CS195693B2

CS195693B2 - Způsob přípravy imunaglobulinových derivátů

Info

Publication number: CS195693B2
Application number: CS154675A
Authority: CS
Inventors: Katsuhiko Tomibe; Yasuhiko Masuho; Kimihiko Matsuzawa; Sachio Ishimoto; Kazuo Satake; Tsuneo Watanabe
Original assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1974-03-08
Filing date: 1975-03-07
Publication date: 1980-02-29
Also published as: JPS5417721B2; SU578892A3; JPS50121421A

Description

Vynález se týká způsobu přípravy nových imunoglobulinových derivátů, vhódných pro vodné, injekční přípravky, obsahující tyto globulinové deriváty.

Spolu se současným pokrokem na poli chemie proteinů se daří objasňovat závislost struktury imunoglobulinu na jeho funkci, jež hraje z hlediska lékařského velmi důležitou úlohu pro humorální imunitu proti tumorům.

Ze studií vyplynulo, že imunoglobulin lze rozdělit do pěti podtypů,' označovaných IgC, IgA, IgM, IgD a IgE, přičemž na IgC připadá alespoň 70 % hmotnostních.

Imunoglobuliny s 'výjimkou IgM sestávají hlavně ze Čtyř peptidových řetězců, a obsahují některé interřetězcové a intrařetězoó.vé disulfidické vazby. Tak například IgC, což je nejtyplčtější z imunoglobulinů, se dá frakcionovat digescí s papainem na dva fragmenty, a to „Fab“ vázající antigeny a ,,Fc“ vázající komplement a tkáň. Dále se zjistilo, že IgC sestává ze dvou polypeptidových těžkých řetězců (řetězců H), a dvou lehkých poly^eptidových řetězců (řetězců L), které jsou pevně vázány disulfidickými vazbami a nekovalentníml vazbami za vzniku proteinové molekuly o molekulové hmotnosti přibližně 160 000, a že molekula obsahuje v průměru asi 4,5 interřetězcových di195893 sulfidických vazeb a asi 12 intraretězcových disulfidických vazeb, viz B, Frangione a C. Milstein, J. Mol. Biol. 33, 893 (1968).

Na podkladě předchozích empiricky zjištěných skutečností byly provedeny četné studie sé zřetelem na použití imunoglobůÍinu pro intravenosní injekce. K využití imunoglobulinu došlo rychlým pokrokem po skončení Cohnovy frakcionace, viž E. C. Cohn a spol., J. Amer. Chem. Soc. 88, 459 (1946).

Cotin se spolupracovníky frakcionoval velká množství lidské plasmy srážením ethanolem. Frakcí II je převážně IgC, obsahující menší množství IgA a IgM, a vyznačuje se účinností proti antilátkám různých mikroorganismů, způsobujících infekční onemocnění. Jeví se proto podávání frakce II jako účinné při profylaxi a therapii onemocnění způsobovaných viry, jako jsou například spalničky, virová hepatitida, jakož i infekčních onemocnění jež způsobují mikroorganismy, résistentní na antibiotika, jako je Streptococcus aureus.

Jediným prostředkem pro podávání takto frakcionovaného a upraveného globulinu, jsou intramuskulární injekce. Avšak při intramuskulární injekci dochází pouze k parciální osmose in jiko váné kapaliny do těla, a účinek není okamžitý. Intramuskulární in19 5 6 9 3 jekce rovněž nedovoluje podávání větších množství tekutiny. Takže ,je vysoce žádoucí připravit imunoglobulin, vhodný pro intravenosnl injikování.'

Intravenosní injekce známých imunoglohulinů způsobují prudké pyrogenní a kardiovaskulární reakce, které jsou zvláště nápadné u χ-globulinovaných pacientů. Tyto nežádoucí reakce při intravenosních Injekcích jsou podmíněny a způsobeny agregáty imunoglobulinu, obsaženými ve frakcionovaném imunoglobulinu. Agregáty imunoglobulinu se vážou s komplementem a tkání, podobně jako komplex antigěn-antllátka, za nežádoucí reakce způsobené anafylaktickým faktorem, vzniklým v těle. Nežádoucí reakci lze předejít použitím kapaliny nad sedlinou, jez sc odděli z upraveného ímunoglobulinu ůltraodstředěním 100 000 g, ale i tak dochází pomalu v takto zpracovaném irnunoglobulinu k reagregování.

Pro přípravu skutečně vhodných intravenosních injekcí imunoglobulinu bylo provedeno mnoho studií. Ve Švýcarsku se zkoušelo zpracovávat imunoglobulin za hodnoty pH 4, čímž se dočasně denaturuje podíl Fc, a upravený podíl je vhodný pro intravenosní injekce, viz S. Barandum a spol·, Vox Sang I, 157 (1962). Oprava je však nedokonalá, a stále lze příležitostně pozorovat nežádoucí reakce.

Imunoglobulin upravený pepsinem, je běžně obchodně dostupný pro íptravenosní injekce, viz H. Koblet, S. Barandum a H. Diggelman, Vox Sang. 13, 92 (1967). Protože 60 až 80 % z upraveného imunoglobulinu se skládá z fragmentu F(ab‘)2, odbourává se injekční kapalina in vivo rychle, jako to bylo dokázáno podle jejího poločasu několika hódin, což je jedna desetina až několik desetin se zřetelem na neupravený imunoglobulin, viz B. Jager, Arch. Intern. Med. 119, 60 (1967). Ještě lepší injekční kapaliny lze získat nahrazením pepsinu plasminem, ale tento postup má tu nevýhodu, že nelze v pozdější fázi plasmin odstranit, viz L. A. Hanson & B. G. Johnson, Int. Arch. Allergy 31, 380 (1967).

-Nověji je navrhováno štěpit selektivně hlavně interřetězcové disulfidické vazby imunoglobulinu a alkylovat vytvořené atomy síry a použít takto získané deriváty imunoglobulinu, které se vyznačují snížením nežádoucích reakcí při intravenózním injlkování.

Tak například jako jeden z pokusů o štěpení interřetězcových disúlfidických vazeb imunoglobulihu k získání polypeptldových řetězců je znám postup, který popsal S. T. Stevenson a spol., Biochem. J. 118, 703 (1960); vyznačuje se tím, že se redukčně štěpí interřetězcové disulfidické vazby lidského imunoglibulinu G působením dithiothreitolu š následujícím alkylováním atomů síry v jodacetamidu. Avšak tento postup je dvoustupňový a navíc se jako produkt získávají alkylované polypeptidý,. alkylóvané na atomech síry, u kterých je vždy potenciální nebezpečí nové antigenicity, Není také snadné převést S-částí ná thiolové skupiny. A proto je rovněž nesnadné získat tímto způsobem vhodné reakčni činidlo na vhodném nosiči, jako je vhodný polymer, za použití aktivního thiolu.

Postup, který popsal Franěk, viz jColl. Czechoslov. Chem. Commus. 29, 1401. (1964), záleží v reakci imunoglobulinu z prasat s natriumsúlfitem a měďnatými ionty za vzniku S-sulfonovaných polypeptidů.

Avšak při reprodukci pokusů popsaných Fraňkem a spol., byly zjištěny tyto nedostatky uvedeného způsobu:

(1) získané denaturováné polypeptidy obsahují měď nebo měďnaté ionty mimořádně nesnadno odstranitelné až v podstatě neodstranitelné, (ii) denaturované polypeptidy se vyznačují prudce klesajícím vázáním antigenu, i když mohou mít požadovanou nízkou antikomplementovou aktivitu, (lil) a původní konformace imunoglobuUnu je rozrušena a změněna, jak je to patrné z měření optické aktivity, jak dokládají dále uvedené kontrolní výsledky.

Skutečnost, že je v podstatě nemožné odstranit menší zbylé podíly mědi z déhatm rovaných -polypeptidických produktů podle Fraňka a spol., znamená, že získaný produkt je tepelně nestálý, je náchylný ke tvorbě agregátů a zjevně je fyziologicky nežádoucí pro použití k Intravenózním injekcím, viz D. A. Derbe, Arthritis and Rheumatism 17, 85 (1974).

