CH652030A5 - Verfahren zur herstellung eines faktor-viii-hochkonzentrates aus blutplasma. - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Faktor-VIII-Hochkonzentrates mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 2,5 Einheiten an Faktor VIII und einem Fibrinogengehalt von weniger als 0,25 mg/mg Protein 20 aus menschlichem oder tierischem Plasma durch mehrstufige Fraktionierung des Plasmas, insbesondere durch Kryopräzi-pitieren und Reinigen mittels Proteinfällungsmittel, wie Polyäthylenglykol.
Es sind bereits Faktor-VIII-Konzentrate bekannt, die 25 aus menschlichem oder tierischem Plasma hergestellt werden und im Vergleich zum nativen Plasma eine erhöhte Aktivität an Faktor VIII aufweisen. Bekannte Verfahren zur Herstellung von Faktor VIII-Konzentraten bedienen sich als Fraktionierungsmassnahmen einer Behandlung des Plasmas mit 30 Äthanol, mit Äther, mit Polyäthylenglykol und/oder Glycin. Bekannt ist auch die Kryopräzipitation des Plasmas nach Pool (1965, «The New England Journal of Medicine» 273, 1443) oder die Kryoäthanolpräzipitation des Plasmas nach Johnson (Congr. Int. Soc. Blood Transf., Sydney, Australia, 35 Abstracts of Paper, Seite 1109 [1966]).
Es gibt auch noch andere Methoden, um Faktor-VIII-Konzentrate herzustellen, nämlich die Behandlung des Plasmas mit Adsorptionsmitteln, wie «Florigel», Bentonit, Ionenaustauschern und permeationschromatographischen 40 Mitteln.
Soweit der Stand der Technik die Behandlung des Plasmas mit Äthanol betrifft, wurde diese erstmals von Cohn (J. Amer. Chem. Soc. 68,459 [1946]) beschrieben. Bei der Behandlung des Plasmas mit Äthanol wird die sogenannte 45 Cohn-Fraktion I erhalten, die jedoch nur eine relativ geringe Faktor VIII-Aktivität besitzt. Die Cohn-Methode wurde von Blombäck (Arkiv för Kemi, 12 387 [1958]) verbessert, wobei Cohn-Fraktion I durch Extraktion mit einem Ätha-nol-Glycin-Zitrat-Puffer weiter gereinigt wurde. Dabei ent-50 stand die sogenannte Fraktion 1-0. Diese kann, wie Simonet-ti et al. (Hemostase 1, 57 [1961]) beschrieben, mit Gerbsäure noch weiter gereinigt werden; auch diese verbesserten Konzentrate haben nur eine relativ geringe Faktor-VIII-Aktivität. Diese Konzentrate haben auch den Nachteil, dass sie 55 hohe Fremdproteingehalte, d.h. Faktor VIII unwirksame Proteingehalte besitzen. So ist in der Cohn-Fraktion I mehr als 60% des Proteins Fibrinogen und in der Blombäck-Frak-tion 1-0 sogar über 80% Fibrinogen enthalten.
Was die bekannte Fraktionierung durch Kryopräzipitie-60 ren betrifft, wurde diese so vorgenommen, dass menschliches oder tierisches Ausgangsplasma tiefgefroren und wieder aufgetaut wurde. Das Kryopräzipitat wurde in einer Pufferlösung gelöst und gegebenenfalls durch Proteinfällungsmittel, wie Polyäthylenglykol und Glycin, weiter gereinigt. Durch 65 die Kryopräzipitation ist es nicht gelungen, die Faktor VIII-Aktivität wesentlich zu steigern. Die Faktor VIII-Aktivität wird durch das Kryopräzipitieren im Vergleich zum Ausgangsplasma nur um etwa das lOfache gesteigert, doch auch
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die in Kombination mit dem Kryopräzipitieren angewendeten weiteren Massnahmen haben bisher die Aktivität der erhaltenen Produkte nicht in der Weise steigern können, wie es erwünschenswert wäre.
Mehrstufige Fraktionierungsverfahren in Verbindung mit einer ersten Kryopräzipitationsstufe sind in den US-PSen 3 652 530, 3 631 018, 3 682 881 sowie in der AT-PS 349 639 beschrieben.
Solche Produkte werden als «hochgereinigter AHF» oder als «High Purity AHF» bezeichnet. Ihre Faktor-VIII-Aktivität beträgt jedoch auch bloss die 90 bis lOOfache Aktivität gegenüber nativem Plasma, während der Faktor-VIII-unwirksame Proteingehalt (Fibrinogen) immer noch 35% des Gesamtproteins ausmacht.
