BR112013005697B1 - Formulação aquosa estável - Google Patents

Abstract

formulações compreendendo o fator estimulante de colônia de granulócito bovino ou uma variante do mesmo, seu processo de preparação, uso de polipeptídeo bg-csf ou de uma variante do mesmo, e liofilizado ou pó. a presente invenção refere-se a formulações aquosas estáveis compreendendo um polipeptídeo de bg-csf ou uma variante do mesmo, uma substância tampão, e um excipiente, sendo que a dita formulação é substancialmente isenta de monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20). a invenção também se refere a métodos para usar uma forma liofilizada ou em pó e a processos para preparar a formulação.

Description

[0001] O fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF) é um membro da família de supergenes do hormônio do crescimento. O G- CSF estimula a proliferação de células precursoras de medula óssea específicas e sua diferenciação em granulócitos. Além disso, o G-CSF é um potente estímulo para a proliferação e maturação de neutrófilos in vivo (Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1987; 84: 2484-2488; vide também Heidari et al., Vet. Immol. Imunopathol. 2001; 81:45-57). O G- CSF também é capaz de induzir a ativação funcional ou “pré-ativação (priming)” de neutrófilos maduros in vitro (Weisbart, R. H. et al., Annals of Internal Medicine 1989; 110:297-303). Foi mostrado que o G-CSF pré-ativa os granulócitos humanos e intensifica a liberação de superóxido estimulada pelo peptídeo quimiotático N-formil-metionil- leucil-fenilalanina (S. Kitagawa, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987; 144:1143-1146, e C. F. Nathan, Blood 1989; 74:301-306), e ativa a fagocitose mediada por IgA de neutrófilos humanos (Weisbart, R. H., et al., Nature 1988; 332: 647-649).

[0002] Foi mostrado que o G-CSF é útil no tratamento de indicações nas quais um aumento nos neutrófilos fornecerá benefícios. O G-CSF também é útil sozinho ou em combinação com outros compostos (como outras citocinas) para o crescimento ou expansão de células em cultura, por exemplo, para transplantes de medula óssea.

[0003] A clonagem de cDNA e expressão de G-CSF humano recombinante (hG-CSF) foi descrita, e o hG-CSF recombinante mostra a maior parte, se não todas as propriedades biológicas da molécula nativa (Souza, L. et al., Science 232, 61-65 (1986)). A análise de sequências do cDNA e dos clones de DNA genômico permitiu a dedução da sequência de aminoácidos e revela que a proteína tem 204 aminoácidos de extensão com uma sequência de sinal de 30 aminoácidos. A proteína madura tem 174 aminoácidos de extensão e não possui sítios de glicosilação N-ligados potenciais, mas vários sítios possíveis para glicosilação O-ligada.

[0004] Preparações farmacêuticas contendo hG-CSF são conhecidas na técnica e incluem várias formulações. Por exemplo, várias formulações de hG-CSF são descritas em Piedmonte et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 60: 50-58 (2008), Herman et al., in Formulation, Characterization, and Stability of Protein Drugs, Rodney Pearlman e Y. John Wang, eds., Plenum Press, New York (1996), patente US 5.919.757 para Michaelis et al., e patente US 6.908.610 para Sato et al. Tradicionalmente, tensoativos são incluídos nas formulações de hG-CSF e podem proteger hG-CSF em interfaces potencialmente desestabilizadoras, contra superfícies encontradas durante o processamento, e contra a alteração de sua estabilidade conformacional.

[0005] A clonagem de cDNA e expressão de G-CSF bovino recombinante (bG-CSF) também foi descrita. Por exemplo, a sequência de polinucleotídeos e polipeptídeos do bG-CSF maduro é apresentada na patente US 5.849.883, que também descreve métodos para clonar, isolar, e purificar o polipeptídeo e seus análogos. O bG-CSF maduro tem 174 aminoácidos de comprimento e tem 82% de homologia ao hG- CSF. Heidari et al., supra, descrevem a expressão, purificação, e as atividades biológicas de bG-CSF.

[0006] A administração de bG-CSF ao gado pode fornecer benefícios terapêuticos. Consequentemente, uma formulação farmacêutica contendo bG-CSF é desejável para utilizar seu potencial terapêutico. Entretanto, formulações farmacêuticas de bG-CSF desenvolvidas de acordo com métodos tradicionais conhecidos na técnica resultam em propriedades de produto indesejáveis, como agregação e desestabilização do polipeptídeo de bG-CSF e/ou da formulação.

[0007] Portanto, existe uma necessidade por uma formulação farmacêutica de bG-CSF estável com propriedades desejáveis, como agregação mínima do produto e propriedades de desestabilização. Consequentemente, a presente invenção apresenta formulações farmacêuticas aquosas estáveis com um polipeptídeo de bG-CSF ou uma variante do mesmo, a qual mostra propriedades desejáveis e também fornece vantagens relacionadas.

[0008] Esta invenção fornece formulações aquosas estáveis compreendendo um polipeptídeo de bG-CSF ou uma variante do mesmo, uma substância tampão, e um excipiente, sendo que a dita formulação é substancialmente isenta de monolaurato de sorbitano polioxietileno (20). A invenção também fornece métodos para usar uma forma liofilizada ou em pó e processos para preparar a formulação.

[0009] As formulações aquosas estáveis do fator estimulante de colônia de granulócitos bovino (“bG-CSF”) de acordo com a invenção contêm um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo. Para uso na presente invenção, “polipeptídeo G-CSF bovino” (alternativamente chamado de “polipeptídeo bG-CSF,” “G-CSF bovino,” ou “bG-CSF”) e variantes dos mesmos devem incluir os polipeptídeos e as proteínas que possuem pelo menos uma atividade biológica de CSF, análogos de bG- CSF, mutantes de bG-CSF, bG-CSF glicosilado alterado, bG-CSF conjugado a PEG, isoformas de bG-CSF, miméticos de bG-CSF, fragmentos de bG-CSF, proteínas de bG-CSF híbridas, proteínas de fusão, oligômeros e multímeros, homólogos, variantes de padrão de glicosilação, variantes, variantes de splice, e muteínas, dos mesmos, independentemente da sua atividade biológica, e ainda independentemente do seu método de síntese ou fabricação incluindo, mas não se limitando a recombinante (produzido a partir de cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou outra forma de ácido nucleico), in vitro, in vivo, por microinjeção de moléculas de ácido nucléico, métodos sintéticos, transgênicos, e ativados por genes. Adicionalmente, o termo polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo abrange polipeptídeos de bG-CSF compreendendo uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido. Vide patente US n° 5.849.883 para exemplos de análogos de G-CSF bovino. A sequência do polipeptídeo bG-CSF maduro tem 174 aminoácidos de comprimento e é a seguinte: T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P

[00010] Além disso, o polipeptídeo bG-CSF com um resíduo de aminoácido metionina inicial é o seguinte: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P

[00011] Substituições em uma ampla variedade de posições de aminoácido no bG-CSF foram descritas. Substituições incluindo, mas não se limitando àquelas que modulam a estabilidade farmacêutica, aumentam a atividade agonista, aumentam a resistência à protease, convertem o polipeptídeo em um antagonista, etc. são abrangidas pelo termo polipeptídeo bG-CSF ou variante do mesmo.

[00012] O termo polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo inclui também bG-CSF glicosilado, por exemplo, mas não se limitando a polipeptídeos glicosilados em qualquer posição de aminoácido, formas glicosiladas N-ligadas do polipeptídeo, ou formas glicosiladas O- ligadas do polipeptídeo. Variantes contendo alterações de nucleotídeo únicas também são consideradas como variantes biologicamente ativa do polipeptídeo bG-CSF. Variantes contendo alterações de nucleotídeo únicas também são consideradas como variantes biologicamente ativas de bG-CSF. Além disso, variantes de splice também estão incluídas. O termo polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo inclui também heterodímeros de bG-CSF, homodímeros, heteromultímeros, ou homomultímeros de qualquer um ou mais bG-CSF ou qualquer outro polipeptídeo, proteína, carboidrato, polímero, pequenas moléculas, ligante, ligante, ou outra molécula ativa de qualquer tipo, ligada por meios químicos ou expressa como uma proteína de fusão (vide, por exemplo patentes US n°s 6.261.550; 6.166.183; 6.204.247; 6.261.550; e 6.017.876), assim como análogos de polipeptídeo contendo, por exemplo, deleções específicas ou outras modificações ainda mantêm atividade biológica (vide, por exemplo, patentes US n°s 6.261.550; 6.004.548; e 6.632.426). Os polipeptídeos bG-CSF e suas variantes são descritos, por exemplo, no pedido de patente U.S. 12/507.237 (agora publicação de pedido de patente US 2010/0035812), aqui incorporado por referência. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em bG-CSF: 8, 62, 69, 125, 133, 136, e qualquer combinação das mesmas (polipeptídeo bG-CSF maduro ou os aminoácidos correspondentes no polipeptídeo bG-CSF com um resíduo de aminoácido metionina inicial). Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural para-acetil fenilalanina (pAF) é substituído pelo aminoácido codificado naturalmente em uma das seguintes posições: S8, S62, L69, G125, T133, A136, e qualquer combinação das mesmas (polipeptídeo bG-CSF maduro ou os aminoácidos correspondentes no polipeptídeo bG-CSF com um resíduo de aminoácido metionina inicial).

