DE2936047A1 - Verfahren zur herstellung eines intravenoes verabreichbaren antikoerperhaeltigen immunglobulinpraeparates und danach hergestellte praeparate - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines intravenoes verabreichbaren antikoerperhaeltigen immunglobulinpraeparates und danach hergestellte praeparate

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DE2936047A1 DE19792936047 DE2936047A DE2936047A1 DE 2936047 A1 DE2936047 A1 DE 2936047A1 DE 19792936047 DE19792936047 DE 19792936047 DE 2936047 A DE2936047 A DE 2936047A DE 2936047 A1 DE2936047 A1 DE 2936047A1
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Description

Inununo Aktiengesellschaft für chemisch-medizinische Produkte Wien, Österreich
Verfahren zur Herstellung eines intravenös verabreichbaren antikörperhältigen Immunglobulinpraparates und danach hergestellte Präparate
030013/0725
Verfahren zur Herstellung eines intravenös verabreichbaren antikörperhältigen Immunglobulinpräparates und danach hergestellte Präparate
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines intravenös verabreichbaren antikörperhältigen Immunglobulinpräparates, wobei menschliches Blutplasma fraktioniert und eine immunglobulinhältige Fraktion durch ein- oder mehrmalige Fällung mit Polyäthylenglykol von unerwünschten Proteinverunreinigungen befreit wird, sowie nach diesem Verfahren hergestellte Präparate.
Nach überstehen einer Infektion ist der menschliche Organismus im allgemeinen gegen eine Zweitinfektion mit demselben Erreger geschützt. Ein solcher Schutz kann auch durch Impfungen erzielt werden; er basiert auf Ausbildung zellulärer und humoraler Immunität. Während die zelluläre Immunität von Lymphozyten getragen wird, sind für die humorale Immunität verschiedene spezifische Antikörper verantwortlich. Antikörper sind hochmolekulare Eiweißstoffe mit Globulincharakter, die im Blut auftreten. Die volle Ausbildung der humoralen Immunität kann die ersten zwei LebensJahrzehnte in Anspruch nehmen und ist besonders in der Zeit zwischen dem 6. und dem 24. Lebensmonat am schwächsten. Seit längerer Zei ist bekannt (1952 Bruton), daß Antikörper bei bestimmten Patienten fehlen können (Antikörpermangelsyndrom), wobei es sich meistens um eine Erkrankung mit familiärer Häufung handelt. Solche Patien-
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ten leiden an verschiedenen, häufig wiederkehrenden Infektionen, die mitunter lebensbedrohende Ausmaße annehmen. Ähnliche Antikörpermangelzustände können nicht nur genetisch auftreten, sondern können auch erworben werden und treten meist als selektives oder partielles Antikörpermangel syndrom (AMS) auf.
Da solche Patienten die ihnen fehlenden Antikörper nicht bilden können, müssen ihnen diese zur Behandlung oder Verhinderung von Infektionen in genügendem Ausmaß zugeführt werden. Die Wirkung einer solchen Substitution ist zeitlich begrenzt und die Wirkungsdauer hängt von der biologischen Halbwertszeit der zugeführten Antikörper ab. Die im Organismus gebildeten Antikörper haben eine biologische Halbwertszeit von drei bis vier Wochen.