Die Erfindung bezweckt die Vermeidung der geschilderten Nachteile und Schwierigkeiten und stellt sich die Aufgabe, ein Faktor-VIII-Hochkonzentrat zu schaffen, in welchem die inerten, nicht-Faktor-VHI-wirksamen Proteine weitestgehend entfernt sind, der Gehalt an Fibrinogen so niedrig wie möglich gehalten ist und die Faktor-VIII-Aktivität, bezogen auf das im Konzentrat vorhandene Protein, höher ist als bei den bekannten therapeutisch verwendeten Präparaten.
Ziel der Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung eines Faktor-VIII-Hochkonzentrates mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 2,5 Einheiten an Faktor VIII und einem Fibrinogengehalt von weniger als 0,25 mg/mg Protein aus menschlichem oder tierischem Plasma durch mehrstufige Fraktionierung des Plasmas zu schaffen, welches Verfahren betriebsmässig bzw. in technischem Massstab anwendbar ist und eine hohe Wirtschaftlichkeit gewährleistet.
Diese Aufgabe wird durch ein mehrstufiges Fraktionierungsverfahren der eingangs bezeichneten Art, bei welchem vorzugsweise als erste Stufe eine Kryopräzipitation angewendet wird, dadurch gelöst, dass eine durch diese Fraktio-nierungsmassnahmen gereinigte und an Faktor VIII angereicherte Fraktion einer Kryoalkoholfällung unterworfen und der erhaltene Niederschlag in eine haltbare Form aufgearbeitet wird.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der gereinigten und an Faktor VIII angereicherten Fraktion bei einem pH-Wert von 5,9 bis 6,3 und einer Temperatur von 0 bis — 3 °C ein ein- oder mehrwertiger Alkohol, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol oder Polyätherglykol («PLURONIC») zugesetzt, die Mischung tiefgefroren und sodann bei einer Temperatur von 0 bis 4 °C aufgetaut, worauf der das Faktor-VIII-Hochkonzentrat enthaltende Niederschlag gelöst und durch Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form gebracht wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung um-fasst die Kombination der folgenden Massnahmen:
- dass menschliches oder tierisches Plasma einer ersten Kryopräzipitation unterworfen wird;
- das Kryopräzipitat in einer wässerigen Pufferlösung gelöst, auf einen pH-Wert von 6,15 bis 6,25 gestellt und die Lösung einer ersten Reinigungsfällung mit Polyäthylenglykol unterworfen wird;
- dass der nach Verwerfen des Niederschlags erhaltene Überstand mindestens einer weiteren Reinigungsfällung mit Polyäthylenglykol unterworfen und
- die nach Verwerfen der Niederschläge schliesslich erhaltene gereinigte, an Faktor VIII angereicherte Fraktion der Kryoalkoholfällung unterworfen wird, indem dieser Fraktion ein ein- oder mehrwertiger Alkohol, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol oder Polyestergly-kol («PLURONIC») zugesetzt, die Mischung tiefgefroren und sodann bei einer Temperatur von 0 bis 4 C aufgetaut wird, worauf der das Faktor-VIII-Hochkonzentrat enthaltende Niederschlag gelöst und durch Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form gebracht wird.
Vorteilhaft werden dabei die erste Polyäthylenglykol-Fällung mit 3 G/V%igem Polyäthylenglykol und die zweite bzw. die weiteren Polyäthylenglykol-Fällungen mit 8 G/V%igem Polyäthylenglykol durchgeführt.
Zweckmässig wird zur Ausfällung des Faktor VIII-Konzentrates eine etwa 10 G/V%ige «PLURONIC»-Lösung verwendet.
Anstelle von Polyäthylenglykol als Proteinfällungsmittel kann auch «PLURONIC» verwendet werden, in welchem Fall
- menschliches oder tierisches Plasma einer ersten Kryopräzipitation unterworfen wird;
- das Kryopräzipitat in einer wässerigen Pufferlösung gelöst, auf einen pH-Wert von 6,25 gestellt und die Lösung einer ersten Reinigungsfällung mit «PLURONIC» unterworfen wird;
- der nach Verwerfen des Niederschlages erhaltene Überstand mindestens einer weiteren Reinigungsfällung mit «PLURONIC» unterworfen und
- die nach Verwerfen der Niederschläge schliesslich erhaltene gereinigte, an Faktor VIII angereicherte Fraktion der Kryoalkoholfällung unterworfen wird, indem dieser Fraktion ein ein- oder mehrwertiger Alkohol, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol oder Poly-äther-glykol («PLURONIC») zugesetzt, die Mischung tiefgefroren und sodann bei einer Temperatur von 0 bis 4 °C aufgetaut wird, worauf der das Faktor-VIII-Hochkonzentrat enthaltende Niederschlag gelöst und durch Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form gebracht wird.
