JPH08259459A - 巨核球増殖分化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、血小板減少症および／または血小
板機能低下を伴う疾患の治療薬として有用な、巨核球増
殖分化剤を提供することを目的とする。 【構成】 本発明の巨核球増殖分化剤は、ＮＦ活性を有
する物質および生体内でＮＦの産生を促進する物質の少
なくとも１種をを有効成分とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、神経栄養因子（ｎｅｕ
ｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ：以下、「ＮＦ」と
いう）活性を有する物質および生体内でＮＦの産生を促
進する物質の少なくとも１種を有効成分とする巨核球増
殖分化剤に関する。本発明の巨核球増殖分化剤は、巨核
球の増殖分化が十分でないために生じる疾患、特に血小
板減少症および／または血小板機能低下を伴う疾患の治
療薬として有用である。

【０００２】

【従来の技術】血小板は、造血幹細胞から分化した巨核
球の細胞質が断片化して生成される、血液中の無核の細
胞である。血小板の寿命はヒトで９−１０日と短いにも
かかわらず、血液中の血小板濃度は定常状態においてほ
ぼ一定に保たれている。また実験動物において種々の方
法で血小板を減少させても、数日のうちに血液中の血小
板数の回復が認められる。これらのことから血小板減少
期において血小板の産生を促進する因子が存在すること
が想定されていた。

【０００３】血小板は止血機構において重要な役割を果
たしている。血小板の数が減少または機能が低下したよ
うな場合には、Ｆａｎｃｏｎｉ症候群、無巨核球性血小
板減少症、再生不良性貧血、Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｓｏｕｌ
ｉｅｒ症候群等の臨床的に危険な疾患を伴う。特に出血
した場合にはそれをコントロールできなくなるような状
態に陥る。このような危険を回避するためには、血小板
を増多する因子の使用が有益である。さらに、血小板増
多因子の使用は、血小板減少症等の造血系疾患のみなら
ず、白血病治療のための骨髄移植におけるエリスロポエ
チン、顆粒球コロニー刺激因子等のサイトカインの治療
効果を高めたり、あるいはまた、ガン化学療法や放射線
療法の際の血小板減少のコントロールにも有益である。
従って、血小板の増多因子が得られれば、そのような治
療法の成功率はさらに上昇し、患者の入院期間も短縮で
きると期待される。

【０００４】血小板増多因子の同定には従来から多くの
努力が払われており、現在、造血細胞から巨核球をへて
血小板が産生される系（巨核球血小板系造血）において
血小板の前駆細胞である巨核球の形成に関与すると考え
られる種々の調節因子が同定されている。

【０００５】これらの調節因子は、大きく２種類に分類
される。第１のグループは単独で巨核球コロニーを形成
させるもので巨核球コロニー刺激因子（Ｍｅｇ−ＣＳ
Ｆ）と呼ばれる。第２のグループは単独で巨核球コロニ
ーを形成させる活性はないが、前者を共存させると巨核
球のコロニー数を増やしたり、その増殖分化を促進する
作用を有するもので巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）
と呼ばれる。第１のグループに属する例としてインター
ロイキン−３（ＩＬ−３）、顆粒球・マクロファージコ
ロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が知られている。第２
のグループに属する例としてエリスロポエチン（ＥＰ
Ｏ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳ
Ｆ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロ
イキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１１（Ｉ
Ｌ−１１）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）等が知られ
ている。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性によって同定された
因子の中には、実際にｉｎ ｖｉｖｏにおいて血小板数
の増加や回復時期の短縮等の効果が認められているもの
もある（溝口秀昭：蛋白質 核酸 酵素，３６，１１９
５（１９９１））。

【０００６】巨核球の増殖分化を促進し、安全性の高い
ものが見いだされれば、臨床面においても有益である。

【０００７】しかし、これらの因子の多くは、巨核球／
血小板系の増殖や分化のみではなく、各系統の血球の分
化にも関与するなど極めて多様な生物活性を示す。例え
ば、ＩＬ−６およびＩＬ−１１には、実際にｉｎ ｖｉ
ｖｏにおける血小板の増多作用があるが、急性期蛋白質
の産生を促したり、場合によっては悪液質を引き起こす
おそれもある。また、ＩＬ−６の場合、腎臓のメサンギ
ウム細胞を増殖させ腎不全を起こす可能性がある（松田
正ら：蛋白質 核酸 酵素，３６，１１８４（１９９
１））。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、安全性の高
いＮＦ活性を有する物質および生体内でＮＦの産生を促
進する物質の少なくとも１種を有効成分とする巨核球増
殖分化剤を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、巨核球の
増殖分化を促進する作用を有する、新規な巨核球増殖分
化因子を見いだすべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を
完成した。即ち、本発明によれば、ＮＦ活性を有する物
質および生体内でＮＦの産生を促進する物質の少なくと
も１種を有効成分とする巨核球増殖分化剤、特に、血小
板減少症および／または血小板機能低下を伴う疾患の治
療に有効な治療薬が提供される。

