KR100265222B1

KR100265222B1 - 트롬보포이에틴조성물

Info

Publication number: KR100265222B1
Application number: KR1019970709023A
Authority: KR
Inventors: 리챠드 아이. 샌더로프; 캐슬린 엠. 콘토
Original assignee: 리스 데브라 케이.; 지모제넥틱스, 인코포레이티드
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-05-22
Publication date: 2000-09-15
Also published as: WO1996040217A1; JP3479082B2; DE69634633D1; CA2223446A1; DE69634633T2; US6790439B1; JPH10510841A; TW443934B; JP2000198745A; KR19990022542A; AU696944B2; ATE293454T1; NZ505602A; EP0831886B1; EP0831886A1; AU5802396A; NZ308395A

Abstract

트롬보포이에틴 조성물, 표면에 트롬보포이에틴의 흡착을 감소시키는 방법, 및 트롬보포이에틴 조성물을 안정화시키는 방법이 개시된다. 이 조성물은 트롬보포이에틴에 추가로 생리학적으로 허용가능한 완충액, 비-이온성 계면활성제 및 폴리올로 구성된 군으로부터 선택된 표면흡착 저해제, 및 등장량의 생리학적으로 허용가능한 염으로 이루어진다.

Description

트롬보포이에틴 조성물{THROMBOPOIETIN COMPOSITIONS}

조혈은 혈액세포가 골수의 다능성 간세포(pluripotent stem)로부터 발생 및 분화하는 과정이다. 이 과정은 표적세포상의 막-결합된 리셉터를 통해 작용하는 폴리펩티드 성장 인자(시토킨)의 복잡한 상호작용을 포함한다. 시토킨 작용은, 종종 계통-특이적 및/또는 단계-특이적인 특별한 시토킨에 대한 반응으로, 세포 증식 및 분화를 초래한다. 간세포로부터 혈소판같은 단일 세포형태의 발달은 적당한 순서로 작용하는 복수의 시토킨의 조화된 작용을 요구할 것이다.

다양한 시토킨이 치료제로서 개발되어 왔다. 예를 들어, 적혈구 발생을 자극하는 에리스로포이에틴은 신부전으로부터 발생하는 빈혈의 치료에 사용된다. 콜로니 자극 인자중 몇몇은 환자의 면역체계의 회복을 가속화하기 위한 암 화학요법과 함께 사용되어 왔다. 인터루킨-2, α-인터페론 및 γ-인터페론은 특정 암의 치료에서 사용된다.

거핵구형성 및 혈소판조혈(thrombocytopoiesis)을 자극하는 활성이 혈소판감소증 동물의 체액에서 동정되었으며 문헌에서 "트롬보포이에틴"으로 언급된다( McDonald,Exp. Hematol 16: 201-205, 1988 및 McDonald,Am. J. Ped. Hematol. Oncol. 14: 8-21, 1992). 이 단백질은 현재 유전학적으로 조작된 배양세포를 사용하여 제조된다. De Sauvage et al.,Nature 369: 533-538, 1994; Lok et al.,Nature 369: 565-568, 1994; Kaushansky et al.,Nature 369: 568-571, 1994; 및 Bartley et al.,Cell 77: 1117-1124, 1994 참조.

인간 트롬보포이에틴(TPO)은 332 아미노산 잔기의 70kD 당단백질이다. 이것은 대략 152 잔기의 아미노-말단 성장인자 도메인 및 탄수화물이 풍부한 카르복실-말단 도메인을 함유하고 있다. 아미노-말단 도메인으로 이루어진 TPO의 절단된(truncated) 형태는 생체외 및 생체내에서 생물학적 활성을 나타낸다. 또한 비-인간 TPO들도 과학문헌에 기재되어 왔다(예를 들어, Lok et al., ibid.; Bartley et al., ibid.; Shimada et al.,Blood 84(10 Suppl. 1): 326a, 1994).

트롬보포이에틴은 단백질분해가 일어나기가 쉬우며 이질성 또는 분해된 형태로 분리되었다(Bartley et al., ibid.; de Sauvage et al., ibid.). 따라서 과학 문헌으로 보고된 트롬보포이에틴의 제조물은 단백질분해 생성물의 적어도 일부가 생물학적으로 활성적이라 하더라도, 다양한 분자종류의 조성 및 비교활성에 관해 잘 특징화되어 있지 않다. 그러나, 지금까지 트롬보포이에틴의 대규모 생산에 대한 연구가 거의 보고되지 않았으며, 약제학적 용도에 적절한 TPO 조성물이 당업계에서 요구된다. 이러한 조제물은 저장시 안정해야 되며 사용하기에 쉬워야만 한다.

