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Von der Standardsubstanz werden 160 mg in 1 ml Aqua ad iniectabilia gelöst und mit isotoner NaCl-Lösung auf 16, 7 mg/ml verdünnt. Das aufgelöste Material wird innerhalb von
4 h verwendet.
Ein erfindungsgemäss verwendbares Immunglobulin-G wird mit Aqua ad iniectabilia so gelöst, dass 1 ml 165 mg Protein enthält. Das aufgelöste Material wird innerhalb von 4 h verwendet.
Die Tiere werden mit einer intravenösen Einzeldosis von 40 mg 5, 5-Diäthylbarbitursäure (Barbitural) /kg Körpermasse anästhesiert, und die Vena jugularis externa wird nach ihrer Auftei- lung am unteren Rand des Unterkiefers präpariert und ein Katheter eingebunden. Danach wird die Arterie carotis vom gleichen Hautschnitt aus freigelegt und ein Katheter eingebunden. Nach der Präparation der Arterie wird 30 min zugewartet, um stabile Ausgangswerte zu erreichen.
Über den tiefen Venenkatheter wird der zentrale Venendruck und über den seichten arteriellen
Katheter wird der arterielle Blutdruck mit Hilfe eines Drucktransducers gemessen. Über den arteriellen Katheter wird zuerst das iv. anwendbare Immunglobulin-G und dann die Standardsub- stanz injiziert.
Während der gesamten Zeit der Versuchsdurchführung wird über den Arterienkatheter der systolische und diastolische Blutdruck mit Hilfe des Drucktransducers aufgezeichnet.
Der Blutdruckmittelwert (systolisch und diastolisch) sowie der Mittelwert der Leukozytenzahl vor der Injektion der Testsubstanz und der Standardsubstanz werden bestimmt. Der maximale
Blutdruckabfall wird durch Messung des Blutdruckes über 20 min nach Injektion der Testsubstanzen bestimmt.
Die vasoaktive Wirkung von iv. anwendbarem Immunglobulin-G wird so ermittelt, dass
500 mg/kg Körpermasse Hund injiziert werden und der durchschnittliche prozentuelle systolische und diastolische Blutdruckabfall bei vier Hunden mit der blutdrucksenkenden Wirkung von im. anwendbarer Standardsubstanz verglichen wird.
Die Bestimmung der leukopenischen Wirkung wird in folgender Weise durchgeführt :
Versuchstieren (Mischlingshunden beiderlei Geschlechts) wird nach Narkotisierung die Vena jugularis und die Arterie carotis präpariert. Vor der Anästhesie wird eine Fastenzeit von minde- stens 12 h angesetzt. Pro Testsubstanz werden je vier qualifizierte Hunde benötigt, die bei intraarterieller Applizierung von standardisiertem intramuskulär anwendbarem Immunglobulin (Standardsubstanz) eine leukopenische Wirkung (Leukozytenabfall) von mindestens 50% bei einer Dosierung von 50 mg/kg Körpermasse zeigen. Hunde, die auf die Standardsubstanz keine Reaktion zeigen, können für die Vergleichstests nicht herangezogen werden.
Die Vorbereitung der Versuchstiere und der Testsubstanzen erfolgt in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben.
Zur Untersuchung der Leukozytenzahl werden Blutproben gezogen. Bei der ersten Blutprobe werden 40 il Blut mit 20 ml Isotone II (COULTER) und sechs Tropfen Zapoglobin (COULTER) versetzt und im Coulter Counter gemessen. Anschliessend werden nach 10,15, 16, 17,18 und 19 min weitere Blutproben zur Bestimmung der Leukozytenzahl gezogen. Dann werden sofort 500 mg Immunglobulin/kg Körpermasse iv. anwendbaren Immunglobulins-G innerhalb von 90 s intraarteriell injiziert. 1, 2,3, 4,5, 7,10, 15 und 20 min nach Injektion werden weitere Blutproben gezogen. Nach 20 min werden 50 mg Immunglobulin/kg Körpermasse der Standardsubstanz innerhalb von 90 s injiziert. Blutproben werden wieder nach 1, 2,3, 4,5, 7,10, 15 und 20 min gezogen.