【００１０】本発明の有効成分である神経栄養因子（Ｎ
Ｆ）活性を有する物質とは、神経細胞（ニューロン）に
作用し、その分化、成熟、生存、再生または老化等にお
いて重要な役割を担っている物質の総称である。ＮＦの
例としては、１９４０年代後半に発見された神経成長因
子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＮＧ
Ｆ）がある。ＮＧＦは、アミノ酸１１８個のポリペプチ
ド鎖（配列番号１）が２本非共有結合した二量体構造を
もつ分子量約２６,０００の蛋白質である。従来知られ
ている機能としては、交感ニューロン、神経冠由来の知
覚ニューロン、脳の一部のコリン作動性ニューロンに作
用し、その生存や機能の維持、神経突起の伸長、神経伝
達物質の合成促進等がある（Ｍｅｉｅｒ，Ｒ．，ら Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．，５， １４８９−１４９３（１９８
６））。またＮＦの別の例としては、１９８２年にＮＧ
Ｆと相同性の高い蛋白質として発見された、脳由来神経
栄養因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔ
ｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ；ＢＤＮＦ）が挙げられ
る。さらに、別の例として、ＮＧＦやＢＤＮＦと相同性
が高く、かつＮＦ作用を有する因子が近年新たに３種発
見されている（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５）。これ
らの３種は総称してニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔ
ｒｏｐｈｉｎ；ＮＴ）ファミリーと呼ばれている。さら
に、別の神経栄養因子として、毛様体神経栄養因子（ｃ
ｉｌｉａｌｌｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏ
ｒ；ＣＮＴＦ）、ヘパリン親和性神経栄養因子（ｈｅｐ
ａｒｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉ
ｃ ｆａｃｔｏｒ；ＨＢＮＦ）（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈ
ｉｎ；ＰＴＮと同等）等が挙げられる（蛋白質 核酸
酵素，Ｖｏｌ．３６， Ｎｏ．７，（１９９１）２４９
−２５７頁）。

【００１１】本発明は、ＮＦがヒト巨核球系細胞の増殖
分化を促進させるという知見、さらに詳しくは、ＮＦが
正常マウス骨髄細胞に対してＭｅｇ−ＰＯＴ活性を有す
るという驚くべき知見に基づいて完成された。ＮＦの巨
核球増殖分化因子としての生理活性は従来全く知られて
おらず、本発明によって初めて明らかにされたものであ
る。

【００１２】ＮＦの巨核球増殖分化因子としての活性の
種特異性は、後述の実施例６に示す通り厳密でない。従
って、本発明の巨核球増殖分化剤の有効成分としては、
ＮＦ活性が得られる限り、特定の種由来のＮＦである必
要はない。しかし、ヒトに使用する場合には種々のヒト
ＮＦを用いることが好ましい。本明細書においてヒトＮ
Ｆとは、ヒト由来の物質であって、神経細胞に作用し、
その分化、成熟、再生または老化等に生理学的影響を及
ぼす物質であればよく、これらに限られるわけではない
が、例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＨＢＮＦな
らびに、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５等のＮＴファミ
リーが含まれる。ＮＦは、天然に発現しているものから
既知の方法により得られたものを使用できる。あるい
は、これらの蛋白質のアミノ酸配列および遺伝子配列は
既知であり、これらの配列に基づいて確立されている遺
伝子工学的手法により産生することもできる。遺伝子組
換えの手法によって製造されたＮＦは市販されており、
容易に入手可能である（例えば、Ａｕｓｔｒａｌ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）。ＮＦはまた、所望により糖鎖
が結合していてもよく、また結合していなくてもよい。

【００１３】ＮＦはさらに、天然の蛋白質のアミノ酸配
列のうち１つまたは複数のアミノ酸残基が置換、欠失、
挿入等により変異したものであっても、ＮＦ活性を有す
る物質であれば本発明の巨核球増殖分化剤の有効成分に
含まれる。変異は自然に生じたものであっても、遺伝子
工学的手法によって施したものであってもよい。当業者
は、慣用された方法により容易にこのような変異蛋白質
を作成することができるであろう。