Es ist bekannt, antikörperhältige Immunglobuline u.a. durch Fraktionieren von menschlichem Blutplasma nach der sogenannten Cohn-Methode (J.L. Oncley, M. Melin, D.A. Richert, J.W. Cameron und P.M. Gross, Jr. "The Separation of the Antibodies, Isoagglutinins, Prothrombin, Plasminogen and β --Lipoprotein into Subfractions of Human Plasma", J.Am. Chem. Soc, Band 71, S 541 (1949)) durch Alkoholfällung herzustellen. Diese Präparate sind zwar für Intramuskulär-Applikationen, aber nicht für Intravenös-Applikationen geeignet, denn während des Herstellungsverfahrens entstehen Nebenprodukte, die nachteilige Eigenschaften aufweisen. Sie führen, wenn sie intravenös injiziert werden, manchmal schon während der Injektion zu zwar kurz dauernden, aber sehr starken Unverträglichkeitsreaktionen, wie z.B. Blutdrucksenkung, die lebensbedrohende Zustände hervorrufen können. Um intravenös injizierbare verträgliche Immunglobuline zu erhalten,hat man bisher Immunglobuline enzymatisch abgebaut oder chemisch verändert.Dadurch wurde allerdings die therapeutische Wirkung bzw. biologische Qualität der Immunglobulinpräparate nachteilig beeinflußt. Nicht nur,
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daß die Immunglobulinmoleküle durch die enzymatische Behandlung verkleinert wurden und dadurch die Qualität der Antikörper vermindert wurden, hemmen kompetitiv die dabei auftretenden Spaltprodukte auch die zu erzielende rj Antiyen/Antikörperreaktion und/oder die Bindung der Äntigen/Antikörper-Komplexe an Fc-Rezeptoren. Ein anderer Nachteil solcher veränderten Immunglobuline ist eine verkürzte bilogische Halbwertszeit.
Ein weiterer Nachteil bei chemisch veränderten Immunglobulinen ist das Auftreten neuer antigener Spezifitäten, die bei wiederholter Gabe unter Umständen zu zusätzlichen Unverträglichkeitsreaktionen führen können.
Ein weiteres zum Stand der Technik gehörendes Verfahren (DE-OS 26 06 118), nach welchem die Herstellung von für intravenöse Injektion geeignetes Gammaglobulin angestrebt wurde, umfaßt eine stufenweise Reinigung einer Plasmaproteinsuspension mit Po.lyäthylenglykol und eine VoIlfällung mit Polyäthylenglykol. Die Polyäthylenglykol-Reinigungsstufen werden bei einer möglichst niedrigen Ionenkonzentration durchgeführt, was zur Vermeidung einer Denaturierung der Proteine als wesentlich angesehen wurde. Die Durchführung der Fraktionierung bei extrem niedriger Ionenkonzentration ist jedoch, wie festgestellt wurde, aufwendig und die hergestellten Produkte sind nicht frei von Unverträglichkeitserscheinungen.
Schließlich gehört noch ein Verfahren zum Stand der Technik (AT-PS 344 883), gemäß welchem zur Intravenösapplikation bestimmte Ganunaylobulinpräparate aus einer Plasmafraktion nach Ausfällen des antikomplementären Gammaglobulinanteiles mit PEG (ΓDlyäthylenglykol) in Anwesenheit von Hydroxyäthylstärke gewonnen werden; doch hat sich ebenfalls gezeigt, daß eine solche Reinigung noch nicht ausreichend ist, um das fertige Präparat ohne
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Nebenreaktionen intravenös anwenden zu können.
Die Erfindung bezweckt die Vermeidung der geschilderten Nachteile und stellt sich die Aufgabe, ein intravenös verabreichbares Immunglobulinpräparat zu schaffen, welches weder enzymatisch abgebaut noch chemisch verändert ist und welches in hohen Dosen ohne Nebenreaktionen intravenös appliziert werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einem Verfahren der eingangs bezeichneten Art dadurch gelöst, daß die immunglobulinhältige Fraktion in einer ersten Reinigungsstufe vor der Polyäthylenglykolfallung einer Behandlung mit einer wässerigen Lösung eines Salzes einer mehrwertigen anorganischen Säure, insbesondere von Ammoniumsulfat, unterworfen wird und daß mindestens eine der folgenden Reinigungsstufen mit Polyäthylenglykol in Anwesenheit eines löslichen Kohlehydrats oder eines nicht proteinfällenden Polyols, d.i. eines Polyols mit mindestens drei Hydroxyl-^ gruppen, durchgeführt wird, worauf das von Proteinverunreinigungen befreite Immunglobulin aus der verbleibenden Lösung durch wasserlösliche Polymere ausgefällt und sodann in bekannter Weise zum pharmazeutischen Präparat fertiggestellt wird.
