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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Hämatopoese
ist der Vorgang, durch den sich Blutzellen entwickeln und aus den
pluripotenten Stammzellen in dem Knochenmark differenzieren. Dieser
Vorgang beteiligt ein komplexes Zusammenspiel von Polypeptid-Wachstumsfaktoren
(Cytokinen), die über
membran-gebundene Rezeptoren auf die Zielzellen wirken. Die Cytokin-Wirkung
führt zu
zellulärer
Proliferation und Differenzierung, wobei eine Antwort auf ein bestimmtes
Cytokin häufig
abstammungsspezifisch und/oder stadienspezifisch ist. Die Entwicklung
eines einzelnen Zelltyps, wie eines Thrombozyten, aus der Stammzelle
kann die koordinierte Wirkung von einer Vielzahl von Cytokinen,
die in der richtigen Reihenfolge wirken, erforderlich machen.
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Es
wurden verschiedene Cytokine als therapeutische Wirkstoffe entwickelt.
Zum Beispiel wird Erythropoetin, das die Entwicklung von Erythrozyten
stimuliert, bei der Behandlung der Anämie, die aus renalem Versagen
entsteht, verwendet. Mehrere der koloniestimulierenden Faktoren
wurden in Verbindung mit Krebs-Chemotherapie verwendet, um die Erholung
des Immunsystems des Patienten zu beschleunigen. Interleukin-2, α-Interferon und γ-Interferon
werden bei der Behandlung bestimmter Krebsarten verwendet.
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Es
wurde eine Aktivität,
die die Megakaryozytopoese und Thrombozytopoese stimuliert, in den
Körperflüssigkeiten
thrombozytopenischer Tiere identifiziert und sie wird in der Literatur
als „Thrombopoetin" bezeichnet (kürzlich von
McDonald, Exp. Hematol. 16 : 201–205, 1988 und McDonald, Am.
J. Ped. Hematol. Oncol. 14 : 8–21,
1992 geprüft).
Dieses Protein wird jetzt unter Verwendung von gentechnisch kultivierten
Zellen hergestellt. Siehe de Sauvage et al., Nature 369 : 533–538, 1994;
Lok et al., Nature 369 565–568,
1994; Kaushansky et al., Nature 369 : 568–571, 1994 und Bartley et al.,
Cell 77 : 1117–1124,
1994.
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Menschliches
Thrombopoetin (TPO) ist ein 70 kD Glykoprotein aus 332 Aminosäureresten.
Es enthält eine
aminoterminale Wachstumsfaktor-Domäne aus ungefähr 152 Resten
und eine carboxylterminale Domäne,
die reich an Kohlenhydraten ist. Gekürzte Formen von TPO, die die
aminoterminale Domäne
umfassen, zeigen biologische Aktivität in vitro und in vivo. Es
wurden auch nichtmenschliche TPOs in der wissenschaftlichen Literatur
beschrieben (zum Beispiel Lok et al., ebenda; Bartley et al., ebenda;
Shimada et al., Blood 84 (10 Suppl. 1) : 326a, 1994).
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Die
Europäische
Patentanmeldung Nr. EP-A-858-809 offenbart in Beispiel 4 eine Zusammensetzung, die
2500 μg
TPO, 10 mg Polyoxyethylen-hydrogeniertes Rizinusöl 60 und 81,82 mg Natriumchlorid
in 10 ml 10mM Tris-Puffer (pH 6,5) enthält. Dieses Dokument kann jedoch
nur gemäß Artikel
54 (3) EPÜ berücksichtigt werden.
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Thrombopoetin
scheint Proteolyse unterworfen zu sein und wurde in heterogener
oder zersetzter Form isoliert (Bartley et al., ebenda; de Sauvage
et al., ebenda). Thrombopoetinpräparate, über die
in der wissenschaftlichen Literatur berichtet wird, sind daher nicht
gut hinsichtlich ihrer Zusammensetzung und den relativen Aktivitäten der
verschiedenen molekularen Arten charakterisiert, obwohl zumindest
einige der proteolytischen Produkte biologisch aktiv sind. Es wurde
jedoch bis zum heutigen Zeitpunkt nur über wenig Arbeiten zu der Produktion
von Erythropoetin in großem
Umfang berichtet und es besteht Bedarf auf dem Fachgebiet nach Zusammensetzungen
von TPO, die für
die pharmazeutische Verwendung geeignet sind. Solche Formulierungen sollten
bei der Lagerung stabil und einfach zu verwenden sein.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen
von TPO, einschließlich
wässerigen
Zusammensetzungen, bereitzustellen, die bei der Lagerung stabil
sind.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren für die Reduktion
der Adsorption von TPO an Oberflächen,
einschließlich
den Oberflächen
von Aufbewahrungsampullen und Filtern, die bei der Zubereitung und
Verpackung von pharmazeutischen Zusammensetzungen von TPO verwendet
werden, bereitzustellen.
