JP2795850B2 - 酵母発現ベクター - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は一般に酵母宿主細胞での蛋白質の増強され
た生産のための方法に関し、そしてさらに詳しくはα−
１−アンチトリプシン及び他の蛋白質の増強された生産
のための改良された方法に関する。
た生産のための方法に関し、そしてさらに詳しくはα−
１−アンチトリプシン及び他の蛋白質の増強された生産
のための改良された方法に関する。
遺伝子工学の分野における今日の方法は酵母における
外来遺伝子の発現を促進した。酵母における真核性（例
えば哺乳類性）遺伝子生成物の製造は哺乳類又は細菌細
胞培養を用いる製造を越える利点を有する。異種性蛋白
質の生産のため宿主として細菌を使用する場合の主たる
欠点の１つは、生成物を医薬として使用することができ
る前に完全に単離されなければならないエンドトキシン
を生産することである。細菌中で生産された異種性蛋白
質は低い溶解性を有することが示され、この問題は克服
されなければ医薬としてのそれらの使用を深刻に限定す
る。さらに、商業的レベルで蛋白質生成物を発現するた
めの哺乳類細胞の使用は非常に高価である。これに対し
て、酵母の商業的規模での発酵はよく確立されており、
多量の異種性蛋白質生成物の製造を可能にする。
外来遺伝子の発現を促進した。酵母における真核性（例
えば哺乳類性）遺伝子生成物の製造は哺乳類又は細菌細
胞培養を用いる製造を越える利点を有する。異種性蛋白
質の生産のため宿主として細菌を使用する場合の主たる
欠点の１つは、生成物を医薬として使用することができ
る前に完全に単離されなければならないエンドトキシン
を生産することである。細菌中で生産された異種性蛋白
質は低い溶解性を有することが示され、この問題は克服
されなければ医薬としてのそれらの使用を深刻に限定す
る。さらに、商業的レベルで蛋白質生成物を発現するた
めの哺乳類細胞の使用は非常に高価である。これに対し
て、酵母の商業的規模での発酵はよく確立されており、
多量の異種性蛋白質生成物の製造を可能にする。
ヒトの体液由来の生成物の使用並びにその様な蛋白質
の精製に伴う困難及び出費についての最近の懸念が、酵
母における組換蛋白質の生産についての関心を提供し
た。酵母中で発現された蛋白質の例としてα−１−アン
チトリプシン（AAT）（Kawasaki、米国特許No.4,599,31
1;及びKawasaki等、米国特許No.4,711,848）が挙げられ
る。
の精製に伴う困難及び出費についての最近の懸念が、酵
母における組換蛋白質の生産についての関心を提供し
た。酵母中で発現された蛋白質の例としてα−１−アン
チトリプシン（AAT）（Kawasaki、米国特許No.4,599,31
1;及びKawasaki等、米国特許No.4,711,848）が挙げられ
る。
α−１−プロテアーゼ阻害物質としても知られるプロ
テアーゼ阻害剤AATは、セリンプロテアーゼのごとき蛋
白質分解酵素の阻害剤として作用する哺乳数血液の成分
である。哺乳類において、α−１−アンチトリプシンの
主要な生理的機能は、構造蛋白質を加水分解する有力な
プロテアーゼであるエラスターゼの阻害である。エラス
ターゼは、肺中の吸入された粒状物の分解を補助するた
めに作用する。α−１−アンチトリプシンにより発揮さ
れる阻害活性は、エラスターゼによる、及び炎症応答の
間に放出される他の蛋白質分解酵素による攻撃から体組
織を保護する防御的、自己調節的機構であると仮定され
る。
テアーゼ阻害剤AATは、セリンプロテアーゼのごとき蛋
白質分解酵素の阻害剤として作用する哺乳数血液の成分
である。哺乳類において、α−１−アンチトリプシンの
主要な生理的機能は、構造蛋白質を加水分解する有力な
プロテアーゼであるエラスターゼの阻害である。エラス
ターゼは、肺中の吸入された粒状物の分解を補助するた
めに作用する。α−１−アンチトリプシンにより発揮さ
れる阻害活性は、エラスターゼによる、及び炎症応答の
間に放出される他の蛋白質分解酵素による攻撃から体組
織を保護する防御的、自己調節的機構であると仮定され
る。
α−１−アンチトリプシンのレベルの低下をもたらす
遺伝的欠陥がヒトにおいて同定されている。Ｚ及びＳと
称される遺伝的変形体は、これらの対立遺伝子の組合せ
（例えば、SS,SZ）を担持する個体におけるα−１−ア
ンチトリプシンのレベルの低下をもたらす変異体対立遺
伝子である。これらの遺伝的欠陥は退化的な（degenera
tive）肺疾患、及び幾つかのケースにおいては肝疾患を
伴うであろう。変異対立遺伝子に関連するα−１−アン
チトリプシン活性の低いレベルは、タバコの煙を包含す
る環境汚染によるα−１−アンチトリプシンの不活性化
酸化によりさらに低下するであろう。さらに、正常対立
遺伝子についてホモ接合的である喫煙者における気腫は
正常α−１−アンチトリプシンの喫煙により誘導された
酸化の結果である。
遺伝的欠陥がヒトにおいて同定されている。Ｚ及びＳと
称される遺伝的変形体は、これらの対立遺伝子の組合せ
（例えば、SS,SZ）を担持する個体におけるα−１−ア
ンチトリプシンのレベルの低下をもたらす変異体対立遺
伝子である。これらの遺伝的欠陥は退化的な（degenera
tive）肺疾患、及び幾つかのケースにおいては肝疾患を
伴うであろう。変異対立遺伝子に関連するα−１−アン
チトリプシン活性の低いレベルは、タバコの煙を包含す
る環境汚染によるα−１−アンチトリプシンの不活性化
酸化によりさらに低下するであろう。さらに、正常対立
遺伝子についてホモ接合的である喫煙者における気腫は
正常α−１−アンチトリプシンの喫煙により誘導された
酸化の結果である。
α−１−アンチトリプシン欠陥を有する患者の治療の
ために置換療法（replacement therapy）が好結果に用
いられた（Gadek等、J.Clin.Invest. 68:1158-1165,19
81）。肝炎ウイルスを含有しないプールされたヒトの供
血者の血漿から濃縮された、投与されたα−１−アンチ
トリプシンは空胞構造内に抗−エラスターゼ活性を確立
し、そして不都合な副作用を生じさせない。
ために置換療法（replacement therapy）が好結果に用
いられた（Gadek等、J.Clin.Invest. 68:1158-1165,19
81）。肝炎ウイルスを含有しないプールされたヒトの供
血者の血漿から濃縮された、投与されたα−１−アンチ
トリプシンは空胞構造内に抗−エラスターゼ活性を確立
し、そして不都合な副作用を生じさせない。
酵母におけるα−１−アンチトリプシン及び他の異種
性蛋白質の発現は一般に全蛋白質に対して約１％〜５％
の発現レベルをもたらす。これに対して、多コピープラ
スミド上に存在する遺伝子によりコードされる酵母蛋白
質は、発現された全蛋白質の50％〜80％と高いレベルで
生産される（Mellor等、Gene 33:215-226,1985）。従
って、酵母における異種性DNA配列の発現レベルは、少
なくとも部分的には異種配列それ自体の性質により、及
びコードされた蛋白質のターンオーバー速度により制御
される（Mellor等、前掲）。Mellor等は、外来蛋白質が
酵母中で不安定であること、及び異種mRNAの定常状態レ
ベルが比較的低いことを示唆した。他方、Kramer等(Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 81:367-370）、及びKniskern等
（Gene 46:135-141,1986）は、異種性mRNAの定常状態
レベルは発現される異種性蛋白質の量に対して高く、そ
してＢ型肝炎コアー抗原の場合、異種性蛋白質は酵母蛋
白質よりも安定であることを示した。
性蛋白質の発現は一般に全蛋白質に対して約１％〜５％
の発現レベルをもたらす。これに対して、多コピープラ
スミド上に存在する遺伝子によりコードされる酵母蛋白
質は、発現された全蛋白質の50％〜80％と高いレベルで
生産される（Mellor等、Gene 33:215-226,1985）。従
って、酵母における異種性DNA配列の発現レベルは、少
なくとも部分的には異種配列それ自体の性質により、及
びコードされた蛋白質のターンオーバー速度により制御
される（Mellor等、前掲）。Mellor等は、外来蛋白質が
酵母中で不安定であること、及び異種mRNAの定常状態レ
ベルが比較的低いことを示唆した。他方、Kramer等(Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 81:367-370）、及びKniskern等
（Gene 46:135-141,1986）は、異種性mRNAの定常状態
レベルは発現される異種性蛋白質の量に対して高く、そ
してＢ型肝炎コアー抗原の場合、異種性蛋白質は酵母蛋
白質よりも安定であることを示した。
他の因子も異種性遺伝子の酵母での発現レベルに影響
するであろうが、しかしこれらの因子の操作は一般に異
種性蛋白質の発現レベルを全蛋白質発現量の約５％より
高く増加していない。これらの因子が最適化される場合
でさえ、外来遺伝子の発現レベルはクローン化酵母遺伝
子により得られるレベルに達しない。
するであろうが、しかしこれらの因子の操作は一般に異
種性蛋白質の発現レベルを全蛋白質発現量の約５％より
高く増加していない。これらの因子が最適化される場合
でさえ、外来遺伝子の発現レベルはクローン化酵母遺伝
子により得られるレベルに達しない。
酵母における外来遺伝子の低い発現レベルの幾つかの
例が文献中に存在する。例えばα−イーターフェロンは
種々のプロモーターを用いる多くの研究者により酵母に
おいて発現された。Mellor等（前掲）、Tuite等(EMBO
J.1:603-608,1982）、及びHitzeman等(Science 219:62
0-625,1983）は酵母ホスホグリセレートキナーゼ（PGK
1）遺伝子プロモーターを用いてα−インターフェロン
を全細胞蛋白質の１〜３％のレベルで生産せしめた。各
場合において、PGK-1プロモーター−α−インターフェ
ロン発現ユニットが酵母２μプラスミド由来のベクター
中で使用された。酵母ADH1遺伝子からの構成的プロモー
ターがHitzeman等により（Nature 293:717-722,1981）
酵母ベクターYRp7においてα−インターフェロンを発現
せしめるために使用された。これらの構成物は全細胞蛋
白質の0.4％でα−インターフェロンを生成した。Bitte
r及びEgan（Gene 32:263-274,1983）は、酵母２μプラ
スミド由来のベクター中でα−インターフェロンを発現
せしめるためにグリセルアルデヒド−３−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ（GAP491，GPDとしても知られる）遺
伝子プロモーターを使用した。これらの生成物は全細胞
蛋白質の約１％でα−インターフェロンをもたらした。
Kramer等（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:367-370,198
4）は、酵母２μプラスミド由来のベクター上でα−イ
ンターフェロンを発現せしめるために酵母抑制酸性ホス
ファターゼ（PH05）遺伝子プロモーターを使用した。誘
導の後、この構成物は全細胞蛋白質の0.2％のレベルで
α−インターフェロンをもたらした。
例が文献中に存在する。例えばα−イーターフェロンは
種々のプロモーターを用いる多くの研究者により酵母に
おいて発現された。Mellor等（前掲）、Tuite等(EMBO
J.1:603-608,1982）、及びHitzeman等(Science 219:62
0-625,1983）は酵母ホスホグリセレートキナーゼ（PGK
1）遺伝子プロモーターを用いてα−インターフェロン
を全細胞蛋白質の１〜３％のレベルで生産せしめた。各
場合において、PGK-1プロモーター−α−インターフェ
ロン発現ユニットが酵母２μプラスミド由来のベクター
中で使用された。酵母ADH1遺伝子からの構成的プロモー
ターがHitzeman等により（Nature 293:717-722,1981）
酵母ベクターYRp7においてα−インターフェロンを発現
せしめるために使用された。これらの構成物は全細胞蛋
白質の0.4％でα−インターフェロンを生成した。Bitte
r及びEgan（Gene 32:263-274,1983）は、酵母２μプラ
スミド由来のベクター中でα−インターフェロンを発現
せしめるためにグリセルアルデヒド−３−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ（GAP491，GPDとしても知られる）遺
伝子プロモーターを使用した。これらの生成物は全細胞
蛋白質の約１％でα−インターフェロンをもたらした。
Kramer等（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:367-370,198
4）は、酵母２μプラスミド由来のベクター上でα−イ
ンターフェロンを発現せしめるために酵母抑制酸性ホス
ファターゼ（PH05）遺伝子プロモーターを使用した。誘
導の後、この構成物は全細胞蛋白質の0.2％のレベルで
α−インターフェロンをもたらした。
α−インターフェロンに匹敵するレベルで酵母におい
て発現された他の蛋白質はＢ型肝炎表面抗原（HBS）及
びヒトα−１−アンチトリプシン（AAT）である。Bitte
r及びEgan（前掲）はGAP491プロモーターを使用して全
細胞蛋白質の４％までのレベルでHBSを発現せしめた。P
H05プロモーターを用いて、酵母中期対数期の培養物
（1.5×107細胞/ml）ml当り3.1μｇのHBSが得られた
（ミヤノハラ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:1−5,19
83）。1010個の細胞が約120mgの全蛋白質を含有する（R
obert A.Smith、私信）と仮定して、約２％のHBSの収量
を計算することができる。Valenzuela等（Nature 298:
347-350,1982）は、ADH1プロモーターを用いるHBSの発
現が、ミヤノハラ等（前掲）により報告されたそれより
約２オーダー低い発現レベルをもたらすことを示した。
て発現された他の蛋白質はＢ型肝炎表面抗原（HBS）及
びヒトα−１−アンチトリプシン（AAT）である。Bitte
r及びEgan（前掲）はGAP491プロモーターを使用して全
細胞蛋白質の４％までのレベルでHBSを発現せしめた。P
H05プロモーターを用いて、酵母中期対数期の培養物
（1.5×107細胞/ml）ml当り3.1μｇのHBSが得られた
（ミヤノハラ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:1−5,19
83）。1010個の細胞が約120mgの全蛋白質を含有する（R
obert A.Smith、私信）と仮定して、約２％のHBSの収量
を計算することができる。Valenzuela等（Nature 298:
347-350,1982）は、ADH1プロモーターを用いるHBSの発
現が、ミヤノハラ等（前掲）により報告されたそれより
約２オーダー低い発現レベルをもたらすことを示した。
AATの発現も同様に低いレベルの発現をもたらした。T
PI1プロモーターを使用して全細胞蛋白質の約0.9％のAA
Tレベルが得られた（米国特許No.4,599,311,1986）。高
コピー数プラスミドを使用して全細胞蛋白質の４〜６％
のAATレベルが得られた（Kawasaki及びBell,EP 171,14
2,1986年公開）。他の研究者は1.2％（Cabezon,EP 151,
102,1985）及び１％（Rosenberg等、Nature 312:77-80,
1984）のAAT発現レベルが達成された。
PI1プロモーターを使用して全細胞蛋白質の約0.9％のAA
Tレベルが得られた（米国特許No.4,599,311,1986）。高
コピー数プラスミドを使用して全細胞蛋白質の４〜６％
のAATレベルが得られた（Kawasaki及びBell,EP 171,14
2,1986年公開）。他の研究者は1.2％（Cabezon,EP 151,
102,1985）及び１％（Rosenberg等、Nature 312:77-80,
1984）のAAT発現レベルが達成された。
酵母における低い異種蛋白質の発現のこれらの例には
幾つかの例外が存在する。これらにはスーパーキシシド
ジスムターゼ（SOD）及び肝炎Ｂコアー抗原（HBcAg）が
含まれる。Hallewell及びMullenbach（W085/01503,198
5）は、全細胞蛋白質の14.8％という報告されたレベル
でSODを生産するGAP491プロモーターの使用を開示して
いる。Knistern等（Gene 46:135-141,1986）はまた、G
AP491プロモーターを使用してＢ型肝炎コアー抗原を全
細胞蛋白質の40％で生産せしめた。
幾つかの例外が存在する。これらにはスーパーキシシド
ジスムターゼ（SOD）及び肝炎Ｂコアー抗原（HBcAg）が
含まれる。Hallewell及びMullenbach（W085/01503,198
5）は、全細胞蛋白質の14.8％という報告されたレベル
でSODを生産するGAP491プロモーターの使用を開示して
いる。Knistern等（Gene 46:135-141,1986）はまた、G
AP491プロモーターを使用してＢ型肝炎コアー抗原を全
細胞蛋白質の40％で生産せしめた。
Kniskern等（前掲）は、高レベルのHBcAgが細胞内で
凝臭体を形成しそして内因性蛋白質分解的攻撃から蛋白
質を保護すると考えられる異種性蛋白質の異常な安定性
と関連することを注目した。
凝臭体を形成しそして内因性蛋白質分解的攻撃から蛋白
質を保護すると考えられる異種性蛋白質の異常な安定性
と関連することを注目した。
Cousens等（EP 196,056）は、後でインビトロで開裂
される融合蛋白質の生産による異種性蛋白質の発現レベ
ルの上昇方法を開示している。
される融合蛋白質の生産による異種性蛋白質の発現レベ
ルの上昇方法を開示している。
要約すれば、異種性蛋白質は一般に、酵母中で低レベ
ルで生産される（全細胞蛋白質の約５％未満）。この現
象の理由は十分には理解されていないが、外来蛋白質自
体の性質及び／又は外来性mRNAの低いレベルが発現レベ
ルを制限すると予想される。HBcAgの顕著な発現は、異
常な蛋白質であって、その構造がその生産レベルを増強
するらしい。この例外は、発現レベルが蛋白質依存的で
あるという仮定をさらに支持するものである。
ルで生産される（全細胞蛋白質の約５％未満）。この現
象の理由は十分には理解されていないが、外来蛋白質自
体の性質及び／又は外来性mRNAの低いレベルが発現レベ
ルを制限すると予想される。HBcAgの顕著な発現は、異
常な蛋白質であって、その構造がその生産レベルを増強
するらしい。この例外は、発現レベルが蛋白質依存的で
あるという仮定をさらに支持するものである。
従って、酵母宿主細胞においてα−１−アンチトリプ
シンのごとき異種性蛋白質の生産を増強するための方法
の必要性が当業界において存在する。この発明はこの要
求を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供す
る。
シンのごとき異種性蛋白質の生産を増強するための方法
の必要性が当業界において存在する。この発明はこの要
求を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供す
る。
要約すれば、本発明は、ADH2プロモーター、異種性遺
伝子又はcDNA及び欠陥選択マーカーを含有する、酵母に
おける異種々性遺伝子又はcDNAの発現を指令することが
できる発現ベクターを開示する。１つの好ましい態様に
おいて、異種性遺伝子はα−１−アンチトリプシンをコ
ードする。
伝子又はcDNA及び欠陥選択マーカーを含有する、酵母に
おける異種々性遺伝子又はcDNAの発現を指令することが
できる発現ベクターを開示する。１つの好ましい態様に
おいて、異種性遺伝子はα−１−アンチトリプシンをコ
ードする。
この発明の他の観点は、ADH2プロモーター、異種性遺
伝子又はcDNA及び欠陥選択マーカーを含有し酵母におけ
る異種性遺伝子又はcDNAの発現を指令することができる
発現ベクターが導入されている、遺伝的欠陥を有する酵
母宿主細胞であって、前記マーカーが酵母宿主細胞中の
前記遺伝的欠陥を補完する酵母宿主細胞を開示する。
伝子又はcDNA及び欠陥選択マーカーを含有し酵母におけ
る異種性遺伝子又はcDNAの発現を指令することができる
発現ベクターが導入されている、遺伝的欠陥を有する酵
母宿主細胞であって、前記マーカーが酵母宿主細胞中の
前記遺伝的欠陥を補完する酵母宿主細胞を開示する。
この発明はまた酵母宿主細胞における蛋白質の増強さ
れた製造のための方法を提供する。この方法は、（ａ）
ADH2プロモーター、異種性遺伝子又はcDNA及び欠陥選択
マーカーを含有し酵母中での異種性遺伝子又はcDNAの発
現を指令することができる発現ベクターを遺伝的欠陥を
有する酵母宿主細胞に導入し、前記選択マーカーが前記
宿主細胞中の遺伝的欠陥を補完し;b）前記酵母宿主細胞
を適当な培地中で増殖せしめ；そしてｃ）前記宿主細胞
により生産された蛋白質を単離することを含む。
れた製造のための方法を提供する。この方法は、（ａ）
ADH2プロモーター、異種性遺伝子又はcDNA及び欠陥選択
マーカーを含有し酵母中での異種性遺伝子又はcDNAの発
現を指令することができる発現ベクターを遺伝的欠陥を
有する酵母宿主細胞に導入し、前記選択マーカーが前記
宿主細胞中の遺伝的欠陥を補完し;b）前記酵母宿主細胞
を適当な培地中で増殖せしめ；そしてｃ）前記宿主細胞
により生産された蛋白質を単離することを含む。
この発明の好ましい態様においては、酵母宿主細胞は
ロイシンでの増殖について栄養要求性でありそして幾つ
かの空胞（vacuolar）プロテアーゼの低下した活性をも
たらすpep4変異を担持するS.セレビシエーの〔ciro〕株
であり、前記異種性遺伝子はα−１−アンチトリプシン
をコードし、そして前記発現ベクターは複製開始点、酵
母２μサークルに由来するREP1，REP2及びREP3、ADH2-4
C プロモーター、並びにleu2-d遺伝子から成る欠陥選択
マーカーを含有する。特定の態様において、α−１−ア
ンチトリプシンは宿主細胞の細胞質中に実質的に保持さ
れ、そして酵母宿主細胞は、酵母細胞により生産された
α−１−アンチトリプシンを単離する前に破砕される。
ロイシンでの増殖について栄養要求性でありそして幾つ
かの空胞（vacuolar）プロテアーゼの低下した活性をも
たらすpep4変異を担持するS.セレビシエーの〔ciro〕株
であり、前記異種性遺伝子はα−１−アンチトリプシン
をコードし、そして前記発現ベクターは複製開始点、酵
母２μサークルに由来するREP1，REP2及びREP3、ADH2-4
C プロモーター、並びにleu2-d遺伝子から成る欠陥選択
マーカーを含有する。特定の態様において、α−１−ア
ンチトリプシンは宿主細胞の細胞質中に実質的に保持さ
れ、そして酵母宿主細胞は、酵母細胞により生産された
α−１−アンチトリプシンを単離する前に破砕される。
この発明の他の観点は以下の具体的な記載及び図面に
より明らかになるであろう。
より明らかになるであろう。
本発明を記載する前に、その理解のために以後に使用
される幾つかの用語の定義を記載するのが役立つであろ
う。
される幾つかの用語の定義を記載するのが役立つであろ
う。
欠陥選択マーカー：低い比活性で発現され、そしてプラ
スミドにより形質転換された細胞の選択を可能にするた
