CS230380B1

CS230380B1 - Method of preparing diagnostic sera for quantitative determination of a-class immunoglobulin

Info

Publication number: CS230380B1
Application number: CS927381A
Authority: CS
Inventors: Jaroslav Korinek
Original assignee: Jaroslav Korinek
Priority date: 1981-12-14
Filing date: 1981-12-14
Publication date: 1984-08-13

Description

Vynález se týká způsobu výroby diagnostického séra ke kvantitativnímu stanovení ímunoglobulinu třídy A, u něhož se řeší dosažení přísné monospecifity se zřetelem k vlivu termostabilní alfa-2 globulinové frakce lidského séra, která má význam pro výtěžnost a efektivnost výroby tohoto diagnostika.The present invention relates to a method for the production of diagnostic serum for the quantitative determination of immunoglobulin of class A, which achieves a strict monospecificity with respect to the effect of the thermostable alpha-2 globulin fraction of human serum which is important for the yield and efficiency of the diagnostic.

Diagnostické sérum ke stanovení imunoglobulinu třídy A se vyrábí iniikováním zvířat lidským imunoglobulinem třídy A, ze séra zvířat se odstraní protilátky nespecifické, vzniklé kontaminací ímunoglobulinu A stopami jiných bílkovin, a výsledné diagnostické sérum se komerčně využívá v různých úpravách, například značkováno peroxidázou, nebo jako součást soupravy pro kvantitativní stanovení ímunoglobulinu třídy A v lidském séru nebo plazmě. Imunoglobulin třídy A se izoluje ze séra, plazmy, nebo z odpadních frakcí z výroby Ímunoglobulinu třídy G srážením solemi zinku, síranem amonným, kyselinou kaprylovou a purifikuje se metodami chromatografickými, eventuálně afinitní chromatografií. Jako kritérium imunochemické čistoty slouží imunochemické metody, nejčastěji imunoelektroforéza s použitím koňských a králičích sér proti lidským bílkovinám.Class A immunoglobulin diagnostic serum is produced by injecting animals with human Class A immunoglobulin, removing non-specific antibodies from immunoglobulin A contaminants from other protein proteins from the animal serum, and the resulting diagnostic serum is commercially used in various treatments, for example peroxidase labeled or as part of kits for the quantitative determination of immunoglobulin class A in human serum or plasma. Class A immunoglobulin is isolated from serum, plasma, or waste fractions from the production of Class G immunoglobulin by precipitation with zinc salts, ammonium sulfate, caprylic acid, and purified by methods of chromatographic or affinity chromatography. Immunochemical methods, mostly immunoelectrophoresis using horse and rabbit sera against human proteins, serve as a criterion of immunochemical purity.

Dosavadní způsoby výroby diagnostika ne2 přihlížejí k vlivu alfa-2 termostabilní frakce lidského séra, pokud je obsažena, třeba jen ve stopách, v ímunoglobulinu třídy A. Tato frakce má však zásadní význam pro výtěžnost výroby, a zcela odlišné postavení v porovnání s ostatními sérovými bílkovinami, z těchto důvodů:The prior art methods of diagnosis ne2 take into account the effect of the alpha-2 thermostable fraction of human serum, if present, even in traces, in immunoglobulin class A. This fraction, however, is essential for production yield and a completely different position compared to other serum proteins , for these reasons:

1. alfa-2 termostabilní frakce lidského séra kontaminuje i zdánlivě „čisté“ preparáty ímunoglobulinu třídy A, přičemž kontaminace není prokazatelná obvyklými imunochemickými metodami, ale projeví se až u injikovaných zvířat neodstranitelnou nespecifickou reakcí, projevující se v imunoelektroforéze lidského séra imunoprecipitací jedné konkrétní subfrakce z početné skupiny alfa-2 globulinů.1. The alpha-2 thermostable fraction of human serum contaminates even apparently "pure" preparations of immunoglobulin class A, contamination is not detectable by usual immunochemical methods, but manifests itself in injected animals unrecoverable nonspecific reaction, manifested in immunoelectrophoresis of human serum by immunoprecipitation numerous groups of alpha-2 globulins.

