DE2658334A1 - Immunglobulin mit verminderter komplementbindung, verfahren zu seiner herstellung sowie dieses enthaltende mittel - Google Patents
Immunglobulin mit verminderter komplementbindung, verfahren zu seiner herstellung sowie dieses enthaltende mittelInfo
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Description
BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg/Lahn 2658334
Aktenzeichen: Ma 284
hoe 76/b 026 Datum: 28. Oktober 19 76
Immunglobulin mit verminderter Komplementbindung, Verfahren zu
seiner Herstellung sowie dieses enthaltende Mittel
Die Erfindung betrifft Immunglobulinpräparationen mit verminderter
Komplementbindung, Verfahren zu deren Herstellung sowie Arzneimittel, welche die Immunglobulinpräparationen enthalten, insbesondere
solche zur intravenösen Applikation.
Die durch Fraktionierung von Serum, insbesondere von menschlichen Serum ausgehend, hergestellten Immunglobulinpräparationen haben
aufgrund ihrer Antikörpereigenschaften eine wesentliche Bedeutung als Prophylaktika und Therapeutika zur Unterstützung körpereigener
Abwehrreaktionen.
Immunglobulinpräparationen erv/iesen sich bislang im wesentlichen nur für die intramuskuläre Anwendung geeignet: bei intravenösen
Applikationen reagierten die Empfänger mehr oder weniger ausgeprägt mit anaphylaktoiden Erscheinungsformen. Eine intravenöse Applikation
der Immunglobulinpräparationen ist jedoch sehr erwünscht, da diese im Organismus rascher zur Wirkung kommen.
Es wird angenommen, daß die anaphylaktoiden Nebenreaktionen auf der
Bindung des Serumkomplementes durch das verabreichte Immunglobulin ·
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beruhen. Man hat darum bereits mehrfach versucht, die Immunglobuline
derart zu verändern, daß ihre Antikörperaktivität erhalten bleibt, das Maß der Komplement-Bindung jedoch soweit verringert
wird, daß die modifizierten Immunglobuline für eine intravenöse
Applikation eingesetzt werden können. Es ist bekannt, Immunglobuline durch enzymatischen Abbau dahingehend .zu verändern, daß die
Bindungssteilen für das Komplement abgespalten werden, der Rest
der Moleküle jedoch noch in der Lage bleibt, die Antigene zu binden. Ein solches Präparat wird mit gutem Erfolg intravenös appliziert.
In einigen Fällen wird das in seinem Molekül verkleinerte Immunglobulin
wegen der vergleichsweise verkürzten Halbwertszeit im Organismus als weniger befriedigend angesehen als Immunglobulinpräparationen
mit weitgehend unverändertem Molekulargewicht.
Auch die Umsetzung von Immunglobulinen mit alkylierenden und acylierenden
Mitteln ist zur Herstellung von intravenös applizierbaren Immunglobulinen beschrieben.
Weiter sind Verfahren bekannt, wonach Immunglobuline durch Reduktion
der intramolekularen Disulfid-Bindungen gespalten und die gebildeten
Sulfhydrilgruppen anschließend alkyliert werden.
Man hat auch schon versucht, in dem Immunglobulin-Molekül die
Disulfid-Bindungen sulfitolytisch zu spalten, wozu relativ
hohe Konzentrationen an Sulfit oder Tetrathionat eingesetzt werden. Die Verwendung von Sulfit zusammen mit Cu-II Ionen führte
zu schlecht beurteilten Produkten.
Die vorliegende Erfindung geht von dem Gedanken aus, daß der wesentliche
Anteil von ünvertraglichkeitsreaktionen bei der Verabreichung von handelsüblichen Gammaglobulinen auf intravenösem
Wege nicht durch das Gammaglobulin-Molekül selbst sondern durch von dem nativen Zustand der Immunglobuline abweichende Strukturen
hervorgerufen wird.
