NO144111B

NO144111B - Fremgangsmaate ved fremstilling av immunoglobulinderivater

Info

Publication number: NO144111B
Application number: NO750768A
Authority: NO
Inventors: Katsuhiko Tomibe; Yasuhiko Masuho; Kimihiko Matsuzawa; Sachio Ishimoto; Kazuo Satake; Tsuneo Watanabe
Original assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1974-03-08
Filing date: 1975-03-07
Publication date: 1981-03-16
Also published as: CH614426A5; DE2508132B2; DE2508132C3; NL7502745A; FR2262996A1; NO144111C; GB1497928A; NL167167B; DE2560155C2; FR2262996B1; SE403703B; IN138636B; DK93475A; DE2508132A1; AU7872975A; SE7502346L; DK141432B; DK141432C; NL167167C; DD118655A5

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte av den art

som er angitt i kravets ingress.

Med den-nåværende fremgang på proteinkjemi-området er det klar-lagt at sammenhengen mellom immunoglobulinets struktur og virkning spiller en meget viktig rolle for medisinsk immuni-

tet.

Studier har vist at immunoglobulin kan oppdeles i 5 typer, dvs.,igG IgA, IgM, IgD og IgE, hvor IgG utgjør ikke mindre enn 70 vekt-%.

Immunoglobuliner, unntatt IgM, er hver sammensatt - av hovedsakelig fire peptidkjeder og flere disulfide bindinger ér tilstede mellom og innen kjedene, i det følgende betegnet henh. sam "interkjedene" og "intrakjedeneVF.eks kan IgG,det mest typiske av immunoglobulin,fraksjoneres når det spaltes med pa-pain i to fragmenter "Fab", som .har antigen-bindende aktivitet og ett fragment■"Fc", som har komplement- og vevs-bindende aktivitet. Det er ytterligere oppdaget at IgG er sammensatt av to tunge polypeptide kjeder (H-kjeder) og to lette polypeptide kjeder (L kjeder), som er sterkt bundet med disulfide bindin-

ger og ikke-kovalente bindinger for å danne et proteinmole-

kyl med en molekylvekt på ca. 160 000, og at molekylet inneholder gjennomsnittlig ca. 4,5 interkjede disulfide bindinger og ca. 12 intrakjede disulfide bindinger (B. Frangione & C. Mil-stein, J. Mol, Biol, 33, 893, (1968)).

Basert på de foregående empiriske fakta er det utført undersø-kelser angående immunoglobulin for intravenøs injeksjon. An-vendelsen av immunoglobulin har fått.generell utbredelse som følge av Cohns fraksjonering (E.G. Cohn et al, J. Amer.Chem.

Soc, 68,.459, (1949)).

Cohn et al. fraksjonerte en.stor mengde av menneskeplasma ved felling med etanol. Fraksjon II er hovedsakelig IgG, inneholdende en mindre mengde IgA og IgM oq utviser antistoffer mot forskjellige mikroorganismer som forårsaker infektøse sykdommer. Derfor er administrasjonen av fraksjon II effektiv for pro-fylakse og terapi for virus-infeksjonssykdommer, såsom meslinger, viral hepatitis etc. såvel som smittsomme sykdommer på grunn av antibiotika-resistente bakterier såsom streptococcus aureus.

Den eneste anvendte administrasjonsform av således fraksjonert og formulert immunoglobulin har vært intramuskulær injeksjon. Imidlertid, ved intramuskulær injeksjon oppnåes kun partiell osmose av injeksjonsvæsken i kroppen og det er ikke mulig å oppnå en øyeblikkeli<g> effekt. Den intramuskulære injeksjonen tillater heller ikke administrasjon i store mengder. Av denne grunn er det ønsket å finne immunoglobulin egnet for intravenøs injeksjon.

Intravenøs injeksjon av kjente immunoglobuliner forårsaker kraf-tige pyrogene og kardiovaskulære reaksjoner, som er spesielt

tydelige hos agammaglobuline pasienter. Slike uheldige reaksjoner av intravenøs injeksjon forårsakes av immunoglobulin-aggre-gat inneholdt i immunoglobulinfraksjonen. Det agqregerede immunoglobulin binder seg til komplement oa vev, på lignende måte som antigen-antistoff-komplekset, hvilket resulterer i uønskede reaksjoner forårsaket av den anafylaktiske faktor dannet i kroppen. De uønskede reaksjoner kan forhindres ved å anvende den supernatante væsken fraskilt fra det dannede immunoglobulin ved 100.000 x G ultrasentrifugering, men en langsom re-aggregering skjer uunngåelig i det således fremstilte immunoglobulin .

Med det formål å få en sikker intravenøs injeksjon av immunoglobulin, er det utført mange undersøkelser. I Sveits er det gjort forsøk på å underkaste immunoglobulin behandling ved pH 4 for temporært å denaturere Fc-fraksjonen og gjøre den egnet for intravenøs injeksjon (S. Barandun etal, Vox Sang 7, 157, (1962). Imidlertid er denne behandling ikke perfekt og de uønskede reaksjoner blir fremdeles til tider observert.

pepsin-behandlet immunoglobulin er kommersielt tilgjengelig for intravenøs injeksjon (H. Koblet, S. Barandun og H.- Diggelman, Vox Sang 13, 92, (1967)). Da 60-80 % av det behandlede immunoglobulin er sammensatt av fragmentet F(ab<1>)2 degraderes injeksjonsvæsken raskt in vivo, som demonstrert ved at dens halveringstid er flere timer, som kun er noen tiendedeler av verdien for ube-handlede immunoglobulin (B. Jager> Arch. Intern. Med., 119, 60

(1968)). Allikevel kan det fremstilles en forbedret injeksjons-væske ved å anvende plasmin i stedet for pepsin, men metoden har den ulempe at plasminet ikke senere kan elimineres (L.A. Hanson & B.G. Johanson, Int. Arch. Allergy 31, 380, (1967)).

Nylig er det foreslått å selektivt spalte hovedsakelig interkjede disulfide bindinge.r i immunoglobulin .og S-alkylere de dannede (-S)-grupper og å anvende immunoglobulinderivatene som oppviser reduserte uønskede reaksjoner for intravenøs injeksjon.

F.eks., som et av forsøkene på å spalte interkjede disulfide bindinger i immunoglobulin for å erholde polypeptide kjeder,

er metoden til S.T. Stevenson et al. (Bio. Chem., J., 118, 703, 1969) kjent, denne omfatter å spalte interkjede disulfide bindinger av menneske-immunoglobulin G ved reduksjon i ditio-treitol med etterfølgende S-alkylering i jodacetamid. Imidlertid krever denne metode totrinns-reaksjoner og ytterligere er produktet S-alkylerte polypeptider som medfører en poten-siell fare for ny antigensitet. Videre er det i det hele tatt ikke lett å omdanne S-delen til tiolgruppe. Således er det også vanskelig å avlede av dette et anvendbart middel ved å anbringe den samme på en bærer, såsom en passende polymer, under anvendelse av aktivt tiol.

