ES2963839T3 - Polipéptidos de relaxina modificados que comprenden un potenciador farmacocinético y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere generalmente a polipéptidos de relaxina modificados, tales como polipéptidos de relaxina 2 humana modificados, que comprenden un aminoácido codificado de forma no natural que está unido a un potenciador farmacocinético, y usos terapéuticos de tales polipéptidos, tales como para el tratamiento de afecciones cardiovasculares (como insuficiencia cardíaca) y/o afecciones relacionadas con la fibrosis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos de relaxina modificados que comprenden un potenciador farmacocinético y usos de los mismos

Divulgaciones de aplicaciones relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio sobre la Solicitud provisional de Estados Unidos N.° 62/627.411, presentada el 7 de febrero de 2018 y la Solicitud provisional de Estados Unidos N.° 62/456.161, presentada el 8 de febrero de 2017.

Divulgación de secuencias

Esta solicitud incluye como parte de su divulgación un listado de secuencias biológicas, contenido en un archivo llamado "46561o2413.txt" que tiene un tamaño de 150.746 bytes, que se creó el 8 de febrero de 2018, que se incorpora por la presente como referencia en su totalidad.

Antecedentes de la divulgación

La presente divulgación se refiere generalmente a polipéptidos de relaxina modificados, tales como polipéptidos de relaxina 2 humana modificados, que comprenden un potenciador farmacocinético y a usos terapéuticos de tales polipéptidos, tal como para el tratamiento de afecciones cardiovasculares (tales como insuficiencia cardiaca) y/o afecciones relacionadas con la fibrosis. En realizaciones ilustrativas, el potenciador farmacocinético está unido a un aminoácido codificado de forma no natural, que puede incorporarse ribosómicamente al polipéptido de relaxina.

La insuficiencia cardiaca (IC) representa una enorme carga para el sistema de atención sanitaria actual, con una prevalencia estimada en Estados Unidos de 5,8 millones y de más de 23 millones en todo el mundo (Rogeret al.,2012.Circulation,125(1): e2-e220). Los síntomas de la IC son el resultado de un gasto cardiaco inadecuado y pueden ser debilitantes según el estadio avanzado de la enfermedad. Los principales síntomas y signos de IC incluyen: 1) disnea (dificultad para respirar) resultante del edema pulmonar debido al flujo ineficaz hacia adelante desde el ventrículo izquierdo y al aumento de la presión en el lecho capilar pulmonar; 2) el edema de las extremidades inferiores ocurre cuando el ventrículo derecho no puede acomodar el retorno venoso sistémico; y 3) fatiga, debido a la incapacidad del corazón defectuoso para mantener un gasto cardiaco suficiente para satisfacer las necesidades metabólicas del cuerpo (Kemp y Conte, 2012. Cardiovascular Pathology, 21:365-371).

Muchas enfermedades contribuyentes, los factores de riesgo y los cambios patológicos pueden, en última instancia, conducir a una insuficiencia cardiaca (Jessup y Brozena, 2003. N Engl J Med, 348(20): 2007-2018). Los acontecimientos perjudiciales que se cree que están implicados en la fisiopatología de la IC van desde los ataques más agudos, tales como el infarto de miocardio, hasta los más crónicos, tales como la hipertensión de por vida. La tasa de mortalidad sigue siendo alta, con ~50 % de las personas con IC que mueren en los 5 años posteriores al diagnóstico (Rogeret al.,2012. Circulation, 125(1): e2-e220; Rogeret al.,2004. Jama, 292(3): 344-50). La insuficiencia cardiaca claramente presenta una importante necesidad médica no cubierta.

La hormona relaxina 2 humana (también llamada relaxina H2) es un péptido de 6 kDa compuesto por 53 aminoácidos que se sabía que era responsable de la remodelación del tracto reproductivo antes del parto, facilitando por tanto el proceso de nacimiento. Si bien es predominantemente una hormona del embarazo, la relaxina también se ha detectado tanto en mujeres no embarazadas como en hombres. La relaxina humana es un miembro de la familia de péptidos de insulina que incluye insulina, una serie de péptidos similares a la insulina (INSL3-6) y factores de crecimiento similares a la insulina (IGFI e IGFII) (Van Der Westhuizenet al.,2007. Curr Drug Targets, 8(1): 91-104). Todos estos péptidos heterodiméricos están relacionados estructuralmente, con cada uno que comprende dos cadenas peptídicas (A y B) que están conectadas por dos puentes disulfuro y la cadena A que contiene un único enlace disulfuro intramolecular. El receptor de relaxina 2 (H2), denominado receptor peptídico de la familia de la relaxina 1 (RXFP1, por sus siglas en inglés), está conservado entre ratón y ser humano con una identidad de aminoácidos de un 85 % y se expresa esencialmente de forma ubicua en humanos y en otras especies (Hallset al.,2007. Br J Pharmacol, 150(6): 677-91).

Durante la gestación humana, para satisfacer las demandas nutricionales que le impone el feto, el cuerpo femenino sufre una disminución significativa de un -30 % en la resistencia vascular sistémica (RVS) y un aumento concomitante de un -50% en el gasto cardiaco (Jeyabalan, 2010: Renal and Electrolyte Disorders. Lippincott Williams & Wilkins.

462-518; Clapp and Capeless, 1997. Am J Cardiol, 80(11): 1469-73). Las adaptaciones vasculares adicionales incluyen un aumento de un -30 % en la distensibilidad arterial global, que es importante para mantener un acoplamiento ventricular-arterial eficaz, así como un aumento de un -50 % tanto en el flujo sanguíneo renal (FSR) como en la tasa de filtración glomerular (TFG), importante para la eliminación de desechos metabólicos (Jeyabalan, 2010: Renal and Electrolyte Disorders. Lippincott Williams & Wilkins. 462-518; Poppaset al.,1997. Circulation, 95(10): págs. 2407-15). Tanto los estudios preclínicos en roedores como los estudios clínicos realizados en una variedad de entornos de pacientes proporcionan pruebas de que la relaxina está implicada, al menos hasta cierto punto, en la mediación de estos cambios fisiológicos adaptativos (Conrad, 2011. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 301(2), R267-275; Teichmanet al.,2009. Heart Fail Rev, 14(4), 321-329). Muchas de estas respuestas adaptativas probablemente serían beneficiosas para los pacientes con IC, dado que la fibrosis excesiva, la distensibilidad arterial deficiente y la función renal deficiente, son características comunes a los pacientes con insuficiencia cardiaca (Mohammedet al.,2015. Circulation, 131(6), 550-559), (Wohlfahrtet al.,2015. Eur J Heart Fail, 17(1), 27-34; Dammonet al.,2011. Prog Cardiovasc Dis, 54(2), 144-153). Como un 30% estimado de los pacientes con IC padecen insuficiencia renal de moderada a grave (Triposkiadis y Skoularigis, 2012. Curr Heart Fail Rep, (4):354-62), un agente tal como la relaxina al mejorar tanto el flujo vascular como el manejo de electrolitos, puede ser de particular beneficio para los pacientes con IC.

El péptido relaxina tiene una semivida farmacocinética corta: la serelaxina, un péptido de relaxina humana recombinante, que se desarrolló para el tratamiento de la IC, tiene una semivida farmacocinética corta en la primera fase de 5 a 15 minutos y requería una perfusión intravenosa continua de 48 horas para una utilidad terapéutica (documento informativo de REASANZ (serelaxina) preparado por Novartis para el encuentro del FDA Cardiovascular and Renal Drugs Advisory Committee. 26 de febrero de 2014). Para enfermedades crónicas como insuficiencia cardiaca, una molécula de relaxina con un perfil farmacocinético mejorado brinda la oportunidad de vías alternativas de administración del fármaco, más allá de la perfusión intravenosa continua, probablemente para que sea más adecuada como terapéutico para pacientes que padecen enfermedades crónicas.

El documento US 20130237481A1 describe polipéptidos de relaxina modificados y sus usos. Ciertos polipéptidos incluyen una o más sustituciones de aminoácidos con aminoácidos codificados de forma natural o no natural y/o enlace a un polímero soluble en agua. El documento US20120046229A1 también describe polipéptidos de relaxina modificados y sus usos. Chenet al.(Adv Drug Deliv Rev. 15 de octubre de 2013; 65(10): 1357-1369. doi:10.1016/j.addr.2012.09.039.) describe las propiedades, diseño y funcionalidad de enlazadores de proteínas de fusión.

Sumario de la divulgación

La invención proporciona polipéptidos de relaxina modificados como se definen en las reivindicaciones. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas como se definen en las reivindicaciones, que comprenden un polipéptido de relaxina modificado de la invención. La invención también proporciona polipéptidos de relaxina modificados y composiciones farmacéuticas de la invención para usar en métodos de tratamiento de una enfermedad como se define en las reivindicaciones. La invención también proporciona métodos como se definen en las reivindicaciones, para fabricar polipéptidos de relaxina modificados de la invención.

En algunas realizaciones, el polipéptido de relaxina modificado comprende AQ1-GGGGS-GluY(SEQ ID NO: 139)-C14-COOH que tiene la estructura:

(Formula III),

en donde dicha AQ1-Relaxina comprende un polipéptido de cadena A de relaxina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a la SEQ ID NO: 35 y un polipéptido de cadena B de relaxina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a la s Eq ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6, en donde la para-acetil-fenilalanina modificada representada en la Fórmula III se sitúa en el extremo N terminal de dicho polipéptido de la cadena A de relaxina.

En algunas realizaciones, el polipéptido de relaxina modificado comprende AQ1-Relaxina-GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH, que tiene la estructura de la Fórmula III descrita en el presente documento, en donde la AQ1-Relaxina comprende un polipéptido de cadena A de relaxina de la SEQ ID NO: 35 y un polipéptido de cadena B de relaxina de la SEQ ID NO: 6, en donde la para-acetil-fenilalanina modificada representada en la Fórmula III se sitúa en el extremo N terminal de dicho polipéptido de la cadena A de relaxina.

En algunas realizaciones, el polipéptido de relaxina modificado es un polipéptido de relaxina modificado que comprende la estructura mostrada en la Fig. 8.

En algunas realizaciones, el polipéptido de relaxina modificado es un polipéptido de relaxina modificado que comprende la estructura mostrada en la Fig. 9.

En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento para el tratamiento de un trastorno asociado a la relaxina y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en un método para tratar una enfermedad asociada con la relaxina que comprende administrar una cantidad eficaz del polipéptido de relaxina modificado o una composición que comprende el polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en un método para tratar una enfermedad cardiovascular que comprende administrar una cantidad eficaz del polipéptido de relaxina modificado o una composición que comprende el polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento a un/a paciente que lo necesita.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en un método para tratar o aliviar un síntoma de insuficiencia cardiaca que comprende administrar una cantidad eficaz del polipéptido de relaxina modificado o una composición que comprende el polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento a un/a paciente que lo necesita.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en un método para tratar una enfermedad asociada con fibrosis, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de relaxina modificado o una composición que comprende el polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento a un/a paciente que lo necesita.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en un método para tratar o evitar la insuficiencia renal, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de relaxina modificado o una composición que comprende el polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento a un/a paciente que lo necesita.

En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en un método para mejorar, estabilizar o restaurar la función renal en un/a paciente que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de relaxina modificado o una composición que comprende el polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento al/a la paciente.

En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un método de fabricación de un polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento, como se define en las reivindicaciones.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

Figura 1.Secuencia de un polipéptido de relaxina 2 humana sin un aminoácido codificado de forma no natural. Los polipéptidos de la cadena A (SEQ ID NO: 4) y de la cadena B (SEQ ID NO: 6) están unidos mediante puentes disulfuro como se representa en la Fig. 5. La posición 1 en la cadena B se modifica con respecto a la cadena B del polipéptido de relaxina 2 humana (SEQ ID NO: 5) (posición subrayada, ácido aspártico sustituido por alanina como se muestra), la cual se ha observado que mejora la fabricación sin afectar significativamente a la potencia. En los ejemplos de trabajo en el presente documento, este polipéptido se denomina "tipo silvestre" o TS-RLX.

Figura 2.Secuencia de RLX-AQ1 ("AQ1"), un polipéptido de relaxina 2 humana con un aminoácido para-acetilfenilalanina (pAcF, subrayada) codificado de forma no natural sustituido para la posición 1 de la cadena A. La cadena A (SEQ ID NO: 35) y la cadena B (SEQ ID NO: 6) están unidas mediante puentes disulfuro en las posiciones representadas en la Fig. 5.

Figura 3.Secuencia de RLX-BM25/AN1 ("BM25/AN1"), un polipéptido de relaxina 2 humana con un aminoácido para-acetil-fenilalanina (pAcF, subrayada) codificado de forma no natural sustituido para la posición 25 de la cadena B y además la posición 1 de la cadena A contiene la sustitución de glutamina por asparagina (subrayada). La cadena A (SEQ ID NO: 36) y la cadena B (SEQ ID NO: 37) están unidas mediante puentes disulfuro en las posiciones representadas en la Fig. 5.

Figura 4.Esquema de un polipéptido prepro-relaxina para la expresión de RLX-AQ1. Un polipéptido preprorelaxina (SEQ ID NO: 38) se expresa en E.coliu otro sistema de expresión. Un aminoácido codificado de forma no natural, tal como pAcF, puede incorporarse ribosómicamente en la secuencia del polipéptido de prepro-relaxina, facilitando el enlace posterior a un potenciador farmacocinético ("prolongador PK"). La secuencia líder específica para la expresión deE. colise indica con círculos grises. El péptido C (péptido de conexión), derivado de proinsulina con sitios de escisión de péptidos añadidos y una sustitución de Lys por Gly, se indica con círculos negros. La secuencia líder y el péptido C se eliminan mediante escisión enzimática (los sitios de escisión se indican con flechas sin etiqueta). La sustitución de alanina en el resto 1 de la cadena B ("B1") (presente en la SEQ ID NO: 6) ayuda a la eliminación de la secuencia líder. Se indica el resto de pAcF para la unión del potenciador PK específico del sitio. Las cadenas A y B se alinean con la denominada por la HUGO, RLN2 y se derivan del ADNc de la variante 1 del transcrito de relaxina2 (refseq NM_134441).

Figura 5.Representación estructural de RLX-AQ1 madura que comprende una cadena A (SEQ ID NO: 36) y una cadena B (<s>E<q>ID NO: 6), que está unida a través de un aminoácido codificado de forma no natural en la posición 1 de la cadena A a un potenciador farmacocinético ("prolongador PK").

Figuras 6A-6B.Efectos de TS-RLX (Fig. 6A) y de AQ1-GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139) -C14-COOH (Fig. 6B) sobre los cambios en la expresión del gen de alfa-actina de músculo liso en fibroblastos cardiacos humanos tratados con TGF-beta, usando qRT-PCR para medir las concentraciones de ARNm. Las cifras sobre las barras indican una reducción porcentual frente a TGF-beta solo, con el vehículo establecido como valor inicial. Media ± ETM; *p < 0,05. Veh = vehículo. nM = nanomolar.

Figuras 7A-7D.Vacuolización epitelial del túbulo cortical renal relacionada con PEG en ratas Sprague Dawley hembra. Riñón de ratas tratadas por vía subcutánea (SC) una vez al día con vehículo o análogos de relaxina. Los análogos de relaxina que contienen PEG (Figs. 7B y 7C) muestran una marcada vacuolización tubular cortical caracterizada por la presencia de grandes vacuolas coalescentes. No se observan vacuolas en animales tratados con vehículo (Fig. 7A) o con relaxina no pegilada (Fig. 7D). Fig. 7A: Vehículo (Arg 150 mM en tampón citrato 10 mM, pH 5,5) SC durante 10 días. Fig. 7B: AQ1-PEG36-Glu-C13-COOH (PEG de 1,5 kD) SC a 40 mg/kg/día durante 7 días. Fig. 7C: AQ1-20-kDa-PEG (20 kD PEG) SC a 15 mg/kg/día durante 10 días. Fig. 7D: AQ1-GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH SC a 40 mg/kg durante 7 días. Ampliación 40*, H&E.

Figura 8. Estructura de AQ1-GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH representada en la Fórmula III.

Figura 9. Estructura de AQ1-GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH representada en la Fórmula III.

Descripción detallada

Definiciones

Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "uno", "uno/una", y "el/la", incluyen referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, una referencia a una "relaxína", "polipéptido de relaxina", o "polipéptido de relaxina modificado", es una referencia a una o más de tales proteínas e incluye equivalentes de las mismas conocidos por las personas normalmente versadas en la materia, etc.

Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por una persona experta en la materia a la cual pertenece la presente invención.

Las expresiones "prolongador farmacocinético", "potenciador farmacocinético", "prolongador PK" y "potenciador PK" se usan indistintamente y cada una se refiere a un resto farmacéuticamente aceptable, dominio o molécula unida covalentemente ("conjugado" o "fusionado") al polipéptido de relaxina modificado descrito en el presente documento, opcionalmente a través de un aminoácido codificado de forma no natural, que impide, retrasa o mitiga la degradación proteolítica u otra modificación química que disminuya la actividad del polipéptido de relaxina modificadoin vivo,aumenta la semivida (semivida en suero y/o semivida terapéutica) y/o mejora o altera otras propiedades farmacocinéticas o biofísicas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, aumentar la tasa de absorción, reducir la toxicidad, mejorar la solubilidad, reducir la agregación, aumentar la actividad biológica y/o la selectividad de la diana del polipéptido de relaxina modificado y/o reducir la inmunogenicidad del polipéptido de relaxina modificado, en relación con un comparador, tal como una forma sin conjugar del polipéptido de relaxina modificado o un polipéptido de relaxina de tipo silvestre. El potenciador PK descrito en el presente documento puede comprender un componente peptídico, que comprende uno o más aminoácidos y un resto prolongador de semivida.

La expresión "resto prolongador de semivida" se refiere a un resto farmacéuticamente aceptable, dominio o molécula unida covalentemente ("conjugado" o "fusionado") al polipéptido de relaxina modificado descrito en el presente documento, por ejemplo, como un componente de un prolongador PK, opcionalmente a través de un aminoácido codificado de forma no natural, directamente o a través de un enlazador (por ejemplo, un componente peptídico o PEG), que aumenta la semivida (semivida en suero y/o semivida terapéutica) y/o mejora o altera otras propiedades farmacocinéticas o biofísicas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, aumentar la tasa de absorción, reducir la toxicidad, mejorar la solubilidad, reducir la agregación, aumentar la actividad biológica y/o la selectividad de la diana del polipéptido de relaxina modificado, aumentar la capacidad de fabricación y/o reducir la inmunogenicidad del polipéptido de relaxina modificado, en relación con un comparador, tal como una forma sin conjugar del polipéptido de relaxina modificado o un polipéptido de relaxina de tipo silvestre. La expresión resto prolongador de semivida incluye, pero no se limita a, restos no proteicos que prolongan la semivida, tales como un ácido graso o un derivado del mismo, un polímero soluble en agua, tal como polietilenglicol (PEG) o PEG discreto, hidroxietil almidón (HES), un lípido, un grupo acilo ramificado o no ramificado, un grupo acilo ramificado o no ramificado C8-C30, un grupo alquilo ramificado o no ramificado y un grupo alquilo ramificado o no ramificado C8-C30; y restos proteináceos que prolongan la semivida, tales como seroalbúmina, transferrina, adnectina (por ejemplo, adnectina que se une a albúmina o que prolonga la farmacocinética (PKE)), dominio Fc y polipéptido sin estructura, tal como polipéptido XTEN y PAS (por ejemplo, secuencias polipeptídicas conformacionalmente desordenadas compuestas por los aminoácidos Pro, Ala y/o Ser) y un fragmento de cualquiera de los anteriores. El término "enlazador" o "espaciador" puede ser cualquier componente que une un resto prolongador de semivida al polipéptido de relaxina modificado. Los enlazadores ilustrativos incluyen, pero sin limitación, pequeños compuestos orgánicos, polímeros solubles en agua de una variedad de longitudes, tales como polietilenglicol) o polidextrano y péptidos o polipéptidos, por ejemplo, de hasta 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 o de hasta 6 aminoácidos de longitud.

La expresión "componente peptídico" se refiere a un componente de un prolongador PK y comprende un péptido de hasta 50 aminoácidos de longitud. Los componentes peptídicos ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, péptidos de hasta 40, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos de longitud. Tal componente peptídico puede unir covalentemente un resto prolongador de semivida al polipéptido de relaxina modificado descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el componente peptídico puede comprender 2-50 aminoácidos. En algunas realizaciones, el componente peptídico puede comprender 2-30 aminoácidos. En algunas realizaciones, el componente peptídico puede comprender 3-20 aminoácidos. En algunas realizaciones, el componente peptídico puede comprender 5-10 aminoácidos.

La expresión "estabilidad" o "estabilidad térmica" se refiere a la capacidad de un polipéptido para resistir el despliegue cuando se calienta. Generalmente cuanto mayor es la estabilidad térmica de una molécula, mayor será la temperatura necesaria para que el polipéptido se despliegue. Los métodos ilustrativos para determinar la estabilidad térmica de un polipéptido son los métodos de calorimetría diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en inglés) y la fluorescencia de barrido térmico. La estabilidad térmica se puede determinar con respecto a un compuesto de comparación, por ejemplo, para identificar un polipéptido que tenga una mayor estabilidad térmica.

El término "agregación" se refiere a la tendencia de un polipéptido a formar complejos unidos de forma no covalente con otras moléculas (tales como otras moléculas del mismo polipéptido), formando por tanto complejos de alto peso molecular. Los métodos ilustrativos para medir la formación de agregados incluyen la cromatografía analítica de exclusión por tamaño. Se pueden determinar cantidades relativas de agregación con respecto a un compuesto de comparación, por ejemplo, para identificar un polipéptido que tiene una agregación reducida.

El término "desamidación" se refiere a la tendencia de los restos de aminoácidos dentro de un polipéptido a sufrir espontáneamente una reacción de desamidación, cambiando por tanto la estructura química del aminoácido y afectando potencialmente a la función del polipéptido. Los métodos ilustrativos para medir la desamidación incluyen el enfoque isoeléctrico capilar con imágenes (icIEF, por sus siglas en inglés). La cantidad relativa de desamidación se puede determinar respecto a un compuesto de comparación, por ejemplo, para identificar un polipéptido que tiene una desamidación disminuida.

La expresión "proteolisisin vivo"se refiere a la escisión de un polipéptido cuando se introduce en un sistema vivo (por ejemplo, cuando se inyecta en un organismo) que puede resultar de las proteasas que se producen en dicho organismo. La proteolisis puede potencialmente afectar a la actividad biológica o a la semivida de un polipéptido. Por ejemplo, la relaxina de tipo silvestre puede sufrir escisión, dando como resultado un polipéptido truncado inactivo. Un método ilustrativo de medición de la proteolisisin vivode la relaxina es el ensayo inmunoabsorbente electroquimioluminiscente (ECLIA, por sus siglas en inglés) basado en Meso Scale Discovery (MSD). La cantidad relativa de la proteolisisin vivopuede determinarse respecto a un compuesto de comparación, por ejemplo, para identificar un polipéptido que tiene una proteolisisin vivodisminuida.

El término "solubilidad" se refiere a la cantidad de una sustancia que puede disolverse en otra sustancia, por ejemplo, la cantidad de un polipéptido de relaxina modificado o sin modificar que se puede disolver en una solución acuosa. Un método ilustrativo para medir la solubilidad de un polipéptido de relaxina modificado o sin modificar es la prueba de solubilidad de flujo pistón. La solubilidad relativa puede determinarse con respecto a un compuesto de comparación, por ejemplo, para identificar un polipéptido que tiene una solubilidad aumentada.

La expresión "actividad biológica" o "bioactividad" se refiere a la capacidad de una molécula de afectar a cualquier propiedad física o bioquímica de un sistema biológico, ruta, molécula o interacción relacionada con un organismo, incluyendo, aunque no de forma limitativa, virus, bacterias, bacteriófago, transposón, prión, insectos, hongos, plantas, animales y seres humanos. Por ejemplo, en el contexto de una relaxina modificada o sin modificar, la actividad biológica incluye cualquiera de las funciones realizadas por la relaxina. Por ejemplo, un polipéptido de relaxina modificado "biológicamente activo" puede presentar una o más de las actividades biológicas de la relaxina de tipo silvestre, incluyendo pero sin limitación a las mismas: activación de un receptor de relaxina 2 RXFP1 que incluye ortólogos de RXFP1 humanos y no humanos, activación de otro receptor de relaxina, tal como RXFP2, que incluye ortólogos humanos y no humanos, actividad antifibróticain vitrooin vivo,eficacia en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca o una enfermedad fibrótica en un ser humano, animal no humano y/o sistema modelo y otras actividades biológicas como se ha divulgado en el presente documento, por ejemplo, disminución de la resistencia vascular sistémica (RVS), aumento del gasto cardiaco, aumento de la distensibilidad arterial global, aumento del flujo sanguíneo renal (FSR) y/o de la tasa de filtración glomerular (TFG). Los métodos ilustrativos para determinar si una molécula posee al menos una actividad biológica de relaxina de tipo silvestre (tal como el polipéptido de relaxina de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5) pueden incluir ensayos de actividadin vitroo ensayos de unión a receptores, por ejemplo, ensayo de acumulación de AMPc intracelular. El nivel relativo de actividad biológica se puede determinar respecto a un compuesto de comparación, por ejemplo, para identificar un polipéptido que tiene actividad biológica o que tiene una actividad biológica suficientemente alta para un uso terapéutico previsto, por ejemplo, tener una EC50 menos de 5 veces, 10 veces, menos de 20 veces, menos de 50 veces o menos de 100 veces mayor que la CE50 de un comparador, en un ensayo de actividadin vitrooin vivo.

El compuesto de comparación descrito en el presente documento puede ser otra secuencia que carece de una modificación, tal como una modificación descrita en el presente documento. Por ejemplo, el compuesto de comparación puede ser la misma secuencia polipeptídica de relaxina modificada sin enlace respecto a un prolongador de PK. Los compuestos comparadores ilustrativos incluyen, sin limitación a los mismos, el polipéptido de relaxina de tipo silvestre de las SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, un polipéptido de relaxina modificado de las SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6, un polipéptido de relaxina modificado de las s Eq ID NO: 36 y SEQ ID NO: 6, un polipéptido de relaxina modificado de las SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 6 u otro compuesto de comparación. En algunas realizaciones, el compuesto de comparación puede contener al menos un aminoácido codificado de forma no natural, que puede estar vinculado a un enlazador, polímero, molécula biológicamente activa, péptido, polipéptido o resto prolongador de semivida descritos en el presente documento (por ejemplo, PEG o ácido graso). En algunas realizaciones, un compuesto de comparación puede contener al menos un aminoácido codificado de forma no natural, que puede o no estar vinculado a un enlazador, polímero, molécula biológicamente activa, péptido, polipéptido o resto prolongador de semivida descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, un compuesto de comparación puede contener sustituciones, deleciones y/o inserciones adicionales de aminoácidos. En algunas realizaciones, la comparación se puede realizar con una forma acilada o no acilada del polipéptido; en el caso anterior, la comparación se puede realizar con un polipéptido que comprende o no un aminoácido codificado de forma no natural.

La expresión "correspondiente" se refiere a una posición ("posición correspondiente" o "posición que corresponde") o a una región ("región correspondiente" o "región que corresponde") dentro de un polipéptido o de una secuencia polinucleotídica que se identifica mediante la comparación con una secuencia de referencia. La secuencia de referencia puede ser una secuencia de tipo silvestre o sin modificar, tal como el polipéptido de relaxina de tipo silvestre de las SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. Se puede identificar una posición o región correspondiente mediante el alineamiento de la secuencia con una secuencia de referencia. Por ejemplo, la "posición correspondiente al aminoácido 1 en la cadena de relaxina A" se refiere a la posición en la secuencia que está en la misma columna de alineación que el aminoácido 1 en la SEQ ID NO: 4 cuando esa secuencia está alineada con la SEQ ID NO: 4. En la alineación, el aminoácido o nucleótido puede coincidir o no con el aminoácido o nucleótido en la posición correspondiente en la secuencia de referencia.

La alineación utilizada para identificar una posición correspondiente o región correspondiente, se puede obtener usando un algoritmo de alineación convencional, tal como Blast (Altschulet al.,J Mol Biol. 1990 Oct 5;215(3):403-10), Smith-Waterman (Smith y Waterman, J Mol Biol. 1981 Mar 25;147(1):195-7) o Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, J Mol Biol. 1970 Mar;48(3):443-53). Se puede utilizar el algoritmo de Needleman-Wunsch para obtener el alineamiento global con la puntuación más alta (es decir, un alineamiento que contiene cada resto en ambas secuencias, aunque una alineación puede comenzar y/o terminar en huecos). Si se utiliza Whether Blast, Smith-Waterman o Needleman-Wunsch, la alineación con la puntuación más alta se puede identificar utilizando parámetros "predeterminados", tal como el uso de la matriz de puntuación BLOSUM62, una penalización por apertura de hueco de 11 y una penalización por extensión de hueco de 1 y (cuando se utiliza Blast para alineación por pares) un tamaño de palabra de 3.

La expresión "enfermedad asociada con fibrosis" incluye enfermedades, trastornos y afecciones, en los que se ha observado que se produce fibrosis o en los que se sabe o se cree que la fibrosis está asociada o que contribuye a la etiología, progresión o síntomas de la enfermedad o en los que se sabe o se cree que se produce fibrosis a medida que avanza la enfermedad. La fibrosis puede afectar a un órgano o tejido, tal como al páncreas, pulmón, corazón, riñón, hígado, ojos, sistema nervioso, médula ósea, ganglios linfáticos, endomiocardio o retroperitoneo. Las enfermedades ilustrativas asociadas con la fibrosis incluyen, pero sin limitación, esteatohepatitis no alcohólica (ENA), fibrosis hepática, precirrosis, cirrosis, enfermedad pulmonar parenquimatosa difusa, fibrosis quística, fibrosis de pulmón o pulmonar, fibrosis masiva progresiva, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis por inyección, fibrosis de riñón o renal, enfermedad renal crónica, enfermedad renal diabética, glomeruloesclerosis focal y segmentaria, nefropatía membranosa, nefropatía por IgA, mielofibrosis, insuficiencia cardiaca, insuficiencia cardiaca metabólica, fibrosis cardiaca, fibrosis de cataratas, cataratas, cicatrices oculares, fibrosis pancreática, fibrosis dérmica, fibrosis intestinal, estenosis intestinales, fibrosis endomiocárdica, fibrosis auricular, fibrosis mediastínica, enfermedad de Crohn, fibrosis retroperitoneal, queloide, fibrosis sistémica nefrógena, esclerodermia, esclerosis sistémica, artrofibrosis, síndrome de Peyronie, contractura de Dupuytren, neuropatía diabética, capsulitis adhesiva, esteatosis hepática alcohólica, hepatoesteatosis, hepatitis vírica, enfermedad biliar, hemocromatosis primaria, cirrosis relacionada con fármacos, cirrosis criptogénica, enfermedad de Wilson, deficiencia de alfa 1 -antitripsina, enfermedad pulmonar intersticial (EPI), enfermedad pulmonar fibrótica humana, degeneración macular, retinopatía retiniana, retinopatía vítrea, fibrosis miocárdica, oftalmopatía de Graves, ergotismo inducido por fármacos, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis/reestenosis, cicatrices hipertróficas, mielofibrosis primaria o idiopática y enfermedad inflamatoria intestinal (incluyendo, aunque no de forma limitativa, colitis de colágeno). En algunas realizaciones, la enfermedad asociada con la fibrosis puede incluir fibrosis hepática, fibrosis de riñón o renal, fibrosis de pulmón o pulmonar y fibrosis de corazón o cardiaca. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada con la fibrosis puede ser la fibrosis hepática. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada con la fibrosis puede ser ENA.

La expresión "sustancialmente purificado" se refiere a un polipéptido de relaxina modificado o sin modificar que puede sustancial o esencialmente estar sin componentes que normalmente acompañan o interactúan con la proteína tal como se encuentra en su entorno de origen natural, es decir, una célula nativa o una célula hospedadora, en el caso de polipéptidos de relaxina modificados o sin modificar producidos de forma recombinante. El polipéptido de relaxina modificado o sin modificar que puede sustancialmente estar sin material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente un 30%, menos de aproximadamente un 25 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 15 %, menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 5 %, menos de aproximadamente un 4 %, menos de aproximadamente un 3 %, menos de aproximadamente un 2 % o menos de aproximadamente un 1 % (en peso seco o húmedo) de proteína contaminante. Por tanto, el polipéptido de relaxina modificado o sin modificar "sustancialmente purificado" producido mediante los métodos de la presente divulgación puede tener un nivel de pureza de al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, específicamente, un nivel de pureza de al menos aproximadamente un 75 %, un 80 %, un 85 % y más concretamente, un nivel de pureza de al menos aproximadamente un 90 %, un nivel de pureza de al menos aproximadamente un 95 %, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 99 % o superior según lo determinado mediante métodos adecuados, tales como análisis de SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC y electroforesis capilar.

Una "célula hospedadora recombinante" o "célula hospedadora" se refiere a una célula que incluye un polinucleótido exógeno, independientemente del método utilizado para la inserción, por ejemplo, captación directa, transducción, apareamiento de F u otros métodos conocidos en la técnica para crear células hospedadoras recombinantes. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido o como alternativa, puede integrarse en el genoma del hospedador.

Como se utiliza en el presente documento, el término "eucariota" se refiere a organismos que pertenecen al dominio filogenético Eukarya, tales como animales (que incluye, aunque no de forma limitativa, mamíferos, insectos, reptiles, aves, etc.), ciliados, plantas (incluyendo, aunque no de forma limitativa, monocotiledóneas, dicotiledóneas, algas, etc.), hongos, levaduras, flagelados, microsporidios, protistas, etc.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "no eucariota" se refiere a organismos no eucariotas o a organismos procariotas. Por ejemplo, un organismo no eucariota puede pertenecer al dominio Eubacteria (que incluye, aunque no de forma limitativa,Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida,etc.) o al dominio filogenético Archaea (que incluye, aunque no de forma limitativa,Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium,tales comoHaloferax volcaniiy especies deHalobacteriumNRC-1,Archaeoglobus fulgidus, Pirococcus furiosus, Pirococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix,etc.).

Como se utiliza en el presente documento, el término "medio" o "medios" incluye cualquier medio de cultivo, solución, soporte sólido, semisólido o rígido, que puede soportar o contener cualquier célula hospedadora, incluyendo células hospedadoras bacterianas, células hospedadoras de levadura, células hospedadoras de insectos, células hospedadoras vegetales, células hospedadoras eucariotas, células hospedadoras de mamífero, células CHO, células hospedadoras procariotas,E. colio células hospedadoras dePseudomonasy contenidos celulares. Por tanto, el término puede abarcar el medio en el que se ha cultivado la célula hospedadora, por ejemplo, medio en el que se ha secretado el polipéptido de relaxina modificado o sin modificar, incluido el medio antes o después de una etapa de proliferación. El término también puede abarcar tampones o reactivos que contienen lisados de células hospedadoras, tal como en el caso en el que el polipéptido de relaxina modificado o sin modificar se produce intracelularmente y las células hospedadoras se lisan o rompen para liberar el polipéptido de relaxina modificado o sin modificar.

El término "relaxina" como se utiliza en el presente documento, se refiere a la relaxina humana, específicamente a la relaxina 2 humana (también conocida como relaxina H2 o RLN2), salvo que el contexto indique lo contrario, cuya secuencia de aminoácidos y estructura espacial son bien conocidas. La relaxina humana está compuesta por una cadena A de veinticuatro aminoácidos y una cadena B de veintinueve aminoácidos que están entrecruzadas mediante puentes disulfuro (véase la Fig. 5). Una relaxina de tipo silvestre adecuadamente reticulada contiene tres puentes disulfuro: uno entre la posición 11 de la cadena A y la posición 11 de la cadena B, un segundo entre la posición 24 de la cadena A y la posición 23 de la cadena B y un tercero entre las posiciones 10 y 15 de la cadena A).

