DK141432B - Fremgangsmåde til fremstilling af intravenøst indgivelige immunoglobulinderivater. - Google Patents

Description

(D

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 141432 DANMARK * (51),nt c|3A 61 K 39/395 «(21) Ansøgning nr. 954/75 (22) Indleveret den 7· DiaT. 1975 (23) Løbedag 7. mar. 1975 (44) Ansøgningen fremlagt og fremlseggeteesskriftet offentliggjort den 17· Π19Γ.· 1 9^0 DIREKTORATET FOR ίΛΛν .__ PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (3°) *lontet begæret fra den

8. mar. 1974, 26541/74, JP

24. Jun· 1974, 71274/74, JP

(71) TEIJIN LIMITED, 11, 1-chome, Minamihonmachi, Hlgashi-ku, Osaka^ JP.

(72) Opfinder: Katsuhlko Tornibe, 5-18-4, Tamadaira, Hlno-shl, Tokyo, JP: Ya= suhlko Masuho, 5-12-TO, Tamadaira, Hino-shi, Tokyo, JP: Kimihiko Mat= suzawa, 1-10-5, Tamadaira, Hlno-shl, Tokyo, JP: Sachio Lshiraoto, T-25-7-705, Kamltakaldo, Suginaml-ku, Tokyo, JP: Kazuo Satake, 4-8-2, Mlta, Tama-ku, Kawasakl-shi, Kanagawa-ken, JP: Tsuneo ¥atanabe, 4-55-17, Hlga= shilkebukuro, Toshima-ku, Tokyo, JP.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af Intravenøst .indgivelige immunoglo= bulinderivater.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte intravenøst indgivelige immunoglobulinderi-vater, ved hvilken nativt immunoglobulin i det væsentlige i fraværelse af oxiderende metalioner, såsom cupriioner, ved pH 3,5-10 omsættes med aktive stoffer til opspaltning af gennemsnitlig 3 til 5 interkædedisulfidbindinger eller inter- og intrakædedisulfidbindinger hos det native immunoglobulin og til S-sulfonering (S-SO3) af de således tilgængeliggjorte svovlatomer, og hvor det ene stof er i stand til i vand at danne sulfitioner, der virker både som reduktionsmiddel og som S-sulfoneringsmiddel, og det andet stof virker som oxidationsmiddel.

Inden for proteinkemiområ.det er sammenhængen mellem imrnuno-globulinstruktur og immunitet ved at blive klarlagt tydeligere. Un- 141432 2 dersøgelser har afsløret, at immunoglobulin8kan underinddeles i fem typer, nemlig IgG, IgA, IgM, IgD og IgE, blandt hvilke IgG udgør ikke mindre end 70 vægtprocent.

Immunoglobulinerne er, med undtagelse af IgM, hver sammensat af i hovedsagen fire peptidkerner, og adskillige disulfidbindinger tjener til sammenbinding af forskellige kæder indbyrdes og til sammenbinding af samme kæde flere steder med sig selv, dvs. de såkaldte interkæde- henholdsvis intrakædebindinger. F.eks. kan ovennævnte IgG, som er den mest typiske hos immunoglobulin, når den nedbrydes med papain, opdeles i to fragmenter "Fab", som har antigenbindende aktivitet, og et fragment "Fc", som har komplement-aktivitet og vævsbindende aktivitet. Man har desuden opdaget, at IgG er sammensat af to tunge polypeptidkæder (H-kæder) og to lette polypep-tidkæder (L-kæder), der er stærkt bundne med disulfidbindinger og ikke-covalente bindinger til dannelse af et proteinmolekyle med en molekylvægt på ca. 160.000, og at molekylet i gennemsnit indeholder ca. 4,5 interkæde-disulfidbindinger (-S-S-) og ca. 1,2 intrakæde--disulfidbindinger (jvf B. Frangione & C. Milstein, J. Mol. Biol.

33, 893 (1968)). Nativt Immunoglobulin kan derfor groft gengives ved formlen l^l^, hvor H og L har ovenstående betydning.

I tegningens fig. A er i stiliseret form vist en model af et humant γ-globulinmolekyle (IgG), [som dog er blevet S-sulfoneret i en vis udstrækning ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen således som vist ved strukturtegnet -··- i stedet for -S-S-].

At antallet af interkædedisulfidbindinger (-S-S-), som forefindes mellem de to H-kæder og de to L-kæder IgG, som er den mest fremherskende fraktion af nativt immunoglobulin, udgør gennemsnitligt 4,5, skyldes, at den i tegningens fig. A viste model af humant γ-globulin faktisk kun repræsenterer en enkelt variant, der betegnes type A? men der forefindes tillige en type B, der i stedet for to disulfidbindinger mellem H-kæderne indeholder tre di-sulfidbindinger mellem disse. Som det ses af fig. A, indeholder type A i alt fire interkædedisulfidbindinger, medens type B indeholder i alt fem interkædedisulfidbindinger, og da indholdet af type A og type B er nogenlunde lige stort, bliver resultatet et gennemsnit på ca. 4,5.

På grundlag af empirisk fastslåede kendsgerninger har man foretaget forskellige studier vedrørende immunoglobulins brug til injektion, nemlig efter isolering ved Cohn's fraktionering (E. G.

141432 3

Cohn et al., J. Amer. Chem. Soc. 68, 459, (1946)), som består i fraktionering af humant plasma ved successiv fældning med vandig ethanol i stigende koncentration. Den ved II identificerede fraktion er overvejende IgG indeholdende en mindre mængde IgA og IgM, og den fremmer antistof-aktivitet mod forskellige mikroorganismer, der fremkalder infektionssygdomme, da γ-globulin virker som bærer i antistofdannelsen. Derfor er indgivelsen af fraktion II effektiv til propylakse og terapi over for virusinfektionssygdomme såsom mæslinger, viral hepatitis osv. samt over for infektionssygdomme hidrørende fra antibiotikum-resistente bakterier såsom Streptococcus aureus.

Den eneste tidligere benyttede foran&taltning til terapeutisk indgivelse af således fraktioneret immunoglobulin i præparat-, form har været intramuskulær injektion, som dog kun fremkalder delvis osmose af injektionsvæsken i kroppen, og således er ude af stand til at give umiddelbar hurtigt indtrædende virkning. Den intramu-skulære injektion tillader heller ikke indgivelse af store mængder og giver muskelømhed på injektionsstedet. Man har derfor længe ønsket fremkomsten af immunoglobulin, som er velegnet til intravenøs injektion.

Ved forsøg på intravenøs injektion af kendt immunoglobulin fremkaldes voldsomme pyrogene og cardiovasculære reaktioner, som er særlig iøjnefaldende hos agammaglobulinæraiske patienter, dvs. personer som helt eller delvis mangler gammaglobulin. Sådanne uheldige reaktioner på intravenøs injektion fremkaldes med de efter fraktioneringen af immunoglobulin fremkaldte aggregater af immunoglobulin, som bindes til komplement og til, væv på lignende måde som antigen-antistofkomplekset, hvilket resulterer i uheldige reaktioner forvoldt af eller fremkaldt med den i kroppen dannede anaphylakti-ske faktor. Sådanne uheldige reaktioner kan dog til dels hindres ved at anvende den oven på svømmende væske, som er adskilt fra im-munoglobulinpræparatet ved ultracentrifugering i et tyngdefelt på 100.000 x g; men reaggregering finder uundgåeligt sted i det således behandlede immunoglobulin i løbet af nogle få dage.

Med henblik på sikker intravenøs injektion af immunoglobulin har man foretaget mange undersøgelser. I Schweiz er der således gjort forsøg på at underkaste immunoglobulin behandling ved en pH-værdi på 4 for midlertidigt at denaturere dens Fc-del og gøre denne egnet til intravenøs injektion (S. Barandun et al, Vox Sang 7, 157, (1962)).

141432 4

Behandlingen er dog ufuldkommen, og de uheldige reaktioner kan stadig lejlighedsvis iagttages.

Pepsinbehandlet immunoglobulin, dvs. spaltet i to dele Fab og en del Fc (jfr. fig. A) , forhandles kommercielt til intravenøs injektion (H. Koblet, S. Barandun og H. Diggelman, Vox Sang 13, 92, (1967)). Da 60 til 80% af det behandlede immunoglobulin er sammensat af fragmentet Ffab'^, nedbrydes injektionsvæsken hurtigt in vivo således som demonstreret ved, at dens halveringslevetid er på kun nogle få timer, hvilket er en til nogle få tiendedele af den ubehandlede immunoglobulins halveringslevetid (B. Jager, Arch.

