DE2324717A1 - Verfahren zur verbesserung der ausbeute an antihaemophilem faktor a - Google Patents

Verfahren zur verbesserung der ausbeute an antihaemophilem faktor a

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Description

Dipl-lng. P. WIRTH · Dr. V. SCHMIED-KOWARZIK DIpL-Ing. G. DANNENBERG · Dr. P. WEINHOLD · Dr. D. GUDEL
281134 6 FRANKFURT AM MAIN
TELEFON (0611) ,J87014 GR. ESCHENHEIMER STRASSE 39
SK/SK H-335
Baxter Laboratories, Inc. Morton Grove, 111. 60053 / USA
Verfahren zur Verbessern^- der Ausbeate an Antihämophilerc Faktor A
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Kerrtellur:?·, eines Konzentrates aus Antihämophilem Faktor (AW, Faktor VIII). Sie bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur Verbesserung der Ausbeute an AEF aus Blutplasma und Plasmafraktionen.
Das Verfahren der Blutkoagulierung ist ein komplizierter biologischer Vor^ar.c und erfordert die Zusammenwirkung verschiedener, in normalem Gesamtblut auftretender Substanzen. Bekanntlich sind bei bestimmten Menschen bestimmte Faktoren, die mit dem Blutkoagulierungsmechanismus in Zusammenhang stehen, abwesend oder stark vermindert. So ist bekanntlich die klassische Hämophilie (Hämophilie A) eine Mangelerkrankung aufgrund der Abwesenheit von AHF (Faktor VIII). Patienten, die an angeborener Hämophilie, die als Hämophilie B bekannt ist, leiden, fehlt dem Blut die Plasmathromboplastinkomponente (PTC, Faktor IX). Verschiedene andere, für den Koagulierungsmechanismus wichtige Faktoren sind die Faktoren II, VII und X.
309850/1103
Bis vor wenigen Jahren bestand die Behandlung von Bluterpatienten in Transfusionen mit Gesamtblut oder Blutplasraa0 Die verbesserte medizinische Praxis fordert jedoch, daf3 man dem Patienten-, wenn möglich, nur solche Blutkomponenten verabreicht, an denen es ihm fehlt. Aufgrund der allgemeinen Knappheit anBlut ist es also vorteilhaft, dieses in verschiedene Komponenten zu fraktionieren, wodurch sie je nach Erfordernis für die Behandlung des Patienten verwendet werden können.
Es sind verschiedene Verfahren zum Fraktionieren von Blut und Blutplasma in seine getrennten Komponenten oder deren Konzentrate bekannt. Besonders zu erwähnen ist die /.rbeit von Edwin Cohn und seinen Mitarbeitern an der Harvard Universität' bei der Entwicklung des Alkoholfraktionierungsverfahrens. Mit besonderem Bezug auf die Produktion von AKi?' zeigen die neueren US-Patentschriften 3 631 018 und 3 652 530 verbesserte Verfahren zur Erzielung eines hochgradig reinen Konzentrates dieses Faktors.
Bei der Forschungsarbeit von Wagner, Thelin, Brinkhous und anderen, an der AHF-Produktion interessierten Gruppen wurde gefunden, daß die Anwesenheit von von Prothrombin- (Faktor II) und seines assoziierten Komplexes von Faktoren
nachteilig war für die liuigzeit,ige ,und kurzzeitige Stabilität des Faktors VIIIi Die übliche Behandlung zur Umgehung dieses Problems bestand in der Entfernung des Prothrombin-komplexes mit verschiedenen Mitteln; wie Aluminiumhydroxid, Magnesiumhydroxid, Bariumcarbonat, Bariumsulfat, Rivanol (6,9-Diamino-2-äthoxyacridinlactat), IRC-50 Ionenaustauscherharz ("XS-64—Rivanol") und Glycinäthylester.
Obgleich die obigen Mittel gewöhnlich wirksam sind, wurdenfoei ihrer Verwendung in klinischem Maßstab verschiedene ernste Nachteile offensichtlich. Der Faktor VIIBiird tatsächlich durch Verwendung dieser Mittel stabilisiert, da die Pro- thrombinentfernung keine Throrabinbildung zuläßt. Thrombin ist hauptsächlich verantwortlich für die Zersetzung von Faktor VIII (vgl. Kieker "Throm.Diath.