Zweckmäßig wird die immunglobulinhältige Fraktion aus menschlichem Blutplasma gemäß der bekannten Cohn-Methode bzw. einer modifizierten Cohn-Methode durch Fällung mit Äthanol gewonnen und das in der Fraktion enthaltene Äthanol· entfernt, u.zw. vorzugsweise durch Dialyse.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden drei Reinigungsstufen angewendet, wobei man im einzelnen derart vorgeht, daß die immunglobulinhältige Fraktion in einer ersten Reinigungsstufe einer Behandlung mit einer Ammoniumsulfatlösung mit einem
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Gehalt von 145 bis 208 g/l (25 bis 35 % AMS-Sättigung) bei einem pH-Wert von 5,9 bis 6,5 unterworfen wird; der Niederschlag abgetrennt und verworfen wird und in einer folgenden Fällungsstufe aus der verbleibenden Lösung durch Behandlung mit einer Ammoniumsulfatlösung mit einem Gehalt von 268 bis 289 g/l (44 bis 47 % AMS-Sättigung) bei einem pH-Wert von 8,0 ein Immunglobulin enthaltender Niederschlag ausgefällt wird; der Niederschlag gewonnen, in Wasser gelöst und Ammoniumsulfat aus der Lösung, vorzugsweise durch Dialyse, entfernt wird; daß sodann diese verbleibende immunglobulinhältige Lösung in einer zweiten Reinigungsstufe in Gegenwart eines Saccharids, Polysaccharids oder Polysaccharidhydrolysates und einer Ionenstärke von mindestens 0,15 einer Behandlung mit Polyäthylenglykol bei einem pH-Wert von 5,8 bis 6,4 unterworfen wird; der entstandene Niederschlag abgetrennt und verworfen und die verbleibende Lösung in einer dritten Reinigungsstufe einer nochmaligen Behandlung mit Polyäthylenglykol bei einem pH-Wert von 6,4 bis 7,0 unterworfen wird, worauf der neuerlieh entstandene Niederschlag abgetrennt und verworfen wird, und das nunmehr frei von schädlichen Verunreinigungen in der verbleibenden Lösung enthaltene Immunglobulin bei einem pH-Wert von 7,0 bis 7,5 durch ein polymeres Fällungsmittel ausgefällt und zum pharmazeutischen Präparat fertig- gestellt wird.
In dieser Maßnahmenkombination kann in der zweiten Reinigungsstufe Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 2000 bis 6000 in einer Menge von 60 bis 90 g/l bei einer Temperatur von 0 bis 40 C als Fällungsmittel eingesetzt werden. Auch in der dritten Reinigungsstufe kann Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 2000 bis 6000 als Fällungsmittel verwendet werden, u.zw. zweckmäßig in einer Menge von 70 bis 100 g/l, ebenfalls bei einer Temperatur
von 0 bis 40° C.
Von den löslichen Kohlehydraten bzw. Polyolen haben sich im
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besonderen Saccharide als geeignet erwiesen, u.zw. Monosaccharide, wie Glucose, Fructose, Mannose, Galaktose, oder Disaccharide, wie Saccharose, Lactose, Maltose, oder Oligo- bzw. Polysaccharide, u.zw. in einer Menge von 1 bis 35 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 20 Gew.-%, bezogen auf die Lösung. Sobald die Reinigung der Immunglobuline in der beschriebenen Weise erfolgt ist, können diese aus der Lösung gewonnen werden, u.zw. durch Fällung mit wasserlöslichen Polymeren. Als solche haben sich Copolymere von Äthylenoxyd und Polyoxypropylen (Handelsbezeichnung der BASF "PLURONIC"), weiters Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon u.dgl. bewährt. Es kann auch Polyäthylenglykol als Fällungsmittel für das reine Immunglobulin verwendet werden, indem man die Konzentration des Polyäthylenglykols in der verbleibenden Lösung erhöht, u.zw. auf mehr als 150 g/l. Das ausgefällte Immunglobulin wird sodann zum pharmazeutischen Präparat aufgearbeitet, wobei bekannte Maßnahmen zur Anwendung kommen können.