Intern, Med, 119, 60, (1967)).

Endvidere kan forbedret injektionsvæske tilvejebringes ved udskiftning af pepsin med plasmin som behandlingsmiddel, men metoden har den ulempe, at plasminen ikke kan elimineres senere (L.Å. Hanson & B. G. Johanson, Int. Arch. Allergy 31, 380, (1967)).

Det er senere blevet foreslået selektivt at spalte hovedsagelig interkæde-disulfidbindingerne hos immunoglobulin og S-ally-lere de herved frembragte tilgængeliggjorte svovlatomer (S-) og anvende disse immunoglobulinderivater, (hvor -- i fig. A da betegner allyleret svovl), som viser en i forhold til ovenstående teknik formindsket uheldig reaktion, til intravenøs injektion. Men særlig god holdbarhed eller stabilitet er dog ikke opnået.

Desuden kendes forsøg på at spalte interkæde-disulfidbindingerne hos immunoglobulin til dannelse af kortere polypeptidkæ-der, f.eks. en af S. T. Stevenson et al (Bio. Chem., J., 118, 703, (1960)) beskrevet metode, som går ud på at spalte interkædedi-sulfidbindingerne hos humant immunoglobulin G ved reduktion i dithio-threitol og S-alkylere de tilgængeliggjorte S-bindinger i iodacetoa-mid. Metoden kræver imidlertid totrinsreaktioner, og desuden er produktet S-alkylerede polypeptider, som indebærer den potentielle fare at have ny antigenecitet. Hertil kommer, at det ingenlunde er let at omdanne S-delen til thiolgrupper. Derfor er det også vanskeligt at aflede et anvendeligt reagens der ud fra ved at understøtte dette på en bærer såsom en velegnet polymer under anvendelse af aktiv thiol.

I Chemical Abstracts (1964) vol 61, 2088e refereres en fremgangsmåde til omsætning af svine-7S-y-globulin med Na2S02 og CuSO^ ved pH 3-10 (bedst ved pH 8-9) under spaltning af otte disulfidbindinger pr. molekyle γ-globulin (eller immunoglobulin) til dannel- 141432 5 se S-sulfonerede immunoglobulinderivater. Dette er mere udførligt beskrevet som Franek's metode af F. Franek m.fl. i Coll. Czech. Chem. Commun., 29, 1401 (1964). Herved behandles immunoglobulin hidrørende fra svin med natriumsulfit og cupriioner som oxidationsmiddel til dannelse af S-sulfonerede polypeptider.

Ved forsøg på at reproducere Franek's metode (jfr. eks. 2 nedenfor og tegningens fig. 1) har man afsløret en række mangler og ulemper ved denne kendte metode: (i) De fremkomne denaturerede polypeptider indeholder kob- . ber eller cupriion, hvis eliminering fra produktet er ekstremt vanskelig eller praktisk taget umulig.

(ii) De denaturerede polypeptider udviser hurtigt formindsket eller nedsat antigen-bindende aktivitet, hvor de af og til har ønskelig lav antikomplement-aktivitet.

(iii) Immunoglobulins oprindelige form er forvrænget, således som bekræftet ved måling af den optiske drejning, jvf. de nedenfor anførte data for kontrolforsøgene.

Da det er praktisk umuligt at eliminere selv en ganske lille mængde tilbageværende kobber fra det denaturerede polypeptidprodukt fremstillet ifølge Franek's metode, er dette produkt termisk ustabilt og tilbøjeligt til at sammenklumpes i form af aggregater. Dette gør det af fysiologiske grunde klart uønskeligt at anvende produktet til intravenøs injektion (D.A. Derber, Arthritis and Rheumatism, 17, 85, (1974)).

I overensstemmelse hermed er det opfindelsens formål at tilvejebringe immunoglobulinderivater, som ikke indeholder kobber eller cupriioner, idet man spalter alle eller nogle af de in-terkædedisulfidbindinger, som sammenknytter de to tunge polypep-tidkæder (H-kæderne) og de to lette polypeptidkæder (L-kæderne) med de tunge polypeptidkæder i nativt immunoglobulin, selektivt og eventuelt også en del af intrakædedisulfidbindingerne og de ved spaltningen tilgængeliggjorte svovlatomer (-S) S-sulfoneres, (således at -» i de dannede immunoglobulinderivater betegner -S—SO^-). Det har vist sig, at dette produkt er egnet til brug i vandige injektionsmidler til intravenøs indgivelse. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at der som oxidationsmiddel anvendes et stof, der er i stand til at danne tetrathionationer.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fås hidtil ukendte immunoglobulinderivater, der udmærker sig ved at have nedsat anti- 141432 6 komplement-aktivitet, og som bevarer særdeles høj antistofaktivitet i menneske- og dyrelegemer.

Her ud over fås den fordel, at disse immunoglobulinderivater er rekonstruerbare in vivo til nativt immunoglobulin og ved intravenøs injektion kun giver ringe skadelige reaktioner, men fremragende antistofaktivitet.

Her opnås tillige den fordel, at de ved fremgangsmåden i-følge opfindelsen fremstillede immunoglobulinderivater fås med meget ensartet kvalitet og langt bedre stabilitet end det ved Franek's metode fremstillede produkt.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen foretages selektiv opspaltning af praktisk talt kun de interkædedisulfidbindinger, som sammenbinder de tunge kæder (H-kæderne) og de lette kæder (L-kæderne) hos immunoglobulin (som markeret ved -* i fig. A), nemlig specielt fordi de tilgængeliggjorte svovlatomer S-sulfoneres ved anvendelse af tetrathionationer, hvorved fås ovennævnte særlige struktur, der er vist i fig. A, hvor de ved « betegnede -S er omdannet til -S-S03-.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes hidtil ukendte immunoglobulinderivater, hvori interkæde-disulfidbindingerne hos nativt immunoglobulin i overvejende grad er spaltet i et gennemsnitligt omfang på 3 til 5 interkædedisulfidbindinger eller interkæde- og intrakæde--disulfidbindinger under et, og idet de tilgængeliggjorte svovlatomer (-S) er S-sulfoneret (-S-SO^).

De dannede immunoglobulinderivater vil altså gennemsnitligt indeholde 3 til 5 og fortrinsvis ca. 4,5 selektivt opspaltede og hver især S-sulfonerede svovlatomer, idet de opspaltede disulfidbindinger i det native immunoglobulin navnlig er de interkædedisulfidbindinger, der sammenholder H- og L-kæderne. Derivaterne indeholder ikke oxiderende metalioner såsom cupriioner, som undgås ved fremgangsmåden.

Immunoglobulinderivaterne indeholder mindst 1,0 international enhed pr. ml af titeren for anti-difteritis ved en koncentration på 10,0 vægtprocent af denne.

Immunoglobulinderivaterne er vandopløselige og velegnede til brug ved fremstillingen af injektionsvæsker, når de blandes med herfor opløseliggørende midler, som er uskadelige for mennesker. Ved opløsning af de vandopløselige sammensætninger i vand kan man nu tilvejebringe stabile vandige midler beregnet til intravenøs injektion. Dette har ikke været muligt før.

1A1432 7

Et særlig foretrukket immunoglobullnderivat er det, i hvilket gennemsnitligt ca. 4,5 interkædedisulfidbindinger hos det native immunoglobulin er opspaltet og de således tilgængelige fri svovlbindinger (altså i det væsentlige 9 atomer i gennemsnit) S-sul-foneres (-S-SO^). Ifølge foretagne undersøgelser har dette foretrukne immunoglobullnderivat en struktur, hvor interkædedisulfid- ' bindingerne, som sammenbinder H- og L-kæderne hos det native immunoglobulin, i det væsentlige alle er spaltet, og de herved tilgænge-liggjorte svovlatomer er S-sulfoneret, dvs. de fire centrale disul-fidbindinger i tegningens fig. A der sammenholder H-kæderne og L-og H-kæderne.

For hver disulfidbro kan reaktionen til opspaltning og S--sulfonering gengives skematisk som følger:

Im/V'S-S'Wv I _^ l/vw'S-SO^ O^S-S/VlV | nativt humant γ-globulin Na2S03 S-sulfoneret humant γ-globulin [GG] Na2S4Og [GGS] hvor zig-zag linierne betegner de resterende dele af H- og L-kæderne.