めにプラスミド上で使用される遺伝子又はcDNA。この様
な遺伝子は、プロモーター領域中の欠失、変異又は変更
のために低速で発現される。この様な遺伝子の例として
Beggs（Nature 275:104-108,1978）により単離されたl
eu2-d遺伝子が挙げられる。低速の発現はまた、選択マ
ーカーの発現を駆動するための異種性プロモーターの使
用によっても惹起され得る。このタイプの選択マーカー
の例には、酵母S.セレビシエー（この明細書に記載す
る）中でアスペルギルス・ニドランス(Aspergillus ni
dulans）tpiA cDNAを発現させるために使用されるE.コ
リ lacＺプロモーターである。他方、シゾサッカロミ
セス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)POT1遺伝子
の場合のように、変更された転写部位のために発現速度
が低い異種性遺伝子を使用することができる（P.R.Russ
ell,Gene 40:125-130,1985）。欠陥選択マーカーはま
た、低い比活性を有する蛋白質をコードすることができ
る。この遺伝子は、低下した比活性を有する蛋白質をコ
ードする変化した内因性遺伝子であることができる。あ
るいは、宿主における欠陥を弱く補完する異種性遺伝子
を使用することができる。
スミドにより形質転換された細胞の選択を可能にするた
めにプラスミド上で使用される遺伝子又はcDNA。この様
な遺伝子は、プロモーター領域中の欠失、変異又は変更
のために低速で発現される。この様な遺伝子の例として
Beggs（Nature 275:104-108,1978）により単離されたl
eu2-d遺伝子が挙げられる。低速の発現はまた、選択マ
ーカーの発現を駆動するための異種性プロモーターの使
用によっても惹起され得る。このタイプの選択マーカー
の例には、酵母S.セレビシエー（この明細書に記載す
る）中でアスペルギルス・ニドランス(Aspergillus ni
dulans）tpiA cDNAを発現させるために使用されるE.コ
リ lacＺプロモーターである。他方、シゾサッカロミ
セス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)POT1遺伝子
の場合のように、変更された転写部位のために発現速度
が低い異種性遺伝子を使用することができる（P.R.Russ
ell,Gene 40:125-130,1985）。欠陥選択マーカーはま
た、低い比活性を有する蛋白質をコードすることができ
る。この遺伝子は、低下した比活性を有する蛋白質をコ
ードする変化した内因性遺伝子であることができる。あ
るいは、宿主における欠陥を弱く補完する異種性遺伝子
を使用することができる。
遺伝的欠陥：点変異、欠失又は分裂により生じ、そして
交配の子孫における欠陥のメンデル分離をもたらす宿主
細胞中の特定の遺伝子内の病変。この様な欠陥は例えば
特定の栄養について栄養要求状態を導くことができる。
この種の病変の例は、S.セレビシエーにおけるleu2-3,1
12変異であり、この変異はこれらの変異株の増殖培地に
おけるロイシンの要求を導く。他方、病変は該病変を含
有する生物体が特定の炭素源を利用すること不可能にす
るものであってもよい。この様な例は、S.セレビシエー
におけるtpi1変異であり、この変異は変異株が唯一の炭
素源としてグルコースを含有する培地上で増殖すること
を防止する。遺伝的欠陥は一般にプラスミドに担持され
た選択マーカーにより補完されるであろう。
交配の子孫における欠陥のメンデル分離をもたらす宿主
細胞中の特定の遺伝子内の病変。この様な欠陥は例えば
特定の栄養について栄養要求状態を導くことができる。
この種の病変の例は、S.セレビシエーにおけるleu2-3,1
12変異であり、この変異はこれらの変異株の増殖培地に
おけるロイシンの要求を導く。他方、病変は該病変を含
有する生物体が特定の炭素源を利用すること不可能にす
るものであってもよい。この様な例は、S.セレビシエー
におけるtpi1変異であり、この変異は変異株が唯一の炭
素源としてグルコースを含有する培地上で増殖すること
を防止する。遺伝的欠陥は一般にプラスミドに担持され
た選択マーカーにより補完されるであろう。
２μサークル：一倍体ゲノム当り60〜100コピまで達成
しそして維持するように複製の細胞サイクル制御を無視
することができる天然酵母プラスミドサークル。２μプ
ラスミドサークルは自己触媒された分子内組換により２
つの異る形能間を相互転換することができる。このプラ
スミドはそれ自身の複製開始点並びにREP1,REP2及びREP
3と称する遺伝子を含有し、これらは該プラスミドの維
持及び複製に関与する。２μサークルの複製及び組換は
Broach及びHicks（Cell 21:501-508,1980）により検討
されている。
しそして維持するように複製の細胞サイクル制御を無視
することができる天然酵母プラスミドサークル。２μプ
ラスミドサークルは自己触媒された分子内組換により２
つの異る形能間を相互転換することができる。このプラ
スミドはそれ自身の複製開始点並びにREP1,REP2及びREP
3と称する遺伝子を含有し、これらは該プラスミドの維
持及び複製に関与する。２μサークルの複製及び組換は
Broach及びHicks（Cell 21:501-508,1980）により検討
されている。
〔ciro〕株:2μプラスミドを含有しない酵母株。
変異単離体：野性型対立遺伝子と異るDNA配列。この様
な相違は該変異配列を担持する細胞における変化した表
現型をもたらすことができる。例えば、S.セリビシエー
の野性型ADH2プロモーターは炭素源としてのグリコース
上で増殖した細胞中で強く抑制され、そしてエタノール
上で増殖した細胞において抑制解除される。ADH2C 又はA
DH3C と称する幾つかの変異単離体は抑制解除条件下で変
化した活性を示すことが記載されている。この明細書に
おいて使用する場合、“ADH2プロモーターの変異単離
体”なる語はこれらの特定の単離体を包含するが、これ
らに限定されない。
な相違は該変異配列を担持する細胞における変化した表
現型をもたらすことができる。例えば、S.セリビシエー
の野性型ADH2プロモーターは炭素源としてのグリコース
上で増殖した細胞中で強く抑制され、そしてエタノール
上で増殖した細胞において抑制解除される。ADH2C 又はA
DH3C と称する幾つかの変異単離体は抑制解除条件下で変
化した活性を示すことが記載されている。この明細書に
おいて使用する場合、“ADH2プロモーターの変異単離
体”なる語はこれらの特定の単離体を包含するが、これ
らに限定されない。
“ADH2プロモーター”なる語は野性型プロモーター及
びその変異単離体の両者を含むであろう。これらのプロ
モーターは少なくとも、野性型プロモーターの抑制機
能、RNAポリメラーゼ結合機能、及び転写開始機能を含
有するであろう。
びその変異単離体の両者を含むであろう。これらのプロ
モーターは少なくとも、野性型プロモーターの抑制機
能、RNAポリメラーゼ結合機能、及び転写開始機能を含
有するであろう。
前記のように、多くの研究者が酵母における種々の異
種性蛋白質の低レベルの発現を達成した。この様な蛋白
質の１つα−１−アンチトリプシン（AAT）は従来約１
％〜６％のレベルでのみ発現されている。本発明は、酵
母ADH2プロモーターが欠陥選択マーカーとの組合わせに
おいて使用される場合、酵母宿主細胞中での異種性遺伝
子又はcDNAの高レベルの発現を指令することができると
いう本発明者等の発見に基く。本発明において開示され
る発現ベクターは安定であり、そして酵母宿主細胞中で
高コピー数で自律複製することができる。抑制されるAD
H2プロモーターを含有することにより、酵母宿主細胞は
異種性mRNAの転写を抑制する条件下で高密度に増殖する
ことができる。所定の細胞濃度が達成された後、次に外
来遺伝子又はcDNAの発現を抑制解除し又はスイッチ・オ
ンにすることができる。好ましい態様において、この明
細書において開示する酵母発現系は全細胞蛋白質の30％
まで又はそれ以上を占めるレベルのAATの発現をもたら
す。
種性蛋白質の低レベルの発現を達成した。この様な蛋白
質の１つα−１−アンチトリプシン（AAT）は従来約１
％〜６％のレベルでのみ発現されている。本発明は、酵
母ADH2プロモーターが欠陥選択マーカーとの組合わせに
おいて使用される場合、酵母宿主細胞中での異種性遺伝
子又はcDNAの高レベルの発現を指令することができると
いう本発明者等の発見に基く。本発明において開示され
る発現ベクターは安定であり、そして酵母宿主細胞中で
高コピー数で自律複製することができる。抑制されるAD
H2プロモーターを含有することにより、酵母宿主細胞は
異種性mRNAの転写を抑制する条件下で高密度に増殖する
ことができる。所定の細胞濃度が達成された後、次に外
来遺伝子又はcDNAの発現を抑制解除し又はスイッチ・オ
ンにすることができる。好ましい態様において、この明
細書において開示する酵母発現系は全細胞蛋白質の30％
まで又はそれ以上を占めるレベルのAATの発現をもたら
す。
全蛋白質の約５％より高いレベルで酵母において発現
された異種性蛋白質は今までほとんど無く、そして発現
レベルは異種性蛋白質又はmRNAの性質により限定される
であろうから、欠陥選択マーカーと組合わせてのADH2プ
ロモーターの使用が少なくとも５〜６倍発現レベルを上
昇せしめることは予想できないであろう。
された異種性蛋白質は今までほとんど無く、そして発現
レベルは異種性蛋白質又はmRNAの性質により限定される
であろうから、欠陥選択マーカーと組合わせてのADH2プ
ロモーターの使用が少なくとも５〜６倍発現レベルを上
昇せしめることは予想できないであろう。
前記のごとく、この発明はADH2プロモーター、異種性
遺伝子又はcDNA、及び欠陥選択マーカーを含有する選択
マーカーを開示する。好ましい態様においては、発現ベ
クターは内因性酵母２μプラスミドのDNA配列を含む。
特に好ましい発現ベクターは２μサークルプラスミド複
製開始点並びに２μREP1，REP2及びREP3遺伝子を含む。
他の好ましい態様において、本発明の発現ベクターは転
写ターミネーターを含有する。特定の好ましい転写ター
ミネーターはTPI1遺伝子に由来する。
遺伝子又はcDNA、及び欠陥選択マーカーを含有する選択
マーカーを開示する。好ましい態様においては、発現ベ
クターは内因性酵母２μプラスミドのDNA配列を含む。
特に好ましい発現ベクターは２μサークルプラスミド複
製開始点並びに２μREP1，REP2及びREP3遺伝子を含む。
他の好ましい態様において、本発明の発現ベクターは転
写ターミネーターを含有する。特定の好ましい転写ター
ミネーターはTPI1遺伝子に由来する。
好ましいADH2プロモーターにはADH2C プロモーター（C
iriacy,Mutat.Res. 29:315-326,1975;Ciriacy,Molec.G
en.Genet. 145:327-333,1976;Ciriacy,Molec.Gen.Gene
t. 176:427-431,1979;Williamson及びYoung,Cell 23:
605-614;1981）が包含される。特定の好ましいADH2C プ
ロモーターはADH2-4C プロモーターである。すでに述べ
たごとく、ADH2プロモーターは転写の制御、RNAポリメ
ラーゼの結合、及び転写の開始を担当する配列を含有す
る。野性型ADH2プロモーターにおいては、制御機能はお
よそヌクレオチド−292からおよそヌクレオチド−271に
延びる２回対称（dyad symmetry）の領域と関連し、RNA
ポリメラーゼ結合はおよそヌクレオチド−160にあるTAT
Aボックスと関連し、そして転写開始は約−60〜−50の
領域において起こる。
iriacy,Mutat.Res. 29:315-326,1975;Ciriacy,Molec.G
en.Genet. 145:327-333,1976;Ciriacy,Molec.Gen.Gene
t. 176:427-431,1979;Williamson及びYoung,Cell 23:
605-614;1981）が包含される。特定の好ましいADH2C プ
ロモーターはADH2-4C プロモーターである。すでに述べ
たごとく、ADH2プロモーターは転写の制御、RNAポリメ
ラーゼの結合、及び転写の開始を担当する配列を含有す
る。野性型ADH2プロモーターにおいては、制御機能はお
よそヌクレオチド−292からおよそヌクレオチド−271に
延びる２回対称（dyad symmetry）の領域と関連し、RNA
ポリメラーゼ結合はおよそヌクレオチド−160にあるTAT
Aボックスと関連し、そして転写開始は約−60〜−50の
領域において起こる。
この発明において使用される欠陥選択マーカーは酵母
宿主株における遺伝的欠陥に対して低レベルの補完のみ
を可能にする。この低レベルの補完は今度は発現ベクタ
ーのコピー数の補償的増加をもたらし、これは選択条件
下での宿主細胞の増殖のために必要なことである（Erha
rt及びHollenberg,J.Bacteriol. 156:625,1983）。こ
の発明の好ましい態様においては、欠陥選択マーカー
は、異種性プロモーターの使用のため又は変化した転写
開始部位のために低レベルで発現される蛋白質をコード
する。それぞれアスペルギルス・ニドランスtriA cDNA
及びシゾサッカロミセス・ポンベPOT1遺伝子はこれに関
して特に好ましい。これに代る好ましい態様において、
欠陥選択マーカーは該マーカーに使用可能に連結された
プロモーター中の欠失又は変化を含む。これに関する特
定の好ましい欠陥選択マーカーはleu2-d遺伝子である。
宿主株における遺伝的欠陥に対して低レベルの補完のみ
を可能にする。この低レベルの補完は今度は発現ベクタ
ーのコピー数の補償的増加をもたらし、これは選択条件
下での宿主細胞の増殖のために必要なことである（Erha
rt及びHollenberg,J.Bacteriol. 156:625,1983）。こ
の発明の好ましい態様においては、欠陥選択マーカー
は、異種性プロモーターの使用のため又は変化した転写
開始部位のために低レベルで発現される蛋白質をコード
する。それぞれアスペルギルス・ニドランスtriA cDNA
及びシゾサッカロミセス・ポンベPOT1遺伝子はこれに関
して特に好ましい。これに代る好ましい態様において、
欠陥選択マーカーは該マーカーに使用可能に連結された
プロモーター中の欠失又は変化を含む。これに関する特
定の好ましい欠陥選択マーカーはleu2-d遺伝子である。
この発明の範囲内において、α−１−アンチトリプシ
ンをコードする異種性遺伝子又はcDNAに加えて、他の種
々の異種性遺伝子又はcDNAを用いることができることは
当業者にとって明らかである。
ンをコードする異種性遺伝子又はcDNAに加えて、他の種
々の異種性遺伝子又はcDNAを用いることができることは
当業者にとって明らかである。
酵母において高レベルで発現され得る蛋白質の１つの
例は凝固因子・ファクターX IIIである。ファクターX I
IIは血液凝固系の成分であって、スロンビンにより活性
化された場合、血液凝固の最終段階において機能してフ
ィブリンポリマーを架橋してフィブリンクロットを安定
化しそして強化する。２個のａサブユニット及び２個の
ｂサブユニットのテトラマーから成るファクターX III
は２個のcDNAとしてクローン化されており、一方はａサ
ブユニットをコードし、そして他方はｂサブユニットを
コードする（それぞれ、イチノセ等、Biochem.J. 25:6
900-6906,1986;及びイチノセ等、Biochem.J. 25:4633-
4638,1986）。ａサブユニットcDNAは、ADH2プロモータ
ーにより駆動されそしてこの明細書に記載する発現ベク
ターに挿入される発現ユニットを用いて酵母において
（米国特許出願No.909,512に記載されているように）発
現された。適当な酵母株への発現ベクターの形質転換
は、この発現の発現ベクターが常用のURA3選択マーカー
を用いる発現ベクターに比べて25倍以上のファクターX
III活性をもたらすことを示した。
例は凝固因子・ファクターX IIIである。ファクターX I
IIは血液凝固系の成分であって、スロンビンにより活性
化された場合、血液凝固の最終段階において機能してフ
ィブリンポリマーを架橋してフィブリンクロットを安定
化しそして強化する。２個のａサブユニット及び２個の
ｂサブユニットのテトラマーから成るファクターX III
は２個のcDNAとしてクローン化されており、一方はａサ
ブユニットをコードし、そして他方はｂサブユニットを
コードする（それぞれ、イチノセ等、Biochem.J. 25:6
900-6906,1986;及びイチノセ等、Biochem.J. 25:4633-
4638,1986）。ａサブユニットcDNAは、ADH2プロモータ
ーにより駆動されそしてこの明細書に記載する発現ベク
ターに挿入される発現ユニットを用いて酵母において
（米国特許出願No.909,512に記載されているように）発
現された。適当な酵母株への発現ベクターの形質転換
は、この発現の発現ベクターが常用のURA3選択マーカー
を用いる発現ベクターに比べて25倍以上のファクターX
III活性をもたらすことを示した。
酵母において発現され得る蛋白質の他の例は抗凝固物
質PAP-I（フナコシ等、Biochem.J. 26:5572-5578,198
7）である。PAP-Iはリポコルチン（lipocortin）の類と
共に仮りに類別される蛋白質であり、そしてリン脂質に
結合する能力を示す。PAP-I蛋白質をコードするcDNAは
クローン化されている（米国特許出願No.011,782及びN
o.059,355に記載されている。このcDNAがこの明細書に
記載する発現ベクター中で使用され、そしてPAP-Iの生
産のために適当な酵母株に形質転換された。好ましい態
様において、この明細書に開示される酵母発現系は、常
用のLEU2選択マーカーを用いる発現ベクターを用いて見
出されるレベルの10倍のPAP-I発現レベルをもたらす。
質PAP-I（フナコシ等、Biochem.J. 26:5572-5578,198
7）である。PAP-Iはリポコルチン（lipocortin）の類と
共に仮りに類別される蛋白質であり、そしてリン脂質に
結合する能力を示す。PAP-I蛋白質をコードするcDNAは
クローン化されている（米国特許出願No.011,782及びN
o.059,355に記載されている。このcDNAがこの明細書に
記載する発現ベクター中で使用され、そしてPAP-Iの生
産のために適当な酵母株に形質転換された。好ましい態
様において、この明細書に開示される酵母発現系は、常
用のLEU2選択マーカーを用いる発現ベクターを用いて見
出されるレベルの10倍のPAP-I発現レベルをもたらす。
この発明の発現ベクターは、１又は複数の遺伝的欠陥
を有する酵母宿主細胞に導入することができ、この発現
ベクターの欠陥選択マーカーが酵母宿主中の該遺伝的欠
陥を補完する。適当な宿主株は寄託機関、例えばAmeric
an Type Culture Collection、マリーランド、ロックビ
ル；及びYeast Genetic Stoch Center、カリホルニア、
バークレーから得ることができ、あるいは標準的変異法
を用いて調製することができる。発現ベクターを酵母宿
主細胞に導入するための方法は文献中によく知られてい
る（例えば、Beggs、前掲、1978;及びHinnen等、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 75:1929-1933,1978）。これに関し
て、適当な宿主細胞には、サッカロミセス・セレビシエ
ー、サッカロミセス・ドウグラシー(Saccharomyces do
uglasii)及びサッカロミセス・カールスベルゲンシス(S
accharomyces carlsbergensis)の株が包含され、〔cir
o〕株が好ましい。内因性２μプラスミドを担持するこ
とが知られている他の酵母種を〔ciro〕状態にすること
ができる。（例えば、Dobson等、Curr.Genet．2:210-21
5,1980の方法による）。サッカロミセス・ドウグラシー
は最初にDonald C.Hawthorneにより単離されたヘテロタ
リック（heterothallic）酵母である。S.ドウグラッシ
ー4770-1A株はベクターYEp13により好結果に形質転換さ
れ、この株はYEp13ベクターから失われた複製機能を補
完することができる内因性２μプラスミドを含有するこ
とが示された。サッカロミセス・カールスベルゲンシス
は内因性２μプラスミドを担持することが知られている
他の種である。S.カールスベルゲンシスの株はGuerineu
等(Biochem.Biophys.Res.Commun. 61:462,1974）及びL
ivingston（Genetics 86:73,1977）により単離され、そ
して研究されている。好ましい態様において、酵母宿主
株、そうでなければ宿主株中で生産された異種性蛋白質
を分解するかもしれない幾つかの内胞性プロテアーゼの
活性の低下をもたらすpep4変異を担持する。
を有する酵母宿主細胞に導入することができ、この発現
ベクターの欠陥選択マーカーが酵母宿主中の該遺伝的欠
陥を補完する。適当な宿主株は寄託機関、例えばAmeric
an Type Culture Collection、マリーランド、ロックビ
ル；及びYeast Genetic Stoch Center、カリホルニア、
バークレーから得ることができ、あるいは標準的変異法
を用いて調製することができる。発現ベクターを酵母宿
主細胞に導入するための方法は文献中によく知られてい
る（例えば、Beggs、前掲、1978;及びHinnen等、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 75:1929-1933,1978）。これに関し
て、適当な宿主細胞には、サッカロミセス・セレビシエ
ー、サッカロミセス・ドウグラシー(Saccharomyces do
uglasii)及びサッカロミセス・カールスベルゲンシス(S
accharomyces carlsbergensis)の株が包含され、〔cir
o〕株が好ましい。内因性２μプラスミドを担持するこ
とが知られている他の酵母種を〔ciro〕状態にすること
ができる。（例えば、Dobson等、Curr.Genet．2:210-21
5,1980の方法による）。サッカロミセス・ドウグラシー
は最初にDonald C.Hawthorneにより単離されたヘテロタ
リック（heterothallic）酵母である。S.ドウグラッシ
ー4770-1A株はベクターYEp13により好結果に形質転換さ
れ、この株はYEp13ベクターから失われた複製機能を補
完することができる内因性２μプラスミドを含有するこ
とが示された。サッカロミセス・カールスベルゲンシス
は内因性２μプラスミドを担持することが知られている
他の種である。S.カールスベルゲンシスの株はGuerineu
等(Biochem.Biophys.Res.Commun. 61:462,1974）及びL
ivingston（Genetics 86:73,1977）により単離され、そ
して研究されている。好ましい態様において、酵母宿主
株、そうでなければ宿主株中で生産された異種性蛋白質
を分解するかもしれない幾つかの内胞性プロテアーゼの
活性の低下をもたらすpep4変異を担持する。
形質転換された酵母宿主細胞は、プラスミド上に存在
する選択マーカーによる遺伝的欠陥の補完について選択
することにより得られる。選択された酵母宿主細胞をグ
ルコースを含有する選択培地で一夜培養せしめ、次にエ