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Es
ist eine zusätzliche
Aufgabe der Erfindung, Verfahren für die Stabilisierung pharmazeutischer
Zusammensetzungen von TPO, einschließlich wässeriger Lösungen und lyophilisierter
Pulver, bereitzustellen.
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Bei
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung,
die TPO, einen physiologisch akzeptablen Puffer, einen Oberflächenadsorptions-Inhibitor,
der aus der Gruppe ausgewählt
wird, die aus nicht-ionischen Tensiden und Polyolen besteht, eine
isotonische Menge eines physiologisch akzeptablen Salzes und Histidin
in einer Menge, die ausreicht, um die Aggregation von Thrombopoetin
zu reduzieren, enthält,
bereit. Das TPO kann menschliches TPO oder nicht-menschliches (zum
Beispiel Ratten-, Maus-, Hunde- oder nicht-menschliches Primaten-)
TPO sein. In bestimmten Ausführungsarten
der Erfindung ist die Zusammensetzung eine wässerige Lösung mit einem pH von 5,0 bis
7,0, vorzugsweise 5,5 bis 6,5. In einer alternativen Ausführungsart
ist die Zusammensetzung ein lyophilisiertes Pulver. In einer anderen
Ausführungsart
ist die Zusammensetzung eine wässerige
pharmazeutische Zusammensetzung, die Thrombopoetin, 10–100 mM Phosphat-Puffer,
0,01–1,0%
Polysorbat 20 oder Polysorbat 80 und eine isotonische Menge Natriumchlorid
umfasst, wobei die Zusammensetzung einen pH von ungefähr 6,0 aufweist,
und die weiter 10–100mM
Histidin umfasst.
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Die
Reduktion der Adsorption von Thrombopoetin an eine Oberfläche kann
erreicht werden, indem man zu einer wässerigen Lösung von Thrombopoetin eine
wirksame Menge eines Oberflächenadsorptions-Inhibitors,
der aus der Gruppe ausgewählt
wird, die aus nicht-ionischen Tensiden und Polyolen besteht, hinzufügt, bevor
man die Lösung
mit der Oberfläche
in Kontakt bringt. In ausgewählten
Ausführungsarten
der Erfindung ist der Oberflächenadsorptions-Inhibitor
ein Polyoxyethylen-sorbitan-Fettsäureester, wie Polysorbat 20 oder
Polysorbat 80.
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In
einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
für die
Stabilisierung einer Zusammensetzung von Thrombopoetin bereit, die
die Zugabe einer wirksamen Menge von Histidin, vorzugsweise 10–100 mM,
zu der Zusammensetzung umfasst, wobei die Zusammensetzung optional
als ein lyophilisiertes Pulver vorliegt.
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Diese
und andere Aspekte der Erfindung werden bei der Bezugnahme auf die
folgende ausführliche Beschreibung
und die angefügten
Zeichnungen offensichtlich werden.
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Kurze Beschreibung der
Abbildungen
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1 veranschaulicht
die Wirkungen von Albumin und Serumproteinen auf die Rückgewinnung
von rekombinantem Maus-TPO nach Filtration.
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2 veranschaulicht
die Wirkungen von nicht-ionischen Tensiden, Polyolen und Zucker
auf die Rückgewinnung
von rekombinantem menschlichem TPO nach Filtration.
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3 veranschaulicht
die Reduktion der Oberflächenadsorption
von TPO durch NaCl.
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4 veranschaulicht
die Wirkungen verschiedener Formulierungen auf die Adsorption von
TPO an Glasperlen.
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5 ist
ein Diagramm von Abbauprofilen für
chromatographisch gereinigtes rekombinantes menschliches TPO bei
37°C in
20mM Phosphat- oder Histidin-Puffer bei pH 6,0.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Der
Begriff „isotonisch" wird hier in seiner
konventionellen Bedeutung verwendet, dass heißt als eine Tonizität gleich
der von Blut, äquivalent
zu einer 0,9% Lösung
von NaCl. „Eine
isotonische Menge" eines
Salzes ist diejenige Menge, die erforderlich ist, um eine Lösung isoton
zu machen oder bei der Rekonstitution eines lyophilisierten Präparates
eine isotone Lösung
herzustellen.
