DE60034445T2

DE60034445T2 - Gefriergetrocknete hgf-präparationen

Info

Publication number: DE60034445T2
Application number: DE60034445T
Authority: DE
Inventors: M. Kashima-gun CHIBA
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1999-05-31
Filing date: 2000-05-31
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2020-06-01
Also published as: KR100767473B1; CA2375779A1; EP1180368A4; ES2408784T3; EP1180368B1; AU5103200A; HK1044471A1; ATE359809T1; KR20020064141A; CN1367703A; EP1180368A1; WO2000072873A1; JP4635340B2; CN100448482C; DE60034445D1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein lyophilisiertes Präparat, das einen Hepatozytenwachstumsfaktor umfasst.
Technischer Hintergrund
Hepatozytenwachstumsfaktor (im Folgenden in der Beschreibung gelegentlich als "HGF" abgekürzt) ist ein Protein, das proliferierende Wirkung auf Hepatozyten aufweist, und es ist bekannt, dass es in verschiedenen tierischen Spezies vorhanden ist. Es sind HGFs mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen berichtet. Der humane Hepatozytenwachstumsfaktor (im Folgenden in der Beschreibung gelegentlich als "hHGF" abgekürzt) wurde im Plasma eines Patienten mit fulminanter Hepatitis von Daikuhara et al. gefunden (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 63-22526 ). Die Aminosäuresequenz des hHGF-Proteins und die für das Protein codierende Gensequenz (cDNA) wurden von Kitamura et al. gefunden (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 3-72883 ). Über ein Verfahren zur Herstellung des hHGF-Proteins und einer Transformante unter Verwendung dieser cDNA wurde berichtet (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 3-285693 ). Unter diesen Umständen wird die Massenherstellung des hHGF-Proteins möglich, und seine Anwendung als Medikament ist zu erwarten.
hHGF ist eine Art eines Glycoproteins, und dieses ist ein Heterodimer und besteht aus einer α-Untereinheit mit einem Molekulargewicht von etwa 80 bis 90 kDa in nicht reduziertem Zustand oder etwa 52 bis 56 kDa in reduziertem Zustand und einer β-Untereinheit mit einem Molekulargewicht von etwa 30 bis 36 kDa. Neben der Wirkung als Hepatozytenwachstumsfaktor hat hHGF verschie dene biologische Wirkungen wie z.B. eine Streufaktor-Wirkung (SF), eine Wirkung als Wachstumsfaktor für die Nierentubulusepithelzellen, eine Wirkung als Reparaturfaktor für geschädigtes Gewebe und eine Wirkung als Wachstumsfaktor für Gefäßendothelzellen, und man erwartet eine Entwicklung des Proteins in Form von Medikamenten zur therapeutischen Behandlung von Leberkrankheiten, Nierenkrankheiten, Kranialnervstörungen, als Haarwuchs fördernde Mittel, Wundheilmittel, Antitumortherapeutika und dergleichen.
Pharmazeutische Präparate von HGF sind in WO 90/10651 und in den japanischen ungeprüften Patentveröffentlichungen Nr. 6-247872 und 9-25241 beschrieben. Die oben genannte WO 90/10651 offenbart ein wässriges Präparat von HGF vom Deletionstyp (TCF), in dem fünf Aminosäurereste von HGF deletiert sind, und die Veröffentlichung lehrt, dass TCF durch Albumin, Humanserum, Gelatine, Sorbit, Mannit, Xylit und dergleichen in einer wässrigen Lösung stabilisiert wird. Die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 6-247872 offenbart eine Injektion, die TCF in einer hohen Konzentration von 5 bis 10 mg/ml enthält und in der eine basische Aminosäure oder dergleichen neben TCF vorliegt. Diese Veröffentlichung erwähnt die Löslichkeit von TCF in einer wässrigen Lösung und offenbart eine wässrige Lösung, die TCF in hoher Konzentration enthält. Die basische Aminosäure (Lysin, Arginin) wird als Lösungsvermittler in der Injektion verwendet.
Bei dem wässrigen HGF-Präparat nimmt jedoch die Löslichkeit von HGF bei neutralem pH rasch ab, und es besteht das Problem fortschreitender Aggregation, Trübung und Gelierung beim mehrtägigen Aufbewahren bei niedriger Temperatur oder Raumtemperatur. Zudem hat das Präparat geringe physikochemische Stabilität und bildet beispielsweise Abbauprodukte und Aggregate, und es besitzt auch als pharmazeutisches Präparat geringe Stabilität, wobei sich beispielsweise die biologische Wirkung verringert. Vom Gesichtspunkt der biologischen Aktivität ist das Präparat daher nicht für eine lange Lagerung geeignet. Des Weiteren kann das wässrige HGF-Präparat aufgrund des Schäumens oder dergleichen beim Schütteln und Rühren aggregieren, trüb werden und gelieren, was zu einer Abnahme der Qualität des pharmazeutischen Präparats und der Arzneimittel-Wirksamkeit bei Langzeitlagerung, Verteilung und Transport führt. Daher ist ein lyophilisiertes Präparat als HGF-Präparat bevorzugt.
Die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 9-25241 offenbart ein lyophilisiertes Präparat von HGF (TCF). Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung lehrt diese Patentveröffentlichung jedoch, dass ein lyophilisiertes Präparat, umfassend HGF (TCF) in hoher Konzentration, das über einen langen Zeitraum stabil ist, bereitgestellt werden kann durch die Verwendung von Citrat als Puffermittel und Glycin, Alanin, Sorbit, Mannit oder dergleichen als Stabilisierungsmittel. Aufgrund der Citronensäure, die als Puffermittel im lyophilisierten Präparat verwendet wird, hat das wiedergelöste Präparat jedoch einen sauren pH. Zudem hat die resultierende Lösung einen hohen osmotischen Druck, der Probleme dahingehend verursacht, dass Schmerzen bei Verabreichung durch Injektion oder entzündliche Reaktionen und Hämolyse an der Verabreichungsstelle und dergleichen auftreten.
HGF ist eine Substanz mit außerordentlich starker physiologischer Wirkung, und bei Verwendung als Medikament muss die Substanz im klinischen Sektor als pharmazeutisches Präparat mit sehr niedriger Konzentration bereitgestellt werden. Die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung angestellten Untersuchungen zeigten, dass bei dem in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 9-25241 beschriebenen lyophilisierten HGF(TCF)-Präparat, das Glycin oder Alanin umfasst, nur wenig Aggregatbildung während der Lagerung beobachtet wurde, wenn das lyophilisierte Präparat aus einer wässrigen Lösung hergestellt wurde, die HGF in hoher Konzentration enthielt, wogegen Aggregatbildung während der Lagerung beobachtet wurde, wenn ein Präparat in Gegenwart von Glycin oder Alanin durch Lyophilisieren einer wässrigen Lösung hergestellt wurde, die HGF mit niedriger Konzentration enthielt, die für die klinische Anwendung erwünscht ist (im Allgemeinen ist HGF in einer Konzentration von weniger als 5 mg/ml enthalten, zum Beispiel etwa 2 mg/ml). Wie in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 9-25241 beschrieben, ist Glycin oder Alanin demgemäß als Stabilisierungsmittel brauchbar, wenn HGF in hoher Konzentration lyophilisiert wird, doch sind die Aminosäuren nicht ausreichend als Stabilisierungsmittel, wenn HGF in niedriger Konzentration lyophilisiert wird. Erwünscht ist daher die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung eines lyophilisierten Präparats, das durch Verwendung einer wässrigen Lösung, die HGF in niedriger Konzentration enthält, kaum Aggregate bildet und ausgezeichnete Stabilität bei langer Lagerung aufweist.
Offenbarung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines lyophilisierten HGF-Präparats, das eine wässrige Lösung bilden kann, die HGF in niedriger Konzentration enthält. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist insbesondere die Bereitstellung eines lyophilisierten HGF-Präparats, das ausgezeichnete Lagerstabilität aufweist und nach erneutem Lösen frei ist von Aggregation, Trübung und Gelierung. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines lyophilisierten Präparats, das günstige pelletbildende Eigenschaften während der Lyophilisierung und ausgezeichnete Wiederlöslichkeit aufweist. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Präparats, das einen pH und ein Verhältnis des osmotischem Drucks aufweist, die für die Injektion erwünscht sind.
Zur Lösung der obigen Aufgaben führten die Erfinder der vorliegenden Erfindung verschiedene Untersuchungen durch. Im Ergebnis fanden sie, dass durch Lyophilisierung einer Lösung, die HGF in einer Konzentration von weniger als 5 mg/ml enthält, in Gegenwart von Stabilisierungsmittel, Natriumchlorid und Puffermittel ein lyophilisiertes Präparat mit günstigen pelletbildenden Eigenschaften, günstiger Löslichkeit und Stabilität bei langer Lagerung erfolgreich erzeugt wurde, und dass bei der Herstellung des lyophilisierten Präparats, wie auch wäh rend der Lagerung des Präparats keine Aggregate gebildet wurden und das lyophilisierte Präparat außerordentlich hohe Stabilität hatte. Des Weiteren fanden sie, dass eine aus dem lyophilisierten Präparat hergestellte wässrige Lösung frei von Aggregation, Trübung, Gelierung oder dergleichen ist und die wässrige Lösung, die die geringe HGF-Konzentration enthält, hinreichende und erfolgreiche klinische Wirksamkeit aufweist. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage der obigen Befunde erreicht.