Úkolem vynálezu je připravit nové imunoglobulinové deriváty, neobsahující ani měď ani měďnaté lonty, přičemž se selektivně štěpí interřetězcové disulfidické vazby spojující dva polypeptidové těžké řetězce' (H řetězce) a. dva polypeptidové lehké řetězce (L řetězce) v imunoglobulinu, nebo se štěpí kromě uvedených interřetězcových disulfldlckých vazeb část intrařetězcových disulfidických vazeb, a štěpením, obnažené atomy síry se sulfonují (S-sulfonace)·; vynález •se také týká přípravy vodných přípravků prp injekce s obsahem nových imunoglóbu* linových derivátů.

Nové imunoglobulínové deriváty mají sníženou antikomplementovou účinnost za podržení mimořádně vysoké antilátkové účinnosti v lidském těle. po delší dobu fl vyznačují se nepatrnými nežádoucími vlastnostmi a vynikající antilátkovou aktivitou s možností rekonstruování nativního imunoglobulinu in vivo.

Vynález se týká způsobu přípravy nových imunoglobullnových derivátů s jednotnou kvalitou a stabilitou selektivním štěpením v podstatě pouze interřetězcových disulfidických vazeb spojujících těžké řetězce (H řetězce] a lehké řetězce (L řetězce) imunoglobulinu se sulfonováním atomů síry.

Způsobem podle vynálezu se připravují nové imunoglohulinové deriváty vazby v prů195693 měru β až 5 interřetězcových disulfidických vazeb, nebo inteřř.etězcových a intrařetězcových vazeb nativního imunoglobulinu štěpeno, čímž vznikají atomy síry, které se sulfonují') za vzniku, seskupení vzorce —S—SOs.

Předmětem vynálezu je tedy způsob přípravy; imunoglobulinových derivátů, který je vyznačený tím, že se štěpí interřetězcové a intrařetězcové disulfidické vazby imunoglobUlinu a sulfonují* se vytvořené atomy síry reakcí se sloučeninou schopnou odštěpovat tetrathionátové lonty a se sloučeninou schopnou odštěpovat sulfitové ionty najednou nebo po sobě v jakémkoliv pořadí, ve vodném prostředí při hodnotě pH 3,5 až 10 a v nepřítomnosti oxidačních kovových iontů, jako jsou ffišunaté ionty, při teplotě 10 až 50 °C, přičemž tetrathionátové a sulfitové ionty jsou v reakčním prostředí v koncentraci molárně 2- a lOOnásobné Se zřetelem na počet. dtsůlfidičkých vazeb imunoglobulinu.

Zvláště se nové iihunoglobulinové deriváty podle tohoto vynálezu vyznačují tím, že se selektivně štěpí v průměru asi 3 až 4,5, zvláště pak asi 4,5 z v podstatě interřetězc ových disulfidlckých vazeb nativního itnunóglobulinu, a takto. štěpením obnažené atomy síry se sulfonují, přičemž se postup provádí v podštatě v nepřítomnosti iontů oxidujících kovů, .jako jsou měďnaté ionty.

Způsobem podle vynálezu připravené nové imúnoglpbulínovéderiváty jsou charakterizovány tím, že /. ...

1. vznikají štěpením v průměru 3 až 5 interřetězcových nebo 3 až. 5 interřetězcových a intrařetězcových disulfidických vazeb nativního imunoglobulinu sulfinací štěpením vzniklých atomů síry za vzniku skupin vzorce —S—SOs;

2. imunoglobulinový derivát obsahuje nejméně 1,0 mez. jednotek/ml antidifteriového titru za koncentrace 10,0 % hmotnostních.

Z imunoglobuljnp.vých derivátů podle vynálezu se mohou připravovat přípravky, rozpustné ve vodě, použitelné k výrobě injekčních roztoků, smícháním s rozpouštědly Zdravotně neškodnými. Rovněž rozpouštěním přípravku, rozpustného . ve vodě, lze připravit vodné, .přípravky pro intravenózní infikování. ;

Zvláště výhodnými imunoglohulinovými deriváty podle výnálézu jsou ty, které mají v průměru v podstatě rozštěpeno 4,5 intérřetězcových disulfidických vazeb nativního imunoglobulinu, a takto vzniklé atomy síry (v podstatě v průměru 9 .atomů) se sulfonují. Tyto výhodné imunoglobulinové deriváty vznikají štěpením v podstatě pouze interřetězcóvých dišulfidických vazeb, spojujících .H-řetězcé a L-řetězce nativního imunoglobůlinu, a takto vzniklé atomy síry se sulfonují.

Nové imunoglobulinové deriváty podle vynálezu je možno připravit reakcí nativního imunoglobulinu se (A) sloučeninou, schopnou tvořit tetrathionátové ionty, a se (B) sloučeninou, schopnou tvořit sulfitové ionty ve vodě, takže I se štěpí v průměru 3 až 5 interřetězcových disulfidických vazeb, ne-, bo interřetězcové a intrařetězcové disulfidické vazby nativního imunoglobulinu, a vzniklé atomy síry se sulfonují (S—SOs). Je možno štěpit nejprve převážně interřetězcové disulfidické vazbý nativního imunoglobulinu.

. Proto tedy imunoglobulinové deriváty podle vynálezu, kde v průměru 3 až 4,5 intramolekulárních disulfidických vazeb nativního imunoglobulinu je štěpeno a vzniklé atomy síry jsou sulfonovány, lze pokládat za produkty, kde byly štěpeny v podstatě pouze interřetězcové disulfidické vazby na-, íivníiiu imunoglobulinu, a vzniklé atomy síry byly sulfonovány.

- Postup podle vynálezu se s výhodou provádí ve vodě, ale použité prostředí .není v žádném případě omezeno na vodu a může se použít jakékoli jiné vodné prostředí, pokud nemá nežádoucího vlivu na reakcí podlé vynálezu. .

Podle vynálezu se působí na. nativní imunoglobulin (A) sloučeninou, ze které mohou vznikat tetrathionátové ionty, a · (B) sloučeninou, ze které mohou vznikat sulfitové ionty, a to ve vodě. tak, že v průměru se štěpí 3 až 4,5 interřetězcových disulfidlckých vazeb, nebo navíc k v podstatě interřetězcovým, vazbám menší množství intrařetšzcových dvojných vazeb, přičemž počet štěpených intramblekulárních disulfidických vazeb je nejvýše v průměru 5, a v podstatě všechny takto vzniklé atomy sirý se sulfonují.

jako sloučenina (A), ze které mohou vznikat ve vodě tetrathionátové ionty, přichází v úvahu kyselina tetrathionová, její odpoví- , dající soli alkalických kovů, jako je sůl sodná, draselná a podobně, jakož i další soli uvedené kyseliny, pokud jsou rozpustné ve vodě, například sůl amonná, která je výhodná, přičemž se může použít kterékoli jiné látky, pokud z ní vznikají ve vodě tetrathionátové iontý.

Jako typické příklady sloučenin (B), ze kterých mohou vznikat ve vodě sulfitové ionty, lze uvést kyselinu siřičitou, sulfit sodný nebo draselný, kyselý sulfit sodný, ale může se opět použít jakékoli jiné sloučeniny, pokud z ní vznikají ve vodě sulfitové ionty.

Sloučenina (A), ze které vznikají ve vodě tetrathionátové ionty, působí jako oxidační činidlo. Na druhé straně sloučenina (B),ze které vznikají sulfitové ionty ve vodě, působí jako redukční činidlo, jakož i S-sulfonující činidlo.

Množství sulfitových a tetrathionátových iontů má být v každém z obou příkladů- takové, že odpovídá nejméně 2-molárnímu poměru, přepočteno na interřetězcové, nebo -interřetězcové a intrařetězcové disulfidické

195B93 vazby nativního globulinu, které se mají štěpit. Může to být také stonásobek (mplárně] se zřetelem na vazby, které se mají štěpit, nebo i vícenásobek.

Je výhodné rozpustit sloučeniny (A) a (B), zvláště pak (BJ ve vodě nebo v roztoku pufru předtím, než se přidávají do reagujícího systému podle vynálezu.