Denne reaktion gennemføres ved behandling af nativt immunoglobulin med to aktive stoffer: (A) En forbindelse, der er i stand til at danne tetrathio-nation, og (B) en forbindelse, der er i stand til at danne sulfition, i vand til opspaltning af gennemsnitlig 3 til 5 af interkædedisulfidbindingerne eller inter- og intrakædedisulfidbindingerne hos nativt immunoglobulin og samtidig S-sulfonering (-S-SO^) af de således tilgængeliggjorte svovlatomer.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det således som ovenfor beskrevet muligt først i overvejende grad selektivt at op-spalte de af nativt immunoglobulins interkædedisulfidbindinger, der sammenholder H-kæderne indbyrdes og en H-kæde med en L-kæde (hver især).

Derfor kan immunoglobulinderivaterne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvori gennemsnitlig 3 til 4,5 inter-molekylære disulfidbindinger er opspaltet og begge respektive svovl-atomer er S-sulfoneret, om ønsket opdeles i et H-kædeprodukt og et L-kædeprodukt, hvilket mest benyttes til analyse af reaktionens forløb der kan gengives som H2L2-► 2H+2L.

141432 8

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres hovedsageligt i vand; men et hvilket som helst andet vandigt medium kan benyttes, sålænge det ikke indvirker skadeligt på den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ønskede reaktion.

Foruden i det væsentlige alle interkædedisulfidbindingerne kan også spaltes en mindre mængde af intrakædedisulfidbindingerne, idet antallet heraf ikke er overvældende og maksimalt ligger på ca.

5, (idet praktisk talt alle de således tilgængeliggjorte svovlatomer også S-sulfoneres), hvor hver L-kæde indeholder 2 og hver H-kæ-de indeholder 4 sådanne intrakædedisulfidbindinger i den viste struktur i fig. A.

Som forbindelsen (A), der er i stand til at danne tetrathionat-ion i vand, foretrækkes tetrathionsyre, alkalimetalsalte deraf såsom natriumtetrathionat, kaliumtetrathionat osv. og vandopløselige salte deraf såsom ammoniumtetrathionat, skønt en hvilken som helst anden forbindelse kan anvendes, for så vidt den er i stand til at danne tetrathionation i vand.

Typiske eksempler på forbindelserne (B), der kan tilvejebringe sulfition i vand, indbefatter svovlsyrling, natriumsulfit, kaliumsulfit og natriumbisulfitmen en hvilken som helst anden forbindelse kan dog anvendes, for så vidt den er i stand til at danne sulfition i vand.

Forbindelsen (A), der er i stand til at danne tetrathionation i vand, optræder som et oxidationsmiddel. Derimod tjener forbindelsen (B), der danner sulfition i vand, som reduktionsmiddel såvel som S-sulfonerende middel.

Mængderne af sulfition og tetrathionation bør hver især være ikke under to gange antallet af mol interkæde- eller inter- og intrakæde-disulfidbindinger tilsammen (-S-S-binding) hos det som udgangsmateriale anvendte native immunoglobulin, der skal opspaltes. Disse mængder kan dog hver især være så høje som 100 gange den molære mængde bindinger, der skal opspaltes, eller endog mere.

Der foretrækkes, at forbindelserne (A) og (B), men især (B), opløses i vand eller en pufferopløsning, før de sættes til reaktionssystemet ifølge opfindelsen.

Reaktionen, som finder sted ved den pågældende fremgangsmåde, kan beskrives ved, at interkædedisulfidbindingerne hos nativt immunoglobulin opspaltes med sulfitionen, idet det ene af kædens svovlatomer omdannes til en S-sulfonatgruppe (-S-SO^) og den anden til en thiol- 14U32 9 gruppe (-SH), og hver af de således dannede thiolgrupper oxideres ned tetrathionation til dannelse af disulfidbinding, eller thiolgruppen reagerer med tetrathionation og omdannes til S-thiosulfat (-S~52°3) 09 angribes igen af sulfitionen. Reaktionen er gåledes en gentagelsesreaktion. Som resultat af en sådan reaktion øpspaltes interkædedf-sulfidbindingeme hos nativt immunoglobulin, og derved frigjorte eller blotlagte svovlatomer omdannes hver især til S-sulfonatgrupper (S-SO^) i de tunge kæder og de lette kæder.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres fortrinsvis ved temperaturer ikke over 50°C og især i intervallet fra 10 til 50°C navnlig fra 15 til 48°C, idet det dog er tilladeligt at gennemføre fremr gangsmåden ved lavere temperaturer.

Normalt er det native immunoglobulin tilbøjeligt til ved høje temperaturer på over 50°C og især over 55°C at denatureres, og opspaltning af intrakædedisulfidbindinger begynder at finde sted. Derfor bør sådanne høje temperaturer undgås.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen bør tilstedeværelsen af sådanne protein-forstyrrende eller -ødelæggende midler som urinstof eller guanidin, der anvendes ved S-sulfitoly.se af insulin eller ribonuclease (J. L. Bailey et al. J. Biol. Chem. , 234, 17 33 (1959)}, helst undgås. Hvis de imidlertid benyttes, bør mængdeforholdet af et sådant proteinomlejrende middel ikke overstige 2,0 mol pr. mol ’ af det native immunoglobulin.

Reaktionstiden skifter afhængigt af sådanne faktoirér som typen af immunoglobulin, mængden af reagens, reaktionstemperatur og tilstedeværelsen af denatureringsmidåel såsom urinstof eller lignende. De foretrukne pH-værdier for reaktionsvæsken liggér i'intervallet fra ca. 3,5 til ca. 10 og isér frå .6 til 9. Ved pH lavéfé end 3,5 er opspaltning af intrakædedisulfidbinding i det native immunoglobulins Fc-del tilbøjelig til at finde sted. Derimod denatureres proteinens vigtige globulindel ved pH-værdier på over 10, hvilket indebærer sådanne skadelige resultater soÉ:iéfiibering af ahtifcomple-mentaktivitetsformindskelsen og formindskelsen eller nedgahgéni antigenbindende aktivitet.

Der er ingen kritisk rækkefølge for tilsætningen af reagenser til reaktionssystemet ifølge den foreliggende opfindelse.

Efter reaktionen underkastes ré'aktibnsblahdingen efter hinanden følgende dialyse mod vand og en hensigtsmæssig pufféropløsning UU 32 10 såsom saltvand, der er 0,01 molær med hensyn til phosphatpuffer (pH 7,4), og som indeholder 2,5% glycin, hvorefter de hidtil ukendte im7. munoglobulinderivater kan tilvejebringes.

De hidtil ukendte immunoglobulinderivater kan desuden om ønsket adskilles i L-kæderne og H-kædeme ved søjlechromatografi under anvendelse af en søjle fyldt med hensigtsmæssige harpikser, f.eks. anvendelse af en søjle med "Sephadex"'e/G-75 og et opløsningsmiddel såsom 1 molær propionsyre i vand som eksempel på elueringsmidlet.

Dette er unødvendigt for produktets anvendelse til intravenøs injektion, men benyttes ved analyse for at konstatere hvor langt reaktionen er forløbet. Det vil forstås at også produkter, der ikke er fuldstændigt spaltede i H- og L-kæder, er brugbare.

Antallet af S-sulfonatgrupper (-S-SO^) i et sådant immuno-globulinderivat (eventuelt fraktioneret i en H-kæderig og en L-kæde-rig del) kan f.eks. bestemmes ved gennemførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen (kun til analysebrug) under anvendelse af radioaktivt natriumsulfit og måling af S-sulfonatgrupperne mærket med 35 S i det herved fremkomne immunoglobinderivat ved hjælp af en væske-scintillationstæller således som demonstreret i de nedenfor anførte udførelseseksempler.

Halvdelen af gennemsnitsantallet af de mærkede S-sulfonatgrupper pr. molekyle af immunoglobulinderivatet bestemt på denne måde svarer således til gennemsnitstallet af opspaltede disulfidbindin-ger i det som udgangsmateriale anvendte native immunoglobulin. Denne analyse angiver altså det totale antal spaltede disulfidbindinger.

På den anden side kan immunoglobulinderivaterne, der indeholder gennemsnitlig ca. 9 S-sulfonatgrupper pr. molekyle, dvs. således som dannet ved opspaltning af gennemsnitlig 4,5 disulfidbin-dinger i det native immunoglobulin og S-sulfonering af de således tilgængeliggjorte svovlatomer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, om ønsket til analyse, fraktioneres i H-kæder og L-kæder under anvendelse af f.eks. søjler fyldt med "Sephadex"® G-75 eller "Sepha-dex"®G-200, fortrinsvis i nærværelse af en mindre mængde urinstof eller guanidin, og med propionsyre som elueringsmiddel således som allerede omtalt.