【００１４】本発明の一態様においては、巨核球増殖分
化剤の有効成分として、ＮＦ活性を有する物質を直接用
いる代わりに、生体内でＮＦの産生を促進する物質を単
独で、またはＮＦ活性を有する物質とともに用いること
もできる。生体内でＮＦの産生を促進する物質として
は、これらに限られるわけではないが、例えば、エピネ
フリン、ノルエピネフリン、ドーパミン等のカテコール
アミン類、４−メチルカテコール、プロペントフィリ
ン、１，４−ベンゾキノン類（古川昭栄：ＨＵＭＡＮ
ＳＣＩＥＮＣＥ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ８，（１９９
２））、ニコチン（特開平５−２０１８６０号）、ポリ
塩基性アミノ酸、ポリ塩基性アミノ酸を分子内に有する
ペプチド（特開平５−５１３２５号）、マルホルミンＡ
１、Ａ２、Ａ３およびＡ４（特開平５−２６２６６３
号）、式（I）：

【化１】 で表されるトリペプチドを有効成分とする物質（特開平
５−２８４９９２号）、一般式（ＩＩ）：

【化２】 ［式中、Ｒ¹、Ｒ²は同一または異なっていて、水素、ハ
ロゲン、アルキル基、アルコキシ基、または置換されて
いてもよいフェニル基であり、Ａｒは置換されていても
よいアリール基またはヘテロアリール基であり、Ｙは単
結合または鎖内に二重結合を有していてもよいアルキレ
ン基であり、そして、Ｗは式Ｗａ：

【化３】 （ここで、Ｒ³、Ｒ⁴は同一または異なっていて、水素、
ハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、または置換され
ていてもよいフェニル基であり、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−ま
たは−Ｎ（Ｒ⁵）−（Ｒ⁵は水素、アルキル基またはアシ
ル基である）であり、Ｚは単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−
Ｎ（Ｒ⁶）−（Ｒ⁶は水素、アルキル基またはアシル基で
ある）、または−ＣＯＮ（Ｒ⁷）−（Ｒ⁷は水素、アルキ
ル基またはアシル基である）であり、Ａはアルキレン基
であり、Ｂはアルコキシカルボニル基、カルボキシル
基、水酸基、−Ｎ（Ｒ⁸）（Ｒ⁹）（Ｒ⁸、Ｒ⁹は同一また
は異なっていて、水素、アルキル基、ヒドロキシアルキ
ル基、アシル基、または置換されていてもよいアラルキ
ル基もしくはヘテロアラルキル基であるか、あるいは隣
接する窒素原子と結合して複素環を形成する基であ
る）、または−ＣＯＮ（Ｒ¹⁰）（Ｒ¹¹）（Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹は
同一または異なっていて、水素、アルキル基、ヒドロキ
シアルキル基、アシル基、または置換されていてもよい
アラルキル基もしくはヘテロアラルキル基であるか、あ
るいは隣接する窒素原子と結合して複素環を形成する基
である）である）により表される基であるか、あるいは
式Ｗｂ：

【化４】 （ここで、Ｒ¹²、Ｒ¹³は同一または異なっていて、水
素、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、置
換されていてもよいフェニル基、または置換されていて
もよいアラルキル基もしくはヘテロアラルキル基である
か、あるいは隣接する窒素原子と結合して複素環を形成
する基であり、Ｐは、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）_p−（ｐは、
０〜２の整数を表す）、−Ｎ（Ｒ¹⁴）−（Ｒ¹⁴は水素、
アルキル基またはアシル基である）または−Ｎ（Ｒ¹⁵）
ＣＯ−（Ｒ¹⁵は水素、アルキル基またはアシル基であ
る）であり、Ｑは、アルキレン基、環状アルキレン基、
酸素または硫黄が介在したアルキレン基または末端にカ
ルボニル基を有するアルキレン基である）により表され
る基であるか、または式Ｗｃ：

【化５】 （ここで、ｎは３〜５の整数を示す）で表される基であ
る］で示されるピリジン化合物を有効成分とする物質
（特開平４−３５２７２１号）、一般式（ＩＩＩ）：

【化６】 ［式中、Ｒは水素、または所望により水酸基、カルボキ
シル基、メルカプト基、カルバモイル基、ヒドロキシフ
ェニル基、グアニジノ基、イミダゾリル基もしくはメチ
ルメルカプト基によって置換されていてもよいＣ₁−Ｃ₄
アルキル基であり、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³はそれぞれ独立
して、水素、アルキル基、アルケニル基またはベンジル
基である］で示されるオキサゾピロロキノリン類および
／またはそのエステルを有効成分とする物質（特開平６
−９３９６号）、一般式（ＩＶ）：