Como se utiliza en el presente documento, "polipéptido de relaxina modificada" o "relaxina modificada" se usan indistintamente e incluirán los polipéptidos y proteínas que difieren de la relaxina de tipo silvestre (por ejemplo, relaxina humana de tipo silvestre de las SEQ ID nO:4 y SEQ ID NO:5) y normalmente tienen al menos una actividad biológica de una relaxina 2, así como los análogos de relaxina, isoformas de relaxina, miméticos de relaxina, polimorfismos (por ejemplo, variantes de secuencia de relaxina de origen natural), fragmentos de relaxina, proteínas de relaxina híbridas, proteínas de fusión, oligómeros y multímeros, homólogos, variantes del patrón de glicosilación, variantes, variantes de empalme y muteínas, de los mismos. Las expresiones "polipéptido de relaxina modificado" y "relaxina modificada" abarcan polipéptidos de relaxina que comprenden una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos.

Se pueden incorporar sustituciones en una amplia variedad de posiciones de aminoácidos en la relaxina de origen natural en un polipéptido de relaxina modificado. Las sustituciones que incluyen, aunque no de forma limitativa, las que modulan la solubilidad o la estabilidad, aumentan la actividad agonista, aumentan la semividain vivooin vitro,aumentan la resistencia a la proteasa, reducen la inmunogenicidad o la toxicidad, facilitan la purificación o la capacidad de fabricación, etc. y están abarcadas por la expresión "polipéptido de relaxina modificado" o "relaxina modificada". Generalmente, las sustituciones de aminoácidos codificados de forma no natural descritas en el presente documento pueden combinarse con otras adiciones, sustituciones o deleciones dentro del polipéptido de relaxina modificado para afectar a los rasgos biológicos del polipéptido de relaxina modificado respecto a otro polipéptido de relaxina (por ejemplo, el polipéptido de relaxina de tipo silvestre de las SEQ ID NO: 4 y<s>E<q>ID NO: 5 u otro polipéptido de relaxina tal como el mismo polipéptido de relaxina sin dicha adición, sustitución o deleción u otro polipéptido de relaxina modificado o sin modificar). Como se define en las reivindicaciones, el polipéptido de relaxina modificado está sustituido por un aminoácido codificado de forma no natural en el resto 1 de la cadena A y tiene 0, 1 o 2 sustituciones, inserciones y/o deleciones adicionales de aminoácidos en la cadena A de relaxina y/o en la cadena B de relaxina. En algunas realizaciones, las otras adiciones, sustituciones o deleciones, pueden aumentar la estabilidad (incluyendo, entre otras, la resistencia a la degradación proteolítica) del polipéptido de relaxina modificado o aumentar la afinidad del polipéptido de relaxina modificado por su receptor. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o deleciones, pueden aumentar la estabilidad farmacéutica del polipéptido de relaxina modificado. En algunas realizaciones, las otras adiciones, sustituciones o eliminaciones, pueden aumentar la solubilidad (incluyendo, aunque no de forma limitativa, cuando se expresan enE. coliu otras células hospedadoras), aumentar la capacidad de fabricación o disminuir la agregación del polipéptido de relaxina modificado. En algunas realizaciones, las adiciones, sustituciones o eliminaciones, pueden aumentar la solubilidad del polipéptido después de la expresión enE. colio en otras células hospedadoras recombinantes. En algunas realizaciones, el(los) sitio(s) puede(n) seleccionarse para la sustitución con un aminoácido codificado de forma natural o no natural además de otro sitio para la incorporación de un aminoácido no natural que da como resultado aumentar la solubilidad de un polipéptido después de la expresión enE. coliu otras células hospedadoras recombinantes.

En algunas realizaciones, los polipéptidos de relaxina modificados comprenden además una inserción, sustitución o deleción adicional que modula la actividad biológica del polipéptido de relaxina modificado. Por ejemplo, las adiciones, sustituciones o deleciones, pueden modular una o más propiedades o actividades de la relaxina modificada. Por ejemplo, las adiciones, sustituciones o deleciones, pueden modular la afinidad para el receptor del polipéptido de relaxina, proteínas de unión o ligando asociado, modular la transducción de señales después de unirse al receptor de relaxina, modular la semividain vivoo circulante, modular la semivida terapéutica, modular la estabilidad del polipéptido, modular la escisión por proteasas, modular la dosis, modular la liberación o la biodisponibilidad, facilitar la purificación, disminuir la desamidación, disminuir la agregación, mejorar la vida útil o la semividain vitroo mejorar o alterar una vía particular de administración. De forma similar, los polipéptidos de relaxina modificados pueden comprender secuencias de escisión de proteasa, grupos reactivos, dominios de unión a anticuerpos (incluyendo, aunque no de forma limitativa, FLAG o poli-His) u otras secuencias basadas en afinidad (incluyendo, aunque no de forma limitativa, FLAG, poli-His, GST, etc.) o moléculas enlazadas (incluyendo, aunque no de forma limitativa, biotina) que mejoran la detección (incluyendo, aunque no de forma limitativa, GFP), purificación u otros rasgos del polipéptido.

La expresión "polipéptido de relaxina modificado" también incluye fragmentos biológicamente activos, variantes biológicamente activas y estereoisómeros de la relaxina de origen natural, así como agonistas, variantes miméticas y antagonistas de las fusiones de relaxina y polipéptidos de origen natural de los mismos. Las fusiones que comprenden aminoácidos adicionales en el extremo amino, terminal carboxilo o ambos, se abarcan mediante la expresión "polipéptido de relaxina modificado". Las fusiones ilustrativas incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, metionil relaxina, en la que una metionina está unida al extremo N terminal de una cadena A y/o de una cadena B de relaxina resultante de la expresión recombinante de la forma madura de relaxina que carece del péptido líder o señal o porción del mismo (por ejemplo, una metionina está unida al extremo N terminal de una cadena A y/o de una cadena B de relaxina resultante de la expresión recombinante, por ejemplo, enE. coli),fusiones con fines de purificación (incluyendo, aunque no de forma limitativa, a polihistidina o epítopos de afinidad), fusiones con péptidos que se unen a seroalbúmina, tales como adnectina PKE y fusiones con proteínas séricas, tales como seroalbúmina y proteínas de fusión que comprenden relaxina y una o más moléculas diferentes ("compañero de fusión"), incluyendo, aunque no de forma limitativa, seroalbúmina, dominio Fc, región constante de inmunoglobulina, polipéptido sin estructura y adnectina y un fragmento de los mismos. Cualquiera de tales fragmentos se puede preparar a partir de las proteínas mediante métodos bioquímicos estándar o mediante la expresión de un polinucleótido que codifica el fragmento.

Salvo los casos donde se indique lo contrario, en general, las expresiones "polipéptido de relaxina" y "relaxina", como se utilizan en el presente documento, abarcan tanto polipéptidos de relaxina sin modificar (es decir, de tipo silvestre) como polipéptidos de relaxina modificados.

La expresión "polipéptido de relaxina modificado" incluye polipéptidos conjugados con un polímero, tal como PEG o prolongador PK y puede comprender opcionalmente una o más derivaciones de cisteína, lisina u otros restos. En algunas realizaciones, el polipéptido de relaxina modificado puede comprender un enlazador, polímero o prolongador PK, en donde el aminoácido al que el enlazador, polímero o prolongador PK, se conjuga puede ser un aminoácido no natural, de acuerdo con la presente divulgación o un aminoácido codificado de forma natural (por ejemplo, lisina o cisteína) utilizando técnicas conocidas en la materia, tales como acoplamiento a lisina o a cisteína.

La expresión "polipéptido de relaxina modificado" también incluye polipéptidos de relaxina conjugados o unidos al prolongador PK descrito en el presente documento a través de un aminoácido codificado de forma natural, por ejemplo, cisteína o lisina, en el polipéptido de relaxina. En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de forma natural puede ser una sustitución o inserción en el polipéptido de relaxina.

La expresión "polipéptido de relaxina modificado" también incluye relaxina modificada glicosilada, tal como, aunque no de forma limitativa, polipéptidos glicosilados en cualquier posición del aminoácido, formas glicosiladas unidas a N o unidas a O del polipéptido. Además, también se incluyen variantes de empalme.

Todas las referencias a posiciones de aminoácidos en la relaxina modificada o sin modificar descritas en el presente documento se basan en la posición correspondiente en la cadena A de la SEQ ID NO: 4 o en la cadena B de la SEQ ID NO: 5, salvo que se indique lo contrario. Los expertos en la técnica apreciarán que las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones en las SEQ ID NO: 4 o 5 u otra secuencia de relaxina, pueden identificarse fácilmente en cualquier otra molécula de relaxina tal como fusiones, variantes, fragmentos, etc. de relaxina. Por ejemplo, se pueden usar programas de alineación de secuencias, tales como BLAST, para alinear e identificar una posición particular en una proteína que se corresponde con una posición en la SEQ ID NO: 4 o 5 u otra secuencia de relaxina. Las sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos descritas en el presente documento en referencia a las SEQ ID NO: 4 o 5 u otra secuencia de relaxina, pretenden referirse también a sustituciones, eliminaciones o adiciones, en posiciones correspondientes en fusiones, variantes, fragmentos, etc. de relaxina descritos en el presente documento o conocidos en la técnica y están expresamente abarcadas por la presente divulgación.

La expresión "polipéptido de relaxina modificado" también abarca homodímeros, heterodímeros, homomultímeros y heteromultímeros, que se forman a través de compañeros de fusión, tales como dominios Fc o que están vinculados, incluyendo, aunque no de forma limitativa, a los unidos directamente a través de cadenas laterales de aminoácidos codificadas de forma no natural, a la misma o a diferentes cadenas laterales de aminoácidos codificadas de forma no natural, a cadenas laterales de aminoácidos codificadas de forma natural o indirectamente a través de un enlazador. Los enlazadores ilustrativos que incluyen, pero sin limitación, pequeños compuestos orgánicos, polímeros solubles en agua de una variedad de longitudes, tales como polietilenglicol) o polidextrano o péptidos o polipéptidos, por ejemplo, de hasta 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o de hasta 1 aminoácido de longitud.

El término "modificado", como se utiliza en el presente documento se refiere a cualquier cambio realizado en un polipéptido dado, tal como cambios en la longitud del polipéptido, la secuencia de aminoácidos, estructura química, modificación cotraduccional o modificación postraduccional de un polipéptido. La expresión "modificado postraduccionalmente" se refiere a cualquier modificación de un aminoácido natural o no natural que le ocurre a tal aminoácido después de que se haya incorporado a una cadena polipeptídica. La expresión abarca, a modo de ejemplo solamente, modificaciones cotraduccionalesin vivo,modificaciones cotraduccionalesin vitro(tal como en un sistema de traducción sin células), modificaciones postraduccionalesin vivoy modificaciones postraduccionalesin vitro.

Un "aminoácido codificado de forma no natural" se refiere a un aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos comunes ni pirolisina ni selenocisteína. Otras expresiones que pueden usarse como sinónimo de la expresión "aminoácido codificado de forma no natural" son "aminoácido no natural", "aminoácido poco natural", "aminoácido de origen no natural" y diferentes versiones de las mismas con y sin guiones. La expresión "aminoácido codificado de forma no natural" también incluye, pero no se limita a, los aminoácidos que se producen mediante la modificación (por ejemplo, modificaciones postraduccionales) de un aminoácido codificado de forma natural (incluyendo, aunque no de forma limitativa, los 20 aminoácidos comunes o la pirrolisina y la selenocisteína), pero que no se incorporan ellos mismos a una cadena polipeptídica en crecimiento mediante el complejo de traducción. Entre los ejemplos de tales aminoácidos codificados de forma no natural se incluyen, pero sin limitación, A/-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina y O-fosfotirosina. La identidad del aminoácido codificado de forma no natural de los polipéptidos modificados con relaxina de la invención se define en las reivindicaciones.

En el contexto de un polipéptido de relaxina modificado, como se utiliza en el presente documento, las expresiones "para-acetil-fenilalanina" y "para-acetil-L-fenilalanina" (incluidas las abreviaturas pAcF y pAF) también abarcan los productos de reacciones químicas en donde el grupo acetilo en la posición para está ausente y en su lugar está presente un enlace a otra molécula. Por tanto, por ejemplo, en un polipéptido de relaxina modificado que comprende una para-acetil-fenilalanina (tal como para-acetil-L-fenilalanina), la para-acetil-fenilalanina puede comprender un enlace de oxima, triazol, amida u otro, en la posición para, por ejemplo, teniendo un enlace de oxima que resulta de la reacción del grupo carbonilo de para-acetil-L-fenilalanina con un grupo aminooxi y que carece de un carbono del carbonilo, en la posición para. Tal para-acetil-fenilalanina puede denominarse "para-acetil-fenilalanina modificada", por ejemplo, "para-acetil-L-fenilalanina modificada".

Un aminoácido ilustrativo codificado de forma no natural es para-acetil fenilalanina (pACF). Puede sintetizarse utilizando el procedimiento descrito anteriormente en Zhang, Z., Smith, B. A. C., Wang, L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P. G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746.

Un "grupo de modificación del extremo amino" se refiere a cualquier molécula que pueda unirse al extremo amino de un polipéptido. De forma similar, un "grupo de modificación del extremo carboxi" se refiere a cualquier molécula que pueda unirse al extremo carboxi de un polipéptido. Los grupos de modificación terminal incluyen, pero sin limitación, diversos polímeros solubles en agua, metionina, péptidos o proteínas, tales como la seroalbúmina, dominio Fc, región constante de inmunoglobulina, polipéptido sin estructura, adnectina o un fragmento de los mismos, ácidos grasos o derivados de los mismos u otros restos que aumentan la semivida sérica(in vivo)de los polipéptidos.

Las expresiones "grupo funcional", "resto activo", "grupo activador", "grupo saliente", "sitio reactivo", "grupo químicamente reactivo" y "resto químicamente reactivo", se usan en la técnica y en el presente documento para referirse a distintas porciones o unidades definibles de una molécula. Las expresiones son en cierto modo sinónimas en las artes químicas, y en el presente documento se usan para indicar las porciones de las moléculas que realizan alguna función o actividad y que son reactivas con otras moléculas.

El término "enlace" se utiliza en el presente documento para referirse a grupos o puentes que normalmente se forman como resultado de una reacción química y habitualmente son enlaces covalentes. Enlaces hidrolíticamente estables significa que los enlaces son sustancialmente estables en agua y que no reaccionan con agua a valores de pH útiles, incluyendo, aunque no de forma limitativa, en condiciones fisiológicas durante un período prolongado de tiempo, tal vez incluso indefinidamente. Los enlaces hidrolíticamente inestables o degradables, significan que los enlaces son degradables en agua o en soluciones acuosas, incluyendo, por ejemplo, la sangre. Los enlaces enzimáticamente inestables o degradables significan que el enlace se puede degradar por una o más enzimas. Como se entiende en la técnica, PEG, ácidos grasos y otros polímeros pueden incluir enlaces degradables en la cadena principal del polímero o en el grupo enlazador entre la cadena principal del polímero y uno o más de los grupos funcionales terminales de la molécula del polímero. Por ejemplo, los enlaces éster que pueden formarse mediante la reacción de ácidos carboxílicos o de ácidos carboxílicos activados con grupos alcohol en un agente biológicamente activo, generalmente se hidrolizan en condiciones fisiológicas para liberar el agente. Otros enlaces hidrolíticamente degradables incluyen, pero sin limitación, enlaces carbonato; enlaces de imina, que pueden resultar de la reacción de una amina y un aldehído; enlaces de éster de fosfato, que pueden formarse haciendo reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; enlaces de hidrazona que pueden ser producto de reacción de una hidrazida y un aldehído; enlaces de acetal, que pueden ser el producto de reacción de un aldehído y un alcohol; enlaces de ortoéster, que pueden ser el producto de reacción de un formiato y un alcohol; enlaces peptídicos, que pueden formarse por un grupo amino, incluyendo, aunque no de forma limitativa, en un extremo de un polímero y en un grupo carboxilo de un péptido; enlaces de oxima o de semicarbazona, que pueden ser el producto de reacción de una funcionalidad carbonilo y de un reactivo que contiene hidroxilamina o semicarbazida; y enlaces oligonucleotídicos, que pueden formarse mediante un grupo fosforamidita, incluyendo, aunque no de forma limitativa, al final de un polímero y un grupo 5' hidroxilo de un oligonucleótido.

Cuando los grupos sustituyentes se especifican por sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, estas también incluyen los sustituyentes químicamente idénticos que resultarían de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo, la estructura CH2O es equivalente a la estructura -OCH2. Las composiciones presentadas en el presente documento pueden incluir compuestos marcados isotópicamente con uno o más átomos reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o un número de masa diferente de la masa atómica o del número de masa que normalmente se encuentra en la naturaleza. Las composiciones presentadas en el presente documento pueden incluir isómeros, incluyendo, pero sin limitación, diastereoisómeros, enantiómeros y mezclas de los mismos, por ejemplo, L-aminoácidos y/o D-aminoácidos (tales como para-acetil-D-fenilalanina y/o para-acetil-L-fenilalanina).

El término "sustituyentes" incluye, pero no se limita a, "sustituyentes que no interfieren". Los "sustituyentes que no interfieren" son los grupos que producen compuestos estables. Los sustituyentes o radicales que no interfieren adecuados incluyen, pero sin limitación, halo, alquilo C1-C10, alquenilo C2-C10, alquinilo C2-C10, alcoxi C1-C10, aralquilo C1-C12, alcarilo C1-C12, cicloalquilo C3-C12, cicloalquenilo C3-C12, fenilo, fenilo sustituido, toluoilo, xilenilo, bifenilo, alcoxialquilo C2-C12, alcoxiarilo C2-C12, ariloxialquilo C7-C12, oxiarilo C7-C12, alquilsulfinilo C1-C6, alquilsulfonilo C1-C10, --(CH2)m--O--(alquilo C1-C10) en donde m es de 1 a 8, arilo, arilo sustituido, alcoxi sustituido, fluoroalquilo, radical heterocíclico, radical heterocíclico sustituido, nitroalquilo, --NO2, --CN, --NRC(O)--(alquilo C1-C10), -C(O)- -(alquilo C1-C10), C2-C10 alquiltioalquilo, -C(O)O--(alquilo C1-C10), --OH, --SO2, =S,-COOH, --NR2, carbonilo, --C(O)--(alquilo C1-C10)-CF3, --C(O)-CF3, --C(O)NR2, --(arilo C1-C10)-S--(arilo C6-C10), --C(O)--(arilo C1-C10), -(CH2)m-O--(--(CH2)m--O--(alquilo C1-C10) en donde cada m es de 1 a 8, --C(O)NR2, --C(S)NR2, --SO2NR2, --NRC(O) NR2,-NRC(S) NR2, sales de los mismos y similares. Cada R, como se utiliza en el presente documento, es H, alquilo o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido, aralquilo o alcarilo.

El término "halógeno" incluye flúor, cloro, yodo y bromo.

El término "alquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, salvo que se especifique lo contrario, un radical hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada o cíclico o una combinación de los mismos, que puede estar completamente saturada, mono o poliinsaturada y que puede incluir radicales di y multivalentes, que tiene el número de átomos de carbono indicado (es decir, C1-10 significa de uno a diez carbonos). Los ejemplos de radicales hidrocarburo saturados incluyen, pero sin limitación, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, tbutilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil)metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, npentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más puentes dobles o puentes triples. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero sin limitación, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo y los homólogos e isómeros superiores. El término "alquilo", salvo que se indique lo contrario, también pretende incluir los derivados de alquilo definidos con más detalle a continuación, tal como "heteroalquilo", Los grupos alquilo que están limitados a grupos de hidrocarburos se denominan "homoalquilo".

El término "alquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente procedente de un alcano, como se ilustra, aunque no de forma limitativa, mediante las estructuras -CH2CH2- y -CH2CH2CH2CH2- e incluye además los grupos descritos a continuación como "heteroalquileno". Habitualmente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, siendo los grupos que tienen 10 o menos átomos de carbono una realización particular de los métodos y composiciones descritos en el presente documento. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, que tiene generalmente ocho átomos de carbono o menos.

Los términos "alcoxi", "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) se usan en su sentido convencional y se refieren a aquellos grupos alquilo unidos al resto de la molécula a través de un átomo de oxígeno, un grupo amino o un átomo de azufre, respectivamente.

El término "heteroalquilo", por sí mismo o en combinación con otro término, significa, salvo que se especifique lo contrario, un radical de cadena de hidrocarburo lineal o ramificada o cíclico o combinaciones de los mismos, que consiste en el número indicado de átomos de carbono y al menos de un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, N, Si y S y en donde los átomos de nitrógeno y azufre opcionalmente pueden oxidarse y el heteroátomo de nitrógeno opcionalmente puede cuaternizarse. El heteroátomo o heteroátomos O, N y S se pueden colocar en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la que el grupo alquilo está unido al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2,-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3 y -CH=CH-N(CH3)-CH3. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos, tales como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-O-Si(CH3)3. De forma similar, el término "heteroalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa un grupo divalente procedente de heteroalquilo, como se ilustra, pero sin limitación, mediante -CH2-CH2-S-CH2 CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para los grupos heteroalquileno, los mismos o diferentes heteroátomos también pueden ocupar uno o ambos extremos de la cadena (incluyendo, aunque no de forma limitativa, alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquilendiamino, aminooxialquileno y similares). Aún más, para los grupos de enlace alquileno y heteroalquileno, la orientación del grupo de unión no está implícita en la dirección en la que se escribe la fórmula del grupo de unión. Por ejemplo, la formula -C(O)2R'- representa tanto -C(O)2R' como -R'C(O)2.

Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", por sí mismo o junto con otros términos, representan, salvo que se especifique lo contrario, versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Por tanto, un cicloalquilo o un heterocicloalquilo incluyen enlaces de anillos saturados, parcialmente insaturados y completamente insaturados. Adicionalmente, para el heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la cual el heterociclo está unido al resto de la molécula. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero sin limitación, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo y similares. Los ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero sin limitación, 1- (1,2,5,6-tetrahidropiridilo), 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1 -piperazinilo, 2-piperazinilo y similares. Adicionalmente, el término abarca estructuras de anillos bicíclicas y tricíclicas. De forma similar, el término "heterocicloalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa un radical divalente derivado de heterocicloalquilo y el término "cicloalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa un radical divalente derivado de cicloalquilo.

El término "arilo" significa, salvo que se especifique lo contrario, un grupo hidrocarburo poliinsaturado aromático sustituyente, que puede ser un anillo único o anillos múltiples (incluyendo, aunque no de forma limitativa, de 1 a 3 anillos) que están fusionados o unidos covalentemente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen de uno a cuatro heteroátomos seleccionados de N, O y S, en donde los átomos de nitrógeno y azufre están opcionalmente oxidados y el átomo o átomos de nitrógeno están opcionalmente cuaternizados. Un grupo heteroarilo se puede unir al resto de la molécula a través de un heteroátomo. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2- tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-benzoimidazolilo, 5-indolilo, 1 -isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas anulares arilo y heteroarilo indicados anteriormente se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables descritos a continuación.

Por razones de brevedad, el término "arilo" cuando se usa junto con otros términos (incluyendo, pero sin limitación, ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluye anillos tanto de arilo como de heteroarilo, como se ha definido anteriormente. Por tanto, el término "aralquilo" o "alcanlo" pretende incluir los radicales en los que un grupo arilo está unido a un grupo alquilo (incluyendo, aunque no de forma limitativa, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y similares), incluidos los grupos alquilo en los que un átomo de carbono (incluyendo, aunque no de forma limitativa, un grupo metileno) se ha reemplazado, por ejemplo, por un átomo de oxígeno (incluyendo, aunque no de forma limitativa, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3-(1-naftiloxi)propilo y similares).

Cada uno de los términos anteriores (incluyendo, aunque no de forma limitativa, "alquilo", "heteroalquilo", "arilo" y "heteroarilo") pretenden incluir formas tanto sustituidas como no sustituidas del radical indicado. A continuación, se proporcionan sustituyentes ilustrativos para cada tipo de radical.

Los sustituyentes de los radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo aquellos grupos denominados a menudo alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o más de una diversidad de grupos seleccionados de, aunque no de forma limitativa: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halógeno, -SiR'R"R"', OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', NR' C(O)NR"W", -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", NR C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", NRSO2R', -CN y -NO2 en un número que varía entre cero y (2 m'+1), donde m' es el número total de átomos de carbono en tal radical. R', R", Rm y R"" cada uno se refiere independientemente a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, incluyendo, aunque no de forma limitativa, arilo sustituido por 1-3 halógenos, alquilo sustituido o no sustituido, alcoxi o grupos tioalcoxi o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como son cada grupo R', R", R''' y R'''' cuando está presente más de uno de estos grupos. Cuando R' y R" están unidos al mismo átomo de nitrógeno, se pueden combinar con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" pretende incluir, pero sin limitarse a, 1 -pirrolidinilo y 4-morfolinilo. Del anterior análisis de los sustituyentes, una persona experta en la materia comprenderá que el término "alquilo" pretende incluir grupos que incluyen átomos de carbono unidos a grupos diferentes a los grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (incluyendo, aunque no de forma limitativa, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo, aunque no de forma limitativa, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 y similares).

Al igual que los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo son variados y se seleccionan de, pero son limitación: halógeno, OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halógeno, -SiR'R"R"', OC(O)R', -C(O)R', CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', NR' C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', NR-C(NR'R"R"')=NR"", NR C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", NRSO2R', -CN y -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoroalcoxi (C1-C4) y fluoroalquilo (C1-C4), en un número que varía entre cero y el número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y donde R', R", R'" y R"" se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, arilo y heteroarilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como un grupo R', R", R'" y R"" cuando está presente más de uno de estos grupos.

La expresión "ácido graso" se refiere a una cadena de acilo saturada o insaturada que tiene de 6 a 20 átomos de carbono o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el ácido graso puede estar unido a un componente peptídico del potenciador PK descrito en el presente documento y terminar en un ácido carboxílico o en un grupo metilo. En algunas realizaciones, el ácido graso unido al componente peptídico del potenciador PK puede terminar en un ácido carboxílico. En algunas realizaciones, el ácido graso puede estar unido al componente peptídico a través de un puente de amida. En algunas realizaciones, el ácido graso puede tener entre 10 y 18 átomos de carbono. En algunas realizaciones, el ácido graso puede tener entre 12 y 17 átomos de carbono. En algunas realizaciones, el ácido graso puede tener 14, 15 o 16 átomos de carbono. En algunas realizaciones, el ácido graso puede tener 15 átomos de carbono.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "polímero soluble en agua" se refiere a cualquier polímero que sea soluble en disolventes acuosos. El enlace de polímeros solubles en agua a polipéptidos de relaxina modificados puede dar como resultado cambios que incluyen, aunque no de forma limitativa, semivida en suero(in vivo)aumentada o modulada o semivida terapéutica aumentada o modulada en relación con la forma sin modificar, inmunogenicidad o toxicidad reducida o modulada, características de asociación física moduladas, tales como disminución de la agregación y formación de multímeros, unión alterada al receptor, unión alterada a uno o más compañeros de unión y dimerización o multimerización del receptor alterada. El polímero soluble en agua puede tener o no su propia actividad biológica y puede utilizarse como enlazador para unir relaxina modificada a otras sustancias, incluyendo, aunque no de forma limitativa, uno o más polipéptidos de relaxina modificados o sin modificar o una o más moléculas biológicamente activas. Los polímeros adecuados incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol, propionaldehído de polietilenglicol, monoalcoxi C1-C10 o derivados de ariloxi del mismo (descritos en la patente de Estados Unidos N.° 5.252.714), monometoxi-polietilenglicol, PEG discretos, polivinil pirrolidona, alcohol polivinílico, poliaminoácidos, anhídrido maleico de divinileter, A/-(2-h¡drox¡propil)-metacr¡lam¡da, dextrano, derivados de dextrano, incluido el sulfato de dextrano, polipropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polisacáridos, oligosacáridos, glicanos, celulosa y derivados de celulosa, incluyendo, aunque no de forma limitativa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa, almidón y derivados del almidón, polipéptidos de dos o más aminoácidos, polialquilenglicol y derivados del mismo, copolímeros de polialquilenglicoles y sus derivados, éteres polivinílicos etílicos y alfa-beta-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida y similares o mezclas de los mismos. Entre los ejemplos de tales polímeros hidrosolubles se incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol y seroalbúmina.

Como se utiliza en el presente documento, el término "polialquilenglicol" (PEG) o "poli(alquenglicol)" se refiere a polietilenglicol (polietilenglicol)), polipropilenglicol, polibutilenglicol y derivados de los mismos. El término "polialquilenglicol" abarca polímeros tanto lineales como ramificados y pesos moleculares promedio de entre 0,1 kDa y 100 kDa. Se enumeran otras realizaciones ilustrativas, por ejemplo, en catálogos de proveedores comerciales, tales como el catálogo de Shearwater Corporation "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001).

Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "semivida sérica modulada" o "semivida moduladain vivo"y términos similares, se refieren al cambio positivo o negativo en la semivida circulante de una relaxina modificada en relación con un comparador, tal como su forma sin modificar o la relaxina de tipo silvestre. La semivida sérica se puede medir tomando muestras de sangre en diversos momentos después de la administración de una relaxina modificada y determinando la concentración de esa molécula en cada muestra. La correlación de la concentración sérica con el tiempo permite calcular la semivida sérica. La semivida en suero(in vivo)aumentada deseable puede ser al menos aproximadamente el doble, pero un aumento menor puede ser útil, por ejemplo, cuando permite un régimen de dosificación satisfactorio o evita un efecto tóxico. En algunas realizaciones, el aumento puede ser al menos aproximadamente tres veces, al menos cinco veces, al menos diez veces, al menos aproximadamente veinte veces o al menos aproximadamente cincuenta veces.

La expresión "semivida terapéutica modulada", como se utiliza en el presente documento, significa el cambio positivo o negativo en la semivida sérica oin vivode la cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de relaxina modificado descrito en el presente documento, en relación con un comparador, tal como su forma sin modificar o la relaxina de tipo silvestre. La semivida terapéutica se mide midiendo las propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de la molécula en diversos momentos después de la administración. Es deseable que la semivida terapéutica aumentada permita un régimen de dosificación beneficioso particular, una dosis total beneficiosa particular o que evite un efecto no deseado. En algunas realizaciones, el aumento de la semivida terapéutica resulta del aumento de la potencia, del aumento o disminución de la unión de la molécula modificada a su diana, aumento o disminución de la descomposición de la molécula por enzimas, tales como proteasas o de un aumento o disminución en otro parámetro o mecanismo de acción de la molécula sin modificar o de un aumento o disminución en la eliminación de la molécula mediada por receptores. En algunas realizaciones, el aumento de la semivida terapéutica puede ser al menos aproximadamente el doble, al menos aproximadamente tres veces, al menos cinco veces, al menos diez veces, al menos aproximadamente veinte veces o al menos aproximadamente cincuenta veces.

El término "aislado", cuando se aplica a un ácido nucleico o proteína, denota que el ácido nucleico o la proteína está sin al menos algunos de los componentes celulares con los que están asociados en el estado natural o que el ácido nucleico o la proteína se han concentrado a un nivel mayor que la concentración de su producciónin vivooin vitro.Puede estar en un estado homogéneo. Las sustancias aisladas pueden estar en estado seco o semiseco o en solución, incluyendo, aunque no de forma limitativa, una solución acuosa. Puede ser un componente de una composición farmacéutica que comprende vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables adicionales. La pureza y la homogeneidad se suelen determinar usando técnicas de química analítica, tales como la electroforesis en gel de poliacrilamida o la cromatografía líquida de alto rendimiento. Un proteína que sea la especie predominante presente en una preparación está prácticamente purificada. En particular, un gen aislado se separa de los marcos abiertos de lectura que flanquean el gen y que codifican una proteína distinta del gen de interés. El término "purificado" denota que un ácido nucleico o proteína da lugar esencialmente a una banda en un gel electroforético. Particularmente, significa que el ácido nucleico o la proteína es al menos un 85 % puro, al menos un 90 % puro, al menos un 95 % puro, al menos un 99 % o más puro.

La expresión "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos, desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma monocatenaria o bicatenaria. Salvo que esté específicamente limitado, la expresión abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de origen natural. Salvo que se limite específicamente lo contrario, la expresión también se refiere a análogos de oligonucleótidos que incluyen PNA (ácido peptidonucleico), análogos del ADN utilizados en tecnología antisentido (fosforotioatos, fosforoamidatos y similares). Salvo que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas de forma conservadora de la misma (incluyendo, entre otras, sustituciones de codones degeneradas) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Es decir, una descripción dirigida a polipéptido se aplica igualmente a una descripción de un péptido y a una descripción de una proteína y viceversa. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos de origen natural, así como a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos es un aminoácido codificado de forma no natural. Como se utiliza en el presente documento, los términos abarcan cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completa, en donde los restos de aminoácidos se unen mediante puentes peptídicos covalentes.

Las "variantes modificadas de forma conservativa" se refieren a secuencias de aminoácidos que contienen sustituciones conservativas. Las variantes modificadas de forma conservativa ilustrativas incluyen sustituciones, deleciones o inserciones individuales respecto a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteínas que altera, añade o elimina un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia polipeptídica o en la secuencia polipeptídica codificada, por ejemplo, hasta 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos o hasta un 0,5 %, un 1 %, un 1,5 %, un 2 %, un 2,5 % o un 3,5 % de los aminoácidos en la secuencia polipeptídica o en la secuencia polipeptídica codificada, que opcionalmente puede ser o puede incluir la sustitución de aminoácidos por un(os) aminoácido(s) químicamente similar(es). Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas para las personas normalmente versadas en la materia. Tales variantes modificadas de forma conservativa son adicionales y no excluyen las variantes polimórficas, los homólogos entre especies y los alelos de los polipéptidos de relaxina modificados divulgados.

Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas para las personas normalmente versadas en la materia. Los ocho grupos siguientes contienen, cada uno, aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:

1) Alanina (A o Ala), Glicina (G o Gly);

2) Ácido aspártico (D o Asp), Ácido glutámico (E o Glu);

3) Asparagina (N o Asn), Glutamina (Q o Gln);

4) Arginina (R o Arg), Lisina (K o Lys), Histidina (H o His);

5) Isoleucina (I o Ile), Leucina (L o Leu), Metionina (M o Met), Valina (V o Val);

6) Fenilalanina (F o Phe), Tirosina (Y o Tyr), Triptófano (W o Trp);

7) Serina (S o Ser), Treonina (T o Thr); y

8) Cisteína (C o Cys), Metionina (M o Met)

(véase, por ejemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman and Co.; 2a edición (diciembre de 1993).

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, hacen referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Las secuencias son "sustancialmente idénticas" si tienen un porcentaje de restos de aminoácidos o de nucleótidos que son iguales (es decir, aproximadamente un 60 % de identidad, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 99 %, identidad sobre una región específica), cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima a lo largo de una ventana de comparación o una región designada medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias (u otros algoritmos disponibles para personas con experiencia habitual en la técnica) o mediante alineación manual e inspección visual. La identidad puede existir a lo largo de una región o ventana de comparación que tiene al menos aproximadamente 20 aminoácidos o nucleótidos de longitud o a lo largo de una región que tiene al menos 25 aminoácidos o nucleótidos de longitud o cuando no se especifica, en toda la secuencia de un polinucleótido o polipéptido. Una "ventana de comparación", como se utiliza en el presente documento, incluye la referencia a cualquier segmento de posiciones contiguas, por ejemplo, al menos o aproximadamente 10, 15, 20, 25 o 30 aminoácidos, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alineen de manera óptima. Los ejemplos de algoritmos que pueden ser adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschulet al.(1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 y Altschulet al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente, así como los algoritmos de Smith-Waterman (Smith y Waterman, J Mol Biol. 1981 Mar 25;147(1):195-7) o de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, J Mol Biol. marzo de 1970; 48 (3): 443-53), que se pueden ejecutar con los parámetros predeterminados, por ejemplo, como se describe en esas publicaciones respectivas.

El término "sujeto", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un animal, en algunas realizaciones a un mamífero y en otras realizaciones a un ser humano, que es el objeto del tratamiento, observación o experimentación. Un animal puede ser un animal de compañía (por ejemplo, perros, gatos y similares), un animal de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos y similares) o un animal de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas y similares).