Vorteilhaft erfolgt die Fertigstellung des gereinigten Immunglobulins zum pharmazeutischen Präparat durch Lösen in pyrogenfreiem Wasser, weitere Dialyse, Ultrafiltration oder Gelfiltration, Einstellung der Immunglobulin-Konzentration auf 5 bis 200 g/l, vorzugsweise 50 bis 160 g/l, und Stellung der Ionenstärke mittels NaCl auf 0,005 bis 0,3, vorzugsweise 0,1 bis 0,2.
Die im Endprodukt enthaltenen Plasmaproteine bestehen mindestens zu 80 % aus nativen Immunglobulinen mit einer Sedimentationskonstante S von 7,0 und einer biologischen Halbwertszeit von 21 bis 28 Tagen. Die antikomplementäre Aktivität des Produktes entspricht einem Wert, wonach mindestens 35 mg Protein zur Neutralisation einer Einheit C1H1- benötigt werden. Weiters sind die erfindungsgemäß hergestellten Präparate dadurch gekennzeichnet, daß sie weniger als 5 % von Proteinkomponenten mit einem Molekular-
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gewicht von mehr als 160.000 enthalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch folgende Beispiele näher erläutert:
5
Beispiel 1: Menschliches Blutplasma wird auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,2 gestellt und auf einer Temperatur von -2 C gehalten. Der Lösung werden 8 Gew.-% Äthanol zugesetzt, wobei ein Niederschlag, der im wesentlichen Fibrinogen enthält, ausfällt. Nach Abtrennen dieses Niederschlages wird die Äthanolkonzentration auf 25 Gew.-% erhöht und die Temperatur auf -6°C abgesenkt. Der ausfallende Niederschlag, der im wesentlichen aus rohem Immunglobulin besteht, wird in einem Phosphat-Acetat-Puffer extrahiert und mit 12 Gew.-% Äthanol bei einem pH-Wert von 5,3 bei -2°C versetzt. Der Niederschlag (der Alpha- und Beta-Globulin enthält) wird verworfen und die Äthanol-Konzentration des Überstandes bei einem pH-Wert von 7,2 und einer Temperatur von -10 C auf 25 Gew.-% erhöht, wodurch das Immunglobulin ausgefällt wird. Die so hergestellte gesammelte pastenförmige Immun-Globulinfraktion wird erfindungsgemäß in folgender Weise weiterbehandelt:
1 kg der Immun-Globulinpaste wird in 2 1 einer 0,9 % NaCl-Lösung unter Rühren gelöst und dialysiert. Danach wird die Proteinkonzentration auf 20 g/l sowie die Ionenstärke auf 0,15 gestellt, und bei einem pH-Wert von 6,25 werden 176 g/l Ammoniumsulfat zugesetzt (erste Reinigungsstufe), worauf der entstandene unerwünschte Verunreinigungen enthaltende Niederschlag verworfen und dem Überstand weiteres Ammoniumsulfat bis zur Erreichung einer Konzentration von 275 g/l zugegeben und der pH-Wert auf 7,2 gestellt wird. Der ausfallende immunglobulinhältige Niederschlag wird in Wasser gelöst und einer Dialyse gegen Leitungswasser unterworfen. Sodann werden der Lösung 80 g/l Polyäthylenglykol in Anwesenheit von 150 g Glucose/1 bei einem pH-Wert von 6,0
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und einer Ionenstärke von 0,15 zugefügt (zweite Reinigungsstufe) . Der Niederschlag wird verworfen, und es wird bei einem pH-Wert von 6,5 bis 6,6 die Polyäthylenglykol-Konzentration auf 95 g/l erhöht. Der neuerlich ausfallende Niederschlag wird verworfen (dritte Reinigungsstufe).
Nun wird der Gehalt der Lösung an Polyäthylenglykol bei einem pH-Wert von 7,2 auf 180 g/l erhöht, wodurch das von Verunreinigungen freie Immunglobulin ausgefällt wird. Das Produkt wird zentrifugiert, und durch fünfmaliges Waschen wird das noch vorhandene Polyäthylenglykol entfernt.
Beispiel 2: 1 kg Immun-Globulinpaste wird in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen und behandelt, jedoch wird in der zweiten Reinigungsstufe statt Glucose Fructose in einer Menge von 150 g/l zugesetzt.