Reakce, jež probíhá podle vynálezu, se dá popsat tak, že se interřetězcové disulfidické vazby nativního imunoglobulinu štěpí sulfitovými ionty, přičemž jeden z atomů síry přechází na S-sulfonátovou skupinu {—S— SO3), a druhý na thiolovou skupinu (—SHJ, a vždy 2 z takto vzniklých thiolových skupin se oxidují tetrathionátovými ionty za vzniku disulfidické vazby; nebo může thiolová skupina reagovat s tetrathionátovými ionty za vzniku S-thiosulfátu (·— S—S2O3), a toto seskupení reaguje se-sulfitovými lonty. Reakci lze tedy opakovat.

V důsledku průběhu popisované reakce se štěpí interřetězcové disulfidické vazby nativního imunoglobulinu a takto vzniklé atomy síry jsou v obou případech převedeny na S-sulfonátové skupiny ( — S—SO3J v těžkých i lehkých řetězcích.

Postup podle tohoto vynálezu se provádí/ s výhodou za teploty nejvýše 50 °C, žvláště v rozmezí 10 až 50 °C, obzvláště 15 až 48 °C, přičemž je pochopitelně možno provádět postup za teplot nižších.

Obvykle za teplot nad 50 °C, zvláště nad 55 °C, může dojít k denaturaci nativního Imunoglobulinu, a dochází k štěpení intrařetězcových disulfldických vazeb. Takže podobných vysokých teplot je třeba se vyvarovat.

Při předmětném postupu je třeba se spíše vyvarovat přítomnosti činidel, rozrušujících proteiny, jako je močovina nebo guanidin, používané při S-sulfitolyse insulinu nebo ribonukleázy, viz J. L. Bailey a spol., J. Biol? Chem. 234, 1733 (1959). Pokud še však takové látky použijí, pak nejvýše do množství 2,0 molu na mol nativního imunoglobulinu.

Reakční doba kolísá v závislosti na typu imunoglobulinu, množství činidla, reakční teplotě a přítomnosti denaturačního činidla, jako je močovina a podobně. Výhodná hodnota pH v reakční kapalině je asi 3,5 až 10, zvláště 6 až 9. Za hodnot pH pod 3,5 dochází spíše ke štěpení intrařetězcových disulfldických vazeb v části Fc nativního imunoglobulinu. Za hodnot pH nad 10 se protein, tvořící podstatu globulinu, denaturuje, což je spojeno s nežádoucími důsledky, jako je inhibování či snižování antikomplementové účinnosti a snížení aktivity při vázání antigenu.

Postup, v jakém se. přidávají jednotlivé složky při reakci podle tohoto vynálezu, nemá rozhodující význam.

Po provedení reakce se reakční směs dialyzuje proti vodě a vhodnému roztoku pufru, jako je vodný roztok chloridu sodného s obsahem 0,01 M fosfátového pufru (pH .8

7,4J a 2,5 % glycinu, a tímto postupem lze potom získat imunoglobulinové deriváty podle vynálezu.

Nové imunoglobulinové deriváty podle vynálezu lze navíc dále dělit na. L-řetězce a H-řetězce (lehké a těžké řetězce) sloupcovou chromatografií za použití kolony š náplní· vhodné pryskyřice, například molekulárního síta na bázi zdextranu zesítěného na trojrozměrnou strukturu, použitelného pro filtraci gelů označovaného Sefadex G-75 s použitím rozpouštědel, jako 1 M roztok kyseliny propionové.

Způsob podle vynálezu není však v žádném případě omezen na shora uvedené a specifické podmínky.

Do rozsahu vynálezu spadá každý postup,

1-.4 ~ ,.4..,1,,, nwc {je wvuwí Uu QirjAu aalÍlívxai iuiuiiDgliJuu lín s (A) tetrathionátovými ionty, a (B) sulfitovými ionty ve vodě, jak bylo shora uvedeno, a štěpí se převážně interřetězcové disulfidické vazby nativního imunoglobulinu a sulfonování s atomy síry, uvolněné štěpením.

Počet S-sulfonátových skupin (—S—SO3) v nových imunoglobulinových derivátech podle vynálezu se může stanovit například provedením obdobného postupu za použití radioaktivního sulfítu sodného a stanovením S-sulfonátových skupin, značených ⁵⁵S, ve vzniklém imunoglobulinovém derivátu kapalinovým šcintilačním počítačem, jak bude uvedeno v příkladech.

Polovina průměrného počtu značených S-sulfonátových skupin na molekulu imunoglobulinového derivátu, takto stanovená, odpovídá průměrnému počtu štěpených iiitramolekulárních disulfidickýčh vazeb ve výchozím nativním Imunoglobulinu.

Na druhé straně je možno imunoglobulinové deriváty, obsahující v průměru asi 9 - S-sulfonátových skupin na molekulu, to je skupin, které vznikají štěpením v průměru

4,5 disulfidických vazeb nativního imuno. globulinu sulfonováním vzniklých atomů síry podle vynálezu, frakciónovat na H a L řetězce za použití například kolony se sefadexem G-75 nebo G-200, s výhodou za přítomnosti menšího množství močoviny nebo guanidinu a za použití roztoku kyseliny propionové jako rozpouštědla, jak bylo shora uvedeno.

Při způsobu podle vynálezu ize použít jakékoliv kombinace reakčních podmínek, pokud jsou vhodné pro přípravu imunoglobulinových derivátů, obsahujících v průměru 9 S-sulfonátových skupin na molekulu, které lze dále frakcionovat na řetězce H a L za použití shora popsané sloupcové chromatografie. Jakmile se empiricky stanoví taková kombinace reakčních podmínek, je možno vhodným způsobem řídit počet štěpených disulfidických vazeb v nativním globulinu úpravou reakční ďobý za zvolené kombinace reakčních podmínek.

Způsob podle vynálezu je blíže objasněn v připojených příkladech, které rozsah vynálezu neomezují, a na připojených obrázcích. . ' Obr. 1 vyjadřuje vztah mezi reakční dobou, nanesenou v hodinách na ose x, a počtem skupin —S—-SO3“ obsažených v reákčním produktu; tento počet je vyjádřen v moléch/mol imunoglobulinu Ig. Použití natriumtetrathionátu vyznačeno bílými kolečky, použití sloučenin dvoumocné mědi k oxidaci vyznačeno černými kolečky. Šipka vyznačuje přidání močoviny.

Obr. 2 vyjadřuje vztah mezi reakční dobou (vyznačenou v hodinách, na ose x) a antikomplémentovou aktivitou (vyznačenou v procentech na ose y) imunoglobulinového derivátu získaného oxidací jak hatriumtetrathicnáícm, tak sloučeninami dvoumocné mědí. Šípka opět znázorňuje přidáni močoviny.

Obr. 3 znázorňuje vztah mezi reakční dobou (vyznačenou na ose x v hodinách) a mezi antidifteriovým titrem (na ose y v mezinárodních jednotkách/ml) získaných imunoglobulinových derivátů. Prázdné sloupce odpovídají oxidaci natriumtetráthionátem, zatímco čárkované sloučeninami dvoumocné mědi. Svislá čára na konci každého sloupce znázorňuje odchylku od antidifteriového titru. Šipka znázorňuje přidání močoviny.

Obr. 4 znázorňuje vztah mezi reakční dobou, vyznačenou na pse x v hodinách a mezí optickou otáčívostí [a]_D ²⁵ °C získaných derivátů imunoglobulinu. Reakce se provádí za použití 2,5% roztoku imunoglobulinu (podobně jako podle obr. 5 a 6). Oxidace natriumtetrathionátem. vyznačena bílými kolečky, sloučeninami dvoumocné mědi černými kolečky. Šipka opět „vyznačuje přidání, močoviny.

Obr. 5 znázorňuje změnu zákalu při tepelném zpracování imunoglobulinových derivátů se změnou reakční doby. Na ose x je vyznačena doba v hodinách; na ose y optická hustota OD₆₅onm při 65Ó nm, což je index zákalu.

' Obr. 6 znázorňuje vztah mezi reakční dobou vyznačenou v hodinách na ose x a obsahem mědi, vyznačeným v ,ug/ml na ose y v získaných imunoglobulinových derivátech.

Obr. 7 znázorňuje výsledky dialýzy v močovinovém roztoku a chromatografie reakčního produktu. Na ose x je vyznačeno číslo frakce, na ose y optická hustota OD₂₈o při 280 μιη.

