AT384892B

AT384892B - Verfahren zum bestimmen von unvertraeglichkeitsreaktionen verursachenden substanzen in therapeutisch und prophylaktisch anzuwendenden blutprodukten

Info

Publication number: AT384892B
Application number: AT200586A
Authority: AT
Inventors: Johann Dr Eibl; Yendra Dr Linnau; Otto Dr Schwarz
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1983-03-16
Filing date: 1983-03-16
Publication date: 1988-01-25
Also published as: ATA200586A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen von Unverträglichkeitsreaktionen verursachenden Substanzen in therapeutisch und prophylaktisch anzuwendenden Blutprodukten sowie die Verwendung dieses Verfahrens zur Prüfung der Sicherheit dieser Produkte.

Im besonderen betrifft die Erfindung ein Bestimmungsverfahren für immunglobulinhältige Präparationen, die zur intravenösen Anwendung bei Menschen bestimmt sind.

Immunglobulinhältige Präparate können bei primären und sekundären Immundefekten A- oder Hypogammaglobulinamie, bei Antikörpermangelsyndrom, bei Virusinfektionen oder bakteriellen Infektionen angewendet werden.

Zur Gewinnung der immunglobulinhältigen Präparationen aus menschlichem Plasma sind be-
EMI1.1

164,109 [ 1964], sowie P. Kistler und H. Nitschmann, Vox Sanguins 7, 414 [1962].

Weiters ist eine Methode bekannt, nach der Immunglobulin aus Plasma mittels Ammonsulfat und Polyäthylenglykol gefällt wird (A. Polson, G. M. Potgieter, J. F. Largrier, G. E. F. Maers und F. J. Jourbet, Biochim. Biophys. Acta. 82,463 [1964]). Nach andern Verfahren wurde die Anwen-
EMI1.2

751 [1956]).

Die nach diesen Methoden hergestellten Präparationen sind jedoch lediglich für eine intramus- kuläre Applikation geeignet. Bei intravenöser Verabreichung zeigen sie unerwünschte Nebenreaktionen.

Man hat sich daher bemüht, Nebenerscheinungen bzw. Nebenwirkungen zu verringern, zu welchem Zweck immunglobulinhältige Präparate mit löslichen proteolytischen Enzymen, wie Pepsin, Plasmin, Papain u. a. behandelt wurden (DE-PS Nr. 1148037). Bei dieser Behandlung wird jedoch die Molekülstruktur der Immunglobuline verändert, mit der Folge einer verkürzten biologischen Halbwertszeit. Es wurde auch festgestellt, dass Enzymreste in den Präparaten zurückbleiben, wodurch diese kontaminiert werden. Die Lagerstabilität ist dementsprechend gering, die Gefahr des Fortschreitens der proteolytischen Spaltung gross.

Neuerdings sind auch Verfahren zur Herstellung von intravenös applizierbaren immunglobulinhältigen Präparationen entwickelt worden, wobei eine aus menschlichem Blut gewonnene Fraktion mit an wasserunlösliches Trägermaterial gebundenen Pänkreasenzymen, wie Trypsin oder Chymotrypsin oder Pankreasprotease, behandelt und die behandelte Fraktion gegebenenfalls einer weiteren Fraktionierung und Konzentrierung unterworfen wird.

Im einzelnen kann ein solches Verfahren darin bestehen, dass aus menschlichem Plasma durch Behandeln mit Äthanol bei einer Temperatur von unter 0 C ein immunglobulinhältiger Niederschlag ausgefällt wird ; - dass der Niederschlag mittels einer Pufferlösung extrahiert und aus der erhaltenen Lösung durch neuerliche Behandlung mit Äthanol ein pastenförmiges Immunglobulinkonzentrat ge- wonnen wird ; - dass dieses Konzentrat durch Dialyse gereinigt wird ; - dass die so gereinigte immunglobulinhältige Fraktion mit einem immobilisierten Enzym aus der Gruppe Trypsin, Chymotrypsin oder Pankreasprotease bei erhöhter Temperatur von etwa 37 C behandelt wird ;

- dass aus der so behandelten Fraktion gereinigtes, im wesentlichen aus IgG bestehendes
Immunglobulin mittels eines Proteinfällungsmittels, vorzugsweise Polyäthylenglykol, ausge- fällt wird und - dass die Fällung gelöst, die Lösung sterilfiltriert und schliesslich lyophilisiert wird.

