DE2715832C3

DE2715832C3 - Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem antihämophilem Globulin A (Faktor VIII)

Info

Publication number: DE2715832C3
Application number: DE2715832A
Authority: DE
Inventors: Yoshiro Nishinomiya Iga; Masashi Nagaokakyo Shiga
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1976-04-09
Filing date: 1977-04-07
Publication date: 1980-01-03
Also published as: DE2715832B2; JPS5512890B2; US4093608A; DE2715832A1; JPS52125609A

Description

Faktor VIII, auch als antihämophiles Globulin A bezeichnet, ist einer der wichtigsten Gerinnungs-Faktoren, der im »intrinsic system« bei der Bildung von Thromboplastin mitwirkt. Bei der Behandlung der Blutung von Patienten mit Kämophilie A hat sich die Substitution von Faktor VIII am besten bewährt. Der Faktor VIII ist aufgrund seines geringen Gehalts im Plasma und seiner Instabilität schwierig vom Plasma abzutrennen und zu reinigen. Es sind zur Zeit einige Faktor VIII Präparate erhältlich, die zur Behandlung von Hämophili.' A Patienten eingesetzt werden. Diese Präparate werden aus der Fraktion I, die durch Fraktionierung mit Äthanol nach Cohn erhalten worden ist, oder durch Kyropräzipnation hergestellt. Diese Präparate sind noch sehr unrein, jnd sie haben einen hohen Fibrinogengehalt. Eine zu häufige oder zu hohe Dosierung kann den Patienten klinisch gefährden, da die Fibrinogenkonzentration auf unzulässig hohe Werte ansteigt. Ferner ist die genaue Dosierung schwierig, weil die Aktivität von Präparat zu Präparat schwankt. Aus den vorstehenden Gründen besteht ein Bedarf an einem ttark gereinigten, konzentrierten Faktor VIII Präparat aus frischem, gepooltem Plasma. Die bisher bekannten hochaktiven Faktor VIII Konzentrate werden im ollgemeinen aus rohen Fraktionen von Faktor VIII, wie der C'ohn-Fraktion I oder aus einem Kryopräzipitat und anschließende Reinigung durch Fraktionierung mit Polyäthylenglykol oder Fraktionierung der Glykokoll Fällung hergestellt. Teilweise Verbesserungen dieser Verfahren sind in den US-PS 36 31 018 und 36 52 530 beschrieben.

Kisker. Thromb. Diath. Haemorrhagica, Bd. 17 (1967). S. 381. und Pen ick und Brinkhouse. Amer |. Med. Sciences. Bd. 232 (1956), S. 434, haben bereits darauf hingewiesen, daß bei der Herstellung von hochaktiven Faktor VIII Konzentraten, insbesondere bei der Abtrennung und Reinigung des Faktors VIII, der gleichzeitig vorhandene Prothrombinkomplex und aktive Formen dieser Faktoren, wie Ha und Xa, sich sehr ungünstig auf die Stabilität des Faktor VIII auswirken und bisweilen den Faktor VlU irreversibel inaktivieren. Zur Verbesserung der Stabilität, der Ausbeute und der Löslichkeit des Faktors Viii ist es daher von Bedeutung, diese störenden Faktoren auf einer möglichst frühen Stufe des Abtrennungs- und Reinigungsverfahrens zu inaktivieren oder zu eliminieren. Verfahren zur Inaktivierung der störenden Faktoren sind beispielsweise in der US-PS 38 03 115 beschrieben. Es ist ferner bekannt, daß diese störenden Faktoren auch mittels eines Adsorptionsmittels, wie Aluminiumhydroxid, Magnesiumhydroxid, Bariumcarbonat, Bariumsulfat, 9,10-Diamino-2-äthoxyacridin-Iactat, einem Ionenaustauscher (Amberlite IRC-50) oder Glycinäthylester, abgetrennt werden können; vgl. E. B i d w e 11 u. Mitarb., Brit. J. HaemaL, Bd. 13(1**67). S. 568, J. P. S ο u 1 i e r u. Mitarb., Presse med., Bd. 72 (1964), S. 1223, P. M. S u r g e η ο r u. Mitarb., ). Phys. Colloid Chem„ Bd. 55 (1951), S. 94 und

