TW443934B - Thrombopoietin compositions - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消费合作社印11 4439 3 4 ^ A7 ____ B7 五、發明説明（1 ) 發明背景 造血是一種過程，藉此使血球細胞從骨髓中有多種作用 的幹纟田胞開始發展和分化3此一過程涉及經由在標靶細胞 上與細胞膜結合的受體而產生作用的多肽生長因子（細胞分 裂素）複雜的相互作用。細胞分裂素作用的結果，導致細胞 的增殖和分化，對特定的細胞分裂素起反應的通常具有系 統-特異性的及/或階段-特異性的s單一細胞類型從幹細胞 開始發展，諸如血小板之類，可能需要按適當順序作用之 多重細胞分裂素的協調作用。 已經發展出各種細胞分裂素作爲治療劑之用人例如，促 紅血球生成素，其刺激紅血球的發展，被用來治療因腎衰 竭所引起的貧血。已經使用數群刺激因予，使其與癌症化 學治療結合，以便加速患者免疫系統的诶復。在某些癌症 的治療中，使用了介白素-2、任-干擾素和干擾素。 已經在血小板減少之動物的體液中，確認刺激巨核細胞 生成和血小板生成的活性，並在文獻中被稱爲”血小板生成 素”（最_ 近由 McDonald, Exp. Hematol. 16:201-205，1988和 McDonald, Am. J. Ped. Hematol. Oncol. H-:8-2 1，1992再回顧） 。現在已經利用遺傳工程培養的細胞來產製該蛋白質=> 參 見 de Sauvage 等人，Nature 369:533-538，1994 ; L〇k 等人， Nature 369:565-568， 1994 ; Kaushansky 等人，Nature 369:56B〇71， 1 994 ;以及 Bartley 等人，Cell 77:1117-1124 ，1994 a

人類的血小板生成素（TPO)是332個胺基酸殘基的70kD 木紙張尺度適圯+囚闉家標苹（CNS )八4規格（210:<2〇7公t ) --- n n n - I— 1^1 i) ___ _ ___I T ---- - n - . (請先閲讀背面之注意^-項再填寫本頁) 443934 A7 B7 五、發明説明（2 ) 糖蛋白。它含有大約152個殘基之胺基-端的生長因子功能 部位，以及富含碳水化合物的羧基-端功能部位。T P 0的截 短形式，包含在活體外和在活體内表現出生物學活性的胺 基-端功能部位。非-人類的丁 p 〇 s亦已經被描述在科學的文 獻中（例如Lok等人’·在同一書中；Bartley等人，在同一書 中；Shimada 等人，Blood 84( 10 附錄 l):326a，1994)。 血小板生成素似乎受到蛋白的水解作用，並以異質性的 或經過降解之形X被分離出來（Bartley等人，在同一書中 ;de Sauvage等人，在同一書中）。因此在科學文獻中所報 告的血小板生成素之製備方法，關於组合物和各種分子種 類的相關活性’尚未完全描述其特性，雖然至少一些蛋白 水解產物是具有生物學上活性的，。然而，已經提出報告的 些微努力，定出大规模產製血小板生成素的日期，且在此 項技藝中’需要適合藥學用途的TP0組合物。這類調配物 在儲存時應該是穩定的，並且是容易使用的。. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 發明概述 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明的目標之一是提供TPO的醫藥組合物，包括在儲 存時是穩定的含水組合物。 本發明的另一個目標是提供降低TP◦對表面之吸附作用 的方法，包括儲存，j、瓶的表面和製備所使用之濾紙，以及 該T P 〇之醫藥組合物的包裝3 本發明的額外目標是提供使該τρο之醫藥組合物穩定的 方法，包括含水;谷液和冷;東乾燥的粉末。 本紙張从適财_家標準（CNS -----— “39 3 4 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（3 ) —方面本發明提供由TPO、生理學上可接受之緩衝溶液 、選自非-離予性之表面活性劑和多元醇的表面吸附抑制劑 ，以及等張含量之生理學上可接受之鹽所組成的醫藥組合 物3該TPO可以是人韻的TPO，或是非人類（例如大鼠、 老鼠、狗或非-人類的靈長類）的τ P 〇 3在本發明的某些具體 實施例中，該组合^是具有5.0到7,〇tpH値的水溶液，較 佳的是5.5到6.5。