AT387717B - Verfahren zum bestimmen von unvertraeglichkeitsreaktionen verursachenden substanzen in therapeutisch und prophylaktisch anzuwendenden blutprodukten sowie verwendung des verfahrens - Google Patents

Description

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   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen von Unverträglichkeitsreaktionen verursachenden Substanzen in therapeutisch und prophylaktisch anzuwendenden Blutprodukten sowie die Verwendung dieses Verfahrens zur Prüfung der Sicherheit dieser Produkte. 



   Im besonderen betrifft die Erfindung ein Bestimmungsverfahren für immunglobulinhaltige Präparationen, die zur intravenösen Anwendung bei Menschen bestimmt sind. 



   Immunglobulinhaltige Präparate können bei primären und sekundären Immundefekten, A- oder Hypogammaglobulinamie, bei Antikörpermangelsyndrom, bei Virusinfektionen oder bakteriellen Infektionen angewendet werden. 



   Zur Gewinnung von immunglobulinhaltigen Präparationen aus menschlichem Plasma sind bereits 
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   Weiters ist eine Methode bekannt, nach der Immunglobulin aus Plasma mittels Ammonsulfat und Polyäthylenglykol gefällt wird (A. Polson, G. M. Potgieter, J. F. Largrier, G. E. F. Mears und F. J. Jourbet,   Biochim. Biophys. Acta.   82,463   [1964]).   Nach andern Verfahren wurde die Anwendung von Ionenaustauschern vorgeschlagen (E. A. Peterson und H. A. Sober, J. Am. Chem. Soc. 78,751 [1956]). 



   Die nach diesen Methoden hergestellten Präparationen sind jedoch lediglich für eine intramuskuläre Applikation geeignet. Bei intravenöser Verabreichung zeigen sie unerwünschte Nebenreaktionen. 



   Man hat sich daher bemüht, Nebenerscheinungen bzw. Nebenwirkungen zu verringern, zu welchem Zweck immunglobulinhaltige Präparate mit löslichen proteolytischen Enzymen, wie Pepsin, Plasmin, Papain   u. a.   behandelt wurden (DE-PS Nr. 1148037). Bei dieser Behandlung wird jedoch die Molekülstruktur der Immunglobuline verändert, mit der Folge einer verkürzten biologischen Halbwertszeit. Es wurde auch festgestellt, dass Enzymreste in den Präparaten zurückbleiben, wodurch diese kontaminiert werden. Die Lagerstabilität ist dementsprechend gering, die Gefahr des Fortschreitens der proteolytischen Spaltung gross. 



   Neuerdings sind auch Verfahren zur Herstellung von intravenös applizierbaren immunglobulinhaltigen Präparationen entwickelt worden, wobei eine aus menschlichem Blut gewonnene Fraktion mit an wasserunlösliches Trägermaterial gebundenen Pankreasenzymen, wie Trypsin oder Chymotrypsin oder Pankreasprotease, behandelt und die behandelte Fraktion gegebenenfalls einer weiteren Fraktionierung und Konzentrierung unterworfen wird. 



   Im einzelnen kann ein solches Verfahren darin bestehen, dass aus menschlichem Plasma durch Behandeln mit Äthanol bei einer Temperatur von unter   0 C   ein immunglobulinhaltiger Niederschlag ausgefällt wird ; dass der Niederschlag mittels einer Pufferlösung extrahiert und aus der erhaltenen Lösung durch neuerliche Behandlung mit Äthanol ein pastenförmiges Immunglobulinkonzentrat gewonnen wird ; dass dieses Konzentrat durch Dialyse gereinigt wird ; dass die so gereinigte immunglobulinhaltige Fraktion mit einem immobilisierten Enzym aus der Gruppe Trypsin, Chymotrypsin oder Pankreasprotease bei erhöhter Temperatur von etwa   37 C   behandelt wird ;

   dass aus der so behandelten Fraktion gereinigtes, im wesentlichen aus IgG bestehendes
Immunglobulin mittels eines Proteinfällungsmittels, vorzugsweise Polyäthylenglykol, ausgefällt wird und dass die Fällung gelöst, die Lösung sterilfiltriert und schliesslich lyophilisiert wird. 



   Präparationen solcher Art enthalten nur geringe Mengen von Substanzen, die Nebenreaktionen bzw. Unverträglichkeitsreaktionen verursachen. 



   Da dem Therapeuten immunglobulinhaltige Präparationen zur Verfügung stehen, die grössere oder kleinere Mengen an Unverträglichkeitsreaktionen verursachenden Substanzen enthalten, besteht die Aufgabe der Erfindung, eine sichere Bestimmungsmethode zur Verfügung zu haben, mit der in einfacher und schneller Weise die pharmakologischen Eigenschaften der Präparationen feststellbar sind, insbesondere ihre Freiheit von vasoaktiven Substanzen und von leukopenischen Substanzen. 