M. S. H ο a g u. Mitarb. J. Clin. Invest., Bd. 39 (1960), S. 554. Aluminiumhydroxid eignet sich besonders gut als Adsorptionsmittel für die störenden Faktoren und wird deshalb sehr häufig verwendet. Aluminiumhydroxid hat jedoch folgende Nachteile:

(1) die Abtrennung der störenden Faktoren, insbesondere des Prothrombin-Komplexes, ist unbefriedigend, und es kann einen unerwünschten Einfluß auf die Stabilität oder einige ande-e Eigenschaften des Faktors VIII ausüben;

(2) es reagiert mit Citronensäure oder deren Salzen unter Bildung eines Gels, so daß seine Verwendung die Möglichkeit der Verwendung von Citraten als Mittel zur Löslichmachung und Stabilisierung des Faktors VIII während seiner Fraktionierung ausschließt;

(3) nach der Behandlung mit Aluminiumhydroxid verbleibt eine geringe Menge an Aluminiumionen, die später zugesetztem Citrat geringe Mengen an

,o Gel bildet, was zu einer Verstopfung des Membranfilters führen kann, wodurch die Sterilfiltration sehr erschwert wird und große Verluste an Faktor VIII auftreten.

Nach M. S. Hoag u. Mitarb. New Kng. |. Med.. Bd. 280 (1969). S. 581. eignet sich ein Dextran mit Diäthylaminoäthylgruppen als Adsorptionsmiitel für den Prothrombin-Komplex. Nach S. F. Michael und G. W. Tun η ah. British J. Haemat.. Bd. 4 (1963). S. 236 bis 244. kann ein Dextran mit Diäthylaminoäthylgruppen als Adsorptionsmittel für den Faktor VIII dienen. Bei der Verwendung von Dextran mit Diäthylaminoäthylgruppen (DEAE-Dextran) als Adsorptionsmittel zur Reinigung des Faktors VIII, der durch den Prothrombin-Komplex verunreinigt ist, besteht somit die Gefahr, daß nicht nur der Prothrombin-Komplex, sondern auch der Faktor VIII an diesem Austauscher adsorbiert wird, wodurch die Ausbeute an Faktor VIII

stark abfällt Dies ist der Grund, warum DEAE-Dextran bisher nicht zur Abtrennung des Faktors VHI vom Prothrombin-Komplex verwendet wurde.

In Die Pharmazie, Bd. 23 (1968), S. 597, ist auf ein Verfahren von Shapiro und W an gh hingewiesen, bei dem zur Reinigung von menschlichem Prothrombin von ACD-PIasma ausgegangen wird und das Prothrombin zunächst bei pH 4,1 an DEAE-Cellulose adsorbiert wird.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem Faktor VIII (antihämophiles Globulin A) aus frischem humanem Plasma oder gepooltem Plasma zu schaffen, bei dem der Prothrombin-Komplex, der für den Abbau oder die Inaktivierung des Faktors VIII verantwortlich ist, vom Faktor VIII abgetrennt wird und der Faktor VIII in hoher Ausbeute sowie verbesserter Stabilität und Löslichkeit anfällt