Gegenstand der Erfindung sind demnach Immunglobulinpräparationen
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und ein Verfahren zu deren Herstellung, wonach durch sulfitolytische
Maßnahmen die Bildung von komplementbxndenden Strukturen verhindert bzw. bereits vorliegende Strukturen in dem Maße verändert
oder adsorptiv entfernt werden, daß sie Komplement nicht oder nur wenig zu binden vermögen.
Die erfindungsgemäßen Immunglobulinpräparationen werden erhalten
durch ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine nach bekannten Verfahren der Fraktionierung von Blutplasma erhältliche
Immunglobulin-Fraktion mit einer niedrigen Konzentration eines sulfitolytischen Agens und/oder einer für die Reduktion der
Komplementbindung ausreichenden Menge eines in Wasser schwer löslichen Phosphats behandelt wird.
Eine geringe Konzentration eines sulfitolytischen Agens stellt im
— 2 Sinne der Erfindung eine Konzentration >
0 aber <.5 · 10 M/l, vorzugsweise 2-4 · 10 M/l dar.
Als sulfitolytisches Agens wird in der Regel Sulfit verwendet. Erfindungsgemäß
wird jedoch ein Disulfit wie Natrium-Disulfit bevorzugt
und vorteilhaft in einer Konzentration von 1.3 bis 3.6"10
M/l eingesetzt. Gemeinsam mit Sulfit können oxidierende Stoffe wie
• 2+ Dithionit und Schwermetallionen wie Cu -Ionen verwendet werden.
Sie können erfindungsgemäß im Bereich von > 0 aber <5 · 10 M/l
eingesetzt werden; in der Regel 1/10 der auf die Molarität bezogenen Menge des sulfitolytischen Agens.
Die Temperatur, bei der die sulfitolytische Substanz zu der Immun ·-
globulinlösung hinzugegeben wird, ist nicht kritisch, soweit nicht bedeutend höhere Temperaturen als 500C vorliegen. Vorzugsweise
wird das Verfahren bei einer Temperatur zwischen + 5°C und 25°C durchgeführt. Trotz dieser generellen Aussage ist festzustellen,
daß die Temperaturen insofern einen Einfluß auf das Verfahren ausüben, als bei höheren Temperaturen geringere
Konzentrationen des Reduktionsmittels benötigt werden.
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Auch die Reaktionszeit steht im umgekehrten Verhältnis zur Konzentration
der sulfitolytischen Angetien. Die Sulfitolyse der
Immunglobulininfraktion wird in der Regel während 5-90 Stunden durchgeführt.
Die Reaktion wird durch Trennung der sulfitolytischen Agentien und
der Immunglobuline beendet. Zweckmäßig werden hierfür die Immunglobuline
ausgefällt. Eine andere Möglichkeit besteht z.B. in der Entfernung der sulfitolytischen Agentien durch Dialyse.
Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die Behandlung von nach dem Stand der Technik erhältlichen Immunglobuüinpräparationen nicht erst
in· einem letzten Reaktionsschritt vorzunehmen. Es ist vielmehr günstiger, letzte Reinigungsschritte, wie sie bei der Immunglobulinpräparation
allgemein üblich sind, dem erfindungsgemäßen Verfahren anzuschließen.
Das Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren ist ein nach
dem Stand der Technik erhältlichen Immunglobulin. Diese Substanz wird in der Literatur verschiedentlich auch mit Gammaglobulin, IgG
und Immunglobulin G bezeichnet. Sie besteht überwiegend aus der sogenannten 7 S-Fraktion mit einem Molekulargewicht von etwa
160.000. Es können sowohl die aus Mischseren erhältlichen Immunglobuline, aber auch die von besonders immunisierten Spendern erfindungsgemäß
eingesetzt werden. Dies sind die sogenannten Hyperimmunglobuline mit überdurchschnittlich hohen spezifisch gegen bestimmte
Antigene gerichteten Antikörpergehalten. Beispielswiese soll hier genannt werden Mumpsimmunglobulin. Die für das erfindungsgemäße
Verfahren geeigneten Ausgangsmaterialien sind durch gängige Verfahren aus Blutplasma zu gewinnen, wie z.B. durch die fraktionierte
Salzfällung des Plasmas oder durch Fällung mit organischen Lösungsmitteln, insbesondere durch Äthanol, mit den verschiedenen Verfahrensvarianten,
die auf die grundlegenden Arbeiten von Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. jjf^, (1946), Seite 449 ff zurückgehen.