在另—些具體實施例中，該組合物爲冷 凍乾燥的粉末。在更進一步的具體實施例中，該组合物含 有足以使血小板生成素之聚集現象降低之含量的組胺酸。 在另外的具體實施例中，該组合物爲含水的醫藥組合物， 其包括血小板生成素、10_100 mM磷酸缓衝溶液、〇 〇1_ 1.0%的聚山梨酸酯20或聚山梨酸，酯80，以及等張含量的氣 化鋼，該組合物具有大約6 · Q之ρ Η値。 在其他觀點中，本發明提供一種降低血小板生成素對表 面（吸附作用的方法，包括在使血小板生成素的水溶液與 表面接觸之前，先在該溶液中加入有效量的、選自非_離子 性表面活性劑和多元醇的表面吸附抑制劑。在本發明選出 的具體實施例中，該表面吸附抑制劑爲聚氧乙烯山梨聚糖 脂肪酸酯，如聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯8〇。 在第二個觀點中，本發明提供—種使血小板生成素之組 合物％疋的方法，其包括在該组合物中加入有效量的組胺 酸3 本發明的這些觀點及其他觀點，參照下列的詳述和附加 的圖片，將成爲顯而易見的。 本纸張尺颜A4_ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本¥c

-•ST 線 ' 6 - 4439 3 4 A7 B7 五 、發明説明（ I片簡述 圖1説明白蛋白和血清蛋白質對在過濾後回收之重组老氣 TPO的影響。 圖2説明非離子性之表面活性劑、多元醇和糖，對在過濾 t 後回收之重組人類T P 0的影響3 圖3説明藉著NaCl降低了 TP◦的表面吸附作用。 圖4説明各種籌配物在Τ P 〇吸附玻璃,】、珠時的影響s 圖5爲以層析法純化之重組人類τρο，在3 7X：下，在pH 値6.0之20mM磷酸或組胺酸緩衝溶液中的降解侧面圖。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 發明詳述 , 在本又中使用的名詞Η等張的"，爲其傳統的意義，也就 是相當於血液的張力，等於〇 9D/c^^NaC1溶液。在冷凍乾燥 製品的重新组合時，鹽的”等張含量"即是使該溶液成爲等 張或是產生等張溶液所需的量s 在本又中濃度是被指定的，按莫耳濃度的單位或液態杈 合物之重量/體積％。當該組合物是以冷康乾燥粉末之形式 存在時各別成伤的;辰度，將以重新組合該粉末時的特$ 濃度來提供之。 調配本發明之组合物，以你、j、m ^ ± J以便減少因爲表面吸附作用、 集現象、其他生理或化學降_紐彳七m 予降解作用，或這些過程的混合 所引起的τ ρ 〇活性的喪失。恭bE) 土 1 _ 次天發明者已經發現非-離子性之 面活性劑和多元醇，可降低T P 平1& i P ◦對表面的吸附作用，如 聚 表 濾 訂 線 本紙張尺度顧f酬家辟（cns ) 443934 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（5 ) 紙或小瓶。 根據本發明，將T P 0與緩衝溶液、選自非-離子性之表面 洁性劑和多元醇的表面吸附抑制劑：以及等張含量的生理 學上可接受之鹽混合。可將該組合物調製成水溶液或冷凍 乾燥的粉末。後者在使用之前，先利用醫藥上可接受之稀 釋劑’如滅菌的注射用水，將其重新組合。 在本發明中使用的缓衝劑，包括低離子程度、在生理學 上可接受缓衝劑> 其在5.0-7_0的pH値範固内是有效的。這 類緩衝劑包括磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和組 胺酸緩衝劑^ "低離子強度'，係意指5 -500mM，較佳的是 UlOOmM，而最好是20mM。較佳的是磷酸鈉和鉀緩衝劑 和组胺酸緩衝劑。該组合物的P H.値較好是從5.5到6 · 5，最 佳的是6_0。特佳的缓衝劑*2〇mM的磷酸鈉緩衝劑，pH値 &〇(16mM單價磷酸鈉+4mM二價磷酸鈉）。 在本發明中可使用的表面吸附抑制劑，包括非離子性之 表面活性劑和多元醇。非_離子性之表面活性劑包括聚氧乙 缔山糖脂胺酸酯’如聚山梨酸酯2〇(聚氧乙烯山梨聚糖 單月桂酸酯）、聚山梨酸酯8〇(聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯） 及其類似物。關於此點可使用的其他非_離子性表面活性劑 ，包括.聚氧化乙烯；山梨聚糖酯；聚氧乙烯烷基醚；以及 脂肪酸的甘油酯，包括單油酸甘油酯和單硬脂酸甘油酯。 在本發明中所使用的多元醇，包括聚乙二醇（例如PEG 3350)、甘露糖醇' 木糖醇、山梨糖醇、肌醇和甘油。