JP4880997B2 - Ａｄａｍｔｓ１３の安定化方法 - Google Patents

Description

本発明はフォンヴィルブランド因子切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）の安定化およびＡＤＡＭＴＳ１３含有組成物の製造方法に関するものである。

血栓性血小板減少性紫斑病(thrombotic thrombocytopenic purpura; ＴＴＰ)は、血小板減少、溶血性貧血、動揺性精神神経障害などを特徴とする症候群である。かつては約８０%の患者が3ヶ月以内に死亡する予後不良の疾患であった。最近、ＴＴＰの病因としてＶＷＦ切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）の活性低下が報告された。すなわち、後天性のＴＴＰは、ＶＷＦ切断酵素に対するＩｇＧ型インヒビターが産生されることによって酵素活性が低下することが原因であることが明らかにされた(非特許文献1及び２)。また先天的なＴＴＰであるUpshaw-Schulman症候群(ＵＳＳ)では、遺伝的にＶＷＦ切断酵素が欠損していることが判明した(非特許文献３)。このＶＷＦ切断酵素をコードする遺伝子は、ＡＤＡＭＴＳ１３であることが判明した(非特許文献４及び５)。

先天性或いは後天性のＡＤＡＭＴＳ１３欠損症の治療は、主に新鮮凍結血漿の輸注或いは血漿交換等によって、予後が大幅に改善されるようになっている。しかしながら、先天性ＡＤＡＭＴＳ１３欠損症患者は約２週間毎に新鮮凍結血漿の輸注を欠かせないことから、輸血副作用が危惧されている。ＡＤＡＭＴＳ１３の濃縮製剤が供給されれば、そのような危惧も大幅に改善されると考えられる。

ＡＤＡＭＴＳ１３は亜鉛型メタロプロテアーゼで、ＶＷＦサブユニットのＴｙｒ８４２−Ｍｅｔ８４３結合を特異的に切断する。この酵素については、特許文献１〜３に血漿からの単離、調製、さらには遺伝子組換えによる調製等に関する出願がなされている。この酵素の精製や性状に関する報告もされている（非特許文献６，７）。これらの報告にはＡＤＡＭＴＳ１３の活性測定には、２価金属イオンを共存させる必要があることや、本酵素の保存安定性には２価金属イオンの存在は悪影響を及ぼすことが示されている。本酵素の熱安定性に関する知見は知られていない。酵素を取り扱う上で安定な条件で扱うことは、酵素組成物を含む製剤、検査薬等を調製する産業上において有益である。
特表2000−508918 特開2003−284570 WO02/42441 A2 New Engl. J. Med.339,1578-1584,1998。 New Engl. J. Med.339,1585-1594,1988。 J. Hematol.74,101-108,2001 J Biochem.130,475-480,2001。 J. Biol. Chem.276,41059-41063,2001 Ｂｌｏｏｄ、８７、４２２３−４２３４，１９９６ Ｂｌｏｏｄ、９８、１６６２−１６６６，２００１

本発明の目的は、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物の加熱安定性及び保存安定性を増強させる方法、安定化された組成物及び組成物の製造方法を提供するものである。

本発明者らは、ＡＤＡＭＴＳ１３をヒト血漿より単離精製し、その性質を鋭意研究し、本酵素がカルシウムイオンやバリウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン等の２価金属イオンの存在下で熱安定性及び保存安定性の改善に大きな効果があることを見出した。

本発明は以下の構成からなる。
１、フォンヴィルブランド因子切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）を含む組成物に２価金属イオンを含有させることを特徴するＡＤＡＭＴＳ１３の安定化方法。
２、カルシウムイオン、バリウムイオン、マンガンイオン又はマグネシウムイオンのうちから選択された少なくとも１種を含有させる上記１に記載のＡＤＡＭＴＳ１３の安定化方法。
３、２価金属イオンを含有させることを特徴とするＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物。
４、２価金属イオンを含有させる工程を用いることを特徴とするＡＤＡＭＴＳ１３又はその含有組成物の製造方法。
５、２価金属イオンを含有させてなるＡＤＡＭＴＳ１３又はその含有組成物の加熱処理方法。
６、上記４または５のいずれかに記載の工程とウイルス不活化工程を組み合わせて調製するＡＤＡＭＴＳ１３又はその含有組成物。

本発明の方法は、ＡＤＡＭＴＳ１３を安定化させうるといった効果をもたらす。したがって本発明の方法を利用した製造方法により調製されたＡＤＡＭＴＳ１３含有組成物は、安定に加熱処理及びその他のウイルス不活化処理を施すことが可能となり、治療用医薬品として有用である。

ＡＤＡＭＴＳ１３は亜鉛型メタロプロテアーゼで、ＶＷＦ分子のＴｙｒ１６０５とＭｅｔ１６０６の間の結合に該当する結合を特異的に切断する。この酵素組成物に２価金属イオンを含有させることにより、本酵素の熱安定性および保存安定性が格段に改善される。２価金属イオンとして、カルシウムイオン、バリウイオン、マンガンイオンおよびマグネシウムイオンが例示される。これらの２価金属イオンを添加することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３の熱安定性が大幅に改善される。金属イオンの濃度は、実験的に求めることができ、例としてカルシウムイオンの場合には、大幅な熱安定性の改善効果は
少なくとも１．５ｍＭで認められた。通常３〜２０ｍＭの添加で十分な効果が得られる。
本発明において用いられる２価金属イオンは、塩化物、硝酸化合物、酢酸化合物、乳酸化合物等の塩類が用いられるが、その対イオン種については特に限定されるものではない。