タノール含有培地に切り替えて外来遺伝子又はcDNAの発
現を抑制解除する。あるいは、細胞をグルコース含有選
択培地に増殖せしめ、細胞にグルコースを消耗せしめ、
これによって外来遺伝子又はcDNAの発現を抑制解除す
る。次に、形質転換された宿主細胞により生産された、
発現された異種性蛋白質を常法に従って単離する。
する選択マーカーによる遺伝的欠陥の補完について選択
することにより得られる。選択された酵母宿主細胞をグ
ルコースを含有する選択培地で一夜培養せしめ、次にエ
タノール含有培地に切り替えて外来遺伝子又はcDNAの発
現を抑制解除する。あるいは、細胞をグルコース含有選
択培地に増殖せしめ、細胞にグルコースを消耗せしめ、
これによって外来遺伝子又はcDNAの発現を抑制解除す
る。次に、形質転換された宿主細胞により生産された、
発現された異種性蛋白質を常法に従って単離する。
形質転換された酵母細胞中で生産された異種性蛋白質
の精製方法は一般に当業界において知られている。蛋白
質が宿主細胞内に維持される場合、まず細胞を破砕し、
そして好ましくは遠心分離により細胞破片を除去して透
明な細胞溶解物を得る。分泌された蛋白質の場合、蛋白
質を培地から直接精製する。次に、透明な細胞溶解物又
は培地を常用の蛋白質精製法により分画する。多段法が
一般に使用されよう。これに関して典型的な方法には沈
澱（例えば、ポリエチレングリコール又は硫酸アンモニ
ウムによる）、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、分取用ゲル電気泳動、高
速液体クロマトグラフィー、及び定圧液体クロマトグラ
フィーが含まれる。多くの場合、段階の間に注目の画分
を例えば硫酸アンモニウム沈澱及びそれに続く透析によ
る過剰の塩の除去により濃縮するのが好ましい。種々の
段階の選択及び順序付けは注目の特定の蛋白質の性質に
依存し、そして従来技術の範囲内にある。
の精製方法は一般に当業界において知られている。蛋白
質が宿主細胞内に維持される場合、まず細胞を破砕し、
そして好ましくは遠心分離により細胞破片を除去して透
明な細胞溶解物を得る。分泌された蛋白質の場合、蛋白
質を培地から直接精製する。次に、透明な細胞溶解物又
は培地を常用の蛋白質精製法により分画する。多段法が
一般に使用されよう。これに関して典型的な方法には沈
澱（例えば、ポリエチレングリコール又は硫酸アンモニ
ウムによる）、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、分取用ゲル電気泳動、高
速液体クロマトグラフィー、及び定圧液体クロマトグラ
フィーが含まれる。多くの場合、段階の間に注目の画分
を例えば硫酸アンモニウム沈澱及びそれに続く透析によ
る過剰の塩の除去により濃縮するのが好ましい。種々の
段階の選択及び順序付けは注目の特定の蛋白質の性質に
依存し、そして従来技術の範囲内にある。
典型的な調製においては、異種性蛋白質、例えばAAT
を生産する酵母宿主細胞を遠心分離により収得し、そし
て適当な緩衝液、例えばリン酸緩衝化塩溶液（PBS）に
再懸濁する。細胞を、好ましくはガラスビーズとの渦動
により破砕する。不所望の蛋白質を、破砕された細胞−
ガラスビーズスラリーから、例えば15％のポリエチレン
グリコールMW1000（PEG-1000）により除去することも好
ましい。次に、混合物を遠心分離してガラスビーズ及び
非可溶化細胞物質を除去する。精製をモニターするた
め、上清を標準的方法、例えばLowry等(J.Biol.Chem．1
93:265-275,1951）の方法により蛋白質含量について、
そして例えばゲル電気泳動又は活性測定により注目の蛋
白質についてアッセイすることができる。次に、上清を
イオン交換カラム、例えばDEAE-Sephacel Fast Flow
（ファルマシヤ、50mM Tris,pH6.5により平衡化したも
の）に適用する。種々の濃度のNaClを含有する緩衝液の
段階的適用により蛋白質を溶出する。AATは典型的には
0.2M Naclにおいて溶出する。AATを含有する画分を透析
する（例えば50mM Tris,pH8中で）。次に、透析された
材料をイオン交換カラム、好ましくはファルマシヤMono
-Qに、定圧液体クロマトグラフ（FPLC、ファルマシヤ、
ピスカナウエイ、N.J.）上で適用する。画分を集め、そ
してポリアクリルアミドゲル電気泳動により可視化する
ことができる。
を生産する酵母宿主細胞を遠心分離により収得し、そし
て適当な緩衝液、例えばリン酸緩衝化塩溶液（PBS）に
再懸濁する。細胞を、好ましくはガラスビーズとの渦動
により破砕する。不所望の蛋白質を、破砕された細胞−
ガラスビーズスラリーから、例えば15％のポリエチレン
グリコールMW1000（PEG-1000）により除去することも好
ましい。次に、混合物を遠心分離してガラスビーズ及び
非可溶化細胞物質を除去する。精製をモニターするた
め、上清を標準的方法、例えばLowry等(J.Biol.Chem．1
93:265-275,1951）の方法により蛋白質含量について、
そして例えばゲル電気泳動又は活性測定により注目の蛋
白質についてアッセイすることができる。次に、上清を
イオン交換カラム、例えばDEAE-Sephacel Fast Flow
（ファルマシヤ、50mM Tris,pH6.5により平衡化したも
の）に適用する。種々の濃度のNaClを含有する緩衝液の
段階的適用により蛋白質を溶出する。AATは典型的には
0.2M Naclにおいて溶出する。AATを含有する画分を透析
する（例えば50mM Tris,pH8中で）。次に、透析された
材料をイオン交換カラム、好ましくはファルマシヤMono
-Qに、定圧液体クロマトグラフ（FPLC、ファルマシヤ、
ピスカナウエイ、N.J.）上で適用する。画分を集め、そ
してポリアクリルアミドゲル電気泳動により可視化する
ことができる。
次に、FPLCからのピーク画分をプールし、そして70％
硫酸アンモニウムにより蛋白質を沈澱せしめることによ
り蛋白質を精製する。沈澱物を遠心により回収し、そし
て好ましくは0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）中
に再懸濁する。次に、再溶解された沈澱を液体クロマト
グラフィーを用いてサイズ分離する。集めた画分をポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により可視化することがで
きる。ピーク画分を集め、そして−80℃で凍結する。
硫酸アンモニウムにより蛋白質を沈澱せしめることによ
り蛋白質を精製する。沈澱物を遠心により回収し、そし
て好ましくは0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）中
に再懸濁する。次に、再溶解された沈澱を液体クロマト
グラフィーを用いてサイズ分離する。集めた画分をポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により可視化することがで
きる。ピーク画分を集め、そして−80℃で凍結する。
AATの収量を、“サンドイッチ型”のエンザイムリン
クドイムノソルベントアッセイ（ELISA）を用い、AATに
対するモノクローナル抗体、及びヒトAATに対する、ア
フィニティー精製されそしてビオチンに結合されたラビ
ット抗血清を用いてアッセイすることができる。典型的
には抗−AATモノクローナル抗体を標準的96ウエルミク
ロタイタープレートにプレートする。抗−AAT抗体の吸
着の後、ウシ血清アルブミンを含有する緩衝液によりプ
レートをブロックする。ブロッキング緩衝液を除去した
後、AATサンプルをプレートに三連で加える。一組の精
製されたAAT標準（＞95％純度、電気泳動により決定）
も各96−ウエルプレートに加える。インキュベーション
及び洗浄の後、検出用抗体−ビオチン接合体をプレート
に加え、そして別のインキュベーション及び洗浄の後、
アビジン−アルカリ性ホスファターゼ接合体を添加す
る。次に、プレートをインキュベートし、洗浄し、そし
てアルカリ性ホスファターゼ基質を加える。発色を405n
mにおいて、例えばTitertek 310C ELISAプレートリーダ
ー上でモニターする。
クドイムノソルベントアッセイ（ELISA）を用い、AATに
対するモノクローナル抗体、及びヒトAATに対する、ア
フィニティー精製されそしてビオチンに結合されたラビ
ット抗血清を用いてアッセイすることができる。典型的
には抗−AATモノクローナル抗体を標準的96ウエルミク
ロタイタープレートにプレートする。抗−AAT抗体の吸
着の後、ウシ血清アルブミンを含有する緩衝液によりプ
レートをブロックする。ブロッキング緩衝液を除去した
後、AATサンプルをプレートに三連で加える。一組の精
製されたAAT標準（＞95％純度、電気泳動により決定）
も各96−ウエルプレートに加える。インキュベーション
及び洗浄の後、検出用抗体−ビオチン接合体をプレート
に加え、そして別のインキュベーション及び洗浄の後、
アビジン−アルカリ性ホスファターゼ接合体を添加す
る。次に、プレートをインキュベートし、洗浄し、そし
てアルカリ性ホスファターゼ基質を加える。発色を405n
mにおいて、例えばTitertek 310C ELISAプレートリーダ
ー上でモニターする。
AATの生物学的活性は、天然AATのエラスターゼを結合
する能力を用いて決定することができる。好ましいアッ
セイ法においては、AATを含有するサンプルをエラスタ
ーゼと、１μｇのエラスターゼ対４μｇのAATの比率で
混合する。これらの混合物を氷上でインキュベートした
後、沸騰水浴中で加熱する。サンプルを10％アクリルア
ミドゲル上で泳動せしめ、そしてウエスタンブロット法
（Towbin等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350,1979）
によりニトロセルロースに移す。精製されたラビット抗
−AAT、西洋ワサビパーオキシダーゼに接合したヤギ抗
−ラビット抗体、及びビオラドHRP発色剤を用いてAATサ
ンプルを可視化する。活性AATを含有するサンプルはエ
ラスターゼとの複合体を形成し、そしてアクリルアミド
ゲルを通して一層ゆっくりと泳動するであろう。
する能力を用いて決定することができる。好ましいアッ
セイ法においては、AATを含有するサンプルをエラスタ
ーゼと、１μｇのエラスターゼ対４μｇのAATの比率で
混合する。これらの混合物を氷上でインキュベートした
後、沸騰水浴中で加熱する。サンプルを10％アクリルア
ミドゲル上で泳動せしめ、そしてウエスタンブロット法
（Towbin等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350,1979）
によりニトロセルロースに移す。精製されたラビット抗
−AAT、西洋ワサビパーオキシダーゼに接合したヤギ抗
−ラビット抗体、及びビオラドHRP発色剤を用いてAATサ
ンプルを可視化する。活性AATを含有するサンプルはエ
ラスターゼとの複合体を形成し、そしてアクリルアミド
ゲルを通して一層ゆっくりと泳動するであろう。
形質転換された酵母細胞により生産された組換蛋白質
のＮ−末端の配列分析を用いて蛋白質をさらに特徴付け
ることができる。アミノ末端の配列決定はEdman（Acta.
Chem.Scand. 4:283-293,1950）により記載されている
方法により行うことができる。配列決定に先立ち、蛋白
質を炭酸水素ナトリウムに対して透析し、そして凍結乾
燥することにより塩を除去する。
のＮ−末端の配列分析を用いて蛋白質をさらに特徴付け
ることができる。アミノ末端の配列決定はEdman（Acta.
Chem.Scand. 4:283-293,1950）により記載されている
方法により行うことができる。配列決定に先立ち、蛋白
質を炭酸水素ナトリウムに対して透析し、そして凍結乾
燥することにより塩を除去する。
当業者に明らかである様に、注目の特定の蛋白質に対
して適当な抗体、アッセイ及び分画条件を用いて他の蛋
白質を同様にして精製することができる。
して適当な抗体、アッセイ及び分画条件を用いて他の蛋
白質を同様にして精製することができる。
次の例を要約すれば、例１はヒトα−１−アンチトリ
プシンをコードするcDNA配列のクローニングを記載す
る。例２はADH2プロモーター配列のサブクローニング及
び変形を記載する。例３は、形質転換された酵母細胞中
でのα−１−アンチトリプシンの発現を指令するベクタ
ーpAT-2,pAT-3,pAT-4、及びpAT-6の作製を記載する。例
４は、例３に記載するプラスミドによる酵母細胞の形質
転換を記載する。形質転換体を適当な培地中で培養し、
そして高レベルのα−１−アンチトリプシンを生産せし
める。例５は形質転換された酵母細胞によるα−１−ア
ンチトリプシンの生産の測定方法を記載する。例６はヒ
トファクターX IIIのサブユニットをコードするcDNAの
クローニングを記載する。例７はファクターX III aサ
ブユニット発現ユニットの作製を記載する。例８は例７
に記載する発現ユニットを用いる発現ベクターの作製、
及び酵母でのファクターX III aサブユニットの発現を
記載する。例９はファクターX III活性の測定方法を記
載する。例10はPAP-1をコードするcDNAのクローニング
を記載する。例11は酵母でのPAP-1の発現を記載する。
次の例は本発明を具体的に説明するものであって、発明
の範囲を限定するものではない。
プシンをコードするcDNA配列のクローニングを記載す
る。例２はADH2プロモーター配列のサブクローニング及
び変形を記載する。例３は、形質転換された酵母細胞中
でのα−１−アンチトリプシンの発現を指令するベクタ
ーpAT-2,pAT-3,pAT-4、及びpAT-6の作製を記載する。例
４は、例３に記載するプラスミドによる酵母細胞の形質
転換を記載する。形質転換体を適当な培地中で培養し、
そして高レベルのα−１−アンチトリプシンを生産せし
める。例５は形質転換された酵母細胞によるα−１−ア
ンチトリプシンの生産の測定方法を記載する。例６はヒ
トファクターX IIIのサブユニットをコードするcDNAの
クローニングを記載する。例７はファクターX III aサ
ブユニット発現ユニットの作製を記載する。例８は例７
に記載する発現ユニットを用いる発現ベクターの作製、
及び酵母でのファクターX III aサブユニットの発現を
記載する。例９はファクターX III活性の測定方法を記
載する。例10はPAP-1をコードするcDNAのクローニング
を記載する。例11は酵母でのPAP-1の発現を記載する。
次の例は本発明を具体的に説明するものであって、発明
の範囲を限定するものではない。
例 制限酵素、DNAポリメラーゼＩ（Klenow断片）、BAL-3
1、T4DNAリガーゼ、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、細菌
アルカリ性ホスファターゼ及びウシアルカリ性ホスファ
ターゼを包含する酵素類はニューイングランド・ビオラ
ブス（ベバリー、Mass）、ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ（ガイセスブルグ、Md.）、及びベーリンガー
−マンハイム・バイオケミカルス（インディアナポリ
ス、Ind）から得、そして製造者の指示に従って、又はM
aniatis等、(Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l、コールドスプリングハーバー、N.Y.,1982に従って使
用した。オリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシス
テムス（フォスター・シティー、カリホルニア）モデル
380-A DNA合成機で合成し、そしてポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により精製した。ヒト胎盤cDNAライブラリ
ーはクロンテック・ラブス・社（パロ・アルト、カリホ
ルニア）から得た。
1、T4DNAリガーゼ、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、細菌
アルカリ性ホスファターゼ及びウシアルカリ性ホスファ
ターゼを包含する酵素類はニューイングランド・ビオラ
ブス（ベバリー、Mass）、ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ（ガイセスブルグ、Md.）、及びベーリンガー
−マンハイム・バイオケミカルス（インディアナポリ
ス、Ind）から得、そして製造者の指示に従って、又はM
aniatis等、(Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l、コールドスプリングハーバー、N.Y.,1982に従って使
用した。オリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシス
テムス（フォスター・シティー、カリホルニア）モデル
380-A DNA合成機で合成し、そしてポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により精製した。ヒト胎盤cDNAライブラリ
ーはクロンテック・ラブス・社（パロ・アルト、カリホ
ルニア）から得た。
例１ AATサブクローニング ヒトのα−１−アンチトリプシン（AAT）の主要な形
態をコードするcDNAを、ヒトの肝臓のcDNAライブラリー
から、DNAハイブリッド化プローブとしてヒヒ配列（Kur
achi他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:6826〜6830,198
0;および Chandra他、Biochem.Biophys.Comm．103:751
〜758,1981）を用い、通常の手順により単離した。ライ
ブラリーは、プラスミドpBR322のPst I部位にヒトの肝
臓cDNAを挿入することにより構成された（Bolivar他、G
ene 2:95〜113,1977）。AAT cDNAが、1500ベースペア
ー（bp）PstIフラグメントとして、ライブラリーから単
離された。このフラグメントを、pUC13のPstI部位に挿
入して、プラスミドpUCalを生成した。pUCalにおいて
は、AAT配列の３′末端上にポリリンカー中のXba Iおよ
びEcoR I部位が存在する。このcDNA配列を用いて、第１
図に示すプラスミドpFATPOTを構成した。プラスミドpFA
TPOTは、サッカロミセス・セレビシエー(Saccharomyces
cerevisiae）E18株形質転換体、寄託番号20699、とし
てATCCに寄託されている。
態をコードするcDNAを、ヒトの肝臓のcDNAライブラリー
から、DNAハイブリッド化プローブとしてヒヒ配列（Kur
achi他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:6826〜6830,198
0;および Chandra他、Biochem.Biophys.Comm．103:751
〜758,1981）を用い、通常の手順により単離した。ライ
ブラリーは、プラスミドpBR322のPst I部位にヒトの肝
臓cDNAを挿入することにより構成された（Bolivar他、G
ene 2:95〜113,1977）。AAT cDNAが、1500ベースペア
ー（bp）PstIフラグメントとして、ライブラリーから単
離された。このフラグメントを、pUC13のPstI部位に挿
入して、プラスミドpUCalを生成した。pUCalにおいて
は、AAT配列の３′末端上にポリリンカー中のXba Iおよ
びEcoR I部位が存在する。このcDNA配列を用いて、第１
図に示すプラスミドpFATPOTを構成した。プラスミドpFA
TPOTは、サッカロミセス・セレビシエー(Saccharomyces
cerevisiae）E18株形質転換体、寄託番号20699、とし
てATCCに寄託されている。
次に、AAT cDNAをプラスミドpMVRI中のTPI1ターミネ
ーターに連結した。このプラスミドは、さらに、TPI1プ
ロモーターを含み、下記のようにして組立てられた。プ
ラスミドPIC7（Marsh他、Gene 32:481〜486,1984）をE
coR Iで消化し、フラグメントの末端をDNAポリメラーゼ
Ｉ（Klenowフラグメント）により平滑末端化し、線状DN
AをT4DNAリガーゼを用いて再環化した。得られたプラス
ミドを用いてE.コリRRI株を形質転換した。形質転換体
からプラスミドDNAを作り、EcoR I部位の欠失について
スクリーンした。正しい制限パタンを有するプラスミド
をpIC7RI＊と表示した。第１図に示すように、プラスミ
ドpTPIC10（AlberおよびKawasaki、同上）からTPI1プロ
モーターフラグメントを得た。このプラスミドをTPI1遺
伝子内のユニークKpn I部位で切断し、TPI1コード領域
をBal31エキソヌクレアーゼにより除去し、キナーゼで
処理したEcoR Iリンカー（配列:GGAATTCC）をプロモー
ターの３′末端に付加した。Bgl IIおよびEcoR Iにより
消化して、Bgl IIおよびEcoR I付着末端を有するTPI1プ
ロモーターフラグメントを得た。次に、このフラグメン
トを、Bal IIおよびEcoR Iにより切断されたプラスミド
YRp7′（Stinchcomb他、Nature 282:39〜43,1979）に
連結した。得られたプラスミド、pTE32、をEcoR Iおよ
びBamH Iにより開裂して、テトラサイクリン耐性遺伝子
の一部を除去した。次に、線状プラスミドを、キナーゼ
処理されアニールされたEcoR I-BamH Iアダプター
（５′AAT TCA TGG AG 3′および５′GAT CCT CCA TG
3′）の付加により再環化して、プラスミドpTEA32を生
成した。プラスミドpTEA32をBgl IIおよびEcoR Iにより
消化し、約900bpのTPI1プロモーターフラグメントをゲ
ル精製した。プラスミドpIC19HをBgl IIおよびEcoR Iに
より切断し、ベクターフラグメントをゲル精製した。次
に、TPI1プロモーターフラグメントを線状pIC19Hに連結
し、この混合物を用いてE.コリ株RRIを形質転換した。
プラスミドDNAを調製し、約900bpのBgl II-EcoR Iフラ
グメントの存在についてスクリーニングした。正しいプ
ラスミドを選定し、pICPPIPと表示した。プラスミドpIC
7RI＊をHind IIIおよびNar Iにより消化し、2500bpフラ
グメントをゲル精製した。部分TPI1プロモーターおよび
pICI9Hベクター配列を含む約900bpのフラグメントを、N
ar IおよびSph Iを用いてpICTPIPから取り出し、ゲル精
製した。プラスミドpFATPOTをSph IおよびHind IIIによ
り消化し、TPI1プロモーターの一部、AAT cDNAおよびTP
I1ターミネーターを含む1750bpフラグメントをゲル精製
した。次に、pIC7RI＊フラグメント、TPI1プロモーター
フラグメントおよびpFATPOTからのTPI1プロモーター−A
AT-TPI1ターミネーターフラグメントをいっしょにして
三重連結として、pMVRIを生成した（第１図）。
ーターに連結した。このプラスミドは、さらに、TPI1プ
ロモーターを含み、下記のようにして組立てられた。プ
ラスミドPIC7（Marsh他、Gene 32:481〜486,1984）をE
coR Iで消化し、フラグメントの末端をDNAポリメラーゼ
Ｉ（Klenowフラグメント）により平滑末端化し、線状DN