Die vorliegende Erfindung macht somit ein lyophilisiertes Präparat verfügbar, umfassend einen Hepatozytenwachstumsfaktor, ein Stabilisierungsmittel, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin, Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure und einem pharmakologisch annehmbaren Salz derselben zur Verhinderung der Bildung von Aggregaten des Hepatozytenwachstumsfaktors, Natriumchlorid und ein Puffermittel, dadurch gekennzeichnet, dass das lyophilisierte Präparat aus einer wässrigen Lösung hergestellt wird, die den Hepatozytenwachstumsfaktor in einer Konzentration von weniger als 5 mg/ml enthält, und/oder das lyophilisierte Präparat zur Herstellung einer den Hepatozytenwachstumsfaktor in einer Konzentration von weniger als 5 mg/ml enthaltenden wässrigen Lösung durch Wiederauflösen verwendet wird.
Diese lyophilisierten HGF-Präparate ergeben keine HGF-Aggregate während der Lyophilisierung und bei langer Lagerung nach der Lyophilisierung und haben ausgezeichnete Stabilität. Zudem weisen sie die charakteristischen Merkmale auf, dass keine Aggregation, Trübung, Gelierung oder dergleichen in einer wässrigen Lösung auftritt, die aus dem lyophilisierten Präparat hergestellt wird, und selbst nach Lagerung der wässrigen Lösung werden kaum Aggregate gebildet.
Normalerweise ist es bevorzugt, dass eine wässrige Lösung, die zur Herstellung eines lyophilisierten Präparats in einem Fläschchen verwendet wird, und eine wässrige Lösung, die durch Lösen des resultierenden lyophilisierten Präparats im Fläschchen hergestellt wird, die gleiche Konzentration an Wirkstoff enthalten.
Daher kann das Präparat der vorliegenden Erfindung vorzugsweise durch Lyophilisieren einer wässrigen Lösung, die HGF in einer Konzentration von weniger als 5 mg/ml enthält, in einem Fläschchen oder einer Ampulle hergestellt werden. Bei dem Präparat der vorliegenden Erfindung liegt zudem der pH der wässrigen Lösung vor der Lyophilisierung und/oder der wässrigen Lösung, die nach erneutem Lösen erhalten wird, vorzugsweise im Bereich von 5 bis 6,5, wie es für Injektionen erwünscht ist. Bei dem Präparat der vorliegenden Erfindung hat die wässrige Lösung vor der Lyophilisierung und/oder die wässrige Lösung, die nach erneutem Lösen erhalten wird, zudem vorzugsweise einen osmotischen Druck, der für eine Injektion erwünscht ist, zum Beispiel nahezu isotonisch in lebenden Körpern oder ein Verhältnis des osmotischen Drucks, das für eine Injektion annehmbar ist (1 bis 2).
Gemäß den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird folgendes bereitgestellt: das oben genannte lyophilisierte HGF-Präparat, wobei das Stabilisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin, Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure und pharmakologisch annehmbaren Salzen derselben; das oben genannte lyophilisierte HGF-Präparat, wobei das Stabilisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin, Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure und pharmakologisch annehmbaren Salzen derselben; das oben genannte lyophilisierte HGF-Präparat, wobei das Stabilisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin, Histidin und pharmakologisch annehmbaren Salzen derselben; und das oben genannte lyophilisierte HGF-Präparat, wobei das Stabilisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin und pharmakologisch annehmbaren Salzen derselben. Diese Stabilisierungsmittel werden dem Präparat vorzugsweise in einer Menge zugesetzt, die ausreicht, die Bildung von HGF-Aggregaten während der Lyophilisierung und/oder bei der Lagerung nach der Lyophilisierung zu verhindern.
Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird zudem folgendes bereitgestellt: das oben genannte lyophilisierte HGF-Präparat, wobei das Puffermittel ein Phosphorsäure-Salz ist; das oben genannte lyophilisierte HGF-Präparat, das des Weiteren ein oberflächenaktives Mittel enthält; das oben genannte lyophilisierte HGF-Präparat, wobei das oberflächenaktive Mittel ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel ist; und das oben genannte lyophilisierte Präparat, wobei das nichtionische oberflächenaktive Mittel ein Polyoxyethylenether-Tensid ist.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Stabilisierungsmittel für HGF bereitgestellt, das zur Lyophilisierung einer wässrigen Lösung verwendet wird, die HGF in einer Konzentration von weniger als 5 mg/ml enthält, und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin, Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure und pharmakologisch annehmbaren Salzen derselben. Bevorzugte Stabilisierungsmittel sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin, Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure und pharmakologisch annehmbaren Salzen derselben. Besonders bevorzugte Stabilisierungsmittel sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin und pharmakologisch annehmbaren Salzen derselben. Diese Stabilisierungsmittel können die Bildung von HGF-Aggregaten während der Lyophilisierung einer wässrigen Lösung, die HGF in einer Konzentration von weniger als 5 mg/ml enthält, und während der Lagerung nach der Lyophilisierung verhindern.
Die vorliegende Erfindung macht zudem ein lyophilisiertes HGF-Präparat verfügbar, das erhalten werden kann durch Lyophilisieren einer wässrigen Lösung, die das oben genannte Stabilisierungsmittel und HGF in einer Konzentration von weniger als 5 mg/ml enthält, und das zur Herstellung einer wässrigen Lösung, die HGF in einer Konzentration von weniger als 5 mg/ml enthält, durch Wiederauflösen verwendet wird. Ein bevorzugtes Präparat des oben genannten lyophilisierten Präparats kann erhalten werden, indem eine wässrige Lösung, die das Stabilisierungsmittel (vorzugsweise ein Stabilisierungsmittel, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin und pharmakologisch annehmbaren Salzen derselben), HGF in einer Konzentration von weniger als 5 mg/ml, Natriumchlorid und ein Puffermittel enthält, in einem Fläschchen lyophilisiert wird.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Die Art des im lyophilisierten Präparat der vorliegenden Erfindung enthaltenen HGF unterliegt keinen speziellen Einschränkungen. Zum Beispiel kann natürlicher HGF aus Humor oder Geweben isoliert werden, die von Säugern wie z.B. Mensch und Ratte stammen und von denen bekannt ist, dass sie HGF enthalten, oder aus Zellen, die HGF spontan produzieren. Es kann auch ein rekombinanter HGF verwendet werden, der erhalten wird durch Einführen der cDNA des Wachstumsfaktors in Zellen mit Hilfe einer Gen-Rekombinationstechnik. Zu den Beispielen für Wirte zur Erzeugung eines rekombinanten HGF zählen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hefe, Fadenpilze, Pflanzenzellen, Insektenzellen, tierische Zellen und dergleichen. Spezielle Beispiele für rekombinanten HGF umfassen HGF, der erhalten wird aus der Plazenta von Säugern, aus Lebergewebe und Blut eines leberkranken Patienten, Fibroblasten-Stämmen wie etwa MRC-5-Zellen und IMR-9-Zellen, HGF-produzierenden Stämmen, die erhalten werden durch Einführen eines Expressionsvektors, der eine für hHGF codierende cDNA enthält, in einen Wirt wie z.B. CHO-Zellen gemäß dem in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 3-285693 beschriebenen Verfahren, und dergleichen.
Als HGF kann des Weiteren ein Vorläuferprotein verwendet werden, etwa ein Protein mit einer Signalsequenz, ein modifiziertes Protein, in dem einige Aminosäuren so substituiert, deletiert und/oder inseriert sind, dass die Aktivität proliferierender Hepatozyten nicht beeinträchtigt wird, oder ein verändertes Protein, in dem ein Saccharid entfernt oder ersetzt ist. Zu den Beispielen für das veränderte Protein gehören die in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 2-288899 , WO 90/10651 , in den japanischen ungeprüften Patentveröffentlichungen Nr. 3-130091 , 3-255096 und 4-30000 , in Nature 342, S. 440-443 (1989) beschriebenen und dergleichen.
Zu den Beispielen für HGF, der vorzugsweise für das lyophilisierte Präparat der vorliegenden Erfindung verwendet wird, gehören Proteinfaktoren mit den folgenden physikochemischen Eigenschaften. Der HGF stammt vorzugsweise vom Menschen. Beispiele für besonders bevorzugte HGF umfassen diejenigen mit den in den japanischen ungeprüften Patentveröffentlichungen Nr. 3-72883 und 4-89499 beschriebenen Aminosäuresequenzen.