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eioe Plaotnafraktion, die sowohl den Prothrombin-Komplex als auch den Faktor VIII enthält mit 0,5 bis 3 mg (bezogen auf das Trockengewicht) DEAE-Dextran pro Einheit Prothrombin behandelt Auf diese Weise wird der Prothrombin-Komplex am DEAE-Dextran adsorbiert und abgetrennt. Wenn die Plasmafraktion bei pH 4.1 an DEAE-Cellulose behandelt wird, werden sowohl der Prothrombin-Komplex als auch der Faktor VIII adsorbiert, was ihre Trennung und Isolierung außerordentlich erschwert.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann als DEAE-Dextran DEAE-Sephadex® A-50 oder A-25 verwendet werden, die sich durch den Vernelzungsgrad und dementsprechend die Porosität unterscheiden; vgl. die Firmenschrift Sephadex®-Ionenaustauscher, Leitfaden zur Ionenaustausch-Chromatographie, Pharmacia Fine Chemicals AB, Juni 1973, sowie Dextran Fractions. Dextran Sr'phate, DEAE-Dextran,defined polymers for biological research, Pharmacia Fine Chemicals AB. Dezember 1974.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Plasma oder eine Plasmafraktion eingesetzt, die den Faktor VIII und den Prothrombin-Komplex enthält. Die Behandlung mit DEAE-Dextian ist wirkungsvoller, wenn ein Ausgangsmaterial verwendet wird, in dem der Faktoi VIII in weniger gereinigtem Zustand vorliegt. Obwohl die Adsorption des Prothrombin-Komplexes durch die Reinheit des Faktors VIII im Plasma oder der Plasmafraktion nicht beeinträchtigt wird und auf jeder Stufe der Reinigung ein hohes Ausmaß an Abtrennung erreicht wird, nehmen die Verluste an Faktor VIII durch Adsorption mit zunehmender Reinheil des Faktors VIII im Plasma oder der Plasmafraktion zu. Deshalb ist die Behandlung mit DLAE-Dextran wii kungsvoller. wenn sie auf einer Frühstufe der Reinigung durchgeführt wird. Besonders wirksam ist das Verfahren, wenn ein Plasma unmitte'lbar mit DFAE-Dextran behandelt wird.

DFiAK-Dextran wird im erfindungsgemäßen Verfah ren in einer Menge von 03 bis 3 mg, vorzugsweise 1,0 bis 1,5 mg, bezogen auf das Trockengewicht, pro Einheit Prothrombin im Plasma oder der Faktor VIINFraktion verwendet. Bei Verwendung von DEAE-Dextran in Mengen außerhalb des angegebenen Bereichs erfolgt keine wirksame Adsorption des Prothrombin-Komplexes, oder es treten Verluste an Faktor VIII ein. Selbstverständlich muß das DEAE-Dextran vor der Verwendung gequollen, mit Puffer behandelt und 30 Minuten bei 121°C dampfsterilisiert werden. Das verfahrensgemäß eingesetzte Plasma bzw. die Faktor VIII-Fraktion hat einen pH-Wert von 6,8 bis 7,9 sowie eine Temperatur von 0 bis 10°C. Außerhalb dieses pH-Bereichs werden der Faktor VIII und der Prothrombin-Komplex inaktiviert Das Plasma oder die Faktor VIII-Fraktion hat eine elektrische Leitfähigkeit von 7000 bis 12 000 μν/cm, gemessen mit einem Digital-Leitfähigkeitsmesser, Modell CM- 15A. Gewöhnlich ist eine Kontaktzeit von 10 bis 60 Minuten ausreichend. Die elektrische Leitfähigkeit des verfahrensgemäß eingesetzten Plasmas oder der Plasmafraktion ist von besonderer Bedeutung. Sie muß im Bereich von 7000 bis 12 000μν/ατι, insbesondere zwischen 8500 und 9500 μν/cm liegen. Bei einem Wert oberhalb 12 000 μν/cm wird der Prothrombin-Komplex unzureichend adsorbiert und abgetrennt. Bei einem Wert unterhalb 7000 μν/cm erfolgt bereits teilweise Adsorption des Faktors VIII. Nach Abtrenni-ng des Prothrombin-Komplexes kann der Überstand, c. h. das den Faktor VIII enthaltende Plasma oder die Plasmafraktion noch in üblicher Weise durch Kryoäthanolpräzipitation nach der Cohn'schen Äthanolfraktionierung (vgl. E I ο m bä. k, Arkiv For Kemi, Bd. 12, Nr. 36 (1958), S. 387 bis 396) und anschließende Reinigung des Präzipitats mit Palyäthylenglykol (vgl. Poison, Vox Sang, Bd. 23 (1*572). S. 107 bis 118) und/oder Glykoll (vgl. Hurt. Thromb. Diath. Haemorr, Bd. 15 (1566), S. 327 bis 337) weiter gereinigt werden.