AをT4DNAリガーゼを用いて再環化した。得られたプラス
ミドを用いてE.コリRRI株を形質転換した。形質転換体
からプラスミドDNAを作り、EcoR I部位の欠失について
スクリーンした。正しい制限パタンを有するプラスミド
をpIC7RI＊と表示した。第１図に示すように、プラスミ
ドpTPIC10（AlberおよびKawasaki、同上）からTPI1プロ
モーターフラグメントを得た。このプラスミドをTPI1遺
伝子内のユニークKpn I部位で切断し、TPI1コード領域
をBal31エキソヌクレアーゼにより除去し、キナーゼで
処理したEcoR Iリンカー（配列:GGAATTCC）をプロモー
ターの３′末端に付加した。Bgl IIおよびEcoR Iにより
消化して、Bgl IIおよびEcoR I付着末端を有するTPI1プ
ロモーターフラグメントを得た。次に、このフラグメン
トを、Bal IIおよびEcoR Iにより切断されたプラスミド
YRp7′（Stinchcomb他、Nature 282:39〜43,1979）に
連結した。得られたプラスミド、pTE32、をEcoR Iおよ
びBamH Iにより開裂して、テトラサイクリン耐性遺伝子
の一部を除去した。次に、線状プラスミドを、キナーゼ
処理されアニールされたEcoR I-BamH Iアダプター
（５′AAT TCA TGG AG 3′および５′GAT CCT CCA TG
3′）の付加により再環化して、プラスミドpTEA32を生
成した。プラスミドpTEA32をBgl IIおよびEcoR Iにより
消化し、約900bpのTPI1プロモーターフラグメントをゲ
ル精製した。プラスミドpIC19HをBgl IIおよびEcoR Iに
より切断し、ベクターフラグメントをゲル精製した。次
に、TPI1プロモーターフラグメントを線状pIC19Hに連結
し、この混合物を用いてE.コリ株RRIを形質転換した。
プラスミドDNAを調製し、約900bpのBgl II-EcoR Iフラ
グメントの存在についてスクリーニングした。正しいプ
ラスミドを選定し、pICPPIPと表示した。プラスミドpIC
7RI＊をHind IIIおよびNar Iにより消化し、2500bpフラ
グメントをゲル精製した。部分TPI1プロモーターおよび
pICI9Hベクター配列を含む約900bpのフラグメントを、N
ar IおよびSph Iを用いてpICTPIPから取り出し、ゲル精
製した。プラスミドpFATPOTをSph IおよびHind IIIによ
り消化し、TPI1プロモーターの一部、AAT cDNAおよびTP
I1ターミネーターを含む1750bpフラグメントをゲル精製
した。次に、pIC7RI＊フラグメント、TPI1プロモーター
フラグメントおよびpFATPOTからのTPI1プロモーター−A
AT-TPI1ターミネーターフラグメントをいっしょにして
三重連結として、pMVRIを生成した（第１図）。
例２ADH2 プロモーターのサブクローニングおよび修飾 野性型ADH2プロモーターの３′末端にEcoR I部位を付
加し、この修飾プロモーターの３′部分をADH2-4 C プロ
モーターの５′部分といっしょにして、ADH2-4 C プロモ
ーターを構成した。pBR322-ADR2-BSa（Williamson他、
同上）からの野性型ADH2構造遺伝子および５′フランキ
ング配列を含む2.2kb BamH1フラグメントを、BamH Iに
より線状化したM13mp19と連結した。制限酵素分析によ
り挿入部の方向を決定した。部位特異的生体外突然変異
生成（Zoller他、DNA 3:479〜488,1984）を、突然変異
プライマーとしてZC237（表１）を用い、二次プライマ
ーとしてZC87（表１）を用いて、M13mp19中のADH2挿入
部に対して行った。陽性クローンにおいて、オリゴヌク
レオチドZC237が、ADH2遺伝子の構造部分をループアウ
トし、翻訳開始シグナルを含む５′フランキング配列を
M13mp19ポリリンカーのEcoR I部位に融合しせしめた。
突然変異生成ファージの複製型分子DNAを作り、BamHTお
よびEcoR Iにより切断して、1.2kbプロモーターフラグ
メントを単離した。このフラグメントを、BamH Iおよび
EcoR Iにより線状化したpUC13中に連結して、プラスミ
ドp237-Wtを生成した。p237-Wtプロモーターを“promot
or up"突然変異体ADH2-4 C プロモーターに変えるため
に、プロモーター機能に影響を与えることが認められて
いる変形を含む、YRp7-ADR3-4C（Russell他、Nature 3
04:652〜654,1983）からの1.1kb BamH I-Sph Iフラグメ
ントを、BamH IおよびSph Iにより切断したp237-Wtのベ
クターフラグメントにサブクローンした。得られたプラ
スミドをp237-4Cと表示した（第２図）。
加し、この修飾プロモーターの３′部分をADH2-4 C プロ
モーターの５′部分といっしょにして、ADH2-4 C プロモ
ーターを構成した。pBR322-ADR2-BSa（Williamson他、
同上）からの野性型ADH2構造遺伝子および５′フランキ
ング配列を含む2.2kb BamH1フラグメントを、BamH Iに
より線状化したM13mp19と連結した。制限酵素分析によ
り挿入部の方向を決定した。部位特異的生体外突然変異
生成（Zoller他、DNA 3:479〜488,1984）を、突然変異
プライマーとしてZC237（表１）を用い、二次プライマ
ーとしてZC87（表１）を用いて、M13mp19中のADH2挿入
部に対して行った。陽性クローンにおいて、オリゴヌク
レオチドZC237が、ADH2遺伝子の構造部分をループアウ
トし、翻訳開始シグナルを含む５′フランキング配列を
M13mp19ポリリンカーのEcoR I部位に融合しせしめた。
突然変異生成ファージの複製型分子DNAを作り、BamHTお
よびEcoR Iにより切断して、1.2kbプロモーターフラグ
メントを単離した。このフラグメントを、BamH Iおよび
EcoR Iにより線状化したpUC13中に連結して、プラスミ
ドp237-Wtを生成した。p237-Wtプロモーターを“promot
or up"突然変異体ADH2-4 C プロモーターに変えるため
に、プロモーター機能に影響を与えることが認められて
いる変形を含む、YRp7-ADR3-4C（Russell他、Nature 3
04:652〜654,1983）からの1.1kb BamH I-Sph Iフラグメ
ントを、BamH IおよびSph Iにより切断したp237-Wtのベ
クターフラグメントにサブクローンした。得られたプラ
スミドをp237-4Cと表示した（第２図）。
次に、ADH2プロモーターを、プラスミドpAT-1中のAAT
の成熟形の第１アミノ酸のためのコドンに融合した。ブ
ラスミドpAT-1は、プラスミドpMVRIからのα−１−アン
チトリプシンcDNA-TPI1ターミネーター配列に連結され
たp237-WtからのADH2プロモーターの発現単位を含む。
これらの配列を、ベクターpCPOTの部分に挿入した。
（プラスミドpCPOTは、E.コリ株HB101形質転換体として
ATCCに寄託されており、寄託番号39685が付されてい
る。これは、完全２μプラスミドDNA、leu2-d遺伝子、p
BR322配列およびシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosa
ccharomyces pombe）POTI遺伝子を含む）。プラスミドp
CPOTをBamH IおよびSal Iにより切断して、約10kbの線
状ベクターフラグメントを単離した。pMVRI（例１）をE
coR IおよびXho Iにより切断して、1.5kba-1−アンチト
リプシンcDNA-TPI1ターミネーターフラグメントを単離
した。1.2kbADH2プロモーターフラグメントをp237-Wtか
らBamH I-EcoR Iフラグメントとして単離し、1.5kba-1
−アンチトリプシンcDNA-TPI1ターミネーターフラグメ
ントおよび線状化pCPOTにより３部連結により連結し
て、pAT-1と表示するプラスミドを生成した。
の成熟形の第１アミノ酸のためのコドンに融合した。ブ
ラスミドpAT-1は、プラスミドpMVRIからのα−１−アン
チトリプシンcDNA-TPI1ターミネーター配列に連結され
たp237-WtからのADH2プロモーターの発現単位を含む。
これらの配列を、ベクターpCPOTの部分に挿入した。
（プラスミドpCPOTは、E.コリ株HB101形質転換体として
ATCCに寄託されており、寄託番号39685が付されてい
る。これは、完全２μプラスミドDNA、leu2-d遺伝子、p
BR322配列およびシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosa
ccharomyces pombe）POTI遺伝子を含む）。プラスミドp
CPOTをBamH IおよびSal Iにより切断して、約10kbの線
状ベクターフラグメントを単離した。pMVRI（例１）をE
coR IおよびXho Iにより切断して、1.5kba-1−アンチト
リプシンcDNA-TPI1ターミネーターフラグメントを単離
した。1.2kbADH2プロモーターフラグメントをp237-Wtか
らBamH I-EcoR Iフラグメントとして単離し、1.5kba-1
−アンチトリプシンcDNA-TPI1ターミネーターフラグメ
ントおよび線状化pCPOTにより３部連結により連結し
て、pAT-1と表示するプラスミドを生成した。
プラスミドpAT-1は、ADH2翻訳開始コドンとAATの成熟
形のための第１アミノ酸コドンとの間に、３つの余分の
アミノ酸コドンを含んでいた。これらの３つのコドン
を、部位特異的生体外突然変異生成（Zoller他、同上）
により除去した。プラスミドpAT-1をSph IおよびBamH I
により切断して、190bpADH2プロモーターフラグメント
を単離した。このフラグメントをBamH IおよびSp Iによ
り線状化されたM13mp18中に連結した。得られた構造物
を、突然変異プライマーとしてZC411（表１）を用い、
二次プライマーとしてZC87を用いて、生体外突然変異生
成に対して、ADH2翻訳開始シグナルを成熟ａ−１−アン
チトリプシンの第１コドンに融合させた。ATGの上流−1
70bpから始まって融合点までをのジデオキシ法により配
列決定して、陽性クローンを確認した。操作の簡単のた
めに、175bpのSph I-EcoR I突然変異プロモーターフラ
グメントをSph IおよびEcoR Iにより線状化されたpUC19
中に連結した。得られた、ADH2プロモーターの最も３′
側の170bpおよびベクターpUC19中のAATの成熟形の第１
アミノ酸に融合されたADH2翻訳開始を含むプラスミドを
p411と表示した（第３図）。
形のための第１アミノ酸コドンとの間に、３つの余分の
アミノ酸コドンを含んでいた。これらの３つのコドン
を、部位特異的生体外突然変異生成（Zoller他、同上）
により除去した。プラスミドpAT-1をSph IおよびBamH I
により切断して、190bpADH2プロモーターフラグメント
を単離した。このフラグメントをBamH IおよびSp Iによ
り線状化されたM13mp18中に連結した。得られた構造物
を、突然変異プライマーとしてZC411（表１）を用い、
二次プライマーとしてZC87を用いて、生体外突然変異生
成に対して、ADH2翻訳開始シグナルを成熟ａ−１−アン
チトリプシンの第１コドンに融合させた。ATGの上流−1
70bpから始まって融合点までをのジデオキシ法により配
列決定して、陽性クローンを確認した。操作の簡単のた
めに、175bpのSph I-EcoR I突然変異プロモーターフラ
グメントをSph IおよびEcoR Iにより線状化されたpUC19
中に連結した。得られた、ADH2プロモーターの最も３′
側の170bpおよびベクターpUC19中のAATの成熟形の第１
アミノ酸に融合されたADH2翻訳開始を含むプラスミドを
p411と表示した（第３図）。
成熟AATの第１アミノ酸に融合された完全ADH2-4 C プ
ロモーターを生成されるために、プロモーター機能に影
響を与えることがRussell他（同上）により見出されて
いる変形を含むADH2-4 C プロモーターの５′のほとんど
の配列を、プラスミドp411中に存在するプロモーターフ
ラグメントに付加した（第３図）。プラスミドp411をSp
h IおよびEcoR Iにより消化して、175bpプロモーターフ
ラグメントを単離した。プラスミドp237-4CをEcoR Iお
よびSph Iにより切断して、ベクター配列および“promo
tor-up"フェノタイプを与えるほぼ５′のプロモーター
配列を含む3.71kbフラグメントを単離した。p411からの
175bpプロモーターフラグメントをp237-4Cベクターフラ
グメント中に連結した。得られた、成熟AAT配列の第１
アミノ酸コドンに融合された完全ADH2-4 C プロモーター
を含むプラスミドをp237-4CMと表示した。
ロモーターを生成されるために、プロモーター機能に影
響を与えることがRussell他（同上）により見出されて
いる変形を含むADH2-4 C プロモーターの５′のほとんど
の配列を、プラスミドp411中に存在するプロモーターフ
ラグメントに付加した（第３図）。プラスミドp411をSp
h IおよびEcoR Iにより消化して、175bpプロモーターフ
ラグメントを単離した。プラスミドp237-4CをEcoR Iお
よびSph Iにより切断して、ベクター配列および“promo
tor-up"フェノタイプを与えるほぼ５′のプロモーター
配列を含む3.71kbフラグメントを単離した。p411からの
175bpプロモーターフラグメントをp237-4Cベクターフラ
グメント中に連結した。得られた、成熟AAT配列の第１
アミノ酸コドンに融合された完全ADH2-4 C プロモーター
を含むプラスミドをp237-4CMと表示した。
プラスミドpAT-1からのADH2プロモーターを、ADH2翻
訳開始部位およびpAT-1中にみられるpUC18ポリリンカー
配列を除去することにより変形して、「ユニバーサル」
プロモーターを創った（第４図）。プラスミドpAT-1をS
ph IおよびBamH Iにより切断して、190bp部分ADH2プロ
モーターフラグメントを単離した。このフラグメント
を、BamH IおよびSph Iにより線状化したM13mp18中に連
結した。得られた構造物を、突然変異プライマーとして
ZC410（表１）を用い、二次プライマーとしてZC87を用
いて、生体外突然変異生成（Zoller他、同上）に付し
た。ZC410を用いる突然変異生成は、ADH2翻訳開始シグ
ナルおよびpUC18ポリリンカー配列をSma I部位において
M13mp18ポリリンカーに融合された単一EcoR I部位で置
き換える。融点までのジデオキシ法配列決定により陽性
クローンが確認された。操作の簡単のため、突然変異し
た部分的ADH2プロモーターフラグメントを、175bp Sph
I-EcoR Iフラグメントとして、Sph IおよびEcoR Iによ
り線状化されたpUC19中にサブクローン化した。p410ES
と表示した、得られたプラスミドは、ADH2プロモーター
の最も３′側の175bpを含んでいた。p410ESからの部分A
DH2プロモーターフラグメントを用いて、野性型ADH2プ
ロモーターを再生した。プラスミドp410ESをSph Iおよ
びEcoR Iにより消化して、175bpの部分的ADH2プロモー
ターフラグメントを単離した。このフラグメントを、pB
R322-ADR2-BSaから誘導された1kb BamH I-Sph Iフラグ
メントと共に、BamH IおよびEcoR Iによる消化により線
状化したpUC13中に３部分連結により連結した。pBR322-
ADR2-BSaから誘導された1kbフラグメントは、野性型ADH
2プロモーター配列と相同の配列を含んでいた。３部分
連結から得られたプラスミドが、制限分析により確認さ
れ、p410-Wtと表示された。
訳開始部位およびpAT-1中にみられるpUC18ポリリンカー
配列を除去することにより変形して、「ユニバーサル」
プロモーターを創った（第４図）。プラスミドpAT-1をS
ph IおよびBamH Iにより切断して、190bp部分ADH2プロ
モーターフラグメントを単離した。このフラグメント
を、BamH IおよびSph Iにより線状化したM13mp18中に連
結した。得られた構造物を、突然変異プライマーとして
ZC410（表１）を用い、二次プライマーとしてZC87を用
いて、生体外突然変異生成（Zoller他、同上）に付し
た。ZC410を用いる突然変異生成は、ADH2翻訳開始シグ
ナルおよびpUC18ポリリンカー配列をSma I部位において
M13mp18ポリリンカーに融合された単一EcoR I部位で置
き換える。融点までのジデオキシ法配列決定により陽性
クローンが確認された。操作の簡単のため、突然変異し
た部分的ADH2プロモーターフラグメントを、175bp Sph
I-EcoR Iフラグメントとして、Sph IおよびEcoR Iによ
り線状化されたpUC19中にサブクローン化した。p410ES
と表示した、得られたプラスミドは、ADH2プロモーター
の最も３′側の175bpを含んでいた。p410ESからの部分A
DH2プロモーターフラグメントを用いて、野性型ADH2プ
ロモーターを再生した。プラスミドp410ESをSph Iおよ
びEcoR Iにより消化して、175bpの部分的ADH2プロモー
ターフラグメントを単離した。このフラグメントを、pB
R322-ADR2-BSaから誘導された1kb BamH I-Sph Iフラグ
メントと共に、BamH IおよびEcoR Iによる消化により線
状化したpUC13中に３部分連結により連結した。pBR322-
ADR2-BSaから誘導された1kbフラグメントは、野性型ADH
2プロモーター配列と相同の配列を含んでいた。３部分
連結から得られたプラスミドが、制限分析により確認さ
れ、p410-Wtと表示された。
ユニバーサルADH2-4 C プロモーターを、プラスミドP4
10ESからの突然変異したプロモーターフラグメントを用
いて再生した。ADH2 C プロモーターフェノタイプを与え
ることが知られている配列を含む1.1kbフラグメント
を、プラスミドp237-4Cから得た。プラスミドp237-4Cを
BamH IおよびSph Iにより切断して、1.1kbADH2-4 C プロ
モーターフラグメントを単離した。ADH2-4 C プロモータ
ーを、p237-4CからのBamH I-Sph Iプロモーターフラグ
メント、p410ESからのSph I-EcoR I突然変異プロモータ
ーフラグメント、並びにBamH IおよびEcoR Iにより線状
化したpUC13を３元連結により連結して再構成した。得
られたプラスミドは、制限分析により確認され、３′末
端で突然変異生成されて、翻訳開始コドンの代りにEcoR
I部位を配置する完全ADH2-4 C プロモーターを含んでい
た。このプラスミドをp410-4Cと表示した。
10ESからの突然変異したプロモーターフラグメントを用
いて再生した。ADH2 C プロモーターフェノタイプを与え
ることが知られている配列を含む1.1kbフラグメント
を、プラスミドp237-4Cから得た。プラスミドp237-4Cを
BamH IおよびSph Iにより切断して、1.1kbADH2-4 C プロ
モーターフラグメントを単離した。ADH2-4 C プロモータ
ーを、p237-4CからのBamH I-Sph Iプロモーターフラグ
メント、p410ESからのSph I-EcoR I突然変異プロモータ
ーフラグメント、並びにBamH IおよびEcoR Iにより線状
化したpUC13を３元連結により連結して再構成した。得
られたプラスミドは、制限分析により確認され、３′末
端で突然変異生成されて、翻訳開始コドンの代りにEcoR
I部位を配置する完全ADH2-4 C プロモーターを含んでい
た。このプラスミドをp410-4Cと表示した。
プラスミドp410-4Cからの「ユニバーサル」プロモー
ターを用いて、プラスミドpMVRI（例１）中に存在するT
PI1プロモーターを置き換えた。プラスミドp410-4CをBa
mH IおよびEcoR Iにより切断して、1.2kbADH2-4 C プロ
モーターフラグメントを単離した。プラスミドpMVRIをE
coR Iにより完全に消化し、Bgl IIにより部分的に消化
して、4.2kbのATT-TPI1ターミネーターベクターフラグ
メントを単離した。これらの２つのフラグメントを連結
して、pTRK4cと表示したプラスミドを形成した。
ターを用いて、プラスミドpMVRI（例１）中に存在するT
PI1プロモーターを置き換えた。プラスミドp410-4CをBa
mH IおよびEcoR Iにより切断して、1.2kbADH2-4 C プロ
モーターフラグメントを単離した。プラスミドpMVRIをE
coR Iにより完全に消化し、Bgl IIにより部分的に消化
して、4.2kbのATT-TPI1ターミネーターベクターフラグ
メントを単離した。これらの２つのフラグメントを連結
して、pTRK4cと表示したプラスミドを形成した。
例３ 発現ベクターpAT-2,pAT-3,pAT-4およびpAT-6の作製 A.pAT-2の作製 ADH2-4C プロモーター、AAT cDNAおよびTPI1ターミネ
ーターを含んでなる発現ベクターpAT-2は、以下のよう
にして組立てられる（第５図）。プラスミドpCPOTをBam
H IおよびSal Iにより完全に消化し、POT1遺伝子を除去
した。10kbの線状ベクターフラグメントを単離した。AD
H2-4C プロモーターフラグメントをプラスミドp237-4Cよ
り取り出した。プラスミドp237-4CをBamH IおよびEcoR
Iで切断し、翻訳開始コドンへの３′部位にEcoR Iを有
する完全なプロモーターを含む1.2kb ADH2-4C を単離し
た。AAT cDNA-TPI1ターミネーターフラグメントをプラ
スミドpMVR1より1.5kb EcoR I-Xho Iフラグメントとし
て単離した。これらの３種のフラグメントを３元連結で
結合させ、E.Coli株RRIに形質転換した。得られたプラ
スミド制限分析により分析した。pAT-2と名付けられた
正確なプラスミドは、ベクターpCPOT内にADH2-4C プロモ
ーター、AAT cDNAおよびTPI1ターミネーターを含んでな
る。
ーターを含んでなる発現ベクターpAT-2は、以下のよう
にして組立てられる（第５図）。プラスミドpCPOTをBam
H IおよびSal Iにより完全に消化し、POT1遺伝子を除去
した。10kbの線状ベクターフラグメントを単離した。AD
H2-4C プロモーターフラグメントをプラスミドp237-4Cよ
り取り出した。プラスミドp237-4CをBamH IおよびEcoR
Iで切断し、翻訳開始コドンへの３′部位にEcoR Iを有
する完全なプロモーターを含む1.2kb ADH2-4C を単離し
た。AAT cDNA-TPI1ターミネーターフラグメントをプラ
スミドpMVR1より1.5kb EcoR I-Xho Iフラグメントとし
て単離した。これらの３種のフラグメントを３元連結で
結合させ、E.Coli株RRIに形質転換した。得られたプラ
スミド制限分析により分析した。pAT-2と名付けられた
正確なプラスミドは、ベクターpCPOT内にADH2-4C プロモ
ーター、AAT cDNAおよびTPI1ターミネーターを含んでな
る。
B.pAT-3の作製 プラスミドpAT-2中の発現ユニットは、ADH2翻訳開始
と成熟形のAATの第一アミノ酸の間の３個の余分のアミ