1) Der Faktor hat ein mittels SDS-PAGE geschätztes Molekulargewicht von etwa 76 000 bis 92 000 (unter nichtreduzierenden Bedingungen).
2) Der Faktor hat die Aktivität proliferierender Hepatozyten.
3) Der Faktor hat starke Affinität zu Heparin.

Neben den obigen physikochemischen Eigenschaften hat der bevorzugte HGF zudem die folgenden Eigenschaften:

4) Die oben genannten Aktivitäten werden durch eine 10-minütige Wärmebehandlung bei 80°C inaktiviert.
5) Die oben genannten Aktivitäten werden durch Verdau mit Trypsin oder Chymotrypsin inaktiviert.

Bei den lyophilisierten HGF-Präparaten, die drei Bestandteile enthalten, d.h., HGF, ein Puffermittel und Natriumchlorid (bei denjenigen, die in den japanischen ungeprüften Patentveröffentlichungen Nr. 6-247872 und 9-25241 beschrieben sind, ist die HGF-Konzentration 5 bis 20 mg/ml), besteht insofern ein Problem, als bei der Verringerung des Gehalts an HGF zur Vermeidung von Problemen wie z.B. Ausfällung von HGF keine günstige Pelletform beim Lyophilisierungsvorgang erhalten werden kann. Weiterhin besteht auch das Problem, dass Ag gregation, Trübung und Gelierung bei einer wässrigen Lösung beobachtet werden, die erhalten wird durch erneutes Lösen eines lyophilisierten Präparats, das aus den obigen drei Bestandteilen resultiert, so dass keine hinreichende physikochemische Stabilität erzielt werden kann. Zur Herstellung eines lyophilisierten Präparats, das durch die Lyophilisierung eine günstige Pelletform ergeben kann und die Herstellung einer wässrigen Lösung ermöglicht, die ausgezeichnete Stabilität bei langer Lagerung aufweist, ist der Zusatz eines Additivs wesentlich zur Verbesserung der pelletbildenden Eigenschaften und der Lagerstabilität im Zustand der wässrigen Lösung.
Das lyophilisierte Präparat der vorliegenden Erfindung wird hergestellt aus einer wässrigen Lösung, die HGF in einer Konzentration von weniger als 5 mg/ml enthält, und/oder so hergestellt, dass eine aus dem lyophilisierten Präparat erzeugte wässrige Lösung HGF in einer Konzentration von weniger als 5 mg/ml enthält. Vorzugsweise kann das lyophilisierte Präparat so hergestellt werden, dass eine wässrige Lösung vor der Lyophilisierung und/oder eine nach dem Wiederauflösen erhaltene wässrige Lösung einen pH aufweist, der zur Injektion erwünscht ist, und im Wesentlichen isotonisch ist mit lebenden Körpern oder ein Verhältnis des osmotischen Drucks aufweist, das zur Injektion annehmbar ist (1 bis 2). Das lyophilisierte Präparat der vorliegenden Erfindung ist gekennzeichnet durch seine ausgezeichnete Lagerstabilität. Das lyophilisierte Präparat ist auch dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat ein günstiges Lyophilisierungspellet beim Lyophilisierungsvorgang bilden kann, und dass eine wässrige Lösung, erhalten durch erneutes Lösen des lyophilisierten Präparats, frei von Problemen bezüglich Aggregation, Trübung oder Gelierung ist, so dass hinreichende physikochemische Stabilität erreicht wird. Weiterhin ist das Präparat in der Lage, die gewünschten pharmakologischen Wirkungen bei klinischen Anwendungen zu erbringen.
Zu den Beispielen für das Stabilisierungsmittel gehören Arginin, Lysin, Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure und pharmakologisch annehmbare Salze der selben. Zu den Beispielen für pharmakologisch annehmbare Salze zählen Alkalimetall-Salze wie z.B. Natrium-Salze und Kalium-Salze. Diese Stabilisierungsmittel können in Form einer Kombination aus zwei oder mehr Arten verwendet werden. Beispiele für bevorzugte Stabilisierungsmittel umfassen Arginin, Lysin, Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure und dergleichen. Von diesen sind Arginin, Lysin, Histidin und Kombinationen derselben besonders bevorzugt. Die Menge des zuzusetzenden Stabilisierungsmittels unterliegt keinen speziellen Einschränkungen, solange die Lagerstabilität von HGF erreicht werden kann, beträgt aber gewichtsbezogen vorzugsweise das 0,01-100-fache, besonders bevorzugt das 0,1-30-fache des Gewichts von HGF.
Auch das Puffermittel unterliegt keinen speziellen Einschränkungen, solange das Mittel eine Wirkung dahingehend aufweist, dass der pH der wässrigen Lösungen vor der Lyophilisierung und nach dem erneuten Lösen eingestellt und die Löslichkeit von HGF aufrechterhalten wird. Zum Beispiel kann ein Phosphat-Puffer, ein Citrat-Puffer, ein Acetat-Puffer oder dergleichen verwendet werden. Als Puffermittel kann vorzugsweise ein Phosphat-Puffer, besonders bevorzugt ein Natriumphosphat-Puffer verwendet werden. Die Menge des zuzusetzenden Puffermittels beträgt zum Beispiel etwa 1 bis 100 mM, bezogen auf die Menge Wasser nach dem Wiederlösen.
Natriumchlorid verbessert die Löslichkeit von HGF in den wässrigen Lösungen vor der Lyophilisierung und nach dem Wiederlösen, wobei es jedoch nicht bevorzugt ist, mehr Natriumchlorid als notwendig zuzugeben, da es den osmotischen Druck erhöht. Im Allgemeinen genügt es, Natriumchlorid in einer Menge zuzusetzen, die zur Erzielung eines bezüglich lebender Körper isotonischen osmotischen Drucks ausreicht. Das Verhältnis des osmotischen Drucks beträgt vorzugsweise 1-2, was als Verhältnis des osmotischen Drucks zur Injektion annehmbar ist. Bevorzugt ist zum Beispiel die Zugabe von 140 mM Natriumchlorid, bezogen auf das Volumen Wasser nach dem Wiederlösen.
Bei HGF besteht das Problem, dass seine Löslichkeit bei neutralem pH rasch abnimmt, da sich der pH mit dem isoelektrischen Punkt von HGF (pl = 7-8) überschneidet. Zum Beispiel hat HGF eine niedrige Löslichkeit von weniger als 1,0 mg/ml um pH 7,0 bis 7,5 in 10 mM Natriumphosphat-Puffer (PBS, Raumtemperatur), der 140 mM Natriumchlorid enthält, während HGF eine Löslichkeit von 5 mg/ml oder höher um pH 5,0 aufweist, und die Löslichkeit von HGF wird bei niedrigerem pH höher. Zudem ist bei einer Natriumchlorid-Konzentration von 0,14 M die Löslichkeit von HGF etwa 1 mg/ml, und wird die Konzentration auf 0,3 M oder höher gesetzt, löst sich HGF mit einer Konzentration von 5 mg/ml oder höher. Daher ist auch in Betracht zu ziehen, dass zur Erhöhung der Löslichkeit von HGF die Lösung unter sauren Bedingungen bei einem pH von 5 oder niedriger gehalten oder die Natriumchlorid-Konzentration auf 0,3 M oder höher erhöht wird. Bei dem Präparat der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass der pH der wässrigen Lösungen vor der Lyophilisierung und/oder nach dem Wiederlösen so eingestellt wird, dass er innerhalb eines schwach sauren Bereichs liegt, insbesondere bei einem pH von 4,0 bis 6,5, vorzugsweise einem pH von 5,0 bis 6,5. In einem solchen pH-Bereich wird die Bildung von Aggregaten unterdrückt.
Das lyophilisierte HGF-Präparat der vorliegenden Erfindung wird des Weiteren vorzugsweise mit einem oberflächenaktiven Mittel versetzt. HGF wird leicht am Behältermaterial wie etwa Glas oder Harz adsorbiert. Insbesondere bei niedriger Konzentration führt die Adsorption von HGF am Behälter zu einer Abnahme des Arzneimittelgehalts in der zu verabreichenden Lösung. Durch Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels kann die Adsorption von HGF am Behälter nach dem Wiederlösen verhindert werden. Zu den Beispielen für oberflächenaktive Mittel gehören nichtionische oberflächenaktive Mittel wie etwa Polysorbate 80, Polysorbate 20, HCO-40, HCO-60, Pluronic F-68 und Polyethylenglycol, und es kann auch eine Kombination aus zwei oder mehr Arten dieser Mittel verwendet werden. Als oberflächenaktive Mittel können besonders bevorzugt Polyoxyethylenether-Tenside (Polysorbate 80 und dergleichen) verwendet werden. Die Menge des oberflächenaktiven Mittels liegt zum Beispiel im Bereich von 0,001 bis 2,0 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Wassers nach dem Wiederlösen.
Das lyophilisierte HGF-Präparat der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden durch Lyophilisieren einer HGF enthaltenden wässrigen Lösung nach einem herkömmlichen Verfahren. Zum Beispiel kann HGF, ein Stabilisierungsmittel, Natriumchlorid und ein Puffermittel in destilliertem Wasser zur Injektion gelöst werden, gegebenenfalls unter Zusatz eines oberflächenaktiven Mittels, durch Filtration sterilisiert, in einen Behälter wie z.B. ein Fläschchen oder eine Ampulle eingefüllt und anschließend lyophilisiert werden. Das lyophilisierte HGF-Präparat der vorliegenden Erfindung kann weitere Additive enthalten, die zur Formulierung notwendig sind, zum Beispiel Antioxidantien, Konservierungsmittel, Trägerstoffe, Linderungsmittel und dergleichen. Ein Beispiel für das Lyophilisierungsverfahren umfasst zum Beispiel ein Verfahren, umfassend drei Einheitsarbeitsgänge: (1) einen Gefrierschritt zum Abkühlen und Gefrieren unter atmosphärischem Druck, (2) einen ersten Trocknungsschritt zum Sublimieren und Trocknen von freiem Wasser, das nicht durch einen gelösten Stoff unter vermindertem Druck zurückgehalten wird, und (3) einen zweiten Trocknungsschritt zum Entfernen von adsorbiertem Wasser oder Kristallwasser, das zu dem gelösten Stoff gehört (Pharm. Tech. Japan 8 (1), S. 75-87, 1992). Das Verfahren zur Herstellung des lyophilisierten Präparats der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf das obige Verfahren beschränkt. Das lyophilisierte Präparat der vorliegenden Erfindung kann bei Gebrauch gelöst werden durch Zugabe eines Lösungsmittels wie z.B. destilliertes Wasser zur Injektion, so dass die HGF-Konzentration niedriger als 5 mg/ml wird.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele näher erläutert werden. Der Umfang der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit HGF in niedriger Konzentration (Vergleichsbeispiel)