Franeks metode (F. Franek, Coll. Czech. Chem. Commun., 29,

1401, (1964) består i å behandle svineimmunoglobulin med na-triumsulfitt og kobber(II)ioner for å danne S-sulfonerte polypeptider .

Forsøk har vist at Franek's metode er beheftet med følgende ulemper: (i) at de resulterende denaturerte polypeptider inneholder kobber eller kobber(II)ioner, som meget vanskelig lar seg eliminere fra produktet. (ii) at de denaturerte polypeptider hurtig utvikler nedsatt antigen-bindende aktivitet, selv om de utviser den ønskede lave antikomplement-aktivitet, og (iii) at den opprinnelige struktur av immunoglobulin blir for-andret, som bekreftet av måling av den optiske dreining, slik som angitt senere.

Det faktum at det så og si er umulig å eliminere de små restene av kobber fra det denaturerte polypeptide produkt erholdt ifølge Franek et al.'s metode, viser at produktet er termisk ustabilt, og tilbøyelig til å danne aggregater og derfor er fysiologisk uegnet for anvendelse for intravenøs injeksjon (D.A. Derber, Arthritis and Rheumatism, 17, 85, (1974)).

I henhold til et trekk ved foreliggende oppfinnelse fremstilles nye immunoglobulin-derivater som ikke inneholder kobber eller kobber(II)ioner, hvori enten interkjede disulfide bindinger som knytter sammen de to tunge polypeptide kjedene (H kjeder) og de to lette polype<p>tide kjeder (L kjeder) i immunoglobulinet blir spaltet selektivt eller foruten de spesifikke intrakjede disulfidbindingene, spaltes en del av de interkjede disulfide bindinger, og de dannede (-S)-grupper S-sulfoneres.

ifølge et annet trekk ved foreliggende oppfinnelse fremstilles nye immunoglobulin-derivater med nedsatt antikomplementaktivi-tet og som kan bibeholde høy antistoff-aktivitet over lengere tid i det menneskelige legeme.

Et ytterligere trekk ved foreliggende oppfinnelse er å fremstille nye immunoglobulin-derivater som utvikler lite skadelige reaksjoner og meget høy antistoff-aktivitet, og som kan rekonstruere naturlige immunoglobin in vivo.

Ved et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse fremstil-- les nye immunoglobulin-derivater ved selektiv spaltning vesentlig bare av de-intrakjede disulfide bindinger som knytter sammen- tunge kjeder (H kjeder) og lette kjeder (L kjeder) av immunoglobulin, og S-sulfonering av de dannede (-S)-grupper.

Ifølge oppfinnelsen fremstilles de nye immunoglobulin-derivater ved at interkjedé disulfidebindinger i naturlig immunoglobulin spaltes ved fremgangsmåten som er særpreget ved det som er angitt i kravets karakteriserende del.

De nye immunoglobulin-derivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen er spesielt karakterisert ved at i gjennomsnitt ca. 3-4,5, særlig ca. 4,5, av i alt vesentlig interkjede disulfide bindinger av naturlig immunoglobulin er selektivt spaltet, og at de således dannede (-S) grupper blir S-sulfonert, og også ved at det inneholder i det vesentlige ingen oksyderende metallioner, såsom kobber(II)ion.

Igjen, hvis angitt uavhengig av plasseringen av spaltede disulfide bindinger, er de nye immunoglobulin-derivatene ifølge oppfinnelsen karakterisert ved at: (1) de blir dannet ved spaltning av i gjennomsnitt 3-5 interkjede, eller 3-5 interkjede og intrakjede, disulfide bindinger av naturlig immunoglobulin og S-sulfonering (-S-SO3) av de derved dannede (-S) grupper, og at (2) immunoglobulin-derivatet inneholder minst 1,0 I.U./ml titrervæske av antidifteri ved en konsentrasjon på 10,0 vekt-%.

Immunoglobulin-derivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan gi vannoppløselige blandinger som er anvendbare for fremstilling av injeksjonsvæsker.

Spesielt foretrukket immunoglobulin-derivat fremstilt ifølge oppfinnelsen er det hvori gjennomsnittlig i det vesentlige 4,5 interkjede disulfide bindinger i naturlig immunoglobulin er spaltet, og de således dannede (-S) grupper (i det vesentlige 9 i gjennomsnitt) er S-sulfonert (-S-S03). Ifølge undersøkelser blir slikt foretrukket immunoglobulin-derivat dannet når interkjede disulfide bindinger, som alene knytter H kjedene og L

kjedene i naturlig immunoglobulin sammen, spaltet, og de der-

ved dannede (-S) grupper S-sulfonert.

De nye immunoglobulin-derivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen erholdes ved å omsette naturlig immunoglobulin med

(A) en forbindelse som er i stand til å danne tetrationatio-

ner, og

(B) en forbindelse som er i stand til å danne sulfitioner,

i vann for å spalte i gjennomsnitt 3-5 av interkjede disulfide

bindinger, eller inter- og intrakjede disulfide bindinger av naturlig immunoglobulin og samtidig med dette S-sulfonere (-S-S03) de således dannede (-S) qrupper.

Ifølge fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, er det mulig

å først spalte hovedsakelig interkjede disulfide bindinger i naturlig immunoglobulin.

Således kan immunoglobulin-derivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen, hvori gjennomsnittlig 3-4,5 intramolekylære disulfi-

de bindinger av naturlig immunoglobulin er spaltet og de dan-

nede (-S) grupper S-sulfonert, ansees som produktet, hvori i det alt vesentlige kun interkjede disulfide bindinger i na-

turlig immunoglobulin er spaltet og de resulterende (-S) grup-

per er S-sulfonert.

Fremgangsmåten ifølge op<p>finnelsen foregår i alt vesentlig i

vann, men mediumet er ikke på noen måte begrenset til vann,

hvilket som helst annet vandig medium kan anvendes så lenge det ikke er til noen skade for reaksjonen ifølge oppfinnelsen.

Ifølge oppfinnelsen blir naturlig immunoglobulin omsatt med

(A) en forbindelse som er i stand til å danne tetrationationer, og (B) en forbindelse som er i stand til å danne sulfitioner, i vann, for å spalte gjennomsnittlig 3-4,5 interkjede disulfide

bindinger eller, i tillegg til alle interkjede disulfide bindinger f å spalte et mindre antall intrakjede disulfide bindinger, idet antallet av spaltede intramolekylære disulfide bindinger ikke overstiger gjennomsnittlig 5, og hvor i det vesentlige alle av de således dannede (-S) grupj>er S-sulfoneres.

Forbindelsen (A), som er i stand til å danne tetrationationer

i vann, tetrationsyre, alkalimetallsalt derav., såsom natriumtetrationat, kaliumtetrationat, etc, og vann-oppløselige salter derav såsom ammoniumtetrationat, er foretrukket.

Typiske eksempler på forbindelsene (B)., som kan danne sulfitioner i vann omfatter svovelsyrling, natriumsulfit, kaliumsul-fit og natriumbisulfit.