ノ酸をコードする。これらの３個のアミノ酸は、プラス
ミドpAT-2に存在するADH2-4C プロモーターをプラスミド
p237-4CMからのADH2-4C プロモーターと置換することに
より除去された（第５図）。プラスミドpAT-2はBamH I
で切断され、α−１−アンチトリプシンcDNA,TPI1ター
ミネーターおよびベクターpCPOTを含んでなる12.4kbベ
クターフラグメントを単離した。このフラグメントを子
牛のアルカリ性ホスファターゼにより処理し、連結の際
の再環化を防いだ。プラスミドp237-4CMをBamH Iで消化
し、ATGに融合したADH2-4C プロモーターおよびAAT cDNA
の第一コドンを含んでなる1.2kbフラグメントを単離し
た。このフラグメントをpAT-2からの線状化フラグメン
トに連結した。ADH2-4C プロモーターの配向は制限分析
により決定され、正確な配向のプロモーターを有するプ
ラスミドをpAT-3と呼ぶ。ATT cDNAに直接融合したADH2-
4C プロモーター、TPI1ターミネーターおよびベクターpC
POTを含んでなるプラスミドpAT-3は、S.セレビシエー
（S.cerevisiae）ZM103の適当な株に形質転された場
合、高プラスミドコピー数を達成するためleu2-d選択シ
ステムを利用する。pAT-3により形質転換されたS.セレ
ビシエーZM103（形質転換体をZM110を称する）はアメリ
カン・タイプ・カルチュアー・コレクションに寄託され
た。
と成熟形のAATの第一アミノ酸の間の３個の余分のアミ
ノ酸をコードする。これらの３個のアミノ酸は、プラス
ミドpAT-2に存在するADH2-4C プロモーターをプラスミド
p237-4CMからのADH2-4C プロモーターと置換することに
より除去された（第５図）。プラスミドpAT-2はBamH I
で切断され、α−１−アンチトリプシンcDNA,TPI1ター
ミネーターおよびベクターpCPOTを含んでなる12.4kbベ
クターフラグメントを単離した。このフラグメントを子
牛のアルカリ性ホスファターゼにより処理し、連結の際
の再環化を防いだ。プラスミドp237-4CMをBamH Iで消化
し、ATGに融合したADH2-4C プロモーターおよびAAT cDNA
の第一コドンを含んでなる1.2kbフラグメントを単離し
た。このフラグメントをpAT-2からの線状化フラグメン
トに連結した。ADH2-4C プロモーターの配向は制限分析
により決定され、正確な配向のプロモーターを有するプ
ラスミドをpAT-3と呼ぶ。ATT cDNAに直接融合したADH2-
4C プロモーター、TPI1ターミネーターおよびベクターpC
POTを含んでなるプラスミドpAT-3は、S.セレビシエー
（S.cerevisiae）ZM103の適当な株に形質転された場
合、高プラスミドコピー数を達成するためleu2-d選択シ
ステムを利用する。pAT-3により形質転換されたS.セレ
ビシエーZM103（形質転換体をZM110を称する）はアメリ
カン・タイプ・カルチュアー・コレクションに寄託され
た。
C.プラスミドpAT-4の作製 ADH2-4C プロモーターATT cDNA発現ユニットをベクタ
ーpTIPに入れ、プラスミドpAT-4を作製した（第６
図）。このベクターpTIPは、E. Coli lacZプロモータ
ーに結合したA.ニドランス（A.nidulans）の tpiA cDN
Aを含んでなり（Mcknightら、Cell、46巻、143〜147
頁、1986年）、S.セレビシエー（S. cerevisiac）にお
けるtpil突然変異を補完する。また、leu2-d選択マーカ
ーも含む。A.ニドランス（A. nidulans）tpiA cDNAはp
UC19中でサブクローン化され（Mcknightら、ibid.）そ
して1.2kb BamH I−部分消化Sst Iフラグメントとして
再単離された。このフラグメントを、Sst IおよびBgl I
Iによる消化によって線状化されたpIC19Rに連結した。
得られたプラスミドpM144を、EcoR Vで線状化し、キナ
ーゼ処理したBamH Iリンカーに連結した。この線状フラ
グメントをSal IおよびBamH Iで切断して過剰のリンカ
ーを除去し、1.2kb tpiA cDNAを単離した。このフラグ
メントを、Sal IおよびBamH Iによる消化により線状化
されたPIC19Rと連結した。得られたプラスミドpM147はp
TIPで用いられるtpiA cDNA用の入手源であった。プラス
ミドpM147をSal IおよびBamH Iで切断し、1.2kb tpiA
cDNAを単離した。プラスミドpCPOTは、２μ配列およびp
BR322配列を含む750bp Sph T-BamH IフラグメントをpBR
322テトラサイクリン耐性遺伝子由来の186bp Sph I-Bam
H Iフラグメントと置換することにより変えられた。得
られたプラスミド、pDPOTをBamH IおよびSal Iで開裂せ
しめ、S.ポンベ（S. pombe)のPOT1遺伝子を除去し、1
0.2kbベクターフラグメントを単離した。これら２種の
フラグメントを互いに連結させ、pTIPと呼ぶプラスミド
を得た。プラスミドpTIPは２μプラスミドの複製開始
点、REP1，REP2及びREP3、E.コリのAmp遺伝子をコード
するpBR322配列、Col El複製開始点並びに欠陥選択性マ
ーカーleu2-d及びtpiAを含んでなり、leu-2選択システ
ムもしくは tpiＡ選択システムのいずれかまたは両方
を用いる高プラスミド複製数の選択を可能にする。
ーpTIPに入れ、プラスミドpAT-4を作製した（第６
図）。このベクターpTIPは、E. Coli lacZプロモータ
ーに結合したA.ニドランス（A.nidulans）の tpiA cDN
Aを含んでなり（Mcknightら、Cell、46巻、143〜147
頁、1986年）、S.セレビシエー（S. cerevisiac）にお
けるtpil突然変異を補完する。また、leu2-d選択マーカ
ーも含む。A.ニドランス（A. nidulans）tpiA cDNAはp
UC19中でサブクローン化され（Mcknightら、ibid.）そ
して1.2kb BamH I−部分消化Sst Iフラグメントとして
再単離された。このフラグメントを、Sst IおよびBgl I
Iによる消化によって線状化されたpIC19Rに連結した。
得られたプラスミドpM144を、EcoR Vで線状化し、キナ
ーゼ処理したBamH Iリンカーに連結した。この線状フラ
グメントをSal IおよびBamH Iで切断して過剰のリンカ
ーを除去し、1.2kb tpiA cDNAを単離した。このフラグ
メントを、Sal IおよびBamH Iによる消化により線状化
されたPIC19Rと連結した。得られたプラスミドpM147はp
TIPで用いられるtpiA cDNA用の入手源であった。プラス
ミドpM147をSal IおよびBamH Iで切断し、1.2kb tpiA
cDNAを単離した。プラスミドpCPOTは、２μ配列およびp
BR322配列を含む750bp Sph T-BamH IフラグメントをpBR
322テトラサイクリン耐性遺伝子由来の186bp Sph I-Bam
H Iフラグメントと置換することにより変えられた。得
られたプラスミド、pDPOTをBamH IおよびSal Iで開裂せ
しめ、S.ポンベ（S. pombe)のPOT1遺伝子を除去し、1
0.2kbベクターフラグメントを単離した。これら２種の
フラグメントを互いに連結させ、pTIPと呼ぶプラスミド
を得た。プラスミドpTIPは２μプラスミドの複製開始
点、REP1，REP2及びREP3、E.コリのAmp遺伝子をコード
するpBR322配列、Col El複製開始点並びに欠陥選択性マ
ーカーleu2-d及びtpiAを含んでなり、leu-2選択システ
ムもしくは tpiＡ選択システムのいずれかまたは両方
を用いる高プラスミド複製数の選択を可能にする。
次いでプラスミドpAT-4を以下のようにして組み立て
た（第６図）。プラスミドpTIPをBamH Iによる消化によ
って線状化し、細菌アルカリ性ホスファターゼにより処
理し、再環化を防いだ。プラスミドpMVR1をEcoR Iおよ
びBgl IIにより消化し、1.5kbα−１−アンチトリプシ
ンcDNA-TP IIターミネーターフラグメントを単離した。
プラスミドp410-4CからのユニバーサルADH2-4C プロモー
ターを1.2kb BamH I-EcoR Iフラグメントとして単離し
た。このフラグメントを1.5kbα−１−アンチトリプシ
ンcDNA-TPI1ターミネーターフラグメントと共に三元連
結により線状化pTIPベクターに結合した。この連結混合
物をE.コリRRI株に形質転換した。
た（第６図）。プラスミドpTIPをBamH Iによる消化によ
って線状化し、細菌アルカリ性ホスファターゼにより処
理し、再環化を防いだ。プラスミドpMVR1をEcoR Iおよ
びBgl IIにより消化し、1.5kbα−１−アンチトリプシ
ンcDNA-TP IIターミネーターフラグメントを単離した。
プラスミドp410-4CからのユニバーサルADH2-4C プロモー
ターを1.2kb BamH I-EcoR Iフラグメントとして単離し
た。このフラグメントを1.5kbα−１−アンチトリプシ
ンcDNA-TPI1ターミネーターフラグメントと共に三元連
結により線状化pTIPベクターに結合した。この連結混合
物をE.コリRRI株に形質転換した。
この形質転換より作られたプラスミドDNAを、制限分
析により分析し、陽性クローンを同定した。このクロー
ンをpAT-4と呼ぶ。
析により分析し、陽性クローンを同定した。このクロー
ンをpAT-4と呼ぶ。
D.プラスミドpAT-6の作製 野性タイプのADH2プロモーターをα−１−アンチトリ
プシンcDNAに融合し、ベクターpTIPに入れプラスミドpA
T-6を得た。プラスミドpTIPをBamT Iにより線状化し、
細菌性ホスファターゼで処理し再環化を防いだ。プラス
ミドpMVR1をBgl IIおよびEcoR Iで消化し、1.5kbα−１
−アンチトリプシンcDNA-TPI1ターミネーターフラグメ
ントを単離した。ユニバーサルADH2プロモーターを1.2k
bBamH I-EcoR Iフラグメントとしてプラスミドp410-Wt
より単離した。このフラグメントを1.5kbα−１−アン
チトリプシンcDNA-TPI1ターミネーターフラグメントと
共に三元連結により線状化pTIPベクターに結合した。こ
の連結混合物をE.コリRRI株に形質転換した。この形質
転換より作られたプラスミドDNAを制限分析により分析
し、陽性クローンを同定した。このクローンをpAT-6と
呼ぶ。
プシンcDNAに融合し、ベクターpTIPに入れプラスミドpA
T-6を得た。プラスミドpTIPをBamT Iにより線状化し、
細菌性ホスファターゼで処理し再環化を防いだ。プラス
ミドpMVR1をBgl IIおよびEcoR Iで消化し、1.5kbα−１
−アンチトリプシンcDNA-TPI1ターミネーターフラグメ
ントを単離した。ユニバーサルADH2プロモーターを1.2k
bBamH I-EcoR Iフラグメントとしてプラスミドp410-Wt
より単離した。このフラグメントを1.5kbα−１−アン
チトリプシンcDNA-TPI1ターミネーターフラグメントと
共に三元連結により線状化pTIPベクターに結合した。こ
の連結混合物をE.コリRRI株に形質転換した。この形質
転換より作られたプラスミドDNAを制限分析により分析
し、陽性クローンを同定した。このクローンをpAT-6と
呼ぶ。
用いたクローン化方針の結果として、pAT-4およびpAT
-6の両方に存在するプロモーター配列は、野性タイプの
配列とATGに対しすぐ５′側で異なる。これらの配列の
変化は、発現レベルを低下させる開始コドンの周囲の配
列をもたらす。発現レベルを最大にするため、これらの
プラスミドをBamH Iで消化し、プロモーター、ATGおよ
び成熟AATの第一コドンを除去する。次に、正確なADH2
‐AAT融合を含んでなるプロモーターフラグメントを置
換する。pAT-4の場合、プラスミドp237-4CMはBamH Iに
より消化され、ADH2-4C プロモーターフラグメントが単
離される。次いでこのプロモーターはBamH I切断pAT-4
に結合され、正確なプロモーターに配向を有するプラス
ミドが選ばれる。
-6の両方に存在するプロモーター配列は、野性タイプの
配列とATGに対しすぐ５′側で異なる。これらの配列の
変化は、発現レベルを低下させる開始コドンの周囲の配
列をもたらす。発現レベルを最大にするため、これらの
プラスミドをBamH Iで消化し、プロモーター、ATGおよ
び成熟AATの第一コドンを除去する。次に、正確なADH2
‐AAT融合を含んでなるプロモーターフラグメントを置
換する。pAT-4の場合、プラスミドp237-4CMはBamH Iに
より消化され、ADH2-4C プロモーターフラグメントが単
離される。次いでこのプロモーターはBamH I切断pAT-4
に結合され、正確なプロモーターに配向を有するプラス
ミドが選ばれる。
例４ 宿主細胞の形質転換およびアルファ−１−アンチトリプ
シンの発現 プラスミドpAT-3およびpAT-4を、当業界において周知
の方法（Beggs,J.D.,同上．、1978年、Hinnenら、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA、75巻、1929〜1933頁、1978年）を
用いて適当な酵母宿主に形質転換した。用いたS.セレビ
シエー株は、遺伝子型pep4であり、内因性２μプラスミ
ドが除去され〔ciro〕にされている。さらに、この株は
プラスミドに存在する欠陥選択マーカーにより補完され
た突然変異を含んでいた。
シンの発現 プラスミドpAT-3およびpAT-4を、当業界において周知
の方法（Beggs,J.D.,同上．、1978年、Hinnenら、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA、75巻、1929〜1933頁、1978年）を
用いて適当な酵母宿主に形質転換した。用いたS.セレビ
シエー株は、遺伝子型pep4であり、内因性２μプラスミ
ドが除去され〔ciro〕にされている。さらに、この株は
プラスミドに存在する欠陥選択マーカーにより補完され
た突然変異を含んでいた。
ベクターpCPOT中でAAT cDNAに融合したADH2-4C プロモ
ーターを含んでなるプラスミドpAT-3がS.セレビシエーZ
M103株(MATa leu2-3，112 ura3 pep5::URA3 bar1 ga
l2〔ciro〕）に形質転換された。形質転換細胞は−LEUD
S（表２）で成長する能力により選択された。
ーターを含んでなるプラスミドpAT-3がS.セレビシエーZ
M103株(MATa leu2-3，112 ura3 pep5::URA3 bar1 ga
l2〔ciro〕）に形質転換された。形質転換細胞は−LEUD
S（表２）で成長する能力により選択された。
表２ −LEUDS プレート 20 g グルコース 6.7 g アミノ酸を含まないイースト窒素ベース（DIFCO
Laboratories,Detroit,Mich.） 40mg アデニン 30mg Ｌ−アルギニン−HCl 50mg Ｌ−アスパラギン酸 20mg Ｌ−ヒスチジンフリーベース 60mg Ｌ−イソロイシン 40mg Ｌ−リジンモノヒドロクロリド 20mg Ｌ−メチオニン 60mg Ｌ−フェニルアラニン 50mg Ｌ−セリン 50mg Ｌ−チロシン 40mg ウラシル 60mg Ｌ−バリン 182 g ソルビトール 18 g 寒天（DIFCO Laboratories） 蒸留水中ですべての成分を混合する。最終体積１リッ
トルとなるよう蒸留水を加える。15分間オートクレーブ
する。オートクレーブした後、150mgのＬ−トリオニン
および40mgのＬ−トリプトファンを加える。プレートに
注ぎ固化する。
Laboratories,Detroit,Mich.） 40mg アデニン 30mg Ｌ−アルギニン−HCl 50mg Ｌ−アスパラギン酸 20mg Ｌ−ヒスチジンフリーベース 60mg Ｌ−イソロイシン 40mg Ｌ−リジンモノヒドロクロリド 20mg Ｌ−メチオニン 60mg Ｌ−フェニルアラニン 50mg Ｌ−セリン 50mg Ｌ−チロシン 40mg ウラシル 60mg Ｌ−バリン 182 g ソルビトール 18 g 寒天（DIFCO Laboratories） 蒸留水中ですべての成分を混合する。最終体積１リッ
トルとなるよう蒸留水を加える。15分間オートクレーブ
する。オートクレーブした後、150mgのＬ−トリオニン
および40mgのＬ−トリプトファンを加える。プレートに
注ぎ固化する。
−LEUD ソルビトールおよび寒天を省略し、−LEUDSプレート
用の方法を用いる。15分間オートクレーブし、オートク
レーブより媒体を除去した後、Ｌ−トレオニンおよびＬ
−トリプトファンを加える。
用の方法を用いる。15分間オートクレーブし、オートク
レーブより媒体を除去した後、Ｌ−トレオニンおよびＬ
−トリプトファンを加える。
MEDA 20 g イーストエキス（DIFCO Laboratories） 5 g 硫酸アンモニウム（Sigma、St.Louis,Mo.） 10ml 100％エタノール 蒸留水中でイーストエキスと硫酸アンモニウムを混合
する。最終体積１リットルとなるよう蒸留水を加える。
25分間オートクレーブを行なう。オートクレーブした
後、媒体を冷却し、10mlの100％EtOHを加える。
する。最終体積１リットルとなるよう蒸留水を加える。
25分間オートクレーブを行なう。オートクレーブした
後、媒体を冷却し、10mlの100％EtOHを加える。
−LEU 1％EtOH グルコースを省略し、−LEUD用の方法を用いる。蒸留
水中ですべての成分を混合する。最終体積１リットルと
なるよう蒸留水を加える。15分間オートクレーブを行な
う。オートクレーブした後、150mgのＬ−トレオニンお
よび40mgのＬ−トリプトファンを加える。媒体を冷却
し、10mlの100％EtOHを加える。
水中ですべての成分を混合する。最終体積１リットルと
なるよう蒸留水を加える。15分間オートクレーブを行な
う。オートクレーブした後、150mgのＬ−トレオニンお
よび40mgのＬ−トリプトファンを加える。媒体を冷却
し、10mlの100％EtOHを加える。
−URADS プレート 20 g グルコース 6.7 g アミノ酸を含まないイースト窒素ベース（DIF
CO Laboratories,Detroit,Mich.） 40mg アデニン 30mg Ｌ−アルギニン−HCl 50mg Ｌ−アスパラギン酸 20mg Ｌ−ヒスチジンフリーベース 60mg Ｌ−イソロイシン 80mg Ｌ−ロイシン 40mg Ｌ−リジンモノヒドロクロリド 20mg Ｌ−メチオニン 60mg Ｌ−フェニルアラニン 50mg Ｌ−セリン 50mg Ｌ−チロシン 60mg Ｌ−バリン 182.2 g ソルビトール 18 g 寒天（DIFCO Laboratories） 蒸留水中ですべての成分を混合する。最終体積１リッ
トルとなるよう蒸留水を加える。15分間オートクレーブ
する。オートクレーブした後、150mgのＬ−トレオニン
および40mgのＬ−トリプトファンを加える。プレートに
注ぎ固化する。
CO Laboratories,Detroit,Mich.） 40mg アデニン 30mg Ｌ−アルギニン−HCl 50mg Ｌ−アスパラギン酸 20mg Ｌ−ヒスチジンフリーベース 60mg Ｌ−イソロイシン 80mg Ｌ−ロイシン 40mg Ｌ−リジンモノヒドロクロリド 20mg Ｌ−メチオニン 60mg Ｌ−フェニルアラニン 50mg Ｌ−セリン 50mg Ｌ−チロシン 60mg Ｌ−バリン 182.2 g ソルビトール 18 g 寒天（DIFCO Laboratories） 蒸留水中ですべての成分を混合する。最終体積１リッ
トルとなるよう蒸留水を加える。15分間オートクレーブ
する。オートクレーブした後、150mgのＬ−トレオニン
および40mgのＬ−トリプトファンを加える。プレートに
注ぎ固化する。
−URAD ソルビトールおよび寒天を省略し、−URADプレート用
の方法を用いる。15分間オートクリーブし、オートクレ
ーブより媒体を除去した後、Ｌ−トレオニンおよびＬ−
トリプトファンを加える。
の方法を用いる。15分間オートクリーブし、オートクレ
ーブより媒体を除去した後、Ｌ−トレオニンおよびＬ−
トリプトファンを加える。
−TRPDS 20 g グルコース 6.7 g アミノ酸を含まないイースト窒素ベース（DIF
CO Laboratories,Detroit,Mich.） 40mg アデニン 30mg Ｌ−アルギニン−HCl 50mg Ｌ−アスパラギン酸 20mg Ｌ−ヒスチジンフリーベース 60mg Ｌ−イソロイシン 80mg Ｌ−ロイシン 40mg Ｌ−リジンモノヒドロクロリド 20mg Ｌ−メチオニン 60mg Ｌ−フェニルアラニン 50mg Ｌ−セリン 50mg Ｌ−チロシン 40mg ウラシル 60mg Ｌ−バリン 182.2 g ソルビトール 18 g 寒天（DIFCO Laboratories） 蒸留水中ですべての成分を混合する。最終体積１リッ
トルとなるよう蒸留水を加える。15分間オートクレーブ
する。オートクレーブした後、150mgのトレオニンを加
える。プレートに注ぎ固化させる。
CO Laboratories,Detroit,Mich.） 40mg アデニン 30mg Ｌ−アルギニン−HCl 50mg Ｌ−アスパラギン酸 20mg Ｌ−ヒスチジンフリーベース 60mg Ｌ−イソロイシン 80mg Ｌ−ロイシン 40mg Ｌ−リジンモノヒドロクロリド 20mg Ｌ−メチオニン 60mg Ｌ−フェニルアラニン 50mg Ｌ−セリン 50mg Ｌ−チロシン 40mg ウラシル 60mg Ｌ−バリン 182.2 g ソルビトール 18 g 寒天（DIFCO Laboratories） 蒸留水中ですべての成分を混合する。最終体積１リッ
トルとなるよう蒸留水を加える。15分間オートクレーブ
する。オートクレーブした後、150mgのトレオニンを加
える。プレートに注ぎ固化させる。
YEPD 20g グルコース 10g イーストエキス（DIFCO） 20g ペプトン（DIFCO） 蒸留水中ですべての成分を混合する。最終体積１リッ
トルとなるよう蒸留水を加える。25分間オートクレーブ
を行なう。
トルとなるよう蒸留水を加える。25分間オートクレーブ
を行なう。
ZM103株内のpAT-3プラスミドからのAATの発現は、ま
ず10mlの−LEUD（表２）内で30℃において一晩形質転換
細胞を増殖させることにより得られた。これは、pAT-3
上に位置するleu2-d遺伝子の弱い補完についての選択に
より、プラズミドが高複製数を達成しそして保持するこ
とを可能にする。この細胞をペレットにし、スペント培
地を捨てた。細胞を再びMEDA（表２）に懸濁し、30℃で
48時間細胞を培養することによってAATの発現を引き起
した。唯一の炭素源としてMEDA中に存在するエタノール
は、ADH2-4C プロモーターを抑制解除し、AATの発現を増
加させる。この方法を用いて、全細胞蛋白の30％のAAT
を検出した。
ず10mlの−LEUD（表２）内で30℃において一晩形質転換
細胞を増殖させることにより得られた。これは、pAT-3
上に位置するleu2-d遺伝子の弱い補完についての選択に
より、プラズミドが高複製数を達成しそして保持するこ
とを可能にする。この細胞をペレットにし、スペント培
地を捨てた。細胞を再びMEDA（表２）に懸濁し、30℃で