2. Vznik nežádoucí nespecifické protilátky v séru zvířat, jimž byl injikován imunoglobulin třídy A, je závislý jednak na kvantitativním obsahu termostabilní alfa-2 globulinové frakce v Ímunoglobulinu, jednak na individuální vnímavosti injikovaného zvířete. Nepříznivým důsledkem kontaminace je nutnost vyřazení buď celé, nebo části produkce zvířecích sér z výrobního procesu, což snižuje efektivnost výroby.2. The generation of unwanted non-specific antibody in the serum of animals injected with Class A immunoglobulin is dependent both on the quantitative content of the thermostable alpha-2 globulin fraction in immunoglobulin and on the individual susceptibility of the injected animal. The adverse consequence of contamination is the need to eliminate either all or part of the production of animal sera from the production process, which reduces production efficiency.

3. Protilátku precipitující alfa-2 termostabilní globulin nelze z diagnostického séra odstranit obvyklými metodami vysycení, pro230380 tože až dosud není k dispozici taková bílkovinná frakce lidského séra, která by alfa-2 termostabilní globulin obsahovala v účinné koncentraci při současné absenci imunoglobulinu třídy A.3. Antibody precipitating alpha-2 thermostable globulin cannot be removed from the diagnostic serum by conventional saturation methods, since the human serum protein fraction that contains alpha-2 thermostable globulin at an effective concentration in the absence of Class A immunoglobulin is not yet available.

4. Průkaz termostabilního alfa-2 globulinu v imunoglobulinu třídy A je možný jen s použitím speciálního diagnostika. Obvykle používaná polyvalentní antihumánní séra odpovídající protilátku nemají. Kromě toho se termostabilní alfa-2 globulinová frakce nezobrazuje zónovou elektroforézou, protože je rozpustná v činidlech používaných k vybarvení zón.4. Demonstration of thermostable alpha-2 globulin in immunoglobulin class A is possible only with the use of special diagnostics. The polyvalent antihuman sera commonly used do not have the corresponding antibody. In addition, the thermostable alpha-2 globulin fraction is not displayed by zone electrophoresis as it is soluble in the agents used to color the zones.

5. Termostabilní alfa-2 globulinovou frakci se dosud nezdařilo ztotožnit s žádnou imunochemicky definovanou bílkovinou, to však neupírá závažnost této frakce při výrobě diagnostika ke stanovení imunoglobulinu třídy A. Název alfa-2 termostabilní globulin je názvem pracovním, charakterizujícím jednak příslušnost k početné alfa-2 globulinů, jednak nezměněnou imunoprecipitační a elektromigrační vlastnost po varu eluátu této frakce z iontoměničového sorbentu.5. The thermostable alpha-2 globulin fraction has not yet been identified with any immunochemically defined protein, but this does not detract from the seriousness of this fraction in the manufacture of diagnostic A-class diagnostics. The name alpha-2 thermostable globulin is a working name 2 globulins, on the one hand the unchanged immunoprecipitation and electromigration property after boiling of the eluate of this fraction from the ion exchange sorbent.

Dosavadní výrobní způsoby diagnostika jsou zákonitě provázeny ekonomickými ztrátami, jako je zvýšení výrobních nákladů, nutnost dalších imunizačnich cyklů, nutnost opakovaných purifikací imimoglobulinu třídy A, s rizikem obdobného výsledku při opakování výrobních postupů.Existing manufacturing methods of diagnosis are inherently accompanied by economic losses, such as an increase in production costs, the need for further immunization cycles, the need for repeated purification of Class A immunoglobulin, with the risk of similar results in repeating the manufacturing procedures.