[00013] Em uma modalidade, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo é bG-CSF-S8pAF, que tem a sequência: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P na qual uma única substituição de para-acetilfenilalanina (pAF) é feita na posição S8.

[00014] Em uma modalidade, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo é bG-CSF-S62pAF, que tem a sequência: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P na qual uma única substituição de para-acetilfenilalanina (pAF) é feita na posição S62.

[00015] Em uma modalidade, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo é bG-CSF-L69pAF, que tem a sequência: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P na qual uma única substituição de para-acetilfenilalanina (pAF) é feita na posição L69.

[00016] Em uma modalidade, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo é bG-CSF-G125pAF, que tem a sequência: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P na qual uma única substituição de para-acetilfenilalanina (pAF) é feita na posição G125.

[00017] Em uma modalidade, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo é bG-CSF-T133pAF, que tem a sequência: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P na qual uma única substituição de para-acetilfenilalanina (pAF) é feita na posição T133.

[00018] Em uma modalidade, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo é bG-CSF-A136pAF, que tem a sequência: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P na qual uma única substituição de para-acetilfenilalanina (pAF) é feita na posição A136.

[00019] A formulação da presente invenção pode incluir um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo que é ligado a um ligante, um polímero, ou uma molécula biologicamente ativa. Os ligantes, polímeros, e moléculas biologicamente ativas são descritos no pedido de patente U.S. 12/507.237 (agora publicação de pedido de patente US 2010/0035812). O termo "ligação" ou "ligante" é usado na presente invenção para se referir a grupos ou ligações que são normalmente formados como o resultado de uma reação química e são tipicamente ligações covalentes. O termo ligações hidroliticamente estáveis significa que as ligações são substancialmente estáveis em água e não reagem com água em valores de pH úteis, incluindo, mas não se limitando a sob condições fisiológicas por um período de tempo prolongado, talvez até mesmo indefinidamente. O termo ligações hidroliticamente instáveis ou degradáveis significa que as ligações são degradáveis em água ou em soluções aquosas, incluindo, por exemplo, sangue. O termo ligações enzimaticamente instáveis ou degradáveis significa que a ligação pode ser degradada por uma ou mais enzimas. Conforme compreendido na técnica, PEG e polímeros relacionados podem incluir ligações degradáveis na cadeia principal do polímero ou no grupo ligante entre a cadeia principal do polímero e um ou mais dos grupos funcionais terminais da molécula do polímero. Por exemplo, ligações éster formadas pela reação de ácidos carboxílicos de PEG ou ácidos carboxílicos de PEG ativados com grupos álcool em um agente biologicamente ativo geralmente hidrolisa, sob condições fisiológicas, para liberar o agente. Outras ligações hidroliticamente degradáveis incluem, mas não se limitam a ligações carbonato; ligações imina resultantes da reação de uma amina e um aldeído; ligações de éster de fosfato formadas pela reação de um álcool com um grupo fosfato; ligações hidrazona que são o produto de reação de uma hidrazida e um aldeído; ligações acetal que são o produto de reação de um aldeído e um álcool; ligações ortoéster que são o produto de reação de um formiato e um álcool; ligações de peptídeo formadas por um grupo amina, incluindo, mas não se limitando a uma extremidade de um polímero como PEG, e um grupo carboxila de um peptídeo; e ligações de oligonucleotídeo formadas por um grupo fosforamidita, incluindo, mas não se limitando a na extremidade de um polímero, e um grupo hidroxila 5’ de um oligonucleotídeo.

[00020] Em algumas modalidades, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo é ligado a um polímero solúvel em água. Para uso na presente invenção, o termo "polímero solúvel em água" se refere a qualquer polímero que é solúvel em solventes aquosos. A ligação de polímeros solúveis em água a um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo pode resultar em alterações que incluem, mas não se limitam a aumento ou modulação da meia-vida sérica, aumento ou modulação da meia-vida terapêutica em relação à forma não modificada, modulação da imunogenicidade, modulação das características de associação física, como agregação e formação de multímeros, alteração da ligação ao receptor, alteração da ligação a um ou mais parceiros de ligação, e alteração da dimerização ou multimerização do receptor. O polímero solúvel em água pode ou não ter sua própria atividade biológica, e pode ser usado como um ligante para ligar o bG-CSF a outras substâncias, incluindo, mas não se limitando a um ou mais polipeptídeos bG-CSF ou variantes dos mesmos, ou uma ou mais moléculas biologicamente ativas. Os polímeros adequados incluem, mas não se limitam a polietileno glicol, propionaldeído de polietileno glicol, derivados mono C1-C10 alcóxi ou ariloxi dessas substâncias (descritos na patente U.S. N° 5.252.714), monometóxi-polietileno glicol, polivinil pirrolidona, álcool polivinílico, ácidos de poliamino, anidrido divinil éter maléico, N-(2-hidróxi-propil)-metacrilamida, dextrano, derivados de dextrano incluindo sulfato de dextrano, polipropileno glicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol polióxi etilado, heparina, fragmentos de heparina, polissacarídeos, oligossacarídeos, glicanos, celulose e derivados de celulose, incluindo, mas não se limitando a metilcelulose e carbóxi metil celulose, amido e derivados de amido, polipeptídeos, polialquileno glicol e seus derivados, copolímeros de polialquileno glicóis e seus derivados, éteres poliviniletílicos, e alfa-beta-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida, e similares, ou suas misturas. Exemplos de polímeros solúveis em água incluem, mas não se limitam a polietileno glicol e albumina sérica. WO 03/074087 e WO 03/074088 descrevem a conjugação de proteínas ou pequenas moléculas a hidróxi alquil amidos (HAS). Exemplos de hidróxi alquil amidos, incluem, mas não se limitam a hidróxi etil amido. Conjugados de hidróxi alquil amido e outra molécula, por exemplo, podem compreender uma ligação covalente entre grupos aldeído terminais do HAS e grupos reativos da outra molécula.

[00021] Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água é uma porção de poli(etilenoglicol). Em algumas modalidades, a porção de poli(etilenoglicol) tem um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 100 kDa. Em outra modalidade, o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa a cerca de 50 kDa. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 10 kDa a cerca de 30 kDa. Em outra modalidade, o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 15 kDa a cerca de 25 kDa. Em ainda outra modalidade, o polímero solúvel em água tem um peso molecular de cerca de 20 kDa. Um versado na técnica entenderia que um polímero solúvel em água com um peso molecular de “cerca de 20 kDa” inclui variabilidade no peso molecular de aproximadamente 15% (isto é, cerca de 17 kDa a cerca de 23 kDa) com base na especificação e na polidispersão da porção.

[00022] Em uma modalidade, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo é bG-CSF-S8pAF, que tem a sequência: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P na qual uma única substituição de para-acetilfenilalanina (pAF) é feita na posição S8 e é ligada a uma porção de poli(etilenoglicol). Por exemplo, se a porção de poli(etilenoglicol) tinha um peso molecular de cerca de 20 kDa, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo nesta modalidade poderia ser identificado como “bG-CSF-S8pAF-20K PEG”, indicando que uma porção de poli(etilenoglicol) de 20 kDa está ligada à substituição de pAF feita na posição S8.

[00023] Em uma modalidade, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo é bG-CSF-S62pAF, que tem a sequência: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P

[00024] na qual uma única substituição de para-acetilfenilalanina (pAF) é feita na posição S62 e é ligada a uma porção de poli(etilenoglicol). Por exemplo, se a porção de poli(etilenoglicol) tinha um peso molecular de cerca de 20 kDa, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo nesta modalidade poderia ser identificado como “bG-CSF-S62pAF-20K PEG”, indicando que uma porção de poli(etilenoglicol) de 20 kDa está ligada à substituição de pAF feita na posição S62.

[00025] Em uma modalidade, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo é bG-CSF-L69pAF, que tem a sequência: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P na qual uma única substituição de para-acetilfenilalanina (pAF) é feita na posição L69 e é ligada a uma porção de poli(etilenoglicol). Por exemplo, se a porção de poli(etilenoglicol) tinha um peso molecular de cerca de 20 kDa, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo nesta modalidade poderia ser identificado como “bG-CSF-L69pAF-20K PEG”, indicando que uma porção de poli(etilenoglicol) de 20 kDa está ligada à substituição de pAF feita na posição L69.

[00026] Em uma modalidade, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo é bG-CSF-G125pAF, que tem a sequência: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P na qual uma única substituição de para-acetilfenilalanina (pAF) é feita na posição G125 e é ligada a uma porção de poli(etilenoglicol). Por exemplo, se a porção de poli(etilenoglicol) tinha um peso molecular de cerca de 20 kDa, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo nesta modalidade poderia ser identificado como “bG-CSF-G125pAF- 20K PEG”, indicando que uma porção de poli(etilenoglicol) de 20 kDa está ligada à substituição de pAF feita na posição G125.

[00027] Em uma modalidade, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo é bG-CSF-T133pAF, que tem a sequência: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P na qual uma única substituição de para-acetilfenilalanina (pAF) é feita na posição T133 e é ligada a uma porção de poli(etilenoglicol). Por exemplo, se a porção de poli(etilenoglicol) tinha um peso molecular de cerca de 20 kDa, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo nesta modalidade poderia ser identificado como “bG-CSF-T133pAF- 20K PEG”, indicando que uma porção de poli(etilenoglicol) de 20 kDa está ligada à substituição de pAF feita na posição T133.