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Die
Konzentrationen werden hier in Einheiten der Molarität oder %
Gew/V von flüssigen
Zusammensetzungen spezifiziert. Wenn die Zusammensetzung in der
Form eines lyophilisierten Pulvers vorliegt, werden die Konzentrationen
der jeweiligen Bestandteile so sein, dass sie die spezifizierte
Konzentration bei der Rekonstitution des Pulvers bereitstellen.
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Die
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind formuliert, um
den Verlust an TPO-Aktivität aufgrund
von Oberflächenadsorption,
Aggregation, anderem physikalischem oder chemischem Abbau oder Kombinationen
dieser Vorgänge
zu reduzieren. Es wurde durch die Erfinder herausgefunden, dass
nicht-ionische Tenside und Polyole die Adsorption von TPO an Oberflächen, wie
Filter oder Ampullen, reduzieren kann.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird TPO mit einem Puffer, einem Oberflächenadsorptions-Inhibitor,
der aus der Gruppe ausgewählt
wird, die aus nichtionischen Tensiden und Polyolen besteht, einer
isotonische Menge eines physiologisch akzeptablen Salzes und Histidin
in einer Menge, die ausreicht, um die Aggregation von Thrombopoetin
zu reduzieren, verbunden. Die Zusammensetzung kann als eine wässerige
Lösung oder
ein lyophilisiertes Pulver formuliert sein. Das Letztere wird vor
der Verwendung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel,
wie sterilem Wasser für
Injektionszwecke, wieder hergestellt.
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Puffer
für die
Verwendung bei der vorliegenden Erfindung beinhalten physiologisch
akzeptable Puffer geringer ionischer Stärke, die innerhalb des pH-Bereiches
von 5,0–7,0
wirksam sind. Solche Puffer beinhalten Phosphat, Acetat, Citrat,
Succinat und Histidin-Puffer.
Mit „geringer
ionischer Stärke" sind 5–500 mM,
vorzugsweise 10–100
mM, am besten ca. 20 mM, gemeint. Natrium- und Kaliumphosphat-Puffer
und Histidin-Puffer werden bevorzugt. Es wird bevorzugt, dass der
pH der Zusammensetzung bei 5,5–6,5,
am besten bei ungefähr 6,0
liegt. Ein besonders bevorzugter Puffer ist 20 mM Natriumphosphat-Puffer,
pH 6,0 (16 mM monobasisches Natriumphosphat + 4 mM dibasisches Natriumphosphat).
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Oberflächenadsorptions-Inhibitoren,
die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beeinhalten nicht-ionische
Tenside und Polyole. Nicht-ionische Tenside beeinhalten Polyoxyethylen-sorbitan-Fettsäureester,
wie Polysorbat 20 (Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat), Polysorbat 80 (Polyoxyethylen-sorbitan-monooleat)
und dergleichen. Andere in dieser Hinsicht nützliche nicht-ionische Tenside
beeinhalten Polyethylenoxide; Sorbitanester; Polyoxyethylenalkylether
und Glyceride von Fettsäuren,
einschließlich
Glycerylmonooleat und Glycerylmonostearat. Polyole für die Verwendung
bei der vorliegenden Erfindung beinhalten Polyethylenglykol (zum
Beispiel PEG 3350), Mannitol, Xylitol, Sorbitol, Inositol und Glycerol.
Im Allgemeinen wird der Oberflächenadsorptions-Inhibitor in einer
Konzentration von 0,001 % bis 5%, vorzugsweise 0,01 % bis 1,0%,
mehr vorzuziehen ungefähr
0,05% eingeschlossen. Ein besonders bevorzugter Oberflächenadsorptions-Inhibitor
ist Polysorbat 80 in einer Konzentration von ungefähr 0,05%.
Es können
auch Kombinationen von Oberflächenadsorptions-Inhibitoren
(zum Beispiel Polysorbat 80 + PEG 3350) verwendet werden.
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Es
wurde herausgefunden, dass eine isotonische Menge eines physiologisch
akzeptablen Salzes die Oberflächenadsorption
von TPO weiter reduziert, wenn es in wässerige Lösungen, die ein nicht-ionisches
Tensid enthalten, eingeschlossen wird. Bevorzugte Salze in dieser
Hinsicht beinhalten Chloridsalze wie NaCl, KCl, CaCl2 und
MgCl2. NaCl wird besonders bevorzugt. Wie
es den Fachleuten klar sein wird, werden die tatsächlich benötigten Mengen
eines Salzes, um Isotonizität
zu erreichen, von solchen Faktoren wie dem besonderen ausgewähltem Salz
und den anderen Bestandteilen der Zusammensetzung abhängen.