발명의 개요

저장시 안정한 수성 조성물을 포함하여 TPO의 약제학적 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

TPO의 약제학적 조성물의 제조 및 포장에서 사용되는 저장 바이알 및 필터의 표면을 포함하여, 표면에 TPO의 흡착을 감소시키는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 심화된 목적이다.

수용액 및 동결건조된 분말을 포함하여, TPO의 약제학적 조성물을 안정화하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또따른 목적이다.

일면으로, 본 발명은 TPO, 생리학적으로 허용가능한 완충액, 비-이온성 계면활성제 및 폴리올로 구성된 군으로부터 선택되는 표면 흡착 저해제, 및 등장량의 생리학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물을 제공한다. TPO는 인간 TPO 또는 비-인간(예를 들어, 랫트, 마우스, 개 또는 비-인간 영장류) TPO일 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서는, 조성물은 pH 5.0 내지 7.0, 바람직하게는 5.5 내지 6.5를 갖는 수용액이다. 다른 구체예에서, 조성물은 동결건조된 분말이다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 트롬보포이에틴의 응집을 감소시키기에 충분한 양의 히스티딘을 포함한다. 다른 구체예에서, 조성물은 트롬보포이에틴, 10-100mM 인산염 완충액, 0.01-1.0% 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80, 및 등장량의 염화나트륨을 포함하는 수성 약제학적 조성물이며, 이 조성물은 약 pH 6.0을 가진다.

다른 면으로, 본 발명은 TPO 수용액을 표면과 접촉시키기 전에 비-이온성 계면활성제 및 폴리올로 구성된 군으로부터 선택된 표면 흡착 저해제의 유효량을 트롬보포이에틴 수용액에 첨가하는 것으로 이루어지는 표면에 트롬보포이에틴의 흡착을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 선택된 구체예에서, 표면 흡착 저해제는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80과 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르이다.

또 다른 면으로, 본 발명은 히스티딘의 유효량을 TPO 조성물에 첨가하는 것으로 이루어지는 트롬보포이에틴의 조성물을 안정화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 이런 면들 및 다른 면들은 다음 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참고로 하여 명백해질 것이다.

도 1은 여과후 재조합 마우스 TPO의 회수에 대한 알부민 및 혈청 단백질의 효과를 예시한다.

도 2는 여과후 재조합 인간 TPO의 회수에 대한 비-이온성 계면활성제, 폴리올 및 당의 효과를 예시한다.

도 3은 NaCl에 의한 TPO의 표면 흡착의 감소를 예시한다.

도 4는 유리비드에 TPO의 흡착상에 대한 다양한 조제물의 효과를 예시한다.

도 5는 pH 6.0의 20mM 인산염 또는 히스티딘 완충액, 37℃에서 크로마토그래피로 정제된 재조합 인간 TPO에 대한 분해 프로파일을 도시한다.

용어 "등장"은 여기서 0.9% NaCl 용액에 해당하는 혈액과 동일한 삼투성인 종래 의미로 사용된다. 염의 "등장량"은 용액을 등장성으로 만들기 위해서 또는 동결건조된 제조물의 재구성시에 등장 용액을 제조하기 위해서 요구되는 양이다.

농도는 여기서 액체 조성물의 몰농도 또는 % w/w 단위로 명기된다. 조성물이 동결건조된 분말의 형태로 있을 때, 각 성분의 농도는 분말의 재구성시에 농도로 명기될 것이다.

본 발명의 조성물은 표면흡착, 응집, 다른 물리적 또는 화학적 분해, 또는 이런 과정의 조합으로 인한 TPO 활성의 손실을 감소시키기 위해서 제제화(formulate)된다. 비-이온성 계면활성제 및 폴리올이 필터 또는 바이알같은 표면에 TPO의 흡착을 감소시킬 수 있다는 것이 본 발명자들에 의해 발견되었다.

본 발명에 따라서, TPO는 완충액, 비-이온성 계면활성제 및 폴리올로 구성되는 군으로부터 선택된 표면 흡착 저해제, 및 등장량의 생리학적으로 허용가능한 염으로 조합된다. 조성물은 수용액 또는 동결건조된 분말로 제제화될 수 있다. 후자는 주사를 위한 멸균수같은 약학적으로 허용가능한 희석제로 사용전에 재구성된다.