通常 將a含有從0 · 0 〇 1 %到5 %之濃度的表面吸附抑制劑，較佳 本紙張尺度適用中--- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 4 439 3 4 Α7 Β7 五、發明説明（6 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 的是〇. 01 %到1 . 〇 %，更佳的是約〇 〇 5 %。特佳的表面吸附 抑制劑爲濃度大約0 · 0 5 %的聚山梨酸酯8 〇。也可以使用表 面吸附抑制劑的混合物（例如聚山梨酸酯8〇 + PEG 3350)。 已丄發現’ ^含有非-離子性之表面活性劑的T p 〇水容液 中’含有等張含量之生理學上可接受之鹽時，能更進一步 地降低T P 0的表面吸附作用。關於此點，較佳的鹽類包括 氣化物鹽類’如NaCl、KC1、CaCl2和MgCl2。NaCl是特 佳的3對熟諳此廣者而言是顯而易見的，達到等張性所需 鹽的實際含量’將依據諸如所選擇之特定的鹽，和該組合 物中的其他成份等因素來決定之。 經濟部中央標準局*:工消費合作社印製 可藉著使該組合物中含有上文揭示之某些成份的組合， 而得到利益。例如’在未經組胺.酸緩衝過的組合物中添加 組胺酸，可使得在該組合物中的T P 0更加穩定。實驗的證 據指出組胺酸降低了 TPO的聚集，也可以在PH>5.5時降低 非-蛋白水解的降解作用（例如脱酿胺化作用或氧化作用）。 因此，可將组胺酸以5 - 5 0 0 m Μ的濃度，包含在例如經蹲酸 緩衝過的Τ Ρ 0.组合物中，較佳的是1 0 -1 〇 〇 m Μ，更佳的是 大約2 0 m Μ。可在含有非-離子性表面活性劑的组合物中添 加聚乙二醇或其他的多元醇，更進一步地降低表面吸附作 用3可使冷凍乾燥的组合物中有利地含有組胺酸和多元醇 ，來降低聚集現象。 亦可使本發明组合物含有白蛋白。關於打算供人類使用 的醫藥組合物，最好是含有人類血清白蛋白，雖然在試劑 級的組合物或打算供獸醫使用的那些組合物（包括動物實驗 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规格（210X297公釐) ^439 3 4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（7 ) 之用途）中，也可以使用非_人類的白蛋白。在冷;東乾燥的組 合物中，白蛋白可用來當作賦形劑，且在含有〇 〇〗_丨〇〇/。 之濃度時，可用來當作穩定劑；最好是大約〇25% ^ 在本發明的組合物中，也可以含有一/或多個防腐劑，特 別是在爲了多重用途而加以包装的那些組合物中。可以用 於本發明中的防腐劑包括經常使用於醫藥製品中的那些， 如對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、苯甲醇、鄰_甲酚、 乙基汞硫代水楊談酯、酚、乙基汞硫代水揚酸鈉及其類似 物0 在本發明之组合物中可含有作爲填充劑、穩定劑或張力 調節劑的糖類。特別感興趣的糖類是作爲經過冷凍乾燥之 組合物的填充劑和穩定劑者。適，當的糖類包括右旋糖、乳 糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖及其類似物。 爲了根據傳統方式遞送來調配TPO之醫藥组合物，使其 以非經腸方式，特別是靜脈内或皮下之方式‘來遞送。調配 方法是此項技藝中已熟知的，並揭示於例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Gennaro 編著，以&。让？11131151^11£€〇· ，Easton PA，1990，其合併於此以作爲參考，在醫藥组合 物中，TP0的濃度通常將會在〇,丨到10毫克/毫升之間。雖 然也可以提供更高的濃度，並在使用之前先稀釋之。也可 以製備所含有之TPO濃度在較佳範圍之外的組合物，像是 用來當作研究試劑的。爲了此項技藝中已知之目的，除了 上文揭示的那些添加成份之外，也可以含有例如在冷凍乾 燥之前加入的填充劑：> 這些組合物中更可以含有其他的細 —.~— __________~ 10 ~ _____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 A7 B7 五、發明説明（8 ) 胞分裂素，特別是早期_作用的細胞分裂素，如幹細胞因子 IL-3, IL-6, IL-11 或GM-CSF = 企圖供藥學用途使用的TPO組合物將是滅菌且不含熱原 的，並將根據可接受之藥學程序來製造和包裝s可按單位 劑量或多重劑量之定量來包裝該組合物3通常將該组合物 包裝於帶有聚四氟乙烯劃線之塞子的密封玻璃小瓶中，並 加以適當之標示。