Präparationen solcher Art enthalten nur geringe Mengen von Substanzen, die Nebenreaktionen bzw. Unverträglichkeitsreaktionen verursachen.

Da dem Therapeuten immunglobulinhältige Präparationen zur Verfügung stehen, die grössere oder kleinere Mengen an Unverträglichkeitsreaktionen verursachenden Substanzen enthalten, besteht die Aufgabe der Erfindung, eine sichere Bestimmungsmethode zur Verfügung zu haben, mit der in einfacher und schneller Weise die pharmakologischen Eigenschaften der Präparationen feststellbar

sind, insbesondere ihre Freiheit von bronchospastischen Substanzen. Weiters ist man bestrebt, phar- makologisch zulässige Grenzwerte für die Prüfung der Sicherheit der immunglobulinhältigen Präpa- rationen vor ihrer Anwendung am Menschen zur Verfügung zu haben.

Die gestellte Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass die Blutprodukte intra- arteriell Meerschweinchen injiziert werden und der Atemdruckanstieg festgestellt wird.

Vorteilhaft werden immunglobulinhältige Blutprodukte für die Bestimmung verwendet.

Die angegebenen Verfahren beruhen auf der Erkenntnis, dass bei der intraarteriellen Injek- tion der Präparationen an Meerschweinchen die Nebenwirkungen verursachenden Substanzen etwa zehnmal so stark in Erscheinung treten wie bei intravenöser Anwendung beim Menschen, so dass auf diese Weise die unschädlichen Grenzwerte für zulässige Verunreinigungen in für Menschen i. v. zu applizierende Präparationen festgelegt werden können.

Die angeführten Bestimmungsverfahren werden mit Vorteil zur Prüfung der Sicherheit von immunglobulinhältigen Präparationen verwendet, mit der Massgabe, dass für eine ausreichende Sicher- heit bei maximal möglicher Dosierung ein signifikanter Atemdruckanstieg im Meerschweinchentest nicht feststellbar ist.

In bezug auf die Prüfung von immunglobulinhältigen Präparationen hinsichtlich ihrer broncho- spastischen Wirkung wurde gefunden, dass eine ausreichende Sicherheit gegeben ist, wenn bei einer
Dosis von mehr als 500 mg/kg Körpergewicht im Durchschnitt bei vier Tieren ein Atemdruckan- stieg von höchstens 30% feststellbar ist.

Zwischen den im vorstehenden angeführten Grenzwerten und der Anzahl der Versuchstiere besteht insoferne ein Zusammenhang, als, wenn die Anzahl der Versuchstiere erhöht wird, der tole- rierbare Grenzwert erniedrigt werden kann und umgekehrt ; d. h. dass bei weniger Versuchstieren die Sicherheitsgrenze erhöht werden sollte.

Die Bestimmung der bronchospastischen (atemdrucksteigenden) Wirkung beim Meerschweinchen erfolgt in folgender Weise :
Versuchstieren (Meerschweinchen männlichen Geschlechtes) wird nach Narkotisierung die Luft- röhre im Kehlkopfbereich präpariert. Nach Intubation wird das Versuchstier mittels eines Beat- mungsgerätes mit einem dem Körpergewicht des Tieres entsprechenden Atemvolumen bei einer Atem- frequenz von 80 min beatmet. Danach wird die Arterie carotis vom gleichen Hautschnitt aus frei- präpariert. Nach intraarterieller Injektion der Testsubstanz wird der Atemdruck laufend gemessen.

