KR101578561B1 - 냉동 저장을 위한, 재조합 단백질의 액상 용액의 안정화 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 100 mM 이상의 1가 염 농도를 가지며 부분적으로 정제된 재조합 단백질 용액을 제공하고, 냉동시에 -56 ℃ 이상의 유리 전이 온도를 갖는 용액을 제공하기에 충분한 양으로 탄수화물을 상기 용액에 첨가하는 것을 포함하는, 냉동 저장을 위해 재조합 단백질의 벌크 용액을 안정화시키는 방법에 관한 것이다.

재조합 단백질, 액상 용액, 벌크 용액, 냉동 저장

Description

냉동 저장을 위한, 재조합 단백질의 액상 용액의 안정화 {STABILIZATlON OF LIQUID SOLUTIONS OF RECOMBINANT PROTEIN FOR FROZEN STORAGE}

본 출원은 미국 특허 가출원 제60/926,698호 (2007년 4월 26일자로 출원됨)의 이익을 주장하며, 그의 개시내용은 본원에 포함된다.

본 발명은 재조합 단백질의 액상 용액, 바람직하게는 벌크 용액의 냉동 및 저장에 관한 것이다.

일반적으로, 세포 배양에 의한 재조합 단백질의 제조에는 일련의 정제 단계가 포함되며, 이들 단계에 의해 목적하는 단백질 생성물이 재조합 숙주 세포 및/또는 관련된 배양 배지로부터 회수된다. 수많은 중요 재조합 단백질이 거대한 상업적 규모로 제조된다. 예를 들어, 제약 단백질의 경우, 목적하는 수준의 생성물 순도를 달성하기 위해 둘 이상의 정제 단계를 이용하는 것은 드물지 않다.

제제화를 위한 최종 정제 전에, 최초 정제되었으나 최종 정제되지는 않은 재조합 단백질의 벌크 용액을 저장하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 단백질-함유 재조합 발효 반응 생성물은 친화성 또는 이온 교환 컬럼에서 최초 정제될 수 있다. 최초 컬럼 통과 후에 단백질 생성물은 부분적으로만 정제되었므로, 용액은 잔 존 세포 배양물 및 여타 단백질과 같은 오염물질을 여전히 함유한다. 이러한 벌크 용액은 의약품으로 최종 제제화되기 전에 반드시 만족스러운 순도의 단백질을 얻도록 추가로 처리되어야 한다.

일반적으로, 최초 통과 정제 처리물로부터 단백질을 회수하기 위해 사용하는 용액 (예를 들어, 용출 완충액)은 높은 염 농도의 용액이다. 컬럼으로부터 용출이 수행되는 경우, 컬럼으로부터 단백질을 분리하기 위해서는 높은 염 농도가 요구된다. 따라서, 최초 통과 정제 처리물로부터 회수된 "벌크" 용액은 높은 농도의 1가 염, 일반적으로는 염화나트륨, 잠재적으로는 염화칼륨, 또는 여타 염을 갖는 용액을 포함할 수 있다.

재조합 단백질의 "벌크" 용액의 저장은, 용액의 높은 염 농도 및 매우 낮은 단백질 농도로 인해 독특한 과제를 제공한다. 이상적으로, 단백질은 안정성을 확보하기 위해 유리 전이 온도 미만에서 저장되며, 그 이유는 유리 상태에서 단백질 불활성화 및 변성이 제약학적 시간 척도상 극도로 느리기 때문이다. 한편, 용액 중의 높은 염 농도는 용액의 유리 전이 온도를 하락시키는 경향이 있으며, 높은 염 농도 및 낮은 단백질 농도를 갖는 용액이 유리 상태에 도달하기 위해서는 매우 낮은 온도가 필요하다.

비용 및 효율 상의 이유로, 큰 부피량의 벌크 용액을 보다 높은 온도에서 냉동 저장하면서 단백질의 안정성 및 활성을 보존하는 것이 바람직하다.

<발명의 요약>

본 발명은, 100 mM 이상의 1가 염 농도, 예를 들어 NaCl 및/또는 KCl 농도를 갖는 재조합 단백질 용액을 제공하고, 냉동시에 -56 ℃ 이상의 유리 전이 온도를 갖는 용액을 제공하기에 충분한 양으로 탄수화물을 상기 용액에 첨가하고, 저장을 위해 상기 용액을 냉동시키는 것을 포함하는, 냉동 저장을 위해 재조합 단백질의 액상 용액을 안정화시키는 방법이다.