可將冷凍乾躁的组合物包裝成工具組， 其含有適當含量妁適當的稀釋劑，如注射用水（W F1)或5 % 在WFI中的右旋糖。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線 只要希望增加髓類系統之細胞的增殖，就可以在治療上 使用本發明之血小板生成素，如血細胞減少症的治療，諸 如由再生障礙性貧血、骨髓發育•不全症候群、化學治療或 先天性血細胞減少症引起的血細胞減少症。τ P 0對於使A 小板之產製增加是特別有用的，如血小板減少症的治療 與各種疾病和臨床狀 '况有關聯的血小板減少症，可能單獨 作用或協同產生狀況。降低的血小板數目，可能是因爲， 例如在血小板產製時有缺陷、異常的血小板分布、因爲被 動輸血造成的稀釋喪失或血小板的異常破壞。例如，癌症 治療時所使用的化學治療藥物，可能抑制了骨髓中血小板 親代細胞的發展，而所得的血小板減少症限制了化學治療 ，並可能需要輸血。此外，某些惡性病可傷害血，】、板產製 和分布3使用放射線治療來殺死惡性細胞，也會殺死血小 板的親代細胞。也可因爲各種由藥物、新生兒的同種異質 免疫或血小板輸jk之同種異質免疫引起的血小板自體免疫 ____- 11 ~__ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（0X297公釐） 443934 A7 B7 五、發明説明（9 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 疾病，導致血小板減少症。T p 〇可減少或排除輸血的需要 ，藉此減少血小板同種異質免疫的發生率。血小板的異常 破壞可把疋因爲⑴在各種移殖或受到創傷之組織中，增加 血小板的消耗：或⑵與例如藥物_引起之血小板減少症、自 發性血，〗'板減少的紫.斑病（ΙΤΡ)、自體免疫之疾病、諸如白 血病和淋巴瘤之類的血液學疾病，或是涉及骨髓之轉移癌 症有關的免疫機轉。其他的ΤΡΟ適應症包括再生障礙性貧 血，以及因爲例> 化學治療或以ΑΖΤ治療ΗΙV感染導致的 藥物-引起之骨髓抑制。 因爲增加的出血而證實了血小板減少症，如來自鼻-口區 域或胃腸道的黏膜出血’以及來自傷口、潰瘍或感染位置 的渗tfo 3 1 治療劑量通常將會在0 . 1到1 0 0微克/每公斤患者體重每天 ，較佳的是0.5-50微克/每公斤每天’更佳的是卜25微克/ 公斤/天’由臨床醫師根據可接受之標準，考量待治療之病 狀的性質和嚴重程度、患者的特性等等，來決定精確的劑 量。劑量的決定係在熟諳此藝者的程度範園内。—般將在 化學治療或骨髓移殖之後，高達28天的期間内投予TP0， 經濟部中央標隼局—工消費合作社印装 或是投予TPO直到達到血小板計數>20,000 /立方毫米爲止 ，較佳的是>50, 〇〇〇 /立方毫米a更普遍而言，在一週或更 短的期間内投予T P 0 ’通常是在一到三天的期間内3 —般 而言，T P 0的有效治療用量是足以使淋巴系或骨髓系親代 細胞之增殖及/或女化’在臨床上明顯地增加產生的量， 這將顯示成熟細胞循環含量的增加（例如血小板、紅血球或 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4439 3 4 經濟部中央梯準局員工消費合作社印製 A7 ______B7____ 五、發明説明（I0 ) 嗜申性白血球）。因此將持續血小板疾病的治療，直到血小 板計數達到至少20,000/立方毫米爲止，較佳的是5 0,000/ 立方毫米。也可將ΤΡ Ο與其他的細胞分裂素混合投予，如 IL-3、-6和-Π ;幹細胞因子：紅血球生成素（EPO) : G-CSF和GM-CSF。在;昆合治療的攝生法中，其他細胞分裂 素的每曰劑量通常將是：EPO，<^150單位/公斤；GM-CSF ，5-15微克/公斤；il-3，1·5微克/公斤；和G-CSF，1-2 5微克/公斤。Ρ 0 —起的混合治療法，例如適用於具有 低Ε Ρ Ο値的負血患者。 也可以在活體外使用ΤΡΟ,諸如用於自體的骨髓培養之 類5簡言之，就是在化學治療和以ΤΡΟ處理之前，先將骨 髓從患者體内移出，可視需要與丄或多種其他的細胞分裂 素混合。然後在化學治療之後將經過處理的骨髓送回给該 患者，以便加速骨髓的恢復3此外，也可以在活體外使用 ΤΡΟ ’擴展骨髓或周園血液的親代（PBPC)細胞。