Podstatou způsobu výroby diagnostického séra ke kvantitativnímu stanovení imunoglobulinu třídy A podle vynálezu je, že na lidský imunoglobulin třídy A a na séra zvířat imunoglobulinem A injikovaných, se působí termostabilním činidlem, připraveným z lidské moče. Výběr individuální moče se provede pomocí diagnostického séra zvířete, jemuž byla termostabilní alfa-2 globulinová frakce injikována, a to s ohledem k co nejvyšší koncentraci této frakce v moči při současně nejnižším obsahu jiných močových bílkovin. Vhodnou moč lze získat od pacientů z nefrologických oddělení nemocnic, nejlépe však od nemocných některými krevními chorobami, při nichž se tato frakce vyskytuje v moči často izolovaně, někdy sdružena s Bence-Jonesovou bílkovinou typu kappa nebo lambda. Od Bence-Jonesovy bílkoviny ji lze snadno na iontoměniči oddělit.The method of manufacture of a diagnostic serum for the quantitative determination of a class A immunoglobulin according to the invention is that a human class A immunoglobulin and the sera of animals injected with immunoglobulin A are treated with a thermostable reagent prepared from human urine. The individual urine is selected using the diagnostic serum of the animal injected with the thermostable alpha-2 globulin fraction, taking into account the highest concentration of this fraction in the urine with the lowest content of other urinary proteins. Appropriate urine may be obtained from patients from nephrological wards of hospitals, but preferably from certain blood diseases in which this fraction occurs in urine often isolated, sometimes associated with a Bence-Jones kappa or lambda protein. It can be easily separated from the Bence-Jones protein on an ion exchanger.

Termostabilní alfa-2 globulinová frakce se získá z dialyzované moče při nízké iontové síle vyvázáním diethylaminoethylcelulózou, z vazby se po promytí uvolní koncentrovanějším pufrem, a eluát se nejméně 3 minuty vaří při 100 °C, čímž se destruují tepelně labilní složky v moči obsažené. Za horka se filtruje mikrobiálním filtrem, filtrát se dialýzou v destilované vodě zbaví solí, a lyofilizuje se. Lyofilizovaná termostabilní frakce se využívá dvojím způsobem:The thermostable alpha-2 globulin fraction is recovered from dialyzed urine at low ionic strength by binding with diethylaminoethylcellulose, released from the binding after washing with a more concentrated buffer, and boiled at 100 ° C for at least 3 minutes to destroy the thermally labile constituents in the urine. It is hot filtered through a microbial filter, the filtrate is freed from salts by dialysis in distilled water, and lyophilized. The lyophilized thermostable fraction is used in two ways:

1. K purifikaci imunoglobulinu třídy A, přičemž se působí prostřednictvím séra zvířete, jemuž byla injikována lyofilizovaná termostabilní frakce v několika imunizačních dávkách. Purifikace imunoglobulinu třídy A má tři možné varianty:What is claimed is: 1. Purification of a class A immunoglobulin by treatment with the serum of an animal injected with a lyophilized thermostable fraction at multiple immunization doses. Purification of immunoglobulin class A has three possible variants:

a) na imunoglobulin třídy A se působí sérem zvířete v průběhu frakcionace metodou, která je schopna alfa-2 termostabilní frakci z imunoglobulinu vyčlenit,(a) the class A immunoglobulin is treated with the serum of the animal during fractionation by a method capable of eliminating the alpha-2 thermostable fraction from the immunoglobulin,

b) ze séra zvířete, jemuž byla injikována termostabilní alfa-2 globulinová frakce se vyčlení imunoglobulin třídy G (obsahující protilátku), imunoglobulin třídy G se smísí s imunoglobulinem A (s imunogénem), a ze směsi se čistý imunoglobulin A opět vyčlení, například na sloupci DEAE celulózy,(b) the serum of an animal injected with a thermostable alpha-2 globulin fraction is detached with a class G immunoglobulin (containing the antibody), the class G immunoglobulin is mixed with immunoglobulin A (with an immunogen), and the pure immunoglobulin A is detached from the mixture, e.g. DEAE cellulose column

c) připraví se imunoglobulin třídy G ze séra zvířete, jemuž byla injikována termostabilní alfa-2 globulinová frakce, naváže se na CN Br sepharózu, a sloupcem se prolije imunoglobulin třídy A.(c) prepare class G immunoglobulin from the serum of an animal injected with a thermostable alpha-2 globulin fraction, bind to CN Br sepharose, and spill the column with class A immunoglobulin.

2. Lyofilizovaná termostabilní alfa-2 globulinová frakce se použije v případě potřeby jako vysycovaci materiál k dosažení požadované specifity diagnostika.2. The lyophilized thermostable alpha-2 globulin fraction is used, if necessary, as a scavenger material to achieve the desired diagnostic specificity.