Die maximale Senkung der Leukozytenzahl wird durch Bestimmung von Blutproben, die 1, 2,3, 4,5, 7,10, 15 und 20 min nach der Injektion der Probe gezogen werden, bestimmt.
Die leukopenische Wirkung von iv. anwendbarem Immunglobulin-G wird so ermittelt, dass 500 mg/kg Körpermasse Hund injiziert werden und der durchschnittliche prozentuelle Leukozytenabfall bei vier Hunden mit der leukopenischen Wirkung von im. anwendbarer Standardsubstanz verglichen wird.
Die Bestimmung der bronchospastischen (atemdrucksteigernden) Wirkung beim Meerschweinchen erfolgt in folgender Weise :
Versuchstieren (Meerschweinchen männlichen Geschlechts) wird nach Narkotisierung die Luftröhre im Kehlkopfbereich präpariert. Nach Intubation wird das Versuchstier mittels eines Beatmungsgerätes mit einem dem Körpergewicht des Tieres entsprechenden Atemvolumen bei einer
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Atemfrequenz von 80/min beatmet. Danach wird die Arterie carotis vom gleichen Hautschnitt aus freipräpariert. Nach intraarterieller Injektion der Testsubstanz wird der Atemdruck laufend gemessen.
Für den Test werden laborgezüchtete Meerschweinchen männlichen Geschlechts mit einem
Körpergewicht zwischen 500 und 700 g verwendet. Pro Testsubstanz werden vier qualifizierte
Meerschweinchen benötigt, die bei intraarterieller Applizierung von standardisiertem im. anwend- barem Immunglobulin (Standardsubstanz) einen Atemdruckanstieg um mindestens 30% bei einer
Dosierung von 50 mg/kg Körpermasse zeigen. Meerschweinchen, die auf die Standardsubstanz keine Reaktion zeigen, können für die Vergleichstests nicht herangezogen werden.
Von der Standardsubstanz werden 160 mg in 1 ml Aqua ad iniectabilia gelöst und mit isotoner NaCI-Lösung auf 16,7 mg/ml verdünnt. Das aufgelöste Material wird innerhalb von
4 h verwendet.
Ein iv. anwendbares Immunglobulin-G wird mit Aqua ad iniectabilia so gelöst, dass 1 ml
165 mg Protein enthält. Das aufgelöste Material wird innerhalb von 4 h verwendet.
Die Tiere werden narkotisiert ; dann wird die Luftröhre im Kehlkopfbereich präpariert, und eine Trachealkanüle wird eingebunden. Mittels eines Beatmungsgerätes wird das Versuchstier mit einem dem Körpergewicht entsprechenden Atemvolumen bei einer Atemfrequenz von 80/min beatmet. Als Beatmungsgerät wird eine Harvard Pumpe Type 681 verwendet.
Danach wird die Arterie carotis vom gleichen Hautschnitt aus freipräpariert und ein Katheter eingebunden. Die Beatmungsdruckregistrierung erfolgt über einen Drucktransducer, der an den
Beatmungsschlauch mit Hilfe eines T-Stückes angeschlossen ist.
Nach der Präparation wird zumindest 10 min gewartet, um stabile Ausgangswerte zu errei- chen. Danach wird der Nullpunkt festgestellt und nach weiteren 2 bis 3 min 150 mg Immunglobu- lin/kg Körpermasse iv. anwendbares Immunglobulin-G innerhalb von 90 s intraarteriell über den
Katheter injiziert.
Nach 20 min werden 50 mg Standardsubstanz/kg Körpermasse innerhalb von 90 s intraarteriell injiziert.
Der maximale Atemdruckanstieg während der auf die Injektion der Probe folgenden 20 min wird bestimmt und auf den Ausgangsmittelwert bezogen.
Die bronchospastische Wirkung von iv. anwendbarem Immunglobulin-G wird so ermittelt, dass 500 mg/kg Körpermasse Meerschweinchen intraarteriell injiziert werden, und der durchschnittliche prozentuelle Atemdruck bei vier Meerschweinchen mit der atemdrucksteigernden Wirkung von im. anwendbarem Immunglobulin-G, Standardsubstanz, verglichen wird.