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Es
können
Vorteile erzielt werden, indem man in die Zusammensetzung Kombinationen
bestimmter oben offenbarter Bestandteile einschließt. Zum
Beispiel kann die Zugabe von Histidin zu einer nicht-Histidin-gepufferten
Zusammensetzung TPO in der Zusammensetzung weiter stabilisieren.
Experimentelle Anzeichen weisen darauf hin, dass Histidin die Aggregation
von TPO reduziert und auch den nicht-proteolytischen Abbau (zum
Beispiel Desamidierung oder Oxidation) bei pH > 5,5 reduzieren könnte. So wird Histidin zum
Beispiel in einer Phosphat-gepufferten TPO-Zusammensetzung in einer
Konzentration von 5–500
mM, vorzugsweise 10–100mM,
mehr vorzuziehen ungefähr
20 mM eingeschlossen. Polyethylenglykol oder ein anderes Polyol
kann zu einer Zusammensetzung, die ein nicht-ionisches Tensid enthält, zugegeben
werden, um die Oberflächenadsorption
weiter zu reduzieren. Polyole können
vorteilhaft in lyophilisierte Zusammensetzungen eingeschlossen werden,
um Aggregation zu reduzieren.
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Albumin
kann auch in die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindungen
eingeschlossen werden. Menschliches Serum-Albumin wird für den Einschluss
in pharmazeutische Zusammensetzungen, die für den Einsatz beim Menschen
gedacht sind, vorgezogen, obwohl nicht-menschliche Albumine in analysenreinen Zusammensetzungen
oder solchen, die für
tiermedizinische Verwendung gedacht sind (einschließlich experimentelle
Verwendung bei Tieren), verwendet werden können. Albumin ist als ein Bindemittel
in lyophilisierten Zusammensetzungen nützlich und wirkt als ein Stabilisator,
wenn es in einer Konzentration von 0,01–1,0%, vorzugsweise ungefähr 0,25%
eingeschlossen wird.
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Es
können
auch ein oder mehrere Konservierungsstoffe in die Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden, insbesondere in
diejenigen Zusammensetzungen, die für mehrfache Verwendung abgepackt
werden. Konservierungsmittel, die in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden können,
beinhalten solche, die allgemein in pharmazeutischen Präparaten
verwendet werden, wie Methylparaben, Propylparaben, Benzylalkohol,
m-Kresol, Ethylmercurithiosalicylat, Phenol, Thiomersal und dergleichen.
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Zucker
können
in die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als Füllstoffe,
Stabilisatoren oder Tonizitätseinsteller
eingeschlossen werden. Zucker sind als Füllstoffe und Stabilisatoren
für lyophilisierte Zusammensetzungen
von besonderem Interesse. Geeignete Zucker schließen Dextrose,
Lactose, Maltose, Saccharose, Trehalose und dergleichen mit ein.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen von TPO werden für die parenterale, insbesondere
intravenöse
oder subkutane Abgabe gemäß konventioneller
Methoden formuliert. Verfahren der Formulierung sind auf dem Fachgebiet
gut bekannt und werden zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed.,
Mack Publishing Co., Easton PA, 1990, offenbart. In pharmazeutischen
Zusammensetzungen wird die Konzentration von TPO typischerweise
innerhalb des Bereiches von 0,1 bis 10 mg/ml liegen, obwohl höher konzentrierte
Lösungen
bereitgestellt und vor der Verwendung verdünnt werden können. Es
können
auch Zusammensetzungen mit TPO-Konzentrationen
außerhalb
dieses bevorzugten Bereiches bereitgestellt werden, wie für die Verwendung
als Forschungsreagenzien. Es können
auch Bestandteile zusätzlich
zu den oben offenbarten für
auf dem Fachgebiet bekannte Zwecke eingeschlossen werden, zum Beispiel
Füllstoffe,
die vor der Lyophilisierung zugegeben werden. Diese Zusammensetzungen
können
weiter auch andere Cytokine, insbesondere früh wirkende Cytokine wie Stammzellenfaktor,
II-3, II-6, II-11 oder GM-CSF enthalten.
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TPO-Zusammensetzungen,
die für
die pharmazeutische Verwendung gedacht sind, werden steril und pyrogenfrei
sein und sie werden nach akzeptierten pharmazeutischen Vorgehensweisen
hergestellt und abgepackt werden. Diese Zusammensetzungen können als
Einheitsdosierung oder in Mengen zur Mehrfachdosierung abgepackt
werden. Die Zusammensetzungen werden typischerweise in versiegelten
Glasampullen mit Polytetrafluoretylen-ausgekleideten Stöpseln und
mit passender Etikettierung abgepackt werden. Lyophilisierte Zusammensetzungen
können
als ein Kit, das eine passende Menge eines geeigneten Verdünnungsmittel, wie
Wasser für
Injektionszwecke (WFI) oder 5% Dextrose in WFI, beinhaltet, abgepackt
werden.