본 발명에서 사용하기 위한 완충액은 5.0-7.0의 pH 범위내에서 효과적인 저 이온 강도, 생리학적으로 허용가능한 완충액을 포함한다. 이러한 완충액은 인산염, 아세트산염, 구연산염, 숙신산염 및 히스티딘 완충액을 포함한다. "저 이온 강도"는 5-500mM, 바람직하게 10-100mM, 가장 바람직하게는 약 20mM을 의미한다. 인산나트륨 및 인산칼륨 완충액 및 히스티딘 완충액이 바람직하다. 조성물의 pH는 5.5-6.5이 바람직하며, 가장 바람직하게는 약 6.0이다. 특히 바람직한 완충액은 20mM 인산나트륨 완충액, pH 6.0(16mM 일염기성 인산나트륨＋4mM 이염기성 인산나트륨)이다.

본 발명에서 유용한 표면흡착 저해제로는 비-이온성 계면활성제 및 폴리올을 포함한다. 비-이온성 계면활성제로는 폴리소르베이트 20(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트), 폴리소르베이트 80(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트) 등같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르를 포함한다. 이런 점에서 유용한 다른 비-이온성 계면활성제는 폴리에틸렌 산화물; 소르비탄 에스테르; 폴리옥시에틸렌알킬 에테르; 및 글리세릴 모노올레에이트 및 글리세릴 모노스테아레이트를 포함하는 지방산의 글리세리드를 포함한다. 본 발명내에서 사용하기 위한 폴리올은 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, PEG 3350), 만니톨, 크실리톨, 소르비톨, 이노시톨, 및 글리세롤을 포함한다. 일반적으로, 표면 흡착 저해제는 0.001% 내지 5%, 바람직하게 0.01% 내지 1.0%, 더욱 바람직하게는 약 0.05% 농도로 포함될 것이다. 특히 바람직한 표면 흡착 저해제는 약 0.05% 농도의 폴리소르베이트 80이다. 표면흡착 저해제의 조합(예를 들어, 폴리소르베이트 80＋PEG 3350)이 또한 사용될 수 있다.

등장량의 생리학적으로 허용가능한 염이 비-이온성 계면활성제를 함유하는 수용액에 포함되었을 때 TPO의 표면흡착을 더욱 감소시키는 것으로 나타났다. 이런 점에서 바람직한 염은 NaCl, KCl, CaCl₂및 MgCl₂와 같은 염화염을 포함한다. NaCl이 특히 바람직하다. 당업자에게 명백할 것처럼, 등장성을 달성하기 위해 요구되는 염의 실제량은 선택된 특별한 염 및 조성물의 다른 성분같은 요소에 의존할 것이다.

상기 개시된 어떤 성분을 조성물 조합내에 포함시킴으로써 이점이 얻어질 수 있다. 예를 들어, 비-히스티딘-완충된 조성물에의 히스티딘의 첨가는 조성물에서 TPO를 더욱 안정화시킬 수 있다. 실험적 증거는 히스티딘이 TPO의 응집을 감소시키며 또한 pH＞5.5에서 비-단백질분해(예를 들어, 탈아미드화 또는 산화)를 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 따라서 히스티딘은 예를 들어, 5-500mM, 바람직하게 10-100mM, 더욱 바람직하게는 약 20mM의 농도로 인산-완충된 TPO 조성물에 포함될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 폴리올이 표면흡착을 더욱 감소시키기 위해서 비-이온성 계면활성제를 함유하는 조성물에 첨가될 수 있다. 히스티딘 및 폴리올은 응집을 감소시키기 위해서 동결건조된 조성물에 유리하게 포함될 수 있다.

알부민이 또한 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 비-인간 알부민이 시약-등급 조성물 또는 수의학적 사용에서 의도되는 조성물(동물에서 실험적 사용을 포함하여)내에서 사용될 수 있다 하더라도, 인간 혈청 알부민이 인간 사용에 의도되는 약학적 조성물에 포함하는 것이 바람직하다. 알부민은 동결건조된 조성물에서 부형제로서 유용하며 0.01-1.0%, 바람직하게 약 0.25%의 농도로 포함되었을 때 안정제로서 작용한다.

하나 이상의 방부제가 또한 본 발명의 조성물에, 특히 다회 사용을 위해 포장된 그러한 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명내에서 사용될 수 있는 방부제는 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤질알코올, m-크레졸, 에틸머큐리티오살리실레이트, 페놀, 티메로살 등과 같은 약제학적 제제화에서 보통 사용되는 것들을 포함한다.