La expresión "cantidad eficaz" como se utiliza en el presente documento, se refiere a esa cantidad del compuesto (por ejemplo, un polipéptido de relaxina modificado descrito en el presente documento) que se administra que puede prevenir, curar, mitigar, aliviar, retardar el inicio, disminuir la gravedad o reducir en cierta medida uno o más de los síntomas de la enfermedad, afección o trastorno que se trate. Las composiciones que contienen el polipéptido de relaxina modificado descrito en el presente documento se pueden administrar para tratamientos profilácticos, potenciadores y/o terapéuticos.

Las expresiones "potenciar" o "que potencia" significan aumentar o prolongar la potencia o la duración de un efecto deseado. Por tanto, con respecto a potenciar el efecto de los agentes terapéuticos, la expresión "que potencia" se refiere a la capacidad de aumentar o prolongar, en potencia o en duración, el efecto de otros agentes terapéuticos en un sistema.

En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen el polipéptido de relaxina modificado se administran a un/a paciente susceptible o de otro modo, en riesgo de padecer una enfermedad, trastorno o afección particular. Tal cantidad se define como una "dosis profilácticamente eficaz".

En aplicaciones terapéuticas, las composiciones que comprenden el polipéptido de aminoácidos no naturales modificado se administran a un/a paciente que ya padece una enfermedad, afección o trastorno, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener o aliviar parcialmente los síntomas de la enfermedad, trastorno o afección. Tal cantidad se define como una "cantidad terapéuticamente eficaz", y puede depender de la gravedad y del curso de la enfermedad, trastorno o afección, terapia previa, el estado de salud del paciente y de la respuesta a los fármacos y del criterio del personal médico responsable. Se considera bien dentro de la experiencia de la técnica determinar tales cantidades terapéuticamente eficaces mediante experimentación rutinaria (por ejemplo, ensayo clínico con aumento escalonado de la dosis).

La expresión "que trata" se utiliza para referirse a tratamientos profilácticos y/o terapéuticos.

"Agente reductor", como se utiliza en el presente documento respecto al replegado de proteínas, se define como cualquier compuesto o material que mantiene los grupos sulfhidrilo en el estado reducido y reduce los puentes disulfuro intra o intermoleculares. Los agentes reductores adecuados incluyen, pero sin limitación, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, cisteína, cisteamina (2-aminoetanotiol) y glutatión reducido. Es fácilmente evidente para las personas normalmente versadas en la materia que es adecuada una amplia variedad de agentes reductores para usar en los métodos y composiciones de la presente invención.

"Agentes oxidante", como se utiliza en el presente documento respecto al replegado de proteínas, se define como cualquier compuesto o material que es capaz de eliminar un electrón de un compuesto que se está oxidando. Los agentes oxidantes adecuados incluyen, pero sin limitación, glutatión oxidado, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado y oxígeno. Es fácilmente evidente para las personas normalmente versadas en la materia que una amplia variedad de agentes oxidantes es adecuada para usar en los métodos de la presente invención.

"Agente desnaturalizante" o "desnaturalizante", como se utiliza en el presente documento, se define como cualquier compuesto o material que provocará un despliegue reversible de una proteína. La fuerza de un desnaturalizante o agente desnaturalizante estará determinada tanto por las propiedades como por la concentración del desnaturalizante o agente desnaturalizante particular. Los desnaturalizantes o agentes desnaturalizantes adecuados pueden ser caótropos, detergentes, disolventes orgánicos, disolventes miscibles en agua, fosfolípidos o una combinación de dos o más de tales agentes. Los caótropos adecuados incluyen, pero sin limitación, urea, guanidina y tiocianato de sodio. Los detergentes útiles pueden incluir, pero sin limitación, detergentes fuertes, tales como dodecilsulfato de sodio o éteres de polioxietileno (por ejemplo, detergentes Tween o Triton), Sarkosyl, detergentes no iónicos suaves (por ejemplo, digitonina), detergentes catiónicos suaves, tales como N->2,3-(Dioleioxi)-propil-N,N,N-trimetilamonio, detergentes iónicos suaves (por ejemplo, colato de sodio o desoxicolato de sodio) o detergentes zwitteriónicos, incluidos, aunque no de forma limitativa, sulfobetaínas (Zwittergent), sulfato de 3-(3-clolamidopropil)dimetilamonio-1-propano (CHAPS) y sulfonato de 3-(3-clolamidopropil)dimetilamonio-2-hidroxi-1-propano (CHAPSO). Los disolventes orgánicos miscibles en agua, tales como acetonitrilo, alcanoles inferiores (especialmente alcanoles C2 - C4, tales como etanol o isopropanol) o alcanodioles inferiores (especialmente alcanoles C2 - C4, tales como etilenglicol), pueden utilizarse como desnaturalizantes. Los fosfolípidos útiles en la presente invención pueden ser fosfolípidos de origen natural, tales como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidilinositol o derivados o variantes de fosfolípidos sintéticos, tales como dihexanoilfosfatidilcolina o diheptanoilfosfatidilcolina.

"Replegado", como se utiliza en el presente documento describe cualquier proceso, reacción o método que transforma polipéptidos que contienen puentes disulfuro de un estado plegado o desplegado incorrectamente a una conformación nativa o plegada adecuadamente con respecto a los puentes disulfuro.

"Plegado conjuntamente", como se utiliza en el presente documento, se refiere específicamente a procesos, reacciones o métodos de replegado que emplean al menos dos polipéptidos que interactúan entre sí y dan como resultado la transformación de polipéptidos desplegados o plegados incorrectamente en polipéptidos nativos correctamente plegados.

El término "protegido" se refiere a la presencia de un "grupo protector" o resto que impide la reacción del grupo funcional químicamente reactivo en ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo a proteger. Por ejemplo, si el grupo químicamente reactivo es una amina o una hidrazida, el grupo protector se puede seleccionar del grupo de ferc-butiloxicarbonilo (t-Boc) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Si el grupo químicamente reactivo es un tiol, el grupo protector puede ser ortopiridildisulfuro. Si el grupo químicamente reactivo es un ácido carboxílico, tal como ácido butanoico o propiónico o es un grupo hidroxilo, el grupo protector puede ser bencilo o un grupo alquilo, tal como metilo, etilo o ferc-butilo. También se pueden usar otros grupos protectores conocidos en la técnica en o con los métodos y composiciones descritos en el presente documento, incluidos los grupos fotolábiles tales como Nvoc y MeNvoc. También se pueden usar otros grupos protectores conocidos en la técnica en o con los métodos y composiciones descritos en el presente documento.

A modo de ejemplo solamente, los grupos de bloqueo/protección pueden seleccionarse de:

Otros grupos protectores se describen en Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a ed., John Wiley & Sons, Nueva York, NY, 1999.

Las expresiones "trastornos del sistema cardiovascular" o "trastornos cardiovasculares" incluyen, por ejemplo, los siguientes trastornos: hipertensión (presión arterial alta), trastornos vasculares periféricos y cardiacos, cardiopatía coronaria, angina de pecho estable e inestable, ataque cardiaco, insuficiencia miocárdica, ritmos cardiacos anormales (o arritmias), disfunción isquémica persistente ("miocardio en hibernación"), disfunción postisquémica temporal ("miocardio aturdido"), insuficiencia cardiaca, alteraciones del flujo sanguíneo periférico, síndrome coronario agudo, insuficiencia cardiaca, enfermedad del músculo cardiaco (miocardiopatía), infarto de miocardio y enfermedad vascular (enfermedad de los vasos sanguíneos).

La expresión "insuficiencia cardiaca" incluye manifestaciones agudas y crónicas de insuficiencia cardiaca, así como tipos de enfermedades más específicas o relacionadas, tales como insuficiencia cardiaca avanzada, insuficiencia cardiaca postaguda, síndrome cardio-renal, insuficiencia cardiaca con función renal deteriorada, insuficiencia cardiaca crónica, insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección de rango medio (HFmEF, por sus siglas en inglés), insuficiencia cardiaca compensada, insuficiencia cardiaca descompensada, insuficiencia cardiaca derecha, insuficiencia cardiaca izquierda, insuficiencia global, miocardiopatía isquémica, miocardiopatía dilatada, insuficiencia cardiaca asociada con defectos cardiacos congénitos, defectos de las válvulas cardiacas, insuficiencia cardiaca asociada con defectos de las válvulas cardiacas, estenosis mitral, insuficiencia mitral, estenosis aórtica, insuficiencia aórtica, estenosis de la tricuspídea, insuficiencia tricúspide, estenosis pulmonar, insuficiencia de la válvula pulmonar, insuficiencia cardiaca asociada con defectos combinados de las válvulas cardiacas, inflamación del miocardio (miocarditis), miocarditis crónica, miocarditis aguda, miocarditis vírica, insuficiencia cardiaca diabética, miocardiopatía alcohólica, insuficiencia cardiaca asociada con trastornos de almacenamiento cardiaco, insuficiencia cardiaca diastólica, insuficiencia cardiaca sistólica, fases agudas de empeoramiento de la insuficiencia cardiaca, insuficiencia cardiaca con fracción de eyección conservada (HFpEF, por sus siglas en inglés), insuficiencia cardiaca con fracción de eyección reducida (HFrEF, por sus siglas en inglés), insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección reducida (HFrEF), insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección conservada (HFpEF), remodelación posmiocárdica, angina de pecho, hipertensión, hipertensión pulmonar e hipertensión arterial pulmonar.

La expresión "trastornos fibróticos" abarca enfermedades y trastornos caracterizados por fibrosis, incluyendo entre otras, las siguientes enfermedades y trastornos: fibrosis del hígado o hepática, cirrosis hepática, ENA, fibrosis pulmonar o fibrosis del pulmón, fibrosis cardiaca, fibrosis endomiocárdica, nefropatía, glomerulonefritis, fibrosis renal intersticial, daño fibrótico resultante de la diabetes, fibrosis de la médula ósea y trastornos fibróticos similares, esclerodermia, morfea, queloides, cicatrices hipertróficas (también tras procedimientos quirúrgicos), nevos, retinopatía diabética, vitreorretinopatía proliferativa y trastornos del tejido conectivo (por ejemplo, sarcoidosis).

Las expresiones "trastorno asociado a la relaxina" y "enfermedad asociada a la relaxina" abarcan enfermedades y trastornos que se pueden prevenir, tratar, aliviar o afectar de otro modo mediante la modulación del nivel de relaxina en el cuerpo, tal como el aumento del nivel de proteína relaxina sérica. Los trastornos asociados a la relaxina incluyen, aunque no de forma limitativa, trastornos del sistema cardiovascular y trastornos fibróticos descritos en el presente documento.

El polipéptido que comprende aminoácidos codificados de forma no natural presentado en el presente documento puede incluir compuestos marcados isotópicamente con uno o más átomos reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o un número de masa diferente de la masa atómica o del número de masa que normalmente se encuentra en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en los presentes compuestos incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, flúor y cloro, tal como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 180, 170, 35S, 18F, 36Cl, respectivamente. Ciertos compuestos marcados isotópicamente descritos en el presente documento, por ejemplo, aquellos en los que se incorporan isótopos radiactivos tales como 3H y 14C, pueden ser útiles en los ensayos de distribución de fármacos y/o sustrato en tejidos. Además, la sustitución con isótopos tales como deuterio, es decir, 2H, puede permitir ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una semividain vivoaumentada o unos requisitos de dosis reducidos.

I. Descripción general

En la divulgación se proporcionan moléculas de relaxina modificadas unidas a un potenciador PK. Se ha demostrado que las realizaciones ilustrativas presentan al menos una propiedad ventajosa seleccionada de semividain vivoaumentada, formación de vacuolas renales disminuida, flujo sanguíneo renal aumentado, mayor solubilidad, agregación disminuida, menor viscosidad, capacidad de fabricación aumentada, en comparación con otros polipéptidos de relaxina modificados o de tipo silvestre.

En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido de relaxina modificado como se define en las reivindicaciones.

El polipéptido de la cadena A de relaxina comprende la SEQ ID NO: 4 sustituida por dicho aminoácido codificado de forma no natural en el resto 1 y que opcionalmente tiene hasta dos sustituciones, inserciones y/o eliminaciones adicionales de aminoácidos. Dicho polipéptido de la cadena A de relaxina puede comprender la SEQ ID NO: 4 sustituida por dicho aminoácido codificado de forma no natural en el resto 1 y que opcionalmente tiene una sustitución, inserción y/o deleción adicional de aminoácidos. Dicho polipéptido de cadena B de relaxina comprende la SEQ ID NO: 5 o la<s>E<q>ID NO: 6 que tiene opcionalmente hasta dos sustituciones, inserciones o deleciones adicionales de aminoácidos. Dicho polipéptido de cadena B de relaxina puede comprender la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6 que tiene opcionalmente una sustitución, inserción y/o deleción adicional de aminoácidos. Dicho polipéptido de cadena A de relaxina puede comprender la SEQ ID NO: 4 sustituida por dicho aminoácido codificado de forma no natural en el resto 1 y dicho polipéptido de cadena B de relaxina puede comprender la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6.

En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de forma no natural puede comprender un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazida, un grupo hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino. Dicho aminoácido codificado de forma no natural puede comprender un derivado de fenilalanina. Dicho aminoácido codificado de forma no natural puede seleccionarse de una fenilalanina para-sustituida, orto-sustituida o meta-sustituida. Dicho aminoácido codificado de forma no natural puede seleccionarse de fenilalanina para-sustituida, orto-sustituida o meta-sustituida que comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazida, un grupo hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino. Dicho aminoácido codificado de forma no natural puede comprender para-acetil-L-fenilalanina. Dicho aminoácido codificado de forma no natural puede estar unido a dicho potenciador farmacocinético. Por ejemplo, dicho aminoácido codificado de forma no natural puede estar unido a dicho potenciador farmacocinético a través de un enlace de oxima o de un enlace de triazol, por ejemplo, un enlace de oxima.

En algunas realizaciones, dicho polipéptido de cadena A de relaxina puede comprender la SEQ ID NO: 35 y dicho polipéptido de cadena B de relaxina puede comprender la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6 y en donde dicha cadena A o cadena B de relaxina opcionalmente puede tener hasta dos sustituciones, inserciones o deleciones adicionales de aminoácidos. Dicho polipéptido de cadena A de relaxina puede comprender la SEQ ID NO: 35 y el polipéptido de cadena B de relaxina puede comprender la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, dicho polipéptido de cadena A de relaxina puede comprender la SEQ ID NO: 35 y el polipéptido de cadena B de relaxina puede comprender la SEQ ID NO: 6.

En algunas realizaciones, dicho componente peptídico puede comprender entre 1 y 25 aminoácidos, por ejemplo, entre 2 y 20 aminoácidos, entre 3 y 10 restos de aminoácidos o entre 4 y 8 restos de aminoácidos.

Dicho componente peptídico comprende GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139), DRDDRD (SEQ ID NO: 102), KKKKKK-GluY (SEQ ID NO: 103), RGGEEKKKEKEK-GluY(SEQ ID NO: 104), GGGEEE-GluY(SEQ ID NO: 105), EEEGGG-GluY (SEQ ID NO: 106), KKKGGG-GluY (SEQ ID NO: 107), GGGKKK-GluY(SEQ ID NO: 109), GSHHHHHGS-GluY (SEQ ID NO: 110), Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-GluY (SEQ ID NO: 112), Sar-Sar-Sar-Glu-Glu-GluY (SEQ ID NO: 113) o KSGGSGG-GluY (SEQ ID NO: 117).

Dicho componente peptídico puede comprender GluY. Por ejemplo, dicho componente peptídico puede comprender GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139).

En realizaciones ilustrativas, dicho polipéptido de relaxina modificado puede comprender el polipéptido de cadena A de relaxina de la SEQ ID<n>O: 4 y el polipéptido de cadena B de relaxina de la<s>E<q>ID NO: 5 o de la SEQ ID NO: 6, sustituido por un aminoácido codificado de forma no natural en el resto 1 de la cadena A, en donde dicho aminoácido codificado de forma no natural está unido a dicho potenciador farmacocinético y dicho potenciador farmacocinético comprende el componente peptídico GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139). En algunas realizaciones, el componente peptídico puede estar unido covalentemente a dicho aminoácido codificado de forma no natural, por ejemplo, mediante un enlace de oxima.

En realizaciones ilustrativas, dicho resto prolongador de semivida puede comprender un ácido graso o un derivado del mismo, en donde el ácido graso o derivado del mismo puede estar unido covalentemente al componente peptídico. Dicho resto prolongador de semivida puede comprender un ácido graso saturado o un derivado del mismo. Dicho resto prolongador de semivida puede comprender un ácido graso terminado con un ácido carboxílico. Dicho resto prolongador de semivida puede comprender un ácido graso de Fórmula I: -Cn-COOH (Fórmula I), en donde n puede estar entre 10 y 18, tal como entre 12 y 17 o 13, 14, 15 o 16. En algunas realizaciones, -Cn- de Fórmula I puede comprender un primer carbono del carbonilo y -(CH2)n-i-. Por ejemplo, -C13- puede ser -(C=O)-(CH2)<i>2-; -C14- puede ser -(C=O)-(CH2)13-; -C15- puede ser -(C=O)-(CH2)14-. En algunas realizaciones, el primer carbono del carbonilo del ácido graso puede estar unido a un resto (gamma) Glu, opcionalmente a través de un puente de amida. En algunas realizaciones, el primer carbono del carbonilo del ácido graso puede estar unido a un resto gamma Glu a través de un puente de amida.

En realizaciones ilustrativas adicionales, dicho resto prolongador de semivida puede comprender -C14-COOH. En realizaciones ilustrativas adicionales, dicho potenciador farmacocinético puede comprender la estructura:

(Fórmula II)

en donde el grupo aminooxi de Fórmula II está unido al aminoácido no natural en dicho polipéptido de relaxina modificado, por ejemplo, mediante un enlace de oxima.

En realizaciones ilustrativas adicionales, dicho resto prolongador de semivida se puede conjugar con dicho componente peptídico a través de un puente de amida.

En realizaciones ilustrativas adicionales, dicho polipéptido de relaxina puede comprender el polipéptido de cadena A de relaxina de la SEQ ID NO: 4 y el polipéptido de cadena B de relaxina de la S<e>Q ID<n>O: 5 o la SEQ ID NO: 6, sustituido por un aminoácido codificado de forma no natural en el resto 1 de la cadena A; en donde dicho aminoácido codificado de forma no natural comprende para-acetil-L-fenilalanina; en donde dicho aminoácido codificado de forma no natural está unido a dicho potenciador farmacocinético que comprende un componente peptídico que comprende GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139); y un resto prolongador de semivida que comprende -C14-COOH, tal como - (C=O)-(CH2)13-COOH.

En una realización adicional, la divulgación proporciona un polipéptido de relaxina modificado que comprende la estructura:

que se define en las reivindicaciones.

En una realización adicional, la divulgación proporciona un polipéptido de relaxina modificado que comprende el conjugado de relaxina "AQ1-GGGGS-GluY(SEQ iD NO: 139)-C14-c Oo H" que comprende un polipéptido de cadena A de relaxina de la SEQ ID NO: 35 y un polipéptido de cadena B de relaxina de la SEQ ID NO: 6, en donde la paraacetil-L-fenilalanina situada en el extremo N terminal de dicho polipéptido de cadena A de relaxina puede estar unida al potenciador PK GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH, como se representa en la Fórmula III:

En una realización adicional, el polipéptido de relaxina modificado comprende la estructura mostrada en la Fig. 8.

En una realización adicional, el polipéptido de relaxina modificado comprende la estructura mostrada en la Fig. 9.

Dicho polipéptido de relaxina modificado es biológicamente activo. Dicho polipéptido de relaxina modificado puede ser terapéuticamente eficaz para el tratamiento de una o más enfermedades o afecciones asociadas con la relaxina. Dicho polipéptido de relaxina modificado puede presentar una disminución de la formación de vacuolas renales, en comparación con un compuesto de comparación, tal como AQ1-PEG 20 kDa (relaxina AQ1 conjugada con PEG con un PM promedio de 20 kDa). Dicho polipéptido de relaxina modificado puede presentar un deterioro nulo o reducido de la función renal, en comparación con un compuesto de comparación, tales como AQ1-PEG 20 kDa. Dicha función renal se puede medir determinando una o más de la tasa de filtración glomerular estimada, aclaramiento de creatina, tasa de filtración glomerular de insulina o tasa de filtración glomerular isotópica.

En realizaciones ilustrativas, dicho polipéptido de relaxina modificado no presenta un flujo sanguíneo renal disminuido y/o puede ser capaz de aumentar el flujo sanguíneo renal, después de la administración. El flujo sanguíneo renal se puede medir determinando el aclaramiento de para-aminohipurato.

Dicho polipéptido de relaxina modificado puede presentar una semividain vivoaumentada, por ejemplo, aumentada en al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces o al menos 50 veces, en comparación con un compuesto de comparación, tal como la relaxina de tipo silvestre.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento para el tratamiento o prevención de un trastorno asociado a la relaxina y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en un método para tratar o evitar una enfermedad asociada con la relaxina que comprende administrar una cantidad eficaz de un polipéptido de relaxina modificado o una composición que comprende un polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento a un/a paciente que lo necesita.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en un método para tratar o evitar una enfermedad cardiovascular que comprende administrar una cantidad eficaz de un polipéptido de relaxina modificado o una composición que comprende un polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento a un/a paciente que lo necesita. Dicha enfermedad cardiovascular puede seleccionarse de arteriopatía coronaria, ataque cardiaco, arritmia, insuficiencia cardiaca, miocardiopatía y enfermedad vascular.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en un método para tratar, prevenir o aliviar un síntoma de insuficiencia cardiaca, que comprende administrar una cantidad eficaz de un polipéptido de relaxina modificado o una composición que comprende un polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento a un/a paciente que lo necesita. Dicha insuficiencia cardiaca puede seleccionarse de insuficiencia cardiaca avanzada, síndrome cardio-renal, insuficiencia cardiaca con función renal deteriorada, insuficiencia cardiaca crónica, insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección de rango medio (HFmEF), insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca postaguda, insuficiencia cardiaca compensada, insuficiencia cardiaca descompensada, insuficiencia cardiaca derecha, insuficiencia cardiaca izquierda, insuficiencia cardiaca global, miocardiopatía isquémica, miocardiopatía dilatada, insuficiencia cardiaca asociada con defectos cardiacos congénitos, insuficiencia cardiaca asociada con defectos de las válvulas cardiacas, insuficiencia cardiaca asociada con defectos combinados de las válvulas cardiacas, insuficiencia cardiaca diabética, miocardiopatía alcohólica, insuficiencia cardiaca asociada con trastornos de almacenamiento cardiaco, insuficiencia cardiaca diastólica, insuficiencia cardiaca sistólica, remodelación posmiocárdica, insuficiencia cardiaca con fracción de eyección conservada (HFpEF), insuficiencia cardiaca con fracción de eyección reducida (HFrEF), angina de pecho, hipertensión, hipertensión pulmonar e hipertensión arterial pulmonar.

En algunas realizaciones, dicha insuficiencia cardiaca puede seleccionarse de insuficiencia cardiaca crónica, insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca postaguda, insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección reducida (HFrEF), insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección conservada (HFpEF), insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección de rango medio (HFmEF), insuficiencia cardiaca diastólica, insuficiencia cardiaca sistólica, remodelación posmiocárdica, angina de pecho, hipertensión, hipertensión pulmonar e hipertensión arterial pulmonar.

En algunas realizaciones, dicha insuficiencia cardiaca puede seleccionarse de insuficiencia cardiaca posaguda, insuficiencia cardiaca avanzada, síndrome cardio-renal e insuficiencia cardiaca con función renal deteriorada.

Dichos métodos de tratamiento pueden comprender además administrar, en combinación, simultánea o secuencialmente, con dicho polipéptido de relaxina modificado, al menos un agente terapéutico adicional seleccionado de inhibidores de ACE, p-bloqueantes, diuréticos, antagonistas de los receptores de mineralocorticoides, moduladores del receptor de rianodina, activadores de SERCA2a, inhibidores de la renina, bloqueantes de los canales de calcio, agonistas del receptor de adenosina A1, receptor parcial de adenosina A1, inhibidores de dopamina p-hidroxilasa, antagonistas del receptor de angiotensina II, antagonistas del receptor de angiotensina II con agonismo sesgado para rutas de señalización celular seleccionadas, combinaciones de antagonistas del receptor de angiotensina II e inhibidores de la enzima neprilisina, inhibidores de la enzima neprilisina, activadores solubles de guanilato ciclasa, activadores de miosina ATPasa, inhibidores de rho-quinasa 1, inhibidores de rho-quinasa 2, agonistas del receptor de la apelina, compuestos donantes de nitroxilo, inhibidores de quinasa II dependientes de calcio, agentes antifibróticos, inhibidores de galectina-3, antagonistas del receptor de vasopresina, moduladores del receptor de FPR2, agonistas del receptor del péptido natriurético, bloqueadores del canal del receptor de potencial transitorio vanilloide tipo 4, agentes antiarrítmicos, bloqueadores de canales de "corriente rara"If,nitratos, compuestos digitálicos, agentes inotrópicos y agonistas de p-receptores, agentes de resellado de membrana celular, por ejemplo, poloxámero 188, agentes antihiperlipidémicos, agentes de elevación de HDL en plasma, agentes antihipercolesterolémicos, inhibidores de la biosíntesis del colesterol (tales como inhibidores de la HMG-CoA reductasa), agonista de LXR, agonista de FXR, probucol, raloxifeno, ácido nicotínico, niacinamida, inhibidores de la absorción del colesterol, secuestrantes de ácidos biliares, resinas de intercambio aniónico, aminas cuaternarias, colestiramina, colestipol, inductores del receptor de la lipoproteína de baja densidad, clofibrato, fenofibrato, bezafibrato, ciprofibrato, gemfibrizol, vitamina B6, vitamina B12, vitaminas antioxidantes, agentes antidiabéticos, inhibidores de la agregación plaquetaria, antagonistas del receptor de fibrinógeno, aspirina o derivados de ácido fíbrico, inhibidores de PCSK9, aspirina e inhibidores de P2Y12, tal como Clopidogrel.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en un método para tratar, prevenir o aliviar un síntoma de una enfermedad asociada con la fibrosis, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de relaxina modificado o una composición que comprende un polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento a un/a paciente que lo necesita. Dicha enfermedad asociada con fibrosis puede comprender fibrosis del corazón, pulmón, riñón, médula ósea o hígado, fibrosis dermatológica o un trastorno ocular fibrótico. Dicha enfermedad asociada con fibrosis puede seleccionarse de fibrosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica (ENA), cirrosis, precirrosis, enfermedad pulmonar parenquimatosa difusa, fibrosis quística, fibrosis pulmonar, fibrosis masiva progresiva, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis por inyección, fibrosis renal, enfermedad renal crónica, enfermedad renal diabética, glomeruloesclerosis focal y segmentaria, nefropatía membranosa, nefropatía por IgA, mielofibrosis, insuficiencia cardiaca, insuficiencia cardiaca metabólica, fibrosis cardiaca, fibrosis de cataratas, cataratas, cicatrices oculares, fibrosis pancreática, fibrosis dérmica, fibrosis intestinal, estenosis intestinales, fibrosis endomiocárdica, fibrosis auricular, fibrosis mediastínica, enfermedad de Crohn, fibrosis retroperitoneal, queloide, fibrosis sistémica nefrógena, esclerodermia, esclerosis sistémica, artrofibrosis, síndrome de Peyronie, contractura de Dupuytren, neuropatía diabética, capsulitis adhesiva, esteatosis hepática alcohólica, hepatoesteatosis, hepatitis vírica, enfermedad biliar, hemocromatosis primaria, cirrosis relacionada con fármacos, cirrosis criptogénica, enfermedad de Wilson, deficiencia de alfa 1 -antitripsina, enfermedad pulmonar intersticial (EPI), enfermedad pulmonar fibrótica humana, degeneración macular, retinopatía retiniana, retinopatía vítrea, fibrosis miocárdica, oftalmopatía de Graves, ergotismo inducido por fármacos, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis/reestenosis, cicatrices hipertróficas, mielofibrosis primaria o idiopática, enfermedad inflamatoria intestinal y colitis ulcerosa.

Dicho método de tratamiento de una enfermedad asociada con fibrosis puede comprender además administrar, en combinación, simultánea o secuencialmente, con dicho polipéptido de relaxina modificado, al menos un agente antifibrosis a dicho/a paciente. Dicho agente antifibrosis puede seleccionarse de nintedanib, Pirfenidona, antagonistas de LPA1, antagonistas de receptores de LPA1, análogos de GLP1, tralokinumab (IL-13, AstraZeneca), vismodegib (antagonista de hedgehog, Roche), PRM-151 (pentraxina-2, TGF beta-1, Promedior), SAR-156597 (Mab biespecífico IL-4 e IL-13, Sanofi), simtuzumab ((anticuerpo anti-lisil oxidasa tipo 2 (anti-LOXL2), Gilead), CKD-942, PTL-202 (PDE inh./pentoxifilina/NAC liberación control oral., Pacífico Term.), omipalisib (inhibidor oral de PI3K/mTOR, GSK), IW-001 (sol. oral mod. de colágeno bovino tipo V, ImmuneWorks), STX-100 (integrina alfa V/hormiga beta-6, Stromedix/Biogen), Actimmune (IFN gamma), PC-SOD (midismase; inhalada, LTT Bio-Pharma / CKD Pharm), lebrikizumab (mAb humanizado anti-IL-13 SC, Roche), AQX-1125 (activador de SHIP1, Aquinox), CC-539 (inhibidor de JNK, Celgene), FG-3019 (FibroGen), SAR-100842 (Sanofi) y ácido obeticólico (OCA o iNt -747, Intercept).

En otro aspecto, la divulgación proporciona un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en un método para tratar o evitar la insuficiencia renal, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de relaxina modificado o una composición que comprende un polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento a un/a paciente que lo necesita.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en un método para mejorar, estabilizar o restaurar la función renal en un/a paciente que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de relaxina modificado o una composición que comprende un polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento a dicho/a paciente.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método de fabricación de un polipéptido de relaxina modificado como se describe en el presente documento, que comprende: (a) proporcionar un polipéptido que comprende una cadena A de relaxina y una cadena B de relaxina, en donde dicho polipéptido comprende un aminoácido codificado de forma no natural; y (b) unir dicho aminoácido codificado de forma no natural a dicho potenciador farmacocinético. Dicho aminoácido codificado de forma no natural puede estar unido a dicho potenciador farmacocinético mediante un enlace de oxima, por ejemplo, que une dicho aminoácido codificado de forma no natural a un componente peptídico del potenciador farmacocinético. Dicho enlace de oxima puede formarse mediante la reacción de un grupo carbonilo y un grupo aminooxi. Dicho grupo carbonilo puede ser un sustituyente de dicho aminoácido codificado de forma no natural y dicho grupo aminooxi puede ser un constituyente de dicho potenciador farmacocinético. Dicho grupo aminooxi puede ser un sustituyente de dicho aminoácido codificado de forma no natural y dicho grupo carbonilo puede ser un constituyente de dicho potenciador farmacocinético, por ejemplo, un constituyente de un componente peptídico de dicho potenciador farmacocinético. Dicho aminoácido codificado de forma no natural puede incorporarse ribosómicamente en dicho polipéptido.

II. Ácidos nucleicos recombinantes y métodos generales para usar con los polipéptidos de relaxina modificados divulgados

En realizaciones de la presente divulgación, los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de relaxina modificado de interés se pueden aislar, clonar y a menudo alterar, utilizando métodos recombinantes. Se pueden utilizar tales realizaciones, incluyendo, aunque no de forma limitativa, para la expresión de proteínas o durante la generación de variantes, derivados u otras secuencias derivadas de un polipéptido de relaxina modificado. En algunas realizaciones, las secuencias que codifican los polipéptidos de relaxina modificados de la divulgación están operativamente unidas a un promotor heterólogo. En algunas realizaciones, el uso de codones de ADN en las secuencias de polinucleótidos que codifican el polipéptido de relaxina modificado se puede optimizar para la expresión deE. colio de una célula de mamífero (por ejemplo, CHO) usando técnicas que son bien conocidas en la materia.

No reivindicados explícitamente, pero útiles para comprender la invención reivindicada, son los polinucleótidos que codifican una cadena de relaxina A (SEQ ID NO: 10), cadena B de relaxina (SEQ ID NO: 11), cadenas de relaxina A y B (SEQ ID NO: 12) y secuencias líder (SEQ ID NO: 13-14).

Se puede sintetizar una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de relaxina modificado descrito en el presente documento basándose en la secuencia de aminoácidos del polipéptido parental, incluyendo, aunque no de forma limitativa, que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4, 5, 6, 35, 36 o 37 y a continuación, cambie la secuencia de nucleótidos para efectuar la introducción (es decir, incorporación o sustitución) o eliminación (es decir, deleción o sustitución) del (de los) resto(s) de aminoácido(s) relevante(s). La secuencia de nucleótidos puede modificarse convenientemente mediante mutagénesis dirigida de acuerdo con métodos convencionales. Como alternativa, la secuencia de nucleótidos puede prepararse mediante síntesis química, incluyendo, aunque no de forma limitativa, mediante el uso de un sintetizador de oligonucleótidos, en donde los oligonucleótidos pueden diseñarse basándose en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y seleccionando preferentemente los codones que están favorecidos en la célula hospedadora en la que se producirá el polipéptido recombinante.

Adicionalmente, se puede incorporar un codón selector que codifica un aminoácido codificado de forma no natural en la secuencia polinucleotídica, como se describe adicionalmente en el presente documento.

La divulgación también se refiere a células hospedadoras eucariotas, a células hospedadoras no eucariotas y a organismos para la incorporaciónin vivode un aminoácido poco natural a través de pares ortogonales de ARNt/RS. Las células hospedadoras están diseñadas genéticamente (incluyendo, aunque no de forma limitativa, transformadas, transducidas o transfectadas) con los polinucleótidos de la divulgación o con construcciones que incluyen un polinucleótido de la divulgación, incluyendo, aunque no de forma limitativa, un vector de la divulgación, que puede ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. Por ejemplo, las regiones codificantes del ARNt ortogonal, la ARNt sintetasa ortogonal y la proteína que se va a derivatizar, están operativamente unidos a elementos de control de la expresión génica que son funcionales en la célula hospedadoras deseada. El vector puede ser, por ejemplo, en forma de un plásmido, un cósmido, un fago, una bacteria, un virus, un polinucleótido desnudo o un polinucleótido conjugado. Los vectores pueden introducirse en células y/o microorganismos mediante métodos convencionales.

III. Codones selectores

Los codones selectores de la divulgación amplían el marco de los codones genéticos de la maquinaria biosintética de proteínas. Por ejemplo, un codón selector incluye, pero no se limita a, un codón de tres bases único, un codón sin sentido, tal como un codón de terminación, incluyendo, aunque no de forma limitativa, un codón ámbar (UAG), un codón ocre o un codón ópalo (UGA), un codón poco natural, un codón de cuatro o más bases, un codón raro o similares. Es fácilmente evidente para las personas normalmente versadas en la materia que existe una amplia gama en el número de codones selectores que pueden introducirse en un gen o polinucleótido deseado, incluyendo, aunque no de forma limitativa, uno o más, dos o más, tres o más, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más en un único polinucleótido que codifica al menos una porción del polipéptido de relaxina modificado.

En un caso, los métodos implican el uso de un codón selector, que es un codón de parada para la incorporación de uno o más aminoácidos poco naturales (es decir, codificados de forma no natural)in vivo.Por ejemplo, se produce un ARNt-O que reconoce el codón de terminación, incluyendo, aunque no de forma limitativa, UAG y se aminoacila mediante una RS-O con un aminoácido poco natural deseado. Este ARNt-O no se reconoce por las aminoacil ARNt sintetasas de origen natural del hospedador. Puede usarse mutagénesis dirigida convencional para introducir el codón de terminación, incluyendo, aunque no de forma limitativa, TAG, en el sitio de interés en un polipéptido de interés. Véase, por ejemplo, Sayers, J.R.,et al.(1988), Nucleic Acids Res, 16:791-802. Cuando la RS-O, ARNt-O y el ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés se combinanin vivo,el aminoácido poco natural se incorpora en respuesta al codón UAG para dar un polipéptido que contiene el aminoácido poco natural en la posición especificada.