In der Praxis wird das erfindungsgemäße Verfahren so durchgeführt, daß zunächst gepooltes humanes Plasma auf einen pH-Wert von fc.8 bis 7.9 und eine elektrische Leitfähigkeit von 7OtK) bis 12 000 μν/cm

Ji eingestellt und sodann mit 0.3 bis 5 mg (bezogen auf das Trockengewicht) DEAE-Dextran, vorzugsweise DEAE-Sephadex® A-50 oder A-25, pro ml Plasma etwa 30 Minuten unter Rühren bei einer Flüssigkeitstemperatur von 0 bis 10⁰C behandelt wird, bis der Prothrombin-

·"> Komplex am DEAE-Dextran adsorbiert ist. Sodann wrd das DEAE-Dextran abgeschleudert. Es wird Prothrombin freies Plasma als Überstand erhalten. Dieses Plasma wird anschließend bei — 1 bis -4" C mit 53 Volumenprozent Äthanol versetzt, bis die Endkon-

+ > zentration von Äthanol einen Wer' von 3 bis 8 Volumenprozent erreicht hat. Es bildet sich ein Kryoäthanolpräzipitat. Der Faktor VIII wird in einer Ausbeute von 72.7 bis 88,3% und einer spezifischen Aktivität (Faktor VIII Einheit pro A 280) von 18,3 bis 29,b. je nach der Herkunft des Plasmas, erhalten. Diese Werte hegen erheblich über den Werten für die spezifische Aktivität der bekannten Faktor VIM Präparate. In der nächsten Stufe wird das erhaltene Xryupräzipitat in einem entsprechenden Medium, wie Tris-Citratpuffer (pH-Wert 7,0 bis 7,4) gelöst und nach der Methode von Poison. a.a.O.. mit 3 bis 5 Gewichtsprozent pro Volumen Polyäthylcnglykol vom Molekulargewicnt 4000 versetzt. Auf diese Weise wird Fibrinogen ausge^fällt. Der Überstand wird mit PoIv

Mi äthylenglykol vom Molekulargewicht 4000 und/oder Glykoll konzentriert. Es wird ein gereinigtes Faktor Vili-Präzipitat erhalten. Aus dem hochgereinigten Faktor Vltl-Präzipiut wird ein stabiles getrocknetes Produkt des humanen Faktors VIII in konzentrierter Form hergestellt Pieses Produkt wird als Conco-eight bezeichnet. In der Tabelle sind die Aktivitäten und Eigenschaften von Conco-eight und drei anderen bekannten Faktor VIII-PräDaraten zusammengefaßt

	5	27 1	5 832	e	Produkt C i
					(250 U/10 ml) \| ¥
Tabelle				Produkt B
Eigenschaften		Corico-eight	Produkt A	(260 U/10 ml)
	(500 U/20 ml)	(290 U/10 ml)