【化７】 ［式中、Ｒは水素原子またはＣ₁−Ｃ₄のアルキル基であ
る］で表されるチオフェン化合物（特開平６−１５７５
１２号）、一般式（Ｖ）：

【化８】 ［式中、Ｒ¹およびＲ²は同一または異なっていて、Ｃ₈
−Ｃ₃₀のアシル基であり、Ｘは、水素原子、または置換
もしくは無置換の低級アルキル基、Ｃ₃−Ｃ₈のシクロア
ルキル基または３−８員複素環であり、Ｙは水素原子ま
たは対カチオン基を表す。ただし、Ｘ中に対アニオンを
持たないカチオン基を有する場合には、ＯＹは酸素アニ
オンである］で示されるジアシル型グリセロリン脂質
（特開平６−１５７３３８号）等が含まれる。これらの
生体内でＮＦの産生を促進する物質は、前記各文献に基
づいて合成等により産生することができる。また、ある
ものは市販として、容易に入手可能である。

【００１５】本発明のＮＦ活性を有する物質および生体
内でＮＦの産生を促進する物質の少なくとも１種を有効
成分として含有する巨核球増殖分化剤は、Ｍｅｇ−ＰＯ
Ｔ活性を有し、体内に投与された時、存在するＭｅｇ−
ＣＳＦと協力して巨核球系細胞の増殖分化を促進させ
る。従って、本発明の巨核球増殖分化剤は血小板減少お
よび／または血小板機能低下を伴う疾患の治療に有効で
ある。血小板減少による疾患の例としては、Ｆａｎｃｏ
ｎｉ症候群、再生不良性貧血、悪性リンパ腫瘍もしくは
急性白血病等の癌、慢性肝障害、腎不全、手術時若しく
は保存血の大量輸血患者、重症感染症、骨髄障害性血小
板減少症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＳＴ
Ｅ、蛇咬症、溶血性尿毒症性症候群、脾機能亢進症、出
血等がある。血小板機能異常による疾患の例としては、
Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｓｏｕｌｉｅｒ症候群、Ｇｌａｎｚｍ
ａｎｎ’ｓ血小板無力症、尿毒症、抗血小板抗体、骨髄
増殖性疾患等がある。

【００１６】本発明の巨核球増殖分化剤の投与は、限定
するわけではないが、一般に非経口的に行われ、例えば
注射投与することにより好ましく実施できる。本発明の
巨核球増殖分化剤の治療または改善薬としての使用量
は、その使用方法、使用目的等により異なるが、例え
ば、ヒトＮＧＦの蛋白質量として、注射投与して用いる
場合には、例えば、１日量約０．００２μｇ／ｋｇ−２
０ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、より好ましく
は、１日量約０．２μｇ／ｋｇ−２ｍｇ／ｋｇである。

【００１７】本発明の巨核球増殖分化剤を液剤として調
製する場合は、ＮＦ活性を有する物質および／または生
体内でＮＦの産生を促進する物質を水性溶剤（例えば、
蒸留水）、水溶性溶剤（例えば、生理食塩水、リンゲル
液）、油性溶剤（例えば、ゴマ油、オリーブ油）等の溶
剤に溶解して、慣用の方法により調製できる。さらに所
望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、
酢酸ナトリウム）、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウ
ム、グリシン）、等張化剤（例えば、ブドウ糖、転化
糖）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチ
レングリコール）、保存剤（例えば、ベンジルアルコー
ル、フェノール）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコ
ニウム、塩酸プロカイン）等の添加剤を加えることもで
きる。また、該水溶液におけるｐＨは、約３−８に、さ
らに好ましくは約５−７に調整される。上記ｐＨ範囲に
調整するためには、例えば希酸（例えば、希塩酸）や希
アルカリ（例えば、希水酸化ナトリウム、希炭酸水素ナ
トリウム）等を添加することにより行える。

【００１８】また、本発明の巨核球増殖分化剤を固形状
のものとして調製する場合は、例えば、ＮＦ活性を有す
る物質および／または生体内でＮＦの産生を促進する物
質を凍結乾燥するか、または、固形状（例えば、粉末
状）のＮＦ活性を有する物質および／または生体内でＮ
Ｆの産生を促進する物質に希釈剤（例えば、蒸留水、生
理食塩水、ブドウ糖）、賦形剤（例えば、カルボキシメ
チルセルロース（ＣＭＣ）、アルギン酸ナトリウム）、
保存剤（例えば、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコ
ニウム、フェノール）、無痛化剤（ブドウ糖、グルコン
酸カルシウム、塩酸プロカイン）等を混合し、凍結乾燥
等の慣用手段により、固形状筋肉内注射用製剤に製造す
ることができる。この製剤は、用時適当な溶剤に溶解し
て使用することができる。