Forbindelsen (A), som er i stand til å danne tetrationationer

i vann, virker som oksydasjonsmiddel. Mens forbindelsen (B), sam.danner sulfitioner i vann, virker som reduserende middel såvel som S-sulfoneringsmiddel.

Mengden av sulfitioner og tetrationationer er minst hver for seg den dobbelte molare mengde i forhold til den molare mengde av interkjede-, eller inter- og intrakjede disulfide bindinger (-S-S-binding) i det naturlige utgangsimmunoglobulinet som skal spaltes. Vesentlig større mengder kan også anvendes.

Det er foretrukket at forbindelsene (A) og (B), spesielt (B), er oppløst i vann eller-i en pufferoppløsning før de tilsettes til reaksjonssystemet.

Omsetningen som finner sted ved foreliggende fremgangsmåte kan beskrives ved at interkjede disulfide bidninger av naturlige immunoglobuliner blir spaltet av sulfitionet, hvorved et av svovelatomene blir omdannet til en S-sulfonatgruppe (-S-SO^) og det andre til en tiolgruppe (SH) , og hver av de således dannede tiolgruppene blir parvis oksydert av tetrationationet til en disulfid binding, eller tiolgruppen reagerer med tetrationationet til en S-tiosulfatgruppe (-S-S2O3) som igjen angripes av.sulfitionet. Således er reaksjonen repeterende.

Som resultatet av en slik reaksjon, blir interkjede disulfide kjeder av naturlig immunoglobulin spaltet, og de derigjennom separerte svovelatomer hver for seg blir omdannet til S-sulfonatgruppe (-S-SG^) i de tunge kjeder og de lette kjeder.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres fortrinnsvis ved temperaturer som ikke er høyere enn 50°C, fortrinnsvis 10 - 50°, særlig 15—48°C, selv om det går an å anvende fremgangsmåten ved lavere temperaturer.

Normalt har det naturlige immunoglobulinet lett for å bli denaturert ved høye temperaturer overstigende 50°C, spesielt over 55°, og spaltning av intrakjede disulfide bindinger begynner å finne sted. Av denne grunne skulle slike høye temperaturer unngåes.

Ved fremgangsmåten bør nærvær av slike proteinødeleggende for-bindelser som urea eller guanidin, som blir anvendt i S-sulfi-tolyser av insulin eller ribonuklease (J.L. Bailey et al., J. Biol. Chem., 234, 1733 (1959)), helst unngåes. Hvis de imidlertid blir anvendt, skulle det kvantitative forhold av slike for-bindelser ikke være mer enn 2,0 mol pr. mol naturlig immunoglobulin .

Reaksjonstiden varierer avhengende av slike faktorer som typen av immunoglobulin, mengde av reaktant, reaksjonstemperatur og nærværet av denaturerende middel, såsom urea eller lignende. Den foretrukne pH-verdi for reaksjonsvæsken ligger mellom ca. 3,5 - 10, spesielt 6-9. Ved pH-verdier lavere enn 3,5, kan en spaltning av intrakjede disulfide bindinger i Fc-delen av naturlig immunoglobulin finne sted. Ved pH som overstiger 10, blir proteinet i globulinet denaturert, dette medfører slike ufordelaktige resultater som inhibering av reduksjonen av antikomplement-aktiviteten og nedsettelse av antigen-dannende aktivitet .

Det er ingen kritisk rekkefølge for tilsetning av reaktantene.

Etter omsetningen blir reaksjonsblandingen underkastet dialyse mot vann og en passende pufferoppløsning, slik som salt inneholdende 0,01M fosfatpuffer (pH 7,4) og 2,5% glycin, hvoretter de nye immunoglubolinderivatene kan erholdes.

Antallet S-sulfonat (-S-SO3)-grupper i et immunoglobulinderivat kan bestemmes ved å anvende radioaktivt natriumsulfit under fremstillingen og måle S-sulfonatene merket med ^<5>S i det resulterende immunoglobulinderivat med en væske-scintillasjonsteller, som vist i nedenfor oppførte eksempler.

Halvparten av gjennomsnittsantallet av de merkede S-sulfonat-grupper pr. molekyl immunoglobulin-derivater bestemt på denne måten tilsvarer det gjennomsnittlige antall av spaltede intramolekylære disulfide bindinger i det naturlige utgangsimmunoglobulinet.

På den annen side kan immunoglobulin-derivatene, som inneholder gjennomsnittlig ca. 9 S-sulfonat-grupper pr. molekyl, dvs. det som dannes ved spaltning av i gjennomsnitt 4,5 disulfide bindinger av naturlig immunoglobulin og S-sulfonering av de dannede (-S) grupper ifølge oppfinnelsen, fraksjoneres i H-kjedene og L-kjedene under anvendelse av f.eks. "Sephadex G-75" eller "G-200" kolonne, fortrinnsvis i nærvær av mindre mengder av urea eller guanidin, med propionsyreoppløsning.

Av denne grunn kan ethvert sett av betingelser bli anvendt med fremgangsmåten, sålenge de tillater dannelse av immunoglobulin-derivater inneholdende gjennomsnittlig 9-S-sulfonat-grupper pr. molekyl, som ytterligere kan fraksjoneres i H-kjeder og L-kjeder ved den spesifiserte kolonnekromatografi. Når et slikt sett av betingelser er bestemt empirisk, kan antallet av spaltede disulfide bindinger kontrolleres passende ved å justere reaksjonstiden under det valgte sett av betingelser.

Foreliggende oppfinnelse vil nå bli forklart mer spesifisert :u med referanser til eksempler.

Reaktantene som anvendes i eksemplene var følgende: Menneskeimmunoglobulin I: 15% oppløsning av menneske-immunoglobulin for intramuskulær injeksjon i pufret salt (pH nøytral) inneholdende 2,5 % glycin, produkt fra Chems-Sero-Therapeutic Research Institute.

Y-Globulin-Human Fr, II (menneskeimmunoglobulin II) produsert av Nutritional Biochemicals Corporation (U.S.A.).

Natriumtetrationat: som var fremstilt straks før anvendelse fra natriumtiosulf at (Na-jS-jO^. 5H20) og jod (I2) i vandig etanol.

Natriumsulfit: spesialkvalitet kjemikalie produsert av Komune Kagaku Yakuhin, Co.

35 x

Na2S03 merket med S : produkt fra New England Nu-clear (U.S.A.).

Tris HC1: Tris (hydroksymetyl)aminometan produsert av Nakarai Kagaku Yakuhin Co., et spesielt kvalitetskjemikalie for biokjemisk forskning med pH nedsatt med vandig 1N-HC1.

Antistoff aktivitets- og antikomplement aktivitets-områder ble målt som følger:

Måling med titrervæske av anti-difteri

Reaksjon: Sensibilisert ved positiv hemagglutinei?

ringsreaksjon (merke 1).

Metode for måling: mikroplateprosess - Blodceller: Menneske • O-type røde blodceller (merke 2) som var blitt behandlet med formalin ble BDB (bis-diazo-benzidin)-behandlet (merke 3) og gjort følsom med difteri-toksin.