La incorporación de aminoácidos poco naturalesin vivose puede realizar sin perturbaciones significativas de la célula hospedadora eucariota. Por ejemplo, debido a que la eficacia de la supresión para el codón UAG depende de la competición entre el ARNt-O, incluyendo, aunque no de forma limitativa, el ARNt supresor de ámbar y un factor de liberación eucariota (incluyendo, aunque no de forma limitativa, eRF) (que se une a un codón de terminación e inicia la liberación del péptido en crecimiento desde el ribosoma), la eficacia de la supresión puede modularse, incluyendo, aunque no de forma limitativa, aumentando el nivel de expresión de ARNt-O y/o del ARNt supresor.

Los aminoácidos poco naturales también pueden codificarse con codones raros. Por ejemplo, cuando se reduce la concentración de arginina en una reacción de síntesis de proteínasin vitro,el codón de arginina poco habitual, AGG, ha demostrado ser eficaz para la inserción de Ala por un ARNt sintético acilado con alanina. Véase, por ejemplo, Maet al.,Biochemistry, 32:7939 (1993). En este caso, el ARNt sintético compite con el ARNtArg de origen natural, que existe como una especie menor enEscherichia coli.

Los codones selectores también comprenden codones prolongados, incluyendo, aunque no de forma limitativa, codones de cuatro o más bases, tales como, codones de cuatro, cinco, seis o más bases. Entre los ejemplos de codones de cuatro bases se incluyen, pero sin limitación, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU y similares. Entre los ejemplos de codones de cinco bases se incluyen, pero sin limitación, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, uA g GC y similares.

En un caso, en la presente divulgación se pueden usar codones prolongados basados en codones raros o en codones sin sentido, lo que puede reducir la lectura sin sentido y la supresión del desplazamiento de fase de lectura en otros sitios no deseados.

Para un sistema dado, un codón selector también puede incluir uno de los codones naturales de tres bases, donde el sistema endógeno no usa (o rara vez usa) el codón de base natural. Por ejemplo, esto incluye un sistema que carece de un ARNt que reconozca el codón natural de tres bases y/o un sistema en el que el codón de tres bases es un codón raro.

Los genes que codifican proteínas o polipéptidos de interés, tales como un polipéptido de relaxina modificado, pueden mutagenizarse usando métodos conocidos por una persona experta en la técnica y descritos en el presente documento para incluir, por ejemplo, uno o más codones selectores para la incorporación de un aminoácido poco natural. Por ejemplo, se mutageniza un ácido nucleico para una proteína de interés para incluir uno o más codones selectores, proporcionando la incorporación de uno o más aminoácidos poco naturales. La divulgación incluye cualquier variante de este tipo, incluyendo, aunque no de forma limitativa, versiones mutantes de cualquier proteína, por ejemplo, que incluyen al menos un aminoácido poco natural.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de interés tal como un polipéptido de relaxina modificado pueden mutarse fácilmente para introducir una cisteína en cualquier posición deseada del polipéptido. La cisteína se usa ampliamente para introducir moléculas reactivas, polímeros solubles en agua, proteínas o una amplia variedad de otras moléculas, en una proteína de interés.

IV. Aminoácidos codificados de forma no natural

Una variedad muy amplia de aminoácidos codificados de forma no natural es adecuada para usar en la presente divulgación. Se puede introducir cualquier número de aminoácidos codificados de forma no natural en un polipéptido de relaxina modificado. En general, los aminoácidos introducidos codificados de forma no natural son sustancialmente químicamente inertes hacia los 20 aminoácidos comunes codificados genéticamente (es decir, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina). En algunas realizaciones, los aminoácidos codificados de forma no natural incluyen grupos funcionales de cadena lateral que reaccionan de manera eficaz y selectiva con grupos funcionales que no se encuentran en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo, aunque no de forma limitativa, azido, cetona, grupos aldehído y aminooxi) para formar conjugados estables. Por ejemplo, un polipéptido de relaxina modificado que incluye un aminoácido codificado de forma no natural que contiene un grupo funcional azido puede hacerse reaccionar con un polímero o prolongador PK o como alternativa, con un segundo polipéptido que contiene un resto alquino para formar un conjugado estable resultante de la reacción selectiva de los grupos funcionales azida y alquino para formar un producto de cicloadición de Huisgen [3+2].

La estructura genérica de un alfa-aminoácido se ilustra a continuación (Fórmula IV):

Un aminoácido codificado de forma no natural es normalmente cualquier estructura que tenga la fórmula mencionada anteriormente en donde el grupo R es cualquier sustituyente distinto del utilizado en los veinte aminoácidos naturales y que pueda ser adecuado para usar en los polipéptidos de relaxina modificados de la presente divulgación. Debido a que los aminoácidos codificados de forma no natural de la divulgación normalmente difieren de los aminoácidos naturales solo en la estructura de la cadena lateral, los aminoácidos codificados de forma no natural forman puentes de amida con otros aminoácidos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, codificados de forma natural o no natural, de la misma manera en que se forman en los polipéptidos naturales. Sin embargo, los aminoácidos codificados de forma no natural tienen grupos de cadenas laterales que los distinguen de los aminoácidos naturales. Por ejemplo, R opcionalmente comprende un alquil-, aril-, acil-, ceto-, azido-, hidroxil-, hidracina, ciano-, halo-, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, seleno-, sulfonil-, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehído, éster, tioácido, hidroxilamina, grupo amino o similares o cualquier combinación de los mismos.

Los aminoácidos ilustrativos codificados de forma no natural que pueden ser adecuados para usar en la presente divulgación y que son útiles para reacciones con polímeros y prolongadores PK incluyen, pero sin limitación, aquellos con grupos reactivos de carbonilo, aminooxi, hidracina, hidrazida, semicarbacida, azida y alquino. En algunas realizaciones, los aminoácidos codificados de forma no natural comprenden un resto sacárido. Entre los ejemplos de tales aminoácidos se incluyen N-acetil-L-glucosaminil-L-serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glucosaminil-L-treonina, N-acetil-L-glucosaminil-L-asparagina y O-manosaminil-L-serina.

Muchos de los aminoácidos codificados de forma no natural proporcionados en el presente documento están disponibles comercialmente, por ejemplo, por Sigma-Aldrich (St. Louis, Misuri, EE. UU.), Novabiochem (una división de EMD Biosciences, Darmstadt, Alemania) o Peptech (Burlington, Massachusetts, EE. UU.). Los que no están disponibles comercialmente se sintetizan opcionalmente como se proporciona en el presente documento o utilizando métodos estándar conocidos por las personas normalmente versadas en la materia. Para técnicas de síntesis orgánica, véanse, por ejemplo, Organic Chemistry por Fessendon y Fessendon, (1982, segunda edición, Willard Grant Press, Boston, Massachusetts); Advanced Organic Chemistry de March (Tercera edición, 1985, Wiley and Sons, Nueva York); y Advanced Organic Chemistry de Carey y Sundberg (Tercera edición, Partes A y B, 1990, Plenum Press, Nueva York). Véanse,también,las Patentes de Estados Unidos N.° 7.045.337 y 7.083.970. Además de los aminoácidos poco naturales que contienen nuevas cadenas laterales, los aminoácidos poco naturales que pueden ser adecuados para usar en la presente divulgación también comprenden opcionalmente estructuras principales modificadas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, como se ilustra en las estructuras de las Fórmulas V y Vi:

V

VI

en donde Z habitualmente comprende OH, NH2, SH, NH-R' o S-R'; X e Y, que pueden ser iguales o diferentes, habitualmente comprenden S u O y R y R', que opcionalmente son iguales o diferentes, normalmente se seleccionan de la misma lista de constituyentes para el grupo R descrito anteriormente para los aminoácidos poco naturales que tienen la Fórmula I, así como hidrógeno. Por ejemplo, los aminoácidos poco naturales de la divulgación comprenden opcionalmente sustituciones en el grupo amino o carboxilo como se ilustra en las Fórmulas V y VI. Los aminoácidos poco naturales de este tipo incluyen, pero sin limitación, a-hidroxi ácidos, a-tioácidos, a-aminotiocarboxilatos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, con cadenas laterales correspondientes a las cadenas laterales de los veinte aminoácidos naturales comunes o de los poco naturales. Además, las sustituciones en el carbono a incluyen opcionalmente, pero sin limitación, aminoácidos L, D o a-a-disustituidos, tales como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido gaminobutírico y similares. Otras alternativas estructurales incluyen aminoácidos cíclicos, tales como análogos de prolina, así como análogos de prolina con anillos de 3, 4, 6, 7, 8 y 9 miembros, aminoácidos p y y, tales como p-alanina sustituida y ácido Y-aminobutírico.

Muchos aminoácidos poco naturales se basan en aminoácidos naturales, tales como tirosina, glutamina, fenilalanina y similares y son adecuados para usar en la presente divulgación. Los análogos de tirosina incluyen, pero sin limitación, tirosinas para-sustituidas, tirosinas orto-sustituidas y tirosinas meta-sustituidas, donde la tirosina sustituida comprende, incluyendo, aunque no de forma limitativa, un grupo ceto (incluyendo, aunque no de forma limitativa, un grupo acetilo), un grupo benzoílo, un grupo amino, una hidrazina, una hidroxiamina, un grupo tiol, un grupo carboxi, un grupo isopropilo, un grupo metilo, un hidrocarburo C6 - C20 de cadena lineal o ramificada, un hidrocarburo saturado o insaturado, un grupo O-metilo, un grupo poliéter, un grupo nitro, un grupo alquinilo o similares. Además, también se contemplan anillos de arilo sustituidos múltiples veces. Los análogos de glutamina que pueden ser adecuados para usar en la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, derivados de a-hidroxi, derivados Y-sustituidos, derivados cíclicos y derivados de glutamina sustituida por amida. Los ejemplos de análogos de fenilalanina que pueden ser adecuados para usar en la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, fenilalaninas para-sustituidas, fenilalaninas orto-sustituidas y fenilalaninas meta-sustituidas, donde el sustituyente comprende, incluyendo, aunque no de forma limitativa, un grupo hidroxi, un grupo metoxi, un grupo metilo, un grupo alilo, un aldehído, un azido, un yodo, un bromo, un grupo ceto (incluyendo, aunque no de forma limitativa, un grupo acetilo), un benzoilo, un grupo alquinilo o similares. Entre los específicos de aminoácidos poco naturales que pueden ser adecuados para usar en la presente divulgación se incluyen, pero sin limitación, una p-acetil-L-fenilalanina, una O-metil-tirosina, una L-3-(2-naftil)alanina, una 3-metil-fenilalanina, una O-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcp-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfoneserina, una fosfonotirosina, una p-yodofenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, una isopropil-L-fenilalanina y una ppropargiloxifenilalanina y similares.

En una realización, se proporcionan composiciones de un polipéptido de relaxina modificado que comprende un aminoácido poco natural (tal como p-acetil-L-fenilalanina). Se proporcionan también diversas composiciones que comprenden p-acetil-L-fenilalanina, incluyendo, aunque no de forma limitativa, proteínas y/o células. En un aspecto, una composición que incluye el aminoácido poco natural p-acetil-L-fenilalanina, incluye además un ARNt ortogonal. El aminoácido poco natural puede estar unido (incluyendo, aunque no de forma limitativa, de forma covalente) al ARNt ortogonal, incluyendo, aunque no de forma limitativa, enlazado covalentemente al ARNt ortogonal a través de un puente de aminoacilo, enlazado covalentemente a un 3'OH o a un 2'OH de un azúcar ribosa terminal del ARNt ortogonal, etc.

El polipéptido de relaxina modificado descrito en el presente documento puede comprender un aminoácido codificado de forma no natural descrito en la patente de Estados Unidos N.° 8.735.539, titulada "Relaxin polypeptides comprising non-naturally encoded amino acids".

V. Estructura y síntesis de aminoácidos no naturales

La presente divulgación proporciona un polipéptido de relaxina modificado unido a un prolongador PK, por ejemplo, que comprende un ácido graso, mediante un puente o enlace de oxima. Muchos tipos de aminoácidos codificados de forma no natural son adecuados para la formación de puentes de oxima. Estos incluyen, pero sin limitación, aminoácidos codificados de forma no natural que contienen un grupo carbonilo, dicarbonilo, similar al carbonilo, carbonilo enmascarado, carbonilo protegido o hidroxilamina. Tales aminoácidos, su estructura y síntesis, se describen en las patentes de EE.UU. N.° 8.012.931 y 8.735.539.

Las estructuras y los métodos ilustrativos de síntesis de aminoácidos codificados de forma no natural, incluyendo aminoácidos que contienen hidroxilamina, son conocidos en la técnica, por ejemplo como se divulga en la Patente de Estados Unidos N.° 7.332.571, Publicaciones de patente de Estados Unidos N.° 2006/0194256, 2006/0217532, 2006/0217289 y 2006/069246.

SÍNTESIS QUÍMICA DE AMINOÁCIDOS CODIFICADOS DE FORMA NO NATURAL

Muchos de los aminoácidos poco naturales adecuados para usar en la presente divulgación se comercializan, por ejemplo, por Sigma (EE. Uu .) o Aldrich (Milwaukee, Wisconsin, EE. UU.). Los que no están disponibles comercialmente se sintetizan opcionalmente como se proporciona en el presente documento o como se proporciona en diversas publicaciones o usando métodos convencionales conocidos por las personas normalmente versadas en la materia.

A. Grupos reactivos de carbonilo

Los aminoácidos con un grupo reactivo de carbonilo permiten una variedad de reacciones para unir moléculas (incluyendo, aunque no de forma limitativa, PEG u otras moléculas solubles en agua, tal como componentes peptídicos) mediante reacciones de adición nucleófila o de condensación aldólica, entre otras.

La síntesis de p-acetil-(+/-)-fenilalanina y de m-acetil-(+/-)-fenilalanina se describe en Zhang, Z.,et al.,Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Una persona experta en la técnica puede preparar de manera similar otros aminoácidos que contienen carbonilo.

En algunas realizaciones, un polipéptido de relaxina modificado que comprende un aminoácido codificado de forma no natural puede modificarse químicamente para generar un grupo funcional de carbonilo reactivo. Por ejemplo, se puede generar una funcionalidad de aldehído útil para reacciones de conjugación a partir de una funcionalidad que tiene grupos amino e hidroxilo adyacentes.

En la presente divulgación, se puede incorporar al polipéptido un aminoácido codificado de forma no natural que porta grupos hidroxilo y amino adyacentes como una funcionalidad de aldehído "enmascarada". Por ejemplo, la 5-hidroxilisina lleva un grupo hidroxilo adyacente a la amina épsilon. Las condiciones de reacción para generar el aldehído normalmente implican la adición de un exceso molar de metaperiodato de sodio en condiciones suaves, para evitar la oxidación en otros sitios dentro del polipéptido. El pH de la reacción de oxidación suele ser de aproximadamente 7,0. Una reacción habitual implica la adición de aproximadamente 1,5 moles de exceso de metaperyodato de sodio a una solución tamponada del polipéptido, seguido de incubación durante unos 10 minutos en oscuridad. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 6.423.685.

La funcionalidad carbonilo se puede hacer reaccionar selectivamente con un reactivo que contiene hidrazina, hidrazida, hidroxilamina o semicarbazida, en condiciones suaves en solución acuosa para formar los enlaces correspondientes de hidrazona, de oxima o de semicarbazona, respectivamente, que son estables en condiciones fisiológicas. Véanse, por ejemplo, Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81,475-481 (1959); Shao, J. y Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Además, la reactividad única del grupo carbonilo permite la modificación selectiva en presencia de las otras cadenas laterales de aminoácidos. Véanse, por ejemplo, Cornish, V. W.,et al.,J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. y Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K.,et al.,Science 276:1125-1128 (1997).

B. Grupos reactivos de hidracina, hidrazida o semicarbazida

Los aminoácidos codificados de forma no natural que contienen un grupo nucleofílico, tal como una hidracina, hidrazida o semicarbazida, permiten la reacción con una variedad de grupos electrófilos para formar conjugados.

Los aminoácidos que contienen hidrazida, hidrazina y semicarbazida están disponibles en fuentes comerciales. Por ejemplo, la L-glutamato-y-hidrazida está disponible en Sigma Chemical (St. Louis, Misuri). Una persona experta en la técnica puede preparar otros aminoácidos no disponibles comercialmente. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 6.281.211.

Los polipéptidos de relaxina modificados que contienen aminoácidos codificados de forma no natural que contienen las funcionalidades de hidrazida, hidrazina o semicarbazida, se pueden hacer reaccionar de manera eficaz y selectiva con una variedad de moléculas que contienen aldehídos u otros grupos funcionales con reactividad química similar. Véase, por ejemplo, Shao, J. y Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). La reactividad única de los grupos funcionales de hidrazida, hidracina y semicarbazida, los hacen significativamente más reactivos frente a los aldehídos, cetonas y otros grupos electrófilos, en comparación con los grupos nucleofílicos presentes en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo, aunque no de forma limitativa, el grupo hidroxilo de serina o treonina o los grupos amino de lisina y el extremo N-terminal).

C. Aminoácidos que contienen aminooxi

Los aminoácidos codificados de forma no natural que contienen un grupo aminooxi (también llamado hidroxilamina) permiten la reacción con una variedad de grupos electrófilos para formar conjugados (incluyendo, aunque no de forma limitativa, con PEG o con componentes peptídicos). Al igual que las hidracinas, hidrazidas y semicarbazidas, la nucleofilia potenciada del grupo aminooxi le permite reaccionar de manera eficaz y selectiva con una variedad de moléculas que contienen aldehídos u otros grupos funcionales con reactividad química similar. Véanse, por ejemplo, Shao, J. y Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995); H. Hang y C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001). Considerando que el resultado de la reacción con un grupo hidrazina es la hidrazona correspondiente, sin embargo, una oxima resulta generalmente de la reacción de un grupo aminooxi con un grupo que contiene carbonilo, tal como una cetona.

Los aminoácidos que contienen aminooxi se pueden preparar a partir de precursores de aminoácidos fácilmente disponibles (homoserina, serina y treonina). Véase, por ejemplo, M. Carrasco y R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853 8858 (2003). Ciertos aminoácidos que contienen aminooxi, tales como ácido L-2-amino-4-(aminooxi)butírico), se han aislado de fuentes naturales (Rosenthal, G., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997). Una persona experta en la técnica puede preparar otros aminoácidos que contienen aminooxi.

D. Grupos reactivos de azida y alquino

La reactividad única de los grupos funcionales azida y alquino los hace útiles para la modificación selectiva de los polipéptidos y otras moléculas biológicas. Las azidas orgánicas, en particular las azidas alifáticas y los alquinos son en general estables frente a condiciones químicas de reacción comunes. En particular, ambos grupos funcionales azida y alquino son inertes frente a las cadenas laterales (es decir, los grupos R) de los 20 aminoácidos comunes encontrados en los polipéptidos de origen natural. Cuando se ponen en estrecha proximidad, sin embargo, la naturaleza "cargada por resorte" de los grupos azida y alquino se revela y estos reaccionan de forma selectiva y eficaz mediante una reacción de cicloadición [3+2] de Huisgen para generar el triazol correspondiente. Véanse, por ejemplo, Chin J.,et al.,Science 301:964-7 (2003); Wang, Q.,et al.,J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W.,et al.,J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002).

Debido a que la reacción de cicloadición de Huisgen implica una reacción de cicloadición selectiva (véanse, por ejemplo, Padwa, A., en COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), págs. 1069-1109; Huisgen, R. en 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), págs. 1-176) en vez de una sustitución nucleófila, la incorporación de aminoácidos codificados de manera no natural que portan cadenas laterales que contienen azida y alquino permite modificar de forma selectiva los polipéptidos resultantes en la posición del aminoácido codificado de manera no natural. La reacción de cicloadición que implica el polipéptido de relaxina modificado que contiene azida o alquino se puede llevar a cabo a temperatura ambiente, en condiciones acuosas mediante la adición de Cu(II) (incluyendo, aunque no de forma limitativa, en forma de una cantidad catalítica de CuSO4) en presencia de un agente reductor para reducir el Cu(II) a Cu(I),in situ,en una cantidad catalítica. Véanse, por ejemplo, Wang, Q.,et al.,J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Tomoe, C. W.,et al.,J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002); Rostovtsev,et al.,Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002). Los agentes reductores ilustrativos incluyen, incluyendo, aunque no de forma limitativa, ascorbato, cobre metálico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutatión, cisteína, Fe2+, Co2+ y un potencial eléctrico aplicado.

En algunos casos, donde se desea una reacción de cicloadición [3+2] de Huisgen entre una azida y un alquino, el polipéptido de relaxina modificado puede comprender un aminoácido codificado de forma no natural que comprende un resto de alquino y el potenciador PK que se unirá al aminoácido puede comprender un resto de azida. Como alternativa, también se puede realizar la reacción inversa (es decir, con el resto de azida en el aminoácido y el resto de alquino presente en el polímero soluble en agua).

El grupo funcional azida también puede hacerse reaccionar selectivamente con un polímero soluble en agua que contenga un éster arílico y funcionalizarse adecuadamente con un resto de arilfosfina para generar un enlace de amida. El grupo aril fosfina reduce la azidain situy la amina resultante a continuación, reacciona eficazmente con un enlace éster proximal para generar la amida correspondiente. Véase, por ejemplo, E. Saxon y C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000). El aminoácido que contiene azida puede ser una alquilazida (incluyendo, aunque no de forma limitativa, ácido 2-amino-6-azido-1-hexanoico) o una arilazida (p-azido-fenilalanina).

El grupo funcional azida también puede hacerse reaccionar selectivamente con un polímero soluble en agua que contenga un tioéster y funcionalizarse apropiadamente con un resto arilfosfina para generar un enlace de amida. El grupo aril fosfina reduce la azidain situy la amina resultante reacciona eficientemente con el enlace tioéster para generar la amida correspondiente.

Los aminoácidos que contienen alquinos están disponibles comercialmente. Como alternativa, los aminoácidos que contienen alquinos se pueden preparar de acuerdo con los métodos convencionales. Por ejemplo, se puede sintetizar p-propargiloxifenilalanina, por ejemplo, como se describe en Deiters, A.,et al.,J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003) y 4-alquinil-L-fenilalanina se puede sintetizar como se describe en Kayser, B.,et al.,Tetrahedron 53(7): 24752484 (1997). Una persona experta en la técnica puede preparar otros aminoácidos que contienen alquinos.

Los aminoácidos que contienen azidas se comercializan por fuentes comerciales. Para los aminoácidos que contienen azidas que no están disponibles comercialmente, el grupo azida se puede preparar de forma relativamente fácil usando métodos convencionales conocidos por las personas normalmente versadas en la materia, incluyendo, aunque no de forma limitativa, a través del desplazamiento de un grupo saliente adecuado (incluyendo, aunque no de forma limitativa, haluro, mesilato, tosilato) o a través de la apertura de una lactona protegida adecuadamente. Véase, por ejemplo, Advanced Organic Chemistry de March (Tercera edición, 1985, Wiley and Sons, Nueva York).

Una molécula que se puede añadir a una proteína de la divulgación a través de una cicloadición [3+2] incluye prácticamente cualquier molécula con un derivado de azida o alquinilo. Las moléculas incluyen, pero sin limitación, colorantes, fluoróforos, agentes de reticulación, derivados de sacáridos, polímeros (incluyendo, aunque no de forma limitativa, polímeros que comprenden polietilenglicol), fotorreticulantes, compuestos citotóxicos, etiquetas de afinidad, derivados de la biotina, resinas, perlas, un péptido, una segunda proteína o polipéptido (o más), polinucleótido(s) (incluyendo, aunque no de forma limitativa, ADN, ARN, etc.), quelatos metálicos, cofactores, ácidos grasos, carbohidratos y similares. Estas moléculas se pueden añadir a un aminoácido poco natural con un grupo alquinilo, incluyendo, aunque no de forma limitativa, p-propargiloxifenilalanina o grupo azido, incluyendo, aunque no de forma limitativa, p-azido-fenilalanina, respectivamente.

E. Grupos reactivos de aminotiol

La reactividad única de los grupos funcionales aminotiol beta-sustituidos los hace útiles para la modificación selectiva de polipéptidos y otras moléculas biológicas que contienen grupos aldehído, mediante la formación de tiazolidina. Véase, por ejemplo, J. Shao y J. Tam, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899. En algunas realizaciones, los aminoácidos de aminotiol beta-sustituidos pueden incorporarse en polipéptidos de relaxina modificados y a continuación, hacerse reaccionar con un potenciador PK que comprende una funcionalidad de aldehído. En algunas realizaciones, un potenciador PK, un conjugado de fármaco u otra carga útil, puede acoplarse a un polipéptido de relaxina modificado que comprende un aminoácido aminotiol beta-sustituido, mediante la formación de tiazolidina.

F. Grupos reactivos adicionales

En las siguientes solicitudes de patente se describen grupos reactivos adicionales y aminoácidos codificados de forma no natural que pueden incorporarse en polipéptidos de relaxina modificados de la divulgación: publicación de patente de EE. UU. N.° 2006/0194256, publicación de patente de EE. UU. N.° 2006/0217532, publicación de patente de patente de EE. UU. N.° 2006/0217289 y publicación de solicitud de patente internacional N.° WO / 2007/070659.

VI. Generación in vivo de polipéptidos de relaxina modificados que comprenden aminoácidos codificados de forma no natural

Los polipéptidos de relaxina modificados de la divulgación se pueden generarin vivoutilizando ARNt modificado y ARNt sintetasas para añadir o sustituir aminoácidos que no están codificados en sistemas de origen natural. Tales métodos se describen en la Patente de EE. UU. N.° 8.735.539.

Los métodos para generar los ARNt y las ARNt sintetasas que utilizan aminoácidos que no están codificados en sistemas de origen natural se describen en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 7.045.337 y 7.083.970. Estos métodos implican generar una maquinaria de traducción que funciona independientemente de las sintetasas y los ARNt endógenos respecto al sistema de traducción (y por tanto, a veces se los denomina "ortogonales"). Habitualmente, el sistema de traducción comprende un ARNt ortogonal (ARNt-O) y una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (RS-O, por sus siglas en inglés). Habitualmente, la RS-O aminoacila preferentemente el ARNt-O con al menos un aminoácido de origen no natural en el sistema de traducción y el ARNt-O reconoce al menos un codón selector que no se reconoce por otros ARNt en el sistema. El sistema de traducción inserta por tanto el aminoácido codificado de forma no natural en una proteína producida en el sistema, en respuesta a un codón selector codificado, "sustituyendo" por tanto, un aminoácido en una posición en el polipéptido codificado.

El uso de ARNt-O/aminoacil-ARNt sintetasas implica la selección de un codón específico que codifica el aminoácido codificado de forma no natural. Si bien se puede utilizar cualquier codón, generalmente es deseable seleccionar un codón que rara vez o nunca se use en la célula en la que se expresa la ARNt-O/aminoacil-ARNt sintetasa. Por ejemplo, los codones ilustrativos incluyen codones sin sentido, tales como codones de terminación (ámbar, ocre y ópalo), codones de cuatro o más bases y otros codones naturales de tres bases que rara vez se utilizan o no se utilizan.

Se pueden introducir codones selectores específicos en posiciones adecuadas en la secuencia codificante del polinucleótido de relaxina modificada usando métodos de mutagénesis conocidos en la técnica (incluyendo, aunque no de forma limitativa, mutagénesis específica de sitio, mutagénesis en casete, mutagénesis de selección de restricción, etc.).

VII. Expresión en no eucariotas y eucariotas

Sistemas de expresión, cultivo y aislamiento

Los polipéptidos de relaxina modificados o sin modificar se pueden expresar en cualquier número de sistemas de expresión adecuados que incluyen, por ejemplo, levadura, células de insectos (por ejemplo, células de insectos infectadas con baculovirus), células de mamíferos y bacterias. A continuación, se proporciona una descripción de sistemas de expresión ilustrativos.

Levadura: Como se utiliza en el presente documento, el término "levadura" incluye cualquiera de las diversas levaduras capaces de expresar un gen que codifica un polipéptido de relaxina modificado, incluyendo, aunque no de forma limitativa,P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. maltosayH. polymorpha.El documento WO 2005/091944 describe la expresión de relaxina en levadura.

E. coli,especies dePseudomonasy otros procariotas:

La expresión "hospedador bacteriano" o "célula hospedadora bacteriana" se refiere a una bacteria que puede ser o que se ha utilizado como un receptor para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. La expresión incluye la progenie de la célula hospedadora bacteriana original que se ha transfectado. Se entiende que la progenie de una única célula parental puede no necesariamente ser completamente idéntica en la morfología o en el complemento del ADN total o genómico respecto al parental original, debido a una mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula parental que sea suficientemente similar al parental para que se caracterice por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de relaxina modificado o sin modificar, está incluida en la descendencia prevista por esta definición.

Al seleccionar hospedadores bacterianos para la expresión, los hospedadores adecuados pueden incluir los que se ha demostrado que tienen, entre otros, buena capacidad de formación de cuerpos de inclusión, baja actividad proteolítica y robustez general. La fermentación industrial/farmacéutica generalmente utiliza bacterias derivadas de cepas K (por ejemplo, W3110) o de bacterias derivadas de cepas B (por ejemplo, BL21). Otros ejemplos de adecuados de hospedadores deE. coliincluyen, pero sin limitación, cepas b L21, DH10B o derivados de las mismas. En otra realización de los métodos de la presente divulgación, el hospedador deE. colies una cepa proteasa menos, que incluye, aunque no de forma limitativa, OMP- y LON-. La cepa de células hospedadoras puede ser una especie dePseudomonas,incluyendo, aunque no de forma limitativa,Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosayPseudomonas putida. Pseudomonas fluorescensbiovar 1, cepa designada MB101, se sabe que es útil para la producción recombinante y está disponible para procesos de producción de proteínas terapéuticas.

Una vez que se ha establecido una cepa de células hospedadoras recombinantes (es decir, la construcción de expresión se ha introducido en la célula hospedadora y se aíslan las células hospedadoras con la construcción de expresión adecuada), la cepa de células hospedadoras recombinantes se cultiva en condiciones adecuadas para la producción de polipéptidos de relaxina modificados.

Las células hospedadoras recombinantes pueden cultivarse en formatos discontinuos o continuos, con recogida de células (en el caso en que el polipéptido de relaxina modificado se acumula intracelularmente) o con recogida del sobrenadante del cultivo en formatos discontinuos o continuos.

Los polipéptidos de relaxina modificados producidos en células hospedadoras bacterianas pueden ser poco solubles o insolubles (en forma de cuerpos de inclusión). En una realización de la presente divulgación, se pueden realizar fácilmente sustituciones de aminoácidos en el polipéptido de relaxina modificado, que se seleccionan con el fin de aumentar la solubilidad de la proteína producida de forma recombinante. El polipéptido de relaxina modificado puede solubilizarse, por ejemplo, con urea o con clorhidrato de guanidina.

En el caso de la proteína relaxina modificada soluble, la relaxina puede secretarse en el espacio periplásmico o en el medio de cultivo. Por ejemplo, la relaxina modificada se secreta en el espacio periplásmico de las células W3110-B2 mediante el uso de plásmidos que codifican construcciones que incluyen ocho secuencias líder diferentes, incluidos las enumerados en las SEQ ID NO: 39-44 y transformándolas en células W3110-B2, a continuación, las células se cultivaron a 37 °C hasta que la DO alcanzó aproximadamente 0,8, momento en el que se induce la expresión con arabinosa al 0,01 %. Cinco horas más tarde se pueden preparar las muestras de liberación periplásmica a partir de los cultivos. Además, la relaxina modificada soluble puede estar presente en el citoplasma de las células hospedadoras. Puede ser deseable concentrar la relaxina modificada soluble antes de realizar las etapas de purificación.

Cuando el polipéptido de relaxina modificado se produce como una proteína de fusión, la secuencia de fusión puede eliminarse. La eliminación de una secuencia de fusión se puede lograr mediante escisión enzimática o química. La eliminación enzimática de secuencias de fusión se puede lograr usando métodos conocidos por las personas normalmente versadas en la materia. La elección de la enzima para la eliminación de la secuencia de fusión puede determinarse por la identidad de la fusión y las condiciones de reacción pueden especificarse por la elección de la enzima, como resultará evidente para una persona experta en la técnica. La escisión química se puede lograr usando reactivos conocidos por las personas normalmente versadas en la materia, incluyendo, aunque no de forma limitativa, bromuro de cianógeno, TEV proteasa y otros reactivos. El polipéptido de relaxina modificado escindido puede purificarse a partir de la secuencia de fusión escindida mediante métodos conocidos por las personas normalmente versadas en la materia.

En general, en ocasiones es deseable desnaturalizar y reducir los polipéptidos expresados y después hacer que los polipéptidos se replieguen en su configuración preferida. Por ejemplo, pueden añadirse guanidina, urea, DTT, DTE y/o una chaperonina, a un producto de traducción de interés. Las proteínas pueden replegarse en un tampón redox que contiene, incluyendo, aunque no de forma limitativa, glutatión oxidado y L-arginina. Los reactivos de replegado pueden fluir o ponerse en contacto de otro modo con uno o más polipéptidos u otro producto de expresión o viceversa.

En el caso de la producción procariota de polipéptido de relaxina modificado, el polipéptido de relaxina modificado así producido puede estar mal plegado y por tanto, carecer o tener actividad biológica reducida. La bioactividad de la proteína puede restablecerse mediante un "replegado". En general, el polipéptido de relaxina modificado o sin modificar mal plegado se repliega mediante solubilización (cuando el polipéptido de relaxina modificado también es insoluble), despliegue y reducción de la cadena polipeptídica utilizando, por ejemplo, uno o más agentes caotrópicos (por ejemplo, urea y/o guanidina) y un agente reductor capaz de reducir los puentes disulfuro (por ejemplo, ditiotreitol, DTT o 2-mercaptoetanol, 2-ME). En una concentración moderada de caotropo, a continuación, se añade un agente oxidante (por ejemplo, oxígeno, cistina o cistamina), lo que permite la formación de puentes disulfuro. El polipéptido de relaxina modificado puede replegarse usando métodos estándar conocidos en la técnica, tales como los descritos en las Patente de Estados Unidos N.° 4.511.502, 4.511.503 y 4.512.922. El polipéptido de relaxina modificado también puede plegarse conjuntamente con otras proteínas para formar heterodímeros o heteromultímeros.

Después del replegado, la relaxina modificada puede purificarse aún más. La purificación de la relaxina modificada se puede lograr usando una variedad de técnicas conocidas por las personas normalmente versadas en la materia, incluyendo la cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa, cromatografía de afinidad y similares o cualquier combinación de las mismas. La purificación adicional también puede incluir una etapa de secado o de precipitación de la proteína purificada.

Después de la purificación, la relaxina modificada puede intercambiarse en diferentes tampones y/o concentrarse mediante cualquiera de diversos métodos conocidos en la técnica, incluyendo, aunque no de forma limitativa, diafiltración y diálisis. La relaxina modificada que se proporciona como una única proteína purificada puede estar sujeta a agregación y precipitación.

La relaxina modificada purificada puede ser al menos un 90 % pura (medida mediante cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa, RP-HPLC o electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, SDS-PAGE) o al menos un 95 % pura o al menos un 98 % pura o al menos un 99 % o más pura. Independientemente del valor numérico exacto de la pureza de la relaxina modificada, la relaxina modificada es suficientemente pura para usar como producto farmacéutico o para su posterior procesamiento, tal como la conjugación con un potenciador PK.

Ciertas moléculas de relaxina modificada pueden usarse como agentes terapéuticos en ausencia de otros principios activos o proteínas (distintos de excipientes, vehículos y estabilizadores, albúmina sérica y similares) o pueden formar complejos con otra proteína o con un polímero.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el rendimiento de relaxina modificada después de cada etapa de purificación puede ser al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 91 %, al menos aproximadamente un 92 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 94 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, al menos aproximadamente un 99,9 % o al menos aproximadamente un 99,99 %, de la relaxina modificada o sin modificar en el material de partida para cada etapa de purificación.