【００１９】本発明の巨核球増殖分化剤の製剤化にあた
り、例えば、ＮＦ活性を有する物質および／または生体
内でＮＦの産生を促進する物質を含有する液剤に、安定
剤としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を配合すると、
溶液状態でｐＨ３−８を示すように調整することができ
る。このようにすると、保存中および凍結や凍結乾燥操
作におけるＮＦ活性を有する物質および／または生体内
でＮＦの産生を促進する物質の活性低下が少なく、また
凍結品においてはその再溶解時の溶状が透明であるので
好ましい。ＨＳＡとしては、いかなるものでもよいが、
本組成物を臨床応用するためには、非経口投与に用いる
程度の品質のものが好ましい。例えば、健康人血漿を原
料としてＣｏｈｎのエタノール分画第６法によって分画
精製したものが用いられる。また、安定剤として、アセ
チルトリプトファンナトリウムや、カプリル酸ナトリウ
ムを含むものであってもよい。ＨＳＡは、各成分を水溶
液とした場合に、水溶液１ｍｌあたり約０．１ｍｇ−約
５０ｍｇ、特に、約０．５ｍｇ−約２０ｍｇ含有させる
ことが好ましい。

【００２０】本発明の巨核球増殖分化剤の製剤化にあた
っては、前記ＨＳＡに加えさらに、例えば、グリシン、
グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、プロリン等
のアミノ酸、特にモノアミノ脂肪酸アミノ酸、もしくは
環状アミノ酸、ブドウ糖、マンノース等の単糖類、ソル
ビット、マンニット等の糖アルコール類、およびこれら
の生理学的に許容される塩、ならびにこれらの誘導体か
らなるグループから選択される化合物の１種類または２
種類以上を配合してもよい。上記配合剤は、例えば、Ｎ
Ｆ活性を有する物質および／または生体内でＮＦの産生
を促進する物質を水溶液とした場合に、水溶液１ｍｌ当
たり、単糖類または糖アルコール類の場合は約１０−１
００ｍｇ、アミノ酸の場合は約５−５０ｍｇ配合するこ
とが好ましい。上記の製剤化にあたっては、水溶液を溶
液状態でｐＨ約３−８、好ましくはｐＨ約５−７を示す
ように調整する。グルタミン酸等の酸性アミノ酸を配合
する場合は該物質を上記所定量加えることにより、所定
のｐＨに調整できる。あるいは、所望により、または上
記酸性アミノ酸を配合しない場合は塩酸、リン酸等の鉱
酸、もしくはコハク酸、酒石酸、クエン酸等の緩衝剤で
所定のｐＨに調整できる。

【００２１】本発明の巨核球増殖分化剤は、水溶液、凍
結品または凍結乾燥品の形態が好ましく、特に、取り扱
いや貯蔵の安定性の面から凍結乾燥品が好ましい。凍結
品としての本発明の巨核球増殖分化剤は、水溶液として
調製した巨核球増殖分化剤を原料として用い、これを通
常約−８０℃〜−２０℃で凍結することにより製造でき
る。該凍結組成物は約−８０℃〜−１０℃で保管するこ
とが好ましい。凍結乾燥品としての本発明の巨核球増殖
分化剤は、例えば上記凍結組成物を常法により減圧乾燥
するか、または、上記水溶液もしくは上記凍結組成物の
融解により得られる水溶液を、所望により小分けし、上
述のように凍結した後、常法により減圧乾燥することに
より製造することができる。あるいは、上記方法により
製造した凍結乾燥品を、例えば前記した単糖類、糖アル
コール類、アミノ酸等を含有し、所望により塩酸等でｐ
Ｈ調整された溶解液に再溶解することによって、本発明
の巨核球増殖分化剤を溶解状態として使用してもよい。

【００２２】注射用製剤としての本発明の凍結乾燥した
巨核球増殖分化剤を製造する場合は、例えば、ＮＦ活性
を有する物質および／または生体内でＮＦの産生を促進
する物質の水溶液ならびに配合剤含有水溶液をそれぞれ
除菌濾過して混合するか、これらの混合液を小分けする
前に除菌濾過等により精製し、無菌操作によりバイアル
瓶等に分注小分けした後上記凍結乾燥処理に付すことが
好ましい。この場合、容器の空間部を真空にするか、窒
素ガス置換することにより、該組成物の安定性を高める
ことができる。また、アミノ酸や単糖類あるいは糖アル
コール類を含有する水溶液で、凍結乾燥品を溶解する場
合には、その水溶液は除菌濾過し、無菌操作によりアン
プル等に分注小分け後、常法により蒸気滅菌したものを
用いることが好ましい。

