DE69631930T2

DE69631930T2 - Stabilisiertes wässriges flüssiges Blutgerinnungsfaktor XIII-Präparat

Info

Publication number: DE69631930T2
Application number: DE69631930T
Authority: DE
Inventors: Naoko Hatoyama-cho Kato; Shuji Kokubunju-shi Kondo
Original assignee: Hoechst Japan Ltd
Current assignee: Sanofi Aventis KK
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2005-01-27
Anticipated expiration: 2016-06-04
Also published as: EP0754463B1; JPH08333277A; CA2178144A1; DE69631930D1; EP0754463A2; EP0754463A3; US6084074A; AU5472896A; AU722743B2; CA2178144C; ES2213759T3; DK0754463T3; ATE262315T1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabilisierte, wässrige flüssige Zubereitung des menschlichen Blutgerinnungsfaktors XIII, vorzugsweise hergestellt mittels rekombinanter DNS-Technologie, die als Stabilisator mindestens ein Element enthält, ausgewählt unter Galaktose, Saccharose, Sorbit, Glutamaten, Aspartaten und Histidin.
Beschreibung des verwandten Stands der Technik
Der menschliche Blutgerinnungsfaktor XII (im Folgenden als „Faktor XIII" bezeichnet) liegt weit verbreite in menschlichem Blutplasma oder der menschlichen Plazenta vor und wird durch Thrombin und Ca²⁺ aktiviert, wodurch er ε-(γ-Glutamyl)lysin-Bindungen zwischen verschiedenen Proteinen bildet, um die Moleküle quer zu vernetzen. Die Dimerisierung der Fibrin-γ-Kette und die Polymerisation der Fibrin-α-Kette über diesen aktiven Typus des Faktors XIII verleihen dem Fibrin Festigkeit und Elastizität und zielen auf den hämostatischen Mechanismus ab. Weiterhin katalysiert dieser aktive Typ des Faktors XIII die Quervernetzung von Fibronectin an Fibrin-α-Ketten oder Collagen und spielt eine wesentliche Rolle im Prozess der Wundheilung (Matsuda, Nippon Ketsueki Gakkai Zasshi, Band 40, Nr. 6, Seiten 995–1002 (1977)).
Zusammenfassung der Erfindung
Faktor XIII wird aus menschlicher Plazenta oder menschlichem Plasma extrahiert, gereinigt und isoliert und kann durch Pasteurisieren (Erwärmen auf 60°C für eine Zeitspanne von 10 Stunden in einer wässrigen Lösung) zur Inaktivierung verschiedener Viren (Retroviren wie das Hepatitis B-Virus, HIV-I und andere) in eine pharmazeutische Zubereitung gebracht werden. Es ist allgemein bekannt, dass der Faktor XIII dazu neigt, seine Aktivität während des Herstellungsverfahrens und bei der Lagerung zu verringern. Insbesondere ist bekannt, dass 1,0–3,0 M Aminosäuren oder 20–60 % (Gewicht/Gewicht) an Monosacchariden oder Oligosacchariden als Stabilisatoren im Hinblick auf die merkliche Verringerung der Aktivität während des Pasteurisierens zugesetzt werden können (US-Patent der Nummer 4,297,344). Wenn der Faktor XIII in flüssiger Form gelagert wird, ist die Stabilität schlecht. Daher setzt man menschliches Serumalbumin und Glukose als Stabilisatoren für die Lagerung zu; anschließend erfolgt eine Gefriertrocknung. Gegenwärtig wird er in Form einer gefriergetrockneten Zubereitung vermarktet, die mit Wasser für Injektionszwecke gemäß der Pharmacopoeia of Japan (JP) als Lösung hierfür verpackt wird. Dieser Formtyp ist schwierig dahingehend, dass die Ärzte die gefriergetrocknete Zubereitung in Wasser für Injektionszwecke genau vor der Verabreichung an die Patienten lösen müssen und dass es weiterhin die Zeit zum Lösen zum Erhalt einer homogenen Lösung erfordert, was ein großes Problem bei der Verabreichung an Patienten in Notfällen darstellte.
Ein gemäß der rekombinanten DNS-Technologie erzeugter Faktor XIII erfordert keine Sterilisierung durch Wärme, da er keine Pathogene wie Viren und andere enthält, eine wässrige Lösung desselben ist jedoch instabil.
Daher ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, eine stabilisierte wässrige flüssige Zubereitung bereitzustellen, in der der Faktor XIII in der Form einer wässrigen Flüssigkeit über eine längere Zeitspanne ohne den Bedarf an Lyophilisierung gelagert werden kann.