Kontroll: standard antistoff til difteri (NIH Japan). merke 1: NIH Japan metode: R. Murata, No. 21 Tokyo

Veterinarian & Animal Husbandry ('75)

merke 2: W.T. Butler: J. Immunol. 90 663 C63). merke 3: J. Dordon, B. Rose, A.H.Sehon: J. Exp.

Med. 108, 37 C58).

Måling av antistoff for meslinger, rubella og kusma (merke 4 - 9)

Reaksjon: mikroplate-prosess med unntagelse for meslinger, for hvilke det ble anvendt testrør-metode.

Antigen: antigener for hemagglutinasjon, produsert av Toshiba

Chemicals.

Kontrollserum: standard antiserum produsert av Toshiba Chemicals, unntatt for meslinger for hvilke ble anvendt standard antiserum (NIH Japan).

merke 4) Guide for Hemagglutination Inhibition Test for Measles

by Microtitre Method: NIH Japan.

merke 5) Sequence for Measuring Human Immunoglobulin is Anti-body Activity to Measles: NIH Japan.

merke'6: T. Toyama, Clinical Examinations, 16, No. 29 ('72). merke 7: An Introduction to Virus Empirical Science: av NIH

Japan, Alumni. pub. ved Maruzen Bookstore ('73). merke 8: Recommended Specifications &r Microbiological Rea-gents, US Dept. of HEW, April, 1965.

merke 9: Mumps HI Reaction Techniques, NIH, Japan

Måling av antikomplement aktivitet:

Fremgangsmåten som er beskrevet i Kabat & Mayer, "Experimental Immunochemistry", s. 225 ('61) ble anvendt. 1%'ig immunoglobu-linoppløsning inneholdende marsvinserum, 20 CE^^/ ml, ble ført inn i 5 ml GVB<++> oppvarmet ved 37°C i en time og det konsumerte antikomplement ble målt ved nevnte metode. Antikomplement-aktiviteten ble indikert i prosent av konsumeringen til 20 CH50/ml.

EKSEMPEL 1

Sammenheng mellom reaksjonsbetingelser og antall spaltninger

av disulfide bindinger).

Betingelse I

Til 51 mg av foran angitte menneskeimmunoglobulin II, 36 mg

35 X

S merket Na^O^ og 22 mg Na2S40g ble tilsatt en vandig opp-løsning av 0,1 M tris-HCl (pH 8,2) til å gi en prøve på 5,0 ml som ble oppvarmet til 45°C og omsetningen fikk forløpe ved denne temperatur. 0,5 ml av reaksjonsblandingen ble uttatt som prøve med engang etter tilsetningen og etter 30 min., 1 times, 2 timers 4 timers,7,4 timeis og 24.timers omsetning. Hver av prøvene ble blandet med 10 ml av 50% mettet ammoniumsulfat under iskjøling, hensto i 15 min. under iskjøling, og det resulterende presipitatet ble separert med sentrifuge. Etter vasking igjen med 50% mettet ammoniumsulfat, ble presipitatet målt med hensyn til radioaktivitet med en væskescintillasjonsteller og fra resultatet ble antallet tilstedeværende -S-SO-j-grupper beregnet.

Betingelse II

Reaksjonen ble begynt under identiske betingelser som under betingelse I, men uten å ta ut prøver i løpet av reaksjonstiden. 4 timer etter at reaksjonen begynte, ble det tilsatt en vandig 10 M ureaoppløsning til reaksjonssystemet, slik at ureakonsen-trasjonen ble 4M. Etter 5 og 6 timers reaksjon (henholdsvis 1 og 2 timer etter tilsetningen av urea,) ble uttatt 0,5 ml av reaksjonsvæsken som prøve og behandlet på lignende måte som prøvene tatt under betingelse I.

Betingelse III

Reaksjonen og behandlingen av prøver ifølge betingelse I ble gjentatt, bortsett fra at reaksjonstemperaturen var 0°C.

Betingelse IV

Reaksjonen og behandlingen av prøver ifølge betingelse I ble gjentatt, bortsett fra at reaksjonstemperaturen var 25°C.

Betingelse V

Reaksjonen og behandlingen av prøver ifølge betingelse I ble gjentatt, bortsett fra at det ikke ble anvendt Na^^Og . 2H20. Reaksjonsresultatene oppnådd under de foregående betingelser I, II, III, IV og V er vist i tabell 1.

Det skal gjores oppmerksom på at antallet av spaltede disulfide bi indinger tilsvarer halvparten av'antallet av -S-SO 3..-grupper.

i

Av reaksjonsresultatene vist i tabell 1 ovenfor, blir det føl-gende konkludert: Når fremgangsmåten utføres i nærvær av tetrationat og natrium-, sulfit, ved 45°C, under betingelse 1 blir 3 disulfide bindinger spaltet, som øker til gjennomsnittlig 4,5 ved 1-7 timers reaksjon og ca. 5,2 etter 24 timers reaksjon.

Når reaksjonen ble utført på identisk måte, bortsett fra at temperaturen var 25°C (betingelse IV), ble antallet spaltede disulfide bindinger nedsatt, og antallet av spaltede bindinger ble gjennomsnittlig ca. 4,3 etter 24 timers reaksjon. Når reaksjonstemperaturen er 0°C (betingelse III), er antallet spaltede disulfide bindinger enda mindre. Imidlertid, i fravær av natriumtetrationat (betingelse V) forløp ikke spaltningen av disulfide bindingene jevnt, mens når urea ble tilsatt til reaksjonssystemet (betingelse II) steg det gjennomsnittlige antall spaltede disulfide bindinger raskt etter ureatilsetningen.

EKSEMPEL 2

Sammenligning av fysikalske egenskaper for immunoglobulinderivat framstilt ved oksydasjon med Na-jS^O, og ved oks<y>dasjon med Cu

Betingelse I

Til 2,0 g av foran spesifiserte menneskeimmunoglobulin II, 1,42 g Na2S03 og 0,86 g Na^Og. 2H20, ble 0,1M tris HC1 (pH 8,2) tilsatt til å gi en 200 ml's blanding, som ble omsatt ved begynnelsestemperaturen 45°C. Straks etter at reaksjonen star-tet og 30 min., 1 time, 2 timer og 4 timer deretter ble 15 ml av reaksjonsblandingen tatt ut som prøver. Rett etter den femte prøve ble tatt, ble 10M ureaoppløsning tilsatt til resten av reaksjonsblandingen til en ureakonsentrasjon på 4M og reaksjonen ble fortsatt. Etter 5 og 6 timers reaksjon (1 og 2 timers reaksjon etter ureatilsetningen) ble 22,5 ml av reaksjonsblandingen tatt som prøve, og tilsatt 22,5 ml iskjølt mettet ammo-niumsulf at etterfulgt av 30 min. henstand og kjøling med is. Det resulterende presipitat ble separert ved sentrifugering

og vasket med en 50%<1>s mettet ammoniumsulfatoppløsning og dialysert i 24 timer med en pufret saltoppløsning med pH 7,4, gjennom et "Visking"-rør. Etter dialysen ble det tatt prøver av hver ønsket mengde for spesifikk analyse, disse ble fortynnet med en pufret saltoppløsning med pH 7,4 inneholdende 2,5

% glycin og analysert.