[00028] Em uma modalidade, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo é bG-CSF-A136pAF, que tem a sequência: M T P L G P A R S L P Q S F L L K C L E Q V R K I Q A D G A E L Q E R L C A A H K L C H P E E L M L L R H S L G I P Q A P L S S C S S Q S L Q L T S C L N Q L H G G L F L Y Q G L L Q A L A G I S P E L A P T L D T L Q L D V T D F A T N I W L Q M E D L G A A P A V Q P T Q G A M P T F T S A F Q R R A G G V L V A S Q L H R F L E L A Y R G L R Y L A E P na qual uma única substituição de para-acetilfenilalanina (pAF) é feita na posição A136 e é ligada a uma porção de poli(etilenoglicol). Por exemplo, se a porção de poli(etilenoglicol) tinha um peso molecular de cerca de 20 kDa, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo nesta modalidade poderia ser identificado como “bG-CSF-A136pAF- 20K PEG”, indicando que uma porção de poli(etilenoglicol) de 20 kDa está ligada à substituição de pAF feita na posição A136.

[00029] Para uso na presente invenção, os termos "estabilidade" e "estável" no contexto de uma formulação compreendendo um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo se referem ao desdobramento térmico e químico, agregação, degradação, desnaturação, fragmentação, ou desestabilização do polipeptídeo bG- CSF ou variante do mesmo sob dadas condições de fabricação, preparação, transporte e armazenamento. As formulações "estáveis" da invenção mantêm integridade estrutural, o que resulta em uma retenção da atividade biológica, desejavelmente mais de 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 99,5% sob dadas condições de fabricação, preparação, transporte e armazenamento. A estabilidade das formulações pode ser avaliada por graus de agregação, despeguilação, degradação, desnaturação, ou fragmentação pelos métodos conhecidos pelos versados na técnica e descritos adicionalmente na presente invenção.

[00030] Para uso na presente invenção, o termo "aquoso" no contexto de uma formulação que compreende um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo se refere a água, um ou mais solventes orgânicos solúveis em água, ou uma mistura dos mesmos. O termo "solvente orgânico" é usado na presente invenção em seu sentido convencional para se referir a um composto orgânico líquido, tipicamente um material orgânico monomérico sob a forma de um líquido, de preferência, um líquido relativamente não viscoso, cuja estrutura molecular contém átomos de hidrogênio, átomos de carbono e, opcionalmente, também outros átomos, e que é capaz de dissolver sólidos, gases ou líquidos.

[00031] As formulações farmacêuticas da invenção podem compreender um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são determinados, em parte, pela composição particular sendo administrada, assim como pelo método particular usado para administrar a composição (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed. 1985)). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não se limitam a substâncias e excipientes tampão, como aqueles contendo solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol, e/ou combinações dos mesmos. Os veículos adequados podem ser substâncias tampão contendo succinato, fosfato, borato, HEPES, citrato, histidina, imidazol, nitrato, bicarbonato, e outros ácidos orgânicos. Os veículos adequados podem ser excipientes contendo álcoois de açúcar poliídrico, aminoácidos como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, leucina, fenilalanina, ácido glutâmico, treonina, etc., açúcares orgânicos ou álcoois de açúcar, como lactose, trealose, estaquiose, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol e similares, incluindo ciclitois como inositol; polietileno glicol; polímeros de aminoácido; agentes redutores contendo enxofre, como ureia, glutationa, ácido tioico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, α-monotioglicerol e tiossulfato de sódio; polipeptídeos de baixo peso molecular (isto é, <10 resíduos); proteínas, como por exemplo, albumina sérica humana, albumina sérica bovina, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinil pirrolidona; monossacarídeos como xilose, manose, frutose e glicose; dissacarídeos como lactose, maltose e sacarose; trissacarídeos como rafinose, e polissacarídeos como dextrano.

[00032] Citrato, histidina, maleato, succinato, fosfato, ou uma combinação dos mesmos pode ser usado de acordo com a invenção como substâncias tampão. Em algumas modalidades, citrato ou succinato é usado como uma substância tampão nas formulações aquosas estáveis. Em algumas modalidades, a substância tampão tem uma molaridade entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM. Em uma modalidade, a substância tampão tem uma molaridade de cerca de 30 mM. As substâncias tampão podem estar presentes sob a forma do ácido livre correspondente ou sob a forma de sais alcalinos, alcalinos terrosos ou de amônio. A formulação pode ainda conter substâncias auxiliares farmacêuticas comuns adicionais. A sequência de adição das várias substâncias auxiliares ou da substância ativa durante a produção das formulações farmacêuticas líquidas é amplamente independente do efeito estabilizante no armazenamento encontrado de acordo com a invenção e está ao critério do versado na técnica.

[00033] Cloreto de sódio, trealose, sorbitol, arginina, ou uma combinação dos mesmos podem ser usados como excipientes de acordo com a invenção. Em uma modalidade, o excipiente é arginina. Em algumas modalidades, a arginina tem uma molaridade entre cerca de 100 mM a cerca de 500 mM. Em outras modalidades, a arginina tem uma molaridade de cerca de 200 a cerca de 300 mM. Em algumas modalidades, a arginina tem uma molaridade de cerca de 250 mM.

[00034] Tradicionalmente, as formulações farmacêuticas de proteínas incluem tensoativos. A inclusão de tensoativos pode proteger proteínas em interfaces potencialmente desestabilizadoras, contra superfícies encontradas durante o processamento, e contra a alteração de sua estabilidade conformacional termodinâmica. Os tensoativos são bem conhecidos na técnica, por exemplo, tensoativos de polissorbato. Um exemplo de um tensoativo de polissorbato é monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20), também conhecido pelo nome comercial Tween 20®. Entretanto, estudos de uma formulação de bG-CSF contendo quantidades-traço de monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20) indicam que agregados aumentam até 3,2% (conforme medido por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)) após 5 dias de incubação a 25°C. Desta forma, as formulações da presente invenção são substancialmente isentas de um tensoativo, um tensoativo de polissorbato, e/ou monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20). Para uso na presente invenção, o termo “substancialmente isento” de um tensoativo, um tensoativo de polissorbato, e/ou monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20) se refere a uma formulação contendo menos de 0,033%, menos de 0,001%, menos de 0,0005%, menos de 0,0003%, ou menos de 0,0001% do tensoativo, tensoativo de polissorbato, e/ou monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20). As formulações da presente invenção são substancialmente isentas de tensoativo, tensoativo de polissorbato, e/ou monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20) de modo a obter uma formulação estável com propriedades desejáveis, tais como agregação mínima e desestabilização mínima do produto, e, onde aplicável, despeguilação reduzida.

[00035] O termo "molécula biologicamente ativa” para uso na presente invenção significa qualquer substância que possa afetar quaisquer propriedades físicas ou bioquímicas de um sistema biológico, via, molécula, ou interação relacionada a um organismo, incluindo, mas não se limitando a vírus, bactérias, bacteriófagos, transpóson, príon, insetos, fungos, plantas, animais, e seres humanos. Em particular, para uso na presente invenção, as moléculas biologicamente ativas incluem, mas não se limitam a qualquer substância destinada ao diagnóstico, cura, mitigação, tratamento, ou prevenção de doença em seres humanos ou outros animais, ou para melhorar de outro modo o bem- estar físico ou mental de seres humanos ou animais. Exemplos de moléculas biologicamente ativas incluem, mas não se limitam a peptídeos, proteínas, enzimas, fármacos de pequena molécula, vacinas, imunógenos, fármacos duros, fármacos macios, carboidratos, átomos ou moléculas inorgânicas, corantes, lipídios, nucleosídeos, radionuclídeos, oligonucleotídeos, toxoides, toxinas, células procarióticas e eucarióticas, vírus, polissacarídeos, ácidos nucleicos e porções dos mesmos obtidos ou derivados de vírus, bactérias, insetos, animais ou qualquer outra célula ou tipo celular, lipossomos, micropartículas e micelas.

[00036] As formulações farmacêuticas da presente invenção incluem as que também contêm, opcionalmente, um ou mais outros ingredientes ativos, em adição a um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo. Para uso na presente invenção, o termo “ingrediente ativo” ou “ingrediente terapêutico” se refere a um composto terapeuticamente ativo, assim como quaisquer pró-fármacos do mesmo e sais farmaceuticamente aceitáveis, hidratos e solvatos do composto e os pró-fármacos. Outros ingredientes ativos podem ser combinados com um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo e podem ser administrados separadamente ou na mesma formulação farmacêutica. A quantidade dos outros ingredientes ativos a ser dada pode ser facilmente determinada pelo versado na técnica com base na terapia com bG-CSF.

[00037] As formulações farmacêuticas da presente invenção incluem as que também contêm, opcionalmente, um ou mais outros ingredientes inativos, em adição a um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo. Para uso na presente invenção, o termo “ingrediente inativo” se refere a um composto terapeuticamente inativo, assim como quaisquer pró-fármacos do mesmo e sais farmaceuticamente aceitáveis, hidratos e solvatos do composto e os pró-fármacos. Outros ingredientes inativos podem ser combinados com um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo e podem ser administrados separadamente ou na mesma formulação farmacêutica. A quantidade dos outros ingredientes inativos a ser dada pode ser facilmente determinada pelo versado na técnica com base na terapia com bG-CSF.