在化學治 療之前’以幹細胞因子（SCF)或G-CSF來刺激骨髓，而釋 放出早期的親代細胞到周圍循環中。可從周圍血液中收集 並濃縮這些親代細胞，然後在培養物中以Τ Ρ 0處理，可視 需要與一或多種其他的的細胞分裂素混合，包括但不限於 SCF、G-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-6 或 IL-11，以便使 其分化並增殖成高-密度之巨核細胞培養物，然後再將其送 回給在高-劑量化學治療之後的患者= Τ Ρ 0也可以用來作爲研究造血過程的實驗試劑。本發明 之組合物和方法，提供了適合這類用途、可穩定儲存的血 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-° 線 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） 443934 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

五、發明説明（U 小板生成素之製品。 進一步以下列未加以限制之實例來解釋本發明。 實例 利用經過轉移感染的幼倉鼠腎臟細胞（BHK 570細胞； ATCC CRL 103li)來製備重组的人類和老鼠TP〇a從細 胞-#)味的培養基質中，藉著在固定不動之MPl受體上的親 和層析法，或是.以層析方式，利用染料-配體親和層析法、 離子交換層析法和蛋白質污染物在羥磷灰石上之吸附作用 的組合’來純化TP0 3在有絲分裂分析中，利用以編碼人 類MPL党體之表現載體轉移感染的Baf3細胞作爲標乾細胞 (Vigon等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5640-5644，1992) ’來分析TPO的生物活性。BaF3是衍生自老鼠骨髓、介白 素 2依賴性的前-淋巴系細胞株（paiaci〇s an(j steinmetz，Cell 41:727-734，1985 ; Mathey-Prevot等人，Mol. Cell. Biol. 6:4133·4135 ’ I986)。在3H-胸腺核苷的存在下，使該細胞 暴露在受試試樣之下3藉著與人類TPO的標準曲線相比較 ，定量出合併到細胞DN A中之3 Η -胸腺核与:的量。在有絲分 裂分析中，將10單位/¾升定爲提供半-最大値刺激的量。 聚山梨酸醋80(吐溫80)，NF級，係得自Spectrum Chemical Mfg. Corp.，New Brunswick，NJ。氣化鈉 (AR，USP)，鱗酸鈉、二價 '七水合物（USP，TAG)，和 畴酸鈉、單價、單水合物（USP)，均得自Mallinkrodt Chemical Corp.，Chesterfield，MO。 _____~ 14 ~ ____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2!〇X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ 4439 3 4 A7 B7五、發明説明（丨2 ) 實例1 藉著濾紙回收和從與玻璃小珠一起培養的溶液中回收， 來評估經過純化之血小板生成素的表面吸附作用。以適當 之測試緩衝溶液（參見下表）稀釋TPO之試樣。 經濟部令央標準局員工消費合作杜印製 TPOf： 缓衝溶液 添加物** 老鼠，chrom. 2〇111从檸檬酸0只4.〇,6.〇 一 老鼠，chrom. 2〇111”檸檬酸？^14.0,6.0 0.25% HS A 老鼠，chrom. 2〇mM 嶙酸_ pH 6.0, 8.0 — 老鼠，chrom. 2〇mM 鱗酸钾 pH 6.0, 8.0 0.25% HSA 老鼠，chrom. 2〇mM Tris pH 8.0 — 老鼠，chrom. 2〇mMTris pH 8.0 ' 0.25% HSA 人類，chrom. — mito diluent 人類，affrn 2〇1111^檸檬酸？只4.0,5.0, 6.0, 7.0, 8.0 — 人類，affin — mito diluent 人類，chrom. 50mM組胺酸pH 5.5 * 一 人類，chrom. 5OmM组胺酸pH 5.0 0.01%聚山梨酸酯80 人類，chronL 50mM组胺酸pH 5.5 0.01%聚山梨酸酯80 人類，chrom. 50mM組胺酸pH 6.0 0.01%聚山梨酸酯80 人類，chrom. 50mM组胺酸pH 5.5 0.05%聚山梨酸酯80 人類，chrom. 