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 Weiters ist man bestrebt, pharmakologisch zulässige Grenzwerte für die Prüfung der Sicherheit der immunglobulinhaltigen Präparationen vor ihrer Anwendung am Menschen zur Verfügung zu haben. 



   Die gestellte Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass die Blutprodukte intraarteriell Hunden injiziert werden und der Blutdruckabfall und/oder der Abfall der Leukozytenzahl festgestellt wird. 



   Vorteilhaft werden immunglobulinhaltige Blutprodukte für die Bestimmung verwendet. 



   Die angegebenen Verfahren beruhen auf der Erkenntnis, dass bei der intraarteriellen Injektion der Präparationen an Hunden die Nebenwirkungen verursachenden Substanzen etwa zehnmal so stark in Erscheinung treten wie bei intravenöser Anwendung beim Menschen, so dass auf diese Weise die unschädlichen Grenzwerte für zulässige Verunreinigungen in für Menschen i. v. zu applizierende Präparationen festgelegt werden können. 



   Die angeführten Bestimmungsverfahren werden mit Vorteil zur Prüfung der Sicherheit von immunglobulinhaltigen Präparationen verwendet, mit der Massgabe, dass für eine ausreichende Sicherheit bei maximal möglicher Dosierung ein signifikanter Abfall des Blutdruckes im Hundetest und/oder ein signifikanter Abfall der Leukozytenzahl im Hundetest nicht feststellbar ist. 



   In bezug auf die Prüfung von immunglobulinhaltigen Präparationen hinsichtlich ihrer vasoaktiven Wirkung wurde gefunden, dass eine ausreichende Sicherheit gegeben ist, wenn bei einer Dosis von mehr als 500 mg/kg Körpergewicht im Durchschnitt bei vier Tieren ein Blutdruckabfall von höchstens 30% feststellbar ist. 



   In bezug auf die Prüfung von immunglobulinhaltigen Präparationen hinsichtlich ihrer leukopenischen Wirkung wurde gefunden, dass eine ausreichende Sicherheit gegeben ist, wenn bei einer Dosis von mehr als 500 mg/kg Körpergewicht im Durchschnitt bei vier Tieren ein Abfall der Leukozytenzahl von höchstens 50% feststellbar ist. 



   Zwischen den im vorstehenden angeführten Grenzwerten und der Anzahl der Versuchstiere besteht insoferne ein Zusammenhang, als, wenn die Anzahl der Versuchstiere erhöht wird, der tolerierbare Grenzwert erniedrigt werden kann und umgekehrt   ; d. h.   dass bei weniger Versuchstieren die Sicherheitsgrenze erhöht werden sollte. 



   Die vasoaktive Wirkung wird erfindungsgemäss in folgender Weise festgestellt :
Versuchstieren (Mischlingen beiderlei Geschlechts) wird nach Narkotisierung die Vena jugularis und die Arterie carotis präpariert. Vor der Anästhesie wird eine Fastenzeit von mindestens 12 h angesetzt. Pro Testsubstanz werden je vier qualifizierte Hunde, d. h. solche Tiere benötigt, die bei intraarterieller Applizierung von standardisiertem intramuskulär anwendbarem Immunglobulin ("Standardsubstanz") eine vasoaktive Wirkung (Blutdruckabfall) von mindestens 30% bei einer Dosierung von 50 mg/kg Körpergewicht zeigen. Dieses standardisierte intramuskulär anwendbare Immunglobulin wird nach der einleitend erwähnten Methode von 
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 bereitet. Hunde, die auf die Standardsubstanz keine Reaktion zeigen, können für die Vergleichstests nicht herangezogen werden. 



   Von der Standardsubstanz werden 160 mg in 1 ml Aqua ad iniectabilia gelöst und mit isotoner   NaCl-Lösung   auf 16,7 mg/ml verdünnt. Das aufgelöste Material wird innerhalb von 4 h verwendet. 



   Das zu untersuchende Immunglobulinpräparat wird mit Aqua ad iniectabilia so gelöst, dass 1 ml 165 mg Protein enthält. Das aufgelöste Material wird innerhalb von 4 h verwendet. 