[00038] A quantidade do polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo nas formulações aquosas estáveis é adequada para se obter um efeito terapêutico. Para uso na presente invenção, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade que dá o benefício desejado a um animal e inclui tanto tratamento quanto administração profilática. A quantidade irá variar de um indivíduo para outro e dependerá de inúmeros fatores, inclusive a condição física geral do paciente e a causa subjacente da condição a ser tratada. A quantidade de polipeptídeo bG-CSF ou variante do mesmo usada para terapia dá uma taxa de alteração aceitável e mantém a resposta desejada em um nível benéfico. Uma quantidade terapeuticamente eficaz das presentes composições pode ser facilmente verificada por um versado na técnica usando materiais e procedimentos disponíveis ao público. Por exemplo, a quantidade do polipeptídeo bG-CSF ou sua variante pode estar presente na formulação em uma quantidade entre cerca de 0,5 e cerca de 12 gramas/litro, de preferência, cerca de 5 gramas/litro.

[00039] De acordo com a presente invenção, as formulações aquosas estáveis de um polipeptídeo bG-CSF ou variante do mesmo podem ser formuladas em vários valores de pH. Em algumas modalidades, a formulação aquosa estável pode ter um valor pH entre cerca de 5,7 e cerca de 6,6. Em uma modalidade, a formulação aquosa estável tem um pH entre cerca de 6,0 e cerca de 6,3. O valor de pH desejado da formulação é ajustado pela adição de bases como hidróxidos alcalinos, hidróxidos alcalinoterrosos ou hidróxido de amônio. O hidróxido de sódio é, de preferência, usado para o ajuste de pH. O ajuste do valor de pH desejado pode, em princípio, ser obtido pela adição de soluções básicas. Em geral, sais de bases fortes com ácidos fracos podem ser usados, como acetato de sódio, citrato de sódio, hidrogênio fosfato dissódico ou dipotássico ou carbonato de sódio. Se a solução farmacêutica de substância auxiliar tiver um valor de pH básico, ela é ajustada por titulação com um ácido até a faixa de pH desejada de 4 a 5 ou 7 a 8 ser alcançada. Ácidos inorgânicos ou orgânicos fisiologicamente tolerados são levados em consideração como ácidos, como, por exemplo, ácido hidroclórico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido cítrico, ou soluções convencionais de substâncias que têm um valor de pH ácido. Nesse aspecto, alguns exemplos de substâncias são sais de ácidos fortes com bases fracas como, por exemplo, di-hidrogeno fosfato de sódio ou di-hidrogeno fosfato de potássio.

[00040] Conforme demonstrado nos exemplos abaixo, as formulações de bG-CSF da presente invenção mostram concentrações de agregado de polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo desejavelmente baixas em condições de armazenamento sob estresse e em condições de armazenamento aceleradas. Para uso na presente invenção, as condições de armazenamento sob estresse são avaliadas após as amostras de formulação serem incubadas a 25°C durante 5 dias. Para uso na presente invenção, as condições de armazenamento aceleradas são avaliadas após as amostras de formulação serem incubadas a 40°C durante 1 dia. As condições de armazenamento também podem ser avaliadas em outras várias temperaturas e durações, para os propósitos da presente invenção. Por exemplo, as condições de armazenamento poderiam ser avaliadas após as amostras de formulação serem incubadas a 25°C durante 28 dias ou após as amostras de formulação serem incubadas a 40°C durante 3 dias.

[00041] As concentrações de agregado do polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo são analisadas após condições de armazenamento em estresse e condições de armazenamento aceleradas. Em algumas modalidades, as formulações de bG-CSF da presente invenção têm uma concentração de agregado de polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo menor que cerca de 2,1% (porcentagem em peso/peso) em condições de armazenamento sob estresse. Em outras modalidades, as formulações de bG-CSF da presente invenção têm uma concentração de agregado de polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo menor que cerca de 1,5% (porcentagem em peso/peso) em condições de armazenamento sob estresse. Em algumas modalidades, as formulações de bG-CSF da presente invenção têm uma concentração de agregado de polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo menor que cerca de 1,5% (porcentagem em peso/peso) em condições de armazenamento aceleradas. Em outras modalidades, as formulações de bG-CSF da presente invenção têm uma concentração de agregado de polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo menor que cerca de 1,5% (porcentagem em peso/peso) em condições de armazenamento sob estresse.

[00042] Além disso, estudos de agitação forçada ou estudos de congelamento e descongelamento podem ser utilizados para avaliar as propriedades de estabilidade de uma formulação da presente invenção. Por exemplo, um estudo de agitação forçada poderia consistir em misturar uma amostra de formulação em um béquer de vidro a uma velocidade, tal como 60 rpm, usando um agitador magnético. A agitação poderia ocorrer por um período de tempo determinado, como duas horas, de modo a determinar as características da amostra da formulação. Um ciclo de congelamento e descongelamento poderia consistir em congelar uma amostra de formulação por 1 hora a cerca de -75°C e descongelar à temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora até nenhum gelo ser observado.

[00043] Além disso, conforme demonstrado nos exemplos abaixo, as formulações de bG-CSF da presente invenção podem mostrar propriedades desejáveis de desestabilização e/ou despeguilação do polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo em condições de armazenamento sob estresse e em condições de armazenamento aceleradas. Para uso na presente invenção, o termo “despeguilação” pode se referir à estabilidade da fixação das porções peguiladas ligadas a um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo, isto é, se tais porções peguiladas permanecem ligadas ao polipeptídeo ao longo do tempo, por exemplo, durante o armazenamento em uma solução aquosa, ou se elas tendem a se separar, por exemplo, como resultado, de hidrólise da ligação éster.

[00044] Em algumas modalidades, as formulações aquosas estáveis de um polipeptídeo bG-CSF ou variante do mesmo podem ser formuladas usando citrato como uma substância tampão e arginina como um excipiente. Em uma modalidade, a formulação aquosa pode ser preparada usando monoidrato de ácido cítrico (Fisher, C/6200/60 ou equivalente) como a substância tampão e L-arginina (Sigma, A8094 ou equivalente) como o excipiente. A formulação aquosa pode ser preparada pela adição de 1,6 ± 0,1 gramas de monoidrato de ácido cítrico e 10,9 ± 0,1 gramas de L-arginina a 200 mL de água de alta qualidade. Posteriormente, o pH pode ser ajustado para 6,0 ± 0,1 usando ácido hidroclórico e a mistura pode ser diluída para 250 mL usando água de alta qualidade. A formulação resultante pode compreender 30mM de citrato, 250mM de arginina, e um polipeptídeo bG-CSF ou variante do mesmo a um pH de 6,0.

[00045] As preparações aquosas de acordo com a invenção podem ser usadas para produzir liofilizados por liofilização convencional ou pós. As preparações de acordo com a invenção são obtidas novamente pela dissolução dos liofilizados em água ou outras soluções aquosas. O termo “liofilização,” também conhecido como secagem por congelamento, é uma técnica comumente empregada para apresentar proteínas que serve para remover água da preparação de proteína de interesse. A liofilização é um processo pelo qual o material a ser seco é primeiro congelada e, então, o solvente gelado ou congelado é removido por sublimação em um ambiente a vácuo. Um excipiente pode estar incluído em formulações pré-liofilizadas para melhorar a estabilidade durante o processo de secagem por congelamento e/ou para melhorar a estabilidade do produto liofilizado mediante armazenamento. Por exemplo, vide Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) e Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991).

[00046] A secagem por atomização de ingredientes farmacêuticos também é conhecida dos versados na técnica. Por exemplo, vide Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals," em Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992). Em adição aos fármacos de pequena molécula, uma variedade de materiais biológicos foram secos por atomização inclusive: enzimas, soro, plasma, micro-organismos e leveduras. A secagem por atomização é uma técnica útil porque ela pode converter uma preparação farmacêutica líquida em um pó fino, sem poeira ou aglomerado em um processo em uma etapa. A técnica básica compreende as quatro etapas a seguir: a) atomização da solução de alimentação em uma aspersão; b) contato com o ar de aspersão; c) secagem da aspersão; e d) separação do produto seco do ar de secagem. Por exemplo, as patentes US n°s 6.235.710 e 6.001.800 descrevem a preparação de eritropoietina recombinante por secagem por atomização.

[00047] Os métodos de uso de uma formulação contendo um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo também são abrangidos pela presente invenção. O bG-CSF tem uma variedade de atividades biológicas incluindo, mas não se limitando à ligação ao seu receptor, causando dimerização de seu receptor, estimulação da produção de neutrófilos, e estimulação da proliferação e diferenciação celular. Exemplos de algumas das atividades biológicas do fator estimulante de colônia de granulócitos e do bG-CSF são descritos acima e nas patentes US n°s 6.676.947; 6.579.525; 6.531.121; 6.521.245; 6.489.293; 6.368.854; 6.316.254; 6.268.336; 6.239.109; 6.165.283; 5.986.047; 5.830.851; 5.043.156; e 5.773.569. As formulações contendo o polipeptídeo b-GCSF ou uma variante do mesmo da invenção são úteis para o tratamento ou prevenção de uma ampla gama de distúrbios. "Prevenção" se refere à redução da probabilidade de que o receptor fique sujeito ou desenvolver qualquer uma das condições patológicas aqui descritas e inclui administração profilática. O termo "prevenção" se aplica particularmente a um paciente que é suscetível à condição patológica particular. "Tratamento" se refere a mediar uma doença ou condição e prevenir, reverter os efeitos clínicos da doença, ou mitigar sua progressão adicional ou atenuar os sintomas associados com a doença ou condição.