309850/1103
Haemorrhagica", Bd. 17, Seite 381 (196?) und Penick und Brinkhous "Americ. J.Med.Sciences", Bd. 232, Seite kj\ (1956)). So wurde bei der Herstellung von Faktor VIII mit aliphatischen Aminosäuren gemäß der ursprünglichen Arbeit von Wagner et al Aluminiumhydroxid verwendet, um (1) die Zersetzung von Faktor VIII während der angewendeten Konzentrationsbehandlungen zu verringern, und (2) die langzeitige Stabilität sowohl nach Lyophilisierung und Rekonstituiertzu erhöhen (vgl. "The Hemophilias", K.M. Brinkhous, Ed. International Symposium, Washington, D.C., Univ. von North Carolina Press, Seite 81 (19&+)). Der Einschluß von Spurenmengen von Aluminium wurde jedoch klinisch als unsicher eingesehen .
Seit der Cryoausfällung ("cryoprecipitation") und einstufigen Herstellung relativ hoch potenter Konzentrate scheint die Verwendung jeglicher Maßnahnen der ProthromMnkoiriplexentfernung umgangen zu sein (vgl. Pool et al "Nature", Bd. 203, Seite 312 (196;O). In der Fraxis wurde jedoch gefunden, daß eine höbe Variablität von bis zu oder nehr als 50 % Variablität der berichteten mittleren Vierte in den AHF Ausbeuten bestand.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung eines Konzentrates aus Antihämophilem Faktor (AHF, Faktor VIII).
Ein weiteres Ziel ist die Schaffung eines Verfahrens zur Verbesserung der Ausbeute an AHF aus Blutplasma und Haaaafraktionen.
ErfindungsgemäS wird allgemein Heparin zu dem wässrigen, das Blutplasma oder die Plasmafraktion enthaltenden Medium zugegeben, das dann zur Erzielung eines Konzentrates von AHF fraktioniert wird.
309850/1103 BAD OFUGINAl,
Die vorliegende Erfindung wird durch die beiliegende Zeichnung veranschaulicht. Sie stellt ein Diagramm des Blutgerinnungsmechanismus dar. Die römischen Zahlen stehen für die verschiedenen Blutgerinnungsfaktoren. Dieses Diagram-η ist selbstverständlich nur eine Arbeitshypothese auf der Basis des derzeitigen V/issens, wobei die vorliegende Erfindung an diese Hypothese nicht gebunden oder durch die beschränkt wird.
Wie oben erwähnt, tritt in der Praxis bei der Herstellung von AKF eir.o
auf
hohe Variabilität dor AKF Ausbeute/. Je lär.rer der Konzentrationsvorgang T.;rr, umso geringer war die AHF Ausbeute. Die Ausbeutenverlucte wurden «twas verbessert durch äußerste Sorgfalt bei der Zntfernung der Blutzellcn. Diese Ergebnisse können mit Eozug auf das Gerinnunnsdiagramm der beiliegenden Zeichnung erklärt werden. Von besonderem Interesse ist der "feedbacl'J'-MechaiiisN.m der durch die gestrichelten Linien dargestellt wird; diese zeigen die V.'ir::1;'!,: von Faktor Ha (Thrombin) auf Faktor V (Proaccelerin) und Faktor VIII (AHr'). Die Wirkung besteht aus zwei Teilen: die Wirkungen von VIII und V werden (1) zuerst durch eine geänderte tertiäre Struktur verbessert und dann (2) zur Unterbrechung eines übermäßigen Gerinnens abgebaut, das zu Zirkulationsstörungen führen könnte.
Aus dem Gerinnungsdiagramm geht hervor, daß die Entfernung der Faktoren Ur VII, X und IX (Prothrombinkomplex) den "feedback"- oder Umkehr-Mechanismus eliminieren würde, da kein Faktor II zur Bildung von Ha vorliegen würde." Auch die erfin dungsgemäße Feststellung, daß zellfreies Plasma eine Konsentration zu höheren Ausbeuten an AHF erlaubt, ist aus dem Gerinnungsdiagramm erklärlich, da kein Thromboplastin gebildet wird und der Beginn der Gerinnung daher nicht einsetzen kann.