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Bevorzugt geeignet als Ausgangsmaterial ist eine ^"-globulinhaltige
Fraktion, die nach Cohn als Fraktion II und III oder nach Nitschmann
Fraktion A genannt ist. Derartige Fraktionen enthalten neben
Jf -Globulin noch (λ. - und ß-Globulin sowie kleiner Mengen Albumin.
Der If-Globulinanteil liegt bei etwa 40 - 80 Gew.-%, bezogen auf die
Menge des Gesamtproteins.
Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, eine im Rahmen des Alkoholfraktionierungsverfahrens
anfallende, noch nicht gereinigte Gamraaglobulinfraktion,
in der Regel die bei der Albuminfraktionierung anfallende Paste, in Wasser oder in einer wenig konzentrierten, vorzugsweise
einer etwa 0,3 - 0,9 %igen Neutralsalzlösung wie Kochsalz aufzulösen. Nach der Auflösung soll das Protein zweckmäßig in einer
Konzentration von 0,5 bis 15 %, vorzugsweise zwischen 1 und 5 % (g/V) vorliegen. Zu dieser Lösung wird bei einem pH-Wert.zwischen
4 und 8, vorzugsweise bei pH 5.0 bis 6.0 das sulfitolytische Mittel
(z.B. das Na2S3O5 oder Na3SO3) und gewünschtenfalls ein Schwermetall-Salz
(z.B. CuSO.) zugesetzt und dabei eine Temperatur zwischen
5 und 500C eingehalten.
Der pH-Wert des Reaktionsgemisches kann während der Reaktion von seinem Ausgangswert abweichen, ohne daß dies nachteilige Folgen hat.
Nach der Umsetzung mit den sulfolytischen Angentien kann die Weiterreinigung
des Immunglobulins auf üblichem Wege unmittelbar fortgeführt werden.
Vor allem hat sich die Einbeziehung einer Adsorption an ein in Wasser
schwer lösliches Phosphat in die Verfahrensschritte der Weiterreinigung
bewährt, da derart behandelte Endprodukte der Immunglobulinreinigung eine verringerte Komplementbindung aufweisen.
So kann z.B. in der Lösung in situ Aluminiumphosphat aus AlCl3 und
Na3PO^ hergestellt werden. Daran können neben Verunreinigungen
auch komplementbindende Aggregate tl'is Immunglobulins an das Aluminiumphosphat
gebunden werden. Auch Calciumphosphat ist zur Entfernung von Verunreinigungen und komplementbindenden Substanzen einsetzbar.
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5-90 Stunden nach Zusatz der sulfitolytischen Antentien können
die Immunglobuline beispielsweise mit Äthanol in an sich bekannter
Weise ausgefällt V7erden. Eine Reinigung ist auch über Ionenaustauscher durchführbar. Wenn Kationenaustauscher bei einem schwach
sauren pH-Wert eingesetzt werden, werden die Immunglobuline besonders rein erhalten. Restliche Cu-Gehalte können durch Metall-Chelat-bildende
Verbindungen, auch in Form von Ionenaustauschern, entfernt werden.
Die danach erhältlichen Immunglobulinpräparationen sind aufgrund
der vorgenommenen partiellen Sulfitolyse hinsichtlich der Komplementbindungskapazität
schwächer komplementbindend als das Ausgangsmaterial. Dieser Effekt kann gewünschtenfalls durch die Adsorption
von komplementbindender Aktivität weiter abgeschwächt werden.