[00048] A administração de produtos de G-CSF resulta na formação de leucócitos. Desta forma, a administração de uma formulação contendo o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo da presente invenção pode ser útil para prevenir infecção em animais que tem risco para a infecção. Uma formulação contendo o polipeptídeo bG- CSF ou uma variante do mesmo da presente invenção pode ser administrada aos animais que têm uma infecção. As infecções que podem ser tratadas com uma formulação contendo o polipeptídeo bG- CSF ou uma variante do mesmo da invenção incluem, mas não se limitam a mastite e febre do transporte. Uma formulação contendo um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo da presente invenção poderia ser administrada a um animal, por exemplo, entre duas semanas e um dia antes do parto e, opcionalmente, uma administração adicional poderia ser dada no dia do parto ou até uma semana após o parto. Em algumas modalidades, o animal que é administrado com a formulação contendo um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo da presente invenção é uma vaca, e o parto é chamado de “parir o bezerro.” Em uma modalidade, uma formulação contendo o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo da presente invenção pode ser administrada a vacas periparturientes para a prevenção de mastite.

[00049] De acordo com a invenção, uma formulação contendo o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo pode ser administrada por uma via convencional adequada para proteínas ou peptídeos, incluindo, mas não se limitando a parenteralmente, por exemplo, injeções, que incluem , mas não se limitam a subcutaneamente ou intravenosamente ou qualquer outra forma de injeções ou infusões. As formulações contendo o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo podem ser administradas por inúmeras vias, incluindo, mas não se limitando a meios orais, intravenosos, intraperitoneais, intramusculares, transdérmicos, subcutâneos, tópicos, sublinguais, intravasculares, intramamários, ou retais. As formulações contendo o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo também podem ser administrados através de lipossomos. Tais vias de administração e as formulações adequadas são de conhecimento geral daqueles versados na técnica. As formulações contendo o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo, sozinhas ou em combinação com outros componentes adequados, também podem produzidas como formulações em aerossol (isto é, elas podem ser "nebulizadas") para serem administradas através de inalação. As formulações em aerossol podem ser colocadas em propelentes pressurizados aceitáveis, como, por exemplo, diclorodifluorometano, propano, nitrogênio, e similares.

[00050] As formulações contendo o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo adequadas para administração parenteral, como, por exemplo, pelas vias intra-articular (nas articulações), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, e subcutânea incluem soluções de injeção estéril isotônica aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizadores, e conservantes. As formulações contendo o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo podem ser apresentadas em recipientes lacrados de dose unitária ou de múltiplas doses, como ampolas e frascos. As formulações contendo o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo também podem ser apresentadas em seringas, como seringas preenchidas.

[00051] A administração parenteral e a administração intravenosa são métodos possíveis de administração das formulações da presente invenção. Em particular, as vias de administração já em uso para agentes terapêuticos homólogos de aminoácidos naturais (incluindo, mas não se limitando aos tipicamente usados para EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFNs, interleucinas, anticorpos, FGFs, e/ou qualquer outra proteína liberada farmaceuticamente), junto com formulações em uso atual, fornecem vias possíveis de administração e formulações contendo o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo da invenção.

[00052] Em algumas modalidades, as formulações da presente invenção contendo o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo são administradas em uma quantidade entre cerca de 0,5 e cerca de 12 gramas/litro. A dose administrada a um animal, no contexto da presente invenção, é suficiente para se ter uma resposta terapêutica benéfica no animal ao longo do tempo, ou outra atividade adequada, dependendo da aplicação. A dose é determinada pela eficácia do vetor particular ou da formulação e da atividade, estabilidade ou meia-vida sérica do polipeptídeo de aminoácido não natural empregado e da condição do animal, assim como do peso corporal ou área superficial do animal a ser tratado. O tamanho da dose também é determinado pela existência, natureza, e extensão de quaisquer efeitos colaterais adversos que acompanham a administração de um vetor específico, formulação, ou similares em um animal específico.

[00053] A dose administrada a um animal no contexto da presente invenção deve ser suficiente para causar uma resposta benéfica no indivíduo ao longo do tempo. Em geral, a quantidade farmaceuticamente eficaz total do polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo da presente invenção administrada parenteralmente por dose está na faixa de cerca de 0,01 μg/kg/dia a cerca de 100 μg/kg, ou cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 1 mg/kg, de peso corporal do animal, embora isto esteja sujeito ao critério terapêutico. Alternativamente, a quantidade farmaceuticamente eficaz do polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo da presente invenção administrada parenteralmente por dose é cerca de 1 mg a cerca de 25 mg, ou cerca de 5 mg a cerca de 20 mg. Por exemplo, a quantidade farmaceuticamente eficaz do polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo da presente invenção administrada parenteralmente por dose pode ser de cerca de 14 mg. A frequência da dosagem também está sujeita ao critério terapêutico.

[00054] A quantidade farmaceuticamente eficaz do polipeptídeo bG- CSF ou uma variante do mesmo pode ser administrada aos animais como uma dose única ou como parte de uma esquema de múltiplas doses. Por exemplo, o polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo pode ser administrado em um esquema de múltiplas doses, sendo que o esquema é um regime de pelo menos duas doses. Em uma modalidade, o esquema de múltiplas doses é um regime de duas doses.

[00055] Em uma modalidade, o esquema de múltiplas doses compreende uma primeira dose administrada a um animal cerca de 1 dia a cerca de 14 dias antes de o animal parir e a segunda dose é administrada ao animal cerca de 4 dias antes até cerca de 7 dias após o animal parir. Em outra modalidade, o esquema de múltiplas doses compreende uma primeira dose administrada a um animal cerca de 7 dias antes de o animal parir e a segunda dose é administrada ao animal no dia do parto.