Mittel zur Lösung des Problems
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf eine stabilisierte, wässrige flüssige Zubereitung eines menschlichen Blutgerinnungsfaktors XIII, hergestellt über rekombinante DNS-Technologie, dadurch gekennzeichnet, dass die Zubereitung als Stabilisator mindestens ein Element umfasst, ausgewählt unter Galaktose, Saccharose, Sorbit, Glutamaten, Aspartaten und Histidin.
Beispiele für den in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Stabilisator schließen Galaktose, Saccharose, Sorbit, Glutamate, Aspartate und Histidin ein. Diese werden einzeln oder in Kombination von zwei oder mehreren verwendet. Bevorzugte Glutamate und Aspartate sind deren Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze; deren Beispiele schließen Salze von Kalium, Natrium und Magnesium ein. Glycin, Alanin, Hydroxyprolin, Glutamin, α-, β- und γ-Aminobutyrate und Glukose, die bei der Wärmedesinfektion des natürlichen Faktors XIII genutzt werden, der aus menschlicher Plazenta oder menschlichem Blutplasma extrahiert und gereinigt wird, haben sich nicht unerwarteterweise als ineffektiv als Lagerungsstabilisator für den Faktor XIII erwiesen, hergestellt über rekombinante DNS-Technologie.
Der gemäß der vorliegenden Erfindung zu stabilisierende Faktor XIII ist ein Faktor XIII, hergestellt über rekombinante DNS-Technologie, wie auch dessen Homologe mit Blutgerinnungsaktivität. Beispiele solcher Faktoren schließen den Faktor XIII ein, beschrieben in der DE 38 04 890 A1 , deren Aminosäuresequenz auf der Aminosäuresequenz des Faktors XIII basiert, beschrieben in Fig. 3 des Berichts von Grundmann et al., Natl. Acad. Sci. USA, Band 83, Seiten 8024–8028 (1986), weist die Aminosäuresequenz von Nr. 1, Ser, bis Nr. 731, Met, aus Fig. 3 auf und hat Phe anstelle der Nr. 88 Leu der Fig. 3.
Die DNS-Sequenz, kodierend die oben erwähnte Aminosäuresequenz, wird zwischen den Polylinkerstellen SstI und HindIII von pEMBLyex4 (J. K. Selton, Genetic Engineering (1987), Plenum Publishing Co., Band 9, Seiten 134–154) insertiert, bei dem es sich um einen Expressionsvektor der Hefe handelt; dadurch wird ein Plasmid zur Herstellung des Faktors XIII gebildet.
Durch Verwendung des resultierenden Plasmids CL3ABYS86 ( DE 38 04 890 A1 ) wird eine Hefe als Wirt transformiert, um den rekombinanten Faktor XIII in Hefe zu erzeugen; der rekombinante Faktor XIII wird aus dem Überstand gereinigt, indem die Hefe zerstört wird, wodurch man einen flüssigen Extrakt, enthaltend biologisch aktiven Faktor XIII, erhält.
Ein Homolog meint hierin etwas, das von der Aminosäuresequenz des Faktors XIII durch Ersatz, Deletion oder Addition modifiziert ist; somit sind Proteine mit Sequenzen, äquivalent zur Aminosäuresequenz des Faktors XIII, natürlich in den Homologen umfasst. Darüber hinaus kann ein Homolog auch als ein Protein mit einem Hauptteil der Aminosäuresequenz in einer Weise definiert sein, in der die Haupteigenschaften des Faktors XIII beibehalten sind.
Pharmazeutische Zubereitungen des Faktors XIII werden gegenwärtig durch intravenöse Injektion als gefriergetrocknete Zubereitung für die Verbesserung der Blutungsneigung, verursacht durch den angeborenen Mangel an Blutgerinnungsfaktor XIII, zur Therapie von aufgerissenen Nähten und Fisteln bei Abnahme des Blutgerinnungsfaktors XIII und zur Symptomverbesserung der Schoenlein Henoch Purpura verabreicht. Im Hinblick auf die nicht weniger als 20.000 verabreichten Fälle in Japan und Übersee und auf Basis der akuten Toxizitätstests, gezeigt in Tabelle 1, besteht üblicherweise keine Notwendigkeit für Bedenken hinsichtlich von Nebenwirkungen und Toxizität, wenn die verabreichte Menge 20–50 Einheiten/kg/Person/Tag beträgt.