본 발명은 또한, 냉동시에 -56 ℃ 이상의 유리 전이 온도를 갖는 용액을 제공하기에 충분한 양으로 탄수화물을 함유하는, 냉동 저장을 위해 안정화된 재조합 단백질의 액상 용액을 제공한다.

도 1은, 탄수화물을 본원에 기재된 바와 같은 여타 부형제와 함께 또는 상기 부형제 없이 재조합 인자 VIII의 벌크 용액에 첨가하는 것이 재조합 단백질 활성의 보존에 미치는 영향을 나타낸다. 4종의 상이한 제제가 F1, F2, F3 및 F4로 표시된다. 24주까지 -30 ℃에서 냉동 및 저장한 후, 제시된 다양한 시점에서 인자 VIII 활성을 분석하였다. 탄수화물이 첨가되기 앞서, 벌크 용액은 대략 60O mM NaCl, 1O mM CaCl₂, 2O mM 이미다졸 및 0.1％ 트리톤 (Triton) X-100을 함유하되, F3은 본원에 기재된 바와 같이 희석되었다. 그래프는 시간 대 응고 효능 (IU/mL)으로 표시된다.

도 2는, 도 1에 예시된 실험에서 사용된 재조합 인자 VIII의 벌크 용액 (단, 안정화용 부형제는 사용되지 않음)을 -70 ℃ 및 -30 ℃에서 냉동 및 저장한 후의 재조합 인자 VIII 활성의 손실률을 나타낸다. "LN₂ → -70 ℃" 표기는 샘플이 액체 질소 중에서 냉동된 후에 -70 ℃에서 저장되었음을 나타내고, "LN₂ → -30 ℃"는 샘플이 액체 질소 중에서 냉동된 후에 -30 ℃에서 저장되었음을 나타낸다. "EVA → -70 ℃"는 샘플이 폴리머 저장 백 중에서 냉동되어 -70 ℃에서 저장되었음을 나타낸다.

재조합 단백질의 액상 용액은, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등을 이용하여 재조합 세포 배양물로부터 얻어진 임의의 재조합 단백질의 용액을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 용액은 부분적으로 정제된 용액을 포함하는 벌크 용액이다. 모든 실시양태에서, 액상 용액은 높은 염 농도의 용액, 바람직하게는 수용액이다.

재조합 단백질에는, 예를 들어 응고 인자(coagulation factor), 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 원충 항원, 펩티드 호르몬, 케모카인, 사이토카인, 성장 인자, 효소, 혈액 단백질, 예컨대 헤모글로빈, α-1 항트립신, 피브리노겐, 인간 혈청 알부민, 프로트롬빈/트롬빈, 항체, 혈전 인자(clotting factor), 및 그의 생물학적 활성 단편, 예컨대 인자 V, 인자 VI, 인자 VII, 인자 VIII 및 그의 유도체, 예컨대 B-도메인이 결실된 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 플레처 (Fletcher) 인자, 피츠제랄드 (Fitzgerald) 인자 및 폰 빌레브란트 (von Willebrand) 인자; 유 단백질, 예컨대 카세인, 락토페린, 리소자임, α-1 항트립신, 단백질 인자, 면역 단백질 및 그의 생물학적 활성 단편, 및 항체, 예를 들어 모노클로날 항체, 단쇄 항체, 항체 단편, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 재조합 세포 배양으로 생성될 수 있는 여타 항체 변이체 분자가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.

현재 바람직한 재조합 단백질은 재조합 인자 VIII이다. 본원에서 사용되는 인자 VIII에는 인자 VIII의 조작된 변이체, 예컨대 B-도메인이 결실된 인자 VIII 변이체가 포함된다.

본 발명의 의미 내에서, "벌크" 용액은 100 mM 이상의 1가 염을 함유하는, 부분적으로 정제되었으나 완전히 정제되지는 않은 재조합 단백질의 액상 용액을 포함한다. 바람직하게는, 상기 1가 염은 정제 컬럼으로부터 재조합 단백질을 용출하는 데 통상적으로 사용되는 NaCl이다. 그러나, NaCl은 전체적으로 또는 부분적으로 KCl로 대체될 수 있다. 또한, 벌크 용액은 다양한 양의 여타 염, 예컨대 2가 염 (염화칼슘 포함)을 함유할 수 있다.

