JP5401446B2 - 凍結貯蔵を目的とした、組み換えタンパク質溶液の安定化 - Google Patents

Description

本願は、２００７年４月２６日に出願された米国仮出願第６０／９２６，６９８号による利益を主張するものである。当該出願の全開示を、本願明細書に引用して援用する。

技術分野
本発明は、組み換えタンパク質の溶液、好ましくはバルク溶液の凍結及び貯蔵に関する。

細胞培養による組み換えタンパク質の生産には、通常、一連の精製工程が含まれている。その精製工程により、所望のタンパク質生成物が組み換えホスト細胞及び／又はそれにまつわる培養培地から回収される。多くの重要な組み換えタンパク質が工業規模で大量生産されている。例えば医薬用タンパク質の場合、生成物の純度が所望のレベルに達するよう、２段階以上の精製が行われることは珍しくない。

初期精製は行われたものの、最終精製までは行われていない組み換えタンパク質のバルク溶液を、処方のため最終精製を行うまで、貯蔵しなければならない場合がある。例えば、組み換え発酵反応のタンパク質含有生成物を、アフィニティー・カラム又はイオン交換カラム中で初期精製する場合がある。カラムへの初回通液を終えた段階では、タンパク質生成物は部分的にしか精製されておらず、その溶液には依然として細胞培養の残留物や他のタンパク質などの不純物が含まれている。最終処方により医薬製品とするに先立ち、バルク溶液をさらに処理して十分な純度のタンパク質とする必要がある。

初回通液精製処理によってタンパク質を回収するのに使用される溶液、例えば溶出バッファーは、通常、高濃度の塩溶液である。カラムから溶出させる場合、タンパク質をカラムから溶離するには塩濃度が高くなければならない。従って、初回通液精製処理により回収される「バルク」溶液は、高濃度の一価塩（通常は塩化ナトリウムであるが、場合によっては塩化カリウムなどの塩であり得る）を含有する溶液になり得る。

組み換えタンパク質の「バルク」溶液の貯蔵は、当該溶液の塩濃度が高く、かつ、タンパク質濃度が非常に低いために、特有の問題を有している。タンパク質をガラス転移温度未満で貯蔵して安定性を確実にするのが理想的である。これは、ガラス状態ではタンパク質の失活及び変性が薬学的な時間尺からみて極めて遅いためである。一方、溶液中の塩濃度が高いと、当該溶液のガラス転移温度が低下する傾向がある。従って、塩濃度が高く、かつ、タンパク質濃度が低い溶液では、上記状態とするのに非常に低い温度が必要となる。

コストや効率の点から、大容量のバルク溶液は比較的高い温度で凍結貯蔵することが望ましいが、その一方、タンパク質の安定性及び活性も維持しなければならない。

本発明は、凍結貯蔵のために、組み換えタンパク質溶液を安定化する方法であって、
ＮａＣｌ及び／又はＫＣｌなどの一価塩の濃度が１００ｍＭ以上である、組み換えタンパク質溶液を準備し、
上記溶液のガラス転移温度が凍結時に−５６℃以上となるのに十分な量の炭水化物を上記溶液に添加し、
貯蔵するために、上記溶液を凍結する
ことを含む方法である。

また、本発明は、組み換えタンパク質溶液であって
凍結貯蔵を目的として安定化されており、
当該溶液のガラス転移温度が凍結時に−５６℃以上となるのに十分な量の炭水化物を含有する
組み換えタンパク質溶液を提供する。