Betingelse II

Reaksjon og behandlingen ifølge betingelse I ble gjentatt, bortsett fra at Na2S4Og.2H20 ble erstattet med 50 mg CuS04. 5H20 og reaksjonen ble avsluttet etter 4. time.

Oppløsningene av de forskjellige immunoglobulin-derivater erholdt på denne måte, ble underkastet de følgende prøver og målinger:

(a) sammenheng mellom reaksjonstid og antallet

av -S-SO-j-grupper:

Antallet av S-SO^-grupper i prøvene oksydert med tetrationat (Na0S040g . 2H20) er vist på fig. 1 med åpne sirkler (o), i overensstemmelse med dataene erholdt under betingelse I og II i eksempel 1. Dataene for prøvene oksydert med Cu<++>, som ble omsatt og behandlet på identisk måte som i betingelse I i eksempel 1, bortsett fra at Na-^S^Og . 2H20 ble erstattet med 50 mg CuS04.5H20, er vist i fig. 1 med sorte prikker ( • ). (b) Sammenheng mellom reaksjonstid og antikomplement- aktivitet: Antikomplement aktivitet for prøvene erholdt ved oksydasjon med Na2S40g . 2H20 under betingelse I i eksempel 2 målt ved den allerede angitte metode, er vist i fig. 2. Antikomplement-aktivitene for prøvene oksydert med Cu<++> under betingelse II er også vist i fig. 2. Det kan sees fra fig. 2 at de antikomplemente aktiviteter for alle prøvene ikke ble nedsatt mer enn 30% etter 30. min. reaksjon. (c) Sammenheng mellom reaksjonstid og titrer- oppløsningen for antidifteri: Den samme prøve som ble anvendt i (b) ovenfor ble målt 3 ganger med hensyn til titreroppløsning av antidifteri med den angitte metode. Avvik og middelverdier er vist i fig. 3. Fra tegningen kan sees at prøvene oksydert med Cu<++> viser titreroppløsning ikke høyere enn 0,3 IU etter 30 min. reaksjon. (d) Sammenheng mellom reaksjonstid og optisk dreining: De samme prøver som ble anvendt for antikomplement-aktivitets-målingene av (b) ovenfor (proteinkonsentrasjon.2,5 %) ble målt med hensyn til optisk dreining, med resultater som vist i fig. 4. Fra de viste resultater kan sees at nærvær av kobber(II)ion i reaksjonssystemet forårsaker progressiv denaturering under reaksjonen,og at nærvær av urea fremskynder denatureringen, som vist av den påfallende økning i optisk dreining.

Det skal gjøres oppmerksom på at den optiske dreining ble målt ved 25°C under anvendelse av en 1-cm celle.

(e) Sammenheng mellom reaksjonstid med turbiditet etter varmebehandling: De samme prøver som ble anvendt for antikomplement-aktivitets-målingene i (b) ble varmebehandlet i luft i 4 timer ved 50°C ved en konsentrasjon på 2,5 %, med resultater som vist i fig. 5. Som det fremgår av fig. 5 forårsaker nærværet av bare en meget liten mengde kobber(II)ion nedsettelse av varmestabili-teten og fremskynder aggregasjonstendensen.

(f) Sammenheng mellom reaksjonstid og kobberinnhold:

De samme prøver som ble anvendt for antikomplement-aktivitets-målingene i (b) ble undersøkt med hensyn til kobber (II) ion-innhold ved atomabsorpsjonsanalyse, med resultater som vist i fig. 6. Av resultatene kan sees at når kobber(II)ioner blir anvendt, kan hverken vasking eller dialyse av prøven eliminere kobber.

(g) Separasjon av tunge kjeder fra lette kjeder:

Den samme prøve som den tatt etter 2 timers reaksjon under betingelse I i eksempel 2 ble dialysert i 24 timer med lN-propionsyre inneholdende 6M urea og ble kromatografert i en "Sephadex G 200" kolonne (1,5 øcm x 80 cm) balansert med den spesifikke vandige oppløsning, med resultater som vist i fig. 7. Den første toppen fra venstre på samme tegning betegner J^I^-kjeder som ennå ikke er separert, den andre toppen H-kjeder og den tredje toppen L-kjeder. Kurven viser at prøven ble separert i'H-kjeder og L-kjeder.

På basis av resultatene, som er vist i figurene 1-7, kan man trekke følgende konklusjoner: 1) Som vist ved resultatene av betingelse I eksperimentene i eksempel 1, hvor fremgangsmåten blir utført i nærvær av tetrationat og sulfitioner, ved en reaksjonstid innen 1-4 timer, er det gjennomsnittlige antall spaltede disulfide bindinger ca. 4,5, og således dannede (-S)-grupper blitt S-sulfonert (gjennomsnittlige antall av S-sulfonerte grupper, ca. 9) under dannelse av S-sulfonert immunoglobulin (fig. 1) som kan separeres i H-kjeder og L-kjeder ved hjelp av f.eks. kromatografi på en "Sephadex G 200" kolonne (fig. 7) og har i det alt vesentlige identisk optisk rotasjon med den til naturlig immunoglobulin (fig. 4).

Av de foregående resultater kan det sikkert antas at det nye immunoglobulin-derivater det dannet ved i det vesentlige spaltningen av kun interkjede disulfide bindinger i naturlige immunoglobulin og S-sulfonering av de dannede (-S)-grupper, fordi antallet av interkjede disulfide bindinger av naturlig immunoglobulin gjennomsnittlig er 4,5.

Et slikt immunoglobulin-derivat har redusert den antikomplemente aktivitet til ikke mere enn 10%, mye lavere enn den for naturlig immunoglobulin (fig. 2), men viser titreroppløsning av anti-difteri ikke vesentlig lavere enn den for naturlig immunoglobulin, som vist ved nesten ekvivalent antigenbindings-aktivitet. Som vist i fig. 3, ved en konsentrasjon på 10 vekt-%, utviser immunoglobulin-derivatet antigen-bindingsaktivitet på minst 1,0 IU/ml. 2) S-sulfonert immunoglobulin-derivater dannet ved spaltning i gjennomsnitt av ferre eller flere enn 4,5 av disulfide bindinger i naturlig immunoglobulin, f.eks. i gjennomsnitt ikke flere enn 3 eller så mange som 5, og S-sulfonering av (-S)-gruppene utviser en noe mindre reduksjon i sin antikomplemente aktivitet sammenlignet med det foretrukne immunoglobulin-derivat beskrevet under punkt 1) ovenfor (figurene 2 og 3), men viser allikevel en vesentlig bedre antikomplement aktivitet i forhold til naturlig immunoglobulin. 3) Når tetrationationene blir erstattet med kobber(II)ioner som oksydasjonsmiddel, inneholder de resulterende immunoglobulin-derivatene kobberioner dog i en meget liten konsentrasjon som tenderer til å bli større når reaksjonstiden blir lengre (fig. 6). Antallet av spaltede disulfide bindinger i naturlige immunoglobulin blir større når reaksjonstidens forlenges (fig. 1), det er derfor vanskelig å fremstille det ønskede immunoglobulin-derivat ved å spalte gjennomsnittlig 4,5 disulfide bindinger i naturlig immunoglobulin. <y>tterligere utviser immunoglubulin-derivatene erholdt ved anvendelse av kobber(II)ion nedsatt antikomplement aktivitet (fig. 2), men samtidig blir deres anti-difteri titreroppløsning bety-delig nedsatt sammenlignet med den for naturlig immunoglobulin. Således blir deres antigen-bindende aktivitet meget nedsatt (fig. 3). Immunoglobulin-derivatene viser igjen, når reaksjonstiden overstiger 1 time, forskjellig optisk dreining i forhold til naturlig immunoglobulin, hvilket viser at det finner sted en strukturell endring i deres proteinbestanddeler. 4) Lignende forandringer i optisk dreining kan også observeres for immunoglobulin-derivater dannet når urea er tilsatt under reaksjonen. Av denne grunn er også fraværet av urea, guanidin og lignende i reaksjonssystemet å anbefale.