Unabhängig von gleichzeitig erwünschten Reinigungserfolgen werden besonders gute Ergebnisse hinsichtlich der verringerten Korr.plementbindung
erreicht, wenn Imnmnglobulinfraktionen mit einem in Wasser schwer löslichen Phosphat behandelt werden. Bevorzugt wird hierfür
Aluminiumphosphat oder Calciumphosphat eingesetzt.
Hierfür sind Mengen von 0,005 bis 0,1 M/l günstig. Die Adsorbentien
werden zweckmäßig durch Zugabe eines wasserlöslichen Kations und eines wasserlöslichen Phosphates von denen bekannt ist, daß
sie schwer lösliche Phosphate miteinander zu bilden vermögen, in der Immunglobulinlösung selbst hei-gestellt. Zweckmäßig wird hierfür
der pH-Wert zwischen 4 und 8,5 gehalten, wobei man für die Adsorption von Komplement-bindender Aktivität mit Hilfe von AlPO.
pH-Werte zwischen 4 und 6 bevorzugt, für Erdalkaliphosphate, wie Calciumphosphat, pH-Werte zwischen 5,8 und 8,5. Gängige wasserlösliche
Kationen, welche mit Phosphationen schwer lösliche Niederschläge zu bilden vermögen, sind Aluminium bevorzugt als AlCl., oder
(Al)2(SO4J3, ferner unter den wasserlöslichen Erdalkalisalzen insbesondere
wasserlösliche Calciumsalze, wie Calciumacetat. Für die Bildung des Adsorptionsmittels in der Immunglobulinlösung wird zweck-
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mäßig mit einem geringen Überschuß der kationischen Komponente gearbeitet.
Wird nun die Sulfitolyse mit einem Adsorptionsschritt im Sinne der
vorstehenden Ausführungen kombiniert, kann die Komplementbindung der Immunglobulinpräparationen auf besonders niedrige Werte, häufig
nahe 0, gebracht werden. Jeder Schritt ist jedoch für sich geeignet, die Komplementbindung der Immunglobulinpräparationen herabzusetzen.
Da das Ziel des Verfahrens darin besteht, die Komplementbindung zu verringern, werden die Verfahrensschritte möglichst so aufeinander
abgestimmt, daß die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlichen
Produkte dieser Forderung entsprechen.
Es entspricht dem Erfindungsgedanken, wenn das Verfahren unter Bedingungen
durchgeführt wird, die der Fachmann als in dieser Hinsicht besonders geeignet erkennt. Das heißt, daß eine Kombination
von hohen Konzentrationen der sulfitolytischen Agentien im Verhältnis
zu niedriger Proteinkonzentration, einer niedrigen Temperatur und einer kurzen Reaktionszeit im beschriebenen Rahmen zuzuordnen
sind und umgekehrt.
Die Bestimmung der ancikornplementären Wirkung erfolgt in einem
Hämolyse-Test mit sensibilisierten Hammelerythrozyten und Meerschweinchenserum
(Komplement). Dabei werden die Erythrozyten und das Komplement mit der Immunglobulinpräparation zur Reaktion gebracht.
Nach entsprechender Inkubationszeit läßt sich erkennen, daß die Imunglobulinpräparation auch bei hohen Konzentrationen die
Härnolyse, welche quantitativ auf photometrischem Wege bestiminbcir
ist, praktisch nicht beeinträchtigt. Weiterhin läßt sich in einem in vivo-Test am Kaninchen nachweisen, daß nach intravenöser Applikation
der erfindungsgemäßen Immunglobuiinpräparation keine Inaktiverung des Komplementfaktors C1 feststellbar ist.
In einer Reihe von erfindungsgemäß durchgeführten Präparationen
liegt die Komplementbindung insgesamt unter 10 % bezogen auf einen
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100 %-Standard. Dieser Wert wird auch nach einer Lagerung der Präparation
von etwa zwei Jahren nur unwesentlich nach oben hin verändert. Die Aggregat-Anteile der Immunglobulxnpräparationen liegen
ebenfalls unter 10 %. In einer 5 %igen Proteinlösung sind bei Verwendung von CuSO, größenordnungsmäßig «ς1 ug/ml Kupfer-II-Ionen
nachweisbar.