[00056] As seguintes modalidades também são contempladas: 1. Formulação aquosa estável compreendendo um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo, uma substância tampão, e um excipiente, sendo que a dita formulação é substancialmente isenta de monolaurato de sorbitano polioxietileno (20). 2. Formulação de acordo com a cláusula 1, em que o polipeptídeo bG-CSF ou a variante do mesmo é ligado a um ligante, um polímero, ou uma molécula biologicamente ativa. 3. Formulação de acordo com a cláusula 1 ou 2, em que o polipeptídeo bG-CSF ou a variante do mesmo é ligado a um polímero solúvel em água. 4. Formulação e acordo com a cláusula 3, em que o polímero solúvel em água compreende uma porção de poli(etilenoglicol). 5. Formulação de acordo com a cláusula 3 ou 4, em que o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 100 kDa. 6. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 3 a 5, em que o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 50 kDa. 7. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 3 a 6, em que o polímero solúvel em água tem um peso molecular de cerca de 20 kDa. 8. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 7, em que o polipeptídeo bG-CSF ou a variante do mesmo é bG- CSF-T133pAF-20K PEG. 9. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 8, em que o polipeptídeo bG-CSF ou variante do mesmo está presente em uma quantidade entre cerca de 0,5 e cerca de 12 gramas/litro. 10. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 9, em que o polipeptídeo bG-CSF ou a variante do mesmo está presente em uma quantidade de cerca de 5 gramas/litro. 11. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 10, em que a substância tampão é citrato, histidina, maleato, succinato, fosfato, ou uma combinação dos mesmos. 12. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 11, em que a substância tampão é citrato ou succinato. 13. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 12, em que a substância tampão é citrato. 14. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 12, em que a substância tampão é succinato. 15. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 14, em que a substância tampão tem uma molaridade entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM. 16. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 15, em que a substância tampão tem uma molaridade de cerca de 30 mM. 17. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 16, em que o excipiente é cloreto de sódio, trealose, sorbitol, arginina, ou uma combinação dos mesmos. 18. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 17, em que o excipiente é arginina. 19. Formulação de acordo com a cláusula 18, em que a arginina tem uma molaridade entre cerca de 100 mM a cerca de 500 mM. 20. Formulação de acordo com a cláusula 18 ou 19, em que a arginina tem uma molaridade de cerca de 200 a cerca de 300 mM. 21. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 18 a 20, em que a arginina tem uma molaridade de cerca de 250 mM. 22. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 21, em que a formulação tem um pH entre cerca de 5,7 e cerca de 6,6. 23. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 22, em que a formulação tem um pH entre cerca de 6,0 e cerca de 6,3. 24. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 23, em que a formulação tem uma concentração média de agregados do polipeptídeo bG-CSF ou variante do mesmo menor que cerca de 2,1% p/p% após um período de incubação de cinco dias em condições de armazenamento sob estresse. 25. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 24, em que a formulação tem uma concentração média de agregados do polipeptídeo bG-CSF ou variante do mesmo menor que cerca de 1,5% p/p% após um período de incubação de um dia em condições de armazenamento aceleradas. 26. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 25, que inclui opcionalmente um ou mais outros ingredientes terapêuticos. 27. Liofilizado ou pó da formulação como definida em qualquer uma das cláusulas 1 a 26. 28. Solução aquosa produzida pela dissolução do liofilizado ou pó como definido na cláusula 27 em água. 29. Processo para preparar a formulação como definida em qualquer uma das cláusulas 1 a 26, compreendendo formar uma solução aquosa estável compreendendo polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo, uma substância tampão, e um excipiente, sendo que a dita formulação é substancialmente isenta de monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20). 30. Método de tratar um animal que tem um distúrbio modulado por bG-CSF, que compreende administrar ao dito animal uma quantidade terapeuticamente eficaz da formulação como definida em qualquer uma das cláusulas 1 a 26. 31. Método de acordo com a cláusula 30, em que o dito distúrbio é uma infecção. 32. Método de acordo com a cláusula 31, em que a dita infecção é mastite e em que o dito animal é uma vaca periparturiente. 33. Formulação aquosa estável que compreende um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo, um tampão de citrato ou succinato, arginina, e opcionalmente, um contraíon para arginina. 34. Formulação de acordo com a cláusula 33, em que a formulação é substancialmente isenta de um tensoativo de polissorbato. 35. Formulação de acordo com a cláusula 33 ou 34, em que o polipeptídeo bG-CSF ou a variante do mesmo é ligado a um ligante, um polímero, ou uma molécula biologicamente ativa. 36. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 33 a 35, em que o polipeptídeo bG-CSF ou a variante do mesmo é ligado a um polímero solúvel em água. 37. Formulação e acordo com a cláusula 36, em que o polímero solúvel em água compreende uma porção de poli(etilenoglicol). 38. Formulação de acordo com a cláusula 36 ou 37, em que o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 100 kDa. 39. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 36 a 38, em que o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 50 kDa. 40. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 36 a 39, em que o polímero solúvel em água tem um peso molecular de cerca de 20 kDa. 41. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 34 a 40, em que o dito tensoativo de polissorbato é um derivado de polioxietileno de monolaurato de sódio. 42. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 34 a 41, em que o dito tensoativo de polissorbato é monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20). 43. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 33 a 42, em que o polipeptídeo bG-CSF ou a variante do mesmo é bG- CSF-T133pAF-20K PEG. 44. Formulação de acordo com a cláusula 43, em que bG- CSF- T133pAF-20K PEG está presente em uma quantidade entre cerca de 0,5 e cerca de 12 gramas/litro, o tampão citrato tem uma molaridade de cerca de 30 mM, a arginina tem uma molaridade de cerca de 250 mM, e em que a formulação tem um valor de pH de cerca de 6,0. 45. Formulação de acordo com a cláusula 43 ou 44, em que a formulação tem uma concentração média de agregados de bG- CSF-T133pAF-20K PEG menor que cerca de 1,6% p/p% após um período de incubação de 28 dias a 25°C. 46. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 43 a 45, em que a formulação tem uma concentração média de agregados de bG-CSF-T133pAF-20K PEG menor que cerca de 2,8% p/p% após um período de incubação de 3 dias a 40°C. 47. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 43 a 46, em que a formulação tem uma concentração média de agregados de bG-CSF-T133pAF-20K PEG de cerca de 1,6% p/p% ou menos após um estudo de agitação forçada. 48. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 43 a 47, em que a formulação tem uma concentração média de agregados de bG-CSF-T133pAF-20K PEG menor que cerca de 1,6% p/p% após cinco ciclos de congelamento-descongelamento. 49. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 33 a 48, em que o contraíon para arginina é cloreto ou sulfato. 50. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 33 a 49, que inclui, opcionalmente, um ou mais outros ingredientes terapêuticos. 51. Liofilizado ou pó da formulação como definida em qualquer uma das cláusulas 33 a 50. 52. Solução aquosa produzida pela dissolução do liofilizado ou pó como definido na cláusula 51 em água. 53. Processo para preparar a formulação como definida em qualquer uma das cláusulas 33 a 50, que compreende formar uma solução aquosa estável compreendendo um polipeptídeo bG-CSF ou variante do mesmo, um tampão citrato, arginina, e opcionalmente, um contraíon para a arginina. 54. Processo de acordo com a cláusula 53, em que a formulação é substancialmente isenta de um tensoativo de polissorbato. 55. Processo de acordo com a cláusula 53 ou 54, em que o polipeptídeo bG-CSF ou variante do mesmo é bG-CSF-T133pAF-20K PEG. 56. Método de tratar um animal que tem um distúrbio modulado por bG-CSF, que compreende administrar ao dito animal uma quantidade terapeuticamente eficaz da formulação como definida em qualquer uma das cláusulas 33 a 50. 57. Método de acordo com a cláusula 56, em que o dito distúrbio é uma infecção. 58. Método de acordo com a cláusula 57, em que a dita infecção é mastite e em que o dito animal é uma vaca periparturiente. 59. Formulação aquosa estável que consiste essencialmente em um polipeptídeo bG-CSF ou uma variante do mesmo, um tampão de citrato ou succinato, arginina, e opcionalmente, um contraíon para arginina. 60. Formulação de acordo com a cláusula 59, em que a formulação é substancialmente isenta de um tensoativo de polissorbato. 61. Formulação de acordo com a cláusula 59 ou 60, em que o polipeptídeo bG-CSF ou a variante do mesmo é ligado a um ligante, um polímero, ou uma molécula biologicamente ativa. 62. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 59 a 61, em que o polipeptídeo bG-CSF ou a variante do mesmo é ligado a um polímero solúvel em água. 63. Formulação e acordo com a cláusula 62, em que o polímero solúvel em água compreende uma porção de poli(etilenoglicol). 64. Formulação de acordo com a cláusula 62 ou 63, em que o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 100 kDa. 65. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 62 a 64, em que o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 50 kDa. 66. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 62 a 65, em que o polímero solúvel em água tem um peso molecular de cerca de 20 kDa. 67. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 60 a 66, em que o dito tensoativo é um tensoativo de polissorbato. 68. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 60 a 67, em que o dito tensoativo é um derivado de polioxietileno de monolaurato de sódio. 69. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 60 a 68, em que o dito tensoativo é monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20). 70. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 59 a 69, em que o polipeptídeo bG-CSF ou a variante do mesmo é bG- CSF-T133pAF-20K PEG. 71. Formulação de acordo com a cláusula 70, em que bG- CSF- T133pAF-20K PEG está presente em uma quantidade entre cerca de 0,5 e cerca de 12 gramas/litro, o tampão citrato tem uma molaridade de cerca de 30 mM, a arginina tem uma molaridade de cerca de 250 mM, e em que a formulação tem um valor de pH de cerca de 6,0. 72. Formulação de acordo com a cláusula 70 ou 71, em que a formulação tem uma concentração média de agregados de bG- CSF-T133pAF-20K PEG menor que cerca de 1,6% p/p% após um período de incubação de 28 dias a 25°C. 73. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 70 a 72, em que a formulação tem uma concentração média de agregados de bG-CSF-T133pAF-20K PEG menor que cerca de 2,8% p/p% após um período de incubação de 3 dias a 40°C. 74. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 70 a 73, em que a formulação tem uma concentração média de agregados de bG-CSF-T133pAF-20K PEG de cerca de 1,6% p/p% ou menos após um estudo de agitação forçada. 75. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 70 a 74, em que a formulação tem uma concentração média de agregados de bG-CSF-T133pAF-20K PEG menor que cerca de 1,6% p/p% após cinco ciclos de congelamento-descongelamento. 76. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 59 a 75, em que o contraíon para arginina é cloreto ou sulfato. 77. Formulação de acordo com qualquer uma das cláusulas 59 a 76, que inclui opcionalmente um ou mais outros ingredientes terapêuticos. 78. Liofilizado ou pó da formulação como definida em qualquer uma das cláusulas 59 a 77. 79. Solução aquosa produzida pela dissolução do liofilizado ou pó como definido na cláusula 78 em água. 80. Processo para preparar a formulação como definida em qualquer uma das cláusulas 59 a 77, que compreende formar uma solução aquosa estável consistindo essencialmente em um polipeptídeo bG-CSF ou variante do mesmo, um tampão citrato, arginina, e opcionalmente, um contraíon para a arginina. 81. Processo de acordo com a cláusula 80, em que a formulação é substancialmente isenta de um tensoativo. 82. Processo de acordo com a cláusula 80 ou 81, em que o polipeptídeo bG-CSF ou variante do mesmo é bG-CSF-T133pAF-20K PEG. 83. Método de tratar um animal que tem um distúrbio modulado por bG-CSF, que compreende administrar ao dito animal uma quantidade terapeuticamente eficaz da formulação como definida em qualquer uma das cláusulas 59 a 77. 84. Método de acordo com a cláusula 83, em que o dito distúrbio é uma infecção. 85. Método de acordo com a cláusula 84, em que a dita infecção é mastite e em que o dito animal é uma vaca periparturiente. 86. Formulação aquosa estável que consiste essencialmente em bG-CSF-T133pAF-20K PEG, um tampão citrato, sendo que o tampão citrato tem uma molaridade de cerca de 30 mM, arginina, sendo que a arginina tem uma molaridade de cerca de 250 mM, e, opcionalmente, um contraíon para a arginina.