EKSEMPEL 3

(selektiv spaltning av interkjede disulfide bindinger).

2 ml av en vandig oppløsning inneholdende 20 mg menneskeimmunoglobulin I, 80 mg <35>S-Na2S0<x> (8,22 x IO<11> dpm/mol) og 40 mg Na2S40g.2H20 ble justert til pH 7,2 med AcOH og omsatt ved 39°C

i 2 timer. Deretter ble reaksjonsblandingen dialysert mot 5 1 vann i 2 4 timer. Deretter ble urea og propionsyre langsomt tilsatt til blandingen til hhv. sluttkonsentrasjoner på 4M og IN. Som prøve for innføring i kromatograferingskolonnen, ble det

tatt 0,1 ml av oppløsningen, og de erholdte data for denne er vist på venstre side av aksen til ordinatene i fig. 8. Resten av blandingen ble underkastet kromatografi under anvendelse av "Sephadex G 200" kolonne (1,5 øcm x 100 cm) balansert med IN propionsyre inneholdend 4M urea.

Radioaktiviteten til prøvene ble målt ved OD280 av nver fraksjon og med en væskescintillasjonsteller med resultater som vist i fig. 8. Resten av blandingen ble underkastet kromatografi på en "Sephadex G 200" kolonne (1,5 øcm x 100 cm) balansert med IN propionsyre inneholdende 4M urea.

Radioaktiviteten av prøvene ble målt ved OD280 av ^ver fraks3on med en væskescintillasjonsteller, med resultater vist i fig. 8.

EKSEMPEL 4

(fraksjonering av tunge kjeder og lette kjeder).

Til en vandig oppløsning inneholdende 100 mq av menneske-^-globulin II, ble 0,4 g Na2S03 og 0,2 g Na2S406.2H20 tilsatt og pH ble justert til 9,0 med IN HC1, etterfulgt av 48 timers omsetning ved romtemperatur. Etter omsetningen ble en mindre mengde av uoppløselige bestanddeler fjernet ved sentrifugering. Reaksjonsblandingen ble så dialysert under anvendelse av "Visking"-rør mot 2,5 1 vann ved 5°C i 15 timer og ytterligere med 2,5 1 av en vandig oppløsning av IN propionsyre ved 5°C i 28 timer. Ved å underkaste dialysatet kromatografi under anvendelse av "Sephadex G 75" kolonne (3,5 øcm x 111 cm) balansert med lN-propionsyre, ble polypeptidkjedene fraksjonert. Som vist i fig. 9, kan det observeres tre topper i kurven, som ble bekreftet å være, i rekkefølgen av større molekylær vekt, av ufraksjonert S-sulfonert immunoglobulin, S-sulfonerte H-kjeder og S-sulfonerte L-kjeder. Identifikasjonen ble foretatt med immunologiske midler såsom Ouchterlony metoden og immuno-elek-troforese, såvel som ved kjemiske analyser såsom aminosyre-analyse, heksoseinnhold-målinger, etc.

Av resultatene vist i figurene 8 og 9 er man kommet frem til følgende konklusjoner: 1) Da den første toppen ble identifisert som ufraksjonert S-sul fonert immunoglobulin, den andre toppen som S-sulfonerte H-kjeder og den tredje toppen som S-sulfonerte L-kjeder ved immunologiske og kjemiske metoder, med referanse til fig. 9 fra venstre til høyre, er det logisk å konkludere at likheten med de tre toppene i fig. 8 fra venstre til høyre, kan tilskri-ves ufraksjonert S-sulfonert immunoglobulin, S-sulfonerte H-kjeder og S-sulfonerte L-kjeder, resp.. Forskjellen mellom kromatogrammene skyldes nærvær av urea i reaksjonssystemet til førstnevnte. 2) Med referanse til fig. 8, fra mengden av protein i L-kjedene som utgjør den tredje toppen, er den molare konsentrasjon beregnet, og fra den molare konsentrasjonen og radioaktivitets-nivået ble det oppdaget at L-kjedene som dannet den tredje toppen inneholder 1,0 S-S03<*> gruppe. På samme måte ble antallet av S-S03 .grupper i H-kjedene i den andre toppen beregnet til å være 3,4, de i det ufraksjonerte S-sulfonerte immunoglobulinet 8, 8 og i blandingen for innføringen i kromatografi-kolonnen 8,6. Som allerede forklart er det en disulfid binding som binder L-kjede og H-kjede, mens gjennomsnittlig 2,5 disulfide bindinger mellom to H-kjeder. Følgelig inneholder menneskeimmunoglobulin gjennomsnittlig 4,5 interkjede disulfide bindinger. 3) Ifølge kromatogrammene i fig. 8 kan den største delen av S-sulfonert immunoglobulin som gjennomsnittlig inneholder 8,6 S-SO^* grupper, separeres i H-kjeder og L-kjeder. Derfor kan det forståes at interkjede disulfide bindinger er selektivt spaltet, mens intrakjede disulfide bindinger blir beholdt i det alt vesentlige intakte.

EKSEMPEL 5

(en utføringsmåte av reaksjonsbetingelsene).

133 ml av menneske-y-globulin I ble oppløst i 1667 ml 0,06M fosfat-puffer (pH 8,2) inneholdende 2,5 % glycin. Til oppløsnin-gen ble tilsatt 7,0 g Na2S03 oppløst i 100 ml av den samme puffer og 4,4 g Na2S40g.2H20 oppløst i 100 ml av den samme puffer og omsatt i 3 timer ved 45°C. Reaksjonsvæsken ble dialysert i 6 timer mot 20 1 av pufret NaCl oppløsning, under anvendelse av Dow Chemical's beger "Ultrafilter b/HFU-1". Dialysevæsken ble byt-tet hver 2. time. Dialysatet ble konsentrert til et volum på 180 ml med det samme filter og tildette ble tilsatt 50 g glycin. Oppløsningen ble filtrert sterilt gjennom en 0,25 pm mem-bran, helt inn i 10 ml ampuller, hver 5,0 ml, og lyofilisert. Den antikomplemente aktivitet CH^0 av den sterile oppløsning ved en konsentrasjon på 50% var 4,3%.