Obr. 8 horní část znázorňuje vztah mezi optickou hustotou OD₂₈o vynesenou na levé ose y a radioaktivitou vyjádřenou v dpm (pokles/min), vynesenou na pravé ose Y frakcí, vynesených na ose x, dělených dialýzou, zpracovaných močovinou a-chromatograf ováných;

spodní část znázorňuje molární podíl skupin S—SOs, zjištěný výpočtem z poklesu radioaktivity podle hprního diagramu; na ose y je vyznačen molární podíl skupin —S—SOj“, na ose x číslo frakce.

Obr, 9 znázorňuje optickou hustotu (na ose y) každé frakce (na ose x) oddělené chromatografií S-sulfonovaného imunoglobulinu v souvislosti, s obr.: 7; neprovádí se však zpracování močovinou. - ’

Obr. IQ znázorňuje výsledky ίή vivo antíkomplementové zkoušky S-sulfonovaného globulinu. Černá kolečka odpovídají Š-sulfonovanému- globulinu, bílá solance, Λ lidskému imunoglobulinu, použitých pro kontrolu. Na ose x je vyznačena doba v minutách po intravehózní injekci morčeti a na ose y komplementový titr.

Obr. 11 znázorňuje stálost in vivo S-sulfonovaného globulinu. Na ose x je počet dní po intraveriózní injekci králíku, ha ose y titr indikující pasivní hemaglutlnaci. Křivka jj— platí pro obchodní í(ab‘j2, křivka —υ—φ—©— platí pro S-sulf onovaný anti-BS A—DNP-imunoglobulin a křivka — Δ — jk— pro intaktní BSA-DNP-imunoglobulin.

Při postupu, použitém v příkladech, byla použita tato činidla:

Iminoglobulin (lidský) I: .15% roztok lidského imunoglobulinu pro intramuskulární Injekce v pufrovaném roztoku chloridu sodného (neutrální pH) s obsahem 2,5 % glycinu (produkt Chems-Sero-Therapeutlc Research Institute);

χ-globulin Fr (lidský), II (lidský imunoglobulin II), Nutritional Biochemieals Corporation (USA);

Sodná sůl kyseliny tetrathionové, připravuje se bezprostředně před použitím reakcí thiosulfátu sodného (NaaSzOí. 5 H2O) a jodu ve vodném ethanolu, sulfit sodný (Komuně Kagaku Yakuhin, Co), sulfit sodný (NazSOj), značený ³⁵S⁺ (New England Nuclear, USA).

< . Pufr „Tris HC1“, to je tris(hydroxymetiiyl)áriiinomethan (Nakarai Kagaku Yakuhin Co), spec. výrobek pro biochemické výzkumy zd pH sníženého přidáním 1 N vodného roztoku chlorovodíku.

Antilátkóvá účinnost a aiitikomplementární účinnost se měří takto:

Měření antidifteriového titru:

Reakce: použije se reakce sensibilizované pasivní hemaglutinace (poznámka 1). Krevní buňky: lidské červené krvinky (pozn. 2) po působení formaldehydu se vystaví účinku bis-diazo-benzidinu (pozn. 3.) a sensibilizují se záškrtovým toxinem.

Kontrola: Standardní antilátka na difteťli (NIH, Japonsko), (pozn. 1) NIH (Japonsko) způsob, viz B. Murata, č. 21, Tokyo Veteřinaian & Animal Husbandry (1975), (pozn.

2), viz W. T. Butler, J. Immunol. 90, 663 (1963), (pozn. 3), j. Dordon, B. Rose, A. H. Sehon, J. Exp. Med. 108, 37 (1958).

, Měření antilátek na spalničky, zarděnky a příušnice (pozn. 4 až 9):

Reakce: Postup na mikrodestíčkách s výjimkou příušnic, kdy se používá postup se zkumavkami.

9 5 8 9 3

Antigen: Antigeny pro hemaglutlnování [Toshiba Chemicals).

Kontrolní sérum: Standardní' antisérum (Toshiba Chemicals), s výjimkou příušnic, kdy se používá standardního antiséra (NIH, Japonsko). ’ ' Pozn. 4: provedení hemaglutinační inhiblce, test na příušnice mikrotitrační metodou: NIH, Japonsko, pozn. 5: sekvence pro měření lidského ímunoglobulinu jako antilátková aktivita vůči příušnicím: NIH, Japonsko, pozn. 6: T. Toyama, Clinical Examinatlons 16, č. 29 (1972), pozn. 7: „An Introductlon to Virus Empirical Science“, vyd' NIH Japan Alumi. pub., vydavatelství Maruzen (1973), pozn. R: ..Recnmmendert Rpeclficatlon for Mlcroblological Reagents, US Depť. of HEW, duben, 1965, pozn. 9: „Mumps (příušnice) HI Řeaction Techniques“, NIH, Japonsko.

Měření antikomplementové aktivity:

Použije se postupu, který popsali Kabat & Mayer v „Experimental Irnmunochemistry“, str. 225 (1961). Jednoprocentní roztok imunoglobulinového roztoku, obsahujícího sérum z morčat, 20 CHso/ral, sé přidá do 5 ml GVB⁺⁺ za vyhřátí na 37 °C po dobu hodiny, a spotřebovaný antikomplejpěnt se stanoví uvedeným postupem. Hladina antlkomplementové aktivity je dána procentem spotřeby vůči 20 CHso/mí.

Příklad 1

Korelace reakčních podmínek s počtem štěpených disulfidických vazeb

Situace Τ

Do 51 mg výše uvedeného lidského imunoglóbulinu II se přidá 36 mg ³⁵S-značeného sulfitu sodného a 22 mg tetrathlonátu sodného a vodný roztok 0,1 M pufru tris-HCl (pH 8,2) za vzniku vzorku o objemu 5,0 ml, který se zahřeje na 45 °C, a další reakce se provádí za této uvedené teploty. Ihned po smíchání se odebere 0,5 ml reakční směsi a další vzorky po 0,5 ml za 30 minut, hodinu, 2 hodiny, a dále 4 hodiny, 7,4 hodin a 24 hodin průběhu reakce. Každý ze vzorků se smíchá s .10 ml 50% nasyceného roztoku sulfátu amonného za chlazení ledem, vše se ponechá stát 15 minut za chlazení ledenii načež se vyloučená sraženina odstředí. Znovu po promytí z 50% nasyceným roztokem sulfátu amonného se změří radioaktivita vzorku za použití kapalinového scintilačního počítače, a z výsledku se propočte počet—S—SOs skupin.

Situace II

Reakce se zahájí za stejných podmínek, jako v situaci T, aíe hez vzorkování během, reakce. Za 4 hodiny po začátku reakce se přidá do reakční směsi vodný 10 M roztok močoviny tak, že koncentrace močoviny v reakční směsi je 4 M.Za5a6hodin reakce, to je za hodinu a 2 po přidání močoviny se odebere z každé kapaliny vzorek 0,5 ml, a ten se zpracuje podobně, jak to bylo uvedeno u vzorků ze situace I.

Situace III

Reakce a-úprava vzorků jako v situaci I s tou výhradou, že se reakce provádí za teploty 0 C. ,

Situace IV

Reakce a úprava vzorků jako v situaci I s tou výhradou, že se reakce provádí za teploty 25 °C.

Situace V .

Reakce a úprava vzorků jako v situaci I s tím rozdílem, že se nepoužije tetrathionát sodný (NazSjOe. 2 H2O].

Výsledky reakcí, provedených za situace I, II, III, IV a V jsou shrnuty v následující tabulce 1.

TABULKA 1

Korelace reakčních podmínek s počtem vzniklých skupin —-S—-SO3

Reakční doba, hodin 0 . 0,5

Reakční situace

I (45 °C) 0 6,1

II (45 °G, po 4 hodinách přidání močoviny) — —

III (0°C) , 0 0,5

IV(25°C) ·-, 0,2 1,6

V (bez NažStOs. 2 HzO) 0 0,5

Počet štěpených disulfidických vazeb odpovídá polovině počtu seskupení —-S—SO3.