Tabelle 1
Die flüssige Zubereitung der vorliegenden Erfindung kann in verschiedenen Formen auf dieselbe Weise wie eine gefriergetrocknete Zubereitung verabreicht werden; sie kann intravenös, hypodermal und intramuskulär verabreicht werden, und eine Zubereitung für die externe Anwendung auf der Haut kann ebenfalls verabreicht werden. Die flüssige Zubereitung der vorliegenden Erfindung sollte vorzugsweise an einem dunklen, kalten Ort auf dieselbe Weise, wie eine gefriergetrocknete Zubereitung gelagert werden; eine Lagerung nahe bei 4°C ist bevorzugt.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wurden Saccharose, D-Sorbit, Natrium-L-glutamat, Natrium-L-aspartat bzw. L-Histidin zu einer wässrigen Lösung des Faktors XIII (eingestellt auf einen Endtiter von 100 Einheiten/ml) zugesetzt, hergestellt über die oben erwähnte rekombinante DNS-Technologie; anschließend wurde die optimale Konzentration für den jeweiligen Fall untersucht. Unter Bezugnahme auf die Ergebnisse dieser Studien wurden schwierigere bzw. härtere Tests für flüssige Zubereitungen durchgeführt, in denen die unten aufgeführten Lösungen jeweils zum Faktor XIII (eingestellt auf einen Endtiter von 100 Einheiten/ml) zugesetzt wurden, um die Aktivitätsänderung des Faktors XIII zu bestimmen: 20 % D-Sorbit; 15 % Saccharose; 0,5 % Natrium-L-glutamat; 1 % Natrium-L-aspartat; 1 % L-Histidin; 20 % D-Sorbit mit 0,5 % Natrium-L-glutamat; 20 % D-Sorbit mit 1 % Natrium-L-aspartat; 20 % D-Sorbit mit 1 % L-Histidin; 15 % Saccharose mit 0,5 % Natrium-L-glutamat; 15 % Saccharose mit 1 % Natrium-L-Aspartat; 15 % Saccharose mit 1 % L-Histidin und als Kontrolle das Wasser für Injektionszwecke der Pharmacopoeia of Japan. Die Ergebnisse zeigen nahezu 100 % Erhalt durch den Zusatz der Stabilisatoren gemäß der vorliegenden Erfindung.
Darüber hinaus wurden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung dem Faktor XIII (eingestellt auf einen Endtiter von 100 Einheiten/ml), hergestellt über die oben erwähnte rekombinante DNS-Technologie, als Additiv 0,5 % Natrium-L-glutamat, 15 % Saccharose mit 1 % Natrium-L-aspartat, 15 % Saccharose mit 1 % L-Histidin und als Kontrolle Wasser für Injektionszwecke der Pharmacopoeia of Japan jeweils zugesetzt; die jeweiligen Lösungen wurden beschleunigten Tests zur Vorhersage der Langzeitaktivitätsänderung des Faktors XIII unterworfen. Eine Verschlechterung der Faktor XIII-Aktivität durch den Zusatz der Stabilisatoren gemäß der vorliegenden Erfindung wurde nicht gezeigt.
Hinsichtlich der Messmethoden für die Faktor XIII-Aktivität sind die Fibrinbildung, die Transglutaminaseaktivitätmessung und die immunologische Messung der Antigenmenge zu erwähnen. Hier wurde jedoch das Dansylcadaverin-Verfahren (J. Nishida et al., Thromb. Res., Band 36, Seiten 123–131 (1984)) verwendet, dass die Faktor XIII-Aktivität quantitativ mit hoher Genauigkeit bestimmen kann. Dansylcadaverin (bezogen von YATRON) ist ein fluoreszierendes Amin, bei dem es sich um ein Substrat des Faktors XIII handelt und das einen Dansylcadaverin/Kasein-Komplex mit Kasein unter Einwirkung des Faktors XIII bildet; der Komplex wird mittels Gelfiltration nach der Reaktion abgetrennt, und die Faktor XIII-Aktivität lässt sich durch die Fluoreszenzintensität des Komplexes bestimmen. Die Faktor XIII-Aktivität wird in Einheiten ausgedrückt; eine Einheit ist die Menge an Faktor XIII, die in einem Milliliter Plasma eines normalen Menschen enthalten ist.