図１は、組み換え第ＶＩＩＩ因子（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ）のバルク溶液に、炭水化物を本明細書に記載されるような他の賦形剤と共に、又は、そのような他の賦形剤は用いずに添加することにより、組み換えタンパク質活性の維持に奏される効果を示す。異なる４つの配合をＦ１、Ｆ２、Ｆ３及びＦ４と呼ぶ。−３０℃で凍結貯蔵し、２４週間まで、図に示す各時点で第ＶＩＩＩ因子活性を分析した。おおむね、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、２０ｍＭのイミダゾール、及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するバルク溶液に炭水化物を添加した。但し、Ｆ３では本明細書に記載するように希釈を行ってから炭水化物を添加した。該グラフは、時間の経過に対し、凝固能（ＩＵ／ｍＬ）の値をプロットしたものである。 図２は、図１に示す実験で使用した第ＶＩＩＩ因子のバルク溶液を安定化賦形剤を添加しないで−７０℃及び−３０℃で凍結貯蔵した場合の組み換え第ＶＩＩＩ因子活性の損失の程度を示す。「ＬＮ_２→−７０℃」とは、サンプルを液体窒素中で凍結してから−７０℃で貯蔵することを指す。「ＬＮ_２→−３０℃」とは、サンプルを液体窒素中で凍結してから−３０℃で貯蔵することを指す。「ＥＶＡ→−７０℃」とは、サンプルをポリマー製貯蔵袋中で凍結してから−７０℃で貯蔵することを指す。

組み換えタンパク質溶液としては、組み換え細胞培養物からアフィニティー・クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーなどを用いて得られる組み換えタンパク質のいずれかを含む溶液を用いることができる。好ましい実施形態において、本溶液はバルク溶液であり、部分的に精製された溶液である。全ての実施形態において、本溶液は塩濃度の高い溶液、好ましくは水性溶液である。

組み換えタンパク質としては、以下に限定されないが、例えば凝固因子、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原、ペプチドホルモン、ケモカイン、サイトカイン、増殖因子、酵素、血液タンパク質、例えばヘモグロビン、α−１−抗トリプシン、フィブリノーゲン、ヒト血清アルブミン、プロトロンビン／トロンビン、抗体、血液凝固因子（ｂｌｏｏｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）、及び、それらの生物学的に活性なフラグメント（例えば第Ｖ因子、第ＶＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに、それらの誘導体、例えばＢ−ドメインが欠失した第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フレッチャー因子、フィッツジェラルド因子、及びフォン・ヴィレブランド因子など）；乳タンパク質、例えばカゼイン、ラクトフェリン、リゾチーム、α−１抗トリプシン、タンパク質因子、免疫タンパク質、及び、それらの生物学的に活性なフラグメント；並びに、抗体、例えばモノクローナル抗体、単鎖抗体、抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び、組み換え細胞培養で産生し得る他の変異抗体分子などが挙げられる。

現段階において好ましい組み換えタンパク質は、組み換え第ＶＩＩＩ因子である。本明細書中、第ＶＩＩＩ因子には、Ｂ−ドメインが欠失した第ＶＩＩＩ因子の変異型など、第ＶＩＩＩ因子を操作した変異型も含まれる。

本発明で用いる意味の範囲内において、「バルク」溶液は、一価塩を１００ｍＭ以上含有する、部分的には精製されているが、完全には精製されていない組み換えタンパク質溶液
である。上記一価塩は、精製カラムから組み換えタンパク質を溶出するのに一般的に用いられるＮａＣｌであるのが好ましい。しかしながら、当該ＮａＣｌの全て又は一部をＫＣｌで置き換えてもよい。また、バルク溶液は、例えば塩化カルシウムといった二価塩など、他の塩をさまざまな量で含有していてもよい。

上記の「部分的には精製されているが、完全には精製されていない」とは、溶液に１回以上の精製工程を施してはいるが、当該溶液には依然として残留不純物が十分に含有しているため、最終製品の処方の前にさらに１回以上の精製工程を施す必要があることを意味する。例えば、組み換え第ＶＩＩＩ因子の「バルク」溶液は最終処方前にさらに精製しなくてはならない。上記最終処方とは、第ＶＩＩＩ因子などのタンパク質の場合、例えば凍結乾燥などである。