EKSEMPEL 6

(sammenlignign av antistoff-aktiviteter mot antigener, i eksperimentene anvendes Na.>S40g eller Cu<++> som oksyderende middel) .

Betingelse I

Til 67 ml av menneske-y-globulin I ble 7,1 g Na2S03 og 0,4 3 g Na2S4Og.2H20, 0,1M tris HC1 pufferoppløsning inneholdende 2,5% glycin tilsatt for å gi et totalt volum på 1,0 1. Etter 3 timers omsetning ved 45°C ble reaksjonsvæsken dialysert under anvendelse av Dow Chemical's beger, "Ultrafilter b/HFU-1" og dialysatet ble konsentrert til et volum på 200 ml, filtrert sterilt gjennom "Seitz" 0,25 jam filter, lyofilisert ved tilsetning av 2,5 g glycin og fortynnet med vann til en 5,0 % oppløsning. Antistoff-aktivitetene til prøveoppløsningen er vist i tabell 2.

Betingelse II

Reaksjonen og behandlingene ble gjentatt ifølge betingelse I bortsett fra at reaksjonstemperaturen og tiden ble endret til 25°C og 24 timer.

Betingelse III

Reaksjonen og behandlingen ble gjentatt ifølge betingelse I bortsett fra at Na2S406.2H20 ble erstattet med 0,16 g CuS04.5H20.

Oppløsningene av immunoglobulin-derivater erholdt fra de foregående betingelser I - III ble undersøktpå deres antistoff-aktivitet mot forskjellige antigener, med resultater som vist i tabell 2.

Av dataene gitt i tabell 2 ovenfor kan de følgende konklusjoner trekkes: 1) Når tetrationat ble anvendt (betingelse I), er titreropp-løsningen av difteri fra S-sulfonert immunoglobulin i det vesentlige ekvivalent med det til naturlig immunoglobulin, men når kobberioner ble anvendt (betingelse III), viser immunoglobulin-derivatet så og si ingen aktivitet. 2) Hva angar titreroppløsningen av meslinger, så bibeholder S-sulfonert immunoglobulin, som var blitt oksydert med tetrationat (betingelse I og II), mer enn 60% av det til naturlig immunoglobulin, men for det oksydert med kobber(II)ion (betingelse II) hadde aktiviteten falt til mindre enn 30%.

Av disse fakta kan det forståes at når kobber(II)ion blir anvendt, er reduksjonen av antistoff-aktiviteten større enn i de de tilfeller hvor tetrationat blir anvendt.

EKSEMPEL 7

(in vivo antikomplement forsøk av S-sulfonert globulin).

Menneske S-sulfonert immunoglobulin ble erholdt på samme måte som i eksempel 6, betingelse I. 3 ml av 5% pufret saltoppløsning inneholdende 2,5% glycin, pH 7,4,3 ml pufret saltoppløsning alene for kontroll og 1 ml av 15% ubehandlet menneske-immunoglobulin I i pufret saltoppløsning inneholdende 2,5% glycin, også som kontroll, ble administrert intravenøst på hunnmarsvin med kroppsvekt 200-300 g og forsøksdyrenes serumkomplement-nivå ble målt i sera på 1,0 ml hver ekstrahert ved kardio-punktering i regelmessige intervaller.

Resultatene er vist grafisk i fig. 10, 'hvorav det kan iakttas

en rask senking i serum-komplement-nivået for forsøksdyrene etter den intravenøse injeksjonen av intakt menneskeimmunoglobulin, som var lik null ved den tilsvarende administrasjon av menneske S-sulfonert immunoglobulin. Det ble også observert skjelving av og til hos marsvinene etter injeksjonen av først-nevnte, noe som ikke var tilfellet for marsvin når S-sulfonert

immunoglobulin ble injisert intravenøst. Av disse fakta kan det sikkert antas at immunoglobulin-derivatet fremstilt ifølge oppfinnelsen er fri for uheldig reaksjon også in vivo.

EKSEMPEL 8

(varighet av kanin S-sulfonert immunoglobulin in vivo og gjendannelse av disulfide bindinger).

(a) Fremstillling av kanin anti BSA-DNP antistoff:

Kvegserum albumin (BSA) ble omsatt med dinitrofluorfenol for å danne en forbindelse som heretter vil bli omtalt under forkor-telsen BSA-DNP. BSA-DNP ble injisert i hannkaniner (Art.New Zealan White, O*) i fotputene sammen med Freunds hjelpestoffer og immunisert. På den 30. dagen etter injeksjonen ble det tap-pet blod fra corotoidåren. Således erholdt antiserum ble behandlet på kjent måte ved presipitering med 45 % mettet ammonium-sulf at og kanin anti BSA-DNP immunoglobulin ble erholdt.

(b) Fremstilling av prøver:

Betingelse 1

Anti BSA-DNP immunoglobulin ble hydrolysert ved 3?°C i 24 timer sammen med 1 vekt-% pepsin regnet på iitrttiinoglobulinet, i henhold til A. Nisonoffs metode (Arch. Biochem. Biophys., 89, 230, (1960)). Hydrolysatet ble underkastet kromatografi med "Sephadex G 150" kolonne og F (ab')2 fragment ble erholdt.

Betingelse 2

250 ml av anti BSA-DNP immunoglobulin, 180 mg Na2S03 og 79 mg Na2S0406.2H20 ble oppløst i 25 ml 0,1 M tris HC1 inneholdende 2,5 % glycin (pH 8,2) og omsatt ved 37°C i 4 timer. Reaksjonsvæsken ble dialysert i 24 timer mot pufret saltoppløsning (pH 7,4) for å erholde kanin S-sulfonert immunoglobulin.

Betingelse 3

Det ovenfor spesifiserte BSA-NDP immunoglobulin ble anvendt slik det var.

(c) Måling av omsetningshastighet og varighet.

De fremstilte prøver ble hver formulert til oppløsninger på 5% konsentrasjon.

Prøveoppløsningen ble injisert intravenøst på hannkaniner (Art New Zealand White O*, prøve 1 til tre kaniner, prøve 2 til tre kaniner og prøve 3 til to kaniner) ved doser på ca. 3 ml. Det ble tatt blodprøver av forsøksdyrene i på forhånd bestemte intervaller og plasmaet ble ekstrahert. Anti BSA-DNP aktiviteten i plasmaet ble bestemt ved passiv hemagglutinasjonsreaksjon

(T. Matsuhashi, Chemistry & Biology, 9 396 ('71)) hvori BSA-DNP ble fiksert på røde blodceller fra sauer under anvendelse av glutaraldehyd og det ble anvendt mikrotitreringsmetode, med re-sulater som vist i fig. 11.