Nejjednodušší, ale velmi účinný způsob výroby diagnostického séra se opírá o variantu la, v níž se roztok imunoglobulinu třídy A pasážuje sloupcem polydextranového gelu (např. Sephadex G 100), jímané podíly se smísí ve stejných objemových poměrech se sérem zvířete, jemuž byla injikována alfa-2 termostabilní frakce. Vzorky se umístí v průhledném gelózním prostředí, a vyčlení se ty frakce imunoglobulinu třídy A, které do 24 hodin zůstanou čiré. Produkčním zvířatům se pak injikují pouze ty subfrakce imunoglobulinu třídy A, které jsou oproštěny od alfa-2 termostabilního globulinu. Pokud se pozorně vyčlení kontaminující frakce, která sloupcem polydextranového gelu prochází poněkud pomaleji, než hlavní podíl imunoglobulinu třídy A, odpadá již vysycení dle bodu 2. V opačném případě se surová antiséra vysytí přídavkem nejmenšího, pokusně zjištěného množství lyofilizátu. Vysyceni se kontroluje imunoelektroforézou, imunoprecipitát z antiséra se odstraní filtrací.The simplest but very effective method of producing diagnostic serum is based on variant 1a, in which a Class A immunoglobulin solution is passed through a column of polydextran gel (eg Sephadex G 100), the aliquots collected are mixed in equal proportions with the serum of the animal injected with alpha. -2 thermostable fraction. The samples are placed in a transparent gel-like medium, and those fractions of immunoglobulin class A that remain clear within 24 hours. Only those immunoglobulin class A subfractions that are free of alpha-2 thermostable globulin are injected into the production animals. If the contaminating fraction, which passes through the polydextran gel column somewhat slower than the major portion of the immunoglobulin class A, is carefully detached, the saturation according to point 2 is no longer necessary. Otherwise, the crude antisera is saturated by adding the smallest amount of lyophilisate. Saturation is checked by immunoelectrophoresis, the immunoprecipitate from the antisera is removed by filtration.

Vynález dosahuje nového a vyššího účinku zvýšenou výtěžností, spolehlivostí a reprodukovatelností. Dosavadní kritéria imunochemické čistoty imunoglobulinu třídy A rozšiřuje o termostabilní frakci lidského séra, která zvlášť výrazně komplikuje výrobu pro vznik až dosud neodstranitelné nespecifity u imunizovaných zvířat. Vynález dosahuje konkrétního vyčíslitelného účinku dosažením požadované specifity diagnostika vysycením surového séra i v těch případech, kdy se uplatnil vliv kontaminujícího termostabilního globulinu, a dosavadní nahodilostní charakter imunizace zvířat nahrazuje racionálním postupem s příznivým ekonomickým důsledkem.The invention achieves new and higher performance by increased yield, reliability and reproducibility. It extends the existing immunochemical purity criteria of immunoglobulin class A with the thermostable fraction of human serum, which significantly complicates production for the development of hitherto unrecoverable non-specificity in immunized animals. The present invention achieves a specific quantifiable effect by achieving the desired specificity of crude serum saturation diagnostics even when contaminating thermostable globulin has been exerted, and replaces the present accidental nature of animal immunization by a rational procedure with a favorable economic consequence.

Příklad použití vynálezu:Example of application of the invention:

ml 3% roztoku imunoglobulinu třídy A bylo profiltrováno sloupcem polydextranového gelu (Sephadex G 100) vrstvou 65X3 centimetru v prostředí 0,15 M chloridu sodného rychlostí toku 1,8 ml/minutu. Frakce jímané po 4 ml testovány v agarózovém 1% gelovém prostředí imunoelektroforézou jednak s monospecifickým antisérem proti imunoglobulinu A, jednak se sérem prasete, jemuž byla ve třech dávkách injikována alla-2 termostabilní frakce lidského séra, připravená z lidské moče. Ve frakcích 1 až 6, počínaje výtokem bílkoviny ze sloupce, byl prokázán zákal (imunoprecipitát) výhradně jen s diagnostickým sérem proti imunoglobulinu A, přičem tyto frakce zůstaly 24 hodin čiré s použitím séra proti termostabilní frakci z moče. Ve frakcích 7 až 12 byl prokázán zákal s oběma antiséry. Směs frakcí 1 až 6 byla pak injikována zvířatům (prasatům) rozdělena ve třech dávkách v intervalu tří týdnů. Za týden po třetí injekci byla zvířata vykrvácena, a centrifugací získáno sérum. Pokusnou injikací prasat frakcemi 7 až 12 (jejich směsí] byla získána antiséra, která kromě protilátky proti imunoglobulinu A obsahovala nespecifickou protilátku proti alfa-2 termostabilnímu globulinu. Rovněž v tomto případě bylo dosaženo požadované specifity antiséra, ale bylo nutno sérum vysytit termostabilní frakcí získanou z lidské moče: sérum bylo odměřeno po 1 ml do devíti centrifugačních zkumavek, a k řadě vzorků pipetováno: 0 — 0,3 — 0,4 — 0,5 — 0,6 — 0,7 — 0,8 — 0,9 — 1 ml 0,1% roztoku termostabilní lyofilizované frakce moče, zkumavky byly doplněny na objem 2 ml 0,15 M roztokem chloridu sodného a ponechány 1 hodinu při 20 °C. Po této době byly zkumavky centrifugovány 10 minut rychlostí 10 000 ot/min v centrifúze typu Janetzki T 24 a supernatantní tekutiny analyzovány imunoelektroforézou, tj. použity jako antiséra k imunoprecipitaci lidského séra. Z výsledku imunoelekíroforézy vyplynulo, že počínaje hodnotou 0,7 ml roztoku lyofilizátu — a všech přídavků větších — dosahují vzorky požadované specifity proti imunoglobulinu A, přičemž precipitace v oblasti alfa-2 globulinové frakce není více patrna. Na podkladě tohoto vyšetření bylo vysyceno 18 litrů surového IgA séra tak, že 12,6 gramů lyofilizátu lidské moče (vyrobeného podle předpisu v dalším textu uvedeného) bylo rozpuštěno ve dvou litrech 0,15 M chloridu sodného a směs za stálého míchání přilita k surovému séru proti imunoglobulinu třídy A. Po 24 hodinách stání při +4 °C bylo sérum přefiltrováno mikrobiálním filtrem a podrobeno výstupní kontrole podle platných technických podmínek. Termostabilní frakce ve formě lyofilizátu byla připravena umístěním 1800 ml výběrové lidské moče v dialyzační trubici průměru 8 cm (Serva Visking Dialysis Tubing, Type 17/ /8 SS), 24 hodin probíhala dlalýza v 18 litrech destilované vody, dalších 24 hodin v 0,02 M fosfátovém pufru o pH 6,8 při teplotě +4 °C. Poté byla dialyzovaná moč přefiltrována filtrační papírovou vrstvou (filtr SEITZ K 5) a přidáno 180 gramů diethylaminoethylcelulózy (DE 52 Whatmann). Směs byla 1 hodinu míchána při 20 °C a přefiltrována fritou hustoty G 1. Zadržená diethylaminoethylcelulóza byla pak eluována 3X 600 ml 0,1 M fosfátového pufru pH 6,8 vždy s třicetiminutovým míccháním, filtrována fritou, a eluáty spojeny. Spojené eluáty byly zahřívány ve varné baňce až k dosažení bodu varu při norm. tlaku, od dosažení varu bylo zahříváno dále tak, aby var pokračoval po dobu tří minut. Tekutina byla za horka přefiltrována filtrační vrstvou (SEITZ K 5 filtr) a dialyzována v 18 litrech destilované vody při +4 °C. Lyofilizací bylo získáno 2,4 gramů termostabilní frakce moče. Diagnostické sérum proti termostabilní frakci bylo získáno rozpuštěním 10 miligramů lyofilizátu v 1 ml 0,15 M chloridu sodném a injekcemi praseti intramuskulárně. Injekce byla v intervalech tří týdnů ještě třikrát opakována, za týden po čtvrté injekci byla zvířeti odebrána krev, odstředěno sérum, a konzervováno přísadou 0,1% azidu sodného.ml of a 3% immunoglobulin class A solution was filtered through a polydextran gel column (Sephadex G 100) with a 65X3 centimeter layer in 0.15 M sodium chloride medium at a flow rate of 1.8 ml / minute. Fractions collected after 4 ml were tested in agarose 1% gel medium by immunoelectrophoresis both with monospecific anti-immunoglobulin A antiserum and with serum from pigs injected in three doses with a human-derived alla-2 thermostable fraction prepared from human urine. In fractions 1 to 6, starting with the protein flow from the column, turbidity (immunoprecipitate) was