48時間細胞を培養することによってAATの発現を引き起
した。唯一の炭素源としてMEDA中に存在するエタノール
は、ADH2-4C プロモーターを抑制解除し、AATの発現を増
加させる。この方法を用いて、全細胞蛋白の30％のAAT
を検出した。
ベクターpTIP中にAAT cDNAに融合したADH2-4C プロモ
ーターを含んでなるプラスミドpAT-4をS.セレビシエーZ
M115株(MATa ade2-101 leu2-3,112 ura3 gal2 Δpe
p4::TPI1-CAT tpil::URA3 〔ciro〕）に形質転換し
た。−LEUDSにおいて増殖する能力により形質転換細胞
を選択した。
ーターを含んでなるプラスミドpAT-4をS.セレビシエーZ
M115株(MATa ade2-101 leu2-3,112 ura3 gal2 Δpe
p4::TPI1-CAT tpil::URA3 〔ciro〕）に形質転換し
た。−LEUDSにおいて増殖する能力により形質転換細胞
を選択した。
ZM115株におけるpAT-4プラスミドからのAATの発現
は、まず25mlの−LEUD中で30℃で一晩形質転換細胞を増
殖させることにより得られた。これは、leu2-dおよびpA
T-4上に位置するlacZ-tpiA発現ユニットの弱い補完の二
重選択を用いることによりプラスミドが高複製数を達成
しそして保持することを可能にする。AAT発現は、培養
物を30℃で40時間、25mlの−LEU 1％EtOH（表２）中に
1:50で稀釈することにより引き起された。唯一の炭素源
として培地中に存在するエタノールはADH2-4 Cプロモー
ターを抑制解除し、AATの発現を増大させる。
は、まず25mlの−LEUD中で30℃で一晩形質転換細胞を増
殖させることにより得られた。これは、leu2-dおよびpA
T-4上に位置するlacZ-tpiA発現ユニットの弱い補完の二
重選択を用いることによりプラスミドが高複製数を達成
しそして保持することを可能にする。AAT発現は、培養
物を30℃で40時間、25mlの−LEU 1％EtOH（表２）中に
1:50で稀釈することにより引き起された。唯一の炭素源
として培地中に存在するエタノールはADH2-4 Cプロモー
ターを抑制解除し、AATの発現を増大させる。
例５ AATアッセイの説明 A.エンザイムリンクトイミノソルベントアッセイ（ELIS
A） 前セクションで述べたようにして、適切に増殖した細
胞を遠心してペレット化し、スペント培地を捨てた。細
胞をペレットにし、蒸留水で洗浄した。洗浄したペレッ
トをアッセイする前に−80℃で凍結した。ガラスビーズ
粗溶解物を、この凍結細胞ペレットより製造した。洗浄
した細胞ペレットを氷上で溶かし、等量の燐酸緩衝化塩
水（PBS.Sigma.St.Louis,Mo.）に稀釈した。ガラスビー
ズ（450〜500μｍ）を全体積の半分まで加えた。この混
合物をフルスピードで１分間、３回撹拌し、その間氷で
サンプルを冷却した。50ml以上のサンプルを同様に処理
し、Bead Beater（Biospec Products,Hartlesville）内
で細胞を溶解した。撹拌の間、より多い体積をエタノー
ル氷浴で冷却した。パスツールピペットでチューブから
液体を取り出し、ミクロフューズチューブに移した。ガ
ラスビーズを１回最初の体積のPBSで洗浄した。このビ
ーズを１分間撹拌し、パスツールピペットで液体を取り
出し、最初の溶解物と一緒にプールした。この溶解物を
エッペンドルフミクロフューズで５分間最高スピードで
遠心した。上澄をアッセイ用に注意深くとり出した。
A） 前セクションで述べたようにして、適切に増殖した細
胞を遠心してペレット化し、スペント培地を捨てた。細
胞をペレットにし、蒸留水で洗浄した。洗浄したペレッ
トをアッセイする前に−80℃で凍結した。ガラスビーズ
粗溶解物を、この凍結細胞ペレットより製造した。洗浄
した細胞ペレットを氷上で溶かし、等量の燐酸緩衝化塩
水（PBS.Sigma.St.Louis,Mo.）に稀釈した。ガラスビー
ズ（450〜500μｍ）を全体積の半分まで加えた。この混
合物をフルスピードで１分間、３回撹拌し、その間氷で
サンプルを冷却した。50ml以上のサンプルを同様に処理
し、Bead Beater（Biospec Products,Hartlesville）内
で細胞を溶解した。撹拌の間、より多い体積をエタノー
ル氷浴で冷却した。パスツールピペットでチューブから
液体を取り出し、ミクロフューズチューブに移した。ガ
ラスビーズを１回最初の体積のPBSで洗浄した。このビ
ーズを１分間撹拌し、パスツールピペットで液体を取り
出し、最初の溶解物と一緒にプールした。この溶解物を
エッペンドルフミクロフューズで５分間最高スピードで
遠心した。上澄をアッセイ用に注意深くとり出した。
まずミクロタイタープレートのウェルに抗体を付着さ
せることにより二重抗体ELISAを開始した。ヒトα−１
−アンチトリプシンカラムで精製したウサギ抗−α−１
−アンチトリプシン（Calbiochem）を0.1M Na2CO3,pH
9.7で５μg/mlに稀釈した。500μｇの抗体を各ウェルに
加え、この混合物を４℃で一晩インキュベートした。２
回、バッファーＣ（PBS＋0.5％ツウィーン20＋0.05％Na
N3＋１％牛血清アルブミン）で洗浄することにより、過
剰の抗体を除去した。標準およびサンプルをバッファー
Ｂで２倍に稀釈した。100μｌの各サンプルをウェルに
加え、37℃で１時間インキュベートした。未結合の物質
を３回バッファーＣで洗浄することにより除去した。ビ
オチン結合マウスモノクローナル抗−α−１−アンチト
リプシンFabを、バッファーＢで１μg/mlに稀釈した。1
00μｌのビオチン結合マウス抗−α−１−アンチトリプ
シンFabを各ウェルに加え、37℃で１時間インキュベー
トした。バッファーＣで３回洗浄することにより過剰の
Fabを除去した。アビジンアルカリ性ホスファターゼ（B
oehringer Mannheim,Indianapolis,Indiana）をバッフ
ァーＢで1:2500に稀釈し、100μｌを各ウェルに加え
た。混合物を37℃で１時間インキュベートし、過剰のア
ビジン−アルカリ性ホスファターゼをバッファーＣで３
回洗浄し除去した。Sigmaホスファターゼ基質をバッフ
ァーＤ（96mlのジエタノールアミン＋56mgのMgCl2を含
み、pH9.8に調節した１の蒸留水）で0.6mg/mlに稀釈
した。100μｌの基質を各ウェルに加え、室温で15〜30
分間、あるいは色が形成するまでインキュベートした。
上澄の405nmにおける吸収を測定し、標準曲線に対し濃
度を決定した。酵母溶解物の全可溶性蛋白濃度をローリ
ー（Lowry）らの方法により測定した。α−１−アンチ
トリプシンの量は、全可溶性蛋白のパーセントとして表
わした。
せることにより二重抗体ELISAを開始した。ヒトα−１
−アンチトリプシンカラムで精製したウサギ抗−α−１
−アンチトリプシン（Calbiochem）を0.1M Na2CO3,pH
9.7で５μg/mlに稀釈した。500μｇの抗体を各ウェルに
加え、この混合物を４℃で一晩インキュベートした。２
回、バッファーＣ（PBS＋0.5％ツウィーン20＋0.05％Na
N3＋１％牛血清アルブミン）で洗浄することにより、過
剰の抗体を除去した。標準およびサンプルをバッファー
Ｂで２倍に稀釈した。100μｌの各サンプルをウェルに
加え、37℃で１時間インキュベートした。未結合の物質
を３回バッファーＣで洗浄することにより除去した。ビ
オチン結合マウスモノクローナル抗−α−１−アンチト
リプシンFabを、バッファーＢで１μg/mlに稀釈した。1
00μｌのビオチン結合マウス抗−α−１−アンチトリプ
シンFabを各ウェルに加え、37℃で１時間インキュベー
トした。バッファーＣで３回洗浄することにより過剰の
Fabを除去した。アビジンアルカリ性ホスファターゼ（B
oehringer Mannheim,Indianapolis,Indiana）をバッフ
ァーＢで1:2500に稀釈し、100μｌを各ウェルに加え
た。混合物を37℃で１時間インキュベートし、過剰のア
ビジン−アルカリ性ホスファターゼをバッファーＣで３
回洗浄し除去した。Sigmaホスファターゼ基質をバッフ
ァーＤ（96mlのジエタノールアミン＋56mgのMgCl2を含
み、pH9.8に調節した１の蒸留水）で0.6mg/mlに稀釈
した。100μｌの基質を各ウェルに加え、室温で15〜30
分間、あるいは色が形成するまでインキュベートした。
上澄の405nmにおける吸収を測定し、標準曲線に対し濃
度を決定した。酵母溶解物の全可溶性蛋白濃度をローリ
ー（Lowry）らの方法により測定した。α−１−アンチ
トリプシンの量は、全可溶性蛋白のパーセントとして表
わした。
B.生物活性アッセイ α−１−アンチトリプシン活性を定性的に示すため、
エラスターゼ結合アッセイを、このサンプルに対し行っ
た。ELISAにより測定されたα−１−アンチトリプシン
を含むサンプルを、全50μｌのTNE（0.02M Tris pH8、
0.05M NaCl、1mM EDTA）中で１μｇエラスターゼ:4μｇ
α−１−抗トリプシンの比でエラスターゼと混合した。
この混合物を45分間氷上でインキュベートし、次いで沸
騰水浴中で３分間加熱した。このサンプルを10％アクリ
ルアミドにのせ、Towbin記載の方法（Proc.Natl.Acad.S
ci.USA、76巻、4350頁、1979年）を用いニトロセルロー
スに移した。α−１−アンチトリプシンサンプルを可視
化するため、精製したウサギ抗−α−１−アンチトリプ
シン、ホースラディシュペルオキシダーゼに結合したヤ
ギ抗−ウサギ、および発色試薬（BioRad HRP Color Dev
elopment Reagent）を用いた。活性α−１−アンチトリ
プシンを含むサンプルはエラスターゼと複合体を形成
し、10％ポリアクリルアミドゲル内をゆっくり泳動す
る。
エラスターゼ結合アッセイを、このサンプルに対し行っ
た。ELISAにより測定されたα−１−アンチトリプシン
を含むサンプルを、全50μｌのTNE（0.02M Tris pH8、
0.05M NaCl、1mM EDTA）中で１μｇエラスターゼ:4μｇ
α−１−抗トリプシンの比でエラスターゼと混合した。
この混合物を45分間氷上でインキュベートし、次いで沸
騰水浴中で３分間加熱した。このサンプルを10％アクリ
ルアミドにのせ、Towbin記載の方法（Proc.Natl.Acad.S
ci.USA、76巻、4350頁、1979年）を用いニトロセルロー
スに移した。α−１−アンチトリプシンサンプルを可視
化するため、精製したウサギ抗−α−１−アンチトリプ
シン、ホースラディシュペルオキシダーゼに結合したヤ
ギ抗−ウサギ、および発色試薬（BioRad HRP Color Dev
elopment Reagent）を用いた。活性α−１−アンチトリ
プシンを含むサンプルはエラスターゼと複合体を形成
し、10％ポリアクリルアミドゲル内をゆっくり泳動す
る。
例６ ヒトX III因子のａサブユニットをコードするcDNAのク
ローニング A.ヒトX III因子のａサブユニットをコードするcDNAの
クローニング ヒト胎盤mRNAより調製したcDNAを含むλgt11発現ライ
ブラリーをヒトX III因子のａサブユニットについてス
クリーニングした。125Iラベルしたアフィニティー精製
ウサギ抗体（比活性＝６×106cpm/μｇ）を、150mmプレ
ートあたり1.5×105プラークの密度でのせたファージを
含むフィルターをスクリーニングするため用いた。ほぼ
３×106のファージをスクリーニングすることにより、
６種の陽性クローンを単離し、各陽性ファージをフラー
ク精製した。
ローニング A.ヒトX III因子のａサブユニットをコードするcDNAの
クローニング ヒト胎盤mRNAより調製したcDNAを含むλgt11発現ライ
ブラリーをヒトX III因子のａサブユニットについてス
クリーニングした。125Iラベルしたアフィニティー精製
ウサギ抗体（比活性＝６×106cpm/μｇ）を、150mmプレ
ートあたり1.5×105プラークの密度でのせたファージを
含むフィルターをスクリーニングするため用いた。ほぼ
３×106のファージをスクリーニングすることにより、
６種の陽性クローンを単離し、各陽性ファージをフラー
ク精製した。
プラーク精製クローンを32P−ラベルオリゴヌクレオ
チドプローブ:5′CTC CAC GGT GGG CAG GTC GTC CTC G
3′でスクリーニングした。これはａサブユニットの活
性化ペプチドに存在するアミノ酸配列Ala-Glu-Asp-Asp-
Leu-Pro-Thr-Val-Gluのコードをプローブする（Takagi
およびDoolittle、Biochem.J.、13巻、750〜756頁、197
4年）。このプローブのヌクレオチド配列は、多くの異
なるヒト蛋白のアミノ酸に最も一般的なコドンを用いる
ことにより選択された（ChenおよびBarker、Trends in
Genetics、１巻、221〜223頁、1985年）。このオリゴヌ
クレオチドは、1.1×108cpm/μｇの比活性に32Pにより
ラベルされた。
チドプローブ:5′CTC CAC GGT GGG CAG GTC GTC CTC G
3′でスクリーニングした。これはａサブユニットの活
性化ペプチドに存在するアミノ酸配列Ala-Glu-Asp-Asp-
Leu-Pro-Thr-Val-Gluのコードをプローブする（Takagi
およびDoolittle、Biochem.J.、13巻、750〜756頁、197
4年）。このプローブのヌクレオチド配列は、多くの異
なるヒト蛋白のアミノ酸に最も一般的なコドンを用いる
ことにより選択された（ChenおよびBarker、Trends in
Genetics、１巻、221〜223頁、1985年）。このオリゴヌ
クレオチドは、1.1×108cpm/μｇの比活性に32Pにより
ラベルされた。
B.cDNA挿入部のDNA配列 ファージDNAを、液体培養溶解法（T.J.Silhavyら、Ex
periments with Gene Fusions CSH Laboratory,N.Y.、1
40〜141頁、1984年）により、続いて遠心および塩化セ
シウム段階勾配によってバンド化することにより、陽性
クローンから調製した。cDNA挿入部はEcoR Iエンドヌク
レアーゼによるファージDNAの消化により単離され、各
挿入部の５′末端および３′末端が配列決定された。大
きなcDNA挿入部を有するクローンの１つ（λ HF X IIIa
3.77,ATCC No.40261）は、さらに配列分析用に選択され
た。この挿入部は３種の内部EcoR Iサイトを含み、EcoR
IによるファージDNAの消化の際に４種のcDNAフラグメ
ントを生じさせる。これらのフラグメントおよび多くの
追加の制限フラグメントが、プラスミドpUC9あるいはpU
C19にサブクローン化された。cDNA挿入部からの他の追
加の制限フラグメントは、異なった配列を得るためM13m
p10,M13mp11,M13mp18、あるいはM13mp19にサブクローン
された。次いでこのcDNA挿入部は、〔α35S〕dATPおよ
びバッファー勾配ゲル（Bigginら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、80巻、3963〜3965頁、1983年）を用いるジデオ
キシ法（Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74巻、54
63〜5467頁、1977年）により配列決定された。ヌクレア
ーゼBAL-31による消化は、EcoR I制限フラグメントによ
る重複配列を提供する５種の追加フラグメントを発生さ
せるため行なわれた。
periments with Gene Fusions CSH Laboratory,N.Y.、1
40〜141頁、1984年）により、続いて遠心および塩化セ
シウム段階勾配によってバンド化することにより、陽性
クローンから調製した。cDNA挿入部はEcoR Iエンドヌク
レアーゼによるファージDNAの消化により単離され、各
挿入部の５′末端および３′末端が配列決定された。大
きなcDNA挿入部を有するクローンの１つ（λ HF X IIIa
3.77,ATCC No.40261）は、さらに配列分析用に選択され
た。この挿入部は３種の内部EcoR Iサイトを含み、EcoR
IによるファージDNAの消化の際に４種のcDNAフラグメ
ントを生じさせる。これらのフラグメントおよび多くの
追加の制限フラグメントが、プラスミドpUC9あるいはpU
C19にサブクローン化された。cDNA挿入部からの他の追
加の制限フラグメントは、異なった配列を得るためM13m
p10,M13mp11,M13mp18、あるいはM13mp19にサブクローン
された。次いでこのcDNA挿入部は、〔α35S〕dATPおよ
びバッファー勾配ゲル（Bigginら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、80巻、3963〜3965頁、1983年）を用いるジデオ
キシ法（Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74巻、54
63〜5467頁、1977年）により配列決定された。ヌクレア
ーゼBAL-31による消化は、EcoR I制限フラグメントによ
る重複配列を提供する５種の追加フラグメントを発生さ
せるため行なわれた。
これらの重復クローンからの3831ベースペアーの配列
は、血中を循環するヒトX III因子のａサブユニットの
完全なアミノ酸配列をコードする。このａサブユニット
は731個のアミノ酸よりなり、Ser-Glu-Thr-Serのアミノ
末端配列で始まる。このアミノ末端配列は、以前Takagi
およびDoolittle（前掲）により報告された。このカル
ボキシル末端Met（ヌクレオチド2281〜2283）に続き、
停止コドン（TGA）、1535ベースペアーの非コード配
列、および潜在ポリアデニル化あるいはプロセシングシ
グナルAATAAAが存在する。ポリアデニル化配列は、10個
のヌクレオチドのポリ（Ａ）末端から14ヌクレオチド上
流に位置した。このポリ（Ａ）末端は、第二のcDNAクロ
ーンにおいてのみ存在し、これをλ HF X III a3.82と
呼ぶ。
は、血中を循環するヒトX III因子のａサブユニットの
完全なアミノ酸配列をコードする。このａサブユニット
は731個のアミノ酸よりなり、Ser-Glu-Thr-Serのアミノ
末端配列で始まる。このアミノ末端配列は、以前Takagi
およびDoolittle（前掲）により報告された。このカル
ボキシル末端Met（ヌクレオチド2281〜2283）に続き、
停止コドン（TGA）、1535ベースペアーの非コード配
列、および潜在ポリアデニル化あるいはプロセシングシ
グナルAATAAAが存在する。ポリアデニル化配列は、10個
のヌクレオチドのポリ（Ａ）末端から14ヌクレオチド上
流に位置した。このポリ（Ａ）末端は、第二のcDNAクロ
ーンにおいてのみ存在し、これをλ HF X III a3.82と
呼ぶ。
λ HFF X III a3.77内のcDNA挿入部も、フレーム内配
列をコードすると考えられる30個のアミノ酸残基をコー
ドする。成熟X III因子を得るためのMetとSerの間の結
合の開裂は、アミノ末端Serを有する成熟蛋白を得るた
め追加プロセシングプロテアーゼを必要とする。これは
に続きアセチル化反応が起こり、成熟蛋白のアミノ末端
においてアセチル−セリンを形成する（TakagiおよびDo
olittle,ibid;Nakamuraら、J.Biochem.、78巻、1247〜1
266頁、1975年）。
列をコードすると考えられる30個のアミノ酸残基をコー
ドする。成熟X III因子を得るためのMetとSerの間の結
合の開裂は、アミノ末端Serを有する成熟蛋白を得るた
め追加プロセシングプロテアーゼを必要とする。これは
に続きアセチル化反応が起こり、成熟蛋白のアミノ末端
においてアセチル−セリンを形成する（TakagiおよびDo
olittle,ibid;Nakamuraら、J.Biochem.、78巻、1247〜1
266頁、1975年）。
重復配列が得られた部位でcDNA挿入部の比較が行なわ
れた場合、X III因子のａサブユニットのヌクレオチド
配列の違いが３か所で発見された。λ HF X III a3.77
において、ヌクレオチド2038,2041および2727は、それ
ぞれA,C、およびＴを含み、一方同じ位置においてλ HF
X III a3.82はG,C、およびＡを含んでいた。これらの
違いは、２種のアミノ酸が変化する結果となり（Valお
よびGluに対しIle650およびGln651）、X III因子のａサ
ブユニットにおけるミクロ不均１性に寄与する多型現象
を表わす（BoardおよびCoggan,Hum. Genet.、59巻、13
5〜136頁、1981年）。
れた場合、X III因子のａサブユニットのヌクレオチド
配列の違いが３か所で発見された。λ HF X III a3.77
において、ヌクレオチド2038,2041および2727は、それ
ぞれA,C、およびＴを含み、一方同じ位置においてλ HF
X III a3.82はG,C、およびＡを含んでいた。これらの
違いは、２種のアミノ酸が変化する結果となり（Valお
よびGluに対しIle650およびGln651）、X III因子のａサ
ブユニットにおけるミクロ不均１性に寄与する多型現象
を表わす（BoardおよびCoggan,Hum. Genet.、59巻、13
5〜136頁、1981年）。
例７ X III因子ａサブユニット発現ユニットの作成 A.pRS202の作成 X III因子ａサブユニット（asFX III）cDNAをinvitro
で突然変異を起こすことにより改変し、３′非コード部
位をXho Iサイトで置換した。取扱を容易にするため、
ファージクローンλ HF X III a3.82に含まれる3.8kb a
sF X III cDNA挿入部をpUC18にサブクローン化した。フ
ァージクローンλ HF X III a3.82はPst Iにより完全に
消化され、asF X III cDNAを含んでなる2.3kbフラグメ
ントが単離された。このフラグメントはPst Iによる消
化により線状化されたpUC18に連結される。得られるプ
ラスミド、pCU18＃９は、アンチセンス（anti-sense）
方向に2.3kb Pst I挿入部を有することが決定された。p
UC18＃９に存在するasF X III cDNA挿入は、翻訳開始部
の５′側19bp、asF X IIIコード領域および翻訳停止部
の５′側120bpを含んでなる。
で突然変異を起こすことにより改変し、３′非コード部
位をXho Iサイトで置換した。取扱を容易にするため、
ファージクローンλ HF X III a3.82に含まれる3.8kb a
sF X III cDNA挿入部をpUC18にサブクローン化した。フ
ァージクローンλ HF X III a3.82はPst Iにより完全に
消化され、asF X III cDNAを含んでなる2.3kbフラグメ
ントが単離された。このフラグメントはPst Iによる消
化により線状化されたpUC18に連結される。得られるプ
ラスミド、pCU18＃９は、アンチセンス（anti-sense）
方向に2.3kb Pst I挿入部を有することが決定された。p
UC18＃９に存在するasF X III cDNA挿入は、翻訳開始部
の５′側19bp、asF X IIIコード領域および翻訳停止部
の５′側120bpを含んでなる。
asF X III cDNA挿入部を単離し、ベクターpUC118（J.