Löslichkeit bei 30-37⁰C (min)	< 10	schwach	25,0	15	20	< 10	I
Farbe der Lösung	13,3	weiß		hellgelb	P
Faktor VIII Aktivität (U/ml)		25,5	26,1	25,1	»1
Proteingehalt nach Lowry-Folin	1,880	29,9	27,7	39,5	I
(mg/ml)	1,13				I
Spezifische Aktivität (U/mg Protein)	0,085	0,853	0,942	0,635	fe
Fibrinogengehalt (mg/ml)		3,70	10,85	13,90	i
(mg/mg Protein)	η \j	0,124	0,392	0,352	I
Bestandteile bei der Elektrophorese (%)	2,3				I
*A 1 tv>>~»«r% rAiisuiiini**	11,4	Λ \j	η	30,!	i
«!-Globulin	11,1	1,2	1,1	2,0
^-Globulin	18,6	3,3	2,0	9,8	I
J?-GIobulin	55,6	57,2	42,5	3,8	t
Fibrinogen	0,32	33,7	49,5	45,5	p
^Globulin		4,6	4,9	8,8	I
Polyäthylenglykol-Gehalt (mg/ml)	x32-.x64	<0,01	0,54	<0,01	I
Isoagglutinin, reziproker Titer	.r32-.x64				RR
Anti-A	negativ	*64	x32-x64	.ν64-Λ·128	r
Anti-B	negativ	*64	λ·32-λ64	.y64-x128
HBs-Antigen (HAI Titer)		negativ	negativ	negativ	I
Anti-HBs (PHA Titer)	1,13 mg/ml	negativ	negativ	negativ	I
Koagulationsfaktoren	0,035 U/ml				I
Faktor I	>24h	3,70 mg/ml	10,85 mg/ml	13.90 mg/ml	I
Faktor II	0,031 U/ml	0,09 U/ml	0,026 U/ml	0,024 U/ml
Faktor II a	0,071 U/ml	>24h	>24 h	>24h	r
Faktor V	25,0 U/ml	0,06 U/ml	0,04 U/ml	0,152 U/ml	k
Faktor VII	0,232 U/ml	0,02 U/ml	0,02 U/ml	0,114 U/ml
Faktor VIII	υ,υιο «j/itii	25,5 U/ml	26,0 U/ml	25,1 U/ml	r?
Faktor IX		0,95 U/ml	0,345 U/ml	0,45 U/ml	I.
17~t.4._- V *χ U rvt-v-ii s.**		Λ Λ1 "> TI /„1 υ,υυ Kjitttt	η mn τι/—w	0 101 U/iii!	*,-**
Testmethode:				ϊ
Faktor I: Thrombin-Gerinnungszeit. T7«l.«_n. ΓΙ 17 T7T1 1 V- Π .ι ■ . _n ..				f

Faktor Ha: 1% Fibrinogen-Gerinnungszeit.

Faktor VIII und IX: Modifizierte partielle Thromboplastin-Zeit

Das Produkt der Erfindung ist den Vergleichsprodukten in folgender Hinsicht wesentlich überlegen:

1. es erfolgt eine rasche Wiederauflösung;

2. das Präparat hat eine hohe spezifische Aktivität;

3. das Präparat hat einen sehr niedrigen Fibrinogengehalt, und

4. der Gehalt an Prothrombin-Komplex ist niedrig.

In F i g. 1 und 2 sind die Ergebnisse von in vitro Versuchen der Wirkung des Präparats der Erfindung bei einem an Faktor VIII armen Plasma erläutert

F i g. 1 zeigt die Wirkung des Präparats der Erfindung (Conco-eight) auf die Gerinnungsfähigkeit von Plasma eines Patienten mit Hämophilie A, bestimmt durch Thrombelastographie. In Fig. 1 zeigt Test Nr. 1 ein normales Muster und Nr. 2 das Muster eines an schwererer Hämophilie A erkrankten Patienten mit Faktor VIII Mangel. Der Gehalt an Faktor VIII im Plasma beträgt weniger als 1% des Normalwertes. Nach

Gabe einer ausreichenden Dosis Conco-ei^it zur Erzielung eines lOprozentigen Faktor VIII-Anstiegs "zeigt sich eine beträchtliche Verbesserung des Thrombelastogramms, was aus Test Nr. 3 hervorgeht, während die Verabreichung von Conco-eight zur Erzielung eines lOOprozentigen Faktor VIII-Anstiegs das Thrombelastogramm das in Nr. 4 angegebene einwandfreie Muster ergib L