당은 충전제, 안정제, 또는 삼투 조절제로서 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 당은 동결건조된 조성물에 대해 충전제 및 안정제로서 특히 흥미있다. 적당한 당으로는 덱스트로스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로스 등을 포함한다.

TPO의 약제학적 조성물은 종래방법에 따라 비경구적, 특히 정맥내 또는 피하내 투여용으로 제제화된다. 제제화 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어,Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990에 개시되어 있으며, 여기 참고문헌으로 통합되어 있다. 약제학적 조성물에서, 비록 더 높은 농도 용액이 제공되고 사용전에 희석될 수 있다 하더라도, TPO의 농도는 전형적으로 0.1 내지 10mg/ml 범위내일 것이다. 이런 바람직한 범위밖의 TPO 농도를 가지는 조성물은 또한 연구시약으로의 사용용 등으로, 제조될 수 있다. 상기 개시된 것에 추가로 예를 들어 동결건조전에 첨가되는 충전제같은 성분이 본 분야에 공지된 목적을 위해 포함될 수 있다. 이런 조성물은 다른 시토킨, 특히 간세포인자, IL-3, IL-6, IL-11 또는 GM-CSF같은 초기-작용 시토킨을 더 함유할 수 있다.

약제학적 사용에 의도되는 TPO 조성물은 멸균되고 및 발열인자(pyrogen)이 없는 것일 것이며 허용되는 약제학적 방법에 따라 제조되고 포장될 것이다. 조성물은 단위 투여량 또는 수회 투여량으로 포장될 수 있다. 조성물은 전형적으로 안이 폴리테트라플루오로에틸렌으로 된 마개 및 적당한 라벨을 가지는 봉합된 유리 바이알로 포장될 것이다. 동결건조된 조성물은 주사용 물(WFI) 또는 WFI중의 5% 덱스트로스같은 적당한 희석제의 적당한 양을 포함하는 키트로서 포장될 수 있다.

본 발명의 트롬보포이에틴 조성물은 재생불량성빈혈, 척수이형성 증후군, 화학요법 또는 선천성 혈구감소증에 의해 유도되는 것같은 혈구감소증의 치료에서처럼 골수계통의 세포증식을 증가가 요구되는 어느곳에서도 치료적으로 사용될 수 있다. TPO는 혈소판감소증의 치료에서같은 혈소판 생성을 증가시키는데 특히 유용하다. 혈소판 감소증은 이 상태를 생성하기 위해서 단독 또는 함께 작용하는 다양한 그룹의 질환 및 임상학적 상태와 관련되어 있다. 감소된 혈소판 수는 예를 들어, 혈소판 생성에서의 결함, 비정상적 혈소판 파괴, 대량수혈로 인한 희석적 손실, 또는 비정상적 혈소판 파괴의 결과일 수 있다. 예를 들어, 암 치료에서 사용되는 화학치료제는 골수에서 혈소판 전구세포의 발달을 억제할 수 있으며, 결과적으로 나타내는 혈소판감소증은 화학요법을 제한하며 수혈을 요구할 수 있다. 또한, 어떤 악성종양은 혈소판 생성 및 혈소판 분포를 손상시킬 수 있다. 악성 세포를 죽이기 위해 사용되는 방사선 요법은 또한 혈소판 전구세포를 죽인다. 혈소판감소증은 또한 약제, 신생아 동종면역성 또는 혈소판 수혈 동종면역성에 의해 유도되는 다양한 혈소판 자가면역 장애로부터 발생할 수 있다. TPO는 수혈의 필요를 감소시키거나 또는 제거시킬 수 있으므로 혈소판 동종면역성의 발생을 감소시킬 수 있다. 비정상적 혈소판 파괴는 (1) 혈관이식 또는 상처난 조직에서 증가된 혈소판 소비; 또는 (2) 예를 들어, 약제-유도된 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증 자반병(ITP), 자가면역질환, 백혈병 및 골수와 관련된 임파종 또는 전이암 같은 조혈장애와 관련된 면역 기작의 결과일 수 있다. TPO에 대한 다른 적용은 예를 들어 화학요법 또는 AZT로 HIV 감염의 치료로부터 발생하는 재생불량성 빈혈 및 약제-유도 골수 억제를 포함한다.

혈소판감소증은 상처, 궤양 또는 주사부위로부터의 삼출뿐만 아니라 비강면 또는 위장관으로부터의 점막출혈같은 증가되는 출혈로서 나타난다.