Derfor kan et hvilket som helst konkret sæt driftsbetingelser, der anvendes til gennemførelse af' fremgangsmåden ifølge opfindelsen, undersøges med henblik på tilvejebringelse af immunoglobulinderivaterne med et indhold af gennemsnitlig ca. 9 S-sulfonatgrupper pr. molekyle udgangs-γ-globulin, idet derivaterne yderligere kan 1A1432 11 opspaltes i H-kæder og L-kæder ved den her specificerede søjlechro- matografi til bestemmelse af udstrækningen af reaktionen H2L2-*· 2H+2L. Så snart et sådant sæt betingelser er impirisk bestemt, kan antallet af opspaltede disulfidbindinger i det native immunglobu-lin i det væsentlige reguleres ved indstilling af reaktionstiden under det valgte sæt driftsbetingelser.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal herefter forklaret mere specifikt under henvisning til udførelseseksempleme, der ved at vise en række foretrukne specifikke udførelsesformer tjener til : nærmere belysning af opfindelsen til fremme af forståelsen heraf.

De i eksemplerne anvendte reagenser er følgende: o Humant immunoglobulin I: 15%'s opløsning af humant immunoglobulin til intramuskulær injektion i pufret saltvand (pH neutralt) indeholdende 2,5%'s glycin, nemlig et produkt fra Chems-Sero^Thera-1 peutic Research Institute.

o γ-Globulin-human fraktion II (humant immunoglobulin II)' fremstillet af Nutritional Biochemicals Corporation (USA).

o Natriumtetrathionat, som fremstilles umiddelbart før brug ud fra natriumthiosulfat (Na2S203-5H20) og iod (I2) i vandig ethanol.

o Natriumsulfit: Special-kvalitet kemisk fremstillet af Komu-ne Kagaku Yakuhin, Co. Japan.

35 x o. Na2S03 radioaktivt mærket med g : Produkt fra New England Nuclear (USA).

o.Tris-HCl: Tris(hydroxymethyl)aminomethan fremstillet af Nakarai Kagaku Yakuhin Co. Japan, en special-kvalitet lavet kemisk til biokemisk forskning med formindsket pH ved hjælp af vandig 1 normal HC1.

Niveauerne for antistofaktivitet og antikomplement-aktivitet måles som følger: o Måling af titeren for antidifteritis-reaktion: Sensibiliseret positiv hemagglutinationsreaktion (note 1) anvendes.

Målemetodei Mikropladeproces

Blodceller: Human O-type røde blodceller (note 2), som er behandlet med formalin, behandles med bls-diazo-benzidin, kaldet ES DB (note 3), og sensibiliseres med difteritis-toxoid.

Kontrol: Standard-antistof mod difteritis (National Institute of Health, Japan).

note 1) metode ifølge NIH Japan: R. Murata, nr. 21 Tokyo Veterinaian & Animal Husbandry (-75).

UU 32 12 note 2) W. T. Butler: J. Immunol. 90 663 (-63).

note 3) J. Dordon, B. Rose og A.H. Sehon: J. Exp. Med. 108, 37, (-58) o Måling af antistof mod mæslinger, røde hunde og fåresyge (note 4-9)

Reaktion: Mikroplademetode med undtagelse af mæslinger, overfor hvilke reagensglasmetoden anvendes.

Antigen: Antigener for hemagglutination fremstillet af Toshiha Chemicals,Japan.

Kontrolserum: Standardantiserum fremstillet af Toshiba Chemicals, undtagen ved mæslinger, overfor hvilke standardantiserum (NIH Japan) anvendes.

note 4) Dobbeltprøve for hemagglutinationsinhibition overfor mæslinger ved mik roti te irmetode: NIH Japan.

note 5) Sekvens til måling af humant gamma immunoglobulins antistofaktivitet over for mæslinger: NIH Japan.

note 6) T. Toyama, Clinical Examinations, 16 nr. 29 (-72).

note 7) An Introduction to Virus Empirical Science: udgivet af NIH Japan Alumni, pub ved Maruzen Bookstore (-73).

note 8) Recommendede Specifications for Microbiological Reagents, US Dept, of HEW april 1965.

note 9) Mumps HI Reaction Techniques, NIH Japan, o Måling af antikomplementaktivitet: Den i Kabat og Mayer "Experimental Immunochemistry" side 225 (-61) beskrevne fremgangsmåde anvendes. En procents immunoglobulinop løsning indeholdende mars vineserum, 20 CH,-0/ml bringes til 5 ml med GVB++ dvs. gelatineveronalpuffer, opvarmet til 37°C i 1 time, og det forbrugte antikomplement måles ved denne metode. Niveauerne for antikomplementaktivitet indiceres ved det procentvise forbrug til 20 CH^/ml, hvor CH^q defineres som en komplimentenhed ved 50% hæmolyse bestemt efter Kobat og Mayers metode, se Experimental Immunochemistry side 255 C61).

Eksempel 1 (Bestemmelse af sammenhæng mellem reaktionsbetingelser og antal opspaltede disulfidbindinger)

Betingelse I

Til 51 mg af det ovenfor specificerede humane immunoglobulin 35 II, 36 mg S-mærket Na^O^st og 22 mg Na2S^Og tilsættes en vandig 0,1 molær tris-HCl (pH 8,2) under tilvejebringelse af en prøve på UH 32 13 5,0 ml, der opvarmes til 45°C, og den efterfølgende reaktion gennemføres ved samme temperatur. Der udtages 0,5 ml -prøver af reaktionsblandingen umiddelbart efter reaktionens igangsættelse,og efter henholdsvis 30 min., 1 time, 2 timer, 4 timef, 7,4 timer og 24 timer af reaktionens forløb. Hver af prøverne blandes med 10 ml 50%'s mættet ammoniumsulfat under isafkøling, tillades at henstå i 15 min. under isafkøling og befries for det herved fremkomne bundfald ved centrifugering. Efter vaskning med igen 50%'s mættet ammoniumsulfat måles bundfaldets radioaktivitet med væskescintillationstæller, og ud fra:, det herved opnåede resultat beregnes antallet af deri indeholdte —S—SO^ grupper.

Betingelse II

Reaktionen påbegyndes under identiske betingelser med de " ovenfor under betingelse I anførte, men uden prøveudtagelse mider reaktionen. Ved tidspunktet 4 timer efter reaktionens påbegyndelse tilsættes en vandig 10 molær urinstofopløsning til reaktionSsysternet, således at sidstnævntes koncentration med hensyn til urinstof gøres 4 molær. Efter 5 og 6 timers reaktion (dvs. efter henholdsvis 1 og 2 timers reaktion efter urinstoftiIsætningen) udtages prøver på hver 0. 5 ml af reaktionsvæsken og behandles på lignende måde som de prøver, der taqes således som specificeret ovenfor under betingelse I.

Betingelse III

Reaktionen og prøvebehandlingen gennemføres som anført ovenfor under betingelse I med undtagelse af, at reaktionstemperaturen er 0°C.

Betingelse IV

Reaktionen og prøveudtagningen fra betingelse I gentages med undtagelse, at reaktionstemperaturen er 25°C.

Betingelse V

Reaktionen og prøveudtagningen som éhført under betingelse I gentages med undtagelse af, at der ikke benyttes ^28^0^. 2^0.

Resultaterne fra de ovenfor under betingelserne I, II, III, IV og V respektivt anførte reaktioner er vist under ét i nedenstående tabel 1. ; : 141432 14

Tabel I

(Korrelation for reaktionsbetingelser med antal dannede -S-SO2 grupper)

Reaktionstid (timer) 0 0,5 1 2 4 5 6 7,4 24

Reak-^S.

tionsbe-N'sv tingelser \___ I (45°C) 0 6,1 9,0 8,9 9,4 - - 8,9 10,4 II (45°C, urinstof tilsat efter 4 timer; - - - - 10,9 13,3 - III (0°C) 0 0,5 1,6 2,5 2,9 - - 3,4 5,0 IV (25°C) 0,2 1,6 4,1 5,0 4,5 - - 7,0 8,5 V (Na2S406.

2H20-fri) 0 0,5 0,8 1,1 0,8 - - - 4,5

Det ses, at antallet af opspaltede disulfidbindinger svarer til halvdelen af antallet af -S-SO^-grupper.

Ud fra de i tabel I ovenfor anførte reaktionsresultater konkluderes følgende: Når den omhandlede fremgangsmåde udføres i nærværelse af tetrathionat og natriumsulfit ved 45°C under betingelse I, op-spaltes ca.3 disulfidbindinger, idet der nås en gennemsnitlig opspaltning på 4,5 i løbet af 1 til 7 timers reaktion og ca. 5,2 efter 24 timers reaktion.