【００２３】本発明の巨核球増殖分化剤を投与するに
は、該組成物が水溶液のものである場合には、そのまま
注射用溶解液として用いる。該組成物が凍結乾燥により
固形状のものである場合には、蒸留水もしくは生理食塩
水等を用いて溶解し注射用溶解液として用いる。なお、
所望により前記の単糖類、糖アルコール類、アミノ酸等
を含有し、前記と同様にｐＨ調整された溶解液で溶解し
た後使用することもできる。

【００２４】さらに、本発明の巨核球増殖分化剤にはＮ
Ｆ活性を有する物質および／または生体内でＮＦの産生
を促進する物質以外に、種々のサイトカインを１種類以
上含有させることもできる。これらの例としては、これ
らに限られるわけではないが、インターロイキン−１、
インターロイキン−２、インターロイキン−３（以下、
「ＩＬ−３」という）、インターロイキン−４、インタ
ーロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイ
キン−７、インターロイキン−１０、インターロイキン
−１１、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒
球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳ
Ｆ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳ
Ｆ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、塩基性線維芽細胞
増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦ
ＧＦ）、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子（ＥＧ
Ｆ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミン
グ成長因子−α（ＴＧＦ−α）、プロテアーゼネキシン
I、プロテアーゼネキシンII、血小板由来成長因子（Ｐ
ＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、白血球遊
走阻止因子（ＬＩＦ）等がある。これらのサイトカイン
を含有させると巨核球増殖分化剤としての効果は相乗的
に増加する。これらの添加量は特に限定しないが、例え
ば、ヒトＮＧＦを１００とした場合にそれぞれ０．００
０１〜２０００００重量％添加すればよい。これらの補
助的有効成分の添加量は上述の値に限定されるものでな
く、症状、患者の年齢等により適宜決定すればよい。

【００２５】なお、これらのサイトカインは必ずしもＮ
Ｆ活性を有する物質および生体内でＮＦの産生を促進す
る物質と同時に同じ薬剤として投与しなくてもよい。即
ち、ＮＦ活性を有する物質および生体内でＮＦの産生を
促進する物質の少なくとも１種を有効成分として含有す
る巨核球増殖分化剤の投与前、または後の適当な時期に
これらの補助的有効成分を投与しても構わない。

【００２６】本明細書において、塩基、アミノ酸等を略
号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓ
ｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎ
ｃｌａｔｕｒｅによる略号または当該分野における慣用
略号に基づく。

【００２７】

【実施例】実施例１ ヒト巨核球系細胞株Ｓ１０細胞（特開平６−２６９２８
４号）の増殖に及ぼすＮＧＦの影響を³Ｈ−ＴｄＲの取
り込み法により検討した。９６穴マイクロプレートにて
２％または１０％ＦＣＳ存在下、５×１０³個の細胞に
マウス顎下腺由来２．５Ｓ ＮＧＦ（ｍＮＧＦ、純度９
５％以上、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ Ｉｎｃ．社製）を１０ｐｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍ
ｌまでの濃度で加え、４８時間培養後、０．５μＣｉの
³Ｈ−ＴｄＲを添加し、４時間後のアイソトープの取り
込みを測定した。

【００２８】ｍＮＧＦはいずれの濃度のＦＣＳ存在下に
おいても、濃度依存的にＳ１０細胞の増殖を促進させ
た。結果を図１に示す。

【００２９】実施例２ 実施例１で使用したｍＮＧＦはマウス顎下腺由来の精製
品であるため夾雑物の混入が避けられない。そこで、Ｓ
１０細胞に対する増殖促進が真にｍＮＧＦによるもので
あることを確認するために、抗ＮＧＦ抗体を添加した場
合の影響を検討した。即ち、ｍＮＧＦに抗マウスＮＧＦ
ＩｇＧ画分（ＣＩＤｔｅｃｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉ
ｎｃ．社製）を加え、室温にて２時間反応させた後に、
Ｓ１０細胞に添加し、増殖に及ぼす影響を³Ｈ−ＴｄＲ
の取り込み法により検討した。なお、ｍＮＧＦと抗マウ
スＮＧＦ ＩｇＧ画分の最終濃度については、それぞれ
１０ｎｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌとなるようにし
た。