Z výsledků reakcí, shrnutých v tabulce 1, lze odvodit toto. Provádí-li se předmětný ρο-

1	2	4	5	. -6	7,4	24
9,0	8,9	9,4	—	—	8,9	10,4
	.—	—	10,9	13,3 -
1,6	2,5	2,9	—'	— .	3,4	. 5,0
4,1	5,0	4,5	—	—	7,0	. 8,5
0,8	1,1	0,8	—	—		4,5
stup	za přítomnosti tetrathiortátu	a	sulfitu

sodného při 45 °C, pak za situace I dochází k štěpení asi 3 disulfidických vazeb, a dosahuje se průběh asi 4,5 během 1 až 7 hodin reakce, a průměr asi 5,2 za 24 hodin reakce.

Provádí-li se reakce· totožným postupem, ale za teploty 25 °C (situace IV), sníží se počet štěpených disulfidických vazeb, přičemž počet štěpených vazeb dosahuje v průměru asi 4,3 za 24. hodin reakce. Pracuje-li se za teploty 0 °C (situace III), pak průměrný počet štěpených disulfidických vazeb se ještě dále sníží. Avšak bez přítomnosti tetrathionátu sodného (situace V) nedochází k hladkému průběhu štěpení disulfidických vazeb. Přidá-li se močovina do reakčního systému (situace II), pak se průměrný počet štěpených disulfidických vazeb prudce zvýší po přidání močoviny.

P ř í k 1 a d 2

Srovnání zhoršení fyzikálních vlastností, přidává-li se jako oxidační činidlo tetrathionát sodný nebo měďnaté ionty.

Situace I

Ke směsi 2,0 g shora definovaného lidského imunoglobulinu II, 1,42 g sulfitu sodného a 0,86 g tetrathionátu sodného NazSíOe. 2 HzO se přidá 0,1 M tris-HCl pufr (pH 8,2) tak, že se objem reakční směsi doplní na 200 ml, a nechá se reagovat ,-za počáteční teploty 45 °C. Ihned po začátku reakce, ά pak za 30 minut, hodinu, dvě a čtyři se odebere vždy vzorek 15 ml reakční kapaliny,.. a bezprostředně po pátém odebrání vzorku se přidá ke zbytku reakční kapaliny 10 id roztok močoviny tak, že. se dosáhne koncentrace močoviny 4M, a v. reakci se pokračuje. Za 5 a 6 hodin, reakce, to je za hodinu a 2 po přidání močoviny, se odebere vzorek 22,5 ml reakční kapaliny, a vždy se přidá 22,5 ml ledem chlazeného nasyceného roztoku' síranu amonného, načež se reakční směs nechá stát 30 minut za chlazení ledem. Vzniklá sraženina se po odstředění promyje roztokem síranu amonného, nasyceného z 50 %, a dialyzuje se 24 hodin proti pufrovanému roztoku chloridu sodného o pH 7,4. Virkingovou trubicí. Po dialýze s,e odeberou vzorky v množství potřebném pro Specifickou analýzu, vzorky se ředí pufrovaným roztokem chloridu sodného o pH 7,4, obsahující 2,5 % glycinú, a analyzují se.

Situace II

Opakuje se reakce a zpracování jako v situaci I s tou výjimkou, že se tetrathionát sodný NazSdOe. 2 HzO nahradí 50 mg pentahydrátu sulfátu měďnatého, a reakce se zakončí za 4 hodiny.

Takto získané roztoky různých imunoglobulinových derivátů se použijí k následujícím testům a měřením:

a) Korelace reakčrií doby a počtu skupin —S—SO3

Počet.skupin —S—SO3 ve vzorcích, oxidovaných tetrathionátem NazSíOg . 2 HzO se nanáší (viz oba 1) formou bílých koleček (Oj společně s podobnými údaji, získanými,za situací I a II příkladu 1. Údaje o dalších vzorcích, oxidovaných mědnátými ionty za podobného provedení a zpracování, jako za situace I z příkladu 1 s tou změnou, že tetrathionát sodný byl nahrazen 50 mg pentahydrátu. měďnatého, jsou nanášený na obr. 1 plnými černými kroužky.

bj Korelace reakční doby s antikomplementovou účinností

Antikomplementové účinnosti vzorků, získaných oxidací tetrathionátem sodným Na^SjCls 2 H»Q za aitnqrp T 7-příkladu 2 za zjištění popsaným již postupem jsou nanášeny na obr. 2 rovněž antikomplementové účinnosti vzorků, oxidovaných měďnatými ionty za situace II. Z vyobrazení 2 lze odvodit, že antikomplementové účinnosti všech vzorků se sníží na nejvýše 30 '% za 30 minut reakční doby.

c) Korelace reakční doby s antidifteriovým titrem

U stejného vzorku, jak byl použit ad b) výše, se změří třikrát antidifteriový titr za použití shora uvedeného postupu. Odchylky a střední hodnoty jsou, na obr. 3. Z grafu lze vyčíst, že u vzorků, oxidovaných mědnatými ionty, je titr nikoli vyšší než 0,3 mez. jednotek za 30 minut reakce,. _

d) Korelace reakční doby a optické rotace

U stejných vzorků, které byly použity pro měření antikomplementové aktivity ad b) (koncentrace proteinu 2,5%), se změří optická rotace, přičemž výsledky jsóu zachyceny na obr. 4. Z výsledků lze vyčíst, že, přítomnost mědnatých iontů způsobuje rychle postupující denaturování během reakce, a že přítomnost močoviny průběh denaturace podporuje, jak je to patrné z nápadného vzestupu optické rotace.

Optická rotace byla měřena v tomto' případě za teploty 25 °S v kyvetě 1 cm.

ej Korelace reakční doby se zákalem po tepelné úpravě

Stejné vzorky, které byly použity při měření antikomplementové účinnosti ad b), se zahřívají-na vzduchu 4 hodiny za teploty 50 °C v koncentraci 2,5 %, přičemž výsledky jsou zachyceny na obr. 5. Jak je to patrné z vyobrazení 5, již přítomnost velmi malých množství. mědnatých iontů způsobí zhoršení stálosti za tepla a zvyšuje tendenci k tvorbě aglomerátů.

f] Korelace reakční doby s obsahem mědi

195 6 93

Stejné vzorky, jako byly použity při měření antlkomplementové aktivity ad b), se použijí ke stanovení obsahu měďnatých lontů atomovou absorpční analýzou, přičemž výsledky jsou patrné z obr. 6. Z výsledků lze vyhodnotit, že při použití měďnatých iontů nelze ani proipytím ani dlalýzou vzorku odstranit měďnaté ionty.

g) Dělení těžkých řetězců ,od lehkých

Týž vzorek, jak byl odebrán po dvou hodinách reakce za situace I v případě vzorku 2, se dialyzuje 24 hodin za použití 1 N roztoku kyseliny propionové s.obsahem 6M močoviny, a potom se chromatografuje na koloně se sefadexem G 200 (1,5 cm, 80. cm) za použití uvedeného již vodného prostředí, přičemž výsledky jsou na obr. 7. Prvý pík z levé strany uvedeného grafu značí řetězce H2L2 ještě neoddělené, druhý pík odpovídá řetězci H, a.třetí pík řetězci L. Z grafu je jasné, že vzorek byl rozdělen na řetězce H a L.

Shrneme-11 výsledky, zachycené na vyobrazeních 1 až 7, lze dospět k následujícím uzávěrům: - ,·

1. Jak je to patrné z výsledků za situace I příkladu 1, provádí-li se předmětný postup za přítomnosti tetrathioňátových a sulfitových iontů po jakoukoli dobu od 1 do 4 hodin, je průměrný počet štěpených disulfidických vazeb asi 4,5, a vzniklé atomy síry se

S-sulfonují (průměrný počet S-sulfonátových skupin je přibližně 9) za vzniku S-sulfonovaného imunoglobulinu (obr. 1), který je dělitelný na řetězce H a L za použití například chromatografie na sefadexu G 200 ve sloupci (obr. 7) a má v podstatě totožné hodnoty optické rotace, jako nativní imunoglobulin (obr. 4).

Z výše uvedených výsledků lže bezpečně předpokládat, že nové imunoglobulinové deriváty. vznikají v podstatě štěpením interřetězcových disulfidických vazeb pouze nativního imunoglobulinu a S-sulfonováním štěpením uvolněných atpmů síry, to se zřetelem na skutečnost, že počet interřetězcových disulfidických vazeb v nativním imunóglobulinu je v průměru 4,5.