Für den Test werden laborgezüchtete Meerschweinchen männlichen Geschlechtes mit einem Körpergewicht zwischen 500 und 700 g verwendet. Pro Testsubstanz werden vier qualifizierte Meer- schweinchen benötigt, die bei intraarterieller Applizierung von standardisiertem im. anwendbarem
Immunglobulin (Standardsubstanz) einen Atemdruckanstieg um mindestens 30% bei einer Dosierung von 50 mg/kg Körpergewicht zeigen. Meerschweinchen, die auf die Standardsubstanz keine Reaktion zeigen, können für die Vergleichstests nicht herangezogen werden.

Von der Standardsubstanz werden 160 mg in 1 ml Aqua ad iniectabilia gelöst und mit isotoner NaCl-Lösung auf 16, 7 mg/ml verdünnt. Das aufgelöste Material wird innerhalb von 4 h verwendet.

Das erfindungsgemäss zu untersuchende Immunglobulinpräparat wird mit Aqua ad iniectabilia so gelöst, dass 1 ml 165 mg Protein enthält. Das aufgelöste Material wird innerhalb von 4 h verwendet.

Die Tiere werden narkotisiert ; dann wird die Luftröhre im Kehlkopfbereich präpariert, und eine Trachealkanüle wird eingebunden. Mittels eines Beatmungsgerätes wird das Versuchstier mit einem dem Körpergewicht entsprechenden Atemvolumen bei einer Atemfrequenz von 80/min beatmet.

Als Beatmungsgerät wird eine Harvard Pumpe Type 681 verwendet.

Danach wird die Arterie carotis vom gleichen Hautschnitt aus freipräpariert und ein Katheter eingebunden. Die Beatmungsdruckregistrierung erfolgt über einen Drucktransducer, der an den Beatmungsschlauch mit Hilfe eines T-Stückes angeschlossen ist.

Nach der Präparation wird zumindest 10 min gewartet, um stabile Ausgangswerte zu erreichen. Danach wird der Nullpunkt festgestellt und nach weiteren 2 bis 3 min 150 mg Immunglobulin/kg Körpergewicht iv. anwendbares Immunglobulin-G innerhalb von 90 s intraarteriell über den Katheter injiziert.

Nach 20 min werden 50 mg Standardsubstanz/kg Körpergewicht innerhalb von 90 s intraarte- riell injiziert.

Der maximale Atemdruckanstieg während der auf die Injektion der Probe folgenden 20 min wird bestimmt und auf den Ausgangsmittelwert bezogen.

Die bronchospastische Wirkung des untersuchten Immunglobulinpräparates wird so ermittelt, dass 500 mg/kg Körpergewicht Meerschweinchen intraarteriell injiziert werden, und der durchschnitt- liche prozentuelle Atemdruck bei vier Meerschweinchen mit der atemdrucksteigernden Wirkung von im anwendbarem Immunglobulin, Standardsubstanz, verglichen wird.

Die Herstellung einer Immunglobulinfraktion, die nur geringe Mengen von Unverträglichkeits- reaktionen verursachenden Substanzen enthält, wird durch das folgende Beispiel näher erläutert.

Beispiel :
1 l Sepharose 4 B-Gel (Pharmacia) wird nach einer Waschung mit 4 l destilliertem Wasser mit 200 g Bromcyan, die in 100 ml Acetonitril gelöst wurden, bei einem PH-Wert von 11, 0 versetzt.

Das Reaktionsgemisch wird durch ein Eisbad gekühlt. Nach Entfernung der flüssigen Phase wird das Gel mit 800 mg Trypsin (Sigma), das in 1 l 0, 2 m NaHCOa gelöst wurde, versetzt. Das nicht gebundene Trypsin wird vom Trypsin, das an das Gel gebunden ist, durch Filtrieren getrennt.

Nachdem das Gel-Trypsin mit 1 l einer 1 m Glycinlösung versetzt wurde, wird es gründlich mit 0, 2 m NaHCOa-Lösung proteinfrei gewaschen. Schliesslich wird das Gel-Trypsin in 1 l 0, 9%iger NaCl-Lösung suspendiert - es ist gebrauchsfertig für die Inkubation mit einer Immunglobulinfrak- tion.

