JPS5846488B2 - スルホ化ヒト免疫グロブリンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はスルホ化ヒト免疫グロブリンの製造法に関する
。

近年蛋白化学の進歩に伴ない医学的に重要な意義を持つ
体液性免疫の担い手としての免疫グロブリンの構造と機
能の関連が解明されてきた。

これまでの研究によれば免疫グロブリンにはＩｇＧ 、
ＩｇＡ 、 ＩｇＭ 、 ＩｇＤ 、 ＩｇＥの５種
類があり、この中ＩｇＧが７０重重重風上を占めること
が知られている。

ＩｇＭを除く免疫グロブリンは主として４本のペプチド
鎖から成り、それらの銀量及び領内には数個のＳ−８結
合が存在している。

例えば、上記免疫グロブリンの最も典型的なタイプであ
るＩｇＧはこれをパパインで分解すると抗原結合能のあ
るフラグメントＦｃ１個、補体及び組織に結合能をもつ
フラグメントＦｃ１個に分別される。

又、上記ＩｇＧは２本のポリペプチド長鎖（Ｈ鎖）と２
本のポリペプチド短鎖（Ｌ鎖）とからなり、それらがジ
スルフィド結合及び非共有結合によって強く結合し、分
子量約１６万の蛋白質分子を形成していること、又それ
ら鎖聞には平均して約４．５個のジスルフィド結合が存
在し、且つ領内にも平均約１２個存在することが判明し
ている。

ＣＢ。Ｆｒａｎｇｉｏｎ ＆ Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅｎ ｓ
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、
Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ）３３，８９３（１９６８）参照〕そして、こ
れらの実験事実に基づいて静注用免疫グロブリンに関す
る種々の研究がなされている。

免疫グロブリンの利用はコーンらの分画法によって急速
に進歩した（ Ｅ、Ｇ、Ｃｏｈｎ ｅｔａｌ ；ジャ
ーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテイ（
Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｂｍ、Ｓｅｃ、）６８．４５９（１９
４６）参照〕。

コーン等はヒト血漿を大量にエタノール沈澱によって分
画した。

その分画用はほとんどがＩｇＧであり、若干のＩｇＡと
ＩｇＭを含み、種々の病原微生物に対する免疫活性があ
る。

よってこの分画用を投与することによって、麻疹、ウィ
ルス性肝炎等のウィルス感染症及び黄色ブドウ状球菌等
の抗生物質耐性細菌による感染症を予防並びに治療する
ことができる。

こうして分画、調製された免疫グロブリンの投与は筋肉
注射に限定されている。

しかし、筋肉注射では、その一部分しか体内に浸透せず
、速効性も得られない上大量投与も不可能である。

そこで静脈注射可能な免疫グロブリンの開発が望まれる
。

一般の免疫グロブリンを静脈注射すると、激しく体温上
昇及び心臓血管反応を惹起する。

特にこの傾向は無ガンマ・グロブリン・血症の患者に顕
著である。

静脈注射による反作用は免疫グロブリン分画中に生じた
、その凝集体に起因する。

凝集した免疫グロブリンは、抗原−抗体複合体と同様に
、補体及び組織に結合する。

その結果体内に生じたアナフィラキシ−性因子により、
反作用が起る。

よって調製した免疫グロブリンを１００，０００×ｇ・
超遠心分離して得た上清を用いるならば、この反作用を
防ぐことができる。

しかし、こうして得た免疫グロブリンも徐々に再凝集が
起る。

免疫グロブリンの静脈注射を安全なものにする目的から
、多くの研究がなされてきた。

スイスでは免疫グロブリンをｐＨ４で処理することによ
りＦｃ部分を一時的に変性させて、静脈注射に用いる試
みがなされてきた。

（Ｓ、Ｂａｒａｎｄｕｎ ｅｔａｌ ：ボックス・ザ
ンキナス（Ｖｏｘ Ｓａｎｇ）７，１５７．（１９６２
）参照〕。

しかし、この処理では不安全であり、時々反作用がみら
れる。

市販されている静脈注射用免疫グロブリンとして、ペプ
シン処理免疫グロブリンがある〔Ｈ：Ｋｏｂｌｅｔ
ｅａｔｌ ｍボックスザン牛ナス（ＶｏｘＳａｎｇ）１
３，９２．（１９６７）参照〕。