EXEMPLO 1 Estudo de triagem de tampão e de excipiente

[00057] Formulações de bGCSF-T133-20K PEG sem monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20) no componente de fundo podem ser submetidas a uma triagem para avaliar a estabilidade do produto usando múltiplos tampões e excipientes (cloreto de sódio, trealose, e arginina). O pH alvo para todos os tampões de diálise é pH 6,0. Para comparação, uma formulação contendo 10 mM de fosfato, 180 mM de manitol, e 60 mM de trealose em pH 6,0 pode ser preparada. As formulações podem ser avaliadas quanto aos efeitos sobre a agregação de proteínas e despeguilação na presença e na ausência de oxigênio.

[00058] As amostras podem ser preparadas por dialisar 1 mL de bGCSF-T133-20K PEG a 2 a 8°C em cada formulação. A concentração de proteínas das amostras dialisadas pode ser determinada antes da normalização da concentração de proteínas para 5 mg/mL. Após a diálise e normalização da concentração, aproximadamente 3 x 1 mL do grupo pós-dialisado e do grupo diluído podem ser colocados para preencher frascos de vidro de 5mL. Um conjunto de amostras pode ser testado para fornecer as condições iniciais. Um segundo conjunto pode ser armazenado a 25°C/60% de umidade relativa durante 5 dias antes do teste. O terceiro conjunto de amostras pode ser desgaseificado na câmara de liofilização, fechado sob uma atmosfera inerte (nitrogênio), e, então, armazenado a 25°C/60% de umidade relativa durante 5 dias antes do teste. Se o nível de agregado, conforme medido por SEC, após 5 dias for < 2,0%, tanto as amostras desgaseificadas quanto as não desgaseificadas podem ser incubadas a 40°C durante um dia.

[00059] Após cinco dias de incubação, a concentração de proteínas de cada amostra pode ser medida. A tabela 1 mostra as concentrações de proteína. Tabela 1. Concentrações de proteína do estudo de triagem de tampão e de excipiente

[00060] A tabela 2 mostra os resu tados de p H para cada amostra. Tabela 2. Resultados de pH do estudo de triagem de tampão e de excipiente

[00061] Os níveis de agregação de proteínas e de despeguilação em cada formulação podem ser analisados por SEC. A tabela 3 mostra os resultados de SEC e indica que os níveis de agregação e despeguilação foram similares em todas as amostras. Tabela 3. Resultados de SEC do estudo de triagem de tampão e de excipiente (após incubações de 5 dias)

[00062] A tabela 4 mostra os resu incubadas a 40°C durante um dia. A c tados de S omparação EC para amostras da composição de agregado indica que as formulações contendo arginina tinham a menor agregação de produto. Além disso, a formulação de referência, fosfato 10 mM, manitol 180 mM, e trealose 60 mM, em pH 6, tem o nível mais elevado de agregação em comparação com todas as outras formulações no estudo de triagem. Tabela 4. Resultados de SEC do estudo de triagem de tampão e excipiente (após incubação de 1 dia)

[00063] Os resultados deste estudo de triagem indicam que todas as formulações com succinato, histidina, maleato, e citrato sem monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20) possuem um aumento desprezível nos agregados (menos de 1% por SEC) após uma incubação de cinco dias a 25°C. Adicionalmente, não existe diferença na estabilidade da proteína entre as amostras desgaseificadas e não desgaseificadas. Além disso, os resultados de SEC das amostras submetidas a estresse a 40°C durante um dia mostram que formulações contendo 0,1 M de arginina têm menos agregação em comparação às formulações contendo excipientes de cloreto de sódio e trealose.

EXEMPLO 2 Efeito do monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20) sobre as formulações de bG-CSF

[00064] O efeito do monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20) sobre a agregação pode ser avaliado para determinar o impacto sobre formulações futuras para estudos de agitação. As amostras podem ser preparadas por dialisar 4mL de bGCSF-T133-20K PEG a 2 a 8°C em fosfato 10mM e NaCl 150 mM a pH 6,0. Após a diálise, ao grupo dialisado pode-se adicionar uma solução de estoque de monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20) a 1% e, então, este grupo pode ser diluído com fosfato 10mM e NaCl 150 mM a pH 6,0 até uma concentração de proteínas final de 5 mg/mL. As amostras de cada formulação podem ser divididas em 2 x 1 mL alíquotas preenchidas em frascos de vidro de 1 mL para formar dois conjuntos de amostras. Um conjunto pode ser armazenado a 2 a 8°C e testado nas condições iniciais; um segundo conjunto pode ser armazenado a 40°C por um dia.

[00065] A tabela 5 mostra os dados de integração de SEC e indica que o nível de agregação aumenta com o aumento da concentração de monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20). A análise de SEC das amostras indica que a agregação de bGCSF-T133-20K PEG aumenta com a concentração de monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20). Como resultado, o monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20) pode ser excluído da formulação futura que testa o bGCSF-T133-20K PEG. Tabela 5. Resultados de SEC do estudo de monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20) (após 1 dia de incubação)

EXEMPLO 3 Desenho experimental de superfície de resposta de Box-Behnken (DOE n° 1)

[00066] O efeito de várias concentrações de arginina junto com outros parâmetros chave históricos da formulação pode ser testado para avaliar os efeitos principais assim como suas interações. O desenho experimental pode ser uma superfície de resposta de Box-Behnken onde cada fator numérico é alterado no nível baixo, intermediário e alto. Além disso, o tipo de tampão pode ser um fator categórico. A combinação de parâmetros pode ser duplicada para citrato e succinato, cada um com três pontos centrais. O pH pode ser ajustado a 6,0 para todas as condições. Uma condição de controle que compreende fosfato 10mM, NaCl 150mM, e monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20) a 0,0033% a pH 6 pode ser incluída para comparação com resultados históricos.

[00067] Todos os tampões de diálise podem ser preparados a pH 6,0 ± 0,1. O PEG-bGCSF pode ser dialisado em 18 condições de tampão que representam todas as condições de tampão do estudo DOE n° 1. A recuperação de proteínas através da etapa de diálise pode ser geralmente de >78% e, desta forma, é consistente dentro do conjunto de amostras de diálise. Após a diálise, a concentração de proteínas do conjunto dialisado pode ser ajustada com o tampão de diálise para o valor alvo mostrado no design experimental de superfície de resposta de Box-Behnken. Isto poderia resultar em 24 combinações de formulação mais três pontos centrais no citrato e três pontos centrais no succinato. Cada formulação pode ser dividida em 3 x 1 mL alíquotas preenchidas em frascos de vidro de 1 mL para formar três conjuntos de amostras: um conjunto pode ser testado como condições iniciais e, então, armazenado a 2 a 8°C, um segundo pode ser armazenado a 25°C durante duas semanas, e o terceiro conjunto pode ser armazenado a 40°C por um dia.

[00068] As alterações na concentração do produto podem ser analisadas para avaliar a estabilidade do produto. A tabela 6 mostra a concentração do produto das amostras antes e depois da incubação. As amostras com citrato a 10mM, arginina a 300mM (8mg/mL) e succinato a 10mM, arginina a 300mM (8mg/mL) têm o maior aumento (0,5 a 0,6mg/mL) enquanto a diferença é menor para todas as outras amostras. Tabela 6. Sumário da concentração de proteína do estudo DOE n° 1 (inicial e 1 dia a 40°C)

[00069] As alterações no pH podem ser analisadas para avaliar a estabilidade do pH das amostras. O pH de todas as amostras pode estar dentro faixa de 6,0 a 6,3. A tabela 7 mostra os valores de pH e a diferença do tempo zero. O pH da amostra é estável por toda a duração do estudo DOE n° 1.

Tabela 7. Sumário do pH do estudo DOE n° 1 (inicial e 1 dia a 40°C)

[00070] As alterações no agregado de S EC, no monômero e nos níveis de despeguilação podem ser analisadas para avaliar a estabilidade da proteína. As tabelas 8, 9 e 10 mostram as composições de agregação, monômero, e despeguilação em cada composição de amostra, respectivamente. Tabela 8. Resultados de agregados de SEC do estudo DOE n° 1

[00071] Os resultados de SEC indicam que o nível de agregados nas amostras de citrato é relativamente inalterado. As amostras de succinato também têm baixos níveis de agregados exceto para amostras com arginina 100mM, sugerindo que os tampões à base de succinato exigiriam mais de 100mM de arginina para manter a baixa agregação de proteínas. A condição de controle (fosfato 10mM, NaCl 150mM, e 0,0033% (p/v) de monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20) em pH 6 e a 5mg/mL) tem 3,7% de agregados após um dia de incubação a 40°C (vide Tabela 8).

[00072] A despeguilação é outra via de degradação de proteínas. A tabela 10 mostra os resultados de SEC para o produto despeguilado e indica que o nível de despeguilação nas amostras de succinato é mais alto (0,4% a 0,8%) que o das amostras de citrato (<0,3%). O nível de despeguilação no controle de fosfato é mais alto que todas as amostras da formulação de citrato e é ligeiramente maior que a maioria das formulações de succinato.