치료적 투여량은 일반적으로 치료되는 상태의 상황 및 심각성, 환자특성 등을 고려하여 허용되는 표준에 따라 임상의에 의해 결정되는 정확한 투여량으로, 하루에 환자체중의 0.1 내지 100 ㎍/kg, 바람직하게 0.5-50 ㎍/kg/일, 더욱 바람직하게는 1-25 ㎍/kg/일 범위일 것이다. 투여량의 결정은 본 분야의 보통 기술수준내에 있다. TPO는 보통 화학요법 또는 골수 이식후 28일까지의 기간에 걸쳐 투여되거나, 또는 혈소판수가 ＞20,000/mm³, 바람직하게 ＞50,000/mm³에 도달할 때까지 투여될 것이다. 더욱 흔하게는, TPO는 1주 이하, 종종 1 내지 3일 기간에 걸쳐 투여될 것이다. 일반적으로, TPO의 치료적 유효량은 림프 또는 골수 전구세포의 증식 및/또는 분화에서 임상학적으로 상당한 증가를 생성하기에 충분한 양이며, 이것은 성숙세포(예를 들어, 혈소판, 적혈구, 또는 중성구)의 순환 수준에서의 증가로서 나타날 것이다. 따라서 혈소판 장애의 치료는 혈소판수가 적어도 20,000/mm³, 바람직하게 50,000/mm³에 도달할 때까지 계속될 것이다. TPO는 또한 IL-3, -6 및 -11; 간세포인자; 에리스로포이에틴(EPO); G-CSF 및 GM-CSF같은 다른 시토킨과 조합하여 투여될 수 있다. 조합 치료의 계획내에서, 다른 시토킨의 일일 투여량은 일반적으로 EPO, ≤150 유닛/kg; GM-CSF, 5-15 ㎍/kg; IL-3, 1-5 ㎍/kg; 및 G-CSF, 1-25 ㎍/kg일 것이다. EPO와의 조합치료는 예를 들어, 낮은 EPO 수치를 갖는 빈혈 환자에서 처방된다.

또한 TPO는 자가이식 골수 배양에서처럼 생체외에서 사용될 수 있다. 간단하게, 골수는 화학요법전에 환자로부터 제거되고 선택적으로 하나 이상의 다른 시토킨과 조합하여 TPO로 처리된다. 처리된 골수는 그후 골수의 회수를 가속화 하기 위해 화학요법후에 환자에게 되돌려진다. 또한, TPO는 골수 또는 말초 혈액 전구세포(PBPC)의 생체외 확장을 위해 사용될 수 있다. 화학요법 처치전에, 골수는 초기 전구세포를 말초 순환계로 방출하기 위해서 간세포인자(SCF) 또는 G-CSF로 자극될 수 있다. 이런 전구체는 말초 혈액으로부터 수집하고 농축된 후 배양중에 SCF, G-CSF, IL-3, GM-CSF, IL-6 또는 IL-11을 포함하나 여기에 제한되지 않는 하나 이상의 다른 시토킨과 선택적으로 조합하여 TPO로 처리되어 고밀도 거핵구 배양으로 분화 및 증식될 수 있으며, 그후 고-투여량 화학요법후에 환자에게 되돌려질 수 있다.

TPO는 또한 조혈과정의 연구에서 실험시약으로서 유용하다. 본 발명의 조성물 및 방법은 이러한 사용을 위한 트롬보포이에틴의 저장-안정성 제조물을 제공한다.

본 발명은 다음 비-제한적인 실시예로 더 예시된다.

재조합 인간 및 마우스 TPO를 트랜스펙트된 베이비 햄스터 신장세포(BHK 570 세포; ATCC CRL 10314)를 사용하여 제조하였다. TPO를 고정된 MPL 리셉터상의 친화성 크로마토그래피에 의해 염료-리간드 친화성 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피 및 수산화인회석(hydroxyapatite)상에서 단백질 불순물의 흡착의 조합을 사용하는 크로마토그래피에 의해 세포-조건화된 배양배지로부터 정제하였다. TPO의 생물학적 활성은 표적세포로서 인간 MPL 리셉터를 암호화하는 발현벡터로 트랜스펙트된 BaF3 세포(Vigon et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5640-5644, 1992)를 사용하여 유사분열(mitogenesis) 분석으로 분석하였다. BaF3는 뮤린 골수로부터 유래된 인터루킨-3 의존성 전-임파양 세포주이다(Palacios and Steinmetz,Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al.,Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986). 세포를³H-티미딘의 존재하에서 테스트 샘플에 노출하였다. 세포성 DNA로 통합된³H-티미딘의 양은 인간 TPO의 표준곡선과 비교함에 의해 정량하였다. 10 유닛/ml은 유사분열 분석에서 ½-최대 자극을 제공하는 양으로서 정의하였다.