Beispiel 3: 1 kg Immun-Globulinpaste wird in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen und behandelt, jedoch wird in der zweiten Reinigungsstufe statt Glucose Saccharose in einer Menge von 150 g/l zugesetzt.
Beispiel 4: 0,5 kg Immun-Globulinpaste, welche in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, aus menschlichem Blutplasma gewonnen wurde, wird in 6 1 0,9 %-iger NaCl-Lösung unter Rühren gelöst und Äthanol durch Ultrafiltration aus der Lösung entfernt. Die Proteinkonzentration der verbleibenden Lösung wird auf 20 g/l und die Ionenstärke auf 0,15 gestellt, worauf bei einem pH-Wert von 6,7 119,5 g/l Dinatriumhydrogenphosphat zugesetzt werden (Reinigungsstufe) . Der ausfallende Niederschlag wird verworfen und der Überstand mittels Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,2 gestellt, wobei neuerlich ein Niederschlag gebildet wird, der abermals verworfen wird (Reinigungsstufe). Danach werden der Lösung 275 g/l Ammoniumsulfat zugesetzt. Der ausfallende, immunglobulinhältige Nieder-
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schlag wird in Wasser gelöst und zur Entfernung der anorganischen Salze dialysiert. Zu der Lösung werden 87,5 g/l Polyäthylenglykol und 150 g/l Glucose zugefügt und der pH-Wert auf 6,0 gestellt. Der Niederschlag wird verworfen (Reinigungsstufe), der pH-Wert der verbleibenden Löaing auf 6,6 erhöht und durch weitere Zugabe von Polyäthylenglykol die Konzentration der Lösung auf 95 g PoIyäthylenglykol/1 erhöht. Der neuerlich ausfallende Niederschlag wird verworfen (Reinigungsstufe). Nun wird der Gehalt der Lösung an Polyäthylenglykol bei einem pH-Wert von 7,2 auf 150 g/l erhöht, wodurch das von Verunreinigungen freie Immunglobulin ausgefällt wird. Das Produkt wird wie in Beispiel 1 zentrifugiert, und durch Waschen wird das vorhandene Polyäthylenglykol entfernt.
Beispiel 5: 1 kg Immunglobulin wird in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen und behandelt, jedoch wird die Endausfällung des von Verunreinigungen freien Immunglobulins durch Zugabe von 38 g/l Pluronic F 68 (ein Copolymeres von Äthylenoxid mit Polyoxypropylen) vorgenommen, wobei ebenfalls ein pH-Wert von 7,2 eingehalten wird.
In der folgenden Tabelle I ist die antikomplementäre Aktivität des nach den Beispielen 1 bis 5 hergestellten Immunglobulins angeführt, wobei die Werte nach E.A. Kabat und M.M. Mayer "Experimental Immunochemistry" (Thomas, Springfield 1961) bzw. Public Health Monograph Nr. 74: Standardized diagnostic complement fixation method and adaptation to microtest (Washington, 1965) bestimmt wurden.
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Tabelle I
Immunglobulin her- Antikomplementäre
gestellt nach Aktivität 5
Beispiel 1 96 mg
Beispiel 2 95 mg
Beispiel 3 101 mg
Beispiel 4 35 mg
Beispiel 5 104 mg
Die nach den Beispielen 1 bis 5 hergestellten Präparate enthielten zu einem Anteil von mehr als 80 % die in der Tabelle II angegebenen 7 S-Komponenten. Die Bestimmung erfolgte in einer analytischen Ultrazentrifuge, gemäß dem Europäischen Arzneibuch, Band II, Deutscher Apotheker Verlag, Stuttgart 1975, wobei eine einprozentige Lösung (V/V) in Phosphat-Pufferlösung pH 6,0 bis 8,0 und der Ionenstärke von mindestens 0,2 der Bestimmung unterworfen wird.