50mM玻拍酸pH 5.5 0.01%聚山梨酸酯80 人類 7 chrom. 2 OmM磷酸钾pH 6.0 — 人類，chrom. 2〇mM _酸钾 pH 6·0 0.01%聚山梨酸酯80 - 15 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 線 本紙張尺度適用中國國家標·隼（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） 443934 經濟部中央標準局員工消費合作杜印裝 A7 B7 五、發明説明（i3 ) 人類，chrom. 2〇mM鱗酸奸pH 6.0 0.01%聚山梨酸酯80+5%薦 糖 ’、 人類，chrom. 2〇mM鱗酸钾pH 6.0 0.01%聚山梨酸酯80+5%甘 露糖醇 人類，chrom. 2〇mM鱗酸卸pH 6.0 0.01%聚山梨酸酯80+1% PEG3350 人類，chrom. 2〇mM屬酸钾pH 6.0 5%蔗糖 人類，chroro· 2〇mM鱗酸钟pH 6.0 5%甘露糖醇 人類，chrom. 2〇mM 靖酸_ pH 6.0 1% PEG3350 人類，chrom. 2 OmM靖酸鉀pH 6.0 0.13MNaCl 人類，chrom. 20, 50，lOOmM鱗酸鉀pHO.〇5%聚山梨酸酯80+ 6.0 0.13MNaCl 人類，chrom. 20mM磷酸鉀pH 4.0, 5.0,0.05%聚山梨酸酯80+ 6.5, 7.0, 8.0 0.13MNaCl 人類，chrora. 2〇mM磷酸鈉pH 5.0, '5.5,0.05%聚山梨酸酯80+ 6.0 0.14M NaCl 人類，chrom. 2〇mM組胺鈉pH 5.0, 5.5, 0.05%聚山梨酸酯80+ 6.0 0.14M NaCl 人類，chrom. 20mM鱗酸鋼pH 6.0 0.05%聚山梨酸酯80 0.14MNaCl 人類，chrom. 20mM鱗酸鈉pH 6.0 0.14M NaCl+0.001% ， 0.01%，0.05%聚山梨酸酯 80 人類，chrora. 20mM鱗酸鈉pH 6.0 0.14M NaCl+0.001% , 0.01%，0.05%聚山梨酸酯 20 * chrom.=以層析方式純化；affin.=親和力純化diluent:補充有 10% FBS、1% L-縠胺醯胺、1% PSN 抗生素混合物（青黴素、鏈黴素、新黴素）、0.001 Μ丙酮酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )戎4規格（2ΙΟΧ 297公釐） (請先閱讀背面之注意ί項再填寫本頁) 、->· 線 443934 Α7 Β7 五、發明説明（丨4 ) 鈉、0.025从取卩63、〇.〇〇〇33%重量/體積之疏基乙醇的 RPMI 1640 = 利用附接注射筒的0.2微米之聚偏氟乙烯膜濾器 (Durapore™ 濾器；M—illipore，Bedford，MA)或 Acrodisc™膜 濾器（Gelman Sciences ’ Ann Arbor，ΜI)來測定濾器吸附作 用。以手將ΤΡΟ的溶液推過該濾器。在將該溶液加至注射 筒之前’和在通過該濾器之後取得試樣。發現在含有 0 · 2 5 %人類▲清白蛋白的調配物中，重組老鼠τ ρ 〇的回收 比不含白蛋白的那些更高（圖1)=重組人類ΤΡΟ也得到類似 的結果3以pH値爲函數’在受試範圍内（pfi4-8)並沒有觀 察到大的濾器回收之差異，但在p' Η 6.0時回收最多。當在調 配物中含有聚山梨酸酯80時，亦降低了重组人類τρο的表 面吸附作用（圖2) 3發現在聚山梨酸酯80的存在之下，等張 的氣化鈉更降低了吸附作用。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在誇大的表面-對-體積比之下，利用玻璃珠進—步研究表 面吸附作用。在5 Ό下’在管狀搖擺器上使〇 . 5毫升稀釋之 ΤΡΟ溶液的試樣（約10微克/毫升）暴露在1.〇克玻璃珠（425_ 6 0 0微米）下。在1 · 5、5和2 4小時之後，定出有絲分裂的活 性’作爲時間的函數來評估吸附作用2如圖4所示，在24小 時的受試期間内’吸附作用隨著時間而增加S聚山梨酸醋 80比起聚山梨酸酯20，降低了更多的吸附作用。當聚山梨 酸酯80的濃度從0.001%增加到0.05%時，回收也隨之增加 。在降低表面吸附作用上，聚山梨酸酯8 0與等張之氯化鋼 ϋ張尺度適用^國國家標準（CNS ) A4規格（ϋ< 297公釐） -- 4439 3 4 A7 B7 經濟部t央標準局員工消費合作衽印製 五、發明説明（15 ) 的混合，比單獨使用聚山梨酸酯8 0更有效。 