폴리소르베이트 80(Tween 80), 그레이드 NF를 Spectrum Chemical Mfg. Corp., New Brunswick, NJ로부터 수득하였다. 염화나트륨(AR, USP), 인산나트륨, 이염기성, 칠수화물(USP, TAC) 및 인산나트륨, 일염기성, 일수화물(USP)을 Mallinkrodt Chemical Corp., Chesterfield, MO로부터 수득하였다.

실시예 1

정제된 트롬보포이에틴의 표면흡착을 유리 비드로 인큐베이트된 용액으로부터 여과 회수 및 회수에 의해 평가하였다. TPO 샘플을 시험동안 적당한 완충액(표 참조)으로 희석하였다.

TPO^*	완충액	첨가제^**
마우스, chrom.	20mM 구연산염 pH 4.0, 6.0	--
마우스, chrom.	20mM 구연산염 pH 4.0, 6.0	0.25% HSA
마우스, chrom.	20mM 인산 칼륨 pH 6.0, 8.0	--
마우스, chrom.	20mM 인산 칼륨 pH 6.0, 8.0	0.25% HSA
마우스, chrom.	20mM 트리스 pH 8.0	--
마우스, chrom.	20mM 트리스 pH 8.0	0.25% HSA
마우스, chrom.	--	미토 희석제
인간, affin.	20mM 구연산염 pH 4.0, 5.0,6.0, 7.0, 8.0	--
인간, affin.	--	미토 희석제
인간, chrom.	50mM 히스티딘 pH 5.5	--
인간, chrom.	50mM 히스티딘 pH 5.0	0.01% 폴리소르베이트 80
인간, chrom.	50mM 히스티딘 pH 5.5	0.01% 폴리소르베이트 80
인간, chrom.	50mM 히스티딘 pH 6.0	0.01% 폴리소르베이트 80

인간, chrom.	50mM 히스티딘 pH 5.5	0.05% 폴리소르베이트 80
인간, chrom.	50mM 숙신산염 pH 5.5	0.01% 폴리소르베이트 80
인간, chrom.	20mM 인산칼륨 pH 6.0	--
인간, chrom.	20mM 인산칼륨 pH 6.0	0.01% 폴리소르베이트 80
인간, chrom.	20mM 인산칼륨 pH 6.0	0.01% 폴리소르베이트 80＋5% 수크로오스
인간, chrom.	20mM 인산칼륨 pH 6.0	0.01% 폴리소르베이트 80＋5% 만니톨
인간, chrom.	20mM 인산칼륨 pH 6.0	0.01% 폴리소르베이트 80＋1% PEG 3350
인간, chrom.	20mM 인산칼륨 pH 6.0	5% 수크로오스
인간, chrom.	20mM 인산칼륨 pH 6.0	5% 만니톨
인간, chrom.	20mM 인산칼륨 pH 6.0	1% PEG 3350
인간, chrom.	20mM 인산칼륨 pH 6.0	0.13M NaCl
인간, chrom.	20, 50, 100mM 인산칼륨 pH6.0	0.05% 폴리소르베이트 80＋0.13M NaCl
인간, chrom.	20mM 인산칼륨 pH 4.0, 5.0,6.5, 7.0, 8.0	0.05% 폴리소르베이트 80＋0.13M NaCl
인간, chrom.	20mM 인산나트륨 pH 5.0, 5.5,6.0	0.05% 폴리소르베이트 80＋0.14M NaCl
인간, chrom.	20mM 히스티딘 pH 5.0, 5.5,6.0	0.05% 폴리소르베이트 80＋0.14M NaCl
인간, chrom.	20mM 인산나트륨 pH 6.0	0.05% 폴리소르베이트 80
인간, chrom.	20mM 인산나트륨 pH 6.0	0.14M NaCl
인간, chrom.	20mM 인산나트륨 pH 6.0	0.14M NaCl＋0.001%,0.01%, 0.05%폴리소르베이트 80
인간, chrom.	20mM 인산나트륨 pH 6.0	0.14M NaCl＋0.001%,0.01%, 0.05%폴리소르베이트 20
^chrom. = 크로마토그래피로 정제된; affin. = 친화성 정제된.^*미토 희석제 = 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% PSN, 항생제 혼합물(페니실린,스트렙토마이신, 네오마이신), 0.001M 피루브산나트륨, 0.025M Hepes, 0.00033%w/v 메르캡토에탄올이 첨가된 RPMI 1640.