Når reaktionen gennemføres på identisk måde med undtagelse af temperaturen, som nu ligger ved 25°C (betingelse IV), formindskes antallet af opspaltede disulfidbindinger, idet antallet af opspaltede bindinger når et gennemsnit på ca. 4,3 efter så lang tids reaktion 141432 15 som 24 timer. Når reakt i on s temper a turen er 0°C (betingelse III) , går det gennemsnitlige antal opspaltede disulfidbindingér yderligere ned. Imidlertid viser det sig, at i fraværelse af natriumtetrathio-nat (betingelse V) svigter opspaltningen af disulfidbindinger, idet den ikke længere forløber glat. Når derimod urinstof tilsættes til reaktionssystemet (betingelse II) forøges det gennemsnitlige antal opspaltede disulfidbindinger hurtigt efter urinstoftiIsætningen..

Eksempel 2 (Sammenligning af forringelsen i fysiske egenskaber, når Na2S40g eller Cu++ anvendes som oxidationsmidlet)

Betingelse I

Til 2,0 g af det ovenfor allerede specificerede humane immunoglobulin II, 1,42 g Na2SC>2 og 0,86 g Na2S^0g.2H20 tilsættes 0,1 molær tris-HCl (pH 8,2) til fremstilling af 200 ml blanding, der omsættes ved en igangsætningstemperatur på 45°C. Umiddelbar efter at reaktionen er gået i gang og ved tidspunkter 30 min., 1 time, 2 timer og 4 timer derefter udtages prøver på hver 15 ml af reaktionsvæsken. Umiddelbart efter den femte prøveudtagning tilsættes 10 molær urins tof op løsning til resten af reaktionsvæsken, således at urinstofkoncentrationen deri gøres 4 molær, og reaktionen fortsættes. Efter 5 timers og 6 timers reaktion (henholdsvis 1 og 2 timers reaktion efter urinstoftilsætningen) udtages prøver på hver 22,5 ml af reaktionsvæsken, og 22,5 ml isafkølet mættet ammoniumsulfat tilsættes til hver af disse udtagne prøver, som så lades henstå i 30 min. under isafkøling. Det herved fremkomne bundfald skilles fra ved centrifugering, vaskes med 50%'s mættet ammoniumsulfat og dialyseres i 24 timer mod afpufret saltvand med pH 7,4 gennem et Visking-rør.

Efter dialysen udtages prøver af hver ønsket mængde til specifik analyse, hvilke prøver fortyndes med afpufret saltvand med pH 7,4 indeholdende 2,5% glycin og analyseres.

Betingelse II

Reaktionen og behandlingerne som anført ovenfor under betingelse I gentages med undtagelse af, at Na2S40g. H2o erstattes med 50 mg CuSC>4.5H20 og reaktionen afsluttes ved udløbet af den fjerde time.

141432 16 Således opnåede opløsninger af de forskellige immunoglobu-linderivater underkastes følgende prøver og målinger.

(a) Bestemmelse af sammenhæng mellem reaktionstid og antal -S-SO^ grupper:

Antallet af -S-SO^ grupper i prøverne, som er oxideret med tetrathionat (Na2S^0g.2H20) afsættes som vist i tegningens fig. 1 med tomme cirkler (o) samtidig med afsætning af lignende data som opnået under betingelserne I og II ifølge eksempel 1. Dataene for andre prøver oxideret med Cu++, der er omsat og behandlet på iøvrigt identisk måde med de under betingelse I i eksempel 1 anførte, dog med undtagelse af at Na2S^0g.2H20 er erstattet med 50 mg CuS0^.5H20, er afsat i tegningens fig. 1 som vist med udfyldte sorte punkter ( ♦).

(b) Bestemmelse af sammenhæng mellem reaktionstid og anti-komplementaktivitet:

Antikomplementaktiviteteme for prøverne opnåst ved oxidation med Na2S^Og. H^O under betingelse I i eksempel 2 måles ved den allerede specificerede metode og afsættes som vist i tegningens fig. 2. Desuden er antikomplementaktiviteterne for prøverne oxideret med Cu++ under betingelse II ligeledes vist i tegningens fig. 2. Det kan ud fra fig. 2 ses, at alle prøvernes antikomplementaktiviteter •formindskes til ikke over 30% efter 30 min. reaktion.

(c) Bestemmelse af sammenhæng mellem reaktionstid og anti-difteritis-titeren:

Den samme prøve som anvendt ovenfor under (b) måles 3 gange .for sin antidifteritis-titer ved den allerede specificerede metode. Opdelingen og middelværdierne er vist i tegningens fig. 3. Ud fra denne grafiske afbildning kan det ses, at prøverne oxideret med +*f

Cu viser en titer, som allerede er under 0,3 internationale enheder efter 30 min. reaktion.

(d) Bestemmelse af sammenhæng mellem reaktionstid og optisk drejning:

Prøverne anvendt til måling af antikomplementaktivitet under (b) ovenfor (proteinkoncentration 2,5%) måles med hensyn til deres optiske drejning og med de i tegningens fig. 4 viste resultater.

Ud fra de viste resultater vil det forstås, at tilstedeværelsen af cupriioni reaktionssystemet forvolder progressiv denaturering under reaktionen, og at tilstedeværelsen af urinstof fremmer denatureringen 141432 17 således som demonstreret ved den iøjnefaldende forøgelse i optisk drejning.

løvrigt er den optiske drejning målt ved 25°C under anvendelse af en 1-centimeter celle.

fe) Bestemmelse af sammenhængen mellem reaktionstid og uklarhed efter varmebehandling:

Samme prøver som anvendt til måling af antikomplement-aktivi-tet under (b) varmebehandles i luft i 4 timer ved 50°C og ved en koncentration på 2,5% med de i tegningens fig. 5 viste resultater. Således som det fremgår af fig. 5 forvolder tilstedeværelsen af kun en meget lille mængde cupriion forringelse af varmestabiliteten og fremmer tendensen til aggregering, dvs. sammenklumpning eller koagulation. Dette ses af, at den optiske tæthed (OD 650 a^i) i fig. 5 ligger på 2-3 gange så højt niveau for Cu++, hvilket betyder uklarhed, der som bekendt er parameter for tendens til aggregation.

(f) Sammenhæng mellem reaktionstid og kobberindhold:

Der benyttes samme prøver som til målingen af antikomplé-mentaktivitet under (b), idet disses kobberionindhold bestemmes ved atomabsorptionsanalyse med de i tegningens fig. 6 viste resultater. Prøverne underkastes vaskning og dialyse (se betingelse II og I ovenfor). Som det ses i fig. 6, desto længere reaktionstid, jo flere cupriioner indeholder de fremkomne immunoglobulinderivater. Det vides ikke hvorfor disse produkter indeholder cupriioner, eller hvorfor disse er så fast bundet. Ud fra disse resultater vil det forstås, at når kobberion benyttes, kan selv vaskning og dialyse af prøven ikke eliminere kobberionen bagefter. Muligvis er cupriio-nerne fanget og låst til de først dannede aktive steder.

(g) Adskillelse af peptider med tunge kæder fra peptider med lette kæder:

Der benyttes samme prøve som den, der udtages efter 2 timers reaktion under betingelse I i eksempel 2, idet denne dialyseres i 24 timer mod 1 N vandig propionsyre, som er 6 molær med hensyn til urinstof, og derefter underkastes prøven chromatografering på en søjle (der måler 1,5 cm i diameter og 80 cm i længden) fyldt ned "Sephadex"4^ 200 bragt i ligevægt med den ovenfor specificerede vandige opløsning. Herved opnås de i tegningens fig. 7 anførte resultater.

Den første top fra venstre på denne grafiske afbildning markerer H2L2“kæder, som endnu ikke er adskilt, medens den anden top viser H-kæder, og den tredje top viser L-kæder. Denne grafiske afbildning 18 U1432 viser, at der fås ret rene fraktioner indeholdende praktisk talt udelukkende H-kæder henholdsvis L-kæder.

Ved opsummering af de i tegningens figurer 1 til 7 demonstrerede resultater kan man nå til følgende konklusioner: 1) Således som demonstreret ved de resultater, der nås ved forsøgene ifølge betingelse 1 i eksempel 1, når man gennemfører fremgangsmåden ifølge opfindelsen, nemlig ved behandling af immunoglobulin i nærværelse af tetrathionat- og sulfitioner, kan i løbet af et hvilket som helst tidsrum gående fra 1 til 4 timer disulf idbind ing-eme spaltes i et omfang således, at gennemsnitstallet herfor er ca.