HGF wird zu einer Konzentration von 1 mg/ml in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,5) gelöst, der 140 mM Natriumchlorid und 0,01% Polysorbate 80 enthält, und zur Sterilisierung filtriert, um eine wässrige HGF-Lösung zu ergeben. Nach Einstellen des pH der wässrigen Lösung wird die Lösung aseptisch in Fläschchen in einer Menge von 2 ml pro Fläschchen gefüllt. Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lyophilisieren der Lösung gemäß den in Tabelle 1 gezeigten Bedingungen. In der Tabelle bedeutet "→", dass die Temperatur verändert wird. Tabelle 1

	Gefriervorgang			Erster Trocknungsvorgang	Zweiter Trocknungsvorgang
Temperatur (°C)	20 → –40	–40	–40 → –20	–20	–20 → 20	20
Zeit (h)	1	5	3	48	2	24
Druck (mmHg)	760	760	< 1	< 1	< 1	< 1

Beispiel 2: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit HGF in niedriger Konzentration (Vergleichsbeispiel)
HGF wird unter Erwärmen zu einer Konzentration von 5 mg/ml in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,5) gelöst, der 140 mM Natriumchlorid und 0,01% Polysorbate 80 enthält, und zur Sterilisierung filtriert, um eine wässrige HGF-Lösung zu ergeben. Nach Einstellen des pH der wässrigen Lösung wird die Lösung aseptisch in Fläschchen in einer Menge von 2 ml pro Fläschchen gefüllt. Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lyophilisieren der Lösung gemäß den in Tabelle 1 gezeigten Bedingungen.
Beispiel 3: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit HGF in hoher Konzentration (Vergleichsbeispiel)
HGF wird zu einer Konzentration von 10 mg/ml in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,5) gelöst, der 140 mM Natriumchlorid, 100 mM Arginin und 0,01% Polysorbate 80 enthält, und zur Sterilisierung filtriert, um eine wässrige HGF-Lösung zu ergeben. Nach Einstellen des pH der wässrigen Lösung wird die Lösung aseptisch in Fläschchen in einer Menge von 2 ml pro Fläschchen gefüllt. Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in hoher Konzentration kann erhalten werden durch Lyophilisieren der Lösung gemäß den in Tabelle 1 gezeigten Bedingungen.
Beispiel 4: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit HGF in niedriger Konzentration (Vergleichsbeispiel)
HGF wird zu einer Konzentration von 1 mg/ml in 10 mM Citrat-Puffer (pH 5,0) gelöst, der 300 mM Natriumchlorid und 0,01% Polysorbate 80 enthält, und zur Sterilisierung filtriert, um eine wässrige HGF-Lösung zu ergeben. Nach Einstellen des pH der wässrigen Lösung wird die Lösung aseptisch in Fläschchen in einer Menge von 2 ml pro Fläschchen gefüllt. Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lyophilisieren der Lösung gemäß den in Tabelle 1 gezeigten Bedingungen.
Beispiel 5: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit HGF in niedriger Konzentration (Vergleichsbeispiel)
HGF wird zu einer Konzentration von 1 mg/ml in 10 mM Citrat-Puffer (pH 5,0) gelöst, der 300 mM Natriumchlorid, 5% Glycin und 0,01% Polysorbate 80 enthält, und zur Sterilisierung filtriert, um eine wässrige HGF-Lösung zu ergeben. Nach Einstellen des pH der wässrigen Lösung wird die Lösung aseptisch in Fläschchen in einer Menge von 2 ml pro Fläschchen gefüllt. Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lyophilisieren der Lösung gemäß den in Tabelle 1 gezeigten Bedingungen.
Beispiel 6: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit HGF in niedriger Konzentration (Vergleichsbeispiel)
HGF wird zu einer Konzentration von 1 mg/ml in 10 mM Citrat-Puffer (pH 5,0) gelöst, der 300 mM Natriumchlorid, 5% Alanin und 0,01% Polysorbate 80 enthält, und zur Sterilisierung filtriert, um eine wässrige HGF-Lösung zu ergeben. Nach Einstellen des pH der wässrigen Lösung wird die Lösung aseptisch in Fläschchen in einer Menge von 2 ml pro Fläschchen gefüllt. Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lyophilisieren der Lösung gemäß den in Tabelle 1 gezeigten Bedingungen.
Beispiel 7: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
HGF wird zu einer Konzentration von 1 mg/ml in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,5) gelöst, der 140 mM Natriumchlorid und 100 mM Arginin enthält, und zur Sterilisierung filtriert, um eine wässrige HGF-Lösung zu ergeben. Nach Einstellen des pH der wässrigen Lösung wird die Lösung aseptisch in Fläschchen in einer Menge von 2 ml pro Fläschchen gefüllt. Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lyophilisieren der Lösung unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1. Für den Gebrauch kann dieses Präparat in 2 ml destilliertem Wasser zur Injektion gelöst werden, um eine Injektion zu ergeben, die HGF in einer Konzentration von 1 mg/ml enthält und einen pH und ein Verhältnis des osmotischen Drucks (1,5, nahezu isotonisch) aufweist, die als Injektion annehmbar sind.
Beispiel 8: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
HGF wird zu einer Konzentration von 1 mg/ml in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,5) gelöst, der 140 mM Natriumchlorid, 100 mM Arginin und 0,01% Polysorbate 80 enthält, und zur Sterilisierung filtriert, um eine wässrige HGF-Lösung zu ergeben. Nach Einstellen des pH der wässrigen Lösung wird die Lösung aseptisch in Fläschchen in einer Menge von 2 ml pro Fläschchen gefüllt. Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lyophilisieren der Lösung unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1.
Beispiel 9: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
HGF wird zu einer Konzentration von 2 mg/ml in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,5) gelöst, der 140 mM Natriumchlorid, 100 mM Arginin und 0,01% Polysorbate 80 enthält, und zur Sterilisierung filtriert, um eine wässrige HGF-Lösung zu ergeben. Nach Einstellen des pH der wässrigen Lösung wird die Lösung aseptisch in Fläschchen in einer Menge von 2 ml pro Fläschchen gefüllt. Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lyophilisieren der Lösung unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1.
Beispiel 10: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
HGF wird zu einer Konzentration von 3 mg/ml in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,5) gelöst, der 140 mM Natriumchlorid, 100 mM Arginin und 0,01% Polysorbate 80 enthält, und zur Sterilisierung filtriert, um eine wässrige HGF-Lösung zu ergeben. Nach Einstellen des pH der wässrigen Lösung wird die Lösung aseptisch in Fläschchen in einer Menge von 2 ml pro Fläschchen gefüllt. Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lyophilisieren der Lösung unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1.