필터 흡착은 주사기에 부착된 0.2 ㎛ 폴리비닐리덴 플루오리드 막 필터(Durapore^TM필터; Millipore, Bedford, MA) 또는 Acrodisc^TM막 필터(Gelman Science, Ann Arbor, MI)를 사용하여 측정하였다. TPO 용액을 손으로 필터를 통해 밀어넣었다. 샘플을 주사기에 용액의 첨가전 및 필터를 통해 통과후에 취하였다. 재조합 마우스 TPO의 회수는 알부민이 없는 것보다 0.25% 사람 혈청 알부민을 함유한 조제물에서 더 높은 것으로 나타났다(도 1). 유사한 결과가 재조합 인간 TPO로 수득되었다. 큰 필터 회수 차이가 테스트된 범위(pH 4-8)상에서 pH 함수로서 관찰되지 않았지만, 회수는 pH 6.0에서 가장 컸다. 재조합 사람 TPO의 표면흡착은 또한 0.01% 폴리소르베이트 80이 조제물에포함되었을 때 감소되었다(도 2). 등장성 염화나트륨이 폴리소르베이트 80의 존재하에서 흡착을 더욱 감소시키는 것으로 나타났다(도 3).

표면흡착을 유리비드를 사용하여 확장된 표면-대-부피하에서 더 조사하였다. 희석 TPO 용액(10 ㎍/ml)의 0.5ml 샘플을 튜브 락커상에서 5℃에서 유리비드(425-600 ㎛) 1.0g에 노출하였다. 유사분열 활성을 시간 함수로서 흡착을 평가하기 위해서 1.5, 5 및 24시간후에 결정하였다. 도 4에 나타난 것처럼, 흡착은 24-시간 테스트 기간에 걸쳐 시간에 따라 증가하였다. 흡착은 폴리소르베이트 20보다 폴리소르베이트 80에 의해 더 큰 정도로 감소하였다. 회수는 폴리소르베이트 80 농도가 0.001%에서 0.05%로 증가함에 따라 증가하였다. 폴리소르베이트 80 및 등장성 염화나트륨의 조합은 폴리소르베이트 80 단독보다 표면흡착을 감소시키는데에 더욱 효과적이었다.

실시예 2

용액중의 TPO의 안정성에 대한 pH의 효과를 인산염 및 히스티딘 완충액에서 테스트하였다. 친화성 및 크로마토그래피로 정제된 재조합 마우스 및 인간 TPO의 샘플을 적당한 완충액으로 희석하거나 또는 NaOH 또는 HCl로 원하는 pH로 적정하였다(표 참조). 그리고 나서 샘플을 다양한 온도에서 저장하고 상기 기재된 것처럼 유사분열 분석 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS PAGE)후 웨스턴 블라팅으로 간헐적으로 분석하였다. 가성-일차 분해 속도상수(K_obs)는 적당할 때 남아 있는 % 유사분열 활성 대 시간의 로그-선 피트의 기울기로부터 계산하였다.

SDS PAGE/웨스턴 블랏 분석은 친화성-정제된 재조합 인간 TPO가 pH- 및 시간-의존 양상으로 저분자량 변이체에 대해 단백질분해를 수행함을 보여주었다. 6-8의 pH 범위에서, 단백질분해는 온도함수로서 증가되는 pH와 함께 증가되는 단백질분해로, 두 개의 저분자량 변이체(겔 전기영동에 의한 35 및 18kD)에 대한 분해를 가져왔다. pH≤5에서, 모(母) 단백질(겔 전기영동으로 ??60kD)보다 다소 낮은 겉보기 분자량을 가지는 분해생성물이 명백하였으며, 온도함수로서 감소되는 pH에 따라 증가되었다.