[00073] Uma vez que os resultados de SEC para as amostras de citrato incubadas a 40°C por um dia têm o mínimo de agregados, um subconjunto das amostras de DOE n° 1 pode ser incubado a 25°C durante 28 dias. As seguintes condições de amostra podem ser analisadas por SEC: 1. citrato 30mM, arginina 100mM a 2mg/mL 2. citrato 30mM, arginina 500mM a 2mg/mL 3. citrato 30mM, arginina 100mM a 8mg/mL 4. citrato 30mM, arginina 500mM a 8mg/mL 5. citrato 30mM, arginina 300mM a 5mg/mL

[00074] A tabela 11 mostra os resultados de SEC do experimento de 28 dias. Além disso, uma análise por RP-HPLC pode ser feita nas amostras incubadas a 28 dias para assegurar falta de degradação do produto. A tabela 12 mostra estes resultados. Tabela 11. Resultados de SEC do estudo DOE n° 1 incubado por 28 dias a 25°C

Tabela 12. Resultados de RP-HPLC do estudo DOE n° 1 incubado por 28 dias a 25°C

EXEMPLO 4 Avaliação da compatibilidade do contraíon e da seringa

[00075] Uma comparação entre o cloreto e o sulfato como contraíons para a arginina pode ser avaliada. A condição das amostras pode ser de 30mM de citrato e 300mM de arginina a 5mg/mL (pH 6). Além disso, a compatibilidade do produto em uma seringa de polipropileno MONOJECT de 3mL para conter o produto farmacêutico pode ser avaliada em comparação a frascos de vidro de 1 mL. O tampão de citrato 30mM, arginina 300mM, pH 6 (cloreto) pode ser preparado usando citrato de sódio e arginina-HCI, e a solução pode ser titulada com HCI 6N. O tampão de citrato 30mM, arginina 300mM, pH 6 (sulfato) pode ser preparado usando monoidrato de ácido cítrico, citrato de sódio, e base de arginina, e a solução pode ser titulada com ácido sulfúrico concentrado. bGCSFT133-20K PEG pode ser dialisado nos dois tampões. As amostras podem ser analisadas por SEC no tempo zero. Um conjunto de amostras pode ser colocado em um frasco de liofilização de vidro de 1 mL e um segundo em seringas de 3mL antes da incubação a 40°C por até 3 dias.

[00076] A tabela 13 mostra os resultados de SEC. Os resultados de SEC indicam que a formação de agregados é de duas a três vezes maior em amostras armazenadas em seringas do que em frascos de vidro. A despeguilação do produto permanece igual a das amostras do tempo zero. Para ambos os contraíons, as amostras em frascos de vidro possuem alteração mínima nos agregados após 3 dias a 40°C. Cloreto poderia ser usado no lugar de sulfato como um contraíon sem impacto sobre a formação de agregados. Tabela 13. Resultados de SEC da avaliação da compatibilidade do contraíon e da seringa

Exemplo 5 Fatorial completo de 2 níveis e três parâmetros (DOE n° 2)

[00077] Um segundo estudo DOE pode ser feito para avaliar o efeito do pH, da concentração de arginina e da concentração de proteínas no tampão citrato. A tabela 14 mostra as condições de formulação usadas em DOE n° 2. Tabela 14. Condições de formulação usadas para o estudo DOE n° 2

[00078] bGCSF-T133-20K PEG pode ser dialisado em 5 condições de tampão. As amostras 1 e 2 podem ser dialisadas em um tampão contendo citrato 30mM e arginina 200mM a pH 5,0. As amostras 3 e 4 podem ser dialisadas em um tampão contendo citrato 30mM e arginina 200mM a pH 5,0. As amostras 5 e 6 podem ser dialisadas em um tampão contendo citrato 30mM e arginina 250mM a pH 6,0. As amostras 7 e 8 podem ser dialisadas em um tampão contendo citrato 30mM e arginina 300mM a pH 6,0. As amostras 9 e 10 podem ser dialisadas em um tampão contendo citrato 30mM e arginina 300mM a pH 5,5. Cada amostra pós-dialisada pode ser ajustada para a concentração alvo final do produto e, então, dividida em 2 x 1 mL alíquotas em frascos de liofilização de vidro para formar dois conjuntos de amostras: um conjunto pode ser armazenado a 2 a 8°C como controles e um segundo conjunto pode ser armazenado a 40°C durante três dias.

[00079] A tabela 15 mostra os resultados de SEC. A alteração nos agregados está entre -0,1% e 2,1%. Agregados mais elevados se correlacionam fortemente com uma maior concentração do produto. A despeguilação delta está entre 0,1% e 0,8%. Uma despeguilação ligeiramente maior se correlaciona com uma concentração do produto mais baixa em baixo pH. Conforme o pH diminui, a despeguilação aumenta, e esta tendência está em consonância com observações históricas nos estudos pré-formulação. Tabela 15. Sumário dos resultados de SEC para o estudo DOE n°2

EXEMPLO 6 Estudo de agitação

[00080] Um estudo de agitação forçada pode ser feito para avaliar a estabilidade da proteína nas formulações. As amostras podem ser preparadas por dialisar bGCSF-T133-20K PEG (16,6 mg/mL de proteína em acetato de sódio 10 mM, 5% de sorbitol pH 4,0) contra citrato 30 mM e arginina 250 mM a pH 6,0. Uma porção do material dialisado pode ser diluída até uma concentração de alvo de 5 mg/mL usando tampão citrato 30mM e arginina 250mM a pH 6,0. O grupo pode então ser filtrado através de um filtro de 0,22 mícron e, então, ser submetido à agitação forçada em um béquer de vidro por mistura a 60 rpm usando um agitador magnético durante duas horas à temperatura ambiente. As amostras podem ser tomadas a cada 30 minutos.

[00081] Todas as amostras são transparentes, incolores, e livres de particulados visíveis para todos os pontos de tempo. A concentração de proteína, a absorbância a 550 nm, e a medição de pH para cada ponto de tempo são mostradas na tabela 16. Tabela 16. Sumário da concentração de proteína, A550, e resultados de pH do estudo de agitação (mistura)

[00082] A concentração de proteína permanece estável ao longo de toda a duração da mistura. O pH permanece consistente ao longo do experimento. A composição do produto por SEC também é consistente ao longo do estudo, conforme mostrado na tabela 17. No todo, os resultados deste estudo indicam que a proteína é estável por toda a duração da agitação forçada. Tabela 17. Sumário dos resultados de SEC do estudo de agitação (mistura)

EXEMPLO 7 Estudo de congelamento e descongelamento

[00083] Um estudo de congelamento e descongelamento pode ser feito para determinar a concentração de proteína e o pH de várias amostras. A proteína nas amostras pode ser submetida a até cinco ciclos de congelamento e descongelamento. As amostras podem ser filtradas através de filtros de 0,22 mícron e dispensadas em frascos de 15mL. Uma alíquota pode ser separada como o controle. Para as três alíquotas remanescentes, cada ciclo de congelamento e descongelamento poderia consistir em congelar a solução de proteína durante uma hora a -75±5°C e descongelar à temperatura ambiente durante aproximadamente uma hora até o gelo não ser mais observado. O frasco de amostra pode ser agitado suavemente três vezes para misturar a amostra. Uma alíquota pode ser separada após o primeiro, o segundo, e o quinto ciclos de congelamento-descongelamento para o teste.

[00084] Todas as amostras são transparentes, incolores, e livres de particulados visíveis para todos os pontos de tempo. A concentração de proteína, a absorbância a 550 nm, e a medição de pH para cada ponto de tempo são mostradas na tabela 18. Tabela 18. Sumário da concentração de proteína, A550, e resultados de pH do estudo de congelamento e descongelamento.

[00085] A concentração de proteína permanece estável após cada ciclo de congelamento e descongelamento. Além disso, o pH permanece consistente ao longo dos cinco ciclos de congelamento- descongelamento. A composição do produto por SEC é similar em todos os pontos de tempo e é mostrada na tabela 19. Tabela 19. Sumário dos resultados de SEC do estudo de congelamento e descongelamento

Claims (6)

1. Formulação aquosa estável, caracterizada pelo fato de que compreende: bG-CSF-T133pAF-20K PEG, um tampão citrato ou succinato, arginina, e opcionalmente, um contraíon para arginina, e sendo que a referida formulação contém menos de 0,033% de um tensoativo de polissorbato.

2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: bG-CSF- T133pAF-20K PEG está presente em uma quantidade entre 0,5 e 12 gramas/litro, o tampão é citrato e tem uma molaridade de 30 mM, a arginina tem uma molaridade de 250 mM, e sendo que a formulação tem um valor de pH de cerca de 6,0.

3. Formulação aquosa estável, caracterizada pelo fato de que consiste essencialmente em: bG-CSF-T133pAF-20K PEG, um tampão citrato ou succinato, arginina, e opcionalmente, um contraíon para arginina.

4. Formulação, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que: bG-CSF- T133pAF-20K PEG está presente em uma quantidade entre 0,5 e 12 gramas/litro, o tampão é citrato e tem uma molaridade de 30 mM, a arginina tem uma molaridade de 250 mM, e sendo que a formulação tem um valor de pH de cerca de 6,0.

5. Formulação aquosa estável, caracterizada pelo fato de que consiste essencialmente em: bG-CSF-T133pAF-20K PEG, um tampão citrato, sendo que o tampão citrato tem uma molaridade de cerca de 30mM, arginina, sendo que a arginina tem uma molaridade de cerca de 250mM e, opcionalmente um contraíon para arginina.

6. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de mastite em uma vaca periparto.