Beispiel 11: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
HGF wird zu einer Konzentration von 4 mg/ml in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,5) gelöst, der 140 mM Natriumchlorid, 100 mM Arginin und 0,01% Polysorbate 80 enthält, und zur Sterilisierung filtriert, um eine wässrige HGF-Lösung zu ergeben. Nach Einstellen des pH der wässrigen Lösung wird die Lösung aseptisch in Fläschchen in einer Menge von 2 ml pro Fläschchen gefüllt. Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lyophilisieren der Lösung unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1.
Beispiel 12: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (Vergleichsbeispiel)
HGF wird zu einer Konzentration von 5 mg/ml in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,5) gelöst, der 140 mM Natriumchlorid, 100 mM Arginin und 0,01% Polysorbate 80 enthält, und zur Sterilisierung filtriert, um eine wässrige HGF-Lösung zu ergeben. Nach Einstellen des pH der wässrigen Lösung wird die Lösung aseptisch in Fläschchen in einer Menge von 2 ml pro Fläschchen gefüllt. Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lyophilisieren der Lösung unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1.
Beispiel 13: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lösen von HGF mit einer Konzentration von 1 mg/ml in der glei chen Weise wie in Beispiel 8 unter Verwendung von 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) an Stelle von 10 mM Phosphat-Puffer mit pH 6,5.
Beispiel 14: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lösen von HGF mit einer Konzentration von 1 mg/ml in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 unter Verwendung von 10 mM Phosphat-Puffer (pH 5,5) an Stelle von 10 mM Phosphat-Puffer mit pH 6,5.
Beispiel 15: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lösen von HGF mit einer Konzentration von 1 mg/ml in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 unter Verwendung von 10 mM Phosphat-Puffer (pH 5,0) an Stelle von 10 mM Phosphat-Puffer mit pH 6,5.
Beispiel 16: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lösen von HGF mit einer Konzentration von 1 mg/ml in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 unter Verwendung von 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7,2) an Stelle von 10 mM Phosphat-Puffer mit pH 6,5.
Beispiel 17: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann erhalten werden durch Lösen von HGF mit einer Konzentration von 1 mg/ml in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 unter Verwendung von 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7,0) an Stelle von 10 mM Phosphat-Puffer mit pH 6,5.
Beispiel 18: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten werden durch Verwendung von 50 mM Arginin an Stelle von 100 mM Arginin.
Beispiel 19: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten werden durch Verwendung von Lysin an Stelle von Arginin.
Beispiel 20: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten werden durch Verwendung von Histidin an Stelle von Arginin.
Beispiel 21: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration
Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten werden durch Verwendung von Glutamin an Stelle von Arginin.
Beispiel 22: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration
Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten werden durch Verwendung von Cystein an Stelle von Arginin.
Beispiel 23: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration
Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten werden durch Verwendung von Prolin an Stelle von Arginin.
Beispiel 24: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten werden durch Verwendung von Natriumglutamat an Stelle von Arginin.
Beispiel 25: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten werden durch Verwendung von Natriumaspartat an Stelle von Arginin.
Beispiel 26: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration
Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten werden durch Verwendung von Glycin an Stelle von Arginin.
Beispiel 27: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration (vorliegende Erfindung)
Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentration kann in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten werden durch Anwenden einer Befüllmenge von jeweils 5 ml an Stelle von 2 ml.
Beispiel 28: Herstellung eines lyophilisierten Präparats mit niedriger Konzentration
Natrium-dextransulfat und HGF werden zu Konzentrationen von 50 mg/ml bzw. 1 mg/ml in 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 6,5) gelöst, der 140 mM Natriumchlorid und 0,01% Polysorbate 80 enthält, und zur Sterilisierung filtriert, um eine wässrige HGF-Lösung zu ergeben. Nach Einstellen des pH der wässrigen Lösung wird die Lösung aseptisch in Fläschchen in einer Menge von 2 ml pro Fläschchen gefüllt. Ein lyophilisiertes Präparat mit HGF in niedriger Konzentrati on kann erhalten werden durch Lyophilisieren der Lösung unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1.
Testbeispiel 1: Bewertung der Löslichkeit von HGF
(1) Verfahren zur Bewertung der Löslichkeit von HGF
HGF wurde in ein Polypropylen-Röhrchen eingewogen und mit 10 mM Natriumphosphat-Puffer versetzt, der Natriumchlorid und ein Stabilisierungsmittel in verschiedenen Konzentrationen sowie 0,01% Polysorbate 80 enthielt. Das Röhrchen wurde sofort bei einer konstanten Temperatur gehalten, um HGF zu lösen. Unmittelbar nach dem Lösen wurde die Lösung zentrifugiert (15 000 U/min, 10 Minuten, konstante Temperatur), um die gesättigte HGF-Lösung vollständig vom ungelösten HGF zu trennen. Der Überstand wurde als Probe gezogen und durch ein Niederprotein-Adsorptionsfilter Millipore GV (hydrophiles Durapore, 0,22 μm) filtriert, und die HGF-Konzentration der resultierenden gesättigten Lösung wurde mittels HPLC quantifiziert (Gelfiltrationsmethode), um die Löslichkeit von HGF bei Sättigung zu bestimmen.
Bedingungen für die HPLC-Analyse

Säule: TOSOH TSK G-3000SWXL (0,78 × 30 cm)
Fließgeschwindigkeit: 0,3 ml/min
Nachweiswellenlänge: OD 280 nm
Temperatur: 30°C
Träger: 0,3 M NaCl, 50 mM Natriumphosphat, 0,1% SDS, pH 7,5
Aufgabe: 50 μl
Retentionszeit von HGF: 24,0 min

