DK151610B - Fremgangsmaade til fremstilling af human-immunoglobulinpraeparater med formindsket komplementaktivitet og god antistofaktivitet - Google Patents

Description

DK 151610B

i o

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af human-immunoglobulinpræparater med formindsket komplementaktivitet og god antistofaktivitet. Disse immunoglobulinpræparater kan anvendes som lægemidler, især 5 til intravenøs indgivelse.

Immunoglobulinpræparater, fremstillet ved fraktionering af serum, især gående ud fra human serum, har på grund af deres antistofegenskaber en væsentlig betydning som prophylaktika og terapeutika til understøttelse af 10 legemets afværgereaktioner.

Immunoglobulinpræparater har hidtil kun vist sig egnet til hovedsagelig intramuskulær anvendelse. Ved intravenøs indgivelse reagerer modtageren mere eller mindre udpræget med anaphylaktoide symtomformer. En intravenøs ind-15 givelse af immunoglobulinpræparaterne er imidlertid meget ønskværdig, fordi denne hurtig kommer til virkning i organismen .

Det antages, at de anaphylaktoide bireaktioner beror på en binding af serumkomplementet ved hjælp af det 20 indgivne immunoglobulin. Man har derfor allerede flere gange forsøgt at ændre immunoglobuliner således, at deres antistofreaktivitet bliver bevaret, men at graden af komplementbindingen imidlertid forringes så meget, at de modificerede immunoglobuliner kan anvendes til intravenøs 25 indgivelse. Det er kendt, at immunoglobuliner ændres ved enzymatisk nedbrydning på en sådan måde, at bindingsstederne for komplementet fraspaltes, idet dog resten af molekylet stadig er i stand til at binde antigener. Et sådant præparat indgives intravenøst med godt resultat.

30 I nogle tilfælde anses det i sit molekyle formind skede immunoglobulin på grund af den forholdsvis forkortede halveringstid i organismen som mindre tilfredsstillende end immunoglobulinpræparater med vidtgående uforandret molekylvægt.

35 Også omsætningen af immunoglobuliner med alkyle- rende eller acylerende midler er beskrevet til fremstilling 2

DK 15161 OB

O

af intravenøst indgivelige immunoglobuliner.

Desuden kendes fremgangsmådef/ ved hvilke immuno-globuliner spaltes ved reduktion af de intramolekylære disulfid-bindinger, og de dannede sulfhydrilgrupper derpå 5 alkyleres.

Man har også allerede forsøgt sulfitolytisk at spalte disulfid-bindingerne i immunoglobulin-molekylet, hvorved’der skal anvendes forholdsvis høje koncentrationer af sulfit eller tetrathionat. Anvendelsen af sulfit sammen 10 med Cu-II-ioner fører til dårligt bedømte produkter.

Fra DK-fremlæggelsesskrift nr. 141.432 er det således kendt at fremstille immunoglobulinderivater, der har nedsat antikomplementaktivitet og fremragende antistofaktivitet, under anvendelse af et sulfitolytisk middel, men 15 i fraværelse af cupriioner. Det har nu overraskende vist sig, at ved anvendelse af meget lave koncentrationer af sulfitolytisk middel kan man anvende cupriioner som oxidationsmiddel ved sulfoneringen af immunoglobuliner uden tab af antigenbindingskapacitet. Ifølge DK-fremlæggelses-20 skrift nr. 141.432 går antigenbindingskapaciteten praktisk taget tabt, når der ved den der anførte fremgangsmåde anvendes cupriioner, og ved fremstilling af immunoglobulin-præparater er formålet netop at bevare antigenbindingskapaciteten.

25 Den foreliggende opfindelse går ud fra den tanke, at den væsentlige andel af uforenelighedsreaktioner ved indgivelse af handelsgængse gammaglobuliner ad intravenøs vej ikke fremkaldes af gammaglobulin-molekylet selv, men af den fra den native tilstand .af immunoglobuliner afvigende 30 struktur.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af human-immunoglobulinpræparater med formindsket komplementaktivitet og god antistofaktivitet, hvorved ved hjælp af sulfitolytiske foranstaltninger dannelsen 35 af komplementbindende strukturer hindres eller allerede foreliggende strukturer ændres i eri sådan grad eller fjernes

DK 15161 OB

O

3 adsorptivt, at komplementet ikke eller kun lidt er i stand til at binde.