これはその６０〜８０％がフラグメントＦ（ａｂ）２で
あるために、体内で速やかに分解され、その半減期は数
時間、未処理のそれに比べて数十分の−である（ Ｂ、
Ｊａｇｅｒ ｅｔａｌ ｐマーチブス・オブ・インタ
ーナショナル・メデインス（Ａｒｃｈ 、 Ｉ ｎ ｔ
ｅｒｎ。

Ｍｅｄ、）１１９，６０．（１９６７）参照〕。

又、ペプシンの代りにプラスミンを用いることにより改
良されるが、プラスミンを除去できない欠点を持ってい
る（ Ｌ、Ａ、Ｈａｎｓｏｎ ｅｔａｌ ｐインター
ナショナル・アーチブス・オブ・アラ−シイ（Ｉｎｔ。

Ａｒｃｈ、Ａｌｌｅｒｇｙ）３１．３８０ 、（１９６
７）参照〕。

近年に至って、免疫グロブリンの主として鎖間Ｓ−８結
合を選択的に切断して、この切断された硫黄原子をＳ−
アルキル化することにより反作用を減じて、かかる免疫
グロブリン誘導体を静脈注射用に利用しようという試み
が提案された。

例えば、免疫グロブリンの銀量ＳＳ結合を切断してポリ
ペプチド鎖を得ようとする試みとしてスチーブンソンの
方法（Ｓ、Ｔ、Ｓ ｔｅｖｓｏｎ ｔバイオケミカル・
ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、） １１８５７０３
、（１９６０）参照〕が知られている。

その方法はヒトの免疫グロブリンＧをジチオスレイトー
ル中で銀量ＳＳ結合を還元的に切断し、次いでヨード酢
酸アミドでＳ−アルキル化する方法である。

しかしながら、この方法は２段階の反応を要し、しかも
生成物がＳ−アルキル化変性ポリペプチドであり、新し
い抗原性の危険があり、しかもＳ部分をチオール基に変
えることも容易でないなどの欠点を有する。

従って、このものを、その活性なチオール基を利用して
ポリマー等の担体に保持させ、更に有用な試薬に誘導す
ることも困難である。

フラネツク等（Ｅ、Ｆｒａｎｋ ｅｔａｌ ｒコレク
ションズ・オブ・チェコスロバキア・ケミカル・コミュ
ニケーション（Ｃｏ１１ 、Ｃｚｅｃｈ、Ｃｈｅｍ。

Ｃｏｍｍｕｎ）２９，１４０１．（１９６４）参照〕は
ブタの免疫グロブリンを亜硫酸ソーダと銅イオンで処理
してＳ−スルホネート化したペプチドを得ている。

しかしながら、ブタのものとは構造的にも違いのあるヒ
ト免疫グロブリンへの適用は示唆されておらず、まして
やＳ−スルホ化で抗補体価が低下することや、このもの
の抗体活性はインタクトのものとほとんど変らないこと
などについては何らの記載も示唆もなされていない。

そこで本発明の目的はヒト免疫グロブリンの２本のポリ
ペプチド長鎖（短鎖）と２本のポリペプチド短鎖（Ｌ鎖
）との銀量ＳＳ結合を選択的に切断するか、或は上記銀
量ＳＳ結合に加えて若干の領内ＳＳ結合の１部を切断し
て、その切断された硫黄原子をＳ−スルホ化せしめたヒ
ト免疫グロブリン誘導体（スルホ化ヒト免疫グロブリン
）の製造法を提供することにある。

本発明によれば、上記の目的は、免疫グロブリンを水中
で銅イオンの存在下に亜硫酸イオンを形成し得る化合物
と反応せしめて、該免疫グロブリンの銀量ジスルフィド
結合又は該銀量及び鋼内ジスルフィド結合の平均して好
ましくは３〜５個を切断すると共に、その切断された硫
黄原子をＳ −スルホ化（−ｓ−ｓｏ３−）することに
よって得られるスルホ化ヒト免疫グロブリンの製造法に
よって達成される。

本発明によって得られるスルホ化ヒト免疫グロブリンは
、低い抗補体価を有し副作用が少なく、生体内で元の免
疫グロブリンに再構成され優れた抗体活性を体内で長時
間に亘って保持し得るという特徴を有する。

本発明により与えられる殊に好適なスルホ化ヒト免疫グ
遁プリンは免疫グロブリンの銀量ジスルフィド結合が平
均して実質的に３〜５個切断され、これ等の切断された
硫黄原子がＳ−スルホ化（−Ｓ−ＳＯ３−）されたもの
である。