【００３０】抗マウスＮＧＦ ＩｇＧ画分のみを加えた
場合はＳ１０細胞の増殖には影響を及ぼさなかったが、
ｍＮＧＦによるＳ１０細胞の増殖促進活性は抗マウスＮ
ＧＦＩｇＧ画分によって完全に抑えられた。従って、ｍ
ＮＧＦそれ自体がＳ１０細胞の増殖を促進させたことが
明らかとなった。結果を図２に示す。

【００３１】実施例３ マウス無血清培養系におけるｍＮＧＦの巨核球コロニー
形成に及ぼす影響を、溝口らの方法（Ａｃｔａ Ｈｅｍ
ａｔｏｌ Ｊｐｎ．，４８：１７８０，（１９８５））
に準じた方法により検討した。ＢＡＬＢ／ｃ 雌性マウ
ス（６〜８週齢）の骨髄細胞２×１０⁵個に組換えマウ
スＩＬ−３（ｒｍＩＬ−３，Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ社製）１００ｎｇ／ｍｌの存在あるいは
非存在下、ｍＮＧＦを１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ
の濃度になるように添加し、軟寒天中にて、５％Ｃ
Ｏ₂、５％Ｏ₂、１００％湿度のインキュベーターで７日
間培養した。０．１％グルタルアルデヒドで固定後、ア
セチルコリンエステラーゼ染色により巨核球を同定し、
３個以上の細胞からなる集塊をコロニーとして計数し
た。

【００３２】ｍＮＧＦ単独では、巨核球コロニーの形成
はほとんど認められなかったが、ｒｍＩＬ−３存在下で
は濃度依存的にコロニー形成が促進された。従って、ｍ
ＮＧＦはＭｅｇ−ＣＳＦ活性は無いものの、Ｍｅｇ−Ｐ
ＯＴ活性を有することが示された。結果を図３に示す。

【００３３】実施例４ ｍＮＧＦのＭｅｇ−ＰＯＴ活性についても抗ＮＧＦ抗体
による影響を検討した。ｍＮＧＦに抗ＮＧＦ ＩｇＧ画
分を加えて室温にて２時間反応させた後、マウス骨髄細
胞に添加し無血清培養に付した。ｍＮＧＦと抗マウスＮ
ＧＦ ＩｇＧ画分の最終濃度は、それぞれ５０ｎｇ／ｍ
ｌおよび５０μｇ／ｍｌとなるようにした。

【００３４】抗マウスＮＧＦ ＩｇＧ画分自体は巨核球
コロニー形成には影響を及ぼさなかったが、ｍＮＧＦの
Ｍｅｇ−ＰＯＴ活性をほぼ完全に抑制した。従って、ｍ
ＮＧＦ自体がＭｅｇ−ＰＯＴ活性を有することが明らか
となった。結果を図４に示す。

【００３５】実施例５ ｍＮＧＦのＭｅｇ−ＰＯＴ活性が直接作用か間接作用か
を検討するため、非付着性骨髄細胞を用いて巨核球コロ
ニー形成を試みた。即ち、１０％ＦＣＳを含む培地にマ
ウス骨髄細胞を５×１０⁶個／ｍｌになるように懸濁さ
せ、組織培養用シャーレに入れ３７℃、１００％湿度の
ＣＯ₂インキュベーターにて静置した。１時間後、ピペ
ットで洗い流しながら浮遊細胞を回収し、同様の操作を
さらに２回繰り返し付着細胞を除去し、血清無添加の培
地で洗浄した。このようにして調製した非付着性骨髄細
胞を巨核球コロニー形成法に付した。

【００３６】ｒｍＩＬ−３非存在下ではコロニー形成は
認められなかったが、ｒｍＩＬ−３存在下（２５または
１００ｎｇ／ｍｌ）では、ｍＮＧＦは濃度依存的にコロ
ニー形成を促進させた。従って、ｍＮＧＦのＭｅｇ−Ｐ
ＯＴ活性は少なくとも単球・マクロファージ系の細胞を
介さず巨核球に直接作用することが示唆された。結果を
図５に示す。

【００３７】実施例６ ＮＧＦは動物種間でアミノ酸配列が極めて良く保存され
ており、立体構造も極めて類似しているものと考えられ
る。実際、ｍＮＧＦはヒト巨核球系細胞株Ｓ１０の増殖
を促進させた（実施例１、実施例２）。従って、ヒトＮ
ＧＦがマウス巨核球コロニー形成を促進させることが予
想される。そこでヒトＮＧＦとしてヒトＮＧＦ ｃＤＮ
ＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞より精製した組換
えヒトＮＧＦ（ｒｈＮＧＦ，Ａｕｓｔｒａｌ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌｓ社製）を用いてマウス巨核球コロニー形
成を試みた。