Som det fremgår klart av fig. 11 er in vivo omsetningshastigheten ekstremt høy for det kommersielle F (ab')2/ som antyder kort varighet av farmasøytisk effektivitet. I motsetning til dette, viser det S-sulfonerte immunoglobulin ca. den samme halveringstid som for naturlig immunoglobulin, dette indikerer lang far-masøytisk effektivitet.

(d) Måling av hemolytisk aktivitet av antistoff.

Det spesifiserte naturlige anti BSA-DNP immunoglobulin ble injisert intravenøst i kaniner og plasmaet ble samlet etter 10 min.. Dette ble fortynnet ved 100 vol. ganger og reagert med marsvin-komplement og røde blodceller fra sauer på hvilke BSA-DNP ble absorbert av garvesyre ved 3 7°C i en time..

Det intakte antistoffet fra betingelse 3 forårsaket 100% hemo'-lyse, mens F(ab')2 fra betingelse 1 og S-sulfonert prøve fra betingelse 2 ikke viste noen hemolytisk aktivitet.

Plasmaet tatt fra kaniner 24 timer etter injeksjonen og produktet fra betingelse 2 forårsaket også 100% hemolyse.

Dette fenomen skyldes sannsynligvis i re-omdannelsen av S-sulfonert immunoglobulin til naturlig immunoglobulin in vivo, dvs. reduksjonen av -S-SO^ til -SH og re-dannelse av disulfide bindinger.

(e) Måling in vivo av nedsettelse merket konsentrasjon:

35

30 mg kanin immunoglobulin, 21 mg S-Na2S03 og 13 mg Na2S^0g. 2H20 ble oppløst i 3 ml 0,1M tris HC1 inneholdende 2,5% glycin (pH 8,2) og omsatt ved 45°C i tre timer. Reaksjonsvæsken ble dialysert i 24 timer mot pufret saltoppløsning (pH 7,4), og så-35

ledes ble erholdt S-merket kanin S-sulfonert immunoglobulin.

Den ovenfor fremstilte prøven ble fortynnet til 5% konsentrasjon og injisert intravenøst til to hannkaniner (New Zealand White Cf*) med 1,5 ml hver og kaninenes plasma ble ekstrahert i på forhånd bestemte intervaller, 0,5 ml pr. kanin. Radioaktiviteten for plasmaet ble målt med scintillasjonsteller, med resultater som vist i tabell 3 nedenfor.

Av resultatene kan det forstås at -S-S03 gruppene i S-sulfonert immunoglobulin blir spaltet i blodet.

Som vist i de foregående eksempler er det ifølge oppfinnelsen mulig å selektivt spalte disulfide bindinger som binder sammen H-kjeder og L-kjeder i naturlig immunoglobulin, og at de således dannede (-S)-grupper kan S-sulfoneres. Antallet av spaltinger kan ytterligere reguleres til 3-5, idet ca. 4,5 er det gjennomsnittlige antaller interkjede disulfide bindinger i naturlig immunoglobulin og (-S)-gruppene som dannes ved spaltning kan S-sulf oneres.

Slike nye immunoglobulin-derivater fremstilt ifølge oppfin-

nelsen innehar antikomplement aktivitet som er meget lavere enn den for naturlig immunoglobulin som illustrert i eksemplene og forårsaker derfor mange færre skadelige reaksjoner av anafylaktiske faktorer. Således kan derivatene ikke bare injiseres in-tramuskulært, men også intravenøst. Dessuten utviser de nye immunoglobulinderivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen nesten ekvivalent antigen-binding aktivitet som naturlig immunoglobulin og utviser derfor utmerket bindingsaktivitet til forskjellige antigener.

Det er kjent fra før å fjerne aggregater fra immunoglobulin frem-tilt ved fraksjonering, adsorpsjon eller sedimentasjon med aktivt karbon eller polymersubstanser. Men allikevel er det ikke sjeldent at de således behandlede immunoglobuliner forårsaker skadelige reaksjoner ved injeksjon.. Ytterligere er det observert reaggregasjon i det således behandlede immunoglobulin under lagring. Således er produktet av sikkerhetshensyn lite egnet som injeksjonspreparat (L.Å. Hanson & B.G. Johanson:

Int. Arch. Allergy, 31, 380 (1967)).

Det er allerede nevnt og vist at immunoglobulinderivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen utviser meget mindre skadelige reaksjoner og utmerker seg på denne måte (cf. fig. 2).

Immunoglobulin-derivatene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse opprettholder antigen-bindingsaktiviteten i en lengre tidsperiode som vist i eksempel 8. Ytterligere blir de S-sulfonerte gruppene i derivatene re-omdannet til disulfide bindinger in vivo, mens sulfonatgruppene blir fjernet fra krop-

pen. Søledes blir til sist derivatene re-omdannet til natur-

lige immunoglobulin. Av denne grunn utviser S-sulfonert immunoglobulin fremstilt ifølge oppfinnelsen også betydelige fordeler overfor de kjente S-alkylerte immunoglobuliner.

Som det er blitt forklart er de nye immunoglobulin-derivater

fremstilt ifølge oppfinnelsen egnet som farmasøytisk ef-fektive bestanddeler ikke bare for intramuskulær injeksjon,

men også for intravenøs injeksjon.

De nye immunoglobulin-derivatene kan danne vannoppløselige preparater for injiserbare væsker, når de blir blandet med oppløsningsmidler som glycin, natriumfosfat, citrat, natrium-klorid og lignende til passende konsentrasjoner. Ytterligere kan preparatene oppløses i vann ved konsentrasjoner, 1-20 vekt-%, fortrinnsvis 2-10 vekt-%, for å danne intravenøst injiserbare preparater.

S-sulfonerte immunoglobuliner fremstilt ifølge oppfinnelsen er ikke bare anvendbare ved menneske-terapi, men også for behandling av dyr såsom ku, hest, svin, sau, hund etc.. Som immunoglobulin-derivater for behandling av dyr er foretrukket naturlige immunoglobuliner erholdt fra de respektive dyr og S-sulfonert ifølge foreliggende oppfinnelse.

Claims

Fremgangsmåte ved fremstilling av immunoglobulinderivater egnet for intravenøs injeksjon, hvor disulfidbindinger i naturlig immunoglobulin spaltes ved S-sulfonering med na-triumsulfitt, karakterisert ved å omsette naturlig immunoglobulin med

(A) en forbindelse som er i stand til å danne et tetra-tionation, og (B) en forbindelse som er i stand til å danne sulfitt- ion i vann, og hvor omsetningen i det vesentlige utføres i fravær av et oksyderende metallion, såsom et kobber(II)-ion, ved en pH i området 3,5 - 10 og ved en temperatur i området 10 - 50°C, idet naturlig immunoglobulin i væskefase bringes til omsetning med minst den dobbelte molare mengde av (A) og (B), i forhold til den molare mengde av disulfidbindinger som skal spaltes i det naturlige immunoglobulin, hvorved det i gjennomsnitt spaltes 3-5 interkjededisulfidbindinger eller inter-og intrakjededisulfidbindinger i det naturlige immunoglobulin.