本溶液は、１００ｍＭ以上の一価塩、好ましくは１００ｍＭのＮａＣｌ、より好ましくは３００ｍＭ以上のＮａＣｌ、より好ましくは５００ｍＭ以上のＮａＣｌ、より好ましくは５６０ｍＭ以上のＮａＣｌ、さらにより好ましくは６００ｍＭ以上のＮａＣｌを含有する。組み換えタンパク質のバルク溶液が、初期精製段階後に、このような高濃度の一価塩を含有しているのは珍しくない。

本発明の別の各実施形態において、本溶液は１００〜２００ｍＭのＮａＣｌを、１００〜３００ｍＭのＮａＣｌを、２００〜３００ｍＭのＮａＣｌを、１００〜４００ｍＭのＮａＣｌを、１００〜５００ｍＭのＮａＣｌを、１００〜６００ｍＭのＮａＣｌを、１００〜８００ｍＭのＮａＣｌを、３００〜５００ｍＭのＮａＣｌを、３００〜６００ｍＭのＮａＣｌを、３００〜８００ｍＭのＮａＣｌを、４００〜６００ｍＭのＮａＣｌを、４００〜８００ｍＭのＮａＣｌを、５００〜６００ｍＭのＮａＣｌを、５６０〜７００ｍＭのＮａＣｌを、５００〜８００ｍＭのＮａＣｌを含有する。

本発明の「バルク」溶液はさらに、当該溶液中のタンパク質濃度が非常に低いという特徴を有する。本発明の実施形態において、バルク溶液中の組み換えタンパク質濃度は、低いものでは０．０００１マイクロモル、０．００１マイクロモル、又は０．０１マイクロモルといった濃度であってもよい。本発明の実施形態において、バルク溶液中の組み換えタンパク質濃度は、高いものでは１０マイクロモル、１マイクロモル、又は０．１マイクロモルといった濃度であってもよい。これらの上限及び下限の任意の組み合わせの範囲内にあるタンパク質濃度はいずれも、本発明で用いる意味の範囲内における「バルク」溶液の一実施形態である。

溶液のガラス転移温度が凍結時において、−５６℃以上、より好ましくは−３４℃以上、又は、これらの各温度間の温度範囲の整数、小数若しくは分数で表される任意の温度、となるのに十分な量の炭水化物を凍結前に溶液に添加する。塩濃度が高く、かつ、タンパク質濃度が低い普通のバルク溶液のガラス転移温度は、本質的には−５６℃未満、例えば−６０〜−７０℃である。ガラス転移温度を−５６℃にまで上昇させるのに必要な炭水化物の添加量は、一つの要素としてタンパク質濃度を考慮して決定するのが望ましい。タンパク質濃度が高ければ、該タンパク質自身によってバルク溶液のガラス転移温度が高まる傾向がある。他の要素としては、炭水化物量は、溶液粘度を過度に上昇させない程度であるのが望ましく、粘度は約９．０ｃＰ未満に維持するのが好ましい。溶液の導電率は炭水化物の添加により変化し得るが、約３９ｍＳ／ｃｍ未満に維持するのが望ましい。

本発明において、溶液の凍結とはバルク溶液の凍結を意味し、異なる技術的事項を含む凍結乾燥とは区別すべきものである。

上記炭水化物とは、医薬品処方において通常使用される種類の炭水化物であってよく、例
えば糖類、二糖類、オリゴ糖類、及び多糖類などである。例として、デキストラン、サイクロデキストラン、キトサン、デンプン、ヒアルロン酸、セルロース、ラフィノース、マルトース、ラクトース、スタキオース、及び、それらの組み合わせなどが挙げられる。好ましい例は、注射用として承認済みの炭水化物であり、例えばショ糖、トレハロース、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、又は、それらの組み合わせなどが挙げられる。医薬品グレードの炭水化物は、多くの供給業者から市販されている。

凍結時の溶液の保護に必要な炭水化物の正確な量は、例えば示差走査熱分析などにより容易に決定でき、タンパク質の種類や炭水化物の種類に応じて異なる。現段階では、炭水化物量は、溶液量に基づき８〜２５％（ｗ／ｗ）であるのが好ましい。