크로마토그래피로 정제된 재조합 인간 TPO는 다른 분해 프로필을 보였다. SDS PAGE/웨스턴 블랏 분석은 pH 감소에 따라 단백질분해가 증가됨을 가지는, pH≤5에서 두 개의 저분자량 종류(겔 전기영동에 의해 30 및 20kD)에 대해 온도-의존 분해를 나타냈다. 중요한 단백질분해가 pH＞6에서는 관찰되지 않았으나, 고 분자량 응집체가 증가되는 pH 및 온도에서 형성되었다. 모든 분해생성물은 모 단백질보다 낮은 생물학적 활성을 나타냈다. 단백질의 가성-일차 분해속도(K_obs)를 나타내는 pH-속도 프로파일(K_obs대 pH에서)은 온도함수에 따라 다양한 경로의 상대적 분해속도의 차이를 나타냈다. 30℃ 및 37℃에서 프로파일은 유사했으며 최대안정성6의 pH를 나타냈다. 생물학적 활성의 빠른 손실이 pH＞6에서 일어났다하더라도, 총 변화는 SDS PAGE 및 웨스턴 블라팅에 의해 분명하지 않았다. 이들 결과는 pH＞6에서 분해는 탈아미드화, 산화, 또는 전기영동에 의해 검출될 수 없는 몇몇 다른 기작을 거쳐 일어남을 제시한다. 5℃에서 분해속도는 비교적 pH≤6에서 일정하였으며, 이것은 이 pH 범위에서 분해경로는 큰 활성화 에너지(급격한 온도 의존성)를 가지며 이 온도에서 TPO의 전체손실에 크게 기여하지 않음을 제시한다.

인산나트륨 및 인산칼륨 완충액을 가지고 한 결과를 비교하였을 때 동등한 분해속도가 pH 함수로서 밝혀졌다. 여러 농도의 인산칼륨 완충액의 사용하였을 때(20mM-100mM, pH 6.0) 중요한 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 히스티딘을 pH 범위 5 내지 6에서 완충액(20mM)으로서 사용하였을 때 차이가 주목되었다. pH 5.0에서 분해속도는 37℃에서 인산염 완충액보다 히스티딘 완충액에서 더 컸으나, pH 5.5 또는 6.0에서 분해속도는 동일하거나 또는 히스티딘 완충액에서 더 낮았다(도 5). 유사한 결과가 비록 차이가 심오하지는 않았으나 30℃에서 나타났다. 5℃에서 분해속도는 pH 5-6에서 히스티딘 및 인산염 완충액에서 동일했다. 이런 결과들은 히스티딘의 존재하에서 저 pH 분해경로를 통해 증가된 분해에 일치하는 반면, 히스티딘은 고 pH 분해경로를 통해 분해를 감소시킨다. 저 pH 분해경로는 온도가 감소함에 따라 억제되기 때문에, 히스티딘의 존재하에서 향상된 분해는 5℃에서 분명하지 않다.

상기로부터, 본 발명의 특정 구체예가 예시를 위해 여기에 기재되었다 하더라도, 다양한 변형이 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어남이 없이 만들어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부되는 청구항을 제외하고는 제한되지 않는다.

Claims

트롬보포이에틴;

10∼100mM 인산염 또는 히스티딘 완충액;

0.01∼1.0%(w/w)의, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 및 만니톨로 구성되는 군으로부터 선택되는 표면 흡착 저해제;

등장량의 염화나트륨; 및

물을 포함하고, 5.5∼6.5의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 수성(水性) 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 완충액은 인산나트륨 완충액 또는 인산칼륨 완충액인 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 인산염 완충액의 농도는 20mM인 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
제 2 항에 있어서, 10∼100mM의 히스티딘을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 히스티딘의 농도는 20mM인 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 표면 흡착 저해제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르인 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80인 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 트롬보포이에틴은 0.1-10mg/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
제 1 항에 있어서, 알부민을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
제 1 항에 있어서, 방부제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
제 1 항에 있어서, 비경구적 사용에 적합한 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
트롬보포이에틴의 표면으로의 흡착을 감소시키는 방법으로,

트롬보포이에틴 수용액에 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 및 만니톨로 구성된 군으로부터 선택되는 표면 흡착 저해제 0.01-0.1%(w/v)를, 상기 용액과 상기 표면을 접촉시키기 전에, 첨가하는 것으로 이루어지는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 표면 흡착 저해제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르인 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80인 것을 특징으로 하는 방법.
트롬보포이에틴 조성물에 히스티딘의 유효량을 첨가하는 것으로 이루어지는 트롬보포이에틴 조성물을 안정화시키는 방법.
제 15 항에 있어서, 히스티딘의 상기 유효량은 10-100mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 조성물은 동결건조된 분말형태인 것을 특징으로 하는 방법.
트롬보포이에틴;

10∼100mM 인산염 완충액;

0.01∼1.0%(w/v) 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; 및

등장량의 염화나트륨을 포함하고, 약 6.0의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 수성 약제학적 조성물.
제 18 항에 있어서, 10∼100mM 히스티딘을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.