Menschliches Blutplasma wird mit 8% Äthanol versetzt, bei einem PH-Wert von 7, 2 und einer
Temperatur von -2OC. Nach Abtrennen des Präzipitates wird die Äthanolkonzentration auf 25% er- höht und gleichzeitig die Temperatur auf-6 C gesenkt. Der ausfallende Niederschlag, der Immun- globulin enthält, wird weiter gereinigt durch eine Extraktion mit einem Phosphat-Acetat-Puffer und wird mit 12% Äthanol bei einem pH-Wert von 5, 4 und einer Temperatur von -2OC versetzt.

Der Niederschlag (der Alpha- und Betaglobulin enthält) wird verworfen. Die Äthanolkonzentra- tion des Überstandes wird, bei einem PH-Wert von 7, 2 und einer Temperatur von-10 C, auf 25% erhöht. Das ausgefallene, pastenförmige Immunglobulin wird gesammelt und das Äthanol durch
Dialyse entfernt.

Danach wird zum Dialysat 170 g/l Ammoniumsulfat bei einem PH-Wert von 6, 25 zugesetzt, das Präzipitat wird abgetrennt und verworfen. Zum'Überstand wird bei einem pH-Wert von 7, 2 weiteres Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 280 g/l zugefügt. Der Niederschlag wird in Wasser gelöst und zur Entfernung des Ammoniumsulfats dialysiert. Nach der Dialyse wird die
Ionenstärke der Immunglobulinlösung auf 0, 15 gestellt.

100 g des so hergestellten Immunglobulins werden mit 30 ml des immobilisierten Trypsins bei 370C 72 h lang behandelt. Nach Entfernung des Gel-Trypsins wird das behandelte Immunglobulin durch 135 g/l Polyäthylenglykol 4000 ausgefällt. Das Präzipitat wird in 0, 9% NaCl aufgelöst, sterilfiltriert, abgefüllt und durch Gefriertrocknung haltbar gemacht.

Das nach dem obigen Beispiel hergestellte Immunglobulin wurde auf seine bronchospastische Wirkung im Meerschweinchentest, wie oben ausgeführt, geprüft. Die gefundenen Werte sind nachstehend ersichtlich.

Durchschnittsatemdruckanstieg von vier Meerschweinchen in % des Ausgangswertes nach Injizierung von 500 mg der erfindungsgemässen Präparation pro kg Körpergewicht :
Immunglobulin gemäss Beispiel 102%
Die gefundenen Werte sind ein Anzeichen dafür, dass das geprüfte Immunglobulin für intravenöse Anwendung am Menschen geeignet und sicher ist.

**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.

Claims

PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zum Bestimmen von Unverträglichkeitsreaktionen verursachenden bronchospastischen Substanzen in therapeutisch und prophylaktisch anzuwendenden Blutprodukten, dadurch gekennzeichnet, dass die Blutprodukte intraarteriell Meerschweinchen injiziert werden und der Atemdruckanstieg festgestellt wird. <Desc/Clms Page number 4>

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass immunglobulinhältige Blutprodukte für die Bestimmung verwendet werden.

3. Verwendung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 und 2, zur Prüfung der Sicherheit von immunglobulinhältigen Blutprodukten, mit der Massgabe, dass für eine ausreichende Sicherheit bei maximal möglicher Dosierung ein signifikanter Atemdruckanstieg im Meerschweinchentest nicht feststellbar ist.

4. Verwendung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 und 2, zur Prüfung der Sicherheit von immunglobulinhältigen Blutprodukten nach Anspruch 2, mit der Massgabe, dass im Test auf bronchospastische Wirkung bei einer Dosis von mehr als 500 mg/kg Körpergewicht im Durchschnitt bei vier Tieren ein Atemdruckanstieg von höchstens 30% feststellbar ist.