309850/1103 BAO ORIGINAL
Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß die die Ausbeute an AHF bei der Herstellung in großem Maßstab durch Zugabe von Heparin während der Fraktionierung verbessert werden kann. Erflndungsgemäß wurde festgestellt, daß im Gegensatz zur bisherigen Praxis ohne Verwendung von Heparin bei seiner Verwendung (1) die Zellverunreinigunf;, z.B. aus dem Fraktionierungsverfahren, nicht zu niedrigeren Ausbeuten führt, (2) die Gewebeverunreinigung, wie sie z.B. wahrend'der intravenösen Verabreichung erfolrt, keine niedrigeren Ausbeuten liefert, (3) eine längere Behan^lungszeit die Ausbeute nicht vermindert ur.d (^) die rekonstituierte Stabilität gegenüber nicht mit Heparin behandelten Plasmakonzentraten mindestens in einer Größenordnung des etwa "jO-Fa.ch^n erhöht wird. Erfindungsgenäß ist es daher nicht nötig, den Prothrcmbinkonplex zur Erzielung einer Stabilität der Faktor VIII Konzentrate zu entfernen, und die üblichen Verluste der Ausbeute aus Zeil- und Gewebeverunreinigung oder längere Behandlangszeiten werden überwunden.
Die erfindungsgemäß während der Fraktionierung von AHF verwendete Heparinmenge kann in ziemlich weiten Grenzen variieren. Es wurde gefunden, daß eine Konzentration von etwa einer Einheit Heparin pro ecm Plasmalösung oder -fraktion etwa optimal ist. Konzentrationen über mehr als etwa 10 Einheiten pro ccn sollten als unnötig und gefährlich vermieden werden. Es sind jedoch auch Konzentrationen von etwa 0,01 Einheit pro ecm wirksam. Der bevorzugte Bereich liegt zwischen etwa O1Ol-Io Einheiten pro ecm. Eine Einheit Heparin wird in der vorliegenden Anmeldung als eine U.S.P. (United States Pharmacopoeia) Einheit definiert. Die U.S.P. Einheit an Heparin ist die Menge, die 1,0 ecm zitratisiertes Schafsplasma· 1 Stunde am Gerinnen hindert, nachdem 0,2 ecm einer 1:100 CaCL, Lösung zugegeben wurde. Die hier verwendete Bezeichnung "Heparin" umfaßt auch das Natriumsalz vcn Heparin, das aufgrund seiner Wasserlöslichkeit bevorzugt wird.
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232A717
3ie vorliegende Erfindung hat sich bei verschiedenen Verfahren zur Herstellung von AHF Konzentraten als zweckmäßig erwiesen und ist auf jedes Plasma oder jede Plasmafraktion anwendbar, die AKF in Mischung mit irgendeinem der FrothrombinkoTTiplexfaktoren enthält, So wurde sie auf Verfahren zur Fraktionierung von AHF (1) aus Plasma durch Glycinausfällung, (2) aus Cryopräzipitat durch Glycinausfällu.i/% (3) aus Cryopräzipitat durch Fulya.thylenglyr.r,lausfällung, (4) aus Cryoprüzipitat durch Polyäthylenglykol- und Glycinausfällung, (5) aus Cryopräzipitat, (6) au.; Plasma und (7) aus Cryopräzipitat durch Polyäthylenr.lykol- unl 11yeir:;v.j;sl"a.llun·* und anschließende "Ecteola"-Chromatographie an^evenaet.
Ein bevorzugtes Verfahren iur Herstellt .ig von AHi', auf welches die vorliegende Erfindung anwendbar ist, ist das in der US-Patentschrift 3 63I 018 beschriebene Verfahren, in welche-i Polyäthylenglytoi (PKG) und Glycin zur. Fraktionieren eines Cryopräzipitaton eines AHF Konzentrates verwendet werden. So wird in Beispiel k der genannten Patentschrift in der Stufe, in welcher das Cryopräzipitat in glycincitrabierter Kochsalzlösung gelöst wird, etwa eine Einheit Heparin pro ecm Lösung zugefügt. Nach der Ausfällung mit Polyäthylenglykol bei 10-$iger Konzentration wird dor erneut gelöste Niederschlag wiederum auf einen Gehalt von etwa einer Einheit Heparin pro ecm Lösung aufgrund des Verlustes an Heparin während der Fraktionierung mit 10-/6igen PoIyäthylenglykol behandelt. Das Heparin wird zweckmäßig durch Einverleibung in die citratierte oder glycincitratierte Kochsalzlösung zugefügt, die zum Lösen der jeweiligen Niederschlage verwendet wird.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie su beschränken.
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Beispiel 1
In folgender Weiae wurde ein stabiles AHF Konzentrat von Menschen in hoher Ausbeute und von hoher Potenz erhalten:
Reagenzien
citratierte Kochsalzlösung - 1 Teil 0,1-molares Natriumeitrat zu ^ Gew.-Teilen 0,9-#iger Kochsalzlösung
glycincitratierte Kochsalzlösung - zur oben hergestellten citratierten Kochsalzlösung wurde ausreichend Glycin sugefürt, um die Lösung bezüglich Glycin 0,1 molar zu machen
gepuffertes Waschwasser - zu dest. Wasser wurde 1/100 Volumen Gepuffertes Citrat zugefügt,· hergestellt durch Einstellen von 0,5 molarem Natriuncitrat mit 0,5 molarer Zitronensäure auf einen pH-Wert von 6,83
Heparin - es wurde ein Material von U.S. Pharnacopoeia-Reinheit verwendet ("Lipo-Kepin" - wässrige Natriumheparininjektion).