U takových imunoglobulinóvých derivátů dochází ke snížení antikomplementové účinnosti na nejvýše 10 %, tedy na hodnotu podstatně nižší, než jakou se vyznačuje nativní lmunoglobulin (obr. 2), ale současně se takové imunoglobulinové deriváty vyznačují antidifteriovým titrem nikoli v podstatě nižším, než jak tomu bylo u nativního imunoglobulinu, jak je to totiž patrné z takřka shodné činnosti vazby antigenu. jak je to patrné z obr. 3, za koncentrace 10 % hmotnostních si podržuje imunoglobulinový derivát aktivitu vazby antigenu nejméně 1,0 mez. jedn/ml.

2. S-sulfonované imunoglobulinové deriváty, vzniklé štěpením méně nebo vlče než průměrně 4,5 disulfidických vazeb nativní16 ho imunoglobulinu, například v průměru nejméně 3 a nejvýše 5 za S-sulfonování atomů síry, se vyznačují poněkud menším snížením antikomplementové účinnosti a nižší účinností vazby antigenu ve srovnání s výhodnými imunoglobulinovýml deriváty, které byly výše popsány ad 1. (obr. 2 a 3), ale stále ještě se vyznačují podstatně zlepšenou aňtikomplementovou účinností ve srovnání s nativním imunoglobulinem.

3. Jestliže se však nahradí tětrathionátové ionty Jako oxidační činidlo měďnatými ionty, pak vzniklé imunoglobulinové deriváty obsahují měďnaté ionty, i když ve velmi nízké koncentraci, jež má tendenci se zvyšovat, s prodlužující se reakční dobou (obr. 6). Také počet štěpených disulfidic,kýnh vazeb nativního imnnngjohuliriu se zvyšuje s prodlužováním reakční doby (obr. 1), a v důsledku toho je obtížné vyrobit předmětné imunoglobulinové., deriváty za štěpení v průměru v podstatě 4,5 disulfidických vazeb nativního imunoglobulinu za zachování stability.

Dále pak se u imunoglobulinových derivátů, získaných použitím měďnatých iontů, jeví snížení - antikomplementové účinnosti (obr. 2), ale současně podezřele klesá jejich antidifteriový titr ve srovnání s titrem nativního imunoglobulinu.. Je tedy jejich účinnost se zřetelem na vazbu antigenu mimořádně snížena (obr. 3). U imunoglobulinových derivátů se opět jeví, jakmile reakční doba přestoupí 1 hodinu, optické rotace, lišící se od nativního imunoglobulinu, což znamená, že došlo ke strukturálním změnám proteinů, které jsou základem jejich konstituce.

4. Podobné změny optické rotace lze rovněž pozorovat u imunoglobulinových derivátů, připravených ve shodě s předmětným postupem, ale za přidání močoviny během reakce. Z tohoto důvodu se doporučuje nepřidávat močovinu, guanidin a podobné látky do reakčního systému.

Příklad 3

Selektivní štěpení interřetězcovýCh disulfidických vazeb ml vodného roztoku, obsahujícího 20 mg lidského imunoglobulinu I, 80 mg značkovaného sulfitu sodného ^MS—Na2SO2⁺ (8,22. . 10¹¹ dpm/mol) á 40 mg tetrathlonátu sodného Na2S40e. 2 HzO se upraví na hodnotu pH 7,2 přidáním kyseliny octové, a reakční směs se nechá reagovat 2 hodiny při 39 °C. Potom se reakční kapalina dialyzuje 24 hodin proti 5 litrům vody, a pomalu se přidává močovina a kyselina propionová až do dosažení konečné koncentrace 4 M a popřípadě 1 N. Z roztoku před nanesením na chromatografickou kolonu se odebere vzorek 0,1 ml, přičemž údaje jsou na levé ose pořadnic obr. 8. Zbytek se chromatografuje na koloně Sefadexu G200 (průměr 1,5 cm

193693

18 na výšku 100 cm) v rovnovážném stavu za použití 1 N roztoku kyseliny propionové s obsahem 4 M močoviny.

Radioaktivita vzorků se měří za OD_28Q u každé frakce za použití kapalinového scintilačního počítače, přičemž výsledky jsou na obr. 8.

P ř í k 1 a d 4

Frakcionace těžkých a lehkých řetězců

K vodnému roztoku, obsahujícímu 100 mg lidského χ-globulinu II, 0,4 g sulfitu sodného a 0,2 g tetrathionátu sodného Na2'S4Q6.2 HzO, se přidá 1 N roztok chlorovodíku tak, že se pH upraví na hodnotu 9,0, načež se nechá reakce probíhat 43 hodin za teploty místnosti. Po proběhnutí reakce se odstraní odstředěním menší množství nerozpustných materiálů, a reakční kapalina se potom dialyzuje za použití Viskingovy trubice proti 2,5 litrům' vody teploty 5 °C, po • dobu 15 hodin, a dále proti 2,5 litrům 1 N vodného roztoku kyseliny propionové při 5°G po dobu . 28 hodin. Dialyzát se chromatografuje na koloně sefadexu G75 (3,5 na 111 cm) za použití 1 N roztoku kyseliny propionové, a polypeptidové řetězce se tím frakcionují. jak je to patrné z obr. 9, jsou na grafu 3 píky, u nichž bylo zjištěno, s přihlédnutím k molekulovým hmotnostem, že jde o nefrakclonovaný S-sulfonovaný imunoglobulin, S-sulfonované H-řetězce a

S-sulfonované L-řetězce. Identifikace byla provedena imunologickými postupy za použití postupu podle Ouchterlony a dále imuno-elektroforézou, jakož i chemičkou analýzou, jako je analýza aminokyselin, stano. vení .obsahu Kéxos a podobně.

Z výsledků na obr. 8’ ái9 lže odvodit tyto závěry:

1. Protože bylo zjištěno, že prvý pík odpovídá néfrakciovanému S-sulfonovanému imunoglobulinu, druhý pík. S-sulfonóvánému H řetězci a třetí pík S-šulfonovanému L řetězci, a to jak imunologickými, tak i chemickými postupy, to s odvoláním na obr. 9, odleva doprava, je rozhodně logické se domnívat, že podobné 3 píky ha vyobrazení 8 jsou odleva doprava přiřaditelné nefrakcionovanému S-sulfonovanému imunoglobulinu, S-sulfonovánému H řetězci a S-sulfonoVanému L řetězci. Rozdíly mezi chrómatografickými tvary jsou způsobeny přítomností močoviny v reakční soustavě.

2. S odvoláním na obr. 8 lze z množství proteinu v L-řetězci, který tvoří třetí pík, propočítat molární koncentraci, a z molární koncentrace a hladiny radioaktivity bylo nalezeno, že L-řetězce, tvořící třetí pík,· obsahují 1,0 skupin S—SOs⁺. Stejným způsobem bylo propočteno,, že počet skupin

S— SO.3+ v řetězci H druhého píku činí 3,4, v hefrakcionovaném ' S-sulfonovaném imunoglobulinu 8,8, a ve směsi před plněním chromatografické kolony 8,6. Jak již bylo ' výšÝŠtíěfíó, “jáhna hisulftdická vazba spojuje řetězec L a řetězec H, zatímco v průměru 2,5 disulfldickýc.h vazeb je mezi dvěma H řetězci. Proto obsahuje lidský imunoglobulin. v průměru 4,5 interřetězcových di; sulfídickýchvazeb.

' 3. Podle výsledku chromatogramu na obr.

. 8 lze dělit největší část S-sulfonovaného .imunoglobulinu, obsahujícího v průměru 8,6 skupin S—SOs⁺, na řetězce H a řetězce L. Lze se proto právem domnívat, že došlo k selektivnímu štěpení interřetězcových disulfihických vazeb, zatímco intrařetězčové disuífidické vazby zůstaly v podstatě nedotčené.

