CS230380B1 - Způsob výroby diagnostického séra ke kvantitativnímu stanovení Ímunoglobulinu třídy A - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby diagnostického séra ke kvantitativnímu stanovení ímunoglobulinu třídy A, u něhož se řeší dosažení přísné monospecifity se zřetelem k vlivu termostabilní alfa-2 globulinové frakce lidského séra, která má význam pro výtěžnost a efektivnost výroby tohoto diagnostika.

Diagnostické sérum ke stanovení imunoglobulinu třídy A se vyrábí iniikováním zvířat lidským imunoglobulinem třídy A, ze séra zvířat se odstraní protilátky nespecifické, vzniklé kontaminací ímunoglobulinu A stopami jiných bílkovin, a výsledné diagnostické sérum se komerčně využívá v různých úpravách, například značkováno peroxidázou, nebo jako součást soupravy pro kvantitativní stanovení ímunoglobulinu třídy A v lidském séru nebo plazmě. Imunoglobulin třídy A se izoluje ze séra, plazmy, nebo z odpadních frakcí z výroby Ímunoglobulinu třídy G srážením solemi zinku, síranem amonným, kyselinou kaprylovou a purifikuje se metodami chromatografickými, eventuálně afinitní chromatografií. Jako kritérium imunochemické čistoty slouží imunochemické metody, nejčastěji imunoelektroforéza s použitím koňských a králičích sér proti lidským bílkovinám.

Dosavadní způsoby výroby diagnostika ne2 přihlížejí k vlivu alfa-2 termostabilní frakce lidského séra, pokud je obsažena, třeba jen ve stopách, v ímunoglobulinu třídy A. Tato frakce má však zásadní význam pro výtěžnost výroby, a zcela odlišné postavení v porovnání s ostatními sérovými bílkovinami, z těchto důvodů:

1. alfa-2 termostabilní frakce lidského séra kontaminuje i zdánlivě „čisté“ preparáty ímunoglobulinu třídy A, přičemž kontaminace není prokazatelná obvyklými imunochemickými metodami, ale projeví se až u injikovaných zvířat neodstranitelnou nespecifickou reakcí, projevující se v imunoelektroforéze lidského séra imunoprecipitací jedné konkrétní subfrakce z početné skupiny alfa-2 globulinů.

2. Vznik nežádoucí nespecifické protilátky v séru zvířat, jimž byl injikován imunoglobulin třídy A, je závislý jednak na kvantitativním obsahu termostabilní alfa-2 globulinové frakce v Ímunoglobulinu, jednak na individuální vnímavosti injikovaného zvířete. Nepříznivým důsledkem kontaminace je nutnost vyřazení buď celé, nebo části produkce zvířecích sér z výrobního procesu, což snižuje efektivnost výroby.

3. Protilátku precipitující alfa-2 termostabilní globulin nelze z diagnostického séra odstranit obvyklými metodami vysycení, pro230380 tože až dosud není k dispozici taková bílkovinná frakce lidského séra, která by alfa-2 termostabilní globulin obsahovala v účinné koncentraci při současné absenci imunoglobulinu třídy A.

4. Průkaz termostabilního alfa-2 globulinu v imunoglobulinu třídy A je možný jen s použitím speciálního diagnostika. Obvykle používaná polyvalentní antihumánní séra odpovídající protilátku nemají. Kromě toho se termostabilní alfa-2 globulinová frakce nezobrazuje zónovou elektroforézou, protože je rozpustná v činidlech používaných k vybarvení zón.

5. Termostabilní alfa-2 globulinovou frakci se dosud nezdařilo ztotožnit s žádnou imunochemicky definovanou bílkovinou, to však neupírá závažnost této frakce při výrobě diagnostika ke stanovení imunoglobulinu třídy A. Název alfa-2 termostabilní globulin je názvem pracovním, charakterizujícím jednak příslušnost k početné alfa-2 globulinů, jednak nezměněnou imunoprecipitační a elektromigrační vlastnost po varu eluátu této frakce z iontoměničového sorbentu.

Dosavadní výrobní způsoby diagnostika jsou zákonitě provázeny ekonomickými ztrátami, jako je zvýšení výrobních nákladů, nutnost dalších imunizačnich cyklů, nutnost opakovaných purifikací imimoglobulinu třídy A, s rizikem obdobného výsledku při opakování výrobních postupů.

Podstatou způsobu výroby diagnostického séra ke kvantitativnímu stanovení imunoglobulinu třídy A podle vynálezu je, že na lidský imunoglobulin třídy A a na séra zvířat imunoglobulinem A injikovaných, se působí termostabilním činidlem, připraveným z lidské moče. Výběr individuální moče se provede pomocí diagnostického séra zvířete, jemuž byla termostabilní alfa-2 globulinová frakce injikována, a to s ohledem k co nejvyšší koncentraci této frakce v moči při současně nejnižším obsahu jiných močových bílkovin. Vhodnou moč lze získat od pacientů z nefrologických oddělení nemocnic, nejlépe však od nemocných některými krevními chorobami, při nichž se tato frakce vyskytuje v moči často izolovaně, někdy sdružena s Bence-Jonesovou bílkovinou typu kappa nebo lambda. Od Bence-Jonesovy bílkoviny ji lze snadno na iontoměniči oddělit.