Essigsäure - hergestellt in 1,0 normaler und 0,1 normaler wässriger Lösung
Glycin - hergestellt ind 1,3 und 1,8 molarer wässriger Lösung. Verfahren
Aus dem Spenderzentrum wurde gefrorenes nerischliches Blutplasma (bei unterhalb A-C.) geliefert. Das Plasma wurde in Pfaudier-Kesseln gepoolt und bei einer Temperatur von -200C. bis -M)°C» durch kontinuierliche Fließ- oder Becherzentrifugierung zentrifugiert. Zum Cryopräzipitat wurde glycincitratierte Kochsalzlösung, die eine Einheit Heparin pro ecm enthielt, zugefügt, wobei die Menge ein Zehntel der Menge des im Cryopräzipitat enthaltenen Plasma betrug.
Das Lösen erfolgte durch Mischen von Cryopräzipitat und güycincitratierter Kochsalzlösung in einer warmen Umgebung (normaler Zimmertemperatur, jedoch nicht über 30°C.
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Das gelöste Cryopräzipitat wurde mit 0,1 normaler Essigsäure auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. Zur Lösung wurde Polyäthylenglykol 4000 (durchschnittliches Molekulargewicht etwa 4000) bis zu einer PnG Konzentration von etwa 3,5 % zugefügt. Die Mischung wurde 10 kinuten bei Zimmertemperatur mild bewegt und dann 15 Minuten bei 5000 Umdr./min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und mit 0,1 normalem Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 6,88 eingestellt. Zur Lösung wurde weiteres Polyäthylenglykol 4000 bis zu einer endgültigen PEG Konzentration von etwa 10 '£ zugefügt. Die Mischung wurde bei Zimmertemperatur 30 Minuten mild bewegt und dann, eine halbe Stund« bei 5000 Umdr./min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und verworfen. Der Niederschlag wurde in haltern V.:asser (2 C.) gewaschen, dann erfolgte 5 Minuten bei 5000 Umdr./nin und einer Temperatur von -4 C. ein Rotationswaschon. Die überstäien.io Flüssigkeit wurde dekantiert und der Niederschlag erneut in glyincitratierter Kochsalzlciiunft, die eine Einheit Heparin pro ecm enthielt, pelöst. Wiederum ist die Men~e des zur erneuten Lösung verwendeten Lösungsmittels etwa ein Zehntel des Plasmasvolumens, das den Niederschlag darstellt.
Der erneut gelöste Niederschlag wurde mit 0,1 normaler PJssigsäure auf einen pH-Wert von 6,88 eingestellt und erneut mit wässrigem Glycin einer Molarität von 1,8 ausgefällt. Während dieser Ausfällungsstufe wurde ausreichend Glycin eugefügt, um die Mischung bezüglich Glycin 1,8 molar zu machen. Die Mischung wurde 4·5-6θ Minuten mild bei einer Temperatur von 2-1O0C. bewegt und dann durch kontinuierliches· Fließ- oder Becherzentrifugieren zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde gesammelt und vorsichtig mit gepuffertem Waschw&sser gewaschen und erneut in citratierter Kochsalzlösung gelöst. Die Lösung wurde durch Filtration unte* Verwendung eines 293 Jwn Milliporen-Filters
3QS85Q/t1G3
- 9 (verwendete Membrane: 1,2 Micron, 0,^5 Micron und 0,3 Micron) geklärt.
c>
Dann wurde das flüssige Produkt durch "shell"-Einfrieren (-60 C.) und mindestens 3-stündiges Lagern in einer Blitzeinfriervorrichtung (-20 C. bis -30°C.) eingefroren.
Das obige Verfahren wurde wiederholt, wobei kein Heparin zur glycincitratierten Kochsalzlösung zugefügt wurde, die zum Lösen des anfänglichen Cryopräzipitates oder' zum Lösen des Niederschlages aus der Fraktionierung mit 10- ifjcn Potyäthylenglykol oder an irgendeinem anderen Punkt während cior Fraktionierung verwendet wurde.
wurden
Die obigen Verfahren/sowohl mit als auch ohne Heparinzugabe wurden vrie.'-rholt.