   Die Tiere werden mit einer intravenösen Einzeldosis von 40 mg/kg Nembutal (Barbitural) anästhesiert, und die Vena jugularis externa wird nach ihrer Aufteilung am unteren Rand des Unterkiefers präpariert und ein Katheter eingebunden. Danach wird die Arterie carotis vom gleichen Hautschnitt aus freigelegt und ein Katheter eingebunden. Nach der Präparation der Arterie wird 30 min zugewartet, um stabile Ausgangswerte zu erreichen. Über den tiefen Venenkatheter wird der zentrale Venendruck und über den seichten arteriellen Katheter wird der arterielle Blutdruck mit Hilfe eines Drucktransducers gemessen. Über den arteriellen Katheter wird zuerst das erfindungsgemäss i. v. anwendbare Immunglobulin-G und dann die Standardsubstanz injiziert. 

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   Während der gesamten Zeit der Versuchsdurchführung wird über den Arterienkatheter der systolische und diastolische Blutdruck mit Hilfe des Drucktransducers aufgezeichnet. 



   Der Blutdruckmittelwert (systolisch und diastolisch) sowie der Mittelwert der Leukozytenzahl vor der Injektion der Testsubstanz und der Standardsubstanz werden bestimmt. Der maximale Blutdruckabfall wird durch Messung des Blutdruckes über 20 min nach Injektion der Testsubstanzen bestimmt. 



   Die vasoaktive Wirkung des untersuchten Immunglobulinpräparates wird so ermittelt, dass 500 mg/kg Körpergewicht Hund injiziert werden und der durchschnittliche prozentuelle systolische und diastolische Blutdruckabfall bei vier Hunden mit der blutdrucksenkenden Wirkung von im. anwendbarer Standardsubstanz verglichen wird. 



   Die Bestimmung der leukopenischen Wirkung wird erfindungsgemäss in folgender Weise durchgeführt. 



   Versuchstieren (Mischlingshunden beiderlei Geschlecht) wird nach Narkotisierung die Vena jugularis und die Arterie carotis präpariert. Vor der Anästhesie wird eine Fastenzeit von mindestens 12 h angesetzt. Pro Testsubstanz werden je vier qualifizierte Hunde benötigt, die bei intraarterieller Applizierung von standardisiertem intramuskulär anwendbarem Immunglobulin (Standardsubstanz) eine leukopenische Wirkung (Leukozytenabfall) von mindestens 50% bei einer Dosierung von 50 mg/kg Körpergewicht zeigen. Hunde, die auf die Standardsubstanz keine Reaktion zeigen, können für die Vergleichstests nicht herangezogen werden. 



   Die Vorbereitung der Versuchstiere und der Testsubstanzen erfolgt in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben. 



   Zur Untersuchung der Leukozytenzahl werden Blutproben gezogen. Bei der ersten Blutprobe werden   40 gel   Blut mit 20 ml Isotone II (COULTER) und sechs Tropfen Zapoglobin (COULTER) versetzt und im Coulter Counter gemessen. Anschliessend werden nach 10,15, 16,17, 18 und 19 min weitere Blutproben zur Bestimmung der Leukozytenzahl gezogen. Dann werden sofort 500 mg Immun- 
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 v.zogen. 



   Nach 20 min werden 50 mg Immunglobulin/kg Körpergewicht der Standardsubstanz innerhalb von 90 s injiziert. Blutproben werden wieder nach 1, 2,3, 4,5, 7,10, 15 und 20 min gezogen. 



   Die maximale Senkung der Leukozytenzahl wird durch Bestimmung von Blutproben, die 1, 2,3, 4,5, 7,10, 15 und 20 min nach der Injektion der Probe gezogen werden, bestimmt. 



   Die leukopenische Wirkung des untersuchten Immunglobulinpräparates wird so ermittelt, dass 500 mg/kg Körpergewicht Hund injiziert werden und der durchschnittliche prozentuelle Leukozytenabfall bei vier Hunden mit der leukopenischen Wirkung von im. anwendbarer Standardsubstanz verglichen wird. 



   Die Herstellung einer Immunglobulinfraktion, die nur geringe Mengen von Unverträglichkeitsreaktionen verursachenden Substanzen enthält, wird durch das folgende Beispiel näher erläutert :
1   l   Sepharose 4 B-Gel (Pharmacia) wird nach einer Waschung mit 4   l   destilliertem Wasser mit 200 g Bromcyan, die in 100 ml Acetonitril gelöst wurden, bei einem pH-Wert von 11, 0 versetzt. Das Reaktionsgemisch wird durch ein Eisbad gekühlt. Nach Entfernung der flüssigen Phase wird 
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 nicht gebundene Trypsin wird vom Trypsin, das an das Gel gebunden ist, durch Filtrieren getrennt. 



   Nachdem das Gel-Trypsin mit 1 1 einer   l   molaren Glycinlösung versetzt wurde, wird es gründlich mit 0, 2 molarer   NaHC03-Lösung   proteinfrei gewaschen. Schliesslich wird das Gel-Trypsin in 1   l     0, 9%iger NaCl-Lösung suspendiert - es   ist gebrauchsfertig für die Inkubation mit einer   Immunglobulinfraktion.   