Termostabilní alfa-2 globulinová frakce se získá z dialyzované moče při nízké iontové síle vyvázáním diethylaminoethylcelulózou, z vazby se po promytí uvolní koncentrovanějším pufrem, a eluát se nejméně 3 minuty vaří při 100 °C, čímž se destruují tepelně labilní složky v moči obsažené. Za horka se filtruje mikrobiálním filtrem, filtrát se dialýzou v destilované vodě zbaví solí, a lyofilizuje se. Lyofilizovaná termostabilní frakce se využívá dvojím způsobem:

1. K purifikaci imunoglobulinu třídy A, přičemž se působí prostřednictvím séra zvířete, jemuž byla injikována lyofilizovaná termostabilní frakce v několika imunizačních dávkách. Purifikace imunoglobulinu třídy A má tři možné varianty:

a) na imunoglobulin třídy A se působí sérem zvířete v průběhu frakcionace metodou, která je schopna alfa-2 termostabilní frakci z imunoglobulinu vyčlenit,

b) ze séra zvířete, jemuž byla injikována termostabilní alfa-2 globulinová frakce se vyčlení imunoglobulin třídy G (obsahující protilátku), imunoglobulin třídy G se smísí s imunoglobulinem A (s imunogénem), a ze směsi se čistý imunoglobulin A opět vyčlení, například na sloupci DEAE celulózy,

c) připraví se imunoglobulin třídy G ze séra zvířete, jemuž byla injikována termostabilní alfa-2 globulinová frakce, naváže se na CN Br sepharózu, a sloupcem se prolije imunoglobulin třídy A.

2. Lyofilizovaná termostabilní alfa-2 globulinová frakce se použije v případě potřeby jako vysycovaci materiál k dosažení požadované specifity diagnostika.

Nejjednodušší, ale velmi účinný způsob výroby diagnostického séra se opírá o variantu la, v níž se roztok imunoglobulinu třídy A pasážuje sloupcem polydextranového gelu (např. Sephadex G 100), jímané podíly se smísí ve stejných objemových poměrech se sérem zvířete, jemuž byla injikována alfa-2 termostabilní frakce. Vzorky se umístí v průhledném gelózním prostředí, a vyčlení se ty frakce imunoglobulinu třídy A, které do 24 hodin zůstanou čiré. Produkčním zvířatům se pak injikují pouze ty subfrakce imunoglobulinu třídy A, které jsou oproštěny od alfa-2 termostabilního globulinu. Pokud se pozorně vyčlení kontaminující frakce, která sloupcem polydextranového gelu prochází poněkud pomaleji, než hlavní podíl imunoglobulinu třídy A, odpadá již vysycení dle bodu 2. V opačném případě se surová antiséra vysytí přídavkem nejmenšího, pokusně zjištěného množství lyofilizátu. Vysyceni se kontroluje imunoelektroforézou, imunoprecipitát z antiséra se odstraní filtrací.

Vynález dosahuje nového a vyššího účinku zvýšenou výtěžností, spolehlivostí a reprodukovatelností. Dosavadní kritéria imunochemické čistoty imunoglobulinu třídy A rozšiřuje o termostabilní frakci lidského séra, která zvlášť výrazně komplikuje výrobu pro vznik až dosud neodstranitelné nespecifity u imunizovaných zvířat. Vynález dosahuje konkrétního vyčíslitelného účinku dosažením požadované specifity diagnostika vysycením surového séra i v těch případech, kdy se uplatnil vliv kontaminujícího termostabilního globulinu, a dosavadní nahodilostní charakter imunizace zvířat nahrazuje racionálním postupem s příznivým ekonomickým důsledkem.

Příklad použití vynálezu:

ml 3% roztoku imunoglobulinu třídy A bylo profiltrováno sloupcem polydextranového gelu (Sephadex G 100) vrstvou 65X3 centimetru v prostředí 0,15 M chloridu sodného rychlostí toku 1,8 ml/minutu. Frakce jímané po 4 ml testovány v agarózovém 1% gelovém prostředí imunoelektroforézou jednak s monospecifickým antisérem proti imunoglobulinu A, jednak se sérem prasete, jemuž byla ve třech dávkách injikována alla-2 termostabilní frakce lidského séra, připravená z lidské moče. Ve frakcích 1 až 6, počínaje výtokem bílkoviny ze sloupce, byl prokázán zákal (imunoprecipitát) výhradně jen s diagnostickým sérem proti imunoglobulinu A, přičem tyto frakce zůstaly 24 hodin čiré s použitím séra proti termostabilní frakci z moče. Ve frakcích 7 až 12 byl prokázán zákal s oběma antiséry. Směs frakcí 1 až 6 byla pak injikována zvířatům (prasatům) rozdělena ve třech dávkách v intervalu tří týdnů. Za týden po třetí injekci byla zvířata vykrvácena, a centrifugací získáno sérum. Pokusnou injikací prasat frakcemi 7 až 12 (jejich směsí] byla získána antiséra, která kromě protilátky proti imunoglobulinu A obsahovala nespecifickou protilátku proti alfa-2 termostabilnímu globulinu. Rovněž v tomto případě bylo dosaženo požadované specifity antiséra, ale bylo nutno sérum vysytit termostabilní frakcí získanou z lidské moče: sérum bylo odměřeno po 1 ml do devíti centrifugačních zkumavek, a k řadě vzorků pipetováno: 0 — 0,3 — 0,4 — 0,5 — 0,6 — 0,7 — 0,8 — 0,9 — 1 ml 0,1% roztoku termostabilní lyofilizované frakce moče, zkumavky byly doplněny na objem 2 ml 0,15 M roztokem chloridu sodného a ponechány 1 hodinu při 20 °C. Po této době byly zkumavky centrifugovány 10 minut rychlostí 10 000 ot/min v centrifúze typu Janetzki T 24 a supernatantní tekutiny analyzovány imunoelektroforézou, tj. použity jako antiséra k imunoprecipitaci lidského séra. Z výsledku imunoelekíroforézy vyplynulo, že počínaje hodnotou 0,7 ml roztoku lyofilizátu — a všech přídavků větších — dosahují vzorky požadované specifity proti imunoglobulinu A, přičemž precipitace v oblasti alfa-2 globulinové frakce není více patrna. Na podkladě tohoto vyšetření bylo vysyceno 18 litrů surového IgA séra tak, že 12,6 gramů lyofilizátu lidské moče (vyrobeného podle předpisu v dalším textu uvedeného) bylo rozpuštěno ve dvou litrech 0,15 M chloridu sodného a směs za stálého míchání přilita k surovému séru proti imunoglobulinu třídy A. Po 24 hodinách stání při +4 °C bylo sérum přefiltrováno mikrobiálním filtrem a podrobeno výstupní kontrole podle platných technických podmínek. Termostabilní frakce ve formě lyofilizátu byla připravena umístěním 1800 ml výběrové lidské moče v dialyzační trubici průměru 8 cm (Serva Visking Dialysis Tubing, Type 17/ /8 SS), 24 hodin probíhala dlalýza v 18 litrech destilované vody, dalších 24 hodin v 0,02 M fosfátovém pufru o pH 6,8 při teplotě +4 °C. Poté byla dialyzovaná moč přefiltrována filtrační papírovou vrstvou (filtr SEITZ K 5) a přidáno 180 gramů diethylaminoethylcelulózy (DE 52 Whatmann). Směs byla 1 hodinu míchána při 20 °C a přefiltrována fritou hustoty G 1. Zadržená diethylaminoethylcelulóza byla pak eluována 3X 600 ml 0,1 M fosfátového pufru pH 6,8 vždy s třicetiminutovým míccháním, filtrována fritou, a eluáty spojeny. Spojené eluáty byly zahřívány ve varné baňce až k dosažení bodu varu při norm. tlaku, od dosažení varu bylo zahříváno dále tak, aby var pokračoval po dobu tří minut. Tekutina byla za horka přefiltrována filtrační vrstvou (SEITZ K 5 filtr) a dialyzována v 18 litrech destilované vody při +4 °C. Lyofilizací bylo získáno 2,4 gramů termostabilní frakce moče. Diagnostické sérum proti termostabilní frakci bylo získáno rozpuštěním 10 miligramů lyofilizátu v 1 ml 0,15 M chloridu sodném a injekcemi praseti intramuskulárně. Injekce byla v intervalech tří týdnů ještě třikrát opakována, za týden po čtvrté injekci byla zvířeti odebrána krev, odstředěno sérum, a konzervováno přísadou 0,1% azidu sodného.

Claims (2)

1. Způsob výroby diagnostického séra ke kvantitativnímu stanovení imunoglobulinu třídy A, vyznačený tím, že na lidský imunoglobulin třídy A se působí sérem zvířete injikovaného lyofilizátem obsahujícím alfa-2 termostabilní frakci lidského séra, připraveným z lidské moče, poté se injikuje vzniklá směs zvířatům, popřípadě se 1 až 5% roztok imunoglobulinu třídy A profiltruje polydextranovým gelem, vzorky frakcí se smísí ve stejných objemových poměrech se sérem zvířete, jemuž byl injikován lyofiliZát připravený z lidské moče, popřípadě upravené frakce imunoglobulinu A, které do

VYNÁLEZU

24 hodin zůstanou čiré, se injikují zvířatům, a k séru zvířat se po injikací přidá stanovené hmotnostní množství lyofilizátu připraveného z lidské moče a směs se přefiltruje.

2. Způsob výroby podle bodu 1, vyznačený tím, že pro úpravu lidské moče působí jednou pětinou až jednou desetinou hmotnostního dílu diethylaminoethylcelulózy v prostředí 0,02 M pufru o rozmezí pH 6 až pH 8, po filtraci se k diethylaminoethylcelulóze přidá 5 až 10 hmotnostních dílů 0,1 M až 0,3 M pufru téhož pH, filtrát se vaří alespoň tři minuty, dialyzuje v desetinásobku destilované vody a lyofilizuje se.