In der pharmazeutischen Zubereitung werden Galaktose, Saccharose oder Sorbit in einer Konzentration von 1,25 bis 40, vorzugsweise 10 bis 20 Gewicht auf Volumenprozent (%(Gewicht/Volumen) = w/v%) eingesetzt. Die Aminosäure ist wirksam, wenn sie in einer Konzentration von 0,125 bis 20 w/v%, vorzugsweise 0,5 bis 2 w/v% verwendet wird. Der Faktor XIII wird in einer Konzentration von 1 bis 2.500 Einheiten/ml, vorzugsweise 60 bis 200 Einheiten/ml verwendet. Ein pH-Regler und ein Regler für den osmotischen Druck zum Isotonisieren können in die pharmazeutische Zubereitung der vorliegenden Erfindung eingearbeitet werden. Der pH der pharmazeutischen Zubereitung der vorliegenden Erfindung liegt vorzugsweise im Bereich von 6 bis 9, stärker bevorzugt im Bereich von 7 bis B.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung soll nun genauer mit Hilfe von Beispielen und Formulierungsbiespielen veranschaulicht werden.
Beispiel 1
Die optimale Konzentration der gegenwärtigen Stabilisatoren wurde untersucht.
Zu dem Faktor XIII, hergestellt gemäß der rekombinanten DNS-Technologie, wie sie in der DE 38 04 890 A1 offenbart ist (eingestellt auf einen Endtiter von 100 Einheiten/ml mit Wasser für Injektionszwecke gemäß der Pharmacopoeia of Japan), wurden Galaktose, Saccharose, D-Sorbit, Natrium-L-glutamat, Natrium-L-aspartat oder L-Histidin zugesetzt und die Mischung in einem heißen Wasserbad 30 Minuten lang auf 60°C erwärmt und anschließend die Aktivität des Faktors XIII bestimmt. Die verbleibende Aktivitätsrate (%) des Faktors XIII wurde berechnet, wobei man als 100 % die Faktor XIII-Aktivität der Zubereitung definierte, in der die Faktor XIII-Lösung auf einen Titer von 100 Einheiten/ml eingestellt war. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Eine Konzentration von Galaktose, Saccharose oder Sorbit kann effektiv 1,25–40 w/v% betragen, wobei 10–20 w/v% besonders bevorzugt sind. Eine Konzentration an Aminosäure kann effektiv 0,125–10 w/v% betragen, wobei 0,5–2 w/v% besonders bevorzugt sind. Auf Basis der obigen Ergebnisse wurden die folgenden Formulierungsbeispiele hergestellt.
Tabelle 2 verbleibende Aktivitätsrate (%)
Formulierungsbeispiel 1
Der gereinigte, rekombinante Faktor XIII wurde auf einen Titer von 200 Einheiten/ml eingestellt und mit einer 40 %-igen Lösung von D-Sobit in gleichen Volumina gemischt, um eine flüssige Zubereitung mit dem Endtiter des Faktors XIII von 100 Einheiten/ml und einem Gehalt einer 20 %-igen D-Sorbit-Lösung herzustellen.
Formulierungsbeispiele 2–13
Die in Tabelle 2 angegebenen Stabilisatoren wurden auf dieselbe Weise, wie in Formulierungsbeispiel 1 beschrieben, verwendet, um die flüssigen Zubereitungen mit dem Endtiter des Faktors XIII von 100 Einheiten/ml herzustellen, enthaltend die Lösungen von Sacchariden, Zuckeralkohol und Aminosäuren mit den in Tabelle 2 angegebenen Konzentrationen.
Beispiel 2: Härterer Test
Die Zubereitungen der Formulierungsbeispiele 1–13 wurden in einem heißen Wasserbad 30 Minuten lang auf 60°C erwärmt und anschließend die Fak00tor XIII-Aktivität bestimmt. Die verbleibende Aktivitätsrate (%) des Faktors XIII wurde berechnet, wobei die Faktor XIII-Aktivität in der Preparation, in der die Lösung des rekombinanten Faktors XIII auf einen Titer von 100 Einheiten/ml eingestellt war, als 100 % definiert wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Die Inaktivierung des Faktors XIII durch Erwärmen für 30 Minuten auf 60°C wurde durch den Zusatz von Sacchariden, Zuckeralkohol und Aminosäuren verhindert, und etwa 100 % Aktivität blieben erhalten.
Tabelle 3
Wie aus den Ergebnissen der Tabelle 3 ersichtlich, erhielt man durch den Zusatz von mindestens einem der vorliegenden Stabilisatoren zu einer Lösung des biologisch aktiven Faktors XIII, hergestellt unter Verwendung der rekombinanten DNS-Technologie, eine stabile Lösung mit einer verbleibenden Faktor XIII-Aktivität von 84 % oder darüber. Wie oben angegeben, lässt sich durch Zusatz mindestens eines der vorliegenden Stabilisatoren eine stabile und sehr sichere flüssige Zubereitung, die als aktive Bestandteile den biologisch aktiven Faktor XIII enthält, erhalten.