實例2 在磷酸緩衝溶液和组胺酸緩衡溶液中，測試p Η値對溶液 中之Τ Ρ 0穩定性的影響3將以親和力和層析方式純化出的 重組老鼠及人類ΤΡ'Ο之試樣，在適當之緩衝溶液中稀釋， 或是以NaOH或HC1滴定至想要的pH値（參見表）。然後將試 樣儲存在各種溫渡之下，並間斷地以上述之有絲分裂分析 和SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS PAGE),隨後是西方墨點 法來分析之=在適當之時，從符合剩下有絲分裂活性對時 間之對數直線的斜率’定出假一級降解速率常數（K()bs), SDS PAGE/西方墨點分析顯示，親和力·純化出之重組 人類TPO遭受蛋白水解作用，依據？11値_和時間_依賴之方 式而成爲較低分子量之變體^在6-8的pH値範圍内，蛋白水 解作用導致切開兩個較低分子量的變體（由凝,膠電泳得知爲 3 5和18]4〇)，以溫度爲函數，蛋白水解作用隨著1)?1値增加 而增加。在ρΗ£5時’顯然降解產物具有明顯稍低於親代蛋 白質的分子量（由凝膠電泳得知約爲6〇kD) ’且以溫度爲函 數’隨著p Η値增加而增加。 以層析方式純化的重组人類ΤΡ0顯示出不同的降解侧面 圖= S D S P A G £ /西方墨點分析指出，在ρ η y時，溫度依 賴性的切開作用’成爲兩個較低分子量的物種（由凝膠電泳 得知爲3 0和2 0 k D)’且蛋白水解作用隨著pH値的降低而增 加。在pH>6時未觀察到明顯的蛋白水解作用，然而在溫度 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 冬紙浪尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（21〇><297公淹 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 443934 A7 --—----— —___B? 五、發明説明（16 ) 和PH値增加時，形成較高分子量的集合體。所有的降解產 物均具有比親代蛋白質低的生物活性値-速率側面圖（ 在k對PH値中）説明了該蛋白質的假—級降解速率d) ，暗不以恤度爲函|時’纟各種途徑之相關降解速率中的 是異。在3CTC和37X：下的側面圖是類似的，並顯示最大稃 定性的PHI約爲6。雖然在ρΗ>ό時發生了生物活性的迅速 喪失’但是經由SDS PAGE和西方墨點法，顯然沒有重大 的改變。這些結果暗示在pH>6時的降解作用，主要是經由 脱醯胺化，乍用、氧化作用，或一些未能由電泳檢測到的其 他機制而發生。在1?只$6時，在5χ：下的降解速率相對上是 固疋不變的，顯示在該ρΗ値範圍中的降解途徑具有相當大 的活化能（不合理的溫度依賴性），< 且對於在該溫度下Τρ〇的 全邵喪失，沒有重大的貢獻。 以Ρ Η値爲函數，比較鈉和鉀之磷酸緩衝溶液的結果時， 發現相等的降解速率。當使用不同濃度的磷酸鉀緩衝溶液 (：2 01111^_10()111\4，1314 6‘0)時，未觀察到顯著差異。然而在 5到6的pH値範圍中，使用组胺酸（2〇m]Vi)作爲缓衝溶液時 注意到有差異。在组胺酸緩衝溶液中的降解速率，比在3 7 C下在磷酸緩衝溶液中的更高，但在ρ η値5.5或6.0時，在 组胺酸緩衝溶液中的降解速率是相同或更低的（圖5 ) 3在3 〇 C下看到類似的結果，雖然差別較不明顯。在51下，在 ρΗ:>-6的組胺酸和鱗酸缓衝溶液中，降解速率相同。這些結 果符合在组胺酸的存在下，經由低ρ Η値之降解途徑，增加 了降解作用’但是组胺酸經由高pH値之降解途徑減少了降 本紙張尺度適用中國國家標车（CNS〉Λ4規格（21〇χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 43g A7 B7 五、發明説明（I7 ) 解作用。因此在降低溫度時，抑制了低p Η値之降解途徑， 而在5 °C下，在组胺酸的存在下促進降解作用則是不明顯的 d 從前文將可明瞭，雖然爲了解釋之目的，已經在本文中 描述了本發明的特定具體實施例，但是可進行不違背本發 明之精神和範圍的各種變化。因此除了附錄的申請專利範 圍之外，未對本發明加以限制。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適财國國家標^

Claims (1)