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Thrombopoetin-Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung können
therapeutisch verwendet werden, wo immer es erwünscht ist, die Proliferation
von Zellen, die aus dem Knochenmark stammen, zu erhöhen, wie
bei der Behandlung von Zytopenie, wie z. B. die, die durch Aplastische
Anämie,
Myelodysplastisches Syndrome, Chemotherapie oder kongenitale Zytopenien
induziert wird. TPO ist besonders für die Steigerung der Thrombozyten-Produktion,
wie zum Beispiel bei der Behandlung von Thrombozytopenie, nützlich. Thrombozytopenie
ist mit einer vielfältigen
Gruppe von Erkrankungen und klinischen Situationen vergesellschaftet,
die alleine oder zusammen wirken können, um den Zustand hervorzurufen.
Erniedrigte Thrombozytenwerte können
zum Beispiel aus Defekten bei der Thrombozyten-Produktion, anormaler
Thrombozytenverteilung, Verdünnungsverlusten
aufgrund massiver Transfusionen oder anormaler Zerstörung von
Thrombozyten resultieren. Zum Beispiel können chemotherapeutische Medikamente,
die bei der Krebstherapie verwendet werden, die Entwicklung von
Thrombozyten-Vorläuferzellen
in dem Knochenmark unterdrücken
und die resultierende Thrombozytopenie begrenzt die Chemotherapie
und kann Transfusionen notwendig machen. Zusätzlich können bestimmte Tumoren die
Thrombozyten-Produktion und Thrombozyten-Verteilung behindern. Bestrahlungstherapie,
die verwendet wird, um bösartige
Zellen zu töten,
tötet auch
Thrombozyten-Vorläuferzellen.
Thrombozytopenie kann auch aus verschiedenen autoimmunen Thrombozytenstörungen,
die durch Medikamente, neonatale Alloimmunität oder Thrombozyten-Transfusions-Alloimmunität induziert
werden, entstehen. TPO kann die Notwendigkeit für Transfusionen reduzieren
oder verhindern, wodurch die Inzidenz von Thrombozyten-Alloimmunität verringert
wird. Anormale Zerstörung
von Thrombozyten kann resultieren aus: (1) erhöhtem Thrombozytenverbrauch
in Gefäßtransplantaten
oder traumatisiertem Gewebe oder (2) Immunmechanismen, die zum Beispiel
mit medikamenten-induzierter Thrombozytopenie, Idiopathischer thrombozytopenischer
Purpura (ITP), Autoimmun-Erkrankungen, hämatologischen Störungen wie
Leukämie
und Lymphom oder metastatischen Tumoren, die das Knochenmark mit
einbeziehen, vergesellschaftet sind. Andere Indikationen für TPO schließen Aplastische
Anämie
und Medikamenten-induzierte Knochenmarkssuppression, die zum Beispiel
aus Chemotherapie oder Behandlung einer HIV-Infektion mit AZT resultiert,
mit ein.
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Thrombozytopenie
manifestiert sich als verstärkte
Blutung, wie Schleimhautblutungen aus dem Nasen-Rachen-Raum oder
dem Gastrointestinal-Trakt, wie auch als Sickerblutungen aus Wunden,
Ulcera oder Injektionsorten.