本発明者等の詳細な研究によれば、かかる本発明方法は
実質的に水中で行われるが、これは決して水媒体のみを
意味するものではなく本発明の反応に障害を及ばない如
何なる水性媒体中で実施されてもよい。

本発明において用いられる水中で銅イオンを発生する化
合物としては、第２銅化合物が適当であり、これらの具
体例としては、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）。

硫酸銅（Ｃｕ（ＮＯｓ ）２ ）、酢酸銅（Ｃｕ （Ｃ
Ｈ３ＣＯＯ）２）が挙げられる。

水中で亜硫酸イオンを形成し得る化合物としては、例え
ば亜硫酸、亜硫酸ソーダ。

亜硫酸カリ、亜硫酸水素ナトリウム等が好適である。

しかしながら、これらに限られるものではなく、水中で
、亜硫酸イオンを形成し得るものであれば如何なるもの
でもよい。

本発明で使用する水中で銅イオンを形成し得る化合物は
酸化剤として作用し、一方水中で亜硫酸イオンを形成し
得る化合物は還元剤及びＳ−スルホ化剤として作用する
。

上記亜硫酸イオン並びに銅イオンの量は、免疫グロブリ
ンの切断すべき鎖間又は領内ジスルフィド結合に対して
それぞれ２モル倍以上が用いられる。

それぞれが１００モル倍又はそれ以上であってもよい。

なお、上記銅イオンを形威し得る化合物及び亜硫酸イオ
ンを形成し得る化合物、殊に後者は予め水又は緩衝液に
溶解しておいて本発明の反応系に添加するのが好ましい
。

本発明方法において生起する反応としては免疫グロブリ
ンの銀量ＳＳ結合が亜硫酸イオンによって切断され、一
方はＳ−スルホ基（−Ｓ−ＳＯ３−）に他方はチオール
基（−８Ｈ）に誘導され、次いでこのようにして生成し
たチオール基の２個が銅イオンによって酸化されてＳＳ
結合を形成するか、又はチオール基が銅イオンと反応し
てＳ−チオサルフェート（Ｓ ５２０３−）になって
、再び亜硫酸イオンによって攻撃を受けるという繰返し
反応であり、かかる反応の結果として銀量ＳＳ結合が切
断され、その切断により生じた硫黄原子がそれぞれＳ−
スルホ基（−Ｓ−ＳＯ３−）に変換したＨ鎖、Ｌ鎖が得
られるのである。

本発明方法は５０℃以下で実施するのが好ましい。

殊に１０〜５０°Ｃ１就中１５〜４８℃が好適であるが
、それ以下の温度でも実施できる。

一般に５０℃、殊に５５℃を超える高温では免疫グロブ
リン分子が変性を受は易く、領内ジスルフィド結合の切
断反応が起り始めるので好ましくない。

反応時間は免疫グロブリンの種類、試薬量、反応温度と
か尿素等の変性剤添加の有無によって異なる。

反応液のｐＨは約３，５〜１０の範囲、特に６〜９の範
囲が好適である。

ｐＨが３．５より低いと免疫グロブリンのＦｃ部分の領
内ジスルフィド結合の切断が起り易くなり、−力ｐＨが
１０を越えると該グロブリン構成蛋白が変性され、この
結果抗補体価の減少が抑制され、且つ抗体活性が減少す
るので好ましくない。

反応系への試薬の添加順序には特に制限はない。

反応後、反応混合物を水及び例えば２．５幅グリシンを
添加したｐＨ７、４の緩衝生理食塩水の如き適当な緩衝
液中で順次透析することにより、本発明の新規免疫グロ
ブリン誘導体を製造することができる。

以下本発明を実施例について説明する。

但し下記の実施例は本発明の理解をよりよくするために
掲げるものであって、本発明は決して下記の実施例によ
って制限されるものではない。

用いた試薬は次の通りである。

０ヒト免疫グロブリンは、化学及び血清療法研究新製の
筋肉注射用２．５幅グリシンを含む生理食塩水中の１５
ｃ／ｂ溶液（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎ。

ｇｌｏｂｕｉｉｎ Ｉ ）又はＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ
Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ（ＵＳＡ）製α−Ｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｈｕｍａｎ
Ｆｒ、■（ｂｕｍａｎｉｍｍｕｎ。