Erfindungsgemäss verwendbare Immunglobulin-G-enthaltende Fraktionen, die in optimaler Weise nebenwirkungsfrei sind, können dadurch hergestellt werden, dass eine aus menschlichem oder tierischem Blut gewonnene Fraktion mit an wasserunlösliches Trägermaterial gebundenen Pankreasenzymen, wie Trypsin oder Chymotrypsin oder Pankreasprotease, behandelt wird und die behandelte Fraktion gegebenenfalls einer weiteren Fraktionierung und Konzentrierung unterworfen wird.
Hiebei wird vorteilhaft als wasserunlösliches Trägermaterial Sepharose 4 B-Gel verwendet.
Das gereinigte Immunglobulin kann aus der mit an wasserunlösliches Trägermaterial gebundenen Enzymen behandelten immunglobulinhaltigen Fraktion, gegebenenfalls nach Entfernen unerwünschter Begleitstoffe, mit Proteinfällungsmitteln ausgefällt und zu einem Endprodukt verarbeitet werden.
Im besondern hat sich eine Kombination der folgenden Reinigungs- und Konzentrationsmassnahmen bewährt : dass aus menschlichem oder tierischem Plasma durch Behandeln mit Äthanol bei einer Tempera- tur von unter OOC ein immunglobulinhaltiger Niederschlag ausgefällt wird ; dass der Niederschlag mittels einer Pufferlösung extrahiert und aus der erhaltenen Lösung durch neuerliche Behandlung mit Äthanol ein pastenförmiges Immunglobulinkonzentrat ge- wonnen wird ; dass dieses Konzentrat durch Dialyse gereinigt wird ; dass die so gereinigte immunglobulinhaltige Fraktion mit einem immobilisierten Enzym aus
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der Gruppe Trypsin, Chymotrypsin oder Pankreasprotease bei erhöhter Temperatur von etwa 37 C behandelt und sodann das immobilisierte Enzym abgetrennt wird ;
dass aus der so behandelten Fraktion gereinigtes, im wesentlichen aus IgG bestehendes
Immunglobulin mittels eines Proteinfällungsmittels, vorzugsweise Polyäthylenglykol, ausgefällt wird und dass die Fällung gelöst, die Lösung sterilfiltriert und schliesslich lyophilisiert wird.
Die Herstellung von erfindungsgemäss verwendbaren Fraktionen wird durch die folgenden Arbeitsvorschriften und Beispiele näher erläutert :
Arbeitsvorschriften zur Bereitung eines immobilisierten Enzyms Arbeitsvorschrift l :
1 l Sepharose 4 B-Gel (Pharmacia) wird nach einer Waschung mit 4 l destilliertem Wasser mit 200 g Bromcyan, die in 100 ml Acetonitril gelöst wurden, bei einem PH-Wert von 11, 0 versetzt.
Das Reaktionsgemisch wird durch ein Eisbad gekühlt. Nach Entfernung der flüssigen Phase wird
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nicht gebundene Trypsin wird vom Trypsin, das an das Gel gebunden ist, durch Filtrieren getrennt.
Nachdem das Gel-Trypsin mit 1 l einer lmolaren Glycinlösung versetzt wurde, wird es gründlich mit 0,2molarer NaHCO,-Lösung proteinfrei gewaschen. Schliesslich wird das Gel-Trypsin in l 1 0, 9%iger NaCI-Lösung suspendiert - es ist gebrauchsfertig für die Inkubation mit einer
Immunglobulinfraktion.
Arbeitsvorschrift 2 :
Das unlösliche Enzym wird in der gleichen Weise wie in Arbeitsvorschrift 1 hergestellt, statt Trypsin wird Pankreasprotease (Merck) genommen.
Arbeitsvorschrift 3 :
Arbeitsvorschrift 1 wird wiederholt, statt Trypsin wird a-Chymotrypsin (a) verwendet.
Beispiele zur Herstellung der Immunglobulin-G-enhaltenden Fraktion
Beispiel 1
Menschliches Blutplasma wird mit 8% Äthanol versetzt, bei einem PH-Wert von 7,2 und einer Temperatur von -2OC. Nach Abtrennen des Präzipitats wird die Äthanolkonzentration auf
25% erhöht und gleichzeitig die Temperatur auf-6 C gesenkt. Der ausfallende Niederschlag, der Immunglobulin enthält, wird weiter gereinigt durch eine Extraktion mit einem Phosphat-Acetat- - Puffer und er wird mit 12% Äthanol bei einem PH-Wert von 5,4 und einer Temperatur von-2 C versetzt.