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Therapeutische
Dosierungen werden im Allgemeinen in dem Bereich von 0,1 bis 100 μg/kg Patientengewicht
pro Tag, vorzugsweise bei 0,5–50 μg/kg pro
Tag, mehr vorzuziehen bei 1–25 μg/kg/Tag
liegen, wobei die genaue Dosis durch den Kliniker, der die Art und
Schwere des Zustandes, der behandelt werden soll, die Patienteneigenschaften
etc. berücksichtigt,
gemäß akzeptierten
Standards festgelegt wird. Die Festlegung der Dosis liegt innerhalb
der normalen Level der Befähigung
auf dem Fachgebiet. TPO wird gewöhnlich über einen Zeitraum
von bis zu 28 Tagen in Folge einer Chemotherapie oder Knochenmarkstransplantation
oder bis eine Thrombozytenzahl von > 20.000/mm3, vorzugsweise > 50.000/mm3,
erreicht ist, verabreicht. Häufiger
wird TPO über
eine Woche oder weniger, oft über
einen Zeitraum von 1 bis 3 Tagen verabreicht werden. Im Allgemeinen
ist eine therapeutisch wirksame Menge von TPO eine Menge, die ausreicht,
um eine klinisch signifikante Steigerung in der Proliferation und/oder
Differenzierung von Lymph- oder Knochenmarks-Vorläuferzellen hervorzurufen,
was sich als eine Steigerung in den zirkulierenden Spiegeln reifer
Zellen (z.B. Thrombozyten, Erythrozyten oder Neutrophilen) manifestieren
wird. Die Behandlung von Thrombozytenstörungen wird so fortgesetzt
bis eine Thrombozytenzahl von mindestens 20.000/mm3,
vorzugsweise 50.000/mm3, erreicht ist. TPO kann
auch in Kombination mit anderen Cytokinen wie IL-3, -6 und -11;
Stammzellenfaktor; Erythropoetin (EPO); G-CSF und GM-CSF verabreicht werden. Innerhalb
von Regimen für
Kombinationstherapie, werden die täglichen Dosierungen für andere
Cytokine in Allgemeinen sein: EPO, < 150 U/kg; GM-CSF, 5–15 μg/kg; IL-3,
1–5 μg/kg und
G-CSF, 1–25 μg/kg. Eine
Kombinationstherapie mit EPO ist zum Beispiel bei anämischen Patienten
mit niedrigen EPO-Spiegeln indiziert.
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TPO
kann auch ex vivo verwendet werden, wie in einer autologen Knochenmarks-Kultur.
Kurz gesagt wird Knochenmark von einem Patienten vor Chemotherapie
entnommen und mit TPO, optional in Kombination mit einem oder mehr
anderen Cytokin(en), behandelt. Das behandelte Knochenmark wird
dann nach der Chemotherapie an den Patienten zurückgegeben, um die Erholung
des Knochenmarks zu beschleunigen. Zusätzlich kann TPO für die ex
vivo Expansion von Knochenmark oder peripheren Blut-Vorläuferzellen (PBCP)
verwendet werden. Vor einer Chemotherapie-Behandlung kann Knochenmark
mit Stammzellenfaktor (SCF) oder G-CSF stimuliert werden, um frühe Vorläuferzellen
an die periphere Zirkulation freizusetzen. Diese Vorläufer können aus
dem peripheren Blut gesammelt und konzentriert werden und dann in
Kultur mit TPO, optional in Kombination mit einem oder mehreren
anderen Cytokin(en), einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, SCF, G-CSF, II-3, GM-CSF, II-6 oder II-11, behandelt werden,
um sich in Megakaryozyten-Kulturen hoher Dichte zu differenzieren
und proliferieren, die dann dem Patienten nach der Hochdosis-Chemotherapie
wieder zugeführt werden
können.
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TPO
ist auch als ein Laborreagens bei dem Studium hämatopoetischer Vorgänge nützlich.
Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen
lagerungsstabile Präparate
für solche
Verwendungen bereit.
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Die
Erfindung wird weiter durch die folgenden, nicht beschränkenden
Beispiele veranschaulicht.
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Beispiele
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Rekombinantes
menschliches und Maus-TPO wurden unter Verwendung transfizierter
Babyhamster-Nierenzellen (BHK 570 Zellen; ATCC CRL 10314) hergestellt.
TPO wurde aus zellkonditionierten Kulturmedien durch Affinitätschromatographie
auf immobilisiertem MPL-Rezeptor oder chromatographisch unter Verwendung
einer Kombination aus Farbstoff-Ligand-Affinitätschromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie
und Adsorption auf Protein-Kontaminanten auf Hydroxyapatit gereinigt.
Die biologische Aktivität
von TPO wurde in einem Mitogenese-Assay unter Verwendung von BaF3-Zellen,
die mit einem Expressionsvektor, der den menschlichen MPL-Rezeptor
kodiert (Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 5640–5644, 1992), transfiziert
wurden, als Zielzellen bestimmt. BaF3 ist eine Interleukin-3-abhängige Prä-Lymphzell-Linie,
die aus Maus-Knochenmark
stammt (Palacios und Steinmetz, Cell 41 : 727–734, 1985; Mathey-Prevot et
al., Mol. Cell. Biol. 6 : 4133–4135,
1986). Die Zellen wurden Testproben in der Gegenwart von 3H-Thymidin ausgesetzt. Die Menge von 3H-Thymidin, das in die zelluläre DNA eingeschlossen
war, wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve von menschlichem
TPO quantifiziert. 10 U/ml wurden als die Menge, die halbmaximale
Stimulation in dem Mitogenese-Assay ergab, definiert.