VieiraおよびJ.Messing,Waksman institute of Microbi
ology,Rutgers,Piscataway,N.J.より入手）ヘサブクロ
ーン化した。2.3kb asF X III挿入部を、Pst Iによる消
化によりpUC18＃９より単離し、pUC118 Pst Iサイトに
サブクローンし、E.Coli.JM109株に形質転換した。アン
チセンス方向に2.3kb asF X III挿入部を含む陽性クロ
ーンをpRS201と呼んだ。
VieiraおよびJ.Messing,Waksman institute of Microbi
ology,Rutgers,Piscataway,N.J.より入手）ヘサブクロ
ーン化した。2.3kb asF X III挿入部を、Pst Iによる消
化によりpUC18＃９より単離し、pUC118 Pst Iサイトに
サブクローンし、E.Coli.JM109株に形質転換した。アン
チセンス方向に2.3kb asF X III挿入部を含む陽性クロ
ーンをpRS201と呼んだ。
asF X III cDNAの３′未翻訳領域の120bpを除去し、X
hoサイトを、部位特定突然変異により翻訳停止コドンの
３′側に挿入した。プラスミドpRS201をE.コリ株MVI193
に形質転換し、一重鎖鋳型DNAを単離した。オリゴヌク
レオチドZC1113（表１）を、asF X IIIコード配列に続
く３′非翻訳領域を除去し、翻訳停止部の３′側にXho
Iサイトを挿入するため設計した。一重鎖鋳型pRS201
に、突然変異を起こすオリゴヌクレオチドZC1113を用い
るZollerらの方法（ibid、1984年）によりin vitro突
然変異を起こした。制限分析により確認された陽性クロ
ーンをpRS202と呼んだ。
hoサイトを、部位特定突然変異により翻訳停止コドンの
３′側に挿入した。プラスミドpRS201をE.コリ株MVI193
に形質転換し、一重鎖鋳型DNAを単離した。オリゴヌク
レオチドZC1113（表１）を、asF X IIIコード配列に続
く３′非翻訳領域を除去し、翻訳停止部の３′側にXho
Iサイトを挿入するため設計した。一重鎖鋳型pRS201
に、突然変異を起こすオリゴヌクレオチドZC1113を用い
るZollerらの方法（ibid、1984年）によりin vitro突
然変異を起こした。制限分析により確認された陽性クロ
ーンをpRS202と呼んだ。
B.プラスミドpRS215の作製 プラスミドpRS202からの2.2kb asF X III cDNAフラグ
メントをADH2-4C プロモーターの後に入れ、そしてプラ
スミドpIC7RI＊に入れた。プラスミドpTRK4C（例２）を
EcoR IおよびSal Iにより完全に消化し、ADH2-4C プロモ
ーター、TPI1ターミネーターおよびpIC7RI＊ベクター配
列を含んでなる4kbフラグメントを単離した。オリゴヌ
クレオチドZC1056およびZC1057（表１）を、EcoR I付着
末端、Bgl IIサイトおよびPst I付着末端を有するアダ
プターを形成するように設計した。このアダプターのEc
oR I付着末端は、他のEcoR I付着末端に連結した際に、
EcoR Iサイトを破壊する。オリゴヌクレオチドZC1056お
よびZC1057は、キナーゼされ、そしてアニールされ、Ec
oR Iアダプターを形成する。プラスミドpRS202より単離
された2.2kb Pst I-Xho I asF X IIIフラグメントは、
三元連結でZC1056/ZC1057アダプターおよび4kb pTRK4c
フラグメントと結合した。得られるプラスミドをpRS215
と呼んだ。
メントをADH2-4C プロモーターの後に入れ、そしてプラ
スミドpIC7RI＊に入れた。プラスミドpTRK4C（例２）を
EcoR IおよびSal Iにより完全に消化し、ADH2-4C プロモ
ーター、TPI1ターミネーターおよびpIC7RI＊ベクター配
列を含んでなる4kbフラグメントを単離した。オリゴヌ
クレオチドZC1056およびZC1057（表１）を、EcoR I付着
末端、Bgl IIサイトおよびPst I付着末端を有するアダ
プターを形成するように設計した。このアダプターのEc
oR I付着末端は、他のEcoR I付着末端に連結した際に、
EcoR Iサイトを破壊する。オリゴヌクレオチドZC1056お
よびZC1057は、キナーゼされ、そしてアニールされ、Ec
oR Iアダプターを形成する。プラスミドpRS202より単離
された2.2kb Pst I-Xho I asF X IIIフラグメントは、
三元連結でZC1056/ZC1057アダプターおよび4kb pTRK4c
フラグメントと結合した。得られるプラスミドをpRS215
と呼んだ。
例８ 酵母におけるファクターX III aサブユニットの発現 A.ベクターpEAS102の構築 ベクターYIpSおよびpJDB207の一部を含んでなるプラ
スミドpEAS102は、以下のように構築した。pJDB219（J.
D.Beggs,Nature 275:104-108,1978）の誘導体、プラス
ミドpJDB207（Beggs,Proceedings of Alfred Benzon Sy
mposium 16:383-389,“Molecular Genetics in Yeas
t",Copenhagen,Denmark,1981）をBamH I及びPst Iによ
り消化し、leu2-d遺伝子、２μDNA及びpBR322配列を含
んでなる4.4kb断片を単離した。
スミドpEAS102は、以下のように構築した。pJDB219（J.
D.Beggs,Nature 275:104-108,1978）の誘導体、プラス
ミドpJDB207（Beggs,Proceedings of Alfred Benzon Sy
mposium 16:383-389,“Molecular Genetics in Yeas
t",Copenhagen,Denmark,1981）をBamH I及びPst Iによ
り消化し、leu2-d遺伝子、２μDNA及びpBR322配列を含
んでなる4.4kb断片を単離した。
プラスミドYIp5（Struhlら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
76:1035-1039,1979）をPst Iで部分消化し、そしてBa
mH Iで完全消化してURA3遺伝子及びpBR322配列を含んで
なる4.3kb断片を単離した。これらの２つの断片が連結
されそして得られたプラスミドをpEAS102と命名した。
76:1035-1039,1979）をPst Iで部分消化し、そしてBa
mH Iで完全消化してURA3遺伝子及びpBR322配列を含んで
なる4.3kb断片を単離した。これらの２つの断片が連結
されそして得られたプラスミドをpEAS102と命名した。
B.プラスミドpRS217の構築 ADH2-4Cプロモーター、asF X III cDNA,TPI1ターミネ
ーター及びpEAS102ベクター配列を含んでなる酵母発現
ベクターが構築された。プラスミドpRS217は以下のよう
に構築した。pRS215（例７）中に存在する発現ユニット
が酵母ベクターpEAS102中に導入された。プラスミドpEA
S102はHind IIIにより完全消化され、その後再環化を妨
げるために細菌性アルカリフォスファターゼで処理し
た。プラスミドpRS215をHind IIIで消化し、ASH2-4Cプ
ロモーター、asF X III cDNA及びTPI1ターミネーターを
含んでなる3.5kb発現ユニットが単離された。これらの
２つの断片を一緒に連結しそしてプラスミドpRS217を創
製した。
ーター及びpEAS102ベクター配列を含んでなる酵母発現
ベクターが構築された。プラスミドpRS217は以下のよう
に構築した。pRS215（例７）中に存在する発現ユニット
が酵母ベクターpEAS102中に導入された。プラスミドpEA
S102はHind IIIにより完全消化され、その後再環化を妨
げるために細菌性アルカリフォスファターゼで処理し
た。プラスミドpRS215をHind IIIで消化し、ASH2-4Cプ
ロモーター、asF X III cDNA及びTPI1ターミネーターを
含んでなる3.5kb発現ユニットが単離された。これらの
２つの断片を一緒に連結しそしてプラスミドpRS217を創
製した。
C.ベクターpRPOTの構築 プラスミドpDPOT（例３）をポリリンカーの挿入によ
り改変した。プラスミドpDPOTをSph I及びBamH Iで消化
し、10.8kb断片を単離した。オリゴヌクレオチドZC1551
及びZC1552は、Sma I,Sst 1及びXho I制限部位を挟むBa
mH I粘結末端及びSph粘結末端を有するアダプターを調
製するために設計された。オリゴヌクレオチドZC1551及
びZC1552をキナーゼ処理しそしてアニーリングしてBamH
I-Sph Iアダプターを調製した。10.8kbのpDPOT断片がZ
C1551/Z1552アダプターの連結により環化した。得られ
たプラスミドをpRPOTと命名した。
り改変した。プラスミドpDPOTをSph I及びBamH Iで消化
し、10.8kb断片を単離した。オリゴヌクレオチドZC1551
及びZC1552は、Sma I,Sst 1及びXho I制限部位を挟むBa
mH I粘結末端及びSph粘結末端を有するアダプターを調
製するために設計された。オリゴヌクレオチドZC1551及
びZC1552をキナーゼ処理しそしてアニーリングしてBamH
I-Sph Iアダプターを調製した。10.8kbのpDPOT断片がZ
C1551/Z1552アダプターの連結により環化した。得られ
たプラスミドをpRPOTと命名した。
D.プラスミドpJR X IIIの構築 TPI1プロモーター、asF X III cDNA及びTPI1ターミネ
ーターを含んでなるプラスミドpRS215由来の発現ユニッ
トが、酵母/E.コリシャトルベクターpRPOT中に導入され
た。pRS215及びpRPOTベクター配列由来の発現ユニット
を含んでなるプラスミドpJR X IIIは、次のように構築
した。プラスミドpRS215をXho Iで消化し、3.5kbの発現
ユニットを単離した。このpRS215発現ユニットを、Xho
I消化で直鎖状にし、次いでウシアルカリフォスファタ
ーゼで処理して自己連結（self-ligation）を防いだpRP
OTとのライゲーションにより結合した。この連結物でE.
coliMC1061株を形質転換した（Dagert及びEhrlich,Ge
ne 6:23-28,1979）。形質転換体から単離したプラスミ
ドDNAを制限分析により分析した。陽性のクローンは、
POT１遺伝子と同じ向きに発現ユニットを含有するこ
とが同定され、そしてそれをpJR X IIIと命名した。
ーターを含んでなるプラスミドpRS215由来の発現ユニッ
トが、酵母/E.コリシャトルベクターpRPOT中に導入され
た。pRS215及びpRPOTベクター配列由来の発現ユニット
を含んでなるプラスミドpJR X IIIは、次のように構築
した。プラスミドpRS215をXho Iで消化し、3.5kbの発現
ユニットを単離した。このpRS215発現ユニットを、Xho
I消化で直鎖状にし、次いでウシアルカリフォスファタ
ーゼで処理して自己連結（self-ligation）を防いだpRP
OTとのライゲーションにより結合した。この連結物でE.
coliMC1061株を形質転換した（Dagert及びEhrlich,Ge
ne 6:23-28,1979）。形質転換体から単離したプラスミ
ドDNAを制限分析により分析した。陽性のクローンは、
POT１遺伝子と同じ向きに発現ユニットを含有するこ
とが同定され、そしてそれをpJR X IIIと命名した。
E.プラスミドpD15及びプラスミドpD16の構築 また、プラスミドpRS215中の発現ユニットが、酵母／
E. coliシャトルベクターpDPOTに挿入された。プラス
ミドpDPOTをBamH I消化により直鎖状にし、次いでウシ
アルカリフォスファターゼ処理して再環化を避けた。プ
ラスミドpRS215をSst I及びPst Iで消化して、ADH2-4 C
プロモーター及びZC1056/ZC1057アダプターの一部を含
んでなる0.65kb断片を単離した。またさらに、プラスミ
ドpRS215をPst I及びBgl IIで消化して、asF X III cDN
A及びTPI1ターミネーターを含んでなる2.3kb断片を単離
した。プラスミドp410-4C（例２）をBamH I及びSst Iで
消化して、ADH2-4 C プロモーターの５′部位を含んでな
る0.55kb断片を単離した。該p410-4 C から誘導される0.
55kb BamH I-Sst I断片、pRS215由来の上記0.65kb Sst
I-Pst I断片及びpRS215由来の3.1kb Pst I-Bgl II断片
をBamH Iで直鎖状にしたpDPOTと４箇所ライゲーション
（four-part ligation）において連結した。間違いなく
逆向きの挿入部を有するものとして２つのプラスミドを
同定した。プラスミドpD15は、そのベクター中のPOT1遺
伝子に対して遠位にADH2-4 C プロモーターを有する発現
ユニットを含有する。プラスミドpD16は、そのベクター
中のPOT1遺伝子に近いほうにADH2-4 C プロモーターを有
する発現ユニットを含有した。
E. coliシャトルベクターpDPOTに挿入された。プラス
ミドpDPOTをBamH I消化により直鎖状にし、次いでウシ
アルカリフォスファターゼ処理して再環化を避けた。プ
ラスミドpRS215をSst I及びPst Iで消化して、ADH2-4 C
プロモーター及びZC1056/ZC1057アダプターの一部を含
んでなる0.65kb断片を単離した。またさらに、プラスミ
ドpRS215をPst I及びBgl IIで消化して、asF X III cDN
A及びTPI1ターミネーターを含んでなる2.3kb断片を単離
した。プラスミドp410-4C（例２）をBamH I及びSst Iで
消化して、ADH2-4 C プロモーターの５′部位を含んでな
る0.55kb断片を単離した。該p410-4 C から誘導される0.
55kb BamH I-Sst I断片、pRS215由来の上記0.65kb Sst
I-Pst I断片及びpRS215由来の3.1kb Pst I-Bgl II断片
をBamH Iで直鎖状にしたpDPOTと４箇所ライゲーション
（four-part ligation）において連結した。間違いなく
逆向きの挿入部を有するものとして２つのプラスミドを
同定した。プラスミドpD15は、そのベクター中のPOT1遺
伝子に対して遠位にADH2-4 C プロモーターを有する発現
ユニットを含有する。プラスミドpD16は、そのベクター
中のPOT1遺伝子に近いほうにADH2-4 C プロモーターを有
する発現ユニットを含有した。
F.pRS217,pJR X III及びpD16の形質転換並びに酵母に
おける活性ファクターの発現 プラスミドpRS217をサッカロミセス・セレビシアエ(S
accharomyces cerevisiae）XV794-7-1C株（MATa ade2-
1 leu2-3 leu2-113 ura3 Δpep4::TPII-CAT〔cir+〕）
にBeggsにより開示された標準的な方法を用いて形質転
換した（Nature 275:104-108,1978）。形質転換体は、
−URADSプレート（第２表）上での増殖能について選択
した。
おける活性ファクターの発現 プラスミドpRS217をサッカロミセス・セレビシアエ(S
accharomyces cerevisiae）XV794-7-1C株（MATa ade2-
1 leu2-3 leu2-113 ura3 Δpep4::TPII-CAT〔cir+〕）
にBeggsにより開示された標準的な方法を用いて形質転
換した（Nature 275:104-108,1978）。形質転換体は、
−URADSプレート（第２表）上での増殖能について選択
した。
上記pRS217プラスミドで形質転換したXY794-7-1C株由
来のファクターX IIIのサブユニットの表現は、まず最
初に該形質転換体を5mlの−URAD（第２表）中で一晩中
増殖することにより達成した。上記一晩培養物を１の
−URADに接種しそして30℃において48時間増殖せしめ
た。この培養物を遠心して細胞ペレットを回収し、そし
てその細胞を蒸留水で１度洗浄した後−80℃で貯蔵し
た。
来のファクターX IIIのサブユニットの表現は、まず最
初に該形質転換体を5mlの−URAD（第２表）中で一晩中
増殖することにより達成した。上記一晩培養物を１の
−URADに接種しそして30℃において48時間増殖せしめ
た。この培養物を遠心して細胞ペレットを回収し、そし
てその細胞を蒸留水で１度洗浄した後−80℃で貯蔵し
た。
プラスミドpJR X III及びプラスミドpD16で酵母宿主
株ZM118（Δtpil::URA3,pep4::URA3,leu2-3,112,ura3、
及びbar1に対するMATa/MATα〔ciro〕ホモ接合性）を形
質転換し、そしてトリプトファン不在の、そして1Mのソ
ルビトールを供給する合成培地（−TRPDSプレート、第
２表）により選択した。
株ZM118（Δtpil::URA3,pep4::URA3,leu2-3,112,ura3、
及びbar1に対するMATa/MATα〔ciro〕ホモ接合性）を形
質転換し、そしてトリプトファン不在の、そして1Mのソ
ルビトールを供給する合成培地（−TRPDSプレート、第
２表）により選択した。
pJR X III及びpD16で形質転換したZM118株からの活性
ファクターX IIIの発現は、まず最初に5mlのYEPD（第２
表）中で一晩上記形質転換体を増殖せしめることにより
達成した。2mlの一晩培養物を200mlのYEPDに接種し、そ
して振盪しながら30℃で増殖せしめた。その培養物を遠
心して細胞ペレットを回収し、そしてその細胞を蒸留水
で一度洗浄した後−80℃で貯蔵した。
ファクターX IIIの発現は、まず最初に5mlのYEPD（第２
表）中で一晩上記形質転換体を増殖せしめることにより
達成した。2mlの一晩培養物を200mlのYEPDに接種し、そ
して振盪しながら30℃で増殖せしめた。その培養物を遠
心して細胞ペレットを回収し、そしてその細胞を蒸留水
で一度洗浄した後−80℃で貯蔵した。
該細胞ペレットを例９に記載したようにアッセイし
た。すべての形質転換体が活性ファクターX IIIを産生
することがわかった。しかしながら、pJR X III形質転
換体は、pRS217形質転換体に比し活性ファクターX III
を６倍産生し、そしてpD16形質転換体はpRS217形質転換
体に比し活性ファクターX IIIを25倍産生することを示
した。
た。すべての形質転換体が活性ファクターX IIIを産生
することがわかった。しかしながら、pJR X III形質転
換体は、pRS217形質転換体に比し活性ファクターX III
を６倍産生し、そしてpD16形質転換体はpRS217形質転換
体に比し活性ファクターX IIIを25倍産生することを示
した。
例９ ファクターX IIIアッセイの説明 A.細胞ペレットの調製 粗製ガラスビーズ細胞破砕物は、凍結細胞ペレットか
ら調製された。洗浄した細胞ペレットを氷上で解かしそ
して1mMβ−メルカプトエタノールを含む等容量のリン
酸緩衝溶液（PBS,Sigma,St.Louis,Mo.）で稀釈した。ガ
ラスビーズ（450-500μｍ）を合計量の1/2になるまで加
えた。渦巻破砕の間中氷上でサンプルを冷却しながら、
１分間十分に渦巻き撹拌し、これを３度くり返した。そ
のチュブから液体をパスツールピペットで取り出した
後、微量遠心管に移した。そのガラスビーズを1mMβ−
メルカプトエタノール（BME）を含有するPBSのもとの量
で１度洗浄した。そのビーズを１分間渦巻き撹拌し次に
液体をパスツールピペットで取り出した後、元の細胞破
砕物と一緒貯蔵した。次に、５分間高速のエッペンドル
フマイクロフュージ（Eppendorf microfuge）（Brinkma
nn,Westbury,N.Y.）により遠心した。上澄液を慎重にア
ッセイのために回収した。
ら調製された。洗浄した細胞ペレットを氷上で解かしそ
して1mMβ−メルカプトエタノールを含む等容量のリン
酸緩衝溶液（PBS,Sigma,St.Louis,Mo.）で稀釈した。ガ
ラスビーズ（450-500μｍ）を合計量の1/2になるまで加
えた。渦巻破砕の間中氷上でサンプルを冷却しながら、
１分間十分に渦巻き撹拌し、これを３度くり返した。そ
のチュブから液体をパスツールピペットで取り出した
後、微量遠心管に移した。そのガラスビーズを1mMβ−
メルカプトエタノール（BME）を含有するPBSのもとの量
で１度洗浄した。そのビーズを１分間渦巻き撹拌し次に
液体をパスツールピペットで取り出した後、元の細胞破
砕物と一緒貯蔵した。次に、５分間高速のエッペンドル
フマイクロフュージ（Eppendorf microfuge）（Brinkma
nn,Westbury,N.Y.）により遠心した。上澄液を慎重にア
ッセイのために回収した。
B.ファクターX III活性のアッセイ ファクターX III活性は、Curtis及びLorandにより開
示された標準法を用いて測定した(Methods Enzymol.
45:177-191,1976）。細胞破砕物は、Lowryらにより開示
されている方法によって総酵母タンパクについて測定し
た（J. Biol.Chem. 193:265-275,1951）。サンプル
は、1mMのBMEを加えたPBSにより10μg/μｌの総酵母タ
ンパクになるまで稀釈した。標準に使用する商業的に入
手可能なファクターX III（第３表）は、10mMジチオス
レイトールを含有する50mMのTris-HCl（pH7.5）で段階
的に稀釈した。５μｌのサンプル又は５μｌの標準を35
μｌの50mM Tris-HCl（pH7.6）及び１μｌのトロンビン
に加えた（第３表）。これらの混合物を30分間37℃でイ
ンキュベートせしめた。これらの反応を2Uのヒルジン
（Sigma）を添加することにより停止した。60μｌの反
応混合物（第３表）を37℃で添加し、そして該混合物を
30分間インキュベートした。この反応は、1mlの7.5％ト
リクロロ酢酸（TCA）を添加することにより停止せしめ
た。サンプルを微量遠心管中で５分間高速で回転せしめ
そしてその上澄を捨てた。そのペレットを２度7.5％のT
CAで洗浄した。その後、ペレットを100μｌの氷酢酸に
溶解した。5mlのシンチレーションカクテル（Optifluo
r,Packard Instruments Co.,Downers Grove,Ili.）を加
え、そしてそのサンプルをシンチレーションカウンター
（Beckman,Palo Alto,Calif.）でカウトした。
示された標準法を用いて測定した(Methods Enzymol.
45:177-191,1976）。細胞破砕物は、Lowryらにより開示
されている方法によって総酵母タンパクについて測定し
た（J. Biol.Chem. 193:265-275,1951）。サンプル
は、1mMのBMEを加えたPBSにより10μg/μｌの総酵母タ
ンパクになるまで稀釈した。標準に使用する商業的に入
手可能なファクターX III（第３表）は、10mMジチオス
レイトールを含有する50mMのTris-HCl（pH7.5）で段階
的に稀釈した。５μｌのサンプル又は５μｌの標準を35
μｌの50mM Tris-HCl（pH7.6）及び１μｌのトロンビン
に加えた（第３表）。これらの混合物を30分間37℃でイ
ンキュベートせしめた。これらの反応を2Uのヒルジン
（Sigma）を添加することにより停止した。60μｌの反
応混合物（第３表）を37℃で添加し、そして該混合物を
30分間インキュベートした。この反応は、1mlの7.5％ト
リクロロ酢酸（TCA）を添加することにより停止せしめ
た。サンプルを微量遠心管中で５分間高速で回転せしめ
そしてその上澄を捨てた。そのペレットを２度7.5％のT
CAで洗浄した。その後、ペレットを100μｌの氷酢酸に
溶解した。5mlのシンチレーションカクテル（Optifluo
r,Packard Instruments Co.,Downers Grove,Ili.）を加
え、そしてそのサンプルをシンチレーションカウンター
（Beckman,Palo Alto,Calif.）でカウトした。
例10 PAP-IをコードするcDNAのクローニング Funakoshiら（Biochem.J. 26:5572-5578,1987）によ
って開示される抗凝血タンパクの単離及び特徴付け。ヒ
ト胎盤cDNAライブラリーをYoung及びDavis（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 80:1194-1198,1983）並びにFosber及びD
avie（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:4766-4770,1984）
の方法によりPAP-1に対するアフィニティー精製抗体を
用いてスクリーニングした。12個の陽性クローンが、５
×105組換え体から得られ、そしてその後プラーク純化
された。最も大きなクローン（1.5kb挿入）の配列解析
は、このクローンが38塩基から翻訳を開始し、そして
３′の非コード化領域を含有するポリ（Ａ）テールまで
延長しているPAP-Iについてコードする、読み取り枠（o
pen reading frame）配列を含有することを示した。次
に、起源となるライブラリーがハイブリゼーションプロ
ーブとして上記クローンを用いて再スクリーニングし
た。該プローブはManiatisらの方法によりラベルした
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:1184-1188,1975）。フ
ィルターは、0.5％SDSを含有するSSC緩衝液（8.2gのク
エン酸ナトリウム〔pH7.0〕及び17.5gのNaCl/l）で60℃
において１時間に２度洗浄した。その後、24個のクロー
ンを得て次にプラーク純化した。Sangerらの方法でジデ
オキシ−35Sを用いて配列解析のために陽性クローンをM
13mp18又はM13mp19にサブクローンした（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 74:5463-5467,1977）。最大のクローン（1.