本発明の特定の各実施形態において、炭水化物量は、溶液量に基づき約８〜１５％、１２〜２０％、１６〜２０％、１５〜２５％、及び、２０〜２５％（ｗ／ｗ）である。

初期精製（溶出など）由来の他の成分がバルク溶液中に含有していてもよく、当該成分の例として、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ ８０又はＴｒｉｔｏｎ−Ｘなど）、塩化カルシウム、又はイミダゾールが挙げられる。他の賦形剤を上記溶液に添加することもできる。下記配合にて示すように、界面活性剤を賦形剤としてさらに添加してもよい。別の賦形剤として、アミノ酸（グリシンなど）を添加してもよい。

組み換えタンパク質の例として組み換え第ＶＩＩＩ因子を用い、本発明を説明する。例えば米国特許第５，５７６，１９４号明細書、米国特許第５，８０４，４２０号明細書、及び米国特許第５，７３３，８７３号明細書に記載されているような当該技術分野で公知の方法により組み換え第ＶＩＩＩ因子を得る。好ましい実施形態においては、大規模発酵反応器中、培地を使用して、哺乳類細胞中で組み換え第ＶＩＩＩ因子を産生させる。上記培地は無血清及び／又は無タンパク質であってもよい。組み換え細胞により、組み換え第ＶＩＩＩ因子を培地中に分泌させるのが好ましい。

組み換え第ＶＩＩＩ因子（全長）をホスト細胞から発現させ、膜吸着クロマトグラフィーにより、清澄組織培養液から当該組み換え第ＶＩＩＩ因子を精製した。当該膜吸着プロセスによって、（概して、Ｓｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２１：３６１−３６７，２００６に記載されるような）結合及び溶出を経て、組み換え第ＶＩＩＩ因子が組織培養液から単離され、濃縮される。溶出液を４バッチに分け、各バッチを無菌瓶に移した（各瓶に４００ｍＬ）。組み換え第ＶＩＩＩ因子と残った残留不純物との他に、溶出液（バルク溶液）は、おおむね、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、２０ｍＭのイミダゾール、及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有していた。溶出液中の組み換え第ＶＩＩＩ因子濃度は、約０．０６７マイクロモルであった。

次に、一種類の炭水化物又は複数の炭水化物を、上述したような他の賦形剤と共に、下記表１の配合１、２、３及び４に示す量で各瓶に室温中添加した。

表１の全ての成分は溶液の重量に基づき重量％で示されている。炭水化物及び他の賦形剤は市販品を用いた。配合したばかりの各バッチからサンプルを採取した。各配合（１）、（２）、（３）及び（４）のサンプルの第ＶＩＩＩ因子活性を標準的な凝固アッセイにより評価した。

配合３については、同じ溶出液から調製したが、２０ｍＭのイミダゾールと１０ｍＭのＣａＣｌ_２とを含むバッファーで希釈し、ＮａＣｌ濃度を半減させた。当該希釈を行うことにより、一価塩濃度が依然として比較的高いものの他の配合よりは低い溶液に対して、本発明のプロセスが適用できるかどうかを試験した。

各サンプルのガラス転移温度を示差走査熱分析（ＤｕＰｏｎｔ 変調ＤＳＣ）により測定した。各配合１、２、３及び４が示したガラス転移温度は、それぞれ、−５６℃、−５２．１℃、−３４．９℃及び−３５．５℃であった。各配合においてガラス転移温度は、炭水化物を添加しなかった場合のガラス転移温度よりも著しく高くなっている（同一バルク溶液に炭水化物を添加しなかった場合、そのガラス転移温度の測定値は−６０〜−７０℃であった）。各配合の粘度は、配合１：１．８４２８ｃＰ；配合２：３．１０８９ｃＰ；配合３：６．８０７６ｃＰ；及び配合４：７．２１２３ｃＰであった。各配合の導電率は、配合１：２７．８ｍＳ／ｃｍ；配合２：２５．５７ｍＳ／ｃｍ；配合３：２１．０５ｍＳ／ｃｍ；及び配合４：３２．１ｍＳ／ｃｍであった。