Tabelle II
Immunglobulin her- 7 S-Komponenten
gestellt nach
Beispiel 1 95,5
Beispiel 2 95,5
Beispiel 3 98,4
Beispiel 4 88,0
Beispiel 5 98,2
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In einer weiteren Bestimmung wurden die nach den Beispielen 1 bis 5 erhaltenen Immunglobuline nach der Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese ^SDS-PAGE, K. Weber und M. Osborn, J. Biol. Chem. 2_44 , 4406 (19691/ untersucht, wobei eine Auffächerung der erhaltenen Proteine nach ihrem Molekulargewicht erhalten wird. Bei den nach den Beispielen 1 bis 5 erfindungsgemäß erhaltenen Immunglobulinen (Proben 1 bis 5) ergaben sich die aus dem beiliegenden Diagramm ersichtlichen Breitenbanden bei MoIekulargewichten von 150.000.
Demgegenüber ist die Probe 6 ein mit Pepsin enzymatisch abgebautes Präparat und die Probe 7 ein mit Plasmin enzymatisch abgebautes Präparat, bei denen die Breitenbanden bei niedrigeren Molekulargewichten von 105.000 bzw. 50.000 liegen. Die Probe 8 zeigt die Molekulargewichtsverteilung in einem chemisch veränderten Präparat, wobei beträchtlich hohe Molekularanteile über 160.000 vorhanden sind und auch Anteile bei niedrigeren Molekulargewichten von etwa 50.000 vorhanden sind.
Die erfindungsgemäß hergestellten Präparate wurden in bezug auf ihre blutdruckbeeinflussende Wirkung mit einem bekannten, nach der Cohnmethode hergestellten blutdruckaktiven Präparat verglichen. Die Vergleichsversuche wurden an narkotisierten Hunden durchgeführt. Dabei wurde die Vena jugularis externa der Hunde am unteren Rand des Unterkiefers präpariert und in beide Venenäste Katheter eingebunden. Weiters wurde die Arteria carotis freipräpariert und ein Katheter eingebunden. Der Blutdruck wurde über den arteriellen Katheter elektromanometrisch gemessen; über die beiden anderen Katheter wurden das Narkotikum und die zu vergleichenden Immunglobulinpraparate unter Konstanthaltung des Injektionsvolumens eingeführt. Die Blutdruckwerte wurden während 60 Minuten nach Zuführung der Testsubstanzen kontrolliert, wobei jeweils die systolischen und diastolischen Blutdruckwerte festgestellt wurden und
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ein Mittelwert aufgezeichnet wurde. Die verabreichten Dosen betrugen jeweils 150 mg/kg. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle veranschaulicht:
Blutdruck in mm/Hg (Mittelwerte) zu nach nach nach nach nach Beginn 5 min 10 min 20 min 30 min , 60 min erfindungsgemäß herge- 100 94 100 100 98 stelltes Präparat
bekanntes 100 43 58 58 70 Präparat
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Claims (10)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines intravenös verabreichbaren antikörperhältigen Immunglobulinpräparates, wobei menschliches Blutplasma fraktioniert und eine immunglobulinhältige Fraktion durch ein- oder mehrmalige Fällung mit Polyäthylenglykol von unerwünschten Proteinverunreinigungen befreit wird, dadurch gekennzeichnet, daß die immunglobulinhältige Fraktion in einer ersten Reinigungsstufe vor der Polyäthylenglykolfällung einer Behandlung mit einer wässerigen Lösung eines Salzes einer mehrwertigen anorganischen Säure, insbesondere von Ammoniumsulfat, unterworfen wird und daß mindestens eine der folgenden Reinigungsstufen mit Polyäthylenglykol in Anwesenheit eines löslichen Kohlehydrats oder eines nicht proteinfällenden Polyols, d.i. eines Polyols mit mindestens drei Hydroxylgruppen, durchgeführt wird, worauf das von Proteinverunreinigungen befreite Immunglobulin aus der verbleibenden Lösung durch wasserlösliche Polymere ausgefällt und sodann in bekannter Weise zum pharmazeutischen Präparat fertiggestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