detected only with diagnostic serum against immunoglobulin A, whereas these fractions remained clear for 24 hours using serum against the thermostable fraction from urine. In fractions 7 to 12, turbidity with both antisera was demonstrated. The mixture of fractions 1 to 6 was then injected into animals (pigs) divided in three doses at three week intervals. One week after the third injection, the animals were bled, and serum was collected by centrifugation. Testing pigs with fractions 7 to 12 (mixtures thereof) yielded antisera which, in addition to the anti-immunoglobulin A antibody, contained a non-specific antibody against alpha-2 thermostable globulin, but in this case the desired antisera specificity was achieved, but human urine: serum was measured in 1 ml in nine centrifuge tubes, and pipetted to a number of samples: 0 - 0.3 - 0.4 - 0.5 - 0.6 - 0.7 - 0.8 - 0.9 - 1 ml of 0.1% thermostable lyophilized urine fraction, the tubes were made up to a volume of 2 ml with 0.15 M sodium chloride solution and kept at 20 ° C for 1 hour, after which the tubes were centrifuged for 10 minutes at 10,000 rpm in a centrifuge type of Janetzki T 24 and supernatant fluids analyzed by immunoelectrophoresis, ie used as antisera for immunoprecipitation of human serum. with 0.7 ml of lyophilisate solution - and all larger additions - the samples achieve the desired specificity against immunoglobulin A, with precipitation in the alpha-2 region of the globulin fraction no longer evident. As a result of this examination, 18 liters of crude IgA serum were saturated by dissolving 12.6 grams of human urine lyophilisate (produced as described below) in two liters of 0.15 M sodium chloride and pouring the mixture into the raw serum while stirring After 24 hours at +4 ° C, the serum was filtered with a microbial filter and subjected to the final control according to the applicable technical conditions. The thermostable lyophilizate fraction was prepared by placing 1800 ml of select human urine in an 8 cm diameter dialysis tubing (Type 17/8 SS) for 24 hours and was pumped in 18 liters of distilled water for a further 24 hours at 0.02. M phosphate buffer pH 6.8 at +4 ° C. Then the dialyzed urine was filtered through a filter paper layer (SEITZ K 5 filter) and 180 grams of diethylaminoethylcellulose (DE 52 Whatmann) was added. The mixture was stirred at 20 ° C for 1 hour and filtered through a density frit G 1. The retained diethylaminoethylcellulose was then eluted with 3X 600 mL of 0.1 M phosphate buffer pH 6.8 with stirring for 30 minutes, frit filtered, and the eluates pooled. The combined eluates were heated in a boiling flask to reach boiling point at room temperature. After boiling, the mixture was heated further to continue boiling for three minutes. The liquid was hot filtered through a filter bed (SEITZ K 5 filter) and dialyzed in 18 liters of distilled water at +4 ° C. Lyophilization yielded 2.4 grams of the thermostable fraction of urine. Diagnostic serum against the thermostable fraction was obtained by dissolving 10 milligrams of lyophilisate in 1 ml of 0.15 M sodium chloride and injecting pigs intramuscularly. The injection was repeated three more times at three-week intervals, one week after the fourth injection, blood was drawn from the animal, serum was centrifuged, and preserved with 0.1% sodium azide.

Claims

Method for the production of diagnostic serum for the quantitative determination of immunoglobulin class A, characterized in that the human immunoglobulin class A is treated with the serum of an animal injected with a lyophilisate containing an alpha-2 thermostable fraction of human serum prepared from human urine. 1 to 5% immunoglobulin class A solution is filtered with a polydextran gel, the fraction samples are mixed in equal proportions with the serum of an animal injected with a lyophilizate prepared from human urine or a modified immunoglobulin A fraction, which

OF THE INVENTION

They remain clear for 24 hours, are injected into the animals, and after injection, a determined amount of lyophilisate prepared from human urine is added to the serum of the animals and the mixture is filtered.

2. A process according to claim 1, wherein about one-fifth to one-tenth part by weight of diethylaminoethylcellulose in a medium of 0.02 M buffer pH 6 to pH 8 is added to treat human urine. parts of 0.1 M to 0.3 M buffer of the same pH, the filtrate was boiled for at least three minutes, dialyzed in ten times distilled water and lyophilized.