4,5, og de således frembragte reaktive svovlatomer S-sulfoneres (idet det gennemsnitlige antal S-sulfonatgrupper er ca. 9) til dannelse af S-sulfoneret immunoglobulin (fig. 1), der kan adskilles i H-kæder og L-kæder ved hjælp af f.eks. chromatografi på en søjle med "Sephadex"® G 200 (fig. 7), hvilke fraktioner har praktisk talt identisk optisk drejning med nativ immunoglobulins optiske drejning (fig. 4)x. (se nedenfor).

Ud fra ovenstående resultater kan de hidtil ukendte immuno-globulinderivater med sikkerhed antages at være dannet ved spaltning i hovedsagen af interkædedisulfidbindinger alene hos det native immunoglobulin og ved S-sulfonering af de ved spaltningen tilgængeliggjorte svovlatomer, nemlig under hensyn til den kendsgerning, at antallet af interkædedisulfidbindinger hos nativt immunoglobulin er gennemsnitlig 4,5.

. Hertil kommer,· at sådanne immunoglob'ulinderivater har en nedsat antikomplement-aktivitet på ikke over 10%, hvilket er langt lavere end det native immunoglobulins antikomplementaktivitet (fig. 2) (se nedenfor); men samtidig udviser derivaterne en antidifteritis--titer, som ikke er nævneværdigt ringere end nativt immunoglobulins åntidifteritistiter (se nedenfor) således som demonstreret ved den næsten ækvivalente antigenbindende aktivitet. Således som vist i fig. 3 bevarer immunoglobulinderivaterne ved en koncentration på 10 vægtprocent en antigenbindende aktivitet på mindst 1,0 internationale enheder pr. ml.

2) De S-sulfonerede immunoglobulinderivater, som dannes ved opspaltning af mere eller mindre end gennemsnitlig 4,5 af disulfidbindingerne hos nativt immunoglobulin, f.eks. gennemsnitligt ikke under 3 eller så meget som 5, og S-sulfonering af de tilgængelig-gjorte svovlatomer, viser en noget mindre nedgang i deres antikom- 19 UU 32 plimentaktiviteter og en ringere antigenbindende aktivitet sammenlignet med de foretrukne immunoglobulinderivater, som netop er beskrevet ovenfor under punkt 1 (fig. 2 og 3), men disse lidt mindre foretrukne immunoglobulinderivater udviser dog stadig betydeligt forbedret antikomplementaktivitet i forhold til nativt immunoglobulin.

3) Når man derimod som det oxiderende middel erstatter tetra-thionationen med cupriionen,indeholder de herved frembragte immunoglobulinderivater stadig cupriionen, selv om det kun er i meget lave koncentrationer, som dog er tilbøjelig til at gå op, efterhånden som reaktionstiden forlænges (fig.6). Også antallet af opspaltede di-sulfidbindinger hos nativt immunoglobulin forøges ved forøgelse af reaktionstiden (fig. 1), og som følge heraf er det vanskeligt at . frembringe det her omhandlede immunoglobulinderivat ved opspaltning,, af gennemsnitlig ca. 4,5 disulfidbindinger hos nativt immunoglobulin under samtidig opnåelse af stabilitet.

Endvidere viser immunoglobulinderivaterne, som fås ved anvendelse af cupriion, formindsket antikomplementaktivitet (fig. 2) , men samtidig formindskes deres antidifteritis—titer i iøjnefaldende grad sammenlignet med immunoglobulins antidifteritis-titer. Deres antigenbindende aktivitet formindskes således ekstremt (fig. 3). Immunoglobulinderivateme viser her ud over, når reaktionstiden overstiger 1 time, optiske drejninger, som adskiller sig fra nativt immunoglobulins optiske, drejning, hvilket tilkendegiver, at der er sket strukturelle ændringer i deres proteinopbygning.

4) Lignende ændringer i optisk drejning kan også konstateres ved immunoglobulinderivater fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, men når man tilsætter urinstof under reaktionens forløb.

Af denne grund anbefales også fraværelsen af urinstof, guanidin og lignende i reaktionssystemet, som benyttes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

x I hver af de pågældende figurer angiver reaktionstiden 0 på abscisseaksen ikke en værdi for nativt immunoglobulin selv, men er · en værdi for det præparat, der er underkastet rensningsbehandling uden at bevirke nogen væsentlig reaktion, når reagenset tilsættes.

·Ί>·^

Disse værdier (i tilfældet hvor der ikke anvendes Cu ) bekræftes imidlertid at være næsten ækvivalente med værdier, der opnås for nativt globulin selv i hvert enkelt tilfælde.

141432 20

Eksempel 3 (Selektiv opspaltning af interkædedisulfidbindinger) 2 ml af en vandig opløsning indeholdende 20 mg humant immunoglobulin I, 80 mg ^S-NajSO* (8,22 x 10 ^ dpm/mol) hvor dpm betegner "decay per minute" beregnet i radioaktivitetsenheder, og 40 mg Na2S40g. 2H20 indstilles på pH 7,2 med eddikesyre/acetatpuffer og omsættes ved 39°C i 2 timer. Derefter dialyseres reaktionsvæsken med 5 liter vand i 24 timer. Derpå tilsættes urinstof og propionsyre langsomt til systemet, således at dette til slut opnår koncentrationer, som er 4 molær henholdsvis 1 N med hensyn til de nævnte stoffer. Som prøve udtages 0,1 ml af opløsningen, der sættes på chromatografisøjlen, idet de herved opnåede data er vist til venstre for ordinataksen i tegningens fig. 8. Resten af systemet underkastes chromatografi under anvendelse af en søjle fyldt med "Sephadex"® G 200 (1,5 cm i diameter og 100 cm lang i ligevægt med 1 N propionsyre, der er 4 molær med hensyn til urinstof.

Prøvernes radioaktiviteter måles ved hjælp af hver enkelt fraktions OD280 me^ væskescintillationstæller, idet der opnås de i tegningens fig. 8 anførte resultater, hvor det nederste koordinatsystem viser antallet af S-SO^ grupper indeholdt i hvert molekyle S-sulfoneret immunoglobulin, der forefindes i hver fraktion.

Analyse Eksempel 4 (Fraktionering af tunge kæder og lette kæder)

Til en vandig opløsning indeholdende 100 mg humant γ-globulin II tilsættes 0,4 g Na2S0g og 0,2 g Na^S^Og.2^0, og systemets pH indstilles på 9,0 med 1 N HC1, hvorefter systemet lades reagere i 48 timer ved stuetemperatur. Efter reaktionen elimineres en ganske lille mængde uopløseligt stof, som er dannet i systemet, ved centrifugering. Reaktionsvæsken dialyseres derefter under anvendelse af

Viskins pølseskin mod 2,5 liter vand ved 5°C i 15 timer og yderligere med 2,5 liter af en vandig opløsning af 1 N propionsyre ved 5°C i 28 timer. Ved at underkaste dialysatet chromatografi under anvendelse af en søjle med "Sephadex'®G 75 (3,5 cm i diameter og 111 cm lang) bragt i ligevægt med 1 N propionsyre fraktioneres polypeptidkædeme. Således som demonstreret i tegningens fig. 9 kan der konstateres tre toppe i den grafiske afbildning, hvori forsøgsresultaterne afsættes 141432 21 med målingerne af C^gg sora funktion af fraktionsnumrene. Disse tre toppe bekræftes efter molekylvægtens størrelse i række at være ufrak-tioneret S-sulfoneret immunoglobulin, S-sulfonerede H-kæder og S-sul-fonerede L-kæder. Identifikationen gennemføres ved immunologiske foranstaltninger såsom Ouchterlony's metode og immunoelektrophorese samt ved kemisk analyse såsom aminosyreanalyse, måling af hexoseind-hold osv.

Ud fra de i fig. 8 og 9 viste resultater udledes følgende konklusioner.

1) Da den første top identificeres som værende uf rakt ioners t S-sulfoneret immunoglobulin, den anden som værende S-sulfonérede H-kæder og den tredje top som værende S-sulfonerede L-kæder ved immunologiske og kemiske metoder, idet der henvises til fig. 9 fra venstre til højre, er det kun logisk at konkludere', at de tre toppe 1 fig.