【００３８】ｒｈＮＧＦは、ＩＬ−３非存在下ではコロ
ニー形成には影響を及ぼさなかったが、ＩＬ−３存在下
では濃度依存的に巨核球コロニー形成を促進させた。従
って、ヒトＮＧＦもＭｅｇ−ＰＯＴ活性を有しているこ
とが明らかとなった。結果を図６に示す。

【００３９】

【発明の効果】本発明の、ＮＦ活性を有する物質および
生体内でＮＦの産生を促進する物質の少なくとも１種を
有効成分とする新たな巨核球増殖分化剤は、巨核球の増
殖分化を促進し、末梢血液中の血小板数を増加させる作
用により、血小板減少症および／または血小板機能低下
を伴う疾患の治療に有効な治療薬となる。

【００４０】

【配列表】配列表 配列番号：１ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 起源： 生物名：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ 配列： Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp 20 25 30 Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn 35 40 45 Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp 50 55 60 Pro Asn Pro Val Asp Ser Glu Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His 65 70 75 Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu 80 85 90 Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp 95 100 105 Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg 110 115 118

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ｍＮＧＦのＳ１０細胞の増殖に対す
る効果を示す。

【図２】 図２は、ｍＮＧＦによるＳ１０細胞の増殖に
対する抗ＮＧＦ抗体の効果を示す。

【図３】 図３は、マウス骨髄細胞無血清培養系におけ
るｍＮＧＦの巨核球コロニー形成に及ぼす効果を示す。

【図４】 図４は、ｍＮＧＦによる巨核球コロニー形成
に対する抗ＮＧＦ抗体の効果を示す。

【図５】 図５は、マウス非付着性骨髄細胞無血清培養
系における、ｍＮＧＦの巨核球コロニー形成に及ぼす効
果を示す。

【図６】 図６は、マウス骨髄細胞無血清培養系におけ
るｒｈＮＧＦの巨核球コロニー形成に及ぼす効果を示
す。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】神経栄養因子（以下、「ＮＦ」という）活
   性を有する物質および生体内でＮＦの産生を促進する物
   質の少なくとも１種を有効成分とする、巨核球増殖分化
   剤。
2. 【請求項２】ＮＦ活性を有する物質が天然由来のヒトＮ
   Ｆである、請求項１に記載の巨核球増殖分化剤。
3. 【請求項３】ＮＦ活性を有する物質が遺伝子組み換えの
   手法により産生されたヒトＮＦである、請求項１に記載
   の巨核球増殖分化剤。
4. 【請求項４】ＮＦ活性を有する物質が蛋白質で構成され
   るものである、請求項１に記載の巨核球増殖分化剤。
5. 【請求項５】ＮＦ活性を有する物質がヒトＮＧＦであ
   る、請求項１−４のいずれか１項に記載の巨核球増殖分
   化剤。
6. 【請求項６】ヒトＮＧＦ蛋白質が配列番号１のアミノ酸
   配列を有する、請求項５に記載の巨核球増殖分化剤。
7. 【請求項７】ＮＦ活性を有する物質を構成する蛋白質
   が、天然に存在するＮＦ蛋白質のアミノ酸配列のうち１
   つまたは複数のアミノ酸残基が置換、欠失または挿入に
   より変異しているが、ＮＦ活性を保持しているものであ
   る、請求項１−６のいずれか１項に記載の巨核球増殖分
   化剤。
8. 【請求項８】ＮＦ活性を有する物質が糖鎖を有するもの
   である、請求項１−７のいずれか１項に記載の巨核球増
   殖分化剤。
9. 【請求項９】インターロイキン−１、インターロイキン
   −２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、
   インターロイキン−５、インターロイキン−６、インタ
   ーロイキン−７、インターロイキン−１０、インターロ
   イキン−１１、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マク
   ロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー
   刺激因子、エリスロポエチン、塩基性線維芽細胞増殖因
   子、酸性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、
   上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、トランスフォーミング
   成長因子−α、プロテアーゼネキシンI、プロテアーゼ
   ネキシンII、血小板由来成長因子、コリン作動性分化因
   子または白血球遊走阻止因子の少なくとも１種をさらに
   含有してなる、請求項１に記載の巨核球増殖分化剤。
10. 【請求項１０】インターロイキン−３をさらに含有して
    なる、請求項１に記載の巨核球増殖分化剤。
11. 【請求項１１】血小板減少症および／または血小板機能
    低下を伴う疾患の治療用の組成物である、請求項１−１
    ０のいずれか１項に記載の巨核球増殖分化剤。