各時点での第ＶＩＩＩ因子活性に対する凝固アッセイから確認されるように、−８０、−３０、−１８及び−１４℃で２４週間まで凍結貯蔵した後でも各配合は全て安定であり、活性が著しく損なわれることはないことが分かった。

図１に示すように、本発明に従って調製した４つの配合全てが、−３０℃で２４週間まで貯蔵した後でも、実質的に初期レベルに匹敵する第ＶＩＩＩ因子凝固活性を維持していた。

図２に示すように、賦形剤を添加しなかった場合、溶液を−３０℃でたった１日貯蔵しただけで、その溶液の第ＶＩＩＩ因子凝固活性は実質的に全て失われた。

Claims (18)

1. 凍結貯蔵のために、組み換えタンパク質溶液を安定化する方法であって、
   ａ．ＮａＣｌ及び／又はＫＣｌの濃度が１００ｍＭ以上である、組み換えタンパク質溶液を準備し、
   ｂ．前記溶液のガラス転移温度が凍結時に−５６℃以上となるのに十分な、前記溶液の重量に基づいて８〜２５重量％の量の炭水化物を前記溶液に添加し、
   ｃ．貯蔵するために、前記溶液を凍結する
   ことを含む方法。
2. 前記組み換えタンパク質溶液はバルク溶液である、請求項１に記載の方法。
3. 前記溶液のＮａＣｌ濃度は１００ｍＭ以上である、請求項１に記載の方法。
4. 前記炭水化物は、ショ糖、トレハロース、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、及び、それらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
5. 前記バルク溶液のＮａＣｌ濃度は３００ｍＭ以上である、請求項１に記載の方法。
6. 前記バルク溶液のＮａＣｌ濃度は６００ｍＭ以上である、請求項１に記載の方法。
7. 前記組み換えタンパク質は第ＶＩＩＩ因子である、請求項１に記載の方法。
8. 前記ガラス転移温度は、−５６℃〜−３５℃である、請求項１に記載の方法。
9. アミノ酸及び／又は界面活性剤を添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 組み換えタンパク質溶液であって、
    凍結貯蔵を目的として安定化されており、
    ＮａＣｌ及び／又はＫＣｌの濃度が１００ｍＭ以上であり、
    当該溶液のガラス転移温度が凍結時に−５６℃以上となるのに十分な、前記溶液の重量に基づいて８〜２５重量％の量の炭水化物を含有する
    組み換えタンパク質溶液。
11. バルク溶液を含む、請求項１０に記載の組み換えタンパク質溶液。
12. ＮａＣｌ濃度は１００ｍＭ以上である、請求項１０に記載の溶液。
13. 前記炭水化物は、ショ糖、トレハロース、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、及び、それらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の組み換えタンパク質溶液。
14. 前記溶液のＮａＣｌ濃度は３００ｍＭ以上である、請求項１０に記載の組み換えタンパク質溶液。
15. 前記溶液のＮａＣｌ濃度は６００ｍＭ以上である、請求項１０に記載の組み換えタンパク質溶液。
16. 前記組み換えタンパク質は第ＶＩＩＩ因子である、請求項１０に記載の組み換えタンパク質溶液。
17. 前記ガラス転移温度は、−５６℃〜−３５℃である、請求項１０に記載の組み換えタンパク質溶液。
18. ＮａＣｌ濃度が１００ｍＭ以上であり、
    組み換え第ＶＩＩＩ因子濃度が０．０００１マイクロモル〜１０マイクロモルであり、
    凍結貯蔵を目的として、ガラス転移温度が凍結時に−５６℃以上となるのに十分な、溶液の重量に基づいて８〜２５重量％の量の炭水化物の添加により安定化されている
    組み換え第ＶＩＩＩ因子溶液。

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