(2) Einfluss des pH auf die Löslichkeit von HGF
Lösungen mit unterschiedlichem pH wurden hergestellt durch Verwendung von 10 mM Natriumphosphat-Puffer, der 140 mM Natriumchlorid und 0,01% Polysorbate 80 enthielt. Die Löslichkeit von HGF wurde nach dem Verfahren von (1) bei 4°C und 20°C untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Löslichkeit von HGF nahm mit fallendem pH allmählich zu. Eine deutliche Verbesserung der Löslichkeit zeigte sich bei pH 5,0 oder darunter. Des Weiteren wurde eine Zunahme der Löslichkeit mit steigender Temperatur bei jeder Probe beobachtet. Tabelle 2

20°C 4°C

pH 7,5 0,8 0,4

pH 7,0 1,8 1,0

pH 6,0 2,3 1,3

pH 5,0 5,9 4,2

Die Löslichkeit von HGF ist in mg/ml angegeben

(3) Einfluss der Natriumchlorid-Konzentration auf die Löslichkeit von HGF
Es wurden 10 mM Natriumphosphat-Pufferlösungen (pH 7,5) hergestellt, die Natriumchlorid in verschiedenen Konzentrationen sowie 0,01% Polysorbate 80 enthielten. Die Löslichkeit von HGF wurde nach dem Verfahren von (1) bei 4°C und 20°C untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Es wurde eine beachtliche Zunahme der Löslichkeit von HGF mit zunehmender Natriumchlorid-Konzentration beobachtet. Des Weiteren wurde eine Zunahme der Löslichkeit mit steigender Temperatur bei jeder Probe beobachtet. Tabelle 3

20°C 4°C

Ohne Zusatz 0,3 0,1

+140 mM NaCl 0,8 0,4

+230 mM NaCl 3,2 1,4

+300 mM NaCl 8,5 4,0

+900 mM NaCl > 190 –

Die Löslichkeit von HGF ist in mg/ml angegeben

(4) Einfluss verschiedener Stabilisierungsmittel auf die Löslichkeit von HGF
Es wurde der Einfluss verschiedener Additive für pharmazeutische Präparate auf die Löslichkeit von HGF untersucht. HGF wurde zu einer Konzentration von 1 mg/ml in 10 mM Natriumphosphat-Pufferlösungen (pH 6,8 bis 7,5) gelöst, die Additive in verschiedenen Konzentrationen, 140 mM Natriumchlorid und 0,01% Polysorbate 80 enthielten, um wässrige HGF-Lösungen zu erhalten. Eine Menge von 200 μl einer jeden wässrigen Lösung wurde in die jeweiligen Vertiefungen einer 96er Mikrotiterplatte gegeben und 48 Stunden bei 4°C aufbewahrt. Anschließend wurde die Trübung einer jeden wässrigen HGF-Lösung durch Messen der OD bei 450 nm unter Verwendung eines Plattenlesegeräts bestimmt. Die Trübung der Lösung nahm mit der Abnahme der Löslichkeit von HGF zu, und dies führte zu Aggregation und Ausfällung von HGF.
Der Einfluss auf die HGF-Löslichkeit wurde für Additive bewertet, darunter 20 Arten von L-Aminosäuren (Arginin, Lysin, Histidin, Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin, Natriumaspartat, Natriumglutamat, Cystein, Glycin, Prolin, Alanin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Valin), 7 Arten von Sacchariden (Mannit, Fructose, Trehalose, Glucose, Sorbit, Sucrose, Lactose), 3 Arten von Polymeren (Dextransulfat, Dextran, PEG), 3 Arten von Proteinen (Humanserumalbumin, saure Gelatine, basische Gelatine) und 3 Arten oberflächenaktiver Mittel (Polysorbate 80, Polysorbate 20, HCO-40, HCO-60). Eine Stabilisierungswirkung zur Aufrechterhaltung der Löslichkeit von HGF wurde bei den nachstehend aufgeführten Substanzen beobachtet.

(i) Aminosäuren: Arginin, Lysin, Histidin, Natriumglutamat, Natriumaspartat, Glutamin, Cystein, Prolin (die Wirkung wurde bei 0,05 M bestätigt).
(ii) Polysaccharide: Dextransulfat (die Wirkung wurde bei 0,1% bestätigt).

Durch Verwendung der Aminosäuren, die merkliche Wirkungen ergaben, wurden Lösungen in 10 mM Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0) hergestellt, die 140 mM Natriumchlorid, 0,01% Polysorbate 80 und die jeweilige Aminosäure in verschiedenen Konzentrationen enthielten. Die Löslichkeit von HGF wurde bei 4°C mit Hilfe des Verfahrens von (1) untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4

		Löslichkeit bei Sättigung	Verhältnis des osmotischen Drucks
Ohne Additiv		1,0	1,0
+L-Arg	50 mM	7,3	1,3
+L-Lys	50 mM	4,5	1,3
+L-His	50 mM	3,2	1,2
+L-GluNa	50 mM	2,2	1,3

+L-Arg	100 mM	> 10	1,6
+L-Lys	100 mM	> 10	1,6
+L-His	100 mM	4,8	1,4
+L-GluNa	100 mM	3,2	1,6

Die Löslichkeit von HGF ist in mg/ml angegeben

Testbeispiel 2: Eigenschaften wässriger HGF-Lösungen vor und nach der Lyophilisierung
Um etwaige Veränderungen der physikalischen Stabilität von HGF während des Lyophilisierungsvorgangs zu beobachten, wurde eine wässrige HGF-Lösung vor der Lyophilisierung und eine wässrige HGF-Lösung, die durch erneutes Lösen des lyophilisierten Präparats in gereinigtem Wasser ohne irgendeine weitere Behandlung erhalten wurde, 24 Stunden bei 4°C aufbewahrt, und eine Eigenschaft (Trübung) der Lösungen wurde nach dem Lösen visuell beobachtet. Ebenfalls bewertet wurden die zum Wiederlösen des lyophilisierten Präparats erforderliche Zeit und das Verhältnis des osmotischen Drucks. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.

Wurden die lyophilisierten Präparaten der Beispiele 1 und 22 wieder gelöst und 24 Stunden bei 4°C aufbewahrt, so wurden die Lösungen trüb. Die Präparate der übrigen Beispiele erwiesen sich bezüglich der obigen Eigenschaft als stabil. Tabelle 5

Präparat	Wässrige Lösung vor der Lyophilisierung	Wässrige Lösung nach dem Wiederlösen	Verhältnis des osmotischen Drucks
Beispiel 1	Trüb	Sofort löslich, trüb	1,0
Beispiel 4	Klar	Sofort löslich, klar	2,0
Beispiel 5	Klar	Kaum löslich, klar	4,0
Beispiel 6	Klar	Kaum löslich, klar	3,9
Beispiel 8	Klar	Sofort löslich, klar	1,5
Beispiel 19	Klar	Sofort löslich, klar	1,6
Beispiel 20	Klar	Sofort löslich, klar	1,4
Beispiel 21	Klar	Sofort löslich, klar	1,3
Beispiel 22	Klar	Kaum löslich, trüb	1,7
Beispiel 23	Klar	Sofort löslich, klar	1,3
Beispiel 24	Klar	Sofort löslich, klar	1,5
Beispiel 25	Klar	Sofort löslich, klar	1,5
Beispiel 26	Klar	Sofort löslich, klar	1,3
Beispiel 28	Klar	Sofort löslich, klar	1,3

Testbeispiel 3: Eigenschaften des lyophilisierten Präparats nach dem Lösen
Die für das Wiederlösen erforderliche Zeit und eine Eigenschaft der Lösung (Trübung) nach dem erneuten Lösen der in den Beispielen erhaltenen lyophilisierten Präparate wurden unmittelbar nach der Lyophilisierung und nach 1 Monat Lagern bei 25°C, 40°C und 50°C bewertet. Die lyophilisierten Präparate wurden in gereinigtem Wasser gelöst, und die Eigenschaft wurde bei Raumtemperatur bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.