7kb挿入）は、完全な長さのcDNAの近傍にコードされて
いることが見い出され、そして５′端に開始Met残基
を、次に完全な成熟タンパクの停止コドン及びポリアデ
ニル化シグナルを包含していた。そのPAP−１のcDNA配
列はリーダーペプチド配列を含有せず、PAP−Ｉがたぶ
ん分泌される組成分でないことを示している。cDNA配列
解析による５′端におけるMetの存在及びタンパク配列
解析による該Metの欠失は、Met残基が翻訳後の事象にお
いて除去されそして新たに形成したNH2−末端Ala残基が
アセチル化により封鎖されることを示した。
って開示される抗凝血タンパクの単離及び特徴付け。ヒ
ト胎盤cDNAライブラリーをYoung及びDavis（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 80:1194-1198,1983）並びにFosber及びD
avie（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:4766-4770,1984）
の方法によりPAP-1に対するアフィニティー精製抗体を
用いてスクリーニングした。12個の陽性クローンが、５
×105組換え体から得られ、そしてその後プラーク純化
された。最も大きなクローン（1.5kb挿入）の配列解析
は、このクローンが38塩基から翻訳を開始し、そして
３′の非コード化領域を含有するポリ（Ａ）テールまで
延長しているPAP-Iについてコードする、読み取り枠（o
pen reading frame）配列を含有することを示した。次
に、起源となるライブラリーがハイブリゼーションプロ
ーブとして上記クローンを用いて再スクリーニングし
た。該プローブはManiatisらの方法によりラベルした
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:1184-1188,1975）。フ
ィルターは、0.5％SDSを含有するSSC緩衝液（8.2gのク
エン酸ナトリウム〔pH7.0〕及び17.5gのNaCl/l）で60℃
において１時間に２度洗浄した。その後、24個のクロー
ンを得て次にプラーク純化した。Sangerらの方法でジデ
オキシ−35Sを用いて配列解析のために陽性クローンをM
13mp18又はM13mp19にサブクローンした（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 74:5463-5467,1977）。最大のクローン（1.
7kb挿入）は、完全な長さのcDNAの近傍にコードされて
いることが見い出され、そして５′端に開始Met残基
を、次に完全な成熟タンパクの停止コドン及びポリアデ
ニル化シグナルを包含していた。そのPAP−１のcDNA配
列はリーダーペプチド配列を含有せず、PAP−Ｉがたぶ
ん分泌される組成分でないことを示している。cDNA配列
解析による５′端におけるMetの存在及びタンパク配列
解析による該Metの欠失は、Met残基が翻訳後の事象にお
いて除去されそして新たに形成したNH2−末端Ala残基が
アセチル化により封鎖されることを示した。
例11 酵母におけるPAP-Iの発現 酵母における発現を目的に、PAP-I cDNAをADH2-4Cプ
ロモーター及びTPI1ターミネーターに、連結した。この
発現ユニットを種々の酵母発現ベクターに挿入し、そし
てそのベクターを選ばれた酵母菌株を形質転換するため
に使用した。
ロモーター及びTPI1ターミネーターに、連結した。この
発現ユニットを種々の酵母発現ベクターに挿入し、そし
てそのベクターを選ばれた酵母菌株を形質転換するため
に使用した。
PAP-I cDNAは、ADH2-4Cプロモーターに次のように結
合した。pUC18中に1.7kbcDNAを含んでなるプラスミドpA
P1.7をNco I及びBamH Iで切断し、直鎖状にしたプラス
ミドを２回のゲル精製を通して単離した。ADH2-4Cプロ
モーターは、次の構造： を有するアダプターを介してPAP-I cDNAの５′端に機能
的に連結した。これは、Nco I,BamH I切断ベクター、p4
10-4C（例２）由来の1.2kbのBamH I-EcoR Iプロモータ
ー断片及び上記アダプターを用いる３箇所ライゲーショ
ン（three-partligation）により達成した。得られたプ
ラスミドは、pPR1と命名した。正しいプロモーター融合
の存在は、DNA配列決定法により確認した。
合した。pUC18中に1.7kbcDNAを含んでなるプラスミドpA
P1.7をNco I及びBamH Iで切断し、直鎖状にしたプラス
ミドを２回のゲル精製を通して単離した。ADH2-4Cプロ
モーターは、次の構造： を有するアダプターを介してPAP-I cDNAの５′端に機能
的に連結した。これは、Nco I,BamH I切断ベクター、p4
10-4C（例２）由来の1.2kbのBamH I-EcoR Iプロモータ
ー断片及び上記アダプターを用いる３箇所ライゲーショ
ン（three-partligation）により達成した。得られたプ
ラスミドは、pPR1と命名した。正しいプロモーター融合
の存在は、DNA配列決定法により確認した。
その後、発現ベクターが構築された。プラスミドpZUC
13は、（pZUC13は、S. cerevisiae染色体遺伝子及びS.
cerevisiae由来の複製の起源をpUC13に挿入した２ミ
クロンのプラスミドを含んでなる。ヨーロッパ特許出願
公開195,691に開示されたプラスミドpMT212を用いる類
似の方法でpZUC12を構築した。そしてそれはヨーロッパ
特許出願公開163,529に開示されている）、Sal Iで切断
しそしてウシ腸液フォスファターゼで処理して自己連結
を防いだ。プラスミドpPR1は、Sal I及びBgl IIで完全
消化し、そして−2.4kbのプロモーター＋PAP-I断片を回
収した。TPI1ターネミーター断片は、プラスミドpFG1か
ら得た（Alber及びKawasaki,J.Mol.Appl.Genet．1:419-
434,1982）。EcoR I部位の約700塩基対の下流にTPI1遺
伝子の語尾アミノ酸コドン由来の領域を包含する。BamH
I部位は、EcoR Iにより上記プラスミドを最初に切断す
ることによってこの特異的なEcoR I部位に取り替えら
れ、その後その端をDNAポリメラーゼ（クレノウフラグ
メント）でブラッティングし、合成BamH Iリンカー（CG
GATCCA）を付加し、そしてさらに再連結してプラスミド
p136を調製した。次に、TPI1ターミネーターをp136から
Xba I-BamH I断片として切り出した。この断片をXba I
及びBamH Iで直鎖状にしたYEp13（Broachら．、Gene
8:121,1979）に連結した。得られたプラスミドはp213と
して知られている。その後、Hind IIIによって該プラス
ミドを消化することによりp213のTPI1ターミネーター領
域からHind III領域を除去し、ポリメラーゼＩ（クレノ
ウフラグメント）で得られたターミニ（termini）をブ
ラッティングし、そしてT4DNAリガーゼを用いて直鎖状
の分子を再環化する。こうして得られるプラスミドをp2
70と命名した。
13は、（pZUC13は、S. cerevisiae染色体遺伝子及びS.
cerevisiae由来の複製の起源をpUC13に挿入した２ミ
クロンのプラスミドを含んでなる。ヨーロッパ特許出願
公開195,691に開示されたプラスミドpMT212を用いる類
似の方法でpZUC12を構築した。そしてそれはヨーロッパ
特許出願公開163,529に開示されている）、Sal Iで切断
しそしてウシ腸液フォスファターゼで処理して自己連結
を防いだ。プラスミドpPR1は、Sal I及びBgl IIで完全
消化し、そして−2.4kbのプロモーター＋PAP-I断片を回
収した。TPI1ターネミーター断片は、プラスミドpFG1か
ら得た（Alber及びKawasaki,J.Mol.Appl.Genet．1:419-
434,1982）。EcoR I部位の約700塩基対の下流にTPI1遺
伝子の語尾アミノ酸コドン由来の領域を包含する。BamH
I部位は、EcoR Iにより上記プラスミドを最初に切断す
ることによってこの特異的なEcoR I部位に取り替えら
れ、その後その端をDNAポリメラーゼ（クレノウフラグ
メント）でブラッティングし、合成BamH Iリンカー（CG
GATCCA）を付加し、そしてさらに再連結してプラスミド
p136を調製した。次に、TPI1ターミネーターをp136から
Xba I-BamH I断片として切り出した。この断片をXba I
及びBamH Iで直鎖状にしたYEp13（Broachら．、Gene
8:121,1979）に連結した。得られたプラスミドはp213と
して知られている。その後、Hind IIIによって該プラス
ミドを消化することによりp213のTPI1ターミネーター領
域からHind III領域を除去し、ポリメラーゼＩ（クレノ
ウフラグメント）で得られたターミニ（termini）をブ
ラッティングし、そしてT4DNAリガーゼを用いて直鎖状
の分子を再環化する。こうして得られるプラスミドをp2
70と命名した。
他方、p270はプラスミドpM220（American Type Cultu
re CollectionにE. coli RRI形質転換体として寄託さ
れ、受理番号39853）をXba I及びBamH Iで消化し、TPI1
ターミネーター断片（〜700bp）を精製し、そしてこの
断片をXba I,BamH I消化YEp13に挿入することによって
も構築し得る。
re CollectionにE. coli RRI形質転換体として寄託さ
れ、受理番号39853）をXba I及びBamH Iで消化し、TPI1
ターミネーター断片（〜700bp）を精製し、そしてこの
断片をXba I,BamH I消化YEp13に挿入することによって
も構築し得る。
該TPI1ターミネーターは、プラスミドp270からXba I-
BamH I断片として除去された。この断片をTPI1プロモー
ターを含有する他の断片と伴にpUC19にクローンしてCAT
（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）
遺伝子に融合し、EcoR V末端を有するTPI1ターミネータ
ー断片を得た。得られたプラスミドpCAT（第11図）と命
名した。次に、TPI1ターミネーターをpCATからEcoR V-B
amH I断片として切断し、そして同じ酵素で切断したpIC
19H（Marshら．、同上）にクローンして、pTT1を得た。
プラスミドpTT1をSal I及びBgl IIで消化し、そして−8
00bp TPI1ターミネーター断片を回収した。３つの断片
（Sal−切断pZUC13,Sal I-Bgl IIプロモーター＋PAP-I
及びBgl II-Sal Iターミネーター）をその後結合した。
逆向きの発現ユニットを有する２つの異なる発現ベクタ
ーを得た。これらのベクターをpZ1及びpZ2と命名した。
BamH I断片として除去された。この断片をTPI1プロモー
ターを含有する他の断片と伴にpUC19にクローンしてCAT
（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）
遺伝子に融合し、EcoR V末端を有するTPI1ターミネータ
ー断片を得た。得られたプラスミドpCAT（第11図）と命
名した。次に、TPI1ターミネーターをpCATからEcoR V-B
amH I断片として切断し、そして同じ酵素で切断したpIC
19H（Marshら．、同上）にクローンして、pTT1を得た。
プラスミドpTT1をSal I及びBgl IIで消化し、そして−8
00bp TPI1ターミネーター断片を回収した。３つの断片
（Sal−切断pZUC13,Sal I-Bgl IIプロモーター＋PAP-I
及びBgl II-Sal Iターミネーター）をその後結合した。
逆向きの発現ユニットを有する２つの異なる発現ベクタ
ーを得た。これらのベクターをpZ1及びpZ2と命名した。
pZ2由来の発現ユニットを酵母／E. coliシャトルベ
クターpDPOTに挿入した。プラスミドpZ2をBamH Iで切断
して3.2kbの発現ユニットを単離した。プラスミドpDPOT
は消化によりリンカーライズし（lincarized）、そして
引き続きウシアルカリフォスファターゼで処理して再環
化を防いだ。3.2kbの発現ユニットをライゲーションに
より直鎖状にしたpDPOTに連結した。２つの異なる発現
ベクターが逆の方向性を有して単離された。これらのベ
クターをpD1及びpD2と命名した。プラスミドpD2は、POT
1遺伝子には不在の転写を司どる発現ユニットを含有し
た。
クターpDPOTに挿入した。プラスミドpZ2をBamH Iで切断
して3.2kbの発現ユニットを単離した。プラスミドpDPOT
は消化によりリンカーライズし（lincarized）、そして
引き続きウシアルカリフォスファターゼで処理して再環
化を防いだ。3.2kbの発現ユニットをライゲーションに
より直鎖状にしたpDPOTに連結した。２つの異なる発現
ベクターが逆の方向性を有して単離された。これらのベ
クターをpD1及びpD2と命名した。プラスミドpD2は、POT
1遺伝子には不在の転写を司どる発現ユニットを含有し
た。
プラスミドpZ2でS. cerevisiae ZA521（MATa leu2-
3,112 ura3 pep4::URA3 bar1 gal2〔ciro〕）株を
形質転換した。この形質転換体は、10mlの−LEUD（第１
表）において30℃で一晩増殖し、そして培養液の吸光度
を600nmで測定した。細胞ペレットは600nmにおける吸光
度が８に等しくなるまでMED Aで再懸濁した。培養は28
時間撹拌しながらインキュベートした。プラスミドpD2
でS. cerevesiae ZM118株を形質転換した。この形質転
換体は、30℃において96時間YEPD（第２表）中で増殖せ
しめた。
3,112 ura3 pep4::URA3 bar1 gal2〔ciro〕）株を
形質転換した。この形質転換体は、10mlの−LEUD（第１
表）において30℃で一晩増殖し、そして培養液の吸光度
を600nmで測定した。細胞ペレットは600nmにおける吸光
度が８に等しくなるまでMED Aで再懸濁した。培養は28
時間撹拌しながらインキュベートした。プラスミドpD2
でS. cerevesiae ZM118株を形質転換した。この形質転
換体は、30℃において96時間YEPD（第２表）中で増殖せ
しめた。
培養物を細胞のペレット化のために遠心し、そしてス
ペント培地で廃棄した。細胞をペレット化しそして蒸留
水で洗浄した。洗浄菌体は、アッセイする以前に−80℃
で凍結した。
ペント培地で廃棄した。細胞をペレット化しそして蒸留
水で洗浄した。洗浄菌体は、アッセイする以前に−80℃
で凍結した。
粗製ガラスビーズ細胞破砕物は、該凍結細胞ペレット
から調製した。上記洗浄細胞ペレットを氷上で融解し、
そして等量のリン酸緩衝溶液（PBS）で稀釈した。ガラ
スビーズ（450-500μｍ）を総量の1/2加えた。サンプル
を撹拌破砕する間中氷で冷却しながら、混合物を１分間
十分なスピードで渦巻撹拌を３度することにより細胞を
溶解した。液体をそのチューブから、パスツールピペッ
トで取り出し微量遠心管に移した。ガラスビーズをPBS
のもともとの量で１度洗浄した。該ビーズを１分間渦巻
き撹拌し、そして液体をパスツールピペットを採取し次
いでもとの細胞溶解物と一緒に貯蔵した。その後、該溶
解物をエッペンドルフマイクロフュージ（Brinkmann,We
stbury,N.Y.）で５分間高速にて遠心した。上澄を慎重
に回収し、Lowryらによって開示された方法により総可
溶性タンパクについてアッセイした(J.Biol.Chem. 19
3:265-275,1951）。
から調製した。上記洗浄細胞ペレットを氷上で融解し、
そして等量のリン酸緩衝溶液（PBS）で稀釈した。ガラ
スビーズ（450-500μｍ）を総量の1/2加えた。サンプル
を撹拌破砕する間中氷で冷却しながら、混合物を１分間
十分なスピードで渦巻撹拌を３度することにより細胞を
溶解した。液体をそのチューブから、パスツールピペッ
トで取り出し微量遠心管に移した。ガラスビーズをPBS
のもともとの量で１度洗浄した。該ビーズを１分間渦巻
き撹拌し、そして液体をパスツールピペットを採取し次
いでもとの細胞溶解物と一緒に貯蔵した。その後、該溶
解物をエッペンドルフマイクロフュージ（Brinkmann,We
stbury,N.Y.）で５分間高速にて遠心した。上澄を慎重
に回収し、Lowryらによって開示された方法により総可
溶性タンパクについてアッセイした(J.Biol.Chem. 19
3:265-275,1951）。
次に、上記細胞溶解物をポリアクリルアミドゲルにて
電気泳動した。Lowry法（Lowryら．上記に同じ）により
アッセイするために約50μｇの総可溶性タンパクを精製
PAP-Iの１μg,2μｇ又は５μｇのPAP-I標準と一緒に12
％のポリアクリルアミドゲルに載せた。サンプルを電気
泳動しそしてクーマシーブルー着色により視覚化した。
酵母産生PAP-Iと精製PAP-I標準との比較により、pZ2形
質転換体により産生されるPAP-Iは、総可溶性タンパク
の約20％のPAP-Iを生産するpD2形質転換体に比し、総可
溶性タンパクの約２％を示すことが見い出された。
電気泳動した。Lowry法（Lowryら．上記に同じ）により
アッセイするために約50μｇの総可溶性タンパクを精製
PAP-Iの１μg,2μｇ又は５μｇのPAP-I標準と一緒に12
％のポリアクリルアミドゲルに載せた。サンプルを電気
泳動しそしてクーマシーブルー着色により視覚化した。
酵母産生PAP-Iと精製PAP-I標準との比較により、pZ2形
質転換体により産生されるPAP-Iは、総可溶性タンパク
の約20％のPAP-Iを生産するpD2形質転換体に比し、総可
溶性タンパクの約２％を示すことが見い出された。
本発明の具体的な態様を、例示の目的で本明細書に開
示したが、種々の改良が本発明の精神及び範囲から逸脱
することなくなし得るであろうことは、上述の内容から
認識されるであろう。
示したが、種々の改良が本発明の精神及び範囲から逸脱
することなくなし得るであろうことは、上述の内容から
認識されるであろう。
第１図はα−１−アンチトリプシンをコードするcDNA配
列のサブクローニングを示す。 第２図はプラスミドpAT-1の作製を示す。 第３図は成熟α−１−アンチトリプシンcDNA配列の第一
アミノ酸コドンに融合したADH-2-4C プロモーターを含ん
で成るプラスミドの作製を示す。 第４図はADH2プロモーター配列を含んで成るプラスミド
の作製を示す。 第５図はα−１−アンチトリプシン発現ベクターpAT-3
の作製を示す。 第６図は発現ベクターpAT-4及びpAT-6の作製を示す。
列のサブクローニングを示す。 第２図はプラスミドpAT-1の作製を示す。 第３図は成熟α−１−アンチトリプシンcDNA配列の第一
アミノ酸コドンに融合したADH-2-4C プロモーターを含ん
で成るプラスミドの作製を示す。 第４図はADH2プロモーター配列を含んで成るプラスミド
の作製を示す。 第５図はα−１−アンチトリプシン発現ベクターpAT-3
の作製を示す。 第６図は発現ベクターpAT-4及びpAT-6の作製を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:865） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/16 - 1/19 C12P 21/00 - 21/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (14)
- 【請求項１】ADH2プロモーター、異種性遺伝子又はcDN
A、及び欠陥選択マーカーを含有する、酵母における異
種性遺伝子又はcDNAの発現を指令することができる発現
ベクター。 - 【請求項２】前記ADH2プロモーターがADH2プロモーター
の変異単離体である、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項３】前記ADH2プロモーターがADH2-4C プロモー
ターである請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項４】前記ベクターが酵母２μサークルに由来す
る機能的遺伝子要素をさらに含有する、請求項１に記載
の発現ベクター。 - 【請求項５】前記要素が複製開始点、並びにREP1，REP2
及びREP3遺伝子を含有する、請求項４に記載の発現ベク
ター。 - 【請求項６】前記ベクターが完全な酵母２μサークルを
含有する、請求の範囲第１項に記載の発現ベクター。 - 【請求項７】前記欠陥選択マーカーがシゾサッカロミセ
ス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)の遺伝子、E.
コリ（E. coli） lacＺプロモーターに作用可能に連
結されたアスペルギルス・ニドランス(Aspergillus ni
dulans） tpiＡのcDNA、又はleu2-d遺伝子を含んで成
る、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項８】前記欠陥選択マーカーが変異体構造遺伝子
を含んで成る、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項９】前記欠陥選択マーカーが該マーカーに作用
可能に連結されたプロモーター中の欠失又は変変を含有
する、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項１０】前記異種性遺伝子又はcDNAがα−１−ア
ンチトリプシン、ファクターX III又はPAP-1をコードす
る、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項１１】請求項１〜10のいずれか１項に記載の発
現ベクターが導入されている、遺伝的欠陥を有する酵母
宿主細胞。 - 【請求項１２】前記酵母細胞がS.セレビシエー（S.cere
visiae）の株である、請求項11に記載の酵母宿主細胞。 - 【請求項１３】酵母主宿細胞中での蛋白質の増強された
生産のための方法であって、 請求項１〜10のいずれか１項に記載の発現ベクターを、
遺伝的欠陥を有する酵母宿主細胞に導入し； 該酵母宿主細胞を適当な培地中で増殖せしめ； そして 該宿主細胞により生産された蛋白質を単離する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項１４】酵母宿主細胞中でのα−１−アンチトリ
プシンの増強された生産のための方法であって、 ロイシンでの増殖について栄養要求性でありそしてpep4
変異を有するS.セレビシエーの 〔ciro〕株に、酵母２μサークル由来の複製開始点並び
にREP1，REP2及びREP3遺伝子、並びにADH2-4C プロモー
ター、α−１−アンチトリプシンをコードする遺伝子又
はcDNA及びleu2-d遺伝子から成る欠陥選択マーカーを含
む、酵母中で異種遺伝子又はcDNAの発現を指令すること
ができる発現ベクターを導入し； 前記酵母宿主細胞を適当な培地中で増殖せしめ； 該酵母宿主細胞を破砕し；そして 該酵母宿主細胞により生産されたα−１−アンチトリプ
シンを単離する； ことを含んで成る方法。
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