Fig.2 zeigt die Wirkung von Conco-eight auf die Gerinnungsfähigkeit von Plasma eines Patienten mit Hämophilie A, bestimmt durch die partielle Thromboplastin Zeit (PTT). Bei einem Faktor VIII-Anstieg des Hämophilie Α-Plasmas auf einen Wert von 5% des Normalwertes liegen 3 von 8 Fällen innerhalb des Normalbereichs. Bei einer Erhöhung auf 10% des Normaiweries liegen sämtliche Fäiie im normalen Gerinnungszeitbereich.

Aus den Figuren ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäß hergestellte Faktor VIII Präparat die Gerinnungs-

fähigkcit von Hämophilie A-FIasma und die partielle Thromboplastin-Zeil erheblich verbessern.

Das erfindungsgemäßc Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem Faktor VIII hat folgende Vorzüge:

(1) Durch die Verwendung von DEAE-Dextrati läßt sich der Prothrombin-Komplex aus dem eingesetzten humanen Plasma oder Plasmafraklionen in einer Menge von mindestens 95% abtrennen. Die Abtrennung ist wesentlich höher als bei der Behandlung mit Aluminiumhydroxid, bei der huf 80% des Prothrombin-Komplexcs abgetrennt werden;

(2) bei der Behandlung mit DEAE-Dextran beträgt der Verlust an Faktor VIII nur 10 bis 15%, wenn als Ausgangsmaterial Plasma, die Colin-Fraktion 1 oder ein Kryopräzipitat eingesetzt werden. Dieser Verlustwert ist vergleichbar oder geringer als der \;„,l..„, A_n- Unt An- nol,or.rlliir,rr mil Atnminiilrohti-

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droxid eintritt. In diesem Falle beträgt der Verlust 8 bis 22%;

(3) bei der Behandlung von Plasma mit DEAE-Dextran wird der Prothrombin-Komplex vor der Abtrennung des Faktors VIII entfernt. Hierdurch wird die Stabilität und die Ausbeute an Faktor VIII erheblieh verbessert;

(4) im Gegensatz zu Aluminiumhydroxid bildet DEAE-Dextran kein Gel mit Citronensäure oder Citraten. Dies gestattet die Verwendung von Citratpuffer, der eine hohe Ausbeule zuläßt, zur Isolierung des Faktors VIII aus der Cohn-Fraktion I oder dem kryopräzipitat. Dies führt zu einer Ausbeuteverbesserung an Faktor Viii auf dieser Behandlungsstufe von etwa 10 bis 15%;

(5) aus den gleichen Gründen, wie vorstehend beschrieben, ist die Gefahr einer Verstopfung des Membranfilters durch Gelbildung vermieden, wodurch sich die Sterilfiltration erheblich vereinfacht;

(6) die Filtration verursacht daher keinen nennenswerten Verlust an Faktor VIII, und die Ausbeute an Faktor VIII ist erheblich verbessert;

(7) nach der Adsorption des Prothrombin-Komplexes kann aieser aus dem UhAt-üextran eiuiert werden. Dies gestattet die Abtrennung und Fraktionierung des Prothrombin-Komplexes.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen wird eine Prothrombin-Einheit definiert als die in 1 ml frischem gepooltem normalem Plasma vorhandene Aktivität, bestimmt nach der einstufigen Methode von Koller, Loeliger und Duckert, Acta Haemau Bd. 6(1951), S. 1. Eine Faktor VIII-Einheit ist definiert als Aktivität in 1 ml frischem gepooltem normalem Plasma, bestimmt nach der partiellen Thromboplastin-Zeit-Methode von Hard is ty und MacPherson, Thromb. Diath. Haemorrh, Bd. 7 (1962), S. 215. Die spezifische Aktivität des Faktors VIII ist die berechnete Aktivität von Faktor VIII in 1 mg Protein.