Der Niederschlag (der a-und 6-Globulin enthält) wird verworfen. Die Äthanolkonzentration des Überstandes wird, bei einem PH-Wert von 7, 2 und einer Temperatur von-10 C, auf 25% erhöht. Das ausgefallene, pastenförmige Immunglobulin wird gesammelt und das Äthanol durch Dialyse entfernt.
Danach wird zum Dialysat 170 g/l Ammoniumsulfat bei einem PH-Wert von 6, 25 zugesetzt, das Präzipitat wird abgetrennt und verworfen. Zum Überstand wird bei einem PH-Wert von 7, 2 weiteres Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 280 g/l zugefügt. Der Niederschlag wird in Wasser gelöst und zur Entfernung des Ammoniumsulfats dialysiert.
Nach der Dialyse wird die Ionenstärke der Immunglobulinlösung auf 0, 15 gestellt.
100 g Immunglobulin werden mit 30 ml nach Arbeitsvorschrift 1 immobilisiertem Trypsin hergestellt und bei 37 C 72 h lang behandelt. Nach Entfernung des Gel-Trypsins wird das behandelte Immunglobulin durch 135 g/l Polyäthylenglykol 4000 ausgefällt. Das Präzipitat wird in 0, 9% NaCl aufgelöst, sterilfiltriert, abgefüllt und durch Gefriertrocknung haltbar gemacht.
Beispiel 2
Die Gewinnung der immunglobulinhaltigen Fraktion erfolgt in gleicher Weise wie in Beispiel l.
Die Inkubation wird mit der immobilisierten, nach Arbeitsvorschrift 2 hergestellten Pankreasprotease durchgeführt. 100 g Immunglobulin werden mit 70 ml gelförmiger immobilisierter Pankreas-
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Zum Überstand wird weiteres Polyäthylenglykol 4000 bis zu einer Endkonzentration von 85 g/l zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wird verworfen.
Durch Erhöhung der Polyäthylenkonzentration auf 135 g/l wird das gereinigte Immunglobulin ausgefällt und wie in Beispiel 1 haltbar gemacht.
Beispiel 3
Die Gewinnung der Immunglobulin-G-enthaltenden Fraktion wird in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, vorgenommen, jedoch wird die Behandlung mit immobilisiertem a-Chymotrypsin bei 37 C 72 h durchgeführt.
Die pharmakologischen Merkmale bzw. Kennwerte der nach den Beispielen 1 bis 3 hergestellten Immunglobulin-G-enthaltenden Fraktionen, nämlich die vasoaktive und leukopenische Wirkung im Hundetest und die bronchospastische Wirkung im Meerschweinchentest, wurden wie im vorherstehenden beschrieben bestimmt ; diese Werte sind aus den folgenden Tabellen zu ersehen :
Tabelle 1
Durchschnittsblutdruck von vier Hunden in % des Ausgangswertes nach Injizierung von 500 mg der Präparation pro kg Körpermasse
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<tb>
<tb> Systolischer <SEP> Diastolischer
<tb> Blutdruck <SEP> Blutdruck
<tb> Präparation <SEP> nach
<tb> Beispiel <SEP> 1 <SEP> 91% <SEP> 86%
<tb> Präparation <SEP> nach
<tb> Beispiel <SEP> 2 <SEP> 93% <SEP> 89%
<tb> Präparation <SEP> nach
<tb> Beispiel <SEP> 3 <SEP> 81% <SEP> 79%
<tb>
Tabelle 2 Durchschnittsleukozytenzahl von vier Hunden in % des Ausgangswertes nach Injizierung von 500 mg der Präparation pro kg Körpermasse
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<tb>
<tb> Beispiel <SEP> 1 <SEP> 73%
<tb> Beispiel <SEP> 2 <SEP> 62%
<tb> Beispiel <SEP> 3 <SEP> 52%
<tb>
Tabelle 3 Durchschnittsatemdruckanstieg von vier Meerschweinchen in % des Ausgangswertes nach Injizierung von 500 mg der Präparation
pro kg Körpermasse
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<tb>
<tb> Beispiel <SEP> 1 <SEP> 102%
<tb> Beispiel <SEP> 2 <SEP> 110%
<tb> Beispiel <SEP> 3 <SEP> 125%
<tb>
Die Überlegenheit der erfindungsgemäss verwendbaren Immunglobulin-G-enthaltenden Fraktionen gegenüber den bekannten, intramuskulär anwendbaren ist mit grosser Anschaulichkeit aus den Diagrammen zu ersehen.