Das erfmdungsgemässe Verfahren wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1
4601 frisch gefrorenes Plasma werden bei 0° und +4°C aufgetaut. Das entstandene Kryopräzipitat wird durch Zen-trifugieren abgetrennt und in 9,61 Tri-Natriumcitrat bei 37 °C gelöst.
Der pH-Wert der Lösung wird auf 6,2 gestellt und 3 G/V%iges Polyäthylenglykol 2000 wird zugesetzt. Dabei entsteht ein Niederschlag, der durch Zentrifugieren abgetrennt und verworfen wird.
Die Ionenstärke des Überstandes, der Faktor VIII enthält, wird durch Zugabe von Tri-Natriumcitrat erhöht. Die restlichen unerwünschten Proteine werden durch Erhöhung der Polyäthylenglykol 2000-Konzentration auf 8 G/V% ausgefällt und nach dem Zentrifugieren verworfen.
Durch Zugabe von 8 G/V%igem Äthanol, bei — 2 °C und einem pH-Wert von 6,1, wird Faktor VIII-Konzentrat ausgefällt; die Suspension wird eingefroren und nach Auftauen bei +4°C wird das Faktor VIII enthaltende Kryoal-koholpräzipitat in einem physiologischen Puffer gelöst, ste-rilfiltriert, abgefüllt und gefriergetrocknet.
Beispiel 2
9600 ml frisch gefrorenes Plasma werden bei 0° bis +4 °C aufgetaut. Das zentrifugierte Kryopräzipitat wird in 240 ml Tri-Natriumcitrat bei 37 °C gelöst.
Der pH-Wert der Lösung wird auf 6,2 gestellt und 3 G/V%iges Polyäthylenglykol 2000 zugesetzt. Der entstandene Niederschlag wird abgetrennt und verworfen.
Durch Zugabe von Tri-Natriumcitrat wird die Ionenstärke erhöht, durch Zugabe von weiterem Polyäthylenglykol 2000 bis auf 8 G/V% fallen unerwünschte Proteine aus; diese werden abgetrennt und verworfen.
Bei pH 6,0 und — 2 bis — 3 C wird Faktor VIII-Konzentrat mittels 10 G/V%igem Methanol ausgefällt; die Suspen5
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sion wird eingefroren und nach Auftauen wird das Kryoal-koholpräzipitat in einem isotonen Puffer gelöst, sterilfiltriert, abgefüllt und gefriergetrocknet.
Beispiel 3
Die Arbeitsweise des Beispieles 2 wird wiederholt, jedoch wird statt 10 G/V%igem Methanol 12%iges Polyäthylenglykol zur Ausfällung des Faktor VIII-Konzentrates verwendet.
Beispiel 4
Die Arbeitsweise des Beispieles 2 wird wiederholt, jedoch wird statt 10 G/V%igem Methanol 10 G/V%iges «PLURONIC» zur Ausfällung des Faktor VIII-Konzentrates verwendet.
Beispiel 5
10,41 frisch gefrorenes Plasma werden bei 0° bis +4°C aufgetaut. Das Kryopräzipitat wird in 250 ml Tri-Natrium-citratpuffer gelöst.
Der pH-Wert der Lösung wird auf 6,3 gestellt und 2,5 G/V%iges «PLURONIC»'® zugesetzt. Der Niederschlag wird verworfen. Nach Erhöhung der lonenstärke wird die «PLURONIC»-Konzentration auf 7,5 G/V% gesteigert und der Niederschlag abermals verworfen.
Der Überstand wird bei einem pH-Wert von 6,0 und einer Temperatur von — 2 °C mit 8 G/V%igem Äthanol behandelt, wobei Faktor VIII-Konzentrat ausfällt. Die Suspension wird eingefroren und nach Auftauen bei +4 °C das Kryoalkoholpräzipitat abgetrennt.
Die durch das erfindungsgemässe Verfahren wesentlich erhöhte spezifische Aktivität der erhaltenen Hochkonzentrate bzw. die Anreicherung an Faktor VIII um mehr als das 200fache gegenüber dem Ausgangsplasma zeigt Tabelle I im Vergleich zu bekannten, im Handel befindlichen Faktor-VIII-Konzentraten.
Tabelle I
Spezifität Einh./mg
Reinheit im Vergleich zu Plasma
Plasma 0,017 1
Kryopräzipitat 0,145 9-fache Faktor VIII von hoher
Reinheit (Handelsprodukt) 1,667 98-fache 15 Hochkonzentrat, hergestellt nach der Erfindung >3,500 206-fache
Der geringere Gehalt des erfindungsgemäss hergestellten Hochkonzentrates an Fibrinogen gegenüber bekannten Konzentraten ergibt sich aus der Tabelle II.