VIII. Expresión en sistemas alternativos

Los polipéptidos de relaxina modificados de la presente divulgación se pueden expresar usando un sistema de traducción sin células (por ejemplo,in vitro).Los sistemas de traducción pueden ser celulares o sin células y pueden ser procariotas o eucariotas. Los sistemas de traducción celular incluyen, pero sin limitación, preparaciones de células completas, tales como células permeabilizadas o cultivos celulares en los que una secuencia de ácido nucleico deseada puede transcribirse a ARNm y traducirse el ARNm. Los sistemas de traducción sin células están disponibles comercialmente y se conocen muchos tipos y sistemas diferentes. Entre los ejemplos de sistemas sin células se incluyen, pero sin limitación, lisados de procariotas, tales como lisados deEscherichia coliy lisados de eucariotas, tales como extractos de germen de trigo, lisados de células de insectos, lisados de reticulocitos de conejo, lisados de ovocitos de conejo y lisados de células humanas. Los extractos de membrana, tales como los extractos pancreáticos caninos que contienen membranas microsomales, también están disponibles, los cuales son útiles para traducir proteínas secretoras.

IX. Proteínas de fusión que contienen polipéptidos de relaxina modificados

La divulgación también proporciona polipéptidos de relaxina modificados o fragmentos de los mismos, que comprenden la secuencia del polipéptido de relaxina modificado y un compañero de fusión. El compañero de fusión podrá conferir una propiedad funcional, incluyendo, aunque no de forma limitativa, extensión de la semivida, facilitación de la purificación y/o fabricación de proteínas, propiedades biofísicas potenciadas, tales como aumentar la solubilidad o la estabilidad y reducción de la inmunogenicidad o toxicidad o cualquier otro fin. Por ejemplo, la proteína de fusión puede presentar una semividain vivoprolongada, facilitando así una dosificación menos frecuente (como dosificación dos veces por semana, una vez por semana o una vez cada dos semanas, etc.) en un régimen terapéutico. Las proteínas de fusión ilustrativas comprenden una relaxina modificada fusionada a un compañero de fusión, tal como una albúmina (por ejemplo, albúmina sérica humana), adnectina prolongadora PK (PKE), XTEN, dominio Fc, región constante de inmunoglobulina o un fragmento de cualquiera de los anteriores o una combinación de cualquiera de los anteriores. Se puede producir una proteína de fusión expresando un ácido nucleico que codifica la secuencia del polipéptido de relaxina modificada y una secuencia asociada a la fusión en el mismo marco de lectura, opcionalmente separados por una secuencia que codifica un péptido de conexión. La proteína de fusión puede comprender el polipéptido de relaxina modificado y el compañero de fusión en cualquier orden, por ejemplo, uno o más compañeros de fusión unidos al extremo N terminal y/o al extremo C terminal de la secuencia del polipéptido de relaxina modificada o uno o más compañeros de fusión unidos tanto al extremo N como al extremo C.

X. Glicosilación de polipéptidos de relaxina modificados y sin modificar

La presente divulgación incluye polipéptidos de relaxina modificados que comprenden uno o más aminoácidos codificados de forma no natural que portan restos de sacáridos. Los restos de sacáridos pueden ser naturales (incluyendo, entre otros, N-acetilglucosamina) o no naturales (incluyendo, entre otros, 3-fluorogalactosa). Los sacáridos pueden estar unidos a los aminoácidos codificados de forma no natural mediante un enlace glicosídico unido a N o al O (incluyendo, aunque no de forma limitativa, N-acetilgalactosa-L-serina) o un enlace no natural (incluyendo, aunque no de forma limitativa, una oxima o el correspondiente glucósido unido a C o S).

Los restos de sacáridos (incluyendo, aunque no de forma limitativa, glicosilo) se pueden añadir a polipéptidos de relaxina modificadosin vivooin vitro.En algunas realizaciones de la presente divulgación, un polipéptido de relaxina modificado que comprende un aminoácido codificado de forma no natural que contiene carbonilo puede modificarse con un sacárido derivatizado con un grupo aminooxi para generar el correspondiente polipéptido glicosilado unido mediante un enlace de oxima. Una vez unido al aminoácido codificado de forma no natural, el sacárido puede elaborarse adicionalmente mediante tratamiento con glicosiltransferasas y otras enzimas para generar un oligosacárido unido al polipéptido de relaxina modificado. Véase, por ejemplo, H. Liu,et al.J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003).

XI. Administración y composiciones farmacéuticas

También se proporcionan en el presente documento composiciones que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de relaxina modificado, como se describe en el presente documento y un transportador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal vehículo o excipiente incluye, pero no se limita a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, sacarosa, histidina, agua, glicerol, PS80 (Polisorbato 80), etanol y/o combinaciones de los mismos. La formulación se elabora para adaptarse al modo de administración.

Por ejemplo, se puede administrar un polipéptido de relaxina modificado descrito en el presente documento a un/a paciente en una concentración de entre aproximadamente 0,1 y 100 mg/kg de peso corporal del paciente receptor. En una realización, se puede administrar un polipéptido de relaxina modificado descrito en el presente documento a un/a paciente en una concentración de aproximadamente 0,5-5 mg/kg de peso corporal del paciente receptor. En otra realización, un polipéptido de relaxina modificado descrito en el presente documento puede administrarse a un/a paciente receptor con una frecuencia de entre una vez al día y una vez cada dos semanas, tres semanas o cuatro semanas, tal como aproximadamente una vez por semana, dos veces por semana, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez cada cuatro días, una vez cada cinco días o una vez cada seis días. En otra realización, se puede administrar a un/a paciente un polipéptido de relaxina modificado descrito en el presente documento una vez por semana.

Debe entenderse que la concentración del polipéptido de relaxina modificado administrado a un/a paciente determinado puede ser mayor o menor que las concentraciones de administración ilustrativas establecidas anteriormente.

Basándose en la información proporcionada en la presente divulgación, una persona experta en la técnica sería capaz de determinar una dosificación eficaz y una frecuencia de administración mediante experimentación rutinaria, por ejemplo, guiada por la divulgación en el presente documento y por las enseñanzas en Goodmanet al.,(2006). Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. Nueva York: McGraw-Hill; o Howlandet al.,(2006). Pharmacology. Lippincott's illustrated reviews. Filadelfia: Lippincott Williams & Wilkins.

Las cantidades promedio de relaxina modificada pueden variar y en particular, deben basarse en las recomendaciones y prescripciones del personal médico cualificado. La cantidad exacta de relaxina modificada es una cuestión de preferencia sujeta a factores tales como el tipo exacto de afección que se está tratando, la afección del paciente que se está tratando, así como los demás ingredientes de la composición. La presente divulgación también proporciona la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de otro agente activo. La cantidad a administrar puede determinarse fácilmente por una persona experta en la técnica.

Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición química o biológica adecuada para la administración a un mamífero. Tales composiciones pueden formularse específicamente para administración a través de una o más de varias vías, incluyendo, aunque no de forma limitativa, la bucal, epicutánea, epidural, inhalación, intraarterial, intracardiaca, intracerebroventricular, intradérmica, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intravenosa, oral, parenteral, rectalmente a través de un enema o supositorio, subcutánea, subdérmica, sublingual, transdérmica y transmucosa. Además, la administración puede realizarse mediante inyección, polvo, líquido, gel, gotas u otros medios de administración.

Como se utiliza en el presente documento "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción que sean fisiológicamente compatibles. En una realización, el vehículo es adecuado para la administración parenteral. En otra realización, el vehículo es adecuado para la administración subcutánea. Como alternativa, el vehículo puede ser adecuado para la administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o sublingual. Los transportadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede estar presente en forma liofilizada. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una elevada concentración de fármaco. El transportador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un estabilizante. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un agente isotónico, por ejemplo, azúcares, tales como sacarosa, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio, en la composición. Al incluir un agente, tal como sales de monoestearato y gelatina, la absorción de las composiciones inyectables puede prolongarse. Además, el polipéptido se puede formular en una formulación de liberación prolongada, por ejemplo, en una composición que incluya un polímero de liberación lenta. Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que pueden proteger el compuesto frente a una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y poliláctico, copolímeros poliglicólicos (PLG).

Los polipéptidos de relaxina modificados y las composiciones de la presente divulgación se pueden administrar mediante cualquier vía convencional adecuada para proteínas o péptidos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, parenteralmente, por ejemplo, inyecciones incluyendo, aunque no de forma limitativa, por vía subcutánea o intravenosa o cualquier otra forma de inyecciones o infusiones. Las composiciones polipeptídicas se pueden administrar mediante varias vías que incluyen, pero sin limitación, la oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, transdérmica, subcutánea, tópica, sublingual o medios rectales. También se pueden administrar composiciones que comprenden relaxina modificada mediante liposomas. El polipéptido de relaxina modificado se puede usar solo o junto con otros componentes adecuados tales como un vehículo farmacéutico. El polipéptido de relaxina modificado se puede usar junto con otros agentes, como se describe en el presente documento.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral, tales como, por ejemplo, por vía intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal y subcutánea, incluyen soluciones de inyección estériles isotónicas, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. Las formulaciones de relaxina modificada pueden presentarse en envases sellados de dosis unitaria o multidosis, tales como ampollas y viales.

La dosis administrada a un/a paciente, en el contexto de la presente divulgación, es suficiente para tener una respuesta terapéutica beneficiosa en el paciente a lo largo del tiempo u otra actividad adecuada, dependiendo de la aplicación. La dosis está determinada por la eficacia de la formulación y la actividad, estabilidad o semivida en suero del polipéptido de relaxina modificado empleado y la afección del paciente, así como por el peso corporal o el área superficial del paciente a tratar.

La dosis administrada, por ejemplo, a un/a paciente de 70 kilogramos, habitualmente está en el intervalo equivalente a las dosis de las proteínas terapéuticas utilizadas actualmente, ajustado para la actividad alterada o la semivida sérica de la composición relevante.

Para la administración, las formulaciones de la presente divulgación se administran a una velocidad determinada por la DL-50 o la DE-50 de la formulación relevante y/u observación de cualquier efecto secundario de los polipéptidos de relaxina modificados en diversas concentraciones, incluyendo, aunque no de forma limitativa, como se aplica a la masa y la salud general del paciente. La administración se puede realizar mediante dosis únicas o divididas.

Los polipéptidos de relaxina modificados de la presente divulgación se pueden administrar directamente a un sujeto mamífero. Los polipéptidos de relaxina modificados de la presente divulgación se pueden preparar en una mezcla en una forma inyectable de dosis unitaria (incluyendo, aunque no de forma limitativa, solución, suspensión o emulsión) con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los polipéptidos de relaxina modificados de la presente divulgación también se pueden administrar mediante infusión continua (usando, incluyendo, aunque no de forma limitativa, minibombas, tales como bombas osmóticas), formulaciones de inyección en embolada única o de depósito de liberación lenta.

Las formulaciones adecuadas para la administración incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles isotónicas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que puede incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. Las soluciones y suspensiones pueden prepararse a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, tampones que contienen succinato, fosfato, borato, HEPES, citrato, histidina, imidazol, acetato, bicarbonato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo, aunque no de forma limitativa, ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular, incluyendo, aunque no de forma limitativa, los que tienen menos de aproximadamente 10 restos; proteínas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, polivinilpirrolidona; aminoácidos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, glicina, glutamina, asparagina, arginina, histidina o derivados de histidina, metionina, glutamato o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, trehalosa, sacarosa, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, incluyendo, aunque no de forma limitativa, EDTA y edetato disódico; iones metálicos divalentes, incluyendo, aunque no de forma limitativa, zinc, cobalto o cobre; azúcares alcohólicos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, incluyendo, aunque no de forma limitativa, sodio y cloruro de sodio; y/o tensioactivos no iónicos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, Tween™ (incluyendo, aunque no de forma limitativa, Tween 80 (polisorbato 80 o PS80) y Tween 20 (polisorbato 20), Pluronics™ y otros ácidos plurónicos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, otros ácidos plurónicos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, ácido plurónico F68 (poloxámero 188) o PEG. Los tensioactivos adecuados incluyen, por ejemplo, pero sin limitación, poliéteres basados en poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno), es decir, (PEO-PPO-PEO) u óxido de polipropileno)-poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno), es decir, (PPO-PEO-PPO) o una combinación de los mismos. PEO-PPO-PEO y PPO-PEO-PPO están disponibles comercialmente con los nombres comerciales Pluronics™, R-Pluronics™, Tetronics™ y R-Tetronics™ (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Michigan) y se describen con más detalle en la patente de Estados Unidos N.° 4.820.352. Otros polímeros en bloque de etileno/polipropileno pueden ser tensioactivos adecuados. Se puede usar un tensioactivo o una combinación de tensioactivos para estabilizar la relaxina modificada frente a una o más tensiones que incluyen, aunque no de forma limitativa, la tensión que resulta de la agitación. Algunos de los anteriores pueden denominarse "agentes de carga". Algunos también pueden denominarse "modificadores de tonicidad". También se pueden aplicar conservantes antimicrobianos para la estabilidad del producto y la eficacia antimicrobiana; los conservantes adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, alcohol bencílico, cloruro de benzalconio, metacresol, metil/propil parabenos, cresol y fenol o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede comprender un tampón que contiene succinato, fosfato, borato, HEPES, citrato, histidina, imidazol, acetato, bicarbonato y/u otros ácidos orgánicos; un carbohidrato (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos), tal como trehalosa, sacarosa, glucosa, manosa o dextrina; y unos tensioactivos, tales como Tween™ 80 (polisorbato 80 o PS80) o Tween 20 (polisorbato 20). En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede comprender un tampón que contiene histidina, un carbohidrato, tal como sacarosa; y unos tensioactivos, tales como PS80.

Los polipéptidos de relaxina modificados de la presente divulgación, incluidos los vinculados a un potenciador PK también pueden administrarse mediante sistemas de liberación sostenida o como parte de ellos. Las composiciones de liberación sostenida incluyen, incluyendo, aunque no de forma limitativa, matrices de polímeros semipermeables en forma de artículos conformados, incluyendo, aunque no de forma limitativa, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen materiales biocompatibles, tales como poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), acetato de etilenvinilo (o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico, polilactidas (ácido poliláctico), poliglicolida (polímero de ácido glicólico), polilactida co-glicolida (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico) polianhídridos, copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato, poli(orto)ésteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos, tales como la fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, propileno de polivinilo, polivinilpirrolidona y silicona. Las composiciones de liberación sostenida también incluyen un compuesto atrapado liposomalmente.

La dosis administrada a un/a paciente en el contexto de la presente divulgación debería ser suficiente para provocar una respuesta beneficiosa en el sujeto a lo largo del tiempo. Generalmente, la cantidad farmacéuticamente eficaz total del polipéptido de relaxina modificado de la presente divulgación administrado por vía parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea) por dosis puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,01 pg/kg a aproximadamente 500 mg/kg, de aproximadamente 0,01 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 100 pg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg o de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o es aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 12 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg o aproximadamente 100 mg/kg, del peso corporal del paciente, aunque esto está sujeto a discreción terapéutica. En algunas realizaciones, el polipéptido de relaxina modificado de la presente divulgación administrado por vía parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea) por dosis puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de 0,5 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg o de 1 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg o es aproximadamente 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 50 mg/kg u 80 mg/kg. En algunas realizaciones, el polipéptido de relaxina modificado de la presente divulgación administrado por vía parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea) por dosis puede ser de aproximadamente 1 mg/kg. En algunas realizaciones, el polipéptido de relaxina modificado de la presente divulgación administrado por vía parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea) por dosis puede ser una dosis fija en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10.000 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5.000 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 2.500 mg, de aproximadamente 100 mg hasta aproximadamente 1.000 mg, de aproximadamente 200 mg hasta aproximadamente 800 mg, de aproximadamente 400 mg hasta aproximadamente 600 mg, de aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 300 mg, de aproximadamente 300 mg a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 500 mg a aproximadamente 700 mg, de aproximadamente 700 mg a aproximadamente 900 mg, de aproximadamente 900 mg a aproximadamente 1.200 mg, de aproximadamente 1.000 mg a aproximadamente 2.000 mg, de aproximadamente 2.000 mg a aproximadamente 3.000 mg, de aproximadamente 3.000 mg a aproximadamente 4.000 mg, de aproximadamente 4.000 mg a aproximadamente 5.000 mg, de aproximadamente 5.000 mg a aproximadamente 6.000 mg, de aproximadamente 6.000 mg a aproximadamente 7.000 mg, de aproximadamente 7.000 mg a aproximadamente 8.000 mg, de aproximadamente 8.000 mg a aproximadamente 9.000 mg o de aproximadamente 9.000 mg a aproximadamente 10.000 mg.

XII. Usos terapéuticos de los polipéptidos de relaxina modificados

La presente divulgación proporciona un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en el tratamiento de enfermedades que incluyen enfermedades cardiovasculares o enfermedades fibróticas, tales como insuficiencia cardiaca, pancreatitis, inflamación, cáncer, esclerodermia, fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis hepática o fibrosis cardiaca.

Dicha enfermedad cardiovascular puede incluir, pero no se limita a, arteriopatía coronaria, ataque cardiaco, arritmia o ritmos cardiacos anormales, insuficiencia cardiaca, enfermedad de las válvulas cardiacas, cardiopatía congénita, miocardiopatía (enfermedad del músculo cardiaco), enfermedad pericárdica, enfermedad de la aorta, síndrome de Marfan o enfermedad vascular (enfermedad de los vasos sanguíneos).

En algunas realizaciones, dicha insuficiencia cardiaca puede comprender uno o más de insuficiencia cardiaca avanzada, síndrome cardio-renal, insuficiencia cardiaca con función renal deteriorada, insuficiencia cardiaca crónica, insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección de rango medio (HFmEF), insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca posaguda, tal como insuficiencia cardiaca descompensada posaguda, insuficiencia cardiaca compensada, insuficiencia cardiaca descompensada, insuficiencia cardiaca derecha, insuficiencia cardiaca izquierda, insuficiencia cardiaca global, miocardiopatía isquémica, miocardiopatía dilatada, insuficiencia cardiaca asociada con defectos cardiacos congénitos, insuficiencia cardiaca asociada con defectos de las válvulas cardiacas, estenosis mitral, insuficiencia mitral, estenosis aórtica, insuficiencia aórtica, estenosis de la tricuspídea, insuficiencia tricúspide, estenosis pulmonar, insuficiencia de la válvula pulmonar, angina de pecho, hipertensión, hipertensión pulmonar o hipertensión arterial pulmonar, insuficiencia cardiaca asociada con defectos combinados de las válvulas cardiacas, inflamación del miocardio (miocarditis), miocarditis crónica, miocarditis aguda, miocarditis vírica, insuficiencia cardiaca diabética, miocardiopatía alcohólica, insuficiencia cardiaca asociada con trastornos de almacenamiento cardiaco, insuficiencia cardiaca diastólica, insuficiencia cardiaca sistólica, disfunción diastólica, remodelación posmiocárdica, insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección conservada (HFpEF) o insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección reducida (HFrEF).

En algunas realizaciones, dicha insuficiencia cardiaca se selecciona de insuficiencia cardiaca crónica, insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca postaguda, insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección reducida (HFrEF), insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección conservada (HFpEF), insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección de rango medio (HFmEF), insuficiencia cardiaca diastólica, insuficiencia cardiaca sistólica, remodelación posmiocárdica, angina de pecho, hipertensión, hipertensión pulmonar e hipertensión arterial pulmonar. En algunas realizaciones, dicha insuficiencia cardiaca se selecciona de insuficiencia cardiaca posaguda, insuficiencia cardiaca avanzada, síndrome cardio-renal e insuficiencia cardiaca con función renal deteriorada.

La fibrosis es la formación de tejido conjuntivo fibroso excesivo en un órgano o tejido. El depósito excesivo de tejido fibroso se asocia con afecciones patológicas que pueden conducir a un deterioro de la función orgánica o tisular. Los órganos afectados pueden incluir los pulmones (fibrosis de pulmón o pulmonar), hígado (fibrosis de hígado o hepática), riñón (fibrosis de riñón o renal) y corazón (fibrosis cardiaca). La fibrosis también puede afectar a otros tejidos y órganos, incluidas las articulaciones, piel, intestino, médula ósea y otros. Las afecciones o enfermedades fibróticas ilustrativas incluyen, pero sin limitación, esteatohepatitis no alcohólica (ENA), que afecta al hígado; enfermedad renal diabética y nefropatía diabética, que afectan al riñón; e insuficiencia cardiaca metabólica, que afecta al corazón. Por ejemplo, la ENA se caracteriza por grasa, inflamación y daño en el hígado en personas que consumen poco o nada de alcohol y puede provocar cirrosis hepática. La ENA tiende a diagnosticarse en personas de mediana edad con sobrepeso u obesidad que a menudo tienen niveles elevados de lípidos en sangre y diabetes o prediabetes.

La actividad biológica de los polipéptidos de relaxina modificados para uso terapéutico potencial se puede determinar utilizando ensayos conocidosin vitrooin vivo.Los polipéptidos de relaxina pueden analizarse para determinar su actividad biológica mediante métodos adecuados conocidos en la técnica. Tales ensayos incluyen, pero sin limitación, ensayos de unión a receptores.

Con respecto a enfermedades tales como la insuficiencia cardiaca y la enfermedad fibrótica, la actividad de una relaxina modificada se puede determinar usando uno o más ensayosin vivo.Dichos ensayos normalmente implican la administración de una relaxina en un modelo animal de dicha enfermedad y la determinación del efecto sobre la progresión de la enfermedad, gravedad u otros indicios de tratamiento eficaz. Tales ensayos pueden usarse para determinar dosis y regímenes de tratamiento eficaces en el sistema modelo y basándose en ello, predecir un régimen de dosificación para uso clínico, por ejemplo, para pacientes humanos. Los ensayos de IC ilustrativos que pueden utilizarse incluyen: 1) el modelo de ligadura de la coronaria descendente anterior izquierda (LAD, por sus siglas en inglés) en ratón, que imita los cambios cardiacos de pacientes que sufren un infarto de miocardio y una progresión a IC (Samuelet al.,Lab. Investigation 91:675-690, 2011); 2) modelo de infusión de AngII limitado, en el que se utilizan concentraciones mínimas de AngII para inducir fibrosis cardiaca (Xuet al.,J. Cardiovasc. Pharmacol. 51:62-70, 2008); 3) modelo de rata sensible Dahl-Salt que se caracteriza por hipertensión, insuficiencia renal y sobrecarga de volumen sanguíneo (Sakataet al.,Circulation 109:2143-2149, 2004); 4) modelo de rata espontáneamente hipertensa (SHR, por sus siglas en inglés) envejecida de fibrosis cardiaca y renal que se utilizó previamente para demostrar la eficacia de TS-RLX (Lekgabeet al.,Hypertension 46:412-418, 2005); y 5) modelo de rata de constricción aórtica torácica de sobrecarga de presión (Kusteret al.,Circulation 111:420-427, 2005). Además de estos modelos, la actividad de las relaxinas modificadas también puede determinarse en un modelo de perro, tal como en perros con IC normal y con taquiestimulación inducida. Adicionalmente, estos ensayos se pueden realizar para determinar si una relaxina modificada es eficaz cuando se administra no solo en modo preventivo, pero también en modo terapéutico. Además, las relaxinas modificadas pueden probarse en modelos de fibrosis, incluida la renal (Yoshidaet al.,Nephrol. Dialysis Transplant 27: 2190-2197, 2012), lung (Huanget al.,Am. J. Pathol. 179:2751-2765, 2011) y fibrosis hepática (Williamset al.,Gut 49:577-583, 2001). Por ejemplo, la eficacia de una relaxina modificada se puede comparar con la eficacia de la relaxina de tipo silvestre (por ejemplo, relaxina humana de tipo silvestre).

Las cantidades administradas de relaxina, los polipéptidos de relaxina y/o los análogos de relaxina de la presente invención pueden variar y en particular, deben basarse en las recomendaciones y prescripciones del personal médico cualificado. La cantidad exacta de relaxina, los polipéptidos de relaxina y/los o análogos de relaxina de la presente invención, es una cuestión de preferencia sujeta a factores tales como el tipo exacto y/o la gravedad de la afección que se está tratando, la afección del paciente que se está tratando, así como los demás ingredientes de la composición. La invención puede comprender además la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de otro agente activo. La cantidad a administrar puede determinarse fácilmente por una persona experta en la técnica basándose en la terapia con relaxina, en las terapias con relaxina disponibles y/o en otros análogos de la relaxina.

Los compuestos de la presente divulgación se pueden usar para reducir el área de miocardio afectada por un infarto y para la profilaxis de infartos secundarios. Se proporciona además el uso de los compuestos de la presente divulgación para la profilaxis y/o tratamiento de trastornos tromboembólicos, daño por reperfusión después de isquemia, lesiones micro y macrovasculares (vasculitis), trombosis arteriales y venosas, edemas, isquemias, tales como el infarto de miocardio, accidente cerebrovascular y ataques isquémicos transitorios, para protección cardiovascular en relación con operaciones de derivación de arteria coronaria (injerto de derivación de arteria coronaria, CABG, por sus siglas en inglés), angioplastias coronarias transluminales percutáneas primarias (ACTP), ACTP después de una trombólisis, ACTP de rescate, trasplantes de corazón y operaciones a corazón abierto y para la protección de órganos en relación con trasplantes, operaciones de derivación, exámenes de catéter y otros procedimientos quirúrgicos. Se proporciona además el uso de los compuestos de la presente divulgación para la profilaxis y/o tratamiento de trastornos respiratorios, tales como, por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (bronquitis crónica, EPOC), asma, enfisema pulmonar, bronquiectasias, fibrosis quística (mucoviscidosis) e hipertensión pulmonar, en particular, hipertensión arterial pulmonar.

Las realizaciones ilustrativas de la presente divulgación proporcionan un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar como medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de enfermedades renales, incluyendo, aunque no de forma limitativa, enfermedades renales agudas y crónicas e insuficiencias renales agudas y crónicas, así como insuficiencia renal crónica y aguda, incluyendo las etapas agudas y crónicas de la insuficiencia renal, con y sin necesidad de diálisis, así como las enfermedades renales subyacentes o relacionadas, tales como hipoperfusión renal, hipotensión inducida por diálisis, glomerulopatías, proteinuria glomerular y tubular, edema renal, hematuria, glomerulonefritis primaria, secundaria, así como aguda y crónica, glomerulonefritis membranosa y membranoproliferativa, síndrome de Alport, glomeruloesclerosis, enfermedades tubulares intersticiales, enfermedades nefropáticas, tales como enfermedades renales primarias y congénitas, inflamación renal, enfermedades renales inmunológicas, tales como rechazo de trasplante renal, enfermedades renales inducidas por complejos inmunes, así como enfermedades nefropáticas inducidas por intoxicaciones, enfermedades renales diabéticas y no diabéticas, pielonefritis, riñones quísticos, nefroesclerosis, nefroesclerosis hipertensiva, síndrome nefrótico, que se caracterizan y se asocian desde el punto de vista diagnóstico con una reducción anormal en el aclaramiento de creatinina y/o la excreción de agua, aumento anormal de las concentraciones sanguíneas de urea, nitrógeno, potasio y/o creatinina, alteración en la actividad de las enzimas renales, tales como la glutamilsintetasa, osmolaridad de la orina y volumen de orina, aumento de microalbuminuria, macroalbuminuria, lesiones glomerulares y arteriolares, dilatación tubular, hiperfosfatemia y/o necesidad de diálisis.

Además, una relaxina modificada de la divulgación se puede utilizar como medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de carcinomas renales, después de una resección incompleta del riñón, deshidratación después del uso excesivo de diuréticos, aumento incontrolado de la presión arterial con hipertensión maligna, obstrucción e infección del tracto urinario, amiloidosis, así como enfermedades sistémicas asociadas con daño glomerular, tales como lupus eritematodo y enfermedades sistémicas inmunológicas reumáticas, así como estenosis de la arteria renal, trombosis de la arteria renal, trombosis de la vena renal, nefropatía inducida por analgésicos y acidosis tubular renal.

Además, la presente divulgación proporciona un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar como medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades renales intersticiales agudas y crónicas inducidas por medios de contraste e inducidas por fármacos, síndrome metabólico y dislipemia.

Además, la presente divulgación proporciona un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar como medicamento para la profilaxis, alivio y/o tratamiento de secuelas o síntomas asociados con enfermedades renales agudas y/o crónicas, tales como edema pulmonar, insuficiencia cardiaca, uremia, anemia, alteraciones electrolíticas (por ejemplo, hiperpotasemia, hiponatremia), así como del metabolismo óseo y de carbohidratos.

Además, la presente divulgación proporciona un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar como medicamento para mejorar, estabilizar o restaurar la función renal en un/a paciente que lo necesita, por ejemplo, un/a paciente que tiene una enfermedad renal como se ha descrito anteriormente.

Otras realizaciones ilustrativas proporcionan un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades pulmonares, especialmente de trastornos asmáticos, hipertensión arterial pulmonar (HAP) y otras formas de hipertensión pulmonar (HP), incluida la enfermedad del corazón izquierdo, VIH, anemia de células falciformes, tromboembolias (HPTEC), sarcoidosis, EPOC o hipertensión pulmonar asociada a fibrosis pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), lesión pulmonar aguda (LPA), deficiencia de alfa-1-antitripsina (AATD, por sus siglas en inglés), fibrosis pulmonar, enfisema pulmonar (por ejemplo, enfisema pulmonar inducido por el humo del cigarro) y fibrosis quística (FQ).

Otras realizaciones ilustrativas proporcionan un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en el tratamiento y/o profilaxis de trastornos fibróticos, incluyendo trastornos fibróticos de los órganos internos, tales como, por ejemplo, el pulmón, el corazón, el riñón, la médula ósea y en particular el hígado, así como la fibrosis dermatológica y las enfermedades fibróticas de los ojos.

La presente divulgación proporciona además un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de trastornos, en particular los trastornos mencionados anteriormente.

La presente divulgación proporciona además un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en un método para el tratamiento y/o prevención de trastornos, en particular los trastornos mencionados anteriormente, usando una cantidad eficaz de al menos una relaxina modificada de la divulgación.

La presente divulgación proporciona además un polipéptido de relaxina modificado de la invención o una composición de la invención para usar en un método para el tratamiento y/o profilaxis de la cardiopatía coronaria, síndrome coronario agudo, insuficiencia cardiaca (por ejemplo, insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca crónica o insuficiencia cardiaca avanzada) e infarto de miocardio.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para usar en los métodos y las composiciones de la presente divulgación incluyen composiciones en donde los principios activos están contenidos en una cantidad eficaz para alcanzar el fin previsto, por ejemplo, tratar la insuficiencia cardiaca. La determinación de una dosis eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica en vista de la presente divulgación.

Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente, en ensayosin vitro,por ejemplo, activación del receptor RXFP1,ex vivoen corazones de rata aislados y perfundidos o en modelos animales, normalmente ratones, ratas, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también se utiliza para lograr un intervalo de concentración y una vía de administración deseables. Tal información se puede usar a continuación para determinar las dosis y las vías de administración útiles en seres humanos.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de relaxina modificada que mejora los síntomas o la afección. La eficacia terapéutica y la toxicidad de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándarin vitroo en animales de experimentación, por ejemplo, la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en un 50 % de la población) y la DL50 (la dosis letal para un 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación, DE50/LD50. Las composiciones farmacéuticas ilustrativas presentan grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos de ensayosin vitroy de estudios en animales se usan para formular un intervalo de dosis para uso humano. La dosificación de tales compuestos se encuentra, por ejemplo, dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo, dependiendo de la forma farmacéutica empleada, la sensibilidad del paciente y la vía de administración.

Las dosis normales pueden variar de 0,1 a 100.000 miligramos de dosis total, dependiendo de la vía de administración. En la bibliografía se proporciona orientación sobre dosis y métodos de suministro particulares. Véanse las Patentes de Estados Unidos N.° 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212.

XIII. Combinaciones

Una relaxina modificada de la divulgación se puede administrar sola o junto con otros compuestos activos. En este contexto, el término combinación abarca cualquier medio de administración concurrente o secuencial, tanto si la relaxina modificada y el otro agente están contenidos o no en la misma composición o se administran por separado, cuya administración podrá ser a través de la misma o diferentes modalidades de administración. La presente divulgación proporciona medicamentos que comprenden al menos una relaxina modificada y uno o más principios activos adicionales, en composiciones farmacéuticas donde se mezclan con excipiente(s) o vehículos farmacéuticamente aceptables, para el tratamiento y/o prevención de los trastornos mencionados anteriormente.

Los principios activos adecuados para una combinación pueden incluir, a modo de ejemplo: principios activos que modulan el metabolismo de los lípidos, antidiabéticos, agentes hipotensores, agentes potenciadores de la perfusión y/o antitrombóticos, antioxidantes, antagonistas de receptores de quimiocinas, inhibidores de p38 cinasa, agonistas de NPY, agonistas de orexina, anoréxicos, inhibidores de PAF-AH, antiflogísticos (inhibidores de la COX, LTB4-antagonistas de los receptores), analgésicos, por ejemplo, aspirina, inhibidores de P2Y12, tales como clopidogrel, Inhibidores de PCSK9, tales como evolocumab (REPATHA) o alirocumab (PRALUENT), antidepresivos y otros psicofármacos.

La presente divulgación proporciona además combinaciones de al menos una relaxina modificada con al menos un principio activo que modifica el metabolismo de los lípidos, antidiabético, principio activo reductor de la presión arterial y/o agente que tiene efectos antitrombóticos.

La relaxina modificada se puede combinar con uno o más principios activos moduladores del metabolismo de los lípidos, por ejemplo, inhibidores de la HMG-CoA reductasa, inhibidores de la expresión de HMG-CoA reductasa, inhibidores de la síntesis de escualeno, inhibidores de ACAT, iductores del receptor de LDL, inhibidores de la absorción del colesterol, adsorbentes poliméricos de ácidos biliares, inhibidores de la reabsorción de los ácidos biliares, inhibidores de MTP, inhibidores de la lipasa, activadores de LpL, fibratos, niacina, agonistas del receptor de niacina, inhibidores de CETP, agonistas de PPAR-a, de PPAR-y y/o PPAR-5, moduladores de RXR, moduladores de FXR, moduladores de LXR, hormonas tiroideas y/o miméticos tiroideos, inhibidores de la ATP citrato liasa, antagonistas de Lp(a), antagonistas del receptor de cannabinoide 1, agonistas del receptor de la leptina, agonistas del receptor de bombesina, inhibidores de PCSK9, agonistas del receptor de histamina y antioxidantes/eliminadores de radicales.

En algunas realizaciones, se administra una relaxina modificada junto con un inhibidor de la HMG-CoA reductasa de la clase de las estatinas, por ejemplo, lovastatina, simvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvastatina, rosuvastatina o pitavastatina. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un inhibidor de la síntesis de escualeno, por ejemplo, BMS-188494 o TAK-475. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un inhibidor de ACAT, por ejemplo, avasimiba, melinamida, pactimiba, eflucimiba o SMP-797. En otra realización, la otra relaxina modificada se administra junto con un inhibidor de la absorción de colesterol, por ejemplo, ezetimiba, tiquesida o pamaquesida. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un inhibidor de MTP, por ejemplo, implitapida, BMS-201038, R-103757 o JTT-130. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un inhibidor de la lipasa, por ejemplo, orlistat. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con una hormona tiroidea y/o un mimético tiroideo, por ejemplo, D-tiroxina o 3,5,3'-triyodotironina (T3). En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un agonista del receptor de niacina, por ejemplo, niacina, acipimox, acifran o radecol. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un inhibidor de la CETP, por ejemplo, dalcetrapib, BAY 60-5521, anacetrapib o vacuna de CETP (CETi-1). En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un agonista de PPAR-y, por ejemplo, de la clase de las tiazolidinedionas, por ejemplo, pioglitazona o rosiglitazona. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un agonista de PPAR-8, por ejemplo, GW-501516 o BAY 68-5042. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un adsorbente polimérico de ácidos biliares, por ejemplo, colestiramina, colestipol, colesolvam, CholestaGel o colestimida. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un inhibidor de la reabsorción de ácidos biliares, por ejemplo, inhibidores de ASBT (= IBAT), tales como, por ejemplo, AZD-7806, S-8921, AK-105, BARI-1741, SC-435 o SC-635. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un antioxidante/eliminador de radicales, por ejemplo, probucol, AGI-1067, BO-653 o AEOL-10150. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un antagonista del receptor cannabinoide 1, por ejemplo, rimonabant o SR-147778.