8 på lignende måde regnet fra venstre mod højre kan tilskrives u-fraktioneret S-sulfoneret immunoglobulin, S-sulfonerede H-kæder henholdsvis S-sulfonerede L-kæder. Forskellen mellem chromatografimønStrene fremkaldes ved tilstedeværelsen af urinstof i førstnævntes reaktionssystem.

2) Idet der henvises til fig. 8 og gås ud fra mængden af protein i L-kædeme, som danner den tredje top, beregnes molkoncentrationen, og idet der gås ud fra den molære koncentration og radioaktivitetsniveauet, konstateres det, at L-kædeme, som danner den tredje top, indeholder 1,0 S-SO^x gruppe pr. mol. På samme måde beregnes antallet af S-SO^x grupper pr. mol i H-kæderne i den anden top som 3,4, og tilsvarende ses, at antallet af S-SO^x grupper pr. mol S-sulfoneret immunoglobulin, der omfatter 2 H-kæder og 2 L-kæder, er 8,8. I blandingen før påsætning på chromatografisøjlen ses det at være 8,6. Således som teoretisk forklaret ovenfor sammenknyttes hver L-kæde med en H-kæde ved 1 disulfidbinding, medens der gennemsnitlig er 2,5 disulfidbindinger mellem to H-kæder. Følgelig indeholder humant immunoglobulin efter teorien gennemsnitlig 2,5+1+1=4,5 interkædedisulfidbindinger. Ved spaltning af disse fås ialt 2 x 4,5 = 9 S-SO^x grupper pr. mol gammaglobulin. Dette r stemmer pænt med det i fig. 8 viste forsøgsresultat.

141432 22 3) Ifølge chromatografimønsteret i fig. 8 kan størstedelen af det S-sulfonerede immunoglobulin indeholdende gennemsnitlig 8,6 S-SO^x grupper adskilles i H-kæder og L-kæder. Derfor vil det forstås; at interkædedisulfidbindingerne spaltes selektivt, medens intra-kædedisulfudbindingerne efterlades praktisk talt intakte.

Eksempel 5 (En udformning af reaktionsbetingelser) 133 ml humant γ-globulin I opløses i 1667 ml 0,06 molær phosphatpuffer |>H 8,2) indeholdende 2,5% glycin. Til opløsningen tilsættes 7,0 g NajSOg opløst i 100 ml af samme puffer og 4,4 g Na2S40g.2H20 i 100 ml af samme puffer, og systemet lades reagere ved 45°C i 3 timer. Reaktionsvæskens dialyseres i 6 timer mod 20 liter afpufret saltvand opbygget af natriumsalt under anvendelse af Dow Chemical's bæger, ultrafilter b/HFU-1, der betegner et dialyseapparat med hule fibre af plast som membran. Dialysens ydervæske udskiftes hver 2 timer. Dialysatet koncentreres til et rumfang på 180 ml med samme filter, og hertil sættes 50 g glycin.

Opløsningen-steril filtreres gennem en 0,25 μ membran, ophæl-des i 10 ml prøveglas med 5,0 ml i hvertog lyofiliseres. Den sterile opløsnings antikomplementaktivitet CH^q ved 50%'s koncentration er 4,3%.

Eksempel 6 (Sammenligning af an tis tof aktiviteterne overfor anegener ved forsøg under anvendelse af Na2S40g eller Cu som oxidationsmidlet)

Betingelse I

Til 67 ml humant γ-globulin I, 7,1 g ^280^ og 0,43 g Na2S40g.2H20 tilsættes 0,1 molær tris-HCl-pufferopløsning indeholdende 2,5% glycin, således at hele rumfanget kommer op på 1,0 liter.

Efter 3 timers omsætning ved 45°C dialyseres reaktionsvæsken under anvendelse af Dow Chemical's bæger. Ultrafilter b/HFU-1, og dialysatet koncentreres til et rumfang på 200 ml, sterilt filtreres gennem seitz' 0,25 n filter, lyofiliseres med tilsætning af 2,5 g glycin og fortyndes med vand til 5%'s opløsning. En prøve af opløsningen udtages til bestemmelse af antistofaktiviteterne med de i nedenstående tabel II anførte resultater.

141432 23

Betingelse II

Reaktionen og behandlingerne som anført ovenfor under betingelse I gentages ned undtagelse af, at reaktionstemperaturen og -tiden ændres til 25°C og 24 timer.

Betingelse III

Reaktionen og behandlingerne som anført ovenfor under betingel· se I gentages med indtagelse af, at 21^0 erstattes med 0,16 g

CuS04.5H20.

Opløsningen af immunoglobulinderivater frembragt under ovenstående betingelser I til III bestemmes for antistofaktiviteter overfor forskellige antigener med de nedenfor i tabel II anførte resultater.

Tabel II

Antigenaktivitet overfor nogle antigener V Antigen

Reakti X. Difteritis Mæslinger Røde hunde Fåresyge ons e 9 n. (enheder/ml) (enheder (relativt) (relativt) eise \ ml)

Intakt 0,8 6,7 171 11 I (Na2s406, 45°C-3 ti- mer) 0,8 5,0 170 -

II

(Na2®4°6r 25°C-24 timer) - 4,4 - 10 III .

(Cu++ 45°C- . , . , -. 3 timer) <0,1 < 2 50 4

Ud fra de i ovenstående tabel II anførte data kan følgende konklusioner nås.

141432 24 1) Når tetrathionat anvendes (betingelse I), er det S-sulfo-nerede immunoglobulins titer over for difteritis praktisk talt ækvivalent med nativt immunoglobulins titer; men når cupriion anvendes (betingelse III), viser immunoglobulinderivatet næsten ingen aktivitet.

2) Vedrørende titeren over for mæslinger bevarer det S-sulfo-nerede immunoglobulin oxideret med tetrathionat (betingelserne I og II) mere end 60% af nativt immunoglobulins titer; men det med cuprjiæ oxiderede (betingelse III) derivats aktivitet er faldet til mindre end 30%.

Ud fra disse kendsgerninger vil det forstås, at når cupriion anvendes, er nedgangen i antistof aktivitet større end i tilfældet, hvor tetrathionat anvendes som oxidationsmidlet.

Eksempel 7 (In vivo antikomplementprøve med S-sulfoneret globulin) På lignende måde som anført under betingelse I i eksempel 6 fås S-sulfoneret immunoglobulin.

3 ml af den 5%'s pufrede saltvandsopløsning indeholdende 2,5% glycin, med pH 7,4, 3 ml pufret saltvand alene som kontrol og 1 ml 15%'s ubehandlet immunoglobulin I i pufret saltvandsopløsning indeholdende 2,5% glycin, der også anvendes som kontrol, indgives ovenstående S-sulfonerede immunoglobulin intravenøst til hunmarsvin med en legemsvægt på 200 til 300 g, og prøvedyrenes serumkomplement-niveauer måles med serumprøver på hver 1,0 ml udtaget ved hjerte-punktur med regelmæssige intervaller.

Resultaterne er anført i tegningens fig. 10, ud fra hvilken det vil forstås, at det bratte fald i serumkomplementniveau, der iagttages hos prøvedyrene efter intravenøs injektion af intakt human immunoglobulin, er 0 ved lignende indgivelse af humant S-sulfoneret immunoglobulin. Desuden iagttages lejlighedsvis skælven ved marsvin efter injektion af førstnævnte præparat, idet dette fænomen igen er 0 hos marsvin, til hvilke S-sulfoneret immunoglobulin er injiceret intravenøst. Ud fra disse kendsgerninger kan det med sikkerhed forventes, at immunoglobulinderivatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er fri for denne uheldige reaktion også in vivo.

14H32 25

Eksempel 8 (Bestandighed ved indgivelse til kaniner af S-sulfoneret immunoglobulin in vivo og gendannelse af disulfidbindinger) (a) Fremstilling af kanin-anti-BSA/DNP-antistof:

Okseserumalbumin (BSA) omsættes med dinifrofluorphenol til dannelse af en forbindelse, der herefter ved forkortelse skal betegnes BSA/DNP. BSA/DNP injiceres til kaniner (arten New Zealand White, $) ved trædepuderne sammen med Freund'å komplette adjuvants og immuniseres. På 30, dagen efter injektionen aftappes kaninerne for blod fra deres hjertearterie. Således opnået antiserum behandles på den i og for sig kendte måde ved en fremgangsmåde med fældning ved hjælp af 45%'s mættet ammoniumsulfat, og kaninanti-BSA/DNP-immunoglobulin fås herved.