Příklad 5

Jedno provedení reakčního postupu

133 ml lidského χ-globulinu I se rozpustí v 1667 ml 0,06 M fosfátového' pufrti (pH

8,2 y s obsahem 2,5 % glycinu. K roztoku še přidá roztok 7,0 g sulfitu sodného v 100 ml téhož pufru a 4,4 g tetrathionátu sodného NazSíÓe. 2HzO, rozpuštěného v 100 ml Stejného pufru, a reakce se provádí po 3 - hodiny při 45 °C. Reakční kapalina se potom dialyzuje 6 hodin' proti 20 litrům pufrovaného roztoku chloridu sodného za použití . dialyzátoru typu dutého vlákna (ultrafiltr b/HFU-1). Vnější kapalina při dialýze se vyměňuje za každé 2 hodiny. Dialyzát se zahustí na 180' ml za použití téhož filtru a za přidání 50 g glycinu.

Roztok se sterilně filtruje za použití 0,25 am membrány, a objemem 5,0 ml se plní ampulky objemu 10 ml, které se lyofilizují. Antikomplementová účinnost GHso sterilního roztoku o koncentraci 50 % byla 4,3 %. Příklad 6 . Srovnání antilátkavě aktivity na aňtigeny při pokusech s použitím tetrathiOrtičitahu sodného nebo mědnatých lontů jako oxidačních činidel.

Situace I

K 67 ml lidského γ-globulinu I se‘přidá . 7,1 g sulfitu sodného a 0,43 g dihýdrátu tetrathionátu sodného a 0,1 M tris-HCl-pufr s obsahem 2,5% glycinu, na objem 1 litr/ Po tříhodinové reakční dohě při 45 °G se'dialyzuje reakční kapalina za použití ultrafiltru b/HFU-1, dialyzát se zahustí na objem 200 ml, sterilně se filtruje Sěitžovým filtrem 0,25 am, lyofilizuje se za přidání 2,5 g glycinu, a zředí se vodou na. 5,0% roztok.' Protilátkové účinnosti vzorku roztoku jsou uvedeny v tabulce 2.

Situace II

Opakuje se reakce á zpracovávání za situace I, jak je to uvedeno výše s tou vý.193693

20 hřadou,, že se reakční teplota a reakční doba .. . sodného NaaSáCte . 2 HaO použije 0,16 g penzmění na 25 °C a 24 hodin. ,····/, tahydrátu sulfátu měďnatého.

U roztoků imunoglobulinových derivátů, ·'/'.'ΐ./,? · '..' Situace III 1 získaných za použití předchozích situací I až ; < III, se stanoví antilátková aktivita ria různé

Reakce a zpracování za .situace I se opa- antigeny s výsledky, které jsou obsaženy kuje s tou změnou, že se místo tetrathlonátu v tabulce 2.

TABULKA 2 • Antilátkové účinnosti na.různé antigeny

Antigen Záškrt ; jedn./ml

Reakční situace bez změny 0,8

I (NazSáOe, 45 °C/3 hod.) .0,8

Π (NazSdúe, z5“u,.24 hod.) —

III (Cu²⁺, 45 °C, 3 hod.) pod 0,1

Z údajů ve výše uvedené tabulce 2 lze odvodit tyto uzávěry:

1. Použije-li se tetrathionátu (situace I), je titr difterie S-sulfonovaného imunoglobulinu v podstatě stejným jako titr nativního imunoglobulinu, ale použijí-li se měďnaté ionty (situace III), nejeví se u imunaglobulinového derivátu takřka žádná účinnost.

2í Se zřetelem na titr spalniček, pak S-sulf onované imuňoglobulinové deriváty, získané oxidací tetrathioničltanem (situace I a II) podržují vícé než 60 % aktivity nativního imunoglobulinu, ale v případě použití oxidace mědnatými ion·/ (situace III) klesá účinnost pod 30 '%.

Z těchto skutečnosti lze odvodit, že při použití měďnatých iont ji je snížení antilátkové účinnosti větší, než v případě použití tetrathioničitanu.

Příklad 7

Antikomplementový test in vivo za použití S-sulfonovaných globulinů.

Postupem, podobným situaci I z příkladu 6, se připraví S-sulfonovaný lidský imunoglobulin.

ml 5% pufrovaného roztoku chloridu sodného s obsahem 2,5 % glycínu o pH 7,4, dále 3 ml pufrovaného roztoku chloridu sodného jako kontrolní pokus a 1 ml 15ψο nativního lidského imunoglobulinu (tedy bez úpravy) v pufrovaném roztoku chloridů. sodného s obsahem 2,5 % glycinu, rovněž jako kontrolní pokus, se podává intravenosně samičkám morčat o hmotnosti 200 až 300 g, a hladina komplementu v séru testovaných jedinců se . změří za použití 1,0 ml séra, extrahovaného v každém případě kardiopunkcí v pravidelných Intervalech.

Výsledky jsou uvedeny v tabulpe 10. Z obr. 10 lze odvodit, že pokles hladiny komplementú v séru byl pozorován v případě

Spalničky Zarděnky Příušnice jedn/pil relativně relativně

6,7 17jL 11

5,0 170 —

4,4 - 10 pod 2 — testovaných jedinců po intravenosní injekci nativního lidského imunoglobulinu, což se 'roynalo. nule za podobného podávání lidského S-sulfonovaného imunoglobulinu. Rovněž bylo pozorováno, že se morčata občas zatřesou po injikovárií, k čemuž nedochází v případě injikování S-sulfonovaných. imunoglobulinů morčatům. Z těchto zjištěných skutečností lze ^bezpečně odvodit, že imunoglobulinový derivát podle tohoto vynálezu je prost nežádoucích reakcí in vivo. Příklad 8

Trvanlivost S-sulfonovaných imunoglobulinů v králících in vivo, a nový .vznik disulfidických vazeb.

(a) Příprava králičí antllátky na albumin z hovězího séra-DNP

Na albumin z hovězího séra se působí dinitrofluorfenolem za vzniku látky, jež zde nadále bude označována zkratkou BSA-DNP. Ta se injlkuje králíkům (samečci druhu bílých, ňovozélandských) na zadních tlapkách spolu s Freunďovým kompletním adjuvans s' následující imunisací. Za 30 dní po injekci se vypustí krev králíků z arterie karotis. Takto získané antisérum se zpracuje postupem, který je jako takový znám, a to srážením za použití 45% nasyceného roztoku síranu amonného, a získá se tím králičí anti BSA-DNP-imunoglobulin.

(b) Příprava vzorků:

Situace 1 '

Anti-BSA-DNP-imunoglobulin se. hydrolysuje při 37 °C po 24 hodin spolu s hmotnostně 1%, přepočteno na imunoglobulin pepsinu, podle A. Nisonoffova postupu, viz Arch. Biochem. Biophys. 89, 230 (1960). Hydrolysát se chromatografuje na koloně Se195693 : 21 fadexu G 150, a získá· . se tím fragment F(ab‘)2.

Situace 2

250. mg anti BSA-DNP-imunoglobulinu, 180 mg sulfitu sodného a 79 mg tetrathionátu sodného (NažSiOe. 2H2O) se rozpustí v 25 ml 0.1 M tris-HCl s obsahem 2,5 % glycinu (pH 8,2), a roztok se ponechá reago• vat 4 hodiny při 37 °C. Reakční kapalina se dialysuje 24 hodin proti pufrovanému roztoku chloridu sodného (pH 7,4) za vzniku králičího S-sulfonovaného imunoglobulinu.

Situace 3

Výše uvedený specifikovaný BSA-DNP-imunoglobulln se použije jako takový.

(c) Měření převrácené rychlosti a trvanlivosti. '

Vzorky, připravené, jak je výše popsáno, se v každém případě upravují do roztoků o koncentraci 5%.

. Vzorky roztoků se intravenosně injikují samečkům králíků (druh novozélandský, bílý, vzorek 1:3 králíci, vzorek 2:3 králíci, a vzorek 3:2 králíci) za dávkování aši 3 ml. Z testovaných zvířat se vypustí krev v předem určených intervalech, a extrahuje se jejich plasma. Anti ESA-DNP-aktivita, plasma se stanoví pasivní hemaglutinační reakcí, viz T. Matsuhashi, Chemistry & Biology 9, 396 (1971), kdy se BSA-DNP fixuje na červené krvinky ovcí za použití glutaraldehydu, a použije se i mikrotitrační způsob s výsledky, které jsou zachyceny na obr. 11.