Die an Antxkomplementaktivität verringerte neue Gammaglobuiinpräparation
enthält im wesentlichen unverändertes 7 S-Immunglobulin
im Vergleich zu den modifizierten Präparationen nach dem Stand
der Technik mit z.T. niedrigeren Sedimentationswerten. Die Antikörperaktivität des Moleküls bleibt erhalten.
Die erfindungsgeniäß herstellbaren Immunglobulxnpräparationen sind
in erster Linie für die intravenöse Applikation gedacht. Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch ein intravenös applizierbares
Arzneimittel, enthaltend die erfindungsgemäß hergestellten Immunglobulxnpräparationen
in einer geeigneten galenischen Zubereitung. Die schwach sulfitolytisch behandelten und anschließenden wie beschrieben
gereinigten Immunglobuline können nach üblicher Sterilfiltration
zum Verbrauch in einer beliebigen Menge abgefüllt werden. Wenn vorgesehen ist, die Präparation als 5 bis 16 %ige Proteinlösung
anzuwenden, ist eine entsprechende Einstellung der gereinigten und sterilfiltrieren Lösung ohne weiteres möglich. Eine 0,3 0,9
% Neutralsalz enthaltende Lösung, der gewünschtenfalls noch physiologisch verträgliche Zuschläge, z.B. eine Alpha-Aminosäure
wie Glycin in 1,5 - 2,5 % zugegeben werden, läßt sich gefriertrocknen, als gefriergetrocknetes Produkt aufbewahren und vor der
Verwendung durch Zufügen der gewünschten Menge von destilliertem Wasser als Lösung rekonstituieren. Auch diese Lösung zeigt keine
erhöhte Komplementbindung. Das rekonstituierte Mittel ist gleicherweise intravenös applizierbar.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Besipielen näher erläutert:
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Die bei der Albuminfraktionierung nach Cohn mit Hilfe von Äthanol
anfallende Gammaglobulinfraktion wird in einer 0,3 %igen Kochsalzlösung
gelöst, wobei für 1 kg der Gammaglobulinpaste 10 Liter Kochsalzlösung verwendet werden. Die Temperatur wird bei etwa 50C
gehalten. Man fügt zu der Lösung 0,07 % (g/vol) Na„S?Or in Form
einer 10 %igen Natriumdisulfitlösung und 0,007 % (g/vol) CuSO. χ
5 H~O in Form einer 1 %igen Kupfersulfatiösung zu. Nach erfolgter
Zugabe werden pro Liter Lösung 200 ml einer 0,2 molaren AlCl .ς-und
200 ml einer 0,2 molaren Na^PO.-Lösung zugefügt. Die Zugabe erfolgt
unter pH-Kontrolle, die einen pH-Wert von etwa 5 gewährleisten soll. Die Lösung wird über Nach bei 50G gerührt. Das Aluminiumphosphat-Adsorbens
wird sodann durch Zentrifugation abgetrennt.
Die die Immunglobuline enthaltende Lösung wird durch Zugabe von 25 % (vol/vol) Äthanol ausgefällt. Das Präzipitat \vird durch Zentrifugation
gewonnen. Es wird in einer ausreichenden Menge destilliertem Wasser gelöst, 0,2 % Äthylendiamintetraessigsäure zugegeben
und der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Durch Zusatz von 25 % Äthanol werden die Immunglobuline erneut präzipitiert, zentrifugiert,
der Niederschlag wird in einer ausreichenden Menge 0,85 %-iger Kochsalzlösung aufgelöst. Zu dieser Lösung v/erden 2,5 % (g/V)
Glycin gegeben.
Danach wird die Präparation lyophilisiert.
Danach wird die Präparation lyophilisiert.