ｇｌｏｂｕｌｉｎ ＩＩ ）を用いた。

Ｏ亜硫酸ナトリウムは、小宗化学薬品製の試薬特級を用
いた。

ｏＴｒｉｓ ＨＣｌ とは牛丼化学薬品製のトリス（
ヒドロキシメチル）アミノメタンの生化学研究用特級試
験薬でｐＨを下げるのに１Ｎ−ＨＣ１水溶液を用いたも
のである。

抗体価、抗補体価の測定は次の通りである。

０ジフテリア抗毒素価測定 反応：感作（間接）赤血球凝集反応（注１）を使用した
。

測定法二マイクロプレート法によった。

使用血清：ホルマリン処理ヒトＯ血球（注２）をビス−
ジアゾ−ベンチジン処理（注３）し、トキソイドで感作
した。

コントロール：コントロールとして標準ジフテリア抗毒
素（国立予防衛生研究所）を使 用した。

注１） 国立予防衛生研究所法：村田良介、第２１号東
京獣医蓄産学会（７５） 注２ ） Ｗ、Ｔ、Ｂｕｔｌｅｒ ｓ Ｊ、 Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ 、 。

９０．６６３．（６３） 注３） Ｊ、Ｇｏｒｄｅｎ、ｅｔａｌ：Ｊ、Ｅｘｐ、
Ｍｅｄ。

１０８．３７．（５８） ０麻疹、風疹、ムンプス抗体価測定（注４〜９）反応二
マイクロプレート法、但し麻疹は試験管法によった。

使用抗原二東芝化学製ＨＡ用抗原 但し麻疹は国立予防衛生研究所標準血清 を使用した。

注４） マイクロタイター法による風疹ＨＩ試験の術弐
指針：国立予防衛生研究所 注５） ヒト免疫グロブリン麻疹抗体価測定手順：国立
予防衛生研究所 注６） 富山哲夫、臨床検査１６屑２９ （７２） 注７） ウィルス実験学総論、国立予防衛生研究所標準
血清、丸善（７３） 注８ ） Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ５ｐｅｃｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｒｅａｇｅｎｔｓ。

Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐｔ ｏｆ ＨＥＷ、Ａｐｒｉｌ １９６
５注９） ＭｕｍｐｓＨＩ反応術式、国立予防衛生研
究所 Ｏ抗補体価の測定法 Ｋａｂａｔ＆Ｍａｙｅｒ ｒＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊ Ｐ ２２５ （
６１）記載の測定法を用いた。

１咎免疫グロブリン水溶液、モルモット血清２０ＣＨ５
０／ｍ７をＧｖＢテ５ＴＩＬｌとし、３７°Ｃ１ｈｒ加
温後、消費された補体量を上記方法で測定した。

抗補体価は２０ＣＨ５０／ｙｄ中何俤消費されたかを示
した。

実施例 １ 前記ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌ ｉｎ ＩＩ
２．０ ｇ。

ＮａＳＯ３１，４２ｇ及びＣｕ ８０４ ｓ ５ Ｈ２
０５０１１１９に０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌｐＨ
８，２を加えて２００−とした。

これを４５℃とし反応を開始させた。反応直後、３０分
後、１，２及び４時間後に反応液１５ｍをサンプリング
し、それぞれに氷冷した飽和硫安２２．５ＷＬｌを加え
、水冷下３０分放置した後、遠心分離した沈澱を５０％
飽和硫安で洗浄した。

この沈澱を透析膜で緩衝生理食塩水ｐＨ７、４に対して
２４時間透析した後、各測定に必要なサンプル量をとり
２．５俤グリシンを含む緩衝生理食塩ｐＨ７４にて希釈
して測定に用いた。

かくして得られた各種免疫グ陥プリン誘導体の溶液につ
いて、反応時間と−８−８０３−数の関係を求めその結
果を第１図に示した。

また、反応時間と抗補体価（カハツへとマイヤーの方法
）との関係を第２図に示した。

第２図より、全サンプルとも、３０分反応後に抗補体価
は３０係以下となっていることがわかる。

実施例 ２ 前記ｈｕｍａｎγ−Ｇｌｏｂｕｌ ｉｎ Ｉ ６７ｍ１
１Ｎａ ２ Ｓ Ｏｓ ７．１ ｇおよびＣｕＳ ０４
、５ Ｈ２００，１６ｇに２．５幅グリセリンを含む０
．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣＩ緩衝液を加えて１．Ｏｌと
した。