Beispiel 3: Beschleunigungstest
Die Formulierungen der Formulierungsbeispiele 3, 10 und 11 wurden bei 40°C gelagert. Zum Beginn der Lagerung und des ersten, zweiten und dritten Monats wurden Proben entnommen und die verbleibenden Aktivitätsraten (%) des Faktors XIII berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Wie in Tabelle 4 gezeigt, wies die Kontrolle, die flüssige Zubereitung des Faktors XIII, hergestellt gemäß der rekombinanten DNS-Technologie, enthaltend keinen Stabilisator, eine geringere Aktivität mit dem Alter während der Lagerung bei 40°C auf. Andererseits zeigten die flüssigen Zubereitungen mit mindestens einem der gegenwärtigen Stabilisatoren darin eine verbleibende Aktivität des Faktors XIII von 90% oder darüber nach drei Monaten bei 40°C.
Gemäß dieser Erfindung wird bereitgestellt eine stabile und sichere wässrige flüssige Zubereitung, enthaltend als aktiven Bestandteil Faktor XIII, durch Zusatz von mindestens einem ausgewählt unter Galaktose, Saccharose, Sorbit, Glutamat, Aspartat und Histidin. Auf diese Weise kann die Zubereitung in flüssigem Zustand über eine längere Zeitspanne gelagert werden, während sie ihre biologische Aktivität behält, und es besteht kein Bedarf für die Rücklösung wie bei der gefriergetrockneten Zubereitung, so dass den Klinikärzten Mühen bei der Verabreichung an Patienten erspart bleiben.

Claims

Verwendung einer nicht lyophilisierten Zubereitung, umfassend: a. ein erstes Element, ausgewählt unter Galaktose, Saccharose und Sorbit; b. ein zweites Element, ausgewählt unter Glutamat, Aspartat und Histidin, bei der Herstellung einer stabilen, wässrigen, flüssigen Zubereitung eines rekombinanten Faktors XIII, worin das erste Element in einer Konzentration von zwischen 1,25 und 40 % (Gewicht/Volumen) der Zubereitung vorliegt, und worin das zweite Element in einer Konzentration von zwischen 0,125 und 10 % (Gewicht/Volumen) der Zubereitung vorliegt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das zweite Element in einer Konzentration von zwischen 0,5 und 2 % (Gewicht/Volumen) vorliegt.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das zweite Element L-Histidin ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1–3, worin das erste Element Saccharose in einer Konzentration von zwischen 1,25 und 20 % (Gewicht/Volumen) ist.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Zubereitung zusätzlich ein Mittel zum Einstellen des pH-Wertes und ein Mittel zum Einstellen des osmotischen Druckes enthält.
Stabile, flüssige Zubereitung von rekombinantem Faktor XIII, worin die Zubereitung ein erstes und zweites Element, wie in einem der Ansprüche 1–4 beschrieben, enthält, und worin die Zubereitung in gelagerter, nicht lyophilisierter Form vorliegt.
Zubereitung gemäß Anspruch 6, zusätzlich umfassend ein Mittel zum Einstellen des pH-Wertes und ein Mittel zum Einstellen des osmotischen Druckes.
Stabile, wässrige, flüssige Zubereitung von rekombinantem Faktor XIII, dadurch gekennzeichnet, dass die Zubereitung als Stabilisator umfasst: a. ein erstes Element, ausgewählt unter Galaktose, Saccharose und Sorbit, worin das erste Element in der Zubereitung in einer Konzentration von zwischen 10 und 20 (Gewicht/Volumen) vorliegt und b. ein zweites Element, ausgewählt unter Glutamat, Aspartat und Histidin, worin das zweite Element in der Zubereitung in einer Konzentration von zwischen 0,125 und 10 % (Gewicht/Volumen) vorliegt.
Zubereitung gemäß Anspruch 8, worin das zweite Element in einer Konzentration von zwischen 0,5 und 2 % (Gewicht/Volumen) vorliegt.
Zubereitung gemäß Anspruch 8 oder 9, worin das zweite Element L-Histidin ist.
Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 8–10, worin das erste Element Saccharose ist.
Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 8–11, worin die Zubereitung zusätzlich ein Mittel zum Einstellen des pH-Wertes und ein Mittel zum Einstellen des osmotischen Druckes umfasst.