(b) Fremstilling af prøver:

Betingelse 1

Anti-BSA/DNP-immunoglobulinet hydrolyseres ved 37°C i 24 timer sammen med 1 vægtprocent, beregnet på immunoglobulin, pepsin i-følge A. Nisonoff's metode (Arch. Biochem. Biophys., 89, 230 (1960)). Hydrolysatet underkastes chroma to gr af i med en "Sephadex"©G 50 søjle, og F(ab')2_delen fås.

Betingelse 2 250 mg af antl-BSA/DNP-immunoglobulinet, 180 g Na2SOg og 79 mg Na2S^0g.2H20 opløses i 25 ml 0,1 molær tris-HCl indeholdende 2,5% glycin (pH 8,2) og omsættes ved 37°C i 4 timer. Reaktionsvæsken dialyseres i 24 timer mod afpufret saltvand (pH 7,4) , hvorved tilvejebringes S-sulfoneret kanin-immunoglobulin.

Betingelse 3

Det ovenfor specificerede anti-BSA/DNP-immunoglobulin anvendes, således som det er.

(C) Måling af omslagshastighed og bestandighed.

De således som ovenfor omtalt fremstillede prøver præpare* res hver især til opløsninger med 5%'s koncentration.

Prøveopløsningerne injiceres intravenøst i kaniner (art New Zealand White, £ , idet prøve 1 gives til tre kaniner, prøve'2 til tre kaniner og prøve 3 til to kaniner) ved en dosering på ca. 3 ml. Prøvedyrene aftappes for blod ved forudbestemfe intervaller, og de* res plasma ekstraheres. Anti-BSA/DNP-aktiviteten i plasmaet bestem- 141432 26 mes ved passiv hemagglutinationsreaktion (T. Matsuhashi, Chemistry & Biology, 9, 396 (-71)), ved hvilken BSA/DNP er fæstnet på røde blodlegemer fra fåreblod under anvendelse af glutaraldehyd og mikro-titermetode, idet der opnås de i tegningens fig. 11 viste resultater.

Således som klart demonstreret i fig. 11 er in vivo omslagshastigheden ekstremt kort for det kommercielle F (ab')2, hvilket antyder kort bestandighed eller varighed for det farmaceutiske effektivitetsniveau. I modsætning hertil viser det S-sulfonerede anti-BSA/-DNP immunoglobulin omtrent den samme halveringslevetid som nativt anti-BSA/DNP immunoglobulins, hvilket lover bestandigt farmaceutisk effektivitetsniveau.

(d) Måling af hemolytisk antistofaktivitet.

Det ovenfor specificerede native anti-BSA/DNP-immunoglobu-lin injiceres intravenøst i kaniner, og deres plasma indsamles 10 min. efter injektionen, fortyndes til 100 gange deres oprindelige rumfang og omsættes med mars vinekonq? lement og røde blodlegemer fra får, hvortil BSA/DNP er adsorberet med tanninsyre, ved 37°C i 1 time.

Det intakte antistof ifølge betingelse 3 bevirker 100%'s hemolyse, medens F(ab')2 ifølge betingelse 1 og S-sulfoneret prøve ifølge betingelse 2 ikke udviser hemolytisk aktivitet.

Med hensyn til det plasma, som udtages fra kaninerne 24 timer efter injektionen, bevirker produktet ifølge betingelse 2 100%'s hemolyse ved samme prøve som ovenfor anført.

Dette fænomen skyldes sand’syhligvis genomdannelsen af S-sulfoneret immunoglobulin til nativt immunoglobulin in vivo, dvs. reduktion af -S-SO^ til -SH og gendanhelse af disulfidbinding.

(e) Måling af nedgang i in vivo mærke-koncentration, idet det S-sulfonerede immunoglobulin er radioaktivt mærket: 35 30 mg kanin immunoglobulin, 21 mg S-Na2SC>3 og 13 mg Na2S^0g.2H20 opløses i 3 ml 0,1 molær tris-HCl indeholdende 2,5% glycin (pH 8,2) og omsættes ved 45°C i 3 timer. Reaktionsvæsken dialyseres i 24 timer mod pufret saltvand (pH 7,4), og således frem-35 stilles S-mærket S-sulfoneret kanin-immunoglobulin.

Denne prøve fortyndes til 5%'s koncentration og injiceres intravenøst i to kaniner (New Zealand White S ) med 1,5 ml hver, og kaninernes plasma fås ved blodudtapninger med forudbestemte niveauer og med 0,5 ml pr. kanin. Plasmaets radioaktiviteter måles med væskescintillationstæller og med de i nedenstående tabel III anførte resultater.

UU32 27

Tabel III

Residual-radioaktivitet i blod

Tid til blodaftapning efter Residual-radioaktivitet i blod intravenøs injektion ----—-—— _Kanin A Kanin B_ 15 min. 100% 100% 3 timer 64 64 7 34 36 24 9,5 8,0 48 2,2 1,0 72 0,7 0

Ud fra de ovenfor anførte resultater vil forstås, at -S-SO^x grupper i det S-sulfonerede immunoglobulin spaltes i blodet. ' Således som demonstreret ved de foregående eksempler er det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen muligt selektivt at spalte disulfidbindingerne, der sammenknytter H-kædeme og L-kædeme i na-tivt immunoglobulin, idet de således blotlagte svovlatomer kan S-sul-foneres. Antallet af spaltninger kan yderligere reguleres til i gennemsnit at ligge i intervallet 3-5 og fortrinsvis ved ca. 4,5, som netop er det gennemsnitlige antal interkædedisulfidbindinger i nativt immunoglobulin, og de efter spaltning blotlagte svovlatomer kan S-sul-foneres.

Sådanne hidtil ukendte immunoglobulinderivater fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen har en antikomplementaktivitet, der er langt lavere end nativt immunoglobulins således som illustreret i eksemplerne og bevirker følgeligt langt mindre uheldige reaktioner på anaphylaktiske faktorer. Således er de herved fremstillede derivater injicerbare ad ikke alene intramuskulaer vej men også ad intravenøs vej. løvrigt udviser de hidtil ukendte immunoglobulinderi-vater en antigenbindende aktivitet, der er næsten ækvivalent med nativt immunoglobulins, og har derfor fremragende bindingsaktiviteter over for forskellige antigener.

Det har tidligere været kendt at fjerne aggregater fra immunoglobulin fremstillet ved fraktionering, nemlig ved adsorption UU 32 28 eller sedimentation med aktivt kul eller polymerstoffer. Men det således behandlede immunoglobulin har stadigvæk ikke helt sjældent bevirket uheldige reaktioner efter injektion i modtageren. Hertil kommer, at genaggregateon konstateres i således behandlet immunoglobulin under opbevaring. Produktet er således stadigvæk ufuldstændigt som sikkert injicerbart middel (L. Å. Hanson & B. G. Johansonj Int.

Arch. Allergy. 31, 380 (1967)).

Det er allerede nævnt og demonstreret, at immunoglobulin-derivateme udviser uheldige reaktioner i langt mindre grad og i den-. ne henseende er enestående (jvf. fig. 2).

Desuden bevarer de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede immunoglobulinderivater deres antigenbindende aktivitet over en forlænget periode således som vist i eksempel 8. Hertil kommer, at de S-sulfonerede grupper i derivaterne genomdannes til disulfid-bindinger in vivo, medens sulfonatgrupper udstødes fra legemet. Derivaterne omdannes således til slut til det native immunoglobulin.

Af denne grund har det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede S-sulfonerede immunoglobulin åbenbare fordele frem for de kendte S-alkylerede immunoglobuliner.

Således som allerede forklaret er det endvidere klart, at de hidtil ukendte immunoglobulinderivater er velegnede som den farmaceutisk effektive bestanddel af præparater til ikke alene intra-muskulær injektion, men også til intravenøs injektion.

De hidtil ukendte immunoglobulinderivater kan tilvejebringe vandopløselige midler til injektionsvæsker, når de blandes med oplø-seliggørende stoffer såsom glycin, natriumphosphat, citrat, natrium-chlorid og lignende ved hensigtsmæssige koncentrationer. Endvidere kan sammensætningerne opløses i vand ved koncentrationer på f.eks.

1-20 vægtprocent og fortrinsvis 2-10 vægtprocent under tilvejebringelse af intravenøst injicerbare midler.

Det er indlysende, at det S-sulfonerede immunoglobulin kan anvendes ikke alene til human terapi, men også til behandling af dyr såsom køer, heste, svin, får, hunde osv. Som immunoglobulinderi-vaterne til behandling af dyr benyttes fortrinsvis de native immunoglobuliner, som fås fra de respektive dyr, og som S-sulfoneres ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.