Fremgangsmåden til fremstilling af immunoglobulin- præparaterne er ejendommelig ved, at en på kendt måde ved 5 fraktionering af blodplasma fremstillelig human-immuno- _2 globulinfraktion behandles med mindre end 5*10 M/l af et sulfitolytisk middel, i nærværelse af cupriioner i en _3 koncentration på mindre end 5·10 M/l og yderligere et i vand tungtopløseligt phosphat.

10 Som sulfitolytisk middel anvendes i reglen sulfit.

Ifølge opfindelsen anvendes imidlertid fortrinsvis et disulfit såsom natrium-disulfit og fordelagtigt en kon- -3 centration på 2-4 · 10 M/liter. Sammen med sulfit kan der 2+ anvendes Cu -ioner som oxiderende stof, i reglen 1/10 15 af den til molariteten henførte mængde af det sulfitoly-tiske middel.

Den temperatur, ved hvilken det sulfitolytiske stof sættes til immunoglobulinopløsningen, er ikke kritisk, blot der ikke foreligger temperaturer meget højere end 20 50°C. Fremgangsmåden gennemføres fortrinsvis ved en tempe ratur mellem 5 og 25°C. På trods af dette generelle udsagn skal det fastslås, at temperaturen for så vidt udøver en indflydelse på fremgangsmåden, fordi mindre koncentrationer af reaktionsmidlet er nødvendige ved højere 25 temperaturer.

Også reaktionstiden står i omvendt forhold til koncentrationen af det sulfitolytiske middel. Sulfitoly-sen af immunoglobulinfraktionen gennemføres i reglen mellem 5-90 timer.

30 Reaktionen afsluttes ved adskillelse af det sulfitolytiske middel og immunoglobulinerne. Hensigtsmæssigt udfældes hertil immunoglobulinerne. En anden mulighed består f.eks. i fjernelsen af det sulfitolytiske middel ved dialyse.

35 Det er snarere gunstigere at lade det her omhand lede fremgangsmådetrin efterfølge af yderligere rensnings- 4

O

DK Ί51610Β trin, som det er almindelig sædvanligt ved immunoglobulin-præparatfremstilling.

Udgangsmaterialet til fremgangsmåden ifølge opfindelsen er et ifølge teknikkens stade tilgængeligt immuno-5 globulin. Dette stof er i litteraturen betegnet på forskellig måde også med gammaglobulin, IgG og immunoglobulin G.

Det består i overvejende grad af den såkaldte 7 S-frak-tion med en molekylvægt på ca. 160.000. Man kan både anvende de fra blanding fraskillelige immunoglobuliner, men også 10 sådanne fra særlig immuniserede donorer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Dette er de såkaldte hyperimmunoglo-buliner med overgennemsnitlige høje specifikt mod bestemte antigener rettede antistofindhold. Eksempelvis skal her nævnes fåresyge-immunoglobulin, som udvindes ved udsorte-15 ring af plasma fra donorer med forhøjede antistoftitere over for fåresyge og efterfølgende oparbejdning til udvinding af immunoglobulinet. De ved den her omhandlede fremgangsmåde egnede udgangsmaterialer kan udvindes på gængs måde ud fra blodplasma, f.eks. ved fraktioneret saltfæld-20 ning af plasma eller ved fældning med organiske opløsningsmidler, især med ethanol, med de forskellige fremgangsmådevarianter, der går tilbage til de grundlæggende arbejder af Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68 (1946), side 449 ff.

Fortrinsvis egnede udgangsmaterialer er en γ-globu-25 linholdig fraktion, der ifølge Cohn benævnes som fraktion II og III eller ifølge Nitschmann som fraktion A. Sådanne fraktioner indeholder foruden γ-globulin yderligere α- og β-globulin samt små mængder albumin, γ-globulinandelen ligger ved 40-80 vægtprocent, henført til mængden af 30 det samlede protein.