Tabelle!!
25 Cohn-Fraktion I
>60%
Blombäck-Fraktion 1-0
2:80%
gereinigter oder hochgereinigter
Faktor VIII
è 35%
Hochkonzentrat, hergestellt
30 nach der Erfindung
10%
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Claims (7)
- 652 0302PATENTANSPRÜCHE1. Verfahren zur Herstellung eines Faktor-VIII-Hochkonzentrates mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 2,5 Einheiten an Faktor VIII und einem Fibrinogengehalt von weniger als 0,25 mg/mg Protein aus menschlichem oder tierischem Plasma durch mehrstufige Fraktionierung des Plasmas, dadurch gekennzeichnet, dass eine durch diese Fraktionierungsmassnahmen gereinigte und an Faktor VIII angereicherte Fraktion einer Kryoalkoholfällung unterworfen und der erhaltene Niederschlag in eine haltbare Form aufgearbeitet wird.
- 2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktionierung des Plasmas durch Kryo-präzipitieren und Reinigen mittels Proteinfällungsmittel, wie Polyäthylenglykol erfolgt.
- 3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der gereinigten und an Faktor VIII angereicherten Fraktion bei einem pH-Wert von 5,9 bis 6,3 und einer Temperatur von 0 bis — 3 °C ein ein- oder mehrwertiger Alkohol, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol oder Polyätherglykol zugesetzt wird, die Mischung tiefgefroren und sodann bei einer Temperatur von 0 bis 4 °C aufgetaut wird, worauf der das Hochkonzentrat enthaltende Niederschlag gelöst und durch Tieffrieren und Lyophilisie-ren in haltbare Form gebracht wird.
- 4. Verfahren nach den Patentansprüchen 2 und 3, gekennzeichnet durch die Kombination der folgenden Massnahmen:-dass menschliches oder tierisches Plasma einer ersten Kryopräzipitation unterworfen wird;- das Kryopräzipitat in einer wässerigen Pufferlösung gelöst, auf einen pH-Wert von 6,15 bis 6,25 gestellt und die Lösung einer ersten Reinigungsfallung mit Polyäthylenglykol unterworfen wird;- dass der nach Verwerfen des Niederschlages erhaltene Überstand mindestens einer weiteren Reinigungsfällung mit Polyäthylenglykol unterworfen und- die nach Verwerfen der Niederschläge schliesslich erhaltene gereinigte, an Faktor VIII angereicherte Fraktion der Kryoalkoholfällung unterworfen wird, indem dieser Fraktion ein ein- oder mehrwertiger Alkohol, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol oder Polyätherglykol zugesetzt wird; die Mischung tiefgefroren und sodann bei einer Temperatur von 0 bis 4 °C aufgetaut wird, worauf der das Faktor-VIII-Konzentrat enthaltende Niederschlag gelöst und durch Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form gebracht wird.
- 5. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Polyäthylenglykolfällung mit 3 Ge-wicht/Volumen-prozentigem Polyäthylenglykol und die zweite bzw. die weiteren Polyäthylenglykolfällungen mit 6 Gewicht/Volumen-prozentigem Polyäthylenglykol durchgeführt werden.
- 6. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Ausfallung des Faktor-VIII-Konzentrates eine etwa 10 Gewicht/Volumen-prozentige Polyätherglykol-lösung verwendet wird.
- 7. Verfahren nach Patentanspruch 1, gekennzeichnet durch die Kombination der folgenden Massnahmen:- dass menschliches oder tierisches Plasma einer ersten Kryopräzipitation unterworfen wird;- dass Kryopräzipitat in einer wässerigen Pufferlösung gelöst, auf einen pH-Wert von 6,25 gestellt und die Lösung einer ersten Reinigungsfällung mit Polyätherglykol unterworfen wird;- dass der nach Verwerfen des Niederschlages erhaltene Überstand mindestens einer weiteren Reinigungsfällung mit Polyätherglykol unterworfen und- die nach Verwerfen der Niederschläge schliesslich erhaltene gereinigte, an Faktor VIII angereicherte Fraktion der Kryoalkoholfällung unterworfen wird, indem dieser Fraktion ein ein- oder mehrwertiger Alkohol, wie Methylal-5 kohol, Äthylalkohol, Polyäthylenglykol oder Polyätherglykol zugesetzt wird; die von 0 bis 4 C aufgetaut wird, worauf der das Faktor-VIII-Hochkonzentrat enthaltende Niederschlag gelöst und durch Tieffrieren und Lyophilisieren in haltbare Form gebracht wird.15
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