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Polysorbat
80 (Tween 80), Reinheitsgrad NF, wurde von Spectrum Chemical Mfg..
Corp., New Brunswick, NJ, erhalten. Natriumchlorid (AR, USP), Natriumphosphat,
dibasisch, Heptahydrat (USP, TAC) und Natriumphosphat, monobasisch,
Monohydrat (USP), wurden von Mallinkrodt Chemical Corp., Chesterfield,
MO erhalten.
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Beispiel 1
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Die
Oberflächenadsorption
von gereinigtem Thrombopoetin wurde durch Filter-Rückgewinnung
und Rückgewinnung
aus Lösungen,
die mit Glasperlen inkubiert wurden, beurteilt. Proben von TPO wurden
in geeigneten Puffern (siehe Tabelle) für die Testung verdünnt. Tabelle
- *
chrom. = chromatographisch gereinigt; affin. = affinitätsgereinigt.
- ** Mito Verdünner
= RPMI 1640 ergänzt
mit 10% FBS, 1% L-Glutamin, 1% PSN antibiotische Mischung (Penecillin,
Streptomycin, Neomycin), 0,001 M Natriumpyruvat, 0,025 M Hepes,
0,00033% Gew./V. Mercaptoethanol.
-
Die
Filteradsorption wurde unter Verwendung von 0,2 μm Polyvinylidenfluorid-Membranfiltern (DuraporeTM Filter; Millipore, Bedford, MA) oder AcrodiscTM Membranfiltern (Gelman Sciences, Ann Arbor,
MI), befestigt an Spritzen, gemessen. Die Lösungen von TPO wurden durch
die Filter per Hand gedrückt.
Es wurden Proben vor der Zugabe der Lösung an die Spritze und nach
dem Durchtritt durch den Filter genommen. Es wurde gefunden, dass
die Rückgewinnung
von rekombinantem Maus-TPO
in Formulierungen, die 0,25% menschliches Serumalbumin enthielten,
höher war
als in denjenigen ohne Albumin (1). Ähnliche
Ergebnisse wurden mit rekombinantem menschlichen TPO erhalten. Es
wurden keine großen
Unterschiede in der Filterrückgewinnung
als eine Funktion des pH über
den getesteten Bereich (pH 4–8)
beobachtet, aber die Rückgewinnung
war bei pH 6,0 am größten. Die
Oberflächenadsorption
von menschlichem rekombinanten TPO wurde ebenfalls reduziert, wenn
0,01 % Polysorbat 80 in die Formulierung eingeschlossen wurde (2). Man
fand heraus, dass isotonisches Natriumchlorid die Adsorption in
Gegenwart von Polysorbat 80 weiter reduziert (3).
-
Die
Oberflächenadsorption
wurde weiter unter übertriebenen
Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnissen unter
Verwendung von Glasperlen untersucht. Es wurden 0,5 ml Proben von
verdünnten
TPO-Lösungen
(≈ 10 μg/ml) gegenüber 1,0
g Glasperlen (425–600 μm) bei 5°C auf einem
Röhrchen-Schüttler ausgesetzt.
Die mitogene Aktivität
wurde nach 1,5, 5 und 24 Stunden bestimmt, um die Adsorption als
eine Funktion der Zeit auszuwerten. Wie in 4 gezeigt
wird, nahm die Adsorption über
den 24 Stunden Testzeitraum mit der Zeit zu. Die Adsorption wurde
in einem größeren Ausmaß durch
Polysorbat 80 als durch Polysorbat 20 reduziert. Die Rückgewinnung
nahm zu, als die Polysorbat 80 Konzentration von 0,001 % auf 0,05%
erhöht
wurde. Die Kombination von Polysorbat 80 und isotonischem Natriumchlorid
war bei der Reduktion der Oberflächenadsorption wirksamer
als Polysorbat 80 allein.
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Beispiel 2
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Der
Effekt des pH auf die Stabilität
von TPO in Lösung
wurde in Phosphat- und Histidin-Puffern getestet. Proben von affinitäts- und
chromatographisch gereinigtem Maus- und Mensch-TPO wurden in geeigneten Puffern
verdünnt
oder mit NaOH oder HCl bis zu dem gewünschten pH titriert (siehe
Tabelle). Die Proben wurden dann bei verschiedenen Temperaturen
gelagert und intermittierend durch Mitogenese-Assay, wie oben beschrieben,
und SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS PAGE), gefolgt von
Western Blotting untersucht. Pseudo-Abbaugeschwindigkeitskonstanten 1.