La relaxina modificada se puede combinar con uno o más antidiabéticos, por ejemplo, insulina y derivados de insulina, sulfonilureas, biguanidas, derivados de meglitinida, inhibidores de glucosidasa, agonistas de PPAR-gamma, inhibidores de la dipeptidil-peptidasa IV (inhibidores de DPP-IV), oxadiazolidinonas, tiazolidinadionas, agonistas del receptor de GLP 1, antagonistas del glucagón, sintetizadores de insulina, agonistas del receptor de CCK 1, agonistas del receptor de la leptina, inhibidores de las enzimas hepáticas implicadas en la estimulación de la gluconeogénesis y/o la glucogenolisis, moduladores de la captación de glucosa y también abridores de canales de potasio.

En algunas realizaciones, la relaxina modificada se administra junto con insulina o un derivado de insulina. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con una sulfonilurea, por ejemplo, tolbutamida, glibenclamida, glimepirida, glipizida o gliclazida. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con una biguanida, por ejemplo, metformina. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un derivado de meglitinida, por ejemplo, repaglinida o nateglinida. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un inhibidor de la glucosidasa, por ejemplo, miglitol o acarbosa. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un inhibidor de DPP-IV, por ejemplo, sitagliptina y vildagliptina. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un agonista de PPAR-gamma, por ejemplo, de la clase de las tiazolinedionas, por ejemplo, pioglitazona o rosiglitazona.

La relaxina modificada se puede combinar con uno o más principios activos hipotensores, por ejemplo, antagonistas de calcio, antagonistas de la angiotensina II, inhibidores de ACE, inhibidores de la renina, bloqueadores de los receptores beta, bloqueadores de los receptores alfa, diuréticos, antagonistas de aldosterona, antagonistas de los receptores de mineralocorticoides, inhibidores de ECE, Inhibidores de la ECA/NEP y los inhibidores de la vasopeptidasa.

En algunas realizaciones, la relaxina modificada se administra junto con un antagonista del calcio, por ejemplo, nifedipino, amlodipino, verapamilo o diltiazem. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un antagonista de la angiotensina II, por ejemplo, losartán, valsartán, candesartán, embusartán, olmesartán o telmisartán. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un inhibidor de ACE, por ejemplo, enalapril, captopril, lisinopril, ramipril, delapril, fosinopril, quinapril, perindopril o trandopril. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un bloqueador de los receptores beta, por ejemplo, propranolol, atenolol, timolol, pindolol, alprenolol, oxprenolol, penbutolol, bupranolol, metipranolol, nadolol, mepindolol, carazalol, sotalol, metoprolol, betaxolol, celiprolol, bisoprolol, carteolol, esmolol, labetalol, carvedilol, adaprolol, landiolol, nebivolol, epanolol o bucindolol. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un bloqueador de los receptores alfa, por ejemplo, prazosina. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un diurético, por ejemplo, furosemida, bumetanida, torsemida, bendroflumetiazida, clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, meticlotiazida, politiazida, triclorometiazida, clorotalidona, indapamida, metolazona, quinetazona, acetazolamida, diclorofenamida, metazolamida, glicerol, isosorbida, manitol, amilorida o triamtereno. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un antagonista del receptor de aldosterona o mineralocorticoides, por ejemplo, espironolactona o eplerenona. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un antagonista del receptor de vasopresina, por ejemplo, conivaptán, tolvaptán, lixivaptán o SR-121463.

La relaxina modificada se puede combinar con uno o más de los siguientes: agentes antitrombóticos, por ejemplo, inhibidores de la agregación plaquetaria o anticoagulantes; diuréticos; antagonistas del receptor de vasopresina; nitratos orgánicos y donadores de NO; compuestos con actividad inotrópica positiva; compuestos que inhiben la degradación del monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) y/o del monofosfato de adenosina cíclico (AMPc), tales como, por ejemplo, inhibidores de las fosfodiesterasas (PDE) 1, 2, 3, 4 y/o 5, en particular inhibidores de la PDE 5, tales como sildenafilo, vardenafil y tadalafil y también inhibidores de la PDE 3, tales como milrinona; péptidos natriuréticos, por ejemplo, "péptido natriurético auricular" (ANP, anaritida), "péptido natriurético tipo B" o "péptido natriurético cerebral" (BNP, nesiritida), "péptido natriurético tipo C" (CNP) y también urodilatina; agonistas del receptor de prostaciclina (receptor de IP), por ejemplo, iloprost, beraprost, cicaprost; inhibidores del canal If (canal raro; en inglés, "funny"), por ejemplo, ivabradina; sensibilizadores del calcio, tales como, a modo de ejemplo, levosimendán; suplementos de potasio; estimuladores independientes de NO, pero dependientes de hemo de la guanilato ciclasa, por ejemplo, los compuestos descritos en los documentos WO 00/06568, WO 00/06569, WO 02/42301 y WO 03/095451; activadores independientes de NO y de hemo de la guanilato ciclasa, por ejemplo, los compuestos descritos en los documentos WO 01/19355, WO 01/19776, WO 01/19778, WO 01/19780, WO 02/070462 y WO 02/070510; inhibidores de la elastasa de neutrófilos humanos (ENH), por ejemplo, sivelestat y DX-890 (Reltran); compuestos que inhiben la cascada de transducción de señales, por ejemplo, inhibidores de tirosina cinasa, por ejemplo, sorafenib, imatinib, gefitinib y erlotinib; y/o compuestos que modulan el metabolismo energético del corazón, por ejemplo, etomohir, dicloroacetato, ranolazina y trimetazidina.

En algunas realizaciones, la relaxina modificada se administra junto con un nitrato orgánico o un donante de NO, por ejemplo, nitroprusiato de sodio, nitroglicerol, mononitrato de isosorbida, dinitrato de isosorbida, molsidomina o SIN-1 o junto con NO inhalado. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un compuesto inotrópico positivo, por ejemplo, glucósidos cardiacos (digoxina), agonistas beta-adrenérgicos y dopaminérgicos, tales como isoproterenol, adrenalina, noradrenalina, dopamina o dobutamina. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con antisimpatotónicos, tales como reserpina, clonidina o alfa-metildopa o junto con agonistas de los canales de potasio, tales como minoxidil, diazóxido, dihidralazina o hidralazina o con sustancias que liberan óxido de nitrógeno, tales como nitrato de glicerol o nitroprusiato de sodio. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un inhibidor de la agregación plaquetaria, por ejemplo, aspirina, clopidogrel, ticlopidina o dipiridamol. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un inhibidor de trombina, por ejemplo, ximelagatrán, melagatrán, dabigatrán, bivalirudina o clexano. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un antagonista de GPIIb/IIIa, por ejemplo, tirofiban o abciximab. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un inhibidor del factor Xa, por ejemplo, rivaroxabán (BAY 59-7939), DU-176b, apixabán, otamixabán, fidexabán, razaxabán, fondaparinux, idraparinux, PMD-3112, YM-150, KFA-1982, EMD-503982, MCM-17, MLN-1021, DX 9065a, DPC 906, JTV 803, SSR-126512 o SSR-128428. En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con heparina o un derivado de heparina de bajo peso molecular (BPM). En otra realización, la relaxina modificada se administra junto con un antagonista de la vitamina K, tales como, a modo de ejemplo, Coumadin (warfarina).

La presente divulgación proporciona además medicamentos o composiciones farmacéuticas que contienen al menos una relaxina modificada, normalmente junto con uno o más auxiliares inertes farmacéuticamente adecuados no tóxicos y también su uso para los fines mencionados anteriormente. Opcionalmente dicho medicamento puede comprender dicha relaxina modificada y otro principio activo, tal como los identificados anteriormente. Por ejemplo, dicho medicamento puede comprender dicha relaxina modificada y otro principio activo en una cantidad eficaz para el tratamiento o la prevención de la insuficiencia cardiaca y/o una enfermedad asociada con la fibrosis.

Ejemplos

Está claro para la persona experta qué compuestos descritos en los siguientes ejemplos son polipéptidos de relaxina modificados de acuerdo con la invención reivindicada y qué compuestos son los que no se reivindican explícitamente pero que son útiles para comprender la invención reivindicada.

Ejemplo 1: Incorporación ribosómica de un aminoácido codificado de forma no natural en preproRelaxina

Este ejemplo ejemplifica la clonación y la expresión de un polipéptido de relaxina que incluye un aminoácido codificado de forma no natural enE. coli.

Los expertos en la técnica conocen métodos para clonar relaxina. Las secuencias de polipéptidos y de polinucleótidos para la relaxina y la clonación de relaxina en células hospedadoras se detallan en la patente de Estados Unidos N.° 4.758.516; patente de Estados Unidos N.° 5.166.191; patentes de Estados Unidos N.° 5.179.195, 5.945.402 y 5.759.807.

El ADNc que codifica la relaxina se muestra como la SEQ ID NO: 12 y la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro se muestra como la SEQ ID NO: 1. En la Tabla 1 se proporcionan secuencias de relaxina ilustrativas.

TABLA 1: Secuencias de relaxina

continuación

Se utiliza un sistema de traducción introducido que comprende un ARNt ortogonal (ARNt-O) y una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (RS-O) para expresar relaxina o análogos de relaxina que contienen un aminoácido codificado de forma no natural. La RS-O aminoacila preferentemente el ARNt-O con un aminoácido codificado de forma no natural. A su vez, el sistema de traducción inserta el aminoácido codificado de forma no natural en la relaxina o análogo de relaxina, en respuesta a un codón selector codificado. Las secuencias de RS-O y ARNt-O adecuadas se describen en el documento WO 2006/068802 titulado "Compositions of Aminoacil-tRNA Synthetase and Uses Thereof" (E9; SEQ ID NO: 16) y el documento WO 2007/021297 titulado "Compositions of tRNA and Uses Thereof" (F13; SEQ ID NO: 17). En la Tabla 2 se ilustran secuencias ilustrativas que pueden utilizarse.

TABLA 2: Secuencias utilizadas en sistemas de ex resión

La transformación deE. colicon plásmidos que contienen el gen de relaxina modificado o análogo de relaxina y el par aminoacil ARNt sintetasa/ARNt ortogonal (específico para el aminoácido codificado de forma no natural deseado) permite la incorporación específica del sitio del aminoácido codificado de forma no natural en el polipéptido de relaxina, como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 8.735.539.

La relaxina madura de tipo silvestre se amplifica mediante PCR a partir de una reacción de síntesis de ADNc utilizando protocolos estándar y se clona en un vector plasmídico, tal como pET30 (NcoI-BamHI). La secuencia de relaxina se subclona en un vector de supresión que contiene un supresor de ámbar tirosil tRNATyr/CUA deMethanococcus jannaschii(Mj tRNATyr/CUA) bajo control constitutivo de un promotor sintético derivado de la secuencia promotora de lipoproteínas deE. coli(Miller, J.H., Gene, 1986), así como la tirosil-ARNt-sintetasa ortogonal (MjTyrRS) (por ejemplo, E9) bajo el control del promotor GlnRS deE. coli.La expresión de relaxina está bajo el control del promotor T7, que es inducida indirectamente por L-arabinosa. Las mutaciones ámbar se introducen mediante protocolos estándar de mutación de cambio rápido (Stratagene; La Jolla, California). Las construcciones se verifican en secuencia.

Supresión con para-acetil-fenilalanina (pAcF)

Se usaron los plásmidos que contienen el gen de relaxina modificado que comprende una mutación ámbar (que codifica la SEQ ID NO: 38 con pAcF en el resto 1 de la cadena A, véase la Fig. 4) y el par aminoacil ARNt sintetasa/ARNt ortogonal, como se ha descrito anteriormente, para transformar en la cepa W3110B55 deEscherichia coli[F-IN(rrnD-rrnE)lambdaaraB::g1tetA fhuA::dhfr proSW375R::cat] para producir cepas deE. colien las que la expresión de la polimerasa T7 estaba bajo el control de un promotor inducible por arabinosa. Los cultivos bacterianos durante la noche se diluyeron 1:100 en matraces agitados que contenían medios de cultivo 2X YT y se cultivaron a 37 °C a una DO600 de ~0,8. La expresión de proteínas se indujo mediante la adición de arabinosa (0,2 % final) y paraacetil-fenilalanina (pAcF) hasta una concentración final de 4 mM. Los cultivos se incubaron a 37 °C durante 5 horas. Las células se sedimentaron y se resuspendieron en tampón de lisis B-PER (Pierce) 100 ul/OD/ml 10 ug/ml de ADNasa y se incubaron a 37 °C durante 30 min. El material celular se eliminó mediante centrifugación y se eliminó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en una cantidad igual de tampón de carga de proteínas SDS-PAGE. Todas las muestras se cargan en un gel PAGE al 4-12 % con MES y DTT. La expresión de relaxina se confirma mediante SDS-PAGE, análisis de transferencia Western o espectrometría de masas con trampa de iones de ionización por electropulverización y similares.

La secuencia del gen de la relaxina modificada puede incluir una etiqueta His N-terminal, por ejemplo, HHHHHHSGG (SEQ ID NO: 55). Las proteínas de relaxina mutantes marcadas con His se pueden purificar usando métodos conocidos por las personas normalmente versadas en la materia. La resina quelante de níquel ProBond (Invitrogen, Carlsbad, California) se puede utilizar mediante los procedimientos estándar de purificación de proteínas marcadas con His proporcionados por el fabricante. Las mediciones funcionales de las proteínas se pueden realizar mediante métodos conocidos en la técnica, métodos proporcionados en esta solicitud y en referencias incorporadas y como alternativa, se puede desarrollar un ELISA en células vivas para evaluar los polipéptidos de relaxina de la invención.

Ejemplo 2: Producción y purificación de relaxina madura que contiene un aminoácido codificado de forma no natural

La preproRelaxina (SEQ ID NO: 38 con pAcF en el resto 1 de la cadena A, véase la Fig. 4) se produjo mediante fermentación en células deE. colicomo cuerpos de inclusión. El aminoácido para-acetil-fenilalanina codificado de forma no natural se incorporó ribosómicamente usando los métodos generales proporcionados en el Ejemplo 1.

Se cultivaron células deE. colique contenían el plásmido que expresaba el polipéptido de relaxina modificado en un fermentador que contenía medio de fermentación. Se añadió kanamicina al fermentador para promover la estabilidad del plásmido. Se añadió clorhidrato de L-alanina-L-para-acetilfenilalanina (L-Ala-pAcF) al fermentador para permitir la incorporación de p-acetilfenilalanina (pAcF) en la secuencia de aminoácidos de preproRelaxina. Finalmente, se añadió L-arabinosa para inducir la expresión de preproRelaxina. La preproRelaxina producida dentro de las células dio como resultado la formación de cuerpos de inclusión insolubles (IB). El caldo de fermentación se recogió después de un período tras la inducción. El título de fermentación fue de aproximadamente 4,5 g de preproRelaxina por litro de fermentación.

Los cuerpos de inclusión (IB, por sus siglas en inglés) se separaron a partir de las células intactas lisando las células en condiciones de cizalla elevada. Los IB intactos se recuperaron mediante centrifugación. Tras la recuperación, los gránulos de IB se resuspendieron en agua y se volvieron a centrifugar para eliminar las impurezas. Los IB lavados se solubilizaron a pH 8,5 en tampón guanidina/Tris 5 M que contenía ditiotreitol (DTT) 5 mM. El replegado de preproRelaxina se logró diluyendo lentamente la solución de IB solubilizada aproximadamente 4,5 veces en tampón Tris enfriado de pH 8,5 que contenía DTT 5 mM y cistamina 8,5 mM. La solución de replegado se incubó durante un mínimo de 12 h antes de continuar con el procesamiento. Una vez completado el período de incubación, el pH se redujo a 3,5-4,0 mediante la adición de ácido acético y ácido clorhídrico, para promover la precipitación de impurezas. El material precipitado se eliminó mediante centrifugación seguida de filtración en profundidad.

La solución de replegado filtrada en profundidad se diluyó aproximadamente 6,5 veces con tampón acetato de pH 4 para reducir la conductividad, en preparación para la carga en una columna de intercambio catiónico Tosoh Bioscience SP550C. Tras la carga, se lavó la columna SP550C y a continuación, se eluyó preproRelaxina usando un gradiente de un 10 % a un 90 % de tampón acetato 50 mM, pH 5,5, que contenía NaCl 1 M. El eluido de SP550C se diluyó con agua purificada hasta que la concentración de preproRelaxina fue de 1,5 mg/ml. El pH se ajustó a 8,0 mediante la adición de Tris 2 M, pH 8,0 seguido de la adición de CaCl22 mM en preparación para la conversión enzimática.

La tripsina natural se modificó con anhídrido succínico (es decir, succinilación) para facilitar la eliminación de la mezcla de reacción preproRelaxina/tripsina al finalizar la etapa de tratamiento con tripsina. Se diluyó tripsina concentrada de tipo silvestre en HCl 10 mM, CaCl2 20 mM hasta 5 mg/ml con agua purificada y a continuación, se añadió tampón borato 1 M, pH 7,6, hasta una concentración final de 0,2 M. Se añadió anhídrido succínico sólido a la solución de tripsina diluida con pH ajustado en un exceso de 100 molar sobre tripsina, en tres adiciones equimolares (3 x 33,3 adiciones en exceso molar) mezclando durante 10 minutos entre cada adición.

Se añadió tripsina succinilada a la solución de preproRelaxina incubada a 22 °C durante 4 horas para garantizar la eliminación enzimática completa del péptido de conexión y de la secuencia líder de la molécula de preproRelaxina. La molécula de Relaxina-R resultante contiene una arginina C-terminal en la cadena B. A continuación, el material tratado con tripsina se procesó a través de un filtro de intercambio aniónico de PA Sartobind de STIC® que se une a la tripsina succinilada al tiempo que la Relaxina-R se recoge en el flujo que lo atraviesa. Se añadió carboxipeptidasa-B (CPB) al filtrado de PA de STIC® y se incubó con agitación durante 2 horas para asegurar la eliminación enzimática completa del resto de arginina C-terminal de la cadena B. La reacción de CPB se detuvo reduciendo el pH de la mezcla de reacción a 2,8 - 3,2.

La relaxina madura se purificó utilizando resina de intercambio catiónico Tosoh Bioscience SP-5PW. La relaxina madura se cargó en la columna y a continuación, se realizaron tres lavados de columna; 1) acetato 50 mM pH 5,5, 2) acetato 50 mM pH 5,5, NaCl 0,1 M y 3) acetato 50 mM pH 4,0. La relaxina unida se eluyó a pH 4 usando un gradiente lineal de un 0 % a un 100 % de KCl 2 M en 20 volúmenes de columna. Se ajustó el pH de la solución de relaxina eluida a 3,0 usando HCl 1 M antes del procesamiento adicional. Como alternativa, la tripsina se eliminó de la mezcla de reacción mediante precipitación. La relaxina precipita después de aumentar el pH de la mezcla de reacción a 8,0 durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se recuperó la relaxina precipitada mediante centrifugación. El sedimento se lavó 3 veces resuspendiendo el sedimento en tampón Tris de pH 8 seguido de centrifugación. Tras el lavado final, el sedimento se resolubilizó en ácido acético 20 mM. La relaxina purificada no mostró ninguna actividad tríptica. El producto final fue la relaxina madura.

Esencialmente se usó el mismo método de síntesis para producir RLX-AQ1 ("AQ1") (Fig. 2) y RLX-BM25/AN1 ("BM25/AN1") (Fig. 3), con la modificación adecuada de la secuencia de preproRelaxina.

Ejemplo 3: Conjugación de relaxina con potenciador PK que comprende un péptido unido a un ácido graso

La relaxina purificada se concentró mediante ultrafiltración hasta aproximadamente 10 mg/ml. Se añadió potenciador PK activado por aminooxi que comprende un péptido y un ácido graso C15 (por ejemplo, GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH) a la mezcla de reacción en un exceso de 1,5 mol sobre la relaxina. A continuación, se añadió un aditivo de hidrazida (es decir, 4 aminobenzoichidrazida) en un exceso de 45 moles sobre la relaxina. La solución se ajustó según fuera necesario con HCl 1 M para mantener un pH entre 3,5 y 4,0 y la temperatura se controló a 30 °C. La reacción de conjugación formó un puente de oxima estable entre el enlazador peptídico unido a un ácido graso C15 (por ejemplo, GGGGS-GluY (S<e>Q ID NO: 139)-C14-COOH), tal como se preparó siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 4 y el resto de para-acetil-fenilalanina en relaxina. La reacción se completó en 16 horas.

La mezcla de reacción de conjugación se diluyó a < 4 mS/cm con tampón acetato 10 mM pH 4,0 y a continuación, se cargó en una columna de intercambio catiónico GE Healthcare SP<h>P. Una vez completada la carga, la columna se lavó con histidina 20 mM, pH 6,0 para eliminar impurezas. El conjugado de relaxina-C15 (que comprende, por ejemplo, AQ1-Relaxina-GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH) se eluyó a continuación, con bicarbonato de amonio 50 mM, pH 8,5. La estructura de la relaxina madura se ilustra esquemáticamente en la Fig. 5 y en la Fórmula III:

El conjugado de relaxina-C15 purificado se concentró y a continuación, se diafiltró en un tampón de formulación final adecuado. Una composición ilustrativa del conjugado es 8 mg/ml de conjugado de relaxina-C15 en histidina 20 mM, sacarosa 0,25 M, polisorbato-80 al 0,05 % (p/v), pH 5,5. La composición se almacena congelada a < -60 °C.

Se pueden preparar otros conjugados de relaxina-ácido graso usando procesos similares.

Ejemplo 4: Síntesis de la fase sólida de potenciadores PK

Los potenciadores PK divulgados en el presente documento se pueden preparar usando los procedimientos que se ejemplifican a continuación.

Las abreviaturas utilizadas en la presente solicitud, incluidas particularmente en los esquemas y ejemplos ilustrativos que siguen, son conocidos para los expertos en la materia. Algunas de las abreviaturas utilizadas son las siguientes: min para minutos; h para horas; ta para temperatura ambiente; sat. para saturado; TFA para ácido trifluoroacético; DMF para N,N-dimetilformamida; DCM para diclorometano; Fmoc para 9-fluorenilmetiloxicarbonilo; HATU = 3-óxido de hexafluorofosfato de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio; DIEA o DIPEA para diisopropiletilamina; NMP para N-metilpirrolidona; EDC para 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida; DMSO para dimetilsulfóxido; MeOH para metanol; EtOAc para acetato de etilo; Et3N para trietilamina; MeCN o ACN para acetonitrilo.

Datos analíticos:Espectrometría de Masas: "ESI-MS(+)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización realizada en modo ion positivo; "ESI-MS(-)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización realizada en modo ion negativo; "ESI-HRMS(+)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización de alta resolución realizada en modo ion positivo; "ESI-HRMS(-)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización de alta resolución realizada en modo ion negativo. Las masas detectadas se informan siguiendo las designación de unidades "m/z". Los compuestos con masas exactas superiores a 1000 a menudo se detectaban como iones de carga doble, de carga triple e/o iones de carga cuádruple. CAD: detector de aerosoles cargados. ELSD: detector de dispersión de luz por evaporación.

Análisis de LCMS Condición A:Columna: BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm, de UHPLC de Waters Acquity; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con TFA al 0,05 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con TFA al 0,05%; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100% de B durante 3 min, a continuación, una parada de 1,0 min al 100 % de B; Flujo: 1 ml/min; Detección: masa.

Análisis de LCMS Condición B:Columna: BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm, de UHPLC de Waters Acquity; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 min, a continuación, una parada de 1,0 min al 100 % de B; Flujo: 1,0 ml/min; Detección: masa.

Análisis de UHPLC-CAD Condición A:Columna: BEH Fenilo, 150 x 2,1 mm, partículas de 1,7 pm, de Waters; Fase móvil A: agua con TFA al 0,05 %, Fase móvil B: acetonitrilo con TFA al 0,05 %; Temperatura: 35 °C; Perfil de gradiente: 10 % de B a 35 % de B de 0 min a 15 min, 35 % de B a 95 % de B de 16 min a 25 min, a continuación, una parada de 1,0 min al 95 % de B; Tiempo posterior a la ejecución: 4 min (en las condiciones iniciales de la fase móvil); Caudal: 0,35 ml/min; Volumen de inyección: 3 pl de 2 mg/ml de muestra en DMSO; Detección: CAD en un intervalo de 100 PA y 0,241 Mpa (35 psi) de gas.

Análisis de UHPLC-CAD Condición B:Columna: BEH Fenilo, 150 x 2,1 mm, partículas de 1,7 pm, de Waters; Fase móvil A: agua con TFA al 0,05 %, Fase móvil B: acetonitrilo con TFA al 0,05 %; Temperatura: 35 °C; Perfil de gradiente: 10 % de B a 95 % de B de 0 min a 25 min, a continuación, una parada de 1,0 min al 95 % de B; Tiempo posterior a la ejecución: 4 min (en las condiciones iniciales de la fase móvil); Caudal: 0,35 ml/min; Volumen de inyección: 3 pl de 2 mg/ml de muestra en DMSO; Detección: CAD en un intervalo de 100 PA y 0,234 Mpa (34 psi) de gas.

Procedimientos generales:

Todas las manipulaciones se realizaron con automatización en un sintetizador de péptidos Prelude (Protein Technologies). Todos los procedimientos, salvo que se indique lo contrario, se realizaron en un recipiente de reacción de polipropileno de 40 ml equipado con una frita inferior. El tubo se conectó al sintetizador de péptidos Prelude a través de la parte inferior y de la parte superior del recipiente. Se puede añadir DMF a través de la parte superior e inferior del recipiente, que lava igualmente arriba y abajo los costados del recipiente. Los reactivos se añadieron solo a través del fondo del recipiente y pasaron a través de la frita para entrar en contacto con la resina. Todas las soluciones se retiraron a través del fondo del envase. "Agitación periódica" describe un breve pulso de gas N2 a través de la frita inferior; el pulso duró aproximadamente 5 segundos y se produjo cada 30 segundos. Las soluciones de aminoácidos generalmente no se usaron más de dos semanas después de la preparación. Las soluciones HATU se utilizaron dentro de las dos semanas de preparación. DMF = dimetilformamida; HATU = 3-óxido de hexafluorofosfato de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio; DIPEA = diisopropiletilamina; resina de cloruro de 2-clorotritilo = resina de cloruro de 2-clorotrifenilmetilo (Chem-Imprex, malla de 100 - 200, perlas amarillas, 1,1 meg/g). Los aminoácidos comunes utilizados se enumeran a continuación, con los grupos protectores de cadena lateral indicados entre paréntesis. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(O(Bu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp((Bu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser((Bu)-OH; Fmoc-Thr^Bu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr((Bu)-OH; Fmoc-Val-OH. Los siguientes derivados de ácidos grasos se utilizaron para la última etapa de acoplamiento, HO2C(CH2)nCH3, n = 10 -18 y HO2C(CH2)n(CO2(Bu), n = 10 -18.

El procedimiento general describe un experimento realizado en una escala de 0,4 mmol, donde la escala se determinó por la cantidad de (2-(aminooxi)etil)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo unido a la resina. Esta escala corresponde a aproximadamente 364 mg de la resina descrita anteriormente. Sin embargo, se utilizaron 800 mg de resina basándose en el supuesto de un 46%de eficiencia de carga. El exceso de cloruro de 2-clorotrifenilmetilo se inactivó con metanol al final de la reacción de carga. Todos los procedimientos se pueden escalar hacia abajo desde la escala de 0,400 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Antes del acoplamiento de aminoácidos, todas las secuencias de síntesis de péptidos comenzaron con un procedimiento de carga del enlazador y un procedimiento de hinchamiento de resina, descrito a continuación como "procedimiento de carga del enlazador" y "procedimiento de hinchamiento de resina". A continuación, el acoplamiento de aminoácidos a una amina primaria N-terminal utilizó el "procedimiento de acoplamiento de amina primaria" que se describe a continuación. El acoplamiento de aminoácidos a una amina secundaria N-terminal utilizó el "procedimiento de acoplamiento secundario" que se describe a continuación. La desprotección global y la escisión de las resinas utilizaron el "procedimiento de desprotección global" que se describe a continuación. Finalmente, la preparación de una solución transparente que contenía productos brutos para la purificación mediante LC-MS utilizó el "procedimiento de preparación de muestras" que se describe a continuación.

Procedimiento de carga del enlazador:Se usó la escala de 0,4 mmol para preparar seis recipientes de reacción (RR) con una carga de 0,4 mmol de (9H-fluoren-9-il)metil (2-(aminooxi)etil)carbamato para las resinas en cada RR. Se añadió DIEA (2,95 ml, 16,9 mmol) a una mezcla de clorhidrato de (9H-fluoren-9-il)metil (2-(aminooxi)etil)carbamato (compuesto4, 0,803 g, 2,4 mmol) en CH2Ch (72 ml) a 0 °C. Inmediatamente después de que se volviera homogéneo, se añadieron 12 ml de esta solución transparente a un vial de 30 ml que contenía 800 mg de resina de cloruro de 2-clorotritilo. Los 6 viales se colocaron en un agitador durante 75 minutos a 750 rpm. A continuación, se añadieron 0,2 ml de MeOH a un vial a la vez, cada uno se agitó durante 2 min a 750 rpm. Las resinas se transfirieron a un RR de 40 ml, se lavaron con CH2Ch (8 ml * 3), DMF (8 ml * 3), CH2Ch (10 ml * 3). Este proceso (inactivación con MeOH y lavados con CH2Cl2/DMF/CH2Ch) se aplicó a los otros 5 viales para ofrecer el compuesto5enlazador unido a resina en seis RR.

Procedimiento de hinchamiento de resina:Los RR que contenían las resinas de la etapa anterior se conectaron al sintetizador de péptidos Prelude y se lavaron (hincharon) tres veces de la siguiente manera: al RR se añadió DMF (10 ml), traws lo cual la mezcla se agitó periódicamente durante 10 min antes de drenar el disolvente a través de la frita.

Procedimiento de acoplamiento de amina primaria:

Al RR que contiene resina de la etapa previa se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 10,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 min y a continuación, la solución se drenó a través de la frita. Al RR se añadió de nuevo piperidina:DMF (20:80 v/v, 10,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 min y a continuación, la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó por el fondo una vez como sigue: se añadió DMF (10,0 ml) a través de la parte inferior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 2 min antes de drenar la solución a través de la frita. La resina se lavó por la parte superior sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, se añadió DMF (10,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 2 min antes de drenar la solución a través de la frita. Al RR se añadió un aminoácido o un ácido graso (0,2 M en DMF, 4,0 ml, 2 eq), HATU (0,2 M en DMF, 4,0 ml, 2 eq) y DIPEA (0,8 M en DMF, 2,0 ml, 4 eq) en ese orden. La mezcla se agitó periódicamente durante 15 min o 30 min, a continuación, la solución de la mezcla de reacción se drenó a través de la frita (el tiempo de reacción de 15 min se usó solo para la primera reacción de acoplamiento para formar el primer enlace de amida en el sintetizador Prelude; para todas las demás secuencias, se aplicó el tiempo de reacción de 30 min). La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: para cada lavado, se añadió DMF (8,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 2 min antes de drenar la solución a través de la frita. Al Rr se añadió DMF (3,3 ml), DIPEA (0,8 M en DMF, 1,5 ml, 3 eq). Después de agitar la mezcla durante 30 segundos, se añadió anhídrido acético (1,0 M en DMF, 5,0 ml, 12,5 eq). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 min, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó por el fondo una vez como sigue: se añadió DMF (10,0 ml) a través de la parte inferior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 2 min antes de drenar la solución a través de la frita. La resina se lavó por la parte superior sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, se añadió DMF (10,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 2 min antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria:

Al RR que contenía las resinas de la etapa previa se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 10,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 min y a continuación, la solución se drenó a través de la frita. Al RR se añadió de nuevo piperidina:DMF (20:80 v/v, 10,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 min y a continuación, la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó por el fondo una vez como sigue: se añadió DMF (10,0 ml) a través de la parte inferior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 2 min antes de drenar la solución a través de la frita. La resina se lavó por la parte superior sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, se añadió DMF (10,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 2 min antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió un aminoácido o un ácido graso (0,2 M en DMF, 4,0 ml, 2 eq), HATU (0,2 M en DMF, 4,0 ml, 2 eq) y DIPEA (0,8 M en DMF, 2,0 ml, 4 eq) en este orden. La mezcla se agitó periódicamente durante 30 min, a continuación, la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó por la parte superior sucesivamente tres veces como sigue: para cada lavado, se añadió DMF (8,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 2 min antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se le añadió de nuevo un aminoácido o un ácido graso (0,2 M en DMF, 4,0 ml, 2 eq), HATU (0,2 M en DMF, 4,0 ml, 2 eq) y DIPEA (0,8 M en DMF, 2,0 ml, 4 eq) en este orden. La mezcla se agitó periódicamente durante 30 min, a continuación, la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó por la parte superior sucesivamente tres veces como sigue: para cada lavado, se añadió DMF (8,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 2 min antes de drenar la solución a través de la frita. Al RR se añadió DMF (3,3 ml), DIPEA (0,8 M en DMF, 1,5 ml, 3 eq). Después de agitar la mezcla durante 30 segundos, se añadió anhídrido acético (1,0 M en DMF, 5,0 ml, 12,5 eq). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 min, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó por el fondo una vez como sigue: se añadió DMF (10,0 ml) a través de la parte inferior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 2 min antes de drenar la solución a través de la frita. La resina se lavó por la parte superior sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, se añadió DMF (10,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 2 min antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de desprotección global:

Una vez finalizado el procedimiento en el Prelude, cada RR se lavó con CH2Ch (8 ml * 6) y se dejó secar al aire. Una vez que la resina fluyó libremente, se transfirió a un vial de 30 ml y se añadieron 8 ml de la solución de escisión (véase más adelante). Después de agitar el vial en un agitador durante 75 minutos a 750 rpm, la mezcla de reacción se filtró. La solución color marrón transparente resultante se dividió en cuatro tubos de ensayo de 25 ml, conteniendo cada uno 16 ml de éter dietílico, dando como resultado la formación de suspensiones blancas. Se centrifugó cada uno; se lavaron dos veces con éter dietílico para formar sólidos blancos en cada uno de los tubos de ensayo. La solución de escisión (50 ml) se preparó como sigue: a un matraz Erlenmeyer de 250 ml se le añadieron 500 mg de ditiotreitol, 46 ml de TFA, 2,5 ml de agua y 1,0 ml de triisopropilsilano, con agitación para formar una solución transparente.

Procedimiento de preparación de muestras:

A cada tubo de ensayo se le añadió el producto bruto obtenido de la etapa anterior, en orden, 0,4 ml de DMSO y 0,4 ml de MeOH. Después de agitar durante 1 min, se formó una solución transparente en muchos casos. Sin embargo, si todavía había sólidos presentes en el tubo de ensayo, se añadía más DMSO (0,2 ml) y la mezcla se agitaba durante 2 min. En este punto, si quedaron sólidos, se eliminó la solución transparente y se añadió más DMSO (hasta 1,0 ml). La solución transparente resultante se sometió a LC-MS preparativa a 2,0 ml por inyección.

Síntesis del Compuesto A

compuestoAggggs-giuí-c i4-cooh

Se añadió DMAP (2,80 g, 23,0 mmol) a una mezcla de ácido pentadecanodioico (25,0 g, 92,0 mmol) en 2-Me-THF (250 ml). Después de agitar a ta durante 10 min, se añadió terc-butanol (13,2 ml, 138 mmol) y se continuó la agitación a ta durante 10 min. Después de que la suspensión resultante se calentara a 60 °C durante 10 min, se convirtió en una solución transparente e incolora. Se añadió una solución de anhídrido de BOC (26,0 g, 119 mmol) en THF (100 ml) durante 2 h en un embudo de adición con presión igualada a la mezcla de reacción anterior a 60 °C. Hacia el final de la adición, la mezcla de reacción se convirtió en una solución transparente de color rosa claro. La agitación continuó a 60 °C durante 18 h. Después de enfriar a 0 °C, se añadieron 100 ml de HCl 1,5 N durante 5 min. A continuación, la mezcla se calentó a ta y se agitó durante 15 min. Después de la separación, la capa orgánica se lavó con salmuera (250 ml x 2), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El material resultante se suspendió en acetonitrilo (250 ml), se agitó a ta durante 1 h y se filtró para eliminar el material de partida diácido que no había reaccionado. A continuación, el filtrado se concentró a aproximadamente 125 ml. La suspensión resultante se agitó a 0 °C durante 2 h, volviéndose más turbia con el tiempo. El sólido resultante se filtró, se lavó con acetonitrilo frío (0 °C) (2 x 15 ml) y se secó, ofreciendo ácido 15-(terc-butoxi)-15-oxopentadecanoico (compuesto1, 8,20 g, 25,0 mmol, 27,2% de rendimiento) en forma de sólido blanquecino. 1H RMN (400 MHz, CDCh, ppm) 82,35 (d,J= 7,58 Hz, 2H), 2,20 (t,J= 7,46 Hz, 2H), 1,68-1,54 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,34-1,24 (m, 18H). 13C RMN (125 MHz, CDCla, ppm) 8179,91, 173,44, 79,93, 35,64, 34,08, 29,57, 29,48, 29,46, 29,41,29,39, 29,29, 29,23, 29,09, 29,06, 28,12, 25,12, 24,70.