Die folgende Tabelle gibt die Ergebnisse, aus den vier Fraktioniorungsver:..uchon: Dabei gibt die Spalte "Cryo Ausbeute; f>" die aus dem Ausgann^plasma gewonnene AHF Menge an; die Spalte "Endproduktausbeute" gibt die endgültige AHF Ausbeute an; die Spalte "$> Rückgewinnung" gibt die aus der Cryo-Stufe gewonnene Menge AHF an (Endproduktausbeute : Cryοausbeute).
- AHF Ausbeute
angew.Verfahren Cryo Ausbeute Endprodukt- ' Rückgewinnung Gesamtvolumen
1» ausbeute; £ # d.Ausganrs-
plasmas; 1
ohne Heprain 35 13,6 38 6000
mit Heparin 35 17 ^9 300
ohne Heparin 32 12,5 39 6000
ait Heparin 33 17 52 300
Aue der obigen Tabelle geht hervor, daß die endgültige AHF Ausbeute bei Vervendung von Heparin 17 £ betrug, während sie ohne Heparin durchschnittlich arischen 12,5 und 13,6 £ lag. Daher erhöhte die Heparinzugabe die Ausbeute gegenüber dem Verfahren ohne Heparin um 25-35 %. Wurde, die endgültige AHF Aus beute durch die Cryopräsipitat AHF Ausbeute dividiert, ist ersichtlich, daß
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sich die Wirksamkeit des Verfahren von 38 und 39 # ohne Heparinzugabe auf 4-9 und 52 $ mit der Heparinzugabe verbessert hatte.
Wurde im obigen Beispiel Polyäthylenglykol 6OOO für eine äquivalente Menge Polyäthylenglykol 4000 ersetzt, dann erhielt man praktisch ähnliche Ergebnisse.
Beispiel 2
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde bis zur Stufe des erneuten Suspendieren des anfänglichen Cryopräzipitates in der glyincitratierten JCochsalzlösung mit und ohne Heparin in der Lösung wiederholt· Die endgültige AKF Ausbeute in diesen beiden Cryopräzipitatkonzentraten von AHF betrug ohne Verwendung von Heparin 34- '% und mit Heparinverwendung"4-1 $. Dies entsprach einer Verbesse» nng der Ausbeute von 21 $,
Be i s ρ i e 1 jj " . .
Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, wobei jedoch die Cyropräzipitatkonzentrate mit und ohne Heparin lyophiliert, dann mit Wasser rekonstituiert und bei Zimmertemperatur (etwa 25°C.)2k Stunden stehen gelassen wurden. Die mit Heparin behandelte Probe bewahrte 98 $> ihrer anfänglichen AHF Aktivität vor dem Stehenlassen, während die nicht-heparinisierte Probe nur 72 $ ihrer anfänglichen AHF Aktivität bewahrte.
30 98 5 0/1 1 0 3

Claims (1)

  1. - li -
    Pat en tansprüche
    (ί'.- Verfahren zur Verbesserung der aus Blutplasma und Plasnafraktionen erhaltenen Ausbeute an Antihämophilem Faktor A (Faktor VIII, AiIF), dadurch gekennzeichnet, daß man dem Plasma oder der Plasmafraktion etwa 0,01-10 Einheiten Heparin pro ecm Lösung zufügt.
    2,- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmafraktion ein Cryopräzipitatkonzentrat von AHF,ist.
    3.- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmafraktion ein Cryopräzipitatkonzentrat vcm MiF ist, das sowohl mit Polyäthylenglykol als ai:ch mit Glycin weiter J/r.':>:tioniert v/ird.
    ')-.- Verfahren nach Anspruch '}, dadurch ge kenn zo5 ebnet, daß das Polyäthylenflyl-ol ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa kOOO hat.
    5·- Verfahre?! nach Anspruch 3» dadurch gekenn ze lehnet, da'-! das Cryopräzipitatkonzentrat mit etwa 3—**■ h Po2,yäthyleng^'tol .ausgefällt, die überstehende Flüssigkeit mit etwa 10 h Polyäthj'lcnglykol ausgefällt und das erhaltene überstehende Material dann mit Glycin fraktioniert wird.
    6.- Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyäthylenglykol ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa ^K)OO hat.
    7,- Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß das Glycin eine molarität von etwa 1,8 hat.
    8.- Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß das Polyäthylenglykol ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 1K)OO und das Glycin eine Molarität von etwa 1,8 hat.
    Der Patentanwalt:
    399850/1103 BADOfUGlNAL
    Leerseite
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