Die Endfertigung für das intravenöse applizierbare Immunglobulin
kann in folgender Weise vorgenommen werden: Das Lyophilisat wird in destilliertem, Wasser aufgelöst, auf einen Proteingehalt von
5 % gebracht, in Endbehälter abgefüllt und erneut lyophilisiert.
Die bei der Albuminfraktionierung nach Cohn mit Hilfe von Äthanol anfallende Gammaglobulinfraktion wird1einer 0,3 %igen Kochsalzlösung
gelöst, wobei für 1 kg Gammaglobulinpaste 10 Liter Kochsalz-
lösung verwendet werden. Die Temperatur wird bei etwa 50C gehalten.
Man fügt zu der Lösung 0,2 % (g/vol) Na2S2O1. in Form einer 10 %igen
Natriumdisulfitlösung und anschließend 0,Q2 % (g/vol) CuSO- χ
5 H„0 in Form einer 1 %igen Kupfersulfatlösung zu. Nach Beendigung
der Zusätze werden pro Liter Lösung T20 ml einer 1 molaren Calcium-Acetatlösung
und 120 ml einer 1/3 molaren sekundären Natriumphosphatlösung unter Rühren zugegeben. Der pH-Wert wird auf 8-0,1
mit 0,1 M Natronlauge gehalten. Der Ansatz wird 20 Stunden bei 5°C
gerührt. Nach dieser Zeit wird das gebildete Calciumphosphat durch
Filtration abgetrennt und die filtrierte Immunglobulinlösung gewonnen.
Die weitere Aufarbeitung der Immunglobuline kannentsprechend- Beispiel
1 durchgeführt werden.
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Claims (14)
1. Verfahren zur Herstellung von Titimunglobulinpräparationen mit
verminderter Kompiementaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß
eine Immunglobulinfraktion mit einer niedrigen Konzentration
eines sulfitolytischen Agens und/oder einem in Wasser schwer löslichen Phosphat behandelt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
_2
Immunglobulinfraktion mit> 0 aber <.5 * 10 M/l eines sulfitolytischen
Agens behandelt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, α3αμ^1ι gekennzeichnet, daß
als sulfitolytisches Agens Dilsufit verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Sulfitolyse in Gegenwart von Schwermetallionen
durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet,
daß die Schwermetallionen in einer Konzentration von τ 0 aber
έ 5 · 10 M/l eingesetzt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Schwermetallionen Kupfer-II-Ionen verwendet werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunglobulinfraktion neben Immunglobulinen etwa 2 0 - 60 %
andere Plasmaproteine enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine
Immunglobulinfraktion bestehend aus 40 - 80 % Immunglobulin und
20 - 60 % anderen Plasmaproteinen in einer Konzentration von 1 - 5 % Protein, 5-90 Stunden, mit 2 - 4 · 10~3 M/l Na15S9O1-
und 2-4 · 10 M/l CuSO4, bei pH 5 bis 8 behandelt und danach,
gegebenenfalls unter Anreicherung und Reinigung der Immunglobuline,
die Proteine abtrennt.
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9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 7, dadurch gekennzeichnet,
daß die Immunglobulxnfraktion mit 0,005 bis 0,15 M/l eines in der Immunglobulinlösung hergestellten, in Wasser schwer löslichen
Phosphates behandelt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das in Wasser schwer lösliche Phosphat Aluminiumphosphat ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das in Wasser schwer lösliche Phosphat Calciumphosphat ist.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine sulfitolytisch behandelte Imrnunglobulinfraktion mit einem in
Wasser schwer löslichen Phosphat behandelt wird.
13. Iiiununglobulinpräparation, gekennzeichnet durch Parameter eines
Produktes, erhältlich nach einem der Ansprüche 1 - 12.
14. Intravenös applizierbares Arzneimittel enthaltend eine Iiiununglobulinpräparation
nach Anspruch 13 in einer geeigneten galenische Zubereitung.
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