Los siguientes compuestos se prepararon de acuerdo con el procedimiento anterior, HO2C(CH2)nCO2fBu, n = 10 -18. La separación del producto deseado - mono éster HO2C(CH2)nCO2fBu del diácido HO2C(CH2)nCO2H sin reaccionar y diéster fBuO2C(cH2)nCO2fBu reaccionado exageradamente, se logró en cada caso utilizando sus diferentes solubilidades en acetonitrilo.

Se añadió hidróxido de potasio (74,1 g, 1122 mmol) en porciones durante 10 min a una solución transparente deterc-N-hidroxicarbamato de butilo (50,0 g, 376 mmol) en etanol anhidro (500 ml) a 0 °C, utilizando un agitador mecánico. Después de agitar a 0 °C durante 10 min y a continuación, a ta durante 20 min, la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y se añadió en porciones bromhidrato de 2-bromoetilamina (100 g, 488 mmol) durante 15 min. Después de agitar a 0 °C durante 30 min y a continuación, a ta durante 5 h, las suspensiones blancas resultantes se filtraron y la torta de filtración se lavó con EtOH (40 ml x 2). Los filtrados combinados se concentraron hasta un volumen de 100 ml, se extrajeron con t-BuOMe (500 ml) y H2O (250 ml). Después de la separación, la capa acuosa se extrajo con t-BuOMe (200 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (2 x 200 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron, concentraron y se secaron a alto vacío para ofrecer un líquido muy viscoso (20,0 g). El líquido resultante se disolvió en t-BuOMe (300 ml). Se añadió HCl (3 M en éter ciclopentilmetílico) (40 ml, 120 mmol) gota a gota a la solución transparente anterior a ta. Se formó una suspensión de color blanco. Después de la agitación a ta durante 4 h, los sólidos blancos resultantes se filtraron, se lavaron con t-BuOMe y se secaron al vacío durante 45 min para ofrecer clorhidrato 2-aminoetoxicarbamato de tere-butilo (compuesto2, 15,5 g, 72,9 mmol, 19,4 % de rendimiento) en forma de un sólido blanco. 1H RMN (400 MHz, DMSO-da, ppm) 510,21 (s a, 1H), 8,27 (s a, 2.6H), 3,92 (t,J= 5,26 Hz, 2H), 2,98 (t,J= 5,26 Hz, 2H), 1,41 (s, 9H). 13C RMN (125 MHz, DMSO-da, ppm) 5157,10, 80,79, 72,00, 37,46, 28,46.

Se añadió bicarbonato de sodio (8,00 g, 95 mmol) a una mezcla agitada de clorhidrato 2-aminoetoxicarbamato de terebutilo (compuesto2, 13,5 g, 63,5 mmol), Fmoc-OSu (25,7 g, 76,0 mmol) en THF (450 ml) y agua (150 ml). Después del agitado a ta durante una noche, todos los componentes volátiles se eliminaron al vacío. El resto se extrajo con EtOAc (400 ml, 200 ml) después de que se hubiera saturado la capa acuosa con NaCl sólido. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se sometió a cromatografía instantánea sobre gel de sílice, eluyendo con EtoAc/hexanos. Las fracciones más puras se combinaron, se concentraron y el residuo se volvió a purificar usando las condiciones anteriores. De nuevo, las fracciones más puras se combinaron y se concentraron. El resto se purificó una tercera vez usando condiciones idénticas. Las fracciones puras se combinaron, se concentraron y se secaron a alto vacío para ofrecer (compuesto3, 19,2 g, 48,2 mmol, 76 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCls, ppm) 57,78 (d,J =7,32 Hz, 2H), 7,65 (d,J=7,32 Hz, 2H), 7,63, (s, 1H), 7,42 (t,J= 7,32 Hz, 2H), 7,33 (t,J= 7,232 Hz, 2H), 6,00 (s a, 1H), 4,40 (d, 2H), 4,26 (t,J= 7,10 Hz, 1H), 3,91 (t,J= 4,20 Hz, 2H), 3,49-3,46 (m, 2H), 1,52 (s, 9H). 13C RMN (125 MHz, CDCls, ppm) 5 157,54, 156,90, 144,06, 141,32, 127,68, 127,08, 125,23, 119,96, 82,11,75,66, 66,91,47,30, 39,23, 28,24.

Se añadió HCl (100 ml, 400 mmol, 4 M en dioxano) a ta a una solución agitada del compuesto3(8,6 g, 21,6 mmol), 1,4-dimetoxibenceno (7,46 g, 54,0 mmol) en éter dietílico (100 ml). Después de agitar a ta durante una noche, la mezcla se convirtió en una suspensión espesa que apenas se podía agitar. Se añadió más éter (400 ml) y la suspensión resultante se agitó a ta durante 30 min. A continuación, se filtró en atmósfera de nitrógeno y los sólidos se lavaron con éter (3 x 100 ml) para ofrecer el compuesto4(6,36 g, 19,0 mmol, 87 % de rendimiento) en forma de un sólido blanco. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6, ppm) 511,10 (s, a, 2,60 H), 7,89 (d,J= 7,58 Hz, 2H), 7,70 (d,J= 7,34 Hz, 2H), 7,54 (t a,J= 5,5 Hz, 1H), 7,42 (t,J= 7,32 Hz, 2H), 7,34 (t,J= 7,32 Hz, 2H), 4,31 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 4,23 (t,J= 6,6 Hz, 1H), 4,06 (t,J= 5,38 Hz, 2H), 3,28 (c, J = 5,22 Hz). 13C RMN (125 MHz, DMSO-d6, ppm) 5 156,74, 144,32, 141,22, 128,11, 127,57, 125,64, 120,60, 73,50, 66,08, 47,17, 38,91.

GGGGS-GluT-C14-COOH

Compuesto A

El material en bruto se purificó por LC/MS preparativa usando las condiciones siguientes: Columna: CSH C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 ^m, de XBridge; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con ácido trifluoroacético al 01,%; Gradiente: 0-34,9 % de B durante 23 min, a continuación, una parada de 2 min al 100 % de B; Flujo: 20 ml/min. Se combinaron las fracciones que contenían el producto deseado y se eliminaron los compuestos orgánicos volátiles usando un flujo de nitrógeno. La solución acuosa resultante que contenía el producto deseado se enfrió a -78 °C bajo un flujo de nitrógeno y se liofilizó para ofrecer el compuesto A del título en forma de un sólido blanco (88 mg, 25,9 % de rendimiento, pureza LC-CAD de un 98,6 %). Condición del análisis A: Tiempo de retención = 1,24 min; ESI-MS (M+H)+ = 775,30.

Condición del análisis B: Tiempo de retención = 1,05 min; ESI-MS (M+H)+ = 775,25.

El material en bruto se purificó por LC/MS preparativa usando las condiciones siguientes: Columna: C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm, de XBridge; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Gradiente: 20-70 % de B durante 20 min, después una parada de 5 min al 100 % de B; Flujo: 20 ml/min. Se combinaron las fracciones que contenían el producto deseado y se eliminaron los compuestos orgánicos volátiles usando un flujo de nitrógeno. La solución acuosa resultante que contenía el producto deseado se enfrió a -78 °C bajo un flujo de nitrógeno y se liofilizó para ofrecer el compuesto del título en forma de un sólido blanco (47 mg, 3,4 % de rendimiento, pureza<l>C-CAD de un 72 %).

Condición del análisis A: Tiempo de retención = 1,14 min; ESI-MS (M+3H)+3 = 1166,90, (M+3H)+4 = 875,45.

Condición del análisis B: Tiempo de retención = 0,991 min; ESI-MS (M+3H)+3 = 1166,90, (M+3H)+4 = 875,50.

Ejemplo 5: Síntesis de la fase de solución de potenciadores PK

Los potenciadores PK divulgados en el presente documento se pueden preparar usando los procedimientos que se ejemplifican a continuación.

(2-(((terc-butoxicarbonil)amino)oxi)etil)carbamato de bencilo, 3.Se añadió DBU (26,3 ml, 174 mmol) en porciones a una mezcla agitada de (2-bromoetil)carbamato de bencilo (30 g, 116 mmol) y hidroxicarbamato de tere-butilo (24,76 g, 186 mmol) en THF (75 ml). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a ta (se observaron precipitados). La LCMS muestra que solo quedaron trazas de material de partida. La mezcla de reacción se concentró, se inactivó con agua, se extrajo con acetato de etilo. Las fase de acetato de etilo se combinó, se lavó con agua, salmuera, a continuación, se secaron con Na2SO4. Después de la concentración, se obtuvieron 45 g de producto bruto y se sometieron a separación cromatográfica (0-20% de acetona en hexano). Después de la separación, Se obtuvo (2-(((tere-butoxicarbonil)am¡no)ox¡)et¡l)carbamato de bencilo (32,9 g, 106 mmol, 91 % de rendimiento) en forma de un aceite amarillo claro muy viscoso. 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 57,43 - 7,30 (m, 5H), 5,75 (s a, 1H), 5,32 (s, 1H), 5,14 (s, 2H), 3,94-3,85 (m, 2H), 3,54-3,42 (m, 2H), 1,50 (s, 9H).

Clorhidrato (2-aminoetoxi)carbamato de terc-butilo, 4.Se disolvió (2-(((tercbutoxicarbonil)amino)oxi)etil)carbamato de bencilo (16,4 g, 52,8 mmol) en MeOH (161 ml) y se añadió cloroformo (5,33 ml, 66,1 mmol). La solución se purgó con nitrógeno antes de la cuidadosa adición de Pd/C (2,81 g, 2,64 mmol). A continuación, la solución se enfrió a 0 °C y se añadió lentamente trietilsilano (76 ml, 476 mmol) gota a gota. La evolución de H2 se observó durante la adición y fue exotérmica. Después de la adición, a continuación, la reacción se dejó calentar gradualmente a ta durante una noche. La mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de celita y se lavó con metanol adicional antes de evaporar al vacío. A continuación, el residuo se trituró con hexano y el sólido resultante se filtró, se lavó con hexano adicional y se dejó secar bajo succión para dar clorhidrato 2-aminoetoxicarbamato de ferc-butilo (10,2 g, 48,0 mmol, 91 % de rendimiento) en forma de un sólido rosado. 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 88,78 (s a, 1H), 8,31 (s a, 2H), 4,24 (s, 2H), 3,39 (s, 2H), 1,48 (s, 9H).

((3,6,9-trioxo-1-fenil-2-oxa-4,7,10-triazadodecano-12-il)oxi)carbamato de terc-butilo, 5.Se añadió N-metilmorfolina (5,17 ml, 47,0 mmol) gota a gota a una solución de clorhidrato 2-aminoetoxicarbamato de ferc-butilo (4 g, 18,81 mmol), ácido 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)acetamido)acético (5,01 g, 18,81 mmol) y HATU (7,87 g, 20,69 mmol) en DMF anhidra (75 ml). La mezcla se dejó en agitación a ta durante una noche. La reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con HCl 1 N. A continuación, la fase acuosa separada se extrajo con una porción adicional de acetato de etilo y a continuación, los orgánicos combinados se lavaron con HCl 1 N, salmuera, solución de bicarbonato sódico sat. seguido de un lavado adicional de salmuera. A continuación, la capa orgánica se secó (Na2SO4) y se concentró al vacío. A continuación, el producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna usando acetato de etilo-hexano como eluyente para dar 6,25 g (78 %) del compuesto del título. 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 87,69 (s, 1H), 7,41-7,28 (m, 6H), 7,00-6,87 (m, 1H), 5,81 (s a, 1H), 5,14 (s, 2H), 3,98 (dd,J= 16,7, 5.7 Hz, 4H), 3,86 (t,J= 4,8 Hz, 2H), 3,55-3,46 (m, 2H), 1,46 (s, 9H). MSm/e447,0 (M+Na+).

Clorhidrato (2-(2-(2-aminoacetamido)acetamido)etoxi)carbamato de terc-butilo, 6.La5(6,25 g, 14,72 mmol) se disolvió en metanol anhidro (58,9 ml) y se añadió cloroformo (1,782 ml, 22,09 mmol) seguido de Pd-C (1,567 g, 1,472 mmol). A continuación, se purgó el matraz de reacción con hidrógeno (globo) y se dejó agitar durante 6 h antes de filtrar a través de celita y evaporar para dar clorhidrato (2-(2-(2-aminoacetamido)acetamido)etoxi)carbamato de fercbutilo (4,87 g, 14,90 mmol, 101 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 10,00 (s a, 1H), 8,71 (t a, J = 5.7 Hz, 1H), 8,18-7,99 (m, 4H), 3,77 (d,J= 5,7 Hz, 2H), 3,69 (t,J= 5,9 Hz, 2H), 3,59 (s, 2H), 3,36 -3,23 (m, 3H), 1,41 (s, 9H).

2-(((benciloxi)carbonil)amino)-5-(((S)-3-hidroxi-1-metoxi-1-oxopropan-2 il)amino)-5-oxopentanoato de (S)-tercbutilo, 8.Se disolvieron ácido (S)-4-(((benciloxi)carbonil)amino)-5-(ferc-butoxi)-5-oxopentanoico (7, adquirido de ChemImpex) (15 g, 44,5 mmol) y clorhidrato de 2-amino-3-hidroxipropanoato de (S)-metilo (6,92 g, 44,5 mmol) en DMF (148 ml) y la solución se enfrió a 0 °C. Se añadió HATU (18,60 g, 48,9 mmol) seguido de N-metilmorfolina (12,22 ml, 111 mmol). La reacción se dejó en agitación a 0 °C en atmósfera de N2 durante 12 h. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc, se inactivó con HCl 1 N, a continuación, se lavó con NaHCO3 y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró al vacío. El producto bruto se purificó mediante purificación cromatográfica (0-40% de acetona/hexano) para dar 2-(((benciloxi)carbonil)amino)-5-(((S)-3-hidroxi-1-metoxi-1-oxopropan-2-il)amino)-5-oxopentanoato de (S)-ferc-butilo (16,31 g, 36,5 mmol, 82 % de rendimiento) en forma de sólido blanquecino. 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 87,37 (s, 5H), 6,5 (s a, 1H), 5,53 (m, 1H); 5,1 (s, 2H), 4,7 (m, 1H), 4,28 (m, 1H), 4,1 (s a, 1H), 3,95 (m, 1H), 3,8 (s, 3H), 2,4 (m, 2H), 2,3 (M, 1H), 1,7 (m, 1H), 1,5 (s, 9H); MSm/e439,2 (M+H+).

Ácido (S)-2-((S)-4-(((benciloxi)carbonil)amino)-5-(terc-butoxi)-5-oxopentanamido)-3-hidroxipropanoico, 9.Se disolvió 2-(((benciloxi)carbonil)amino)-5-(((S)-3-hidroxi-1-metoxi-1-oxopropan-2-il)amino)-5-oxopentanoato de (S)-ferc-butilo (14 g, 31,9 mmol) en THF (106 ml) y agua (53,2 ml) y se enfrió a 0 °C. Después de agitar durante 30 minutos, se añadió LiOH (0,688 g, 28,7 mmol). La mezcla de reacción se agitó a esta temperatura en atmósfera de N2. Después de que se completara la reacción, el pH de la mezcla de reacción se ajustó a ~4 a 0 °C. La mezcla de reacción se extrajo con EtOAc (3 x 150 ml). La fase orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró en vapor rot para dar ácido (S)-2-((S)-4-(((benciloxi)carbonil)amino)-5-(ferc-butoxi)-5-oxopentanamido)-3-hidroxipropanoico (13,01 g, 30,7 mmol, 96 % de rendimiento) en forma de sólido blanquecino. MSm/e425,0 (M+H+).

5-(ferc-butoxicarbonil)-10-(hidroximetil)-3,8,11,14-tetraoxo-1-fenil-2-oxa-4,9,12,15-tetraazaheptadecan-17-oato de (5S,10S)-metilo, 10. Se disolvió clorhidrato de 2-(2-aminoacetamido)acetato de metilo (5 g, 27,4 mmol) en DMF (116 ml) y se cargó ácido (S)-2-((S)-4-(((benciloxi)carbonil)amino) -5-(fercácido -butoxi)-5-oxopentanamido)-3-hidroxipropanoico (11,62 g, 27,4 mmol). A esta mezcla de reacción se añadió HATU (11,45 g, 30,1 mmol) y N-metilmorfolina (7,53 ml, 68,5 mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta en atmósfera de N2 durante 12 h. LC/M<s>y HPLC indicaron la finalización de la reacción. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (150 ml) y se inactivó con HCl 1 N. La capa orgánica se separó y se lavó con salmuera (50 ml), NaHCOaac (50ml) y finalmente salmuera (3x50ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se evaporó al vacío para dar el producto deseado en forma de aceite espeso, que fue para purificación cromatográfica (0-10 % MeOH/DCM) para dar el producto deseado 5-(fe/'c-butoxicarboml)-10-(hidrox¡met¡l)-3,8,11,14-tetraoxo-1-feml-2-oxa-4,9,12,15-tetraazaheptadecan-17-oato de (5S,10S)-metilo (14 g, 25,3 mmol, 93 % de rendimiento) en forma de aceite espeso. 1H RMN (CDCI3, 400 MHz) 57,38 (s, 5H), 5,1 (m, 2H), 4,0 (m, 6H), 3,7 (s, 3H), 2,4 (m, 2H), 2,2 (M, 1H), 1,9 (m, 1H), 1,45 (s, 9H); MS m/e 553,2 (M+H+).

Ácido (5S,10S)-5-(ferc-butox¡carbon¡I)-10-(h¡drox¡met¡I)-3,8,11,14-tetraoxo-1-fen¡I-2-oxa-4,9,12,15-tetraazaheptadecan-17-oico, 11. Se disolvió 5-(ferc-butox¡carbon¡I)-10-(h¡drox¡met¡I)-3,8,11,14-tetraoxo-1-fen¡I-2-oxa-4,9,12,15-tetraazaheptadecan-17-oato de (5S,10S)-metilo (5S,10S)-metilo (20 g, 36,2 mmol) en THF (193 ml) y agua (97 ml) y se enfrió a 0 °C. Después de agitar durante 30 minutos, se añadió LiOH (0,780 g, 32,6 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 0 °C en atmósfera de N2 durante 5 h. El progreso de la reacción se controló mediante LC/MS y HPLC. Después de que se completara la reacción, se diluyó con EtOAC (150 ml) y se neutralizó mediante HCl 1 N. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3x50 ml), se secó sobre Na2SO4 anhidro, se concentró al vacío y se secó a alto vacío durante 12 h para dar el producto deseado en forma de un sólido blanquecino (18 g, 96 % de rendimiento). MS m/e 539,1 (M+H+).

12 13

Ácido 15-(terc-butoxi)-15-oxopentadecanoico, 13.Se calentó una suspensión de ácido pentadecanodioico (20,2 g, 70,5 mmol) en anhídrido acético (70 ml) a 128 °C en una atmósfera de Ar. La solución resultante se agitó a esta temperatura durante 6,0 h y a continuación, se enfrió hasta temperatura ambiente. La solución se diluyó con tolueno (100 ml) y se evaporó. El residuo se eliminó con tolueno (4 x 80 ml) y se secó al vacío durante 6,5 h para dar 27,53 g de un sólido blanquecino. A una mezcla del sólido anterior (27,53 g) y t-butanol (235 ml), a temperatura ambiente y en atmósfera de Ar, se añadió 4-dimetilaminopiridina (34,8 g, 282 mmol) en tres porciones durante un período de 15 min. La mezcla se calentó a 50 °C y la solución resultante se agitó a esta temperatura durante 34,0 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con tolueno (50 ml) y se evaporó. El residuo se extrajo con tolueno (2 x 100 ml) y a continuación, se recogió en éter/CH2Cl29/1 (600 ml). La solución se lavó con HCl 1 M (400 ml), Hcl 0,5 M(400 ml), agua (300 ml) y salmuera (300 ml). La capa orgánica se secó (Na2SO4) y se evaporó. El bruto se recogió en CH2Cl2 (50 ml) y se sonicó. La suspensión resultante se filtró a través de un embudo de fritado mediano y el sólido se enjuagó en el embudo con dos pequeñas porciones de CH2Cl2. El filtrado y los enjuagues se combinaron y se evaporaron. El concentrado se sometió a cromatografía (cartucho de columna instantánea de 120 g, CH2Cl2 a C ^C h /i-PrOH 9/1) para dar, en orden de elución:

- una mezcla ~5/1 (7,19 g, aceite incoloro) de di-ferc-butil pentadecanodioato y ácido 15-(ferc-butoxi)-15-oxopentadecanoico.

- ácido 15-(ferc-butoxi)-15-oxopentadecanoico (4,38 g, 19 % de rendimiento) en forma de sólido blanco: LC/MS [M-H]-1 = 327; 1H RMN (400 MHz, CDCls) 52,37 (t,J =7,4 Hz, 2H), 2,22 (t,J= 7,5 Hz, 2H), 1,63 (m, 4H), 1,47 (s, 9H), 1,28 (m, 18H).

- una mezcla ~4/1 (4,42 g, sólido blanquecino) de ácido 15-(ferc-butoxi)-15-oxopentadecanoico y ácido pentadecanodioico.

La mezcla de di y mono ferc-butil ésteres (7,19 g) se separó mediante cromatografía (cartucho de columna instantánea de 120 g, CH2Cl2 a CH2Cl2/i-PrOH 9/1) para ofrecer una cantidad adicional de ácido 15-(ferc-butoxi)-15-oxopentadecanoico (0,8 g, 4 % de rendimiento) en forma de sólido blanco.

La mezcla de mono éster ferc-butílico y diácido (4,42 g) se separó mediante cromatografía (cartucho de columna ultrarrápida de 330 g, Hex a Hex/acetona 4/1) para ofrecer una cantidad adicional de ácido 15-(ferc-butoxi)-15-oxopentadecanoico (2,92 g, 13 % de rendimiento) en forma de un sólido blanco.

La cantidad total aislada de ácido 15-(ferc-butoxi)-15-oxopentadecanoico fue 8,1 g (36 % de rendimiento).

N2-((benciloxi)carbonil)-N5-((S)-1-((2-((2-((2-((2,2-dimetil-4,10-dioxo-3,6- dioxa-5,9-diazaundecan-11-il)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)amino)-3-hidroxi-1-oxopropan-2-il)-L -glutaminato de íerc-butilo, 14.Se disolvieron clorhidrato de 2-(2-(2-aminoacetamido)acetamido)etoxicarbamato de ferc-butilo (3,73 g, 11,41 mmol) y ácido (5S,10S)-5-(ferc-butoxicarbonil)-10-(hidroximetil)-3,8,11,14-tetraoxo-1-fenil-2-oxa-4,9,12,15-tetraazaheptadecan-17-oico (5,85 g, 10,87 mmol) en DMF (36,2 ml) a ta en una atmósfera de nitrógeno. La solución se enfrió a 0 °C antes de añadir HATU (4,55 g, 11,96 mmol) seguido de la adición de N-metilmorfolina (2,99 ml, 27,2 mmol) gota a gota. La reacción se dejó calentar a ta durante una noche. La reacción se enfrió a 0 °C antes de inactivarse con agua helada y se agitó vigorosamente mientras el hielo se derretía. Cuando todo el hielo que rodeaba el matraz se hubo derretido, se había formado un precipitado que a continuación, se filtró con succión durante la noche (lento). El sólido ceroso resultante se disolvió en metanol (200 ml) antes de que se evaporara. El tratamiento con metanol (aproximadamente 20 ml) seguido de la adición de éter dietílico a continuación, precipitó el producto que se recogió por succión para dar 6,4 g de 28-(((benciloxi)carbonil)amino)-23-(hidroximetil)-2,2-dimetil-4,10,13,16,19,22,25-heptaoxo-3,6-dioxa-5,9,12,15,18,21,24-heptaazanonacosan-29-oato de (23S,28S)-ferc-butilo (73% de rendimiento).

1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 89,96 (s a, 1H), 8,24 - 8,01 (m, 5H), 7,87 (t a, J = 5,6 Hz, 1H), 7,62 (d a, J = 7,8 Hz, 1H), 7,40 - 7,30 (m, 5H), 5,10 -4,96 (m, 3H), 4,30 -4,24 (m, 1H), 4,10 (c, J = 5,3 Hz, 3H), 3,93 - 3,84 (m, 1H), 3,80 -3,53 (m, 13H), 3,31 -3,23 (m, 2H), 3,17 (d,J= 5,3 Hz, 7H), 2,90 (s, 1H), 2,75 -2,67 (m, 1H), 2,35 -2,20 (m, 2H), 1,98 - 1,86 (m, 1H), 1,82 -1,71 (m, 1H), 1,42-1,24 (m, 20H). MS m/e 811,4 (M+H+).

N5-((S)-1-((2-((2-((2-((2,2-dimetil-4,10-dioxo-3,6-dioxa-5,9-diazaundecan-11 (il)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)amino)-3-hidroxi-1-oxopropan-2-il)-L-glutaminato de íerc-butilo, 15.Se añadió metanol (158 ml) en una porción a 28-(((benciloxi)carbonil)amino)-23-(hidroximetil)-2,2-dimetil-4,10,13,16,19,22,25-heptaoxo-3.6- dioxa-5,9,12,15,18,21,24-heptaazanonacosan-29-oato de (23S,28S)-ferc-butilo (6,4 g, 7,89 mmol) y se dejó agitar el sólido en atmósfera de nitrógeno hasta que la amina se disolvió (aproximadamente 3 h). A continuación, se añadió Pd/C (0,840 g, 0,789 mmol) y a continuación, se introdujo una atmósfera de hidrógeno mediante un globo. La reacción se dejó agitar a ta antes de filtrar a través de papel de filtro de vidrio y evaporar el filtrado para dar 4,8 g de 28-amino-23-(hidroximetil)-2,2-dimetil-4,10,13,16,19,22,25-heptaoxo-3,6-dioxa-5,9,12,15,18,21,24-heptaazanonacosan-29-oato de (23S,28S)-ferc-butilo (90 % de rendimiento) en forma de sólido crujiente blanquecino.

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 89,96 (s a, 1H), 8,29 -8,19 (m, 1H), 8,17 -7,96 (m, 3H), 7,87 (t a, J = 5,7 Hz, 1H), 5,00 (s a, 1H), 4,28 - 4,08 (m, 1H), 3,78 - 3,56 (m, 10H), 3,30 - 3,14 (m, 3H), 2,90 (s, 1H), 2,75 - 2,67 (m, 1H), 2,34 - 2,06 (m, 3H), 1,87 - 1,74 (m, 1H), 1,68 - 1,50 (m, 1H), 1,41 (d,J= 4,3 Hz, 15H), 1,10 (s, 1H).

(23S,28S)-28-(íerc-butoxicarbonil)-23-(hidroximetil)-2,2-dimetil-4,10,13,16,19,22,25,30-octaoxo-3,6-dioxa-5,9,12,15,18,21,24,29-octaazatetratracontan-44-oato de íerc-butilo, 16.

Se añadió N-metilmorfolina (1,950 ml, 17,73 mmol) gota a gota a una solución parcial de 28-amino-23-(hidroximetil)-2,2-dimetil-4,10,13,16,19,22,25-heptaoxo-3,6-dioxa-5,9,12,15,18,21,24-heptaazanonacosan-29-oato de (23S,28S)-ferc-butilo (4,8 g, 7,09 mmol), ácido 15-(ferc-butoxi)-15-oxopentadecanoico (2,446 g, 7,45 mmol) y HATU (2,97 g, 7,80 mmol) a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno. Se añadieron 20 ml adicionales de DMF para solubilizar la mezcla de reacción que a continuación, se dejó calentar lentamente a ta durante la noche. A continuación, se enfrió la reacción en una tanda de hielo antes de la inactivación con hielo y dejar que se fundiera mientras se agitaba vigorosamente la mezcla. A continuación, se filtró el sólido para dar un sólido gomoso (6,1 g) que se transfirió a SFC para su purificación. La purificación de SFC produjo 28-(ferc-butoxicarbonil)-23-(hidroximetil)-2,2-dimetil-4,10,13,16,19,22,25,30-octaoxo-3.6- dioxa-5,9,12,15,18,21,24,29-octaazatetratracontan-44-oato de (23S,28S)-ferc-butilo (2,5 g, 2,53 mmol, 35,7 % de rendimiento) en forma de sólido blanco que se usó en la siguiente etapa. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 89,96 (s a, 1H), 8,23 - 8,02 (m, 1H), 7,97 (d a, J = 7,5 Hz, 1H), 7,84 (t,J= 5,8 Hz, 1H), 4,96 (t,J= 5,6 Hz, 1H), 4,32 - 4,21 (m, 1H), 4,17 - 4,03 (m, 1H), 3,85 (d,J= 6,0 Hz, 1H), 3,76 (d a, J = 5,1 Hz, 1H), 3,72 - 3,55 (m, 1H), 3,30 - 3,24 (m, 1H), 2,27 - 2,07 (m, 1H), 2,01 -1,86 (m, 1H), 1,80 - 1,65 (m, 1H), 1,49 - 1,38 (m, 5H), 1,35 (s a, 1H), 1,29-116 (m, 4H). MSm/e987,7 (M+H+).

Ácido (17S,22S)-1-(aminooxi)-22-carboxM7-(hidroximetM)-4,7,10,13,16,19,24-heptaoxo-3,S,9,12,15,18,23-heptaazaoctatriacontan-38-oico, compuesto A.Se disolvió 28-(terc-butoxicarbonil)-23-(hidroximetil)-2,2-dimetil-4,10,13,16,19,22,25,30-octaoxo-3,6-dioxa-5,9,12,15,18,21,24,29-octaazatetratracontan-44-oato de (23S,28S)-tercbutilo (2,5 g, 2,53 mmol) en 25 ml 10 ml de una mezcla de lavado de TFA:TIPS 92:8 enfriado. La solución se añadió directamente al sólido blanco y se dejó agitar a ta durante 3 h. La solución se enfrió a 0 °C y se añadieron 320 ml de heptano: 40 ml de MTBE añadidos antes de la transferencia al refrigerador durante la noche. Se había separado un aceite claro que era visible en el fondo del matraz. Se eliminó el sobrenadante y se añadió éter dietílico frío (1 litro). El sólido blanco resultante se agitó durante 2 h antes de filtrarlo y secarlo rápidamente en un embudo Buchner para dar 2,1 g de Ácido (17S,22S)-1-(aminooxi)-22-carboxi-17-(hidroximetil)-4,7,10,13,16,19,24-heptaoxo-3,6,9,12,15,18,23-heptaazaoctatriacontan-38-oico (95 % de rendimiento).1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 88,42 - 8,34 (m, 1H), 8,20 - 7,95 (m, 3H), 4,81 - 4,74 (m, 1H), 4,61 (dd,J= 10,9, 4,6 Hz, 1H), 4,48 (dd,J= 10,8, 7,5 Hz, 1H), 4,30 - 4,03 (m, 1H), 3,93 -3,30 (m, 10H), 2,47 -2,39 (m, 1H), 2,33 (dt, J = 3,7, 1,9 Hz, 1H), 2,27 -2,08 (m, 3H), 2,05 -1,91 (m, 1H), 1,82 -1,69 (m, 1H), 1,52 - 1,43 (m, 2H), 1,24 (s, 9H), 1,21 - 1,00 (m, 1H). El análisis de HPLC con detección CAD indicó una pureza de un 81 %, Agilent 1100 LC/UV/CAD, ACE C18-300 300 X 4,6 mm de DI, 5 pm, A: Agua TFA al 0,05 %; B: ACN TFA al 0,05 %.

Ejemplo 6: Síntesis de la fase de solución de potenciadores PK adicionales

Análisis de LCMS Condición A:Columna: BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm, de UHPLC de Waters Acquity; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con TFA al 0,05 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con TFA al 0,05%; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100% de B durante 3 min, a continuación, una parada de 1,0 min al 100 % de B; Flujo: 1 ml/min; Detección: masa.

Análisis de LCMS Condición B:Columna: BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm, de UHPLC de Waters Acquity; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 min, a continuación, una parada de 1,0 min al 100 % de B; Flujo: 1,0 ml/min; Detección: masa.

Análisis de UHPLC-ELSD Condición A: Condiciones de HPLC:Columna: BEH C18, 150 x 2,1 mm, partículas de 1.7 pm, de Waters; Fase móvil A: agua con TFA al 0,05 %, Fase móvil B: acetonitrilo con TFA al 0,05 %; Temperatura: 35 °C; Perfil de gradiente: 10 % de B a 50 % de B de 0 min a 15 min, 50 % de B a 60 % de B de 16 min a 20 min, 60 % B a 95 % B de 21 min a 26 min y a continuación, una parada de 4,0 min al 95 % de B; Tiempo posterior a la ejecución: 4 min (en las condiciones iniciales de la fase móvil); Caudal: 0,35 ml/min; Volumen de inyección: 5 pl de muestra de 1 mg/ml en MeCN/agua 50/50;Condiciones de MS:Intervalo de masa m/z 120 - 2000. Ionización y modo: Ionización por electronebulización, modo de ion positivo.Condiciones de ELSD:Aumento: 20. Temperatura del tubo de deriva: 60 °C. Caudal de gas: 0,276 MPa (40 psi).

Análisis de UHPLC-ELSD Condición B: Condiciones de HPLC:Columna: CSH C18, 150 x 2,1 mm, partículas de 1.7 pm, de BEH de Waters; Fase móvil A: agua con TFA al 0,05 %, Fase móvil B: acetonitrilo con TFA al 0,05 %; Temperatura: 35 °C; Perfil de gradiente: 10 % de B a 95 % de B de 0 min a 24 min, a continuación, una parada de 3,0 min al 95 % de B; Tiempo posterior a la ejecución: 4 min (en las condiciones iniciales de la fase móvil); Caudal: 0,35 ml/min; Volumen de inyección: 2 pl de muestra de 1 mg/ml en MeCN/agua 50/50;Condiciones de MS:Intervalo de masa m/z 120 - 2000. Ionización y modo: Ionización por electronebulización, modo de ion positivo.Condiciones de ELSD:Aumento: 50. Temperatura del tubo de deriva: 60 °C. Caudal de gas: 0,276 MPa (40 psi)

Análisis de UHPLC-CAD Condición C: Condiciones de HPLC:Columna: BEH Fenilo, 150 x 2,1 mm, partículas de 1.7 pm, de Waters; Fase móvil A: agua con TFA al 0,05 %, Fase móvil B: acetonitrilo con TFA al 0,05 %; Temperatura: 35 °C; Perfil de gradiente: 10 % de B a 95 % de B de 0 min a 25 min, a continuación, una parada de 2,0 min al 95 % de B; Tiempo posterior a la ejecución: 4 min (en las condiciones iniciales de la fase móvil); Caudal: 0,35 ml/min; Volumen de inyección: 5 pl de 1 mg/ml de muestra en MeOH;Condiciones de MS:Intervalo de masa m/z 120 - 2000. Ionización y modo: Ionización por electronebulización, modo de ion positivo.Condiciones de CAD:Intervalo: 100 PA. Caudal de gas: 0,241 MPa (35 psi).