Jak je jasně patrné z obr. 11, je převrácená rychlost in vivo mimořádně krátká pro obchodně dostupný F (ab‘)2, což znamená krátké trvání farmaceutické účinnosti. Na rozdíl od toho se vyznačují S-sulfonované imunoglobuliny přibližně stejným poločasem ve srovnání s nativním imunoglobulinem, což značí trvalý farmaceutický účinek.

(d) Měření hemolytické aktivity 'antllátek

Specifikovaný nativrtí anti-BSA-DNP-imunoglobulin se intravenosně injikuje králíkům, jejich plasma se jímá 10 minut po injekci, jež se zředí 100 oójemovými díly s následující reakcí s komplementem morčete a červenými krvinkami ovcí, na nichž .se adsorbuje BSA-DNP taninóvou kyselinou po dobu hodiny při' 37 °C. Nedotčená antilátka za situace 3 způsobuje 100% hemolysu, zatímco F(ab‘)2 dle situace 1 a S-sulfonovaný vzorek situace 2 nemá žádnou hemolytickou účinnost.

S přihlédnutím k plašmatu, odebranému z králíků za 24 hodin po injekci, způsobuje produkt ze situace 2 100% hemolysu při testech podobných, jak to bylo popsáno výše. ..

Tento jev je pravděpodobně způsobený rekonversí S-sulfonovaného imunoglobulinu na nativní imunoglobulin in vivo, například redukci seskupení —S—SOs na skupiny —SH za opětovného vzniku disulfidických vazeb.

(e) Měření redukce in vivo značkované koncentrace:

mg králičího imunoglobulinu, 21 mg značkovaného sulfitu sodného ³⁵S-Na2S.O3-a 13 mg tetrathionátu sodného Na2S<iO6.2H2O se rozpustí v 3 ml 0,1 M tris-HCl s obsahem

2,5 '% glycinu (pH 8,2), a za teploty 45 °C se nechá reakce probíhat 3 hodiny. Reakční kapalina se dialysuje 24 hodin proti pufrovánému roztoku chloridu sodného o pH 7,4, a takto se připraví ?⁵-S-značkovaný králičí

S-sulfonovaný imunoglobulin.

Výše uvedený vzorek, zředěný na koncentraci 5%, se intravenosně injikuje dvěma králíkům (bílá rasa, novozélandský, samečci), vždy za použití 1,5 ml pro každého, a plasma králíků se odebere v předem určených časových odstupech, vždy 0,5 ml na králíka. Radioaktivity plasmy se změří za použití kapalinového scintilačního počítače s výsledky, které. jsou uvedeny v následující tabulce 3. .

' , . TABULKA 3

Zbývající radioaktivita v krvi

Doba vypuštění krve po intravenosni injekci Zbývající radioaktivita v krvi ,15 minut králík A králík B _ ' 100% _ 100% hodiny 64 64 hodin 34 36 hodin 9,5 . 8,0 .

hodin 2,2 1,0 hodin 0,7 0

5 6 33

Z výše uvedených výsledků; lze odvodit, že dochází ke štěpeni —Š—SO3⁺ skupin S-sulfonoyaných imunoglobuli-nů v- krvi..

Jak je to doloženo výše uvedenými příklady postupu podle vynálezu, je možné selektivně štěpit disulfidické vazby spojující H-řetězce a L-řetězce v nativním imunoglobulinu, načež je možno takto vzniklé atomy síry S-sulfonovat. Počet štěpení lze dále navíc řídit tak, že se štěpí v průměru 3 áž 5, zhruba 4,5 interřetězcových disúlfidických vazeb nativního Imunoglobulinu, načež se sirné atomy, uvolněné štěpením, S-sulfonují.

Tyto nové imunoglohulinové deriváty podle tohoto vynálezu se vyznačují antlkomplementovou účinností podstatně nižší ve srovnání s nativními imunoglobuliny, jako jc to doloženo v příkladech, a v důsledku toho způsobují podstatně méně nežádoucích reakcí analytického charakteru. Takže je možno tyto deriváty injikóvat nejen intramuskulárně, ale též intravenosně. Navíc pak se tyto nové imunoglohulinové deriváty podle tohoto vynálezu vyznačují takřka ekvivalentní aktivitou vazby antigenu ve srovnání s nativními imunoglobuliny, a proto , se vyznačují mimořádně skvělým vázáním různých antigenů.

Je již známo, že lze odstraňovat agregáty z imunoglobulinu, připraveného frakcionováním, tedy adsorpci nebo sedimentací na aktivním uhlí nebo polymerních látkách. Avšak stále se vyznačují takto upravené imunoglobuliny velmi zhusta, nežádoucími reakcemi, jež se projevují u příjemce injekcí. Dále se potom znovu objevuje opětované agregování při skladování takto upravených Imunoglobulinů. Takže produkt se jeví stále nedokonalým pro bezpečné použití injikovatelrtých přípravků, viz L. A. Hanson & B. G. Johanson, Intern. Arch. Allergy 31, 380 (1967).

. Jak bylo uvedeno a doloženo, vyznačují se imunoglohulinové deriváty podle tohoto vynálezu zdaleka méně nežádoucími reakcemi, a vynikají v tomto směru, víz obr. 2.

Rovněž pak si imunoglohulinové deriváty podle vynálezu podržuj! účinnost vázat anťigeny po delší dobu, jak jé to patrné z příkladu 8, A dále ještě Š-sulfqnátové skupiny v derivátech přecházejí zpět in vivo na disulfidické vazby, zatímco sulfonátové skupiny jsou odstraňovány z těla. Takže posléze jsón znovu převáděny deriváty podle vynálezu na nativní imunoglobulin. Z toho důvodu rovněž má S-sulfonovaný imunoglobulin podle vynálezu zjevné výhody ve srovnání se známými S-alkylovanými imunoglohuliny.

Jak to jíž byle vysvětleno, je rovněž jasné, že se nové imunoglohulinové deriváty podle vynálezu hodí jako farmakologícky účinné složky nejen intramuskulárních injekcí, ale i intravenosních injekcí.

Z nových imunoglobulinových derivátů podle vynálezu lze vyrobit přípravky, rozpustné ve vodě a vhodné pro injikovatelné kapaliny po smíchání s činidly, usnadňujícími rozpuštění, jako'je glycin, fosforečnan sodný, sodná sůl kyseliny citrónové, chlorid sodný a podobně, vždy za vhodné koncentrace, hmotnostně 1 až 20 %, s výhodou 2 až 10 takže se tlm získají intravenosně injikovatelné přípravky.

Je zřejmé, že S-sulfonované imunoglohuliny podle vynálezu jsou vhodné nejen v lékařství, ale dají sé rovněž použít při léčbě zvířat, jako je například hovězí dobytek, koně, prasata, ovce, psi. Jako imunoglobulinové deriváty při léčbě zvířat se s výhodou nativní imunoglobuliny, získané z odpovídajících zvířat S-sulfonují za dodržení postupu podle vynálezu.

Claims

PREDMET

1, Způsob přípravy imunoglobullnových derivátů, vyznačený tím, že se štěpí interřetězcové a intrařetězcové disulfidické vazby imunoglobulinu a sulfonují se vytvořené atomy síry reakcí se sloučeninou schopnou odštěpovat tetrathionátové ionty a s.e sloučeninou schopnou odštěpovat sulfitové ionty najednou nebo po sobě v jakémkoliv pořadí, ve vodném prostředí při hodnotě pH
3,5 až 10 a v nepřítomnosti oxidačních kovových iontů, jako jsou měďnaté. ionty, při teplotě 10 až 50 °C, přičemž tetrathionátové

VYNALEZU. '·· a sulfitové ..ionty jsou v reakčním prostředí v koncentraci molárně 2 až lOQnásobné se zřetelem na počet disúlfidických vazeh imunoglobulinu. 2. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že sloučeninou odštěpující tetrathionátové ionty je tetrathionová kyselina nebo tetrathionát sodný, draselný nebo amonný a sloučeninou odštěpující sulfitové lonty je kyselina siřičitá, siřičitan sodný nebo kyselý siřičltan sodný nebo siřičitan draselný.