"부분적으로 정제되었으나 완전히 정제되지는 않은"이란, 액상 용액이 하나 이상의 정제 단계를 거쳤으나 충분한 잔류 불순물을 여전히 함유하여 최종 생성물 제제화 전에 하나 이상의 추가 정제 단계가 필요한 것을 의미한다. 예를 들어, 재조합 인자 VIII의 "벌크" 용액은 최종 정제화 전에 추가로 정제되어야 한다 (인자 VIII 및 여타 단백질의 경우, 동결건조가 포함될 수 있음).

액상 용액은 100 mM 이상의 1가 염, 바람직하게는 100 mM NaCl, 보다 바람직하게는 300 mM 이상의 NaCl, 보다 바람직하게는 500 mM 이상의 NaCl, 보다 바람직하게는 560 mM 이상의 NaCl, 보다 더 바람직하게는 600 mM 이상의 NaCl을 함유한다. 재조합 단백질의 벌크 용액이 최초 정제 단계 후에 높은 1가 염 농도를 갖는 것은 드물지 않다.

본 발명의 또다른 실시양태에서, 액상 용액은 100 내지 200 mM NaCl, 100 내지 300 mM NaCl, 200 내지 30OmM NaCl, 100 내지 400 mM NaCl, 100 내지 500 mM NaCl, 100 내지 600 mM NaCl, 100 내지 800 mM NaCl, 300 내지 500 mM NaCl, 300 내지 600 mM NaCl , 300 내지 800 mM NaCl, 400 내지 600 mM NaCl, 400 내지 800 mM NaCl, 500 내지 600 mM NaCl, 560 내지 700 mM NaCl, 및 500 내지 800 mM NaCl을 함유한다.

본 발명의 "벌크" 용액은 또한, 매우 낮은 단백질 농도를 특징으로 한다. 본 발명의 실시양태에서, 벌크 용액 중의 재조합 단백질 농도는 0.0001 μM, 0.001 μM 또는 0.01 μM 만큼 낮을 수 있다. 본 발명의 실시양태에서, 벌크 용액 중의 재조합 단백질 농도는 10 μM, 1 μM 또는 0.1 μM 만큼 높을 수 있다. 상기 상한 및 하한의 임의 조합 내에 있는 임의의 단백질 농도가 본 발명의 의미 내에 있는 "벌크" 용액의 실시양태이다.

탄수화물은, 냉동시에 -56 ℃ 이상, 보다 바람직하게는 -34 ℃ 이상, 또는 그 사이의 정수 또는 분수로 표현되는 임의 온도의 유리 전이 온도를 갖는 용액을 제공하기에 충분한 양으로 냉동 전에 액상 용액에 첨가된다. 높은 염 농도 및 낮은 단백질 농도의 벌크 용액의 일반적인 유리 전이 온도는 실질적으로 -56 ℃ 미만, 예를 들어 -60 내지 -70 ℃이다. 유리 전이 온도를 -56 ℃로 상승시키는 데 필요한 탄수화물 첨가량에 있어서, 단백질 농도가 한 인자로서 고려되어야 한다. 높은 단백질 농도는 그 자체로 벌크 용액의 유리 전이 온도를 상승시키는 경향이 있다. 다른 인자로서, 탄수화물의 양은 용액의 점도를 과도하게 증가시키지 않아야 하며, 점도는 약 9.0 cP 미만으로 유지되는 것이 바람직하다. 용액의 전도도는 탄수화물 첨가에 의해 변화될 수 있으며, 바람직하게는 약 39 mS/cm 미만으로 유지되어야 한다.

본 발명의 문맥 내에서, 용액의 냉동이란 벌크 액상 용액을 냉동시키는 것을 의미하며, 상이한 기술적 고려가 포함되는 동결 건조와는 구분되어야 한다.

탄수화물은 제약 제제에서 일반적으로 사용되는 탄수화물 유형, 예를 들어 단당류, 및 이당류, 올리고당류 및 다당류일 수 있다. 그 예로는 덱스트란, 시클로덱스트란, 키토산, 전분, 히알루론산, 셀룰로스, 라피노스, 말토스, 락토스, 스타키오스 및 이들의 조합이 포함된다. 바람직한 예는 주사용으로 승인된 탄수화물, 예를 들어 수크로스, 트레할로스, 히드록시에틸 전분, 덱스트란 또는 이들의 조합이다. 제약 등급 탄수화물은 여러 공급자로부터 구입할 수 있다.