Det har vist sig hensigtsmæssigt at opløse en inden for rammerne af en alkoholfraktioneringsrensningsmetode dannet, endnu ikke renset γ-globulinfraktion, i reglen den ved albuminfraktionering dannede pasta, i vand eller i en 35 kun lidt koncentreret, fortrinsvis 0,3-0,9%1s neutralsaltopløsning, såsom kogsalt. Efter opløsning skal proteinet

: DK 15161 OB

5

O

hensigtsmæssigt foreligge i en koncentration på 0,5-15%, fortrinsvis mellem 1 og 5% (g/rumf.). Til denne opløsning sættes det sulfitolytiske middel ved en pH-værdi mellem 4 og 8, fortrinsvis mellem 5,0 og 6,0, (f.eks. Na2S20^ 5 eller Na2S0g) og CuSO^, og herved holdes temperaturen mellem 5 og 50°C.

pH-værdien af reaktionsblandingen kan under reaktionen afvige fra sin udgangsværdi, uden at dette har uheldige resultater. Efter omsætningen med det sulfitoly-10 tiske middel tilsættes den derpå fremkomne immunoglobulin-opløsning et i vand tungtopløseligt phosphat, hvorpå der eventuelt kan gennemføres en koncentrering og rensning af immunoglobulinerne. Medtagelse af en adsorption i fremgangsmådetrinene for yderligere rensning fører til en 15 yderligere forringelse af komplementbindingen.

Således kan f.eks. i opløsningen fremstilles in situ aluminiumphosphat ud fra AlCl^ og Na3PC>4. Hertil kan foruden forureninger også komplementbindehde aggregater af immuno-globulinet bindes til aluminiumphosphat. Også calciumphos-20 phat kan anvendes til fjernelse af forureninger og komplementbindende stoffer.

5-90 timer efter tilsætningen af de sulfitolytiske midler kan immunoglobulinerne f.eks. udfældes med ethanol på kendt måde.

25 De herved fremstillelige immunoglobulinpræparater, er på grund af den foretagne partielle sulfitolyse, hvad angår komplementbindingskapaciteten svagere komplementbindende end udgangsmaterialet. Denne effekt kan om ønsket yderligere svækkes ved adsorption af komplementbindende 30 aktivitet.

Uafhængig af samtidigt ønskede rensningsresultater opnås særlig gode resultater hvad angår den formindskede komplementbinding, når sulfitolytisk, i nærværelse af kobberioner behandlede, immunoglobulinfraktioner som nævnt be-35 handles med et i vand tungtopløseligt phosphat. Hertil anvendes fortrinsvis aluminiumphosphat eller calciumphosphat.

DK 151610B

O

6

Hertil er mængder på 0,005-0,1 M/liter gunstige.

De adsorberende midler fremstilles hensigtsmæssigt ved tilsætning af en vandopløselig kation og et vandopløseligt phosphat om hvilke det er kendt, at de er i stand til at 5 danne tungtopløselige phosphater med hinanden, i immuno-globulinopløsningen selv. Hertil holdes pH-værdien hensigtsmæssigt mellem 4 og 8,5, hvorved man til adsorption af komplementbindende aktivitet ved hjælp af AlPO^ foretrækker pH-værdier mellem 4 og 6, og ved alkalimetalphos-10 phater, såsom kaliumphosphat, pH-værdier mellem 5,8 og 8,5.

Gængse vandopløselige kationer, der er i stand til at danne tungtopløselige bundfald med phosphationer, er aluminium, fortrinsvis som AlClg eller (Al) 2(80^)3/ desuden blandt de vandopløselige jordalkalimetalsalte især vandopløselige 15 calciumsalte, såsom kalciumacetat· Til dannelsen af adsorptionsmidlet i immunoglobulinopløsningen arbejdes der hensigtsmæssigt med et ringe overskud af deri kationiske komponent .