Ordnung (Kobs) wurden aus den Abfällen der
log-linearen Einstellungen (fits) der verbleibenden mitogenen Aktivität gegen
die Zeit geschätzt,
wenn geeignet.
-
SDS
PAGE/Western Blot Analyse zeigte, dass affinitätsgereinigtes rekombinantes
menschliches TPO Proteolyse zu Varianten geringeren Molekulargewichtes
auf eine pH- und zeitabhängige
Weise unterworfen ist. In dem pH-Bereich von 6–8, resultierte die Proteolyse
in der Spaltung in zwei Varianten geringeren Molekulargewichtes
(35 und 18 kD durch Gelelektrophorese), wobei die Proteolyse mit
zunehmendem pH als eine Funktion der Temperatur zunahm. Bei pH ≤ 5, trat ein
Abbauprodukt mit einem offensichtlich gering niedrigerem Molekulargewicht
als das des Elternproteins (≈ 60
kD durch Gelelektrophorese) auf und nahm mit abnehmendem pH als
eine Funktion der Temperatur zu.
-
Chromatographisch
gereinigtes rekombinantes menschliches TPO zeigte ein unterschiedliches
Abbauprofil. SDS PAGE/Western Blot Analyse wies auf eine temperaturabhängige Spaltung
in zwei Arten niedrigeren Molekulargewichtes (30 und 20 kD durch
Gelelektrophorese) bei pH ≤ 5
auf, wobei die Proteolyse mit abnehmenden pH zunahm. Es wurde keine
signifikante Proteolyse bei pH > 6
beobachtet, es bildeten sich jedoch Aggregate höheren Molekulargewichtes bei
Zunahme von pH und Temperatur. Alle Abbauprodukte wiesen geringere
biologische Aktivität
als ihr Elternprotein auf. Die pH-Geschwindigkeitsprofile (in Kobs gegen pH), die die Pseudo-Abbaugeschwindigkeiten
1. Ordnung (Kobs) des Proteins darstellen,
legten Unterschiede in den relativen Abbaugeschwindigkeiten der
verschiedenen Stoffwechselwege als eine Funktion der Temperatur
nahe. Die Profile bei 30°C
und 37°C
waren ähnlich
und zeigten einen pH maximaler Stabilität ≈ 6. Obwohl ein schneller Verlust
an Bioaktivität
bei pH > 6 auftrat,
wurden grobe Änderungen
durch SDS PAGE und Western Blotting nicht offensichtlich. Diese
Ergebnisse legten nahe, dass bei pH > 6 der Abbau vorrangig über Desamidierung,
Oxidation oder irgendeinen anderen Mechanismus, der durch Elektrophorese
nicht nachweisbar ist, auftritt. Die Abbaugeschwindigkeit bei 5°C war bei
pH ≤ 6 relativ
konstant, was nahe legt, das der/die Abbau-Stoffwechselweg(e) in
diesem pH-Bereich eine große
Aktivierungsenergie (steile Temperaturabhängigkeit) besitzen und nicht
wesentlich zu dem gesamten Verlust von TPO bei dieser Temperatur
beitragen.
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Äquivalente
Abbaugeschwindigkeiten wurden als eine Funktion des pH gefunden,
wenn die Ergebnisse mit Natrium- und Kalium-Phosphat-Puffern verglichen
wurden. Es wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet, wenn
verschiedene Konzentrationen von Kaliumphosphat-Puffern verwendet
wurden (20 mM–100mM,
pH 6,0). Es wurden jedoch Unterschiede bemerkt, wenn Histidin als
ein Puffer (20 mM) in dem pH-Bereich von 5 bis 6 verwendet wurde.
Die Abbaugeschwindigkeit war bei einem pH von 5,0 bei Histidin-Puffer
größer als
bei Phosphat-Puffer bei 37°C,
aber bei pH 5,5 oder 6,0 waren die Abbaugeschwindigkeiten äquivalent
oder niedriger bei Histidin-Puffer (5). Ähnliche
Ergebnisse wurden bei 30°C
gesehen, obwohl die Unterschiede weniger stark waren. Bei 5°C waren die
Abbaugeschwindigkeiten bei Histidin- und Phosphat-Puffern bei pH
5–6 äquivalent.
Diese Ergebnisse stimmen mit gesteigertem Abbau über Niedrig-pH-Abbaustoffwechselwege
in der Gegenwart von Histidin überein,
während
Histidin den Abbau über
Hoch-pH-Stoffwechselwege reduziert. Da die Niedrig-pH-Stoffwechselwege
inhibiert werden, wenn die Temperatur gesenkt wird, ist der verstärkte Abbau
in der Gegenwart von Histidin bei 5°C nicht feststellbar.