所定温度で所定時間反応後、Ｄｏｗ社のビーカー、ウル
トラフィルターｂ／ＨＦＵ−１を用いて、透析し２００
ｒＩＬｌになる迄濃縮した。

これを５ｅｉｔｚの無菌フィルター（０，２５μｐｏｒ
ｅ ５ｉｚｅ）を用いて濾過した後、グリシン２．５ｇ
を加えて凍結乾燥した。

これに水を加えて５．０％溶液とし、その抗体価を測定
した。

その結果を第１表に示す。

スルホ化ヒト免疫グロブリンは、インタクトとほとんど
同程度の抗体価を有していることがわかる。

実施例 ３ ｉｎ ｖｉｖｏにおけるスルホ化ヒト免疫グロブリンの
抗補体活性試験 実施例２と同様にして、スルホ化ヒト免疫グロブリンを
得た。

体重２００〜３００．！１モルモットに、上記グロブリ
ンの５俤と２．５饅グリシンを含む緩衝生理食塩水溶液
（ｐＨ７，４）３−を、また対照として緩衝生理食塩水
のみ３ａまたは未処理のヒト免疫グロブリン■の１５係
と２．５係グリシンを含む緩衝生理食塩水溶液１−を静
脈注射した後、軽量的に１．０ｍｌ心臓穿刺により、そ
の血清中の補体価を測定した。

その結果を第３図に示した。

第３図から未処理ヒト免疫グロブリンにおいては急激な
補体価の減少が注射後見られるが、スルホ化ヒト免疫グ
ロブリンでは見られない。

また、前者には静注後しばしばモルモットにしんせん（
ふえる）が認められるが、後者では全く認められないこ
とがわかった。

このことから本発明による免疫グロブリン誘導体はｉｎ
ｖｉｖｏでもアナフラキシーショックが起らないもの
であることが期待される。

かかる本発明のスルホ化ヒト免疫グロブリンは、前記実
施例に示した通り、インタクトの免疫グロブリンの抗補
体価に比べて遥かに、低い抗補体価を有するので、アナ
フィラキシ−性因子による反作用が少く、従って単に筋
肉注射用としてのみならず、静脈注射用組成物として用
いることができ、その上本発明のスルホ化ヒト免疫グロ
ブリンはインタクトの免疫グロブリンと比べて抗原結合
活性がそれ程低下しないので、種々の抗原に対して優れ
た結合を有するのである。

又、本発明のスルホ化ヒト免疫グロブリンは、実施例３
に示した通り、抗体活性の保持期間が長く、シかも体内
でそのＳ−スルホ基がジスフィルド結合に再転換し、一
方、スルホ基は体外に排泄されて、究極的に免疫グロブ
リンに再転換することが認められる。

以上説明した通り本発明のスルホ化ヒト免疫グロブリン
は、筋肉注射用薬剤成分としてのみならず静脈注射用薬
剤成分として用いられることは明らかである。

また、本発明のスルホ化ヒト免疫グロブリンは、例えば
、グリシン、リン酸ソーダ。

クエン酸１食塩等の可溶化剤と適当の濃度で配合するこ
とにより注射液製造用の水可溶性組成物となすことがで
き、更にこれを水に溶解して静脈注射用組成物となすこ
とも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒト免疫グロブリンをＣｕ＋＋で酸化した場
合の反応生成物に含まれる一５Ｓ０３一基の変動を反応
時間との関係で示したものである。 第２図は、ヒト免疫グロブリンのＣｕ＋十による酸化生
成物の抗補体活性を、酸化反応時間との関係で示したも
のである。 第３図は、スルホ化ヒト免疫グロブリンをモルモットに
静注した場合の、血清中における補体価の変化を示した
ものである。 対照として生理食塩水及びインタクト−γ−グロブリン
を用いた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒト免疫グロブリンを水中で銅イオンの存在下に亜
   硫酸イオンと反応せしめ、該グロブリン中のジスルフィ
   ド結合を切断しＳ−スルホ化することを特徴とする、抗
   補体活性の低下したスルホ化ヒト免疫グロブリンの製造
   法。 ２ ヒト免疫グロブリン中のジスルフィド結合が３〜５
   個切断されることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載のスルホ化ヒト免疫グロブリンの製造法。