냉동 동안 용액을 보호하는 데 필요한 탄수화물의 정확한 양은, 예를 들어 시차 주사 열량법에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 특정 단백질 및 특정 탄수화물에 따라 달라진다. 현재 바람직한 탄수화물 양은 액상 용액의 중량을 기준으로 8 내지 25％ (w/w)이다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 탄수화물의 양은 액상 용액의 중량을 기준으로 약 8 내지 15％ (w/w), 12 내지 20％ (w/w), 16 내지 20％ (w/w), 15 내지 25％ (w/w), 및 20 내지 25％ (w/w)이다.

벌크 용액 중에는 최초 정제 (예를 들어, 용출)로부터 얻어진 여타 성분, 예를 들어 계면활성제 (예를 들어, 트윈 (Tween) 80 또는 트리톤-X), 염화칼슘 또는 이미다졸이 존재할 수 있다. 여타 부형제가 액상 용액에 첨가될 수 있다. 하기 제제들에서 제시된 바와 같이, 추가의 계면활성제가 부형제로서 첨가될 수 있다. 추가의 부형제로서 아미노산 (예를 들어, 글리신)이 첨가될 수 있다.

재조합 인자 VIII을 예시적인 재조합 단백질로서 사용하여 본 발명을 예시한다. 재조합 인자 VIII은, 예를 들어 미국 특허 제5,576,194호; 제5,804,420호; 및 제5,733,873호에 기재된 바와 같은, 당업계에 알려져 있는 방법을 이용하여 제조된다. 바람직한 실시양태에서, 재조합 인자 VIII은 대규모 발효 반응기 중에서 혈청이 없고/거나 단백질이 없는 배지의 포유동물 세포에서 제조된다. 바람직하게는, 재조합 인자 VIII은 재조합 세포에 의해 배지로 분비된다.

재조합 인자 VIII (전장)을 숙주 세포로부터 발현시키고, 맑은 조직 배양액으로부터 막 흡착제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 막 흡착제 공정은 (일반적으로 문헌 [Suck et al., J. Biotechnology, 121:361-367, 2006]에 기재된 바와 같이) 결합 및 용출에 의해 조직 배양액으로부터 재조합 인자 VIII을 단리 및 농축한다. 용출액은 4개의 배치 (batch)로 나누고, 각 배치를 멸균 보틀에 옮겼다 (각 보틀 당 400 mL). 용출액 (벌크 용액)은 재조합 인자 VIII 및 남아 있는 잔류 불순물 이외에도 대략 60O mM NaCl, 1O mM CaCl₂, 2O mM 이미다졸 및 0.1％ 트리톤 X- 100을 함유하였다. 용출액 중의 재조합 인자 VIII 농도는 대략 0.067 μM이었다.

이후, 탄수화물 또는 탄수화물들의 조합을 하기 표 1에 제제 1, 2, 3 및 4로서 제시된 양으로, 제시된 여타 부형제와 함께 실온에서 각 보틀에 첨가하였다.

제제 1	제제 2	제제 3	제제 4
8％ 수크로스 3％ 글리신	15％ 수크로스	10％ 히드록시에틸 전분 8％ 트레할로스 80 ppm 트윈	15％ 덱스트란 8％ 트레할로스 80 ppm 트윈

표 1의 모든 성분은 용액의 중량을 기준으로 하여 중량％로 표시된다. 탄수화물 및 여타 부형제는 구입하였다. 새롭게 제제화된 각 배치로부터 샘플을 채취하였다. 제제 1, 2, 3 및 4로부터의 샘플을, 표준 응고 분석법을 이용하여 인자 VIII 활성에 대해 평가하였다.

제제 3은 동일한 용출액으로부터 제조하되, 20 mM 이미다졸 및 10 mM CaCl₂를 함유하는 완충액으로 희석하여 NaCl 농도를 1/2로 감소시켰다. 상기 희석액을 사용하여, 본 발명의 방법이 낮지만 여전히 비교적 높은 1가 염 농도를 갖는 용액에 적용될 수 있는지 여부를 조사하였다.

