bei. 45° C während 3 Stunden umgesetzt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde während 24 Stunden gegen gepufferte Salzlösung (pH 7»4) dialysiert und auf diese Weise das *^S-markierte Kaninchen-S-sulfonierte Immunoglobulin hergestellt.

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Die vorstellende, auf eine 5%ige Konzentration verdünnte Probe wurde intravenös an zwei Kaninchen (New Zealand White, $-) mit jeweils 1,5 ml injiziert und das Kaninchenplasma in bestimmten Abständen in einer Menge von 0,5 ml je Kaninchen abgenommen. Die Radioaktivitäten des Plasmas wurden durch einen Flüssigkeitsscintilationszähler gemessen, wobei die in Tabelle Illjaufgeführten Ergebnisse erhalten wurden.

Tabelle III Verbliebene Radioaktivität im Blut

Blutentnahme-zeit nach	Verbliebene	Radioaktivität im
der intravenösen Injektion	Blut
	Kaninchen A	Kaninchen B
15 Minuten	100 %	100 %
3 Stunden	64	64
7	34	36
24	9,5	8,0
48	2,2	1,0
72	0,7	0

Aus den vorstehenden Werten ergibt es sich, dass die -S-SO,*-Gruppen in dem S-sulfonierten Immunoglobulin im Blut gespalten sind.

Wie sich aus den vorstehenden Beispielen zeigt, ist es gemäss der Erfindung möglich, selektiv die Disulfidbindungen, welche die Η-Ketten und die L-Ketten im nativen Immunoglabulin verbinden, zu spalten und die dabei gebildeten Schwefelatome einer S-SuIfonierung zu unterziehen. Die Anzahl der Spaltung kann weiterhin auf einen durchschnittli-

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chen Bereich von 3 bis 5» etwa 4,5, gesteuert werden, was die durchschnittliche Anzahl der Interkettendisulfidbindungen von nativem Immunoglobulin ist, und die bei der Spaltung gebildeten Schwefelatome können S-sulfoniert werden.

Diese neuen Immunoglobulinderivate gemäss der Erfindung besitzen Antikomplementaktivität weit niedriger als bei nativem Immunoglobulin, wie sich aus den Beispielen ergibt, und verursachen infolgedessen weit weniger unzulässige Reaktionen der anaphylaktischen Faktoren. Deshalb sind die Derivate nicht nur intramuskulär injizierbar, sondern auch intravenös. Darüberhinaus zeigen die neuen Immunoglobulinderivate gemäss der Erfindung praktisch eine äquivalente Antigenbindungsaktivität wie natives Immunoglobulin und besitzen deshalb ausgezeichnete Bindungsaktivitäten für verschiedene Antigene.

Es ist bereits bekannt, Aggregate aus den durch Fraktionierung hergestellten Immunoglobulin durch Absorption oder Sedimentation mit Aktivkohle oder Polymersubstanzen zu entfernen. Jedoch verursacht das auf diese Weise behandelte Immunoglobulin nicht selten unzulässige Reaktionen des Injektionsträgers. Darüberhinaus wird eine Reaggregation des auf diese Weise behandelten Immunoglobulins während der Lagerung beobachtet. Das Produkt ist' somit für eine sicher injizierbare Masse nach wie vor unvollständig (L. S. Hanson & B. G. Johanson; Int. Arch. Allergy, ^I, 380 (1967)).

Es wurde bereits erwähnt und gezeigt, dass die Immunoglobulinderivate gemäss der Erfindung weit weniger unzulässige Reaktionen zeigen und in diesem Gesichtspunkt ganz ausgezeichnet sind, wozu auf Fig. 2 verwiesen wird.

Die Immunoglobulinderivate gemäss der Erfindung behalten auch die Antigenbindungsaktivität während eines lan-

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gen Zeitraumes bei, wie in Beispiel 8 belegt ist. Weiterhin werden die S-SuIfonatgruppen in den Derivaten in Disulfidbindungen in vivo zurückgewandelt, während die SuIfonatgruppen aus dem Körper ausgeschieden werden. Somit werden schliesslich die Derivate in natives Immunoglobulin zurückverwandelt. Auch aus diesem Grund hat das S-sulfonierte Immunoglobulin gemäss der Erfindung ganz offensichtliche Vorteile gegenüber den bekannten S-alkylierten Immunoglobulinen.