Beispiel 1

Liter frisches gefrorenes humanes Plasma (Gesamtprothrombin-Aktivität 1,3 χ IfJ⁶ Einheiten, Faktor VIII Gesamtaktivität lßxlO⁶ Einheiten) werden aufgetaut und gepoolL Sodann wird seine Temperatur auf 4° C, sein pH-Wert mit 0,1 η-Natronlauge auf 7,4 und seine elektrische Leitfähigkeit mit 1 molarer wäßriger Kochsalzlösung auf ΙΟΟΟΟμν/cm eingestellt. Hierauf wird das Plasma mit 23,8 kg (Trockengewicht 2 kg;

IO

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 1,53 mg/Einheit Prothrombin) DEAE-Sephadex® A-50 bei 4°C versetzt. Der Austauscher wird vorher gequollen Und mit 0,02rnolarem Citratpuffer (pH 7,0) gepuffert und dampfsterilisiert. Das Plasma wird mit dem DEAE-Dextrem etwa 60 Minuten unter Rühren behandelt. Hierauf wird das mit dem Prolhrombin-Komplex beladene DEAE-Dextran bei der gleichen Temperatur abgeschleudert. Die Abtrennung des Prolhrombin-Komplexes beträgt 96,5% und die Ausbeute an Faktor VIII 88,5%. Sodann wird das erhaltene Plasma bei 0 bis -2°C mit 53 volumenprozentigem Äthanol versetzt, bis die Endkonzentration an Äthanol im Plasma einen Wert von 4,5 Volumenprozent erreicht. Hierauf wird das Plasma zentrifugiert. Es werden 8,3 kg einer Faktor VIII-Fraktion in Form eines Kryoäthanolpräzipitats erhalten. Aus diesem Präzipitat wird der Faktor VIII in 150 Liter 0,02molarem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-0,01 molaren Natriumeitrat-Puffer (pH 7,4) extrahiert. Auf diese Weise wird eine rohe Lösung von Faktor VIII mit einer 25,4mal höheren spezifischen Aktivität als das eingesetzte Plasma in einer Ausbeute von 75,3%, bezogen auf das eingesetzte Plasma, erhalten. Sodann wird die rohe Lösung mit Polyäthylenglykol vom Molekulargewicht 4000 bis zu einer Konzentration von 4 Gewichtsprozent pro Volumen versetzt. Die entstandene Fällung des Fibrinogens wird abgetrennt. Der Faktor VIII enthaltende Überstand wird mit einer weiteren Menge Polyäthylenglykol vom Molekulargewicht 4000 versetzt, bis dessen Endkonzentration 14 Gewichtsprozent pro Volumen beträgt. Hierbei wird gereinigter Faktor VIII in Form eines Präzipitats erhalten. Das gereinigte Präzipitat wird mit einer geringen Menge einer l,8molaren Glykokoll-Lösung gewaschen, um restliches Polyäthylenglykol abzutrennen. Sodann wird das Präzipitat in 10 bis 15 ml pro 1 g feuchtes Präzipitat in einem 0,01 molaren Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-0,01 molaren Natriumcitrat-0,1 molaren Natriumchlorid-Puffer vom pH-Wert 7,4 gelöst. Es wird eine konzentrierte Faktor VIII Lösung mit etwa 30 Einhegen Faktor VIII pro ml erhalten. Die Lösung wird ciprilfiltriprt unrj in rinciAt*ijnCTCAinhpii»n unterteilt die gefriergetrocknet werden. Die getrockneten Faktor Vlll-Präparate werden in der gleichen Menge Wasser, wie sie vorher durch Gefriertrocknung entfernt wurde, wieder gelöst. Die erhaltene Lösung hat eine Aktivität von 25 bis 30 Einheiten pro ml und folgende Eigenschaften:

Spezifische Aktivität
von Faktor VIII
Fibrinogengehalt
Polyäthylenglykol-Gehalt
Isoagglutinin-Titer
HBs-Antigen und Anti-HBs-Antikörper

Aktiver Gerinnungsfaktor

3 Einheiten/mg Protein
0,048 mg/mg Protein
0,2 mg/ml
1 :32

negativ nach dem Hämagglutinations-Hemmtest und dem passiven Hämagglutinations-Test mindestens 24 Std, bestimmt durch die 1%-Fibrinogen-Gerinnungszeit.

Beispiel 2

1300 Liter frisches gefrorenes gepooltes humanes Plasma werden aufgetaut und bei 0 bis —2° C mit 5 Volumenprozent Äthanol versetzt Es wird eine Fraktion von Faktor VIII in Form eines Kryoäthanol-

präzipitats isoliert. Dieses Präzipitat wird in 130 Liter eines 0,02molaren Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-0,01 molaren Natriumcitrat-Puffers vom pH-Wert 7,0 eingetragen. Das Gemisch wird bei 25⁰C gerührt und sodann zentrifugiert. Als Überstand wird eine rohe Extraktlösung von Faktor VIII mit einer Prothrombin-Gesamtaktivität »on 40 000 Einheiten und einer Faktor Vlll-Gesamtaktivität Von 1,04 χ ΙΟ⁶ Einheiten erhalten. Die Temperatur der Lösung wird auf 4°C, ihr pH-Wert mit 0,1 η-Salzsäure auf 7,0 und ihre elektrische Leitfähigkeit mit ί molarer Kochsalzlösung auf 9000^iV/cm eingestellt, Sodann werden 450 g DEAE-Sephadex® A-25 Gel (40 g Trockengewicht, 1 mg/l·

i0

Einheit Prothrombin) eingetragen. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt. Danach wird das mit dem Prothrombin-Komplex beladene DEAE-Dextran abgeschleudert. Als Überstand wird eine Rohlösung von Faktor VIII erhalten, die praktisch frei von Prothrombin-Komplex ist. Die Ausbeute an Faktor VIII beträgt 63,5%, und die spezifische Aktivität ist 19,5mal höher als im eingesetzten Plasma. Danach wird aus der erhaltenen Rohlösung gemäß Beispiel 1 das Fibrinogen abgetrennt und der Faktor VIII konzentriert. Es wird ein hochgereinigtes Faktor Vlll-Präzipitat erhalten, das gemäß Beispiel 1 zu einem Konzentrat mit ähnlichen Eigenschaften verarbeitet wird.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

27 ο on Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem antihärnophilem Globulin A (Faktor VIII) aus frischem humanem Plasma durch Fällen der Faktor VIII enthaltenden Fraktion als Kryoäthanol-Präzipitat. Reinigen des Präzipitals mit Polyäthylenglykol und Trocknen des hochgereinigten Konzentrats, dadurch gekennzeichnet, daß man die humane Plasmafraktion, die sowohl den Prothrombin-KompIex als auch den Faktor VIII enthält, und einen pH-Wert von 6,8 bis 7,9 und eine Flüssigkeitstemperatur von O bis 10⁰C und eine elektrische Leitfähigkeit von 7000 bis 12 000μν/αη aufweist, mit einem schwach basischen Anionenaustauscher auf der Basis eines Dextrans mit Diäthylaminoäthylgruppen (DEAE-Dextran) in Mengen von 0,5 bis 3 mg (bezogen auf das Trockengewicht) DEAE-Dextran behandelt und den die Fraktion des Faktors VIII enthaltenden Oberstand vom Austauscher abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung mit dem DEAE-Dextran während eines Zeitraums von 10 bis 60 Minuten durchführt

3. Verfahren naeh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als DEAE-Dextran DEAE-Sephadex® A-50 oder A-25 verwendet.