Kombineres nu sulfitolysen med et adsorptionstrin 20 som ovenfor beskrevet, kan komplementbindingen af immunoglo-bulinpræparaterae bringes ned på en særlig lav værdi, ofte nær ved nul. Hvert skridt er imidlertid hver for sig egnet til at nedsætte komplementbindingen af immunoglobulinpræ-parater.

25 Da målet for fremgangsmåden består i at formindske komplementbindingen, afstemmes fremgangsmådetrinene så vidt muligt efter hinanden, at de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede produkter tilfredsstiller disse krav.

30 Det ligger inden for opfindelsen, når fremgangsmå den gennemføres under betingelser, som fagmanden i derine henseende erkender som særlig egnede. Dette vil sige, at en kombination af høje koncentrationer af det sulfitolyti-ske middel i forhold til lave proteinkoncentrationer kan 35 forbindes med lave temperaturer og eri kort reaktionstid inden for de beskrevne rammer og omvendt.

DK 151610 B

7

O

Bestemmelsen af den antikomplemeritære virkning sker ved et hæmolyseforsøg med sensibiliserede fåreerythrocy-ter og marsvineserum (komplement). Herved bringes erythrocy-terne og komplementet til reaktion med immunoglobulinpræpa-5 ratet. Efter tilsvarende inkubationstid kan det erkendes, at immunoglobulinpræparatet også i højere koncentrationer praktisk taget ikke påvirker hæmolysen, der kan bestemmes kvantitativt på photometrisk måde. Desuden kan det i et in vivo forsøg på kaniner påvises, at der efter intravenøs 10 indgivelse af det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede immunoglobulinpræparat kun kan fastslås en ubetydelig og forbigående sænkning af komplementspejlet i blodplasma målt ved komplementfaktoren Cl.

I en række af de ved fremgangsmåden ifølge opfin-15 delsen fremstillede præparationer ligger komplementbindingen i alt under 10% henført til en 100% standard. Denne værdi er selv efter en opbevaring af præparatet i løbet af ca. 2 år kun uvæsentligt ændret opadtil. Aggregatandelene i immunoglobulinpræparaterne ligger ligeledes under 10%.

20 I en 5%'s proteinopløsning kan der ved anvendelse af CuSO^ påvises <1 ^ug/ml kobber-11-ioner.

De hvad angår antikomplementaktiviteten formindskede hidtil ukendte γ-globulinpræparater indeholder hovedsagelig uændret 7 S-immunoglobulin i sammenligning med de modifice-25 rede præparater ifølge teknikkens stade med undertiden lavere sedimentationsværdier. Antistofaktiviteten af molekylet forbliver bevaret.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede immunoglobulinpræparater er i første linie påtænkt til 30 en intravenøs anvendelse. De svagt sulfitolytisk behandlede og derpå som beskrevet rensede immunoglobuliner kan efter sædvanlig steril filtrering anvendes i vilkårlige mængder. Når det påses, at præparaterne anvendes som 5-16%*s proteinopløsning, er en tilsvarende indstilling 35 af den rensede og sterilfiltrerede opløsning uden videre mulig. En opløsning, der indeholder 0,3-0,9% neutralsalt, der om ønsket yderligere indeholder fysiologisk uskadelige tilsætninger, f.eks. en α-aminosyre, såsom

O

8

DK 15161 OB

glycin i en mængde på 1,5-2,5%, kan frysetørres, opbevares som frysetørret produkt og før anvendelsen rekonstitueres som opløsning ved tilsætning af den ønskede mængde destilleret vand. Også denne opløsning udviser ingen forøget 5 komplementbinding. Det rekonstituerede middel kan ligeledes indgives intravenøs.

Opfindelsen skal belyses nærmere ved hjælp af efterfølgende eksempler.