Wie bereits gezeigt, sind die neuen Immunoglobulinderivate gemäss der Erfindung als pharmazeutisch wirksame Bestandteile nicht nur für die intramuskuläre Injektion, sondern auch für die intravenöse Injektion geeignet.

Die neuen Immunoglobulinderivate gemäss der Erfindung ergeben wasserlösliche Massen für injizierbare Flüssigkeiten, wenn sie mit Löslichmachungsmitteln, wie Glycin, Natriumphosphat, Citrat, Natriumchlorid und dgl., vermischt werden, in geeigneten Konzentrationen. Weiterhin können die Massen in Wasser bei Konzentrationen von beispielsweise 1 bis 20 Gew.%, vorzugsweise 2 bis 10 Gew.%, gelöst werden, so dass sich intravenös injizierbare Massen ergeben.

Die S-sulfonierten Immunoglobuline gemäss der Erfindung sind nicht nur für die Therapie beim Menschen brauchbar, sondern auch zur Behandlung von Tieren, wie Kühen, Pferden, Schweinen, Schafen, Hunden und dgl. Als Immunoglobulinderivate zur Behandlung der Tiere werden die aus den jeweiligen Tieren erhaltenen nativen Immunoglobuline für die S-Sulfonierung gemäss der Erfindung bevorzugt verwendet.

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Claims

Patentansp rüche

Neue Immunoglobulinderivate, dadurch gekennzeichnet, dass die Interkettendisulfidbindungen des Immunoglobulins überwiegend gespalten sind und durchschnittlich 3 bis 5 der Interkettendisulfidbindungen oder der Inter- und Intra-Kettendisulfidbindungen gespalten sind, und die dabei gebildeten Schwefelatome (S-) S-sulfoniert (—S—SO;,) sind.
2. Immunoglobulinderivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass durchschnittlich etwa 3 his 4-,5 Interkettendisulfidbindungen des Immunoglobulins praktisch selektiv gespalten sind und die dabei gebildeten Schwefelatome S-sulfoniert sind.
3- Immunoglobulinderivate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass durchschnittlich etwa 4-,5 Interkettendisulfidbindungen des Immunoglobulins praktisch selektiv gespalten sind und die gebildeten Schwefelatome S-sulfoniert sind.
4·. Immunoglobulinderivate nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, dass sie praktisch frei von oiidierenden Metallionen, wie Kupfer(II)-ionen sind.
5. Immunoglobulin, dadurch gekennzeichnet, dass

(1) hierin durchschnittlich 3 his 5 Interkettendisulfidbindungen oder Inter- und Intra-Kettendisulfidbindungen des Immunoglobulins gespalten sind und die dabei gebildeten Schwefelatome (S-) S-sulfoniert (-S-SO,) sind und

(2) sie einen Titer der Anti-Diphtherie von mindestens 1,0 internationalen Einheiten (IE)/ml bei einer Konzentration von 10,0 Gew.% besitzen.
6. Wasserlösliche Masse, dadurch gekennzeichnet, dass

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sie ein Immunoglobulinderivat enthält, worin durchschnittlich 3 bis 5 Interkettendisulfidbindungen oder Inter- und Intra-Kettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins gespalten sind und die dabei gebildeten Schwefelatome S-sulfoniert (-S-SG,) sind und die einen Anti-Diphtherietiter von mindestens 1,0 ΙΕ/ml bei einer Konzentration von 10,0 Gew.% zeigen, sowie ein unschädliches Löslichmachungsmittel für das Immunoglobulinderivat enthält.
7. Wässrige injizierbare Masse, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einem Immunoglobulinderivat nach Anspruch 1 bis 5» unschädlichen Löslichmachungsmitteln für die Immunoglobulinderivate und Wasser aufgebaut ist.
8. Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten, dadurch gekennzeichnet, dass natives Immunoglobulin mit

(A) einer Verbindung, die zur Bildung von Tetrathionationen fähig ist, und

.(B) einer Verbindung, die zur Bildung von Sulfitionen in Wasser fähig ist, umgesetzt wird, so dass durchschnittlich 3 bis 5 Interkettendisulfidbindungen oder Inter- und Intrakettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins gespalten werden und die dabei gebildeten Schwefelatome S-sulfoniert (-S-SO*) werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einem pH-^ert im Bereich von 3,5 bis 10 durchgeführt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9» dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung praktisch in Abwesenheit von oxidierenden Metallionen, wie Kupfer(II)-ionen durchgeführt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 50° G durchgeführt wird.

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