Von denjenigen bei 25°C gelagerten wurde die Lösung des Präparats von Beispiel 22 unmittelbar nach dem Wiederlösen des lyophilisierten Präparats trübe, während sich die Präparate der übrigen Beispiele bezüglich dieser Eigenschaft als stabil erwiesen. Des Weiteren wurden nach Lagerung bei 40°C und 50°C die Lösungen der Präparate der Beispiele 1, 22, 23, 24 und 25 unmittelbar nach dem Lösen trübe. Die Präparate der übrigen Beispiele erwiesen sich bezüglich der obigen Eigenschaft jedoch als stabil. Tabelle 6

Präparat	Präparat nach 1 Monat Lagerung
Präparat	25°C	40°C	50°C
Beispiel 1	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, trüb	Sofort löslich, trüb
Beispiel 4	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, klar
Beispiel 5	Kaum löslich, klar	Kaum löslich, klar	Kaum löslich, klar
Beispiel 6	Kaum löslich, klar	Kaum löslich, klar	Kaum löslich, klar
Beispiel 8	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, klar	Sofort löslich; klar
Beispiel 19	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, klar
Beispiel 20	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, klar
Beispiel 21	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, klar
Beispiel 22	Kaum löslich, trüb	Kaum löslich, trüb	Kaum löslich, trüb
Beispiel 23	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, trüb	Sofort löslich, trüb
Beispiel 24	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, trüb	Sofort löslich, trüb
Beispiel 25	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, trüb	Sofort löslich, trüb
Beispiel 26	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, klar
Beispiel 28	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, klar	Sofort löslich, klar

Testbeispiel 4: Änderung des Aggregatgehalts im lyophilisierten Präparat
Das Verhältnis von Aggregatgehalt und HGF-Gehalt bei den in den Beispielen erhaltenen lyophilisierten Präparaten wurde unmittelbar nach der Lyophilisierung (Anfangswert) und nach 1 Monat Lagerung bei 25°C, 40°C und 50°C verglichen. Es wurde das Verfahren von Testbeispiel 1(1) (Gelfiltrationsmethode) angewandt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 7 und 8 gezeigt.
Retentionszeit der Aggregate: 20,4 min, 21,8 min
Retentionszeit von HGF: 24,0 min
Bei Erhöhung der Lagerungstemperatur wurde eine wachsende Tendenz zur Aggregatbildung beobachtet. Die lyophilisierten Präparate der Beispiele 8, 19 und 20 im Besonderen ergaben jedoch außerordentlich geringe Aggregatbildung und erwiesen sich als physikochemisch stabil. So wurde geschlossen, dass die Aggregatbildung durch Zugabe von Arginin, Lysin und Histidin selbst nach Lagerung bei hoher Temperatur auf niedrigem Niveau gehalten (Aggregatbildungsrate: etwa 3% oder niedriger bei 40°C und etwa 5 bis 9% oder niedriger bei 50°C) und dadurch die Lagerstabilität verbessert wurde. Ein ähnlicher Test wurde als Vergleichsbeispiel durchgeführt, indem ein lyophilisiertes Präparat von Beispiel 1 verwendet wurde, das nach dem gleichen Verfahren unter Verwendung der gleichen Bestandteile erhalten wurde, mit der Ausnahme, dass kein Arginin enthalten war. Im Ergebnis wurde eine deutliche Zunahme der Aggregatbildung bei Erhöhung der Lagerungstemperatur beobachtet.
Wie in Tabelle 8 gezeigt, wurde des Weiteren belegt, dass durch Abnahme der HGF-Konzentration (weniger als 5 mg/ml) die Aggregatbildung beschleunigt wird, was zu einer geringeren Lagerstabilität führt. Es wurde gefunden, dass durch Verwendung von Glycin oder Alanin als Stabilisierungsmittel des lyophilisierten Präparats, wie beschrieben in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 9-25411 , bei den lyophilisierten Präparaten mit HGF in niedriger Konzentration (Beispiele 5, 6 und 26, 1 mg/ml) im Vergleich zu den lyophilisierten Präparaten mit HGF in hoher Konzentration (Beispiele 5 und 6 der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 9-25411 , 20 mg/ml) die Aggregatbildung beschleunigt war und die Lagerstabilität abnahm.

Dagegen wurde gezeigt, dass bei den lyophilisierten Präparaten der Beispiele 8, 19 und 20, bei denen Arginin, Lysin oder Histidin als Stabilisierungsmittel des lyophilisierten Präparats verwendet wurden, die Aggregatbildung selbst bei den lyophilisierten Präparaten mit HGF in niedriger Konzentration (1 mg/ml) deutlich unterdrückt und somit die Lagerstabilität verbessert wurde. Tabelle 7

Präparat	Präparat nach 1 Monat Lagerung
Präparat	Anfangswert	25°C	40°C	50°C
Beispiel 1	0,48	5,50	24,27	40,63
Beispiel 4	0,35	0,48	3,80	11,24
Beispiel 5	0,31	0,69	4,40	9,58
Beispiel 6	0,30	0,54	3,20	9,53
Beispiel 8	0,30	0,11	0,18	0,60
Beispiel 19	0,31	0,16	1,74	4,48
Beispiel 20	0,31	0,18	0,28	0,88
Beispiel 21	0,31	0,54	2,77	16,89
Beispiel 22	–	–	–	–
Beispiel 23	0,32	0,31	3,24	11,24
Beispiel 24	0,32	2,19	4,90	6,39
Beispiel 25	0,34	1,11	4,80	7,73
Beispiel 26	0,36	0,33	6,21	22,66
Beispiel 28	2,74	3,48	13,30	32,87
Beispiel 1*	1,07			6,17
Beispiel 5*	0,92			4,09
Beispiel 6*	0,93			2,90
Beispiel 9*	1,78			14,01

* Zitiert aus den Tabellen 4 und 6 der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 9-25241

	Präparat	Aggregatgehalt/HGF-Gehalt von lyophilisiertem Präparat, gelagert 1 Monat bei 50°C
	Präparat ohne Aminosäure
Beispiel 1	HGF mit 1 mg/ml	40,63
Beispiel 4	HGF mit 1 mg/ml	11,24
Beispiel 9*	HGF mit 10 mg/ml	14,01
Beispiel 1*	HGF mit 20 mg/ml	6,17
	Präparat mit Glycin
Beispiel 5	HGF mit 1 mg/ml	9,58
Beispiel 5*	HGF mit 20 mg/ml	4,09
	Präparat mit Alanin
Beispiel 6	HGF mit 1 mg/ml	9,53
Beispiel 6*	HGF mit 20 mg/ml	2,90

Testbeispiel 5: Änderung des Aggregatgehalts im lyophilisierten Präparat – Einfluss des pH auf die Aggregatbildung
Das Verhältnis von Aggregatgehalt und HGF-Gehalt bei den in den Beispielen 8, 13, 14, 16 und 17 hergestellten lyophilisierten Präparaten mit unterschiedlichem pH wurde unmittelbar nach der Lyophilisierung (Anfangswert) und nach 1 Monat, 2 Monaten und 3 Monaten Lagerung bei 50°C bestimmt. Es wurde das Verfahren von Testbeispiel 1(1) (Gelfiltrationsmethode) angewandt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.
Retentionszeit der Aggregate: 20,4 min, 21,8 min
Retentionszeit von HGF: 24,0 min

Bei den lyophilisierten Präparaten der Beispiele 16 und 17 mit einem pH von 7,0 und 7,2 erhöhte sich mit der Zeit die Aggregatbildung während der Lagerung bei 50°C. Bei den Präparaten der Beispiele 8, 13 und 14 dagegen, die einen pH von 6,5 oder niedriger hatten, wurde die Aggregatbildung niedrig gehalten. Es wurde somit geschlossen, dass die Stabilität bei schwach saurem pH verbessert wurde. Tabelle 9

Präparat	Lagerung bei 50°C
Präparat	Anfangswert	1 Monat Lagerung	2 Monate Lagerung	3 Monate Lagerung
Beispiel 14 (pH 5,5)	0,48	0,38	0,56	0,76
Beispiel 13 (pH 6,0)	0,35	0,91	0,51	1,31
Beispiel 8 (pH 6,5)	0,31	1,40	1,58	1,28
Beispiel 17 (pH 7,0)	0,30	1,26	2,16	2,96
Beispiel 16 (pH 7,2)	0,30	5,64	7,63	12,71