5 die immunglobulinhältige Fraktion aus menschlichem Blutplasma gemäß der Cohn-Methode durch Fällung mit Äthanol gewonnen und das in der Fraktion enthaltene Äthanol vor der stufenweisen Behandlung mit Fällungsmitteln entfernt wird, u.zw. vorzugsweise durch Dialyse.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunglobulinhältige Fraktion in einer ersten Reinigungsstufe einer Behandlung mit einer Ammoniumsulfatlösung mit einem Gehalt von 145 bis 208 g/l bei einem pH-Wert von 5,9 bis 6,5 unterworfen wird, der Niederschlag abgetrennt und verworfen wird und in einer
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folgenden Fällungsstufe aus der verbleibenden Lösung durch Behandlung mit einer Airanoniumsulfatlösung mit einem Gehalt von 268 bis 289 g/l bei einem pH-Wert von 8,0 ein Immunglobulin enthaltender Niederschlag ausgefällt wird; der Niederschlag gewonnen, in Wasser gelöst und Ammoniumsulfat aus der Lösung, vorzugsweise durch Dialyse, entfernt wird; daß sodann diese verbleibende immunglobulinhältige Lösung in einer zweiten Reinigungsstufe in Gegenwart eines Saccharids, Polysaccharids oder Polysaccharidhydrolysates und bei einer Ionenstärke von mindestens 0,15 einer Behandlung mit Polyäthylenglykol bei einem pH-Wert von 5,8 bis .6,4 unterworfen wird; der entstandene Niederschlag abgetrennt und verworfen und die verbleibende Lösung in einer dritten Reinigungsstufe einer nochmaligen Behandlung mit Polyäthylenglykol bei einem pH-Wert von 6,4 bis 7,0 unterworfen wird, worauf der neuerlich entstandene Niederschlag abgetrennt und verworfen wird und das nunmehr frei von schädlichen Verunreinigungen in der verbleibenden Lösung enthaltene Immunglobulin bei einem pH-Wert von 7,0 bis 7,5 durch ein polymeres Fällungsmittel ausgefällt und zum pharmazeutischen Präparat fertiggestellt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in der zweiten Reinigungsstufe Polyäthylenglykol 200O bis 6000 in einer Menge von 60 bis 90 g/l bei einer Temperatur von 0 bis 40° C verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in der dritten Reinigungsstufe Polyäthylenglykol 2000 bis 6000 in einer Menge von 70 bis 100 g/l bei einer Temperatur von 0 bis 40 C verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Saccaride Monosaccharide, wie Glucose, Fructose,
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Mannose, Galaktose, oder Disaccharide, wie Saccharose, Lactose, Maltose, oder Oligo- bzw. Polysaccharide in einer Menge von 1 bis 35 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 20 Gew.-%, verwendet werden.
5
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das von Proteinverunreinigungen befreite Immunglobulin durch Zugabe von Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyäthylenglykol u.dgl. ausgefällt wird.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Fertigstellung des gereinigten Immunglobulins zum pharmazeutischen Präparat durch Lösen in pyrogenfreiem Wasser, weitere Dialyse, Ultrafiltration oder Gelfiltration, Einstellung der Immunglobulin-Konzentration auf 5 bis 200 g/l, vorzugsweise 50 bis 160 g/l und Stellung der Ionenstärke mittels NaCl auf 0,005 bis 0,3, vorzugsweise 0,1 bis 0,2, erfolgt.
9. Intravenös verabreichbares antikörperhältes Imiriunglobulinpräparat, hergestellt nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens 80 % natives Immunglobulin mit einer Sedimentationskonstante S von 7,0 und einer biologischen Halbwertszeit von 21 bis 28 Tagen enthält und eine antikomplementäre Aktivität besitzt, entsprechend welcher mindestens 35 mg Protein zur Neutralisation einer Einheit C1Hr0 benötigt werden.
10. Präparat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es weniger als 5 % von Proteinkomponenten mit einem Molekulargewicht von mehr als 160.000 enthält.
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DE19792936047 1978-09-19 1979-09-06 Verfahren zur herstellung eines intravenoes verabreichbaren antikoerperhaeltigen immunglobulinpraeparates und danach hergestellte praeparate Granted DE2936047A1 (de)

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