   Menschliches Blutplasma wird mit 8% Äthanol versetzt, bei einem pH-Wert von 7, 2 und einer 
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 globulin enthält, wird weiter gereinigt durch eine Extraktion mit einem Phosphat-Acetat-Puffer und er wird mit 12% Äthanol bei einem pH-Wert von 5, 4 und einer Temperatur   von-2 C   versetzt. 



   Der Niederschlag (der Alpha- und Betaglobulin enthält) wird verworfen. Die Äthanolkonzentration des Überstandes wird, bei einem PH-Wert von 7, 2 und einer Temperatur   von-10 C,   auf 25% erhöht. Das ausgefallene, pastenförmige Immunglobulin wird gesammelt und das Äthanol durch Dialyse entfernt. 



   Danach wird zum Dialysat 170   g/l   Ammoniumsulfat bei einem PH-Wert von 6, 25 zugesetzt, das Präzipitat wird abgetrennt und verworfen. Zum Überstand wird bei einem PH-Wert von 7, 2 weiteres Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 280   g/l   zugefügt. Der Niederschlag wird in Wasser gelöst und zur Entfernung des Ammoniumsulfats dialysiert. Nach der Dialyse wird die Ionenstärke der Immunglobulinlösung auf 0, 15 gestellt. 



   100 g des so hergestellten Immunglobulins werden mit 30 ml des immobilisierten Trypsins bei   37 C   72 h lang behandelt. Nach Entfernung des Gel-Trypsins wird das behandelte Immunglobulin durch 135 g/l Polyäthylenglykol 4000 ausgefällt. Das Präzipitat wird in   0, 9% NaCl   aufgelöst, sterilfiltriert, abgefüllt und durch Gefriertrocknung haltbar gemacht. 



   Das nach dem obigen Beispiel hergestellte Immunglobulin wurde auf seine vasoaktive und leukopenische Wirkung im Hundetest, wie oben ausgeführt, geprüft. Die gefundenen Werte sind nachstehend ersichtlich. 



   Durchschnittsblutdruck von vier Hunden in % des Ausgangswertes nach Injizierung von 500 mg der erfindungsgemässen Präparation pro kg Körpergewicht : 
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<tb> Systolischer <SEP> Diastolischer
<tb> Blutdruck <SEP> Blutdruck
<tb> Immunglobulin <SEP> gemäss <SEP> Beispiel <SEP> 91% <SEP> 86%
<tb> 
 
Durchschnittsleukozytenzahl von vier Hunden in % des Ausgangswertes nach Injizierung von 500 mg der erfindungsgemässen Präparation pro kg Körpergewicht : 
Immunglobulin gemäss Beispiel 73% 
Die gefundenen Werte sind ein Anzeichen dafür, dass das geprüfte Immunglobulin für intravenöse Anwendung am Menschen geeignet und sicher ist. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zum Bestimmen von Unverträglichkeitsreaktionen verursachenden vasoaktiven Substanzen in therapeutisch und prophylaktisch anzuwendenden Blutprodukten, dadurch gekennzeichnet, dass die Blutprodukte intraarteriell Hunden injiziert werden und der Blutdruckabfall und/oder der Abfall der Leukozytenzahl festgestellt wird.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass immunglobulinhaltige Blutprodukte für die Bestimmung verwendet werden.

   3. Verwendung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 und 2, zur Prüfung der Sicherheit von immunglobulinhaltigen Blutprodukten, mit der Massgabe, dass für eine ausreichende Sicherheit bei maximal möglicher Dosierung ein signifikanter Abfall des Blutdruckes im Hundetest und/oder ein signifikanter Abfall der Leukozytenzahl im Hundetest nicht feststellbar ist.

   4. Verwendung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 und 2 zur Prüfung der Sicherheit von immunglobulinhaltigen Blutprodukten nach Anspruch 2, mit der Massgabe, dass im Test auf vasoaktive Wirkung bei einer Dosis von mehr als 500 mg/kg Körpergewicht im Durchschnitt bei vier Tieren ein Blutdruckabfall von höchstens 30% feststellbar ist.

   5. Verwendung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 und 2 zur Prüfung der Sicherheit von <Desc/Clms Page number 5> immunglobulinhaltigen Blutprodukten nach Anspruch 2, mit der Massgabe, dass im Test auf leukopenische Wirkung bei einer Dosis von mehr als 500 mg/kg Körpergewicht im Durchschnitt bei vier Tieren ein Abfall der Leukozytenzahl von höchstens 50% feststellbar ist.