Testbeispiel 6: Änderung der biologischen Aktivität (spezifische Aktivität) des lyophilisierten Präparats
Die in den Beispielen 1 und 8 hergestellten lyophilisierten Präparaten wurden 2 Monate lang bei 25°C oder 50°C oder 1,5 Jahre bei 10°C oder 25°C gelagert. Die biologische Aktivität der durch erneutes Lösen der lyophilisierten Präparate erhaltenen wässrigen Lösungen wurde bestimmt mit Hilfe des nachstehend gezeigten Verfahrens zur Bestimmung der biologischen Aktivität. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt.
Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität
Der humane Leberzellenstamm PLC/PRF/5 wurde bis zur logarithmischen Wachstumsphase kultiviert, und die Überlebensrate der Zellen wurde beobachtet. Anschließend wurde eine Zelllösung mit einer Dichte von 0,7 × 10⁵ Zellen/ml hergestellt. Eine Menge von 100 μl Zelllösung wurde jeweils in die Vertiefungen einer 96er Assayplatte gegeben, die vorher mit einer HGF-Probe oder einer Standardprobe versetzt worden war, so dass die Zellenzahl 0,7 × 104 Zellen/Vertiefung war (n = 4). Nach 20 Stunden Vorinkubieren bei 37°C in einem Brutschrank mit 5% Kohlendioxid wurde [³H]-Thymidin zugesetzt, und die Kultur wurde weitere 6 Stunden fortgesetzt. Nach Beendigung des Kultivierens wurden die Zellen mit einem Beta Plate System (Pharmacia) abgenommen, und die Menge des in die Zellen aufgenommenen [³H] wurde gemessen. Die Messergebnisse wurden mittels Paralleltest verifiziert. Der Titer (%) wurde erhalten durch Dividieren der spezifischen Aktivität der HGF-Probe durch die spezifische Aktivität des Standards.
Was das mit Arginin versetzte lyophilisierte Präparat von Beispiel 8 anbelangt, so war die biologische Aktivität selbst nach der Lagerung bei hoher Temperatur nahezu unverändert, und das Präparat war im Hinblick auf die biologische Aktivität stabil. Ein ähnlicher Test wurde des Weiteren als Vergleichsbeispiel durchgeführt, indem ein lyophilisiertes Präparat verwendet wurde, das nach dem gleichen Verfahren unter Verwendung der gleichen Bestandteile wie in Beispiel 1 erhalten wurde, mit der Ausnahme, dass kein Arginin enthalten war. Im Ergebnis wurde eine deutliche Abnahme der biologischen Aktivität bei erhöhter Lagerungstemperatur beobachtet. Tabelle 10

2 Monate Lagerung 1,5 Jahre Lagerung

25°C 50°C 10°C 25C°

Beispiel 1 64,5% 10,2% – –

Beispiel 8 87,1% 71,0% 72,6% 66,1%
Industrielle Anwendbarkeit
Das lyophilisierte Präparat der vorliegenden Erfindung kann zur Herstellung einer klinisch brauchbaren wässrigen Lösung verwendet werden, die HGF in niedriger Konzentration enthält, und das Präparat ist nahezu frei von Aggregatbildung während der Lyophilisierung und der Lagerung nach der Lyophilisierung und hat somit ausgezeichnete Stabilität. Weiterhin ist das Präparat gekennzeichnet durch günstige pelletbildende Eigenschaften während der Lyophilisierung und eine ausgezeichnete Wiederlöslichkeit. Zudem kann das Präparat so hergestellt werden, dass es einen pH und ein Verhältnis des osmotischen Drucks aufweist, die für eine Injektion erwünscht sind.

Claims

Ein lyophilisiertes Präparat enthaltend einen Hepatocyten-Wachstumsfaktor, ein Stabilisierungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin, Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure und ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon zur Vermeidung der Bildung von Aggregaten des Hepatocyten-Wachstumsfaktors, Natriumchlorid, und eine Puffersubstanz, dadurch gekennzeichnet, dass das lyophilisierte Präparat aus einer wässrigen Lösung hergestellt wird, die den Hepatocyten-Wachstumsfaktor in einer Konzentration von weniger als 5 mg/mL enthält und/oder dass das lyophilisierte Präparat verwendet wird zur Herstellung einer wässrigen Lösung enthaltend den Hepatocyten-Wachstumsfaktor in einer Konzentration von weniger als 5 mg/mL durch Wiederauflösung.
Das lyophilisierte Präparat gemäß Anspruch 1, wobei das Stabilisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin, Histidin, und ein pharmakologisch akzeptables Salz davon.
Das lyophilisierte Präparat gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Puffersubstanz ein Phosphorsäuresalz ist.
Das lyophilisierte Präparat gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der pH-Wert der wässrigen Lösung vor der Lyophilisierung im Bereich von 5 bis 6,5 eingestellt wird.
Das lyophilisierte Präparat gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der pH-Wert der wässrigen Lösung vor der Wiederauflösung im Bereich von 5 bis 6,5 eingestellt wird.
Das lyophilisierte Präparat gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 5, das weiterhin eine oberflächenaktive Substanz enthält.
Das lyophilisierte Präparat gemäß Anspruch 6, wobei die oberflächenaktive Substanz eine nichtionische oberflächenaktive Substanz ist.
Das lyophilisierte Präparat gemäß Anspruch 7, wobei die nichtionische oberflächenaktive Substanz eine Polyoxyethylen-Ether oberflächenaktive Substanz ist.
Das lyophilisierte Präparat gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 8, das in einem Gefäß oder in einer Ampulle hergestellt wird.
Das lyophilisierte Präparat gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Stabilisierungsmittel in einem gewichtsmäßigen Verhältnis vom 0,1 bis 30-fachen bezogen auf das Gewicht des HGF enthalten ist.
Verwendung eines Stabilisierungsmittels für HGF zur Lyophilisierung einer wässrigen Lösung enthaltend HGF in einer Konzentration von weniger als 5 mg/mL, mit einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 6,5, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin, Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, und ein pharmakologisch akzeptables Salz davon.
Die Verwendung eines Stabiliserungsmittels gemäß Anspruch 11 zur Vermeidung der Bildung von HGF-Aggregaten während der Lyophilisierung und/oder Lagerung nach der Lyophilisierung.
Die Verwendung des Stabilisierungsmittels gemäß Anspruch 11, in einem gewichtsmäßigen Verhältnis vom 0,1 bis 30-fachen bezogen auf das Gewicht des HGF.
Die Verwendung des Stabilisierungsmittels gemäß irgend einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin, Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, und ein pharmakologisch akzeptables Salz davon.
Ein Verfahren zur Herstellung eines lyophilisierten Präparates enthaltend einen Hepatocyten-Wachstumsfaktor durch Lyophilisieren einer wässrigen Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 5,0 bis 6,5 und enthaltend einen Hepatocyten-Wachtumsfaktor, ein Stabilisierungsmittel zur Vermeidung von Aggregaten des Hepatocyten-Wachstumsfaktors, Natriumchlorid, und eine Puffersubstanz, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung den Hepatocyten-Wachstumsfaktor in einer Konzentration von weniger als 5 mg/mL enthält.
Das Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das Stabilisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin, Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, und ein pharmakologisch akzeptables Salz davon.
Das Verfahren gemäß Anspruch 15 oder 16, wobei das Stabilisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin, Histidin, und ein pharmakologisch akzeptables Salz davon.
Das Verfahren gemäß irgend einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Puffersubstanz ein Phosphorsäuresalz ist.
Das Verfahren gemäß irgend einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei die wässrige Lösung weiterhin eine oberflächenaktive Substanz enthält.
Das Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die oberflächenaktive Substanz eine nichtionische oberflächenaktive Substanz ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die nichtionische oberflächenaktive Substanz eine Polyoxyethylen-Ether oberflächenaktive Substanz ist.
Das Verfahren gemäß irgend einem der Ansprüche 15 bis 21, wobei das Verfahren in einem Gefäß oder einer Ampulle durchgeführt wird.
Das Verfahren gemäß den Ansprüchen 15 bis 22, wobei das Präparat das Stabilisierungsmittel in einem gewichtsmäßigen Verhältnis vom 0,1 bis 30-fachen bezogen auf das Gewicht des HGF enthält.