Eksempel i·.· · 10 En ved albuminfrakt'ionering ifølge Cohn ved hjælp af ethanol dannet gammaglobulinfraktion opløses i eii 0,3% kogsaltopløsning, hvorved der til 1 kg gammaglobulinpasta anvendes 10 liter kogsaltopløsning. Temperaturen holdes ' ved ca. 5°C. Til opløsningen sættes 0,07% (g/rumfang) 15 Na2S205 i form af en 10%.'s natriumdisulfitopløsning og 0,007% (g/rumfang) CuSO^ x 5 H20 i form af. en 1%'s kobbersaltopløsning. Efter endt tilsætning tilsættes der pr. liter opløsning 200 ml af en 0,2 molær A1C13- og 200 ml af en 0,2 molær Na3P04-opløsning. Tilsætningen sker under 20 pH-kontrol, der skal sikre en pH-værdi på ca. 5. Opløsningen o omrøres natten over ved 5 C. Aluminiumphosphat-adsorbensen fraskilles derpå ved centrifugering.

Opløsningen, der' indeholder iromunoglobulinerhe, udfældes ved tilsætning af 25% (rumfang/rurofang) ethanol.

25 Bundfaldet fraskilles ved centrifugering. Det opløses i en tilstrækkelig mængde destilleret vand, og der tilsættes 0,2% ethylendiamintetraeddikesyre, og pH-værdieri indstilles til 7,0. Ved tilsætning af 25% ethanol fældes immunoglo-bulinerne på ny og centrifugeres, og bundfaldet opløses i 30 en tilstrækkelig mængde 0,85%'s kogsaltopløsning. Til denne opløsning sættes 2,5% (g/rumfang) glycin. Herpå lyophili-seres præparatet.

Færdiggørelsen til det intravenøst indgivelige immunoglobulin kan foretages på følgende måde: lyophiii-35 satet opløses i destilleret vand, bringes til et protein-indhold på 5%, fyldes i en slutbeholder og lyophiliseres på ny.

9

O

DK 151610B

Eksempel 2.

En ved albuminfraktionering ifølge Cohn ved hjælp af ethanol dannet gammaglobulinfraktion opløses i en 0,3%/s kogsaltopløsning, hvortil der til 1 kg gammaglobulinpasta g anvendes 10 liter kogsaltopløsning. Temperaturen holdes ved ca. 5°C. Til opløsningen sættes 0,2% (g/rumfang)

Na2S20g i form af en 10%'s natriumdisulfitopløsning og derpå 0,02% (g/rumfang) CuSO^ x 5 I^O. i form af en 1%'s kobbersulfatopløsning. Efter afsluttet tilsætning tilsættes 10 der pr. liter opløsning under omrøring 120 ml af en 1 molær calciumacetatopløsning og 120 ml af en 1/3 molær sekundær natriumphosphatopløsning. pH-værdien holdes ved + 8-0,1 med 0,1 molær natriumhydroxidopløsning. Blandingen omrøres i 20 timer ved 5°C. Efter dette tidsrum fraskilles 15 det dannede calciumphosphat ved filtrering, og den filtrerede immunoglobulinopløsning udvindes.

Den videre oparbejdning af immunoglobulinerne kan gennemføres svarende til eksempel 1.

20 25 1 35

Claims (2)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af human-immu- noglobulinpræparater med formindsket komplementaktivitet og god antistofaktivitet, kendetegnet ved, at en 5 human-immunoglobulinfraktion behandles med mindre end _2 5*10 M/l af et sulfitolytisk middel, i nærværelse af _3 cupriioner i en koncentration på mindre end 5*10 M/l og yderligere et i vand tungtopløseligt phosphat.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved, at a) en human-immunoglobulinfraktion bestående af 40 til 80% immunoglobulin og 20 til 60% andre plasmaproteiner i en koncentration på 1-5% protein, i 5 til 90 timer behandles med 2-4*10~3 M/l Na2S205 og 2-4·1θ"4 M/l CuS04, ved 15 en pH-værdi på 5-8, og b) immunoglobulinfraktionen behandles med 0,005-0,15 M/l af et i immunoglobulinopløsningen fremstillet, i vand tungt opløseligt phosphat, hvorpå proteinerne fraskilles, eventuelt under berigelse og rensning af immunoglobuli- 20 nerne. 25 3° 35