1. 44393 弟851〇7698號專利申請案 申請專利範圊f ιΈ：本(QA年1月）结 Α8 Β8 經濟部失標隼局買工消費合作社印装 六世—叫 1.—種用於增加髓類系統細胞增殖之醫藥組合物，其包 含： 血小板生成素； 選自5至500 mM磷酸鹽 '醋酸鹽、擰檬酸鹽和組胺酸 緩衝劑pH5.0到7.0所組成之生理學上可接受之緩衝劑； 選自聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯所组成之〇 〇 0〖％到 5 %的表面吸附抑制劑；以及 等張性含量的生理學上可接耷之氣化物鹽。 2·根據申蜻專利範圍第1項之:組合物，其為ρ η 5.0到7.0的 水溶液。 3. 根據申請專利範圍第2項之组合物，其為pH值為5.5到 6.5。 4. 根據申請專利範園第1項之組合物，其為冷凍乾燥粉末。 5. 根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該血小板生成素 係人類血小板生成素。 6. 根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該緩衝劑為磷酸 鹽缓衝劑，且該组合物更含有組胺酸，其含量足以降低 企小板生成素聚集。 7. 根據申請專利範圍第丨項之組合物，其中該聚氧乙烯山梨 聚糖脂肪酸酯為聚山梨酸酯2 0或聚山梨酸酯8 0。 8. 根據申請專利範圍第7項之組合物，其中該聚山梨酸酯2 0 或聚山梨酸酯8 0之含量濃度為0.0 1 %到1 % (重量/體積）。 9. 根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該鹽為N a C1 ' K C1、C a C12 或 M g 12。 本紙乐尺度適用中國囿家揉準（CNS ) A4規路（210X297公釐） I —^1 - I - 1 ^^^1 I -I - Τ. 术:.1 n^i (锖先閣讀背ίί之泣意事項再填寫本頁) a43g34 Α8 Β8 C8 DS ▽、申請專利範圍 根擔申凊專利範圍第1項之組合物，其更包含了白蛋白β ^^1 ^^^1 n·^ —^^ii t— 1:1 - - i ^^^1 - pi - n^i 一eJ (請先闔讀背面之注意事項再填寫本頁) 江根據申請專利範圍第1項之組合物，其更包含了防腐劑。 12.根據申請專利範圍第1項之組合物，其適於非經腸式用 途。 Β. 一種降低血小板生成素吸附活體外表面之方法，其包括 在血小板生成素水溶液與該表面接觸之前，先在該溶液 中添加有效量的選自聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯所組成 之〇 . 〇 0 1 %到5 %的表面吸附抑制劑。 根據申請專利範圍第1 3項 < 方法，其中該聚氧乙烯山梨 聚糖脂肪酸酯為聚山梨酸酯2〇或聚山梨酸酯8〇。 h根據申請專利範圍第丨4項之方法，其中加至該溶液中之 該聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80之含量濃度為〇.〇1 %到 1 ·〇%(重量/體積）。 16_ —種穩定血小板生成素用於增加髓類系統細胞增殖之醫 藥组合物的方法，其包括在該组合物中添加有效量的组 胺酸，其中該有效量為自5 mM到500 mM。 17. 根據申請專利範圍第丨6項之方法，其中該有效量之組胺 酸為 10·100πιΜ。 經濟部中央揉隼局貝工消費合作社印製 18. 根據申請專利範圍第1 6項之方法，其中該組合物係呈冷 凍乾燥粉末之形式。 19. 一種含水的用於增加髓類系統細胞增殖之醫藥组合物， 其包括 血小板生成素； 1 0 - 1 0 0 m Μ之磷酸鹽緩衝劑； -2- 本紙伕尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4439 3 4 ^ AS B8 C8 DS 六、申請專利範圍 0.01-1.Ο %之聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80 ;以及 等張性含量之氯化鋼，該組合物之ρ Η值約6.0。 20.根據申請專利範圍第1 9項之組合物，其更含有1 0-1 00 m Μ的組胺酸。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局貝工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規名·（ 210Χ2ί>7公釐）