Im Diagramm I sind die Blutdruckkurven bei systolischer und diastolischer Messung von jeweils vier Hunden aufgezeichnet, wobei auf der Abszisse jeweils die verabreichten Mengen
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in mg/kg Körpermasse der Tiere aufgetragen sind. Die voll ausgezeichnete Linie im Bereich von A bis B entspricht dem Verlauf des Blutdruckes bei Verabreichung von erfindungsgemäss verwendbaren Immunglobulin-G-enthaltenden Präparaten ;
der Verlauf der Kurve von A bis C (voll ausgezogene Linie und strichlierte Linie) entspricht dem Verlauf der Blutdruckkurve bei
Applikation der im.-Standardsubstanz. Es ist ersichtlich, dass bei einer Applikation der im. anwendbaren Standardsubstanz von 5 mg/kg Körpermasse der Blutdruck um 30% abgefallen ist, wogegen bei der Applikation des erfindungsgemäss verwendbaren Präparats dieser Abfall erst bei einer Dosierung von 500 mg/kg Körpermasse auftritt, d. h. das erfindungsgemäss verwendbare
Immunglobulin hat eine um das mindestens 100fach geringere vasoaktive Wirkung als die bekannten im. anwendbaren Präparate unter sonst gleichen Bedingungen.
Aus dem Diagramm II ist die leukopenische Wirkung im Hundetest als Durchschnitt von vier Tieren im Vergleich zwischen dem erfindungsgemäss verwendbaren Präparat und dem standardi- sierten, im. anwendbaren Standardpräparat zu ersehen. Die voll ausgezogene Linie im Bereich von A bis B entspricht dem erfindungsgemäss verwendbaren Immunglobulin-G-enthaltenden Präparat, und die Linie von A bis C (voll ausgezogene Linie und strichlierte Linie) dem Abfall der Leukozy- tenzahl bei Applikation der im. anwendbaren Standardsubstanz.
Es ist ersichtlich, dass bei einer Applikation der im. anwendbaren Standardsubstanz die Leukozyten um 50% abgefallen sind, wogegen bei der Applikation des erfindungsgemäss verwendbaren Präparats dieser Abfall erst bei einer Dosierung von 500 mg/kg Körpermasse auftritt, d. h. das erfindungsgemäss verwend- bare Immunglobulin-G-enthaltende Präparat hat eine um das mindestens 1000fach niedrigere leukopenische Wirkung als die bekannten, im. anwendbaren Präparate unter sonst gleichen Bedingungen.
Ähnlich sieht der Vergleich der bronchospastischen Wirkungen im Meerschweinchentest gemäss dem Diagramm III aus, wobei der Verlauf der Kurve von A bis B (voll ausgezogene Linie) dem erfindungsgemäss verwendbaren Präparat und der Verlauf der Kurve von A bis C (voll ausgezogene und strichlierte Linie) dem standardisierten im. anwendbaren Präparat entspricht. Der 30%ige Atemdruckanstieg erfolgt beim bekannten im. anwendbaren Präparat schon bei einer Dosierung von 2 mg/kg Körpermasse, wogegen der gleiche Anstieg beim iv. anwendbaren Präparat erst bei einer Dosis von 500 mg/kg Körpermasse erfolgt, d. h. dass die bronchospastische Nebenwirkung bei dem erfindungsgemäss verwendbaren Präparat um das 250fache geringer ist.
Auf Grund ihrer chemischen Zusammensetzung und ihrer pharmakologischen Eigenschaften sind die erfindungsgemäss verwendbaren Immunglobulin-G-enthaltenden Fraktionen in hervorragender Weise zur Verwendung für die Behandlung von primären und sekundären Immundefekten, A- oder Hypogammaglobulinamie, bei Antikörpermangelsyndrom, bei Virusinfektionen oder bakteriellen Infektionen sowie bei Autoimmun- und Immunkomplexerkrankungen geeignet.