ＡＤＡＭＴＳ１３を含む溶液は、トリス緩衝液などの適当な緩衝液が用いられる。又その緩衝液のｐＨは通常ｐＨ４〜１０の範囲、とりわけＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性が安定に保たれるｐＨ５〜９、より好適にはｐＨ６〜８の範囲が選択される。緩衝液には塩類や界面活性剤等、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等の添加物、アジ化ナトリウムや抗生物質等の防腐剤、デキストラン、マンニトール等の凍結乾燥のための賦型剤等を加えることもできる。

ＡＤＡＭＴＳ１３の安定化および活性化の方法、ＡＤＡＭＴＳ１３含有組成部およびその製造方法に関する本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３の含有組成物の形状は液状、凍結状態、又は固形状の何れの形状にも及ぶ。さらに本発明はＡＤＡＭＴＳ１３がヒト又は動物の生体試料、例えば血液から単離精製されたもの、或いは未精製のもの、遺伝子組換え技術により発現されたもの等、由来や起源に制限されるものではない。

本発明は生体試料中に存在しうるウイルスを不活化する工程と組み合わせることもできる。ウイルス不活化処理の例として、界面活性剤処理、メチレンブルーと可視光線照射、ベータープロピオラクトン処理、紫外線照射等の公知のウイルス不活化処理工程と
本発明の方法又は製造方法を用いた、液状又は乾燥加熱処理を組合せることができる。

本発明においては、本発明の組成物を治療用医薬品、研究用ＡＤＡＭＴＳ１３含有標品又はＡＤＡＭＴＳ１３活性又は抗原測定用試薬の検量物質として含めることができる。これらの組成物は、液状或いは凍結乾燥品等の形状で提供される。

クエン酸加正常ヒト血漿を抗ＡＤＡＭＴＳ１３モノクローナル抗体（クローンＡ１０、受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２０１８９）固定化セファロースカラムに通し、ＡＤＡＭＴＳ１３をカラムに吸着させた。吸着カラムを０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄後、４０％（Ｖ／Ｖ）エチレングリコールを含む０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で吸着画分を溶出させた。溶出画分を過剰量の０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析し、粗精製ＡＤＡＭＴＳ１３画分を得た。その画分を、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー等でさらに精密に精製することも可能であったが、特に必要が無い場合を除いて、粗精製ＡＤＡＭＴＳ１３画分を用いた。

塩化カルシウム、塩化バリウム、塩化マンガン及び塩化マグネシウムを各０．１Ｍとなるように生理食塩水に加えた溶液を調製した。各溶液１容とＡＤＡＭＴＳ１３を含む試料９容を混和し検討用試料とした。各溶液の代わりに生理食塩水を加えたものを対照とした。各試料を２５℃、３７℃、４５℃、５６℃、６５℃の各温度で２０分間インキュベーションし、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定したときの結果を図１に示した。対照の
活性を１００％としたときの相対活性で表したところ、４５℃、２０分間のインキュベーションで対照は約４分の１の残存活性しか示さないのに対して、２価金属イオンを加えたものでは何れもほぼ完全に活性を保持していることから、２価金属イオンの添加による熱安定性の向上が確認できた。塩化カルシウムの添加は５６℃でもほぼ完全に活性を保持していた。また、塩化カルシウムおよび塩化バリウムを加えた場合には、ＡＤＡＭＴＳ１３の活性自体が約２倍に増強された。

塩化カルシウムを１０ｍＭ含むＡＤＡＭＴＳ１３画分と、含まない画分を５６℃でインキュベーションしたときの活性の変化を経時的に調べた。その結果を図２に示した。塩化カルシウムを含まない画分では５分後にはほぼ完全に活性を失ったのに対して、１０ｍＭ塩化カルシウム存在下では９０分後においても、５０％以上の活性を保持していた。したがって、カルシウムイオンの添加により、明らかにＡＤＡＭＴＳ１３を安定化できることが確認できた。

塩化カルシウムを１０ｍＭ含むＡＤＡＭＴＳ１３画分と、含まない画分をそれぞれ冷蔵、室温、３７℃で保存したときの活性の変化を経時的に調べた。その結果を表１に示した。塩化カルシウムを含まない画分では３７℃で２０日間保存後、完全に活性を失ったのに対して、１０ｍＭ塩化カルシウム存在下では６０％以上の活性を保持していた。したがって、カルシウムイオンの添加により、長期保存においても安定化効果があることが確認できた。

本発明の２価金属イオン添加によるＡＤＡＭＴＳ１３の安定化により、ＡＤＡＭＴＳ１３の長期保存および加熱処理が可能になり、それらの成果に基づく治療薬、診断薬等の開発に利用できる。

本発明の２価金属イオン添加によるＡＤＡＭＴＳ１３の熱安定性を示した図である。 カルシウムイオンの有無による５６℃でのＡＤＡＭＴＳ１３活性の経時変化を示した図である。

Claims (2)

1. フォンヴィルブランド因子切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）を含む組成物に、カルシウムイオン、バリウムイオン、マンガンイオン又はマグネシウムイオンのうちから選択された少なくとも１種の２価金属イオンを含有させることを特徴する、ＡＤＡＭＴＳ１３の安定化方法。
2. ＡＤＡＭＴＳ１３を含む組成物に、カルシウムイオン、バリウムイオン、マンガンイオン又はマグネシウムイオンのうちから選択された少なくとも１種の２価金属イオンを含有させてなるＡＤＡＭＴＳ１３含有組成物の加熱処理方法。

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