시차 주사 열량법 (듀퐁 (DuPont)에 의해 변형된 DSC)을 이용하여 각 샘플의 유리 전이 온도를 측정하였다. 제제 1, 2, 3 및 4에서 나타난 유리 전이 온도는 각각, -56 ℃, -52.1 ℃, -34.9 ℃ 및 -35.5 ℃였다. 각 경우에서, 유리 전이 온도는 첨가되는 탄수화물의 부재 하에 관측된 유리 전이 온도보다 유의하게 높다 (탄수화물이 없는 동일한 벌크 용액의 경우, -60 내지 -70 ℃로 측정되었음). 제제의 점도는 다음과 같다: 제제 1: 1.8428 cP; 제제 2: 3.1089 cP; 제제 3: 6.8076 cP; 및 제제 4: 7.2123 cP. 제제의 전도도는 다음과 같다: 제제 1: 27.8 mS/cm; 제제 2: 25.57 mS/cm; 제제 3: 21.05 mS/cm; 및 제제 4: 32.1 mS/cm.

모든 제제는 다양한 시점에서 인자 VIII 활성의 응고 분석에 의해 측정시, 24주까지 -80, -30, -18 및 -14 ℃에서의 냉동 저장 후에 활성의 유의한 손실 없이 안정한 것으로 나타났다.

도 1에 제시된 바와 같이, 본 발명에 따른 4종의 제제는 모두, 24주까지 -30 ℃에서의 저장 후에 인자 VIII 응고 활성을 실질적으로 최초 수준에서 유지하였다.

도 2에 제시된 바와 같이, 용액은 첨가되는 부형제의 부재 하에 -30 ℃에서의 1일 저장 후에 인자 VIII 응고 활성의 실질적으로 전부를 상실하였다.

Claims (24)

1. a. 10O mM 이상의 NaCl 또는 KCl, 또는 이들 모두의 농도 및 0.0001 μM 내지 1.0 μM의 재조합 인자 VIII 단백질 농도를 포함하는 재조합 인자 VIII 단백질의 액상 용액을 제공하는 단계;

   b. 냉동시에 -56 ℃ 이상의 유리 전이 온도를 갖는 용액을 제공하기에 충분한 양인, 용액의 중량을 기준으로 8 내지 25 중량％의 양으로 탄수화물을 상기 용액에 첨가하는 단계;

   c. 저장을 위해 상기 용액을 냉동하는 단계; 및

   d. 상기 용액을 동결 건조시키지 않고 냉동시킨 온도에서 상기 용액을 저장하는 단계

   를 포함하는, 냉동 저장을 위해 재조합 인자 VIII 단백질의 액상 용액을 안정화시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 재조합 인자 VIII 단백질의 액상 용액이 벌크 용액인 방법.
3. 제1항에 있어서, 용액이 10O mM 이상의 NaCl 농도를 포함하는 것인 방법.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 탄수화물이 수크로스, 트레할로스, 히드록시에틸 전분, 덱스트란 및 이들이 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 용액이 30O mM 이상의 NaCl 농도를 포함하는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 용액이 60O mM 이상의 NaCl 농도를 포함하는 것인 방법.
8. 삭제
9. 제1항에 있어서, 유리 전이 온도가 -56 ℃ 내지 -35 ℃인 방법.
10. 제1항에 있어서, 아미노산 또는 계면활성제, 또는 이들 모두를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
11. 10O mM 이상의 NaCl 또는 KCl, 또는 이들 모두의 농도 및 0.0001 μM 내지 1.0 μM의 재조합 인자 VIII 단백질 농도를 포함하고, 냉동시에 -56 ℃ 이상의 유리 전이 온도를 갖는 용액을 제공하기에 충분한 양으로 탄수화물을 더 포함하며, 상기 탄수화물이 용액의 중량을 기준으로 8 내지 25 중량％의 양으로 존재하는, 냉동 저장을 위해 안정화시킨 재조합 인자 VIII 단백질의 액상 용액.
12. 제11항에 있어서, 벌크 용액을 포함하는 재조합 인자 VIII 단백질의 액상 용액.
13. 제11항에 있어서, 10O mM 이상의 NaCl 농도를 포함하는 재조합 인자 VIII 단백질의 액상 용액.
14. 삭제
15. 제11항에 있어서, 탄수화물이 수크로스, 트레할로스, 히드록시에틸 전분, 덱스트란 및 이들이 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 재조합 인자 VIII 단백질의 액상 용액.
16. 제11항에 있어서, 30O mM 이상의 NaCl 농도를 포함하는 재조합 인자 VIII 단백질의 액상 용액.
17. 제11항에 있어서, 60O mM 이상의 NaCl 농도를 포함하는 재조합 인자 VIII 단백질의 액상 용액.
18. 삭제
19. 제11항에 있어서, 유리 전이 온도가 -56 ℃ 내지 -35 ℃인 재조합 인자 VIII 단백질의 액상 용액.
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제

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