Análisis de UHPLC-CAD Condición D: Condiciones de HPLC:Columna: BEH Fenilo, 150 x 2,1 mm, partículas de 1.7 pm, de Waters; Fase móvil A: agua con TFA al 0,05 %, Fase móvil B: acetonitrilo con TFA al 0,05 %; Temperatura: 35 °C; Perfil de gradiente: 10 % de B a 35 % de B de 0 min a 15 min, 35 % de B a 95 % de B de 16 min a 25 min, a continuación, una parada de 2,0 min al 95 % de B; Tiempo posterior a la ejecución: 3 min (en las condiciones iniciales de la fase móvil); Caudal: 0,35 ml/min; Volumen de inyección: 2 pl de muestra de 1 mg/ml en MeOH/agua 50/50;

Condiciones de MS:Intervalo de masa m/z 120 - 2000. Ionización y modo: Ionización por electronebulización, modo de ion positivo.Condiciones de CAD:Intervalo: 100 PA. Caudal de gas: 0,241 MPa (35 psi)

Síntesis de PEGas-GluV-Cia-CHa (8).

Tetradecanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (1).Se añadió DCC en CH2CI2 (1M, 99 ml, 99 mmol) a una solución agitada de ácido tetradecanoico (20,55 g, 90 mmol) en DMF (100 ml). La mezcla se agitó a TA durante una noche, se filtró, se concentró y se secó a alto vacío. Los sólidos resultantes se suspendieron en éter/hexanos (1:3, 80 ml) durante 45 min, se recogió por filtración y se secó para ofrecer tetradecanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (1) (16,96 g, 52,1 mmol, 58 % de rendimiento) en forma de sólido blanco, que se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.

Ácido (S)-5-(ferc-butoxi)-5-oxo-4-tetradecanamidopentanoico (2).Se añadió agua (150 ml) a una mezcla agitada de ácido (S)-4-amino-5-(ferc-butoxi)-5-oxopentanoico (10,5 g, 51,7 mmol), tetradecanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (1) (16,81 g, 51,7 mmol) y NaHCO3 (5,21 g, 62,0 mmol) en DME (450 ml). La solución transparente resultante se agitó a TA durante 4 h. Se eliminó el DME al vacío y a continuación, el HCl acuoso (1 M, 67,2 ml, 67,2 mmol) se añadió para ajustar el pH a 2-3. La suspensión resultante se agitó a 0 °C durante 30 min y a continuación, se filtró. El sólido blanco resultante se secó azeotrópicamente con DME (2x), a continuación, se suspendió en éter/hexanos 1:3 (160 ml) a TA durante 1 h. El sólido blanco resultante se recogió mediante filtración y se secó a alto vacío para ofrecer ácido (S)-5-(terc-butoxi)-5-oxo-4-tetradecanamidopentanoico (2) (8,5 g, 21 mmol, 40 % de rendimiento), que se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.

2-tetradecanamidopentanodioato de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de (S)-l-íerc-butMo (3).Se añadió DCC en CH2Ch (1M, 26,6 ml, 26,6 mmol) a una mezcla agitada de ácido (S)-5-(terc-butoxi)-5-oxo-4-tetradecanamidopentanoico (2) (10,0 g, 24,2 mmol) y 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (3,06 g, 26,6 mmol) en Dm F (30 ml) a TA. La mezcla de reacción se agitó a TA durante una noche, se filtró y se concentró. El residuo se disolvió en CH2Ch y se purificó mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc/hexanos (1:2) para ofrecer 2-tetradecanamidopentanodioato de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de (S)-1-terc-butilo (3) (8,95 g, 17,5 mmol, 73% de rendimiento) en forma de sólido blanco. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 86,29 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 4,58 (m, 1H), 2,82 (s, 4H), 2,70 (m, 1H), 2,63 (m, 1H), 2,29 (m, 1H), 2,20 (t,J= 7,5 Hz, 2H), 2,06 (m, 1H), 1,60 (m, 2H), 1,46 (s, 9H), 1,25 (m, 20H), 0,86 (t, J = 6,3 Hz, 3H). 13C RMN (CDCla, 100 MHz) 8 173,0, 170,3, 168,7, 167,6, 82,4, 51,2, 36,0, 31,5, 29,29. 29,27, 29,25, 29,11, 28,97, 28,92, 27,6, 27,15, 27,10, 25,21,25,11, 22,3, 13,7.

Compuesto 5.Se añadió agua (4,5 ml) a TA a una mezcla agitada del compuesto4(750 mg, 0,448 mmol), 2-tetradecanamidopentanodioato de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de (S)-1-terc-butilo3(297 mg, 0,582 mmol) y NaHCO3 (75 mg, 0,90 mmol) en DME (13,5 ml). Después de que la solución transparente resultante se agitara a Ta durante una noche, se añadió HCl acuoso (1M, 0,896 ml, 0,896 mmol) y la mezcla se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de fase inversa de presión media en una columna C-18, eluyendo con MeCN/NH4OAc ac (controlado por ELSD-MS). Se combinaron las fracciones que contenían el producto deseado y se eliminaron los compuestos orgánicos volátiles usando un flujo de nitrógeno. La solución acuosa resultante que contenía el producto deseado se liofilizó para ofrecer el compuesto5del título (610 mg, 66 % de rendimiento) en forma de sólido blanco. (M+2H)2+ 1036, (M+3H)3+ 691.

Compuesto 6.Se añadió DCC en CH2Ch (1M, 0,32 ml, 0,32 mmol) a una mezcla agitada del compuesto5(550 mg, 0,266 mmol) y 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (36,7 mg, 0,319 mmol) en CH2Ch (12ml). La mezcla se agitó a TA durante una noche, se filtró y se concentró al vacío para ofrecer el compuesto6en forma de un sólido blanco, que se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.

Compuesto 7.Se añadió agua (2,5 ml) a una mezcla agitada del compuesto6(577 mg, 0,266 mmol), 2-aminoetoxicarbamato de terc-butilo (Miao, Z.; Liu, J.; Norman, T.; Driver, R. w O 2006/069246) (70,3 mg, 0,399 mmol) y NaHCO3 (33,5 mg, 0,40 mmol) en DME (7,5 ml) a TA. La mezcla se agitó a TA durante una noche y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía de fase inversa de presión media en una columna C-18, eluyendo con MeCN/NH4Cl ac (controlado por ELSD-MS). Se combinaron las fracciones que contenían el producto deseado y se eliminaron los compuestos orgánicos volátiles usando un flujo de nitrógeno. La solución acuosa resultante que contenía el producto deseado se liofilizó para ofrecer el compuesto7del título (360 mg, 61 % de rendimiento) en forma de sólido blanco. (M+2H)2+ 1115, (M+3H)3+ 743.

Compuesto 8.Se añadió TFA (2 ml) a una mezcla agitada del compuesto7(274 mg, 0,123 mmol), 1,4-dimetoxibenceno (155 mg, 1,12 mmol) en CH2Ch (2 ml) a TA. La mezcla se agitó durante 4 h y después se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía de fase inversa de presión media en una columna C-18, eluyendo con MeCN/NH4Cl ac (controlado por ELSD-MS). Se combinaron las fracciones que contenían el producto deseado y se eliminaron los compuestos orgánicos volátiles usando un flujo de nitrógeno. La solución acuosa resultante que contenía el producto deseado se liofilizó para ofrecer el compuesto8del título (228 mg, 84 % de rendimiento) en forma de sólido blanco. Se determinó que su pureza de UHPLC-ELSD fue de un 93,3 % utilizando el Análisis de UHPLC-ELSD Condición A. (M+2H)2+ 1037, (M+3H)3+ 691.

Síntesis de PEG36-GluY-C13-CO2H (16).

Ácido 14-(terc-butoxi)-14-oxotetradecanoico (9).Se cargó un matraz de fondo redondo secado a la llama de 1 l con ácido tetradecanodioico (21 g, 81 mmol), DMAP (9,93 g, 81 mmol) y tolueno (300 ml). Después de que la mezcla se agitase a TA durante 15min, se añadieron 2-metilpropan-2-ol (11,7ml, 122mmol) y dicarbonato de di-ferc-butilo (26,6 g, 122 mmol). La mezcla resultante se agitó a TA durante 30 min y a continuación, se calentó a 116 °C durante 15 h. La mezcla se concentró y el residuo se sometió a cromatografía instantánea sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc/hexanos (1:2) que contenía HOAc al 1 %, para ofrecer ácido 14-(terc-butoxi)-14-oxotetradecanoico (9) (9,0 g, 29 mmol, 35 % de rendimiento). El material era aproximadamente un 80 % puro según 1H RMN (la impureza principal fue el di-terc-butil éster) y se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.

14-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) tetradecanodioato de 1-ferc-butilo (10).Se añadió DCC en CH2Cl2 (1M, 59,6 ml, 59,6 mmol) a una solución agitada de ácido 14-(terc-butoxi)-14-oxotetradecanoico (9) (12,5 g, 39,8 mmol) y 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (6,86 g, 59,6 mmol) en CH2Cl2 (200 ml). La mezcla se agitó a TA durante una noche, se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía instantánea sobre gel de sílice, eluyendo con CH2Cl2 para ofrecer 14-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) tetradecanodioato de 1-ferc-butilo (10) (6,2 g, 15 mmol, 38 % de rendimiento) en forma de sólido blanco. 1H RMN (CDCh, 400 MHz) 62,84 (s a, 4H), 2,60 (t,J= 7,2 Hz, 2H), 2,20 (t,J= 7,5 Hz, 2H), 1,74 (m, 2H), 1,57 (m, 2H), 1,44 (s, 9H), 1,40 (m, 2H), 1,26 (m, 14H). 13C RMN (CDCh, 100 MHz) d 173,4, 169,2, 168,7, 79,9, 35,6, 31,0, 29,54, 29,51,29,47, 29,34, 29,31,29,09, 28,8, 28,1,25,6, 25,1.

Ácido (S)-5-(terc-Butoxi)-4-(14-(terc-butoxi)-14-oxotetradecanamido)-5-oxopentanoico (11).Se añadió agua (40 ml) a una mezcla agitada de ácido (S)-4-amino-5-(ferc-butoxi)-5-oxopentanoico (1,600 g, 7,87 mmol), 14-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) tetradecanodioato de 1-ferc-butilo (10) (3,6 g, 7,87 mmol) y NaHCO3 (0,794 g, 9,45 mmol) en DME (120 ml). La solución resultante se agitó a TA durante una noche. Se eliminó el DME al vacío y HCl acuoso (1 M, 9,45 ml, 9,45 mmol) se añadió para ajustar el pH a 2-3. La mezcla se extrajo con CH2Ch (1 x 250 ml, 2 x 50 ml) mientras la capa acuosa se saturaba con NaCl sólido. Las capas orgánicas combinadas se secaron Na2SO4, se filtraron, se concentraron y se secaron a alto vacío para ofrecer ácido (S)-5-(ferc-butoxi)-4-(14-(ferc-butoxi)-14-oxotetradecanamido)-5-oxopentanoico (11) (5,14 g, 10,3 mmol) en forma de sólido blanco que se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.

2-(14-(ferc-butoxi)-14-oxotetradecanamido)pentanodioato de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) (S)-1-ferc-butilo (12).

Se añadió DCC en CH2Ch (1M, 11,8 ml, 11,8 mmol) a una solución agitada de ácido (S)-5-(ferc-Butoxi)-4-(14-(fercbutoxi)-14-oxotetradecanamido)-5-oxopentanoico (11) (3,93 g, 7,87 mmol) y 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (1,359 g, 11,81 mmol) en CH2Ch (100 ml). La mezcla se agitó a TA durante 20 h y a continuación, se filtró. El filtrado se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice, eluyendo con EtOAc/CH2Ch (1:19) para ofrecer 2-(14-(ferc-butoxi)-14-oxotetradecanamido)pentanodioato de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de (S)-1-ferc-butilo (12) (3,2 g, 68 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 86,27 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 4,59 (m, 1H), 2,84 (s, 4H), 2,71 (m, 1H), 2,63 (m, 1H), 2,31 (m, 1H), 2,22 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 2,18 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 2,08 (m, 1H), 1,58 (m, 4H), 1,47 (s, 9H), 1,43 (s, 9H), 1,25 (m, 16H). 13C RMN (CDCla, 100 MHz) d 173,41, 173,37, 170,7, 169,1, 168,0, 82,8, 79,9, 51,6, 36,4, 35,6, 29,58, 29,47, 29,35, 29,30, 29,10, 28,12, 27,99, 27,55, 27,50, 25,59, 25,48, 25,13.

Compuesto 13.Se añadió agua (4 ml) a una mezcla agitada del compuesto4(750 mg, 0,448 mmol) (adquirido de Quanta BioDesign, Powell, Ohio), 2-(14-(ferc-butoxi)-14-oxotetradecanamido)pentanodioato de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de (S)-1-ferc-butilo (12) (401 mg, 0,672 mmol) y NaHCO3 (45,1 mg, 0,537 mmol) en DME (12 ml). Después de que la mezcla se agitara a TA durante una noche, se añadió HCl acuoso (1 M, 0,537 ml, 0,537 mmol). La mezcla se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía de fase inversa de presión media en una columna C-18, eluyendo con MeCN/NH4Cl ac (controlado por ELSD-MS). Se combinaron las fracciones que contenían el producto deseado y se eliminaron los compuestos orgánicos volátiles usando un flujo de nitrógeno. La solución acuosa resultante que contenía el producto deseado se liofilizó para ofrecer el compuesto13del título (870 mg, 90 % de rendimiento) en forma de sólido blanco. (M+2H)2+ 1079, (M+3H)3+ 719.

Compuesto 14.Se añadió DCC en CH2Ch (1M, 0,605 ml, 0,605 mmol) a una mezcla agitada del compuesto13(870 mg, 0,403 mmol) y 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (69,6 mg, 0,605 mmol) en CH2Ch (10 ml) a TA. La mezcla se agitó a TA durante una noche, se filtró, se concentró y se secó a alto vacío para ofrecer el compuesto14en forma de sólido blanco que se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.

Compuesto 15.Se añadió agua (4 ml) a una mezcla agitada del compuesto14(908 mg, 0,403 mmol) y 2-aminoetoxicarbamato de ferc-butilo (2) (142 mg, 0,806 mmol) en DME (12 ml) a TA. La mezcla se agitó a TA durante una noche, se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía de fase inversa de presión media en una columna C-18, eluyendo con MeCN/NH4Cl ac (columna: Teledyne Isco C18 Redi SepRf Oro de alto rendimiento; Detector: ELSD; Tasa: 60 ml/min; Disolvente A: H2O al 95 %, 5 % de MeCN NH4OAC 10 mM; Disolvente B: H2O al 5% , 95% de MeCN, NH4OAc 10 mM). Se combinaron las fracciones que contenían el producto deseado y se eliminaron los compuestos orgánicos volátiles usando un flujo de nitrógeno. La solución acuosa resultante que contenía el producto deseado se liofilizó para ofrecer el compuesto15del título (730 mg, 78 % de rendimiento) en forma de sólido blanco. (M+2H)2+ 1158, (M+3H)3+ 772.

Compuesto 16.Se añadió TFA (8 ml, 104 mmol) a una mezcla agitada del compuesto15(420 mg, 0,181 mmol) y 1,4-dimetoxibenceno (201 mg, 1,451 mmol) en CH2Ch (8 ml) a TA. La mezcla se agitó a TA durante 3 h, se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía de fase inversa de presión media en una columna C-18, eluyendo con MeCN/NH4Cl ac (controlado por ELSD-MS). Se combinaron las fracciones que contenían el producto deseado y se eliminaron los compuestos orgánicos volátiles usando un flujo de nitrógeno. La solución acuosa resultante que contenía el producto deseado se liofilizó para ofrecer el compuesto16del título (240 mg, 63 % de rendimiento) en forma de sólido blanco. Se determinó que su pureza de UHPLC-ELSD fue de un 75,2 % utilizando el Análisis de UHPLC-ELSD Condición B. (M+2H)2+ 1052, (M+3H)3+ 701.

Síntesis de espermina-Gluv-C14-CO2H (27)

(4-((3-aminopropil)(íerc-butoxicarbonil)amino)butil)(3-(((benciloxi)carbonil)amino)propil)carbamato de terc-butilo (18). Se añadió agua (100 ml) a una mezcla de N-(benciloxicarboniloxi)succimiTiida (16,6 g, 66,4 mmol), butan-1,4-diNbis((3-aminopropil)carba<iT i>ato) de di-íerc-butilo (17) (Str0mgaard, K; Bjomsdottir, I; Andersen, K; Brierley, M. J.; Rizoli, S.; Eldursi, N; Mellor, I,. R.; 4 Peter N.R. Usherwood, P. N. R.; Hansen, S. H.; Krogsgaard-Larsen, P.; Jaroszewski, J. W. Chirality, 2000, 12, 93) (19,1 g, 47,4 mmol) en THF (300 ml). Después de que se agitara a TAdurante una noche, se eliminó al vacío todo el THF y la mezcla se extrajo con CH2CI2 (350 ml, 100 ml x 2) mientras la capa acuosa se saturaba con NaCl sólido. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtró, se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía instantánea eluyendo con 2M NH3-MeOH/CH2Ch (de 1:19 a 1:9) para ofrecer (4-((3-aminopropil)(ferc-butoxicarbonil)amino)butil)(3-(((benciloxi)carbonil)amino)propil)carbamato de ferc-butilo (18) (5,19 g, 9,67 mmol, 20,4 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 ppm 7,22 - 7,40 (m, 5 H), 5,01 - 5,12 (m, 2 H), 3,34 - 3,48 (m, 4 H), 3,01 -3,31 (m, 5 H), 2,65 (t a,J= 6,60 Hz, 2 H), 1,86 -2,19 (m, 4 H), 1,55 -1,75 (m, 4 H), 1,43 - 1,50 (m, 4<h>), 1,43 (s, 9 H), 1,42 (s, 9 H). Los espectros de 13C RMN fueron muy complejos debido a la presencia de rotámeros.

Pentadecanodioato de 15-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de 1-(ferc-butilo) (19).Una mezcla de ácido 15-(ferc-butoxi)-15-oxopentadecanoico (Compuesto1en el Ejemplo 4) (3,28 g, 10,0 mmol), 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (1,73 g, 15,0 mmol) y EDC (2,88 g, 15,0 mmol) en CH2Ch (100 ml) se agitó a TA durante 16 h. A continuación, se diluyó con CH2Ch (200 ml) y se lavó con salmuera/agua (1:1) dos veces, se secó sobre Na2SO4, se filtró, se concentró y se secó a alto vacío para ofrecer pentadecanodioato de 15-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de 1-(ferc-butilo) (19) (4,26 g, 10,0 mmol, 100 % de rendimiento), que se usó directamente en la siguiente etapa.

Ácido (S)-5-(ferc-butoxi)-4-(15-(ferc-butoxi)-15-oxopentadecanamido)-5-oxopentanoico (20). Se añadió una solución de NaHCO3 (1,01 g, 12,0 mmol) en agua (30 ml) a una mezcla de ácido (S)-4-amino-5-(ferc-butoxi)-5-oxopentanoico (2,44 g, 12,0 mmol) y pentadecanodioato de 15-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de 1-(ferc-butilo) (19) (4,26 g, 10,0 mmol) en DME (90 ml). Después de que la mezcla se agitara a TA durante 16 h, todo el DME se eliminó al vacío, el pH se ajustó a 2-3 y la mezcla se extrajo con CH2Ch (350 ml, 150 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron, se concentraron y se secaron a alto vacío para ofrecer ácido (S)-5-(ferc-butoxi)-4-(15-(fercbutoxi)-15-oxopentadecanamido)-5-oxopentanoico (20) (5,14 g, 10,0 mmol, 100% de rendimiento), que se usó directamente en la etapa siguiente.

(15-(ferc-butoxi)-15-oxopentadecanoil)-L-glutamato de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de 1-( ferc-butilo) (21). Una mezcla de ácido (S)-5-(ferc-butoxi)-4-(15-(ferc-butoxi)-15-oxopentadecanamido)-5-oxopentanoico (20) (5,14 g, 10,0 mmol), 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona (1,73 g, 15,0 mmol), EDC (2,88 g, 15,0 mmol) en CH2Ch (100 ml), se agitó a TA durante 16 h. A continuación, se diluyó con CH2Ch (200 ml) y se lavó con salmuera/agua (1:1) dos veces. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró, se concentró al vacío y el residuo se sometió a cromatografía instantánea eluyendo con EtOAc/CH2Ch para ofrecer 2-(15-(ferc-butoxi)-15-oxopentadecanamido)pentanedioato de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de (S)-1-(ferc-butilo) (21) (3,41 g, 5,58 mmol, 55,8 % de rendimiento) (55,8 % de rendimiento para 3 etapas) en forma de sólido blanco. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 ppm 6,20 (d a, J = 7,82 Hz, 1 H), 4,62 (td,J= 7,95, 4,89 Hz, 1 H), 2,80 -2,91 (m, 4 H), 2,56 -2,79 (m, 2 H), 2,29 -2,42 (m, 1 H), 2,17 -2,28 (m, 4 H), 2,02 -2,16 (m, 1 H), 1,54 -1,69 (m, 4 H), 1,48 - 1,53 (m, 9 H), 1,44 -1,48 (m, 9 H), 1,21 -1,39 (m, 18 H). 13C RMN (101 Mhz, CDCh) 8 ppm 173,35, 173,33, 170,66, 168,95, 168,01, 82,82, 79,85, 51,66, 36,46, 35,66, 29,61, 29,49, 29,35, 29,31, 29,12, 28,15, 28,00, 27,62, 27,54, 25,60, 25,48, 25,15.

(S)-8,13,21-tris(ferc-butoxicarbonil)-3,18,23-trioxo-1-fenil-2-oxa-4,8,13,17,22-pentaazaheptatriacontan-37-oato de ferc-butilo (22).Se añadió agua (20 ml) a una mezcla de 4-((3-aminopropil)(ferc-butoxicarbonil)amino)butil)(3-(((benciloxi)carbonil)amino)propil)carbamato de ferc-butilo (18) (1,42 g, 2,65 mmol), 2-(15-(ferc-butoxi)-15-oxopentadecanamido)pentanodioato de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de (S)-1-ferc-butilo (21) (1,62 g, 2,65 mmol) en DME (60 ml). Después de que la mezcla se agitara a TA durante una noche, todos los componentes volátiles (incluido el agua) se eliminaron a alto vacío y el residuo se secó azeotrópicamente con MeOH (2 x). El residuo se disolvió en MeOH/CH2Ch(1:9, <10 ml) y se sometió a cromatografía instantánea, eluyendo con MeOH/CH2Ch ofrecer (S)-8,13,21-tris(ferc-butoxicarbonil)-3,18,23-trioxo-1-fenil-2-oxa-4,8,13,17,22-pentaazaheptatriacontan-37-oato de ferc-butilo (22) (2,74 g, 2,65 mmol, 100 % de rendimiento) en forma de líquido viscoso. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 ppm 7,29 - 7,39 (m, 5 H), 7,12 - 7,25 (m, 1 H), 6,69 - 6,89 (m, 1 H), 5,67 - 5,95 (m, 1 H), 5,03 - 5,15 (m, 2 H), 4,30 - 4,47 (m, 1 H), 3,38 - 3,54 (m, 8 H), 3,05 -3,32 (m, 8 H), 2,12 -2,35 (m, 6 H), 1,86 -2,05 (m, 1 H), 1,51 -1,76 (m, 7 H), 1,45 (s, 9 H), 1,44 (s, 27 H), 1,17 -1,33 (m, 20 H). Los espectros de 13C RMN fueron muy complejos debido a la presencia de rotámeros.

(S)-5-(3-aminopropil)-10,18-bis(ferc-butoxicarbonil)-2,2-dimetil-4,15,20-trioxo-3-oxa-5,10,14,19-tetraazatetratriacontan-34-oato de ferc-butilo (23).Una mezcla de (S)-8,13,21-tris(ferc-butoxicarbonil)-3,18,23-trioxo-1-fenil-2-oxa-4,8,13,17,22-pentaazaheptatriacontan-37-oato de ferc-butilo (22) (1,36 g, 1,32 mmol) y Pd-C (0,140 g, 10 % en peso) en etanol (100 ml) se hidrogenaron en un agitador Parr (H2, 0,207 MPa (30 psi)) durante 18 h a TA. La mezcla se filtró, se lavó con EtOH, se concentró y se secó a alto vacío para ofrecer 5-(3-aminopropil)-10,18-bis(ferc-butoxicarbonil)-2,2-dimetil-4,15,20-trioxo-3-oxa-5,10,14,19-tetraazatetratriacontan-34-oato de (S)-ferc-butilo (23) (1,19 g, 1,32 mmol, 100 % de rendimiento), que se usó directamente en la etapa siguiente. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 ppm 6,91 - 7,09 (m, 1 H), 6,46 - 6,73 (m, 1 H), 4,34 - 4,54 (m, 1 H), 3,66 - 3,81 (m, 1 H), 3,10 - 3,36 (m, 10 H), 2,82 -2,93 (m, 2 H), 2,58 -2,67 (m, 3 H), 2,13 -2,36 (m, 6 H), 1,55 - 1,72 (m, 6 H), 1,49 - 1,53 (m, 4 H), 1,48 (s, 9<h>), 1,47 (d,J= 3,18 Hz, 27 H), 1,22 - 1,37 (m, 20 H). Los espectros de 13C Rm N fueron muy complejos debido a la presencia de rotámeros.

Ácido (S)-20,28,33-tris(ferc-butoxicarbonM)-2,2-dimetil-4,18,23,38-tetraoxo-3-oxa-19,24,28,33,37-pentaazahentetracontan-41-oico (24).Se añadió piridina (13 ml) a una mezcla de 5-(3-aminopropil)-10,18-bis(fercbutoxicarbonil)-2,2-dimetil-4,15,20-trioxo-3-oxa-5,10,14,19-tetraazatetratriacontan-34-oato de (S)-ferc-butilo (23) (1,19 g, 1,32 mmol) y dihidrofuran-2,5-diona (0,66 g, 6,6 mmol). Después de que la mezcla se agitara a TA durante 16 h, todos los componentes volátiles se eliminaron al vacío y el residuo se sometió a cromatografía instantánea eluyendo con M eOH/C^Ch que contiene 0,5 % de AcOH para ofrecer ácido (S)-20,28,33-tris(ferc-butoxicarbonil)-2,2-dimetil-4,18,23,38-tetraoxo-3-oxa-19,24,28,33,37-pentaazahentetracontan-41-oico (24) (1,32 g, 1,32 mmol, 100% de rendimiento) en forma de líquido viscoso. 1H RMN (400 MHz, cloroformo-d) 6 ppm 4,38 - 4,50 (m, 1 H), 3,47 - 3,58 (m, 1 H), 3,09 - 3,32 (m, 9 H), 2,75 (s, 4 H), 2,64 - 2,73 (m, 2 H), 2,46 - 2,59 (m, 2 H), 2,27 - 2,35 (m, 2 H), 2,17 - 2,27 (m, 4 H), 2,07 -2,14 (m, 4 H), 1,83 -2,04 (m, 1 H), 1,67 - 1,80 (m, 3 H), 1,55 - 1,66 (m, 4 H), 1,41 - 1,54 (m, 38 H), 1,19 -1,37 (m, 20 H).

(S)-8,13-bis(íerc-butoxicarbonM)-3,18,23-trioxo-4,8,13,17,22-pentaazahexatNacontano-1,21,36-tncarboxMato 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de 21,36-di-íerc-butilo (25). Se añadió DCC en CH2Ch (1,0 millones, 2,0 ml, 2,0 mmol) a una mezcla de ácido (S)-20,28,33-tris(ferc-butoxicarbonil)-2,2-dimetil-4,18,23,38-tetraoxo-3-oxa-19,24,28,33,37-pentaazahentetracontan-41-oico (24) (1,32 g, 1,32 mmol), 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (0,23 g, 2,0 mmol) en CH2Ch (20 ml). Después de que la mezcla se agitara a TA durante 16 h, se filtró, se concentró y se secó a alto vacío para ofrecer (S)-8,13-bis(ferc-butoxicarbonil)-3,18,23-trioxo-4,8,13,17,22-pentaazahexatriacontano-1,21,36-tricarboxilato 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de 21,36-di-terc-butilo (25) (1,45 g, 1,32 mmol, 100% de rendimiento), que se usó directamente en la etapa siguiente.

(S)-18,23,31-tris(íerc-butoxicarbonil)-2,2-dimetil-4,10,13,28,33-pentaoxo-3,6-dioxa-5,9,14,18,23,27,32-heptaazaheptatetracontan-47-oato de ferc-butilo (26).Se añadió una solución de NaHCO3 (0,233 g, 2,77 mmol) en agua (4 ml) a una mezcla de 8,13-bis(ferc-butoxicarbonil)-3,18,23-trioxo-4,8,13,17,22-pentaazahexatriacontano-1,21,36-tricarboxilato 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de (S)-21,36-di-ferc-butilo (25) (1,45 g, 1,32 mmol) y clorhidrato 2-aminoetoxicarbamato de ferc-butilo (0,561 g, 2,64 mmol) en DME (12 ml) a TA. Después de que la mezcla se agitara a TA durante 6 h, todos los componentes volátiles, entre los que se incluyen el agua, se eliminaron al vacío y el residuo se secó azeotrópicamente con THF. El residuo se sometió a cromatografía instantánea eluyendo con MeOH/CH2Ch para ofrecer S)-18,23,31-tris(terc-butoxicarbonil)-2,2-dimetil-4,10,13,28,33-pentaoxo-3,6-dioxa-5,9,14,18,23,27,32-heptaazaheptatetracontan-47-oato de terc-butilo (26) (0,87 g, 0,75 mmol, 57 % de rendimiento) en forma de líquido viscoso. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 6 ppm 4,33 - 4,48 (m, 1 H), 3,80 - 3,94 (m, 4 H), 3,42 - 3,55 (m, 14 H), 3,08 - 3,32 (m, 7 H), 2,68 - 2,77 (m, 4 H), 2,50 - 2,63 (m, 4 H), 2,13 - 2,34 (m, 4 H), 1,54 - 1,74 (m, 6 H), 1,43 - 1,53 (m, 45 H), 1,22 - 1,35 (m, 20 H). Los espectros de 13C RMN fueron muy complejos debido a la presencia de rotámeros.

Ácido (S)-1-(aminooxi)-25-carboxi-4,7,22,27-tetraoxo-3,8,12,17,21,26-hexaazahentetracontan-41-oico (27). A una mezcla de 18,23,31-tris(ferc-butoxicarbonil)-2,2-dimetil-4,10,13,28,33-pentaoxo-3,6-dioxa-5,9,14,18,23,27,32-heptaazaheptatetracontan-47-oato de (S)-ferc-butilo (26) (0,50 g, 0,43 mmol) y DTT (0,067 g, 0,43 mmol) en TFA (1,5 ml), se añadieron trietilsilano (0,10 ml, 0,63 mmol) y agua (0,10 ml, 5,6 mmol). La mezcla resultante se agitó a TA durante 2 h y a continuación, se eliminaron todos los componentes volátiles usando un flujo de N2 durante una noche. El residuo se sometió a purificación usando mediante LC/M<s>preparativa usando las siguientes condiciones: Columna: CSH C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm, de Waters; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %; Gradiente: 0-35 % de B durante 25 minutos, a continuación, una parada de 5 minutos al 100 % de B; Flujo: 20 ml/min. Se combinaron las fracciones que contenían el producto deseado y se eliminaron los componentes orgánicos volátiles usando un flujo de nitrógeno. La solución acuosa resultante que contenía el producto deseado se enfrió a -78 °C bajo un flujo de nitrógeno y se liofilizó para ofrecer el compuesto del título (27) en forma de sólido blanco (72 mg, 21 % de rendimiento). Se determinó que su pureza de LC-CAD fue de un 94,9 % utilizando el Análisis de UHPLC-CAD Condición C. [MH]+ 745,09.

Condición del análisis A: Tiempo de retención = 1,27 min; ESI-MS (MH)+ = 744,55.

Condición del análisis B: Tiempo de retención = 1,20 min; ESI-MS (MH)+ = 744,40.

Síntesis del Compuesto 39:

Octadecanodioato de 18-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de l-(ferc-butilo) (29).Se añadió EDC (1,406 g, 7,33 mmol) a una mezcla de ácido 18-(terc-butoxi)-18-oxooctadecanoico (28) (preparado mediante un método similar al utilizado para preparar el compuesto1 enel Ejemplo 4) (2,09 g, 5,64 mmol) y 1-hidroxipirroMdina-2,5-diona (0,844 g, 7,33 mmol) en CH2Cl2 (40 ml). La mezcla se agitó a TA durante una noche, se diluyó con CH2Ch (100 ml) y se lavó con NaHO3. Después de la separación, la capa acuosa se extrajo con CH2Ch (80 ml * 2). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se sometió a cromatografía instantánea eluyendo con CH2Ch para ofrecer octadecanodioato de 18-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de 1-(terc-butilo) (29) (2,13 g, 4,55 mmol, 81 % de rendimiento) en forma de sólido blanco. 1H RMN (400 MHz, cD ch) 8 2,85 (s a, 4H), 2,62 (t,J= 7,5 Hz, 2H), 2,22 (t,J= 7,6 Hz, 2H), 1,77 (quint., J = 7,5 Hz, 2H), 1,67 - 1,54 (m, 3H), 1,50 -1,37 (m, 10H), 1,37 -1,21 (m, 22H). 13C RMN (101 MHz, CDCI3) 5 ppm 173,33, 169,12, 168,67, 79,85, 35,67, 30,98, 29,65 (s a), 29,62 (s a), 25,61, 29,55, 29,50, 29,36, 29,31, 29,12, 29,09, 28,81, 28,15, 25,15, 24,60.

(S)-18-((6-(((bencMoxi)carboml)ammo)-1-(terc-butoxi)-1-oxohexan-2-N)ammo)-18-oxooctadecanoato de terc-butilo (30).Se añadió NaHCO3 (0,41 g, 4,83 mmol) a una mezcla de 18-(2,5-dioxopirrolidin-1-il)octadecanodioato de 1-ferc-butiío (29) (1,13 g, 2,416 mmol) y clorhidrato de Lys(NE-CBZ)-O(Bu (1,17 g, 3,14 mmol) en DME (60 ml) y agua (20 ml). La suspensión ligera resultante se agitó a TA durante una noche. Se eliminó el DME al vacío y a continuación, se añadió HCl acuoso (1 M, 4,83 ml, 4,83 mmol) para ajustar el pH a 2-3. La mezcla se extrajo con EtOAc (200 ml, 100 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron, se concentraron al vacío y se sometieron a cromatografía instantánea eluyendo con EtOAc/CH2Ch para ofrecer 18-((6-(((benciloxi)carbonil)amino)-1-(ferc-butoxi)-1-oxohexan-2-il)amino)-18-oxooctadecanoato de (S)-ferc-butilo (30) (1,66 g, 2,42 mmol, 100 % de rendimiento) en forma de líquido viscoso incoloro. 1H RMN (400 m Hz , CDCh) 5 ppm 7,29 -7,38 (m, 5 H), 6,08 (d a,J= 7,34 Hz, 1 H), 5,06 - 5,19 (m, 2 H), 4,84 - 5,02 (m, 1 H), 4,48 (td,J= 7,70, 5,14 Hz, 1 H), 3,07 - 3,27 (m, 2 H), 2,15 -2,24 (m, 4 H), 1,75 - 1,88 (m, 1H), 1,49 - 1,70 (m, 7 H), 1,46 (s, 9 H), 1,44 (s, 9 H), 1,20 -1,34 (m, 26 H). 13C RMN (101 MHz, CDCh) 5 ppm 173,30, 172,87, 171,81, 171,05, 156,49, 136,67, 128,47, 128,03, 82,03, 79,82, 66,55, 60,35, 52,24, 40,66, 36,65, 35,64, 32,35, 29,67, 29,64, 29,61, 29,50, 29,48, 29,44, 29,33, 29.29, 29.10, 28.13, 28.00, 25.63, 25.13, 22.25, 21.00, 14.19. [MH]+ 689,62.

(S)-18-((6-amino-1-(terc-butoxi)-1-oxohexan-2-il)amino)-18-oxooctadecanoato de terc-butilo (31). Una mezcla de 18-((6-(((benciloxi)carbonil)amino)-1-(ferc-butoxi)-1-oxohexan-2-il)amino)-18-oxooctadecanoato de (S)-terc-butilo (30) (1,060 g, 1,2 mmol) y Pd-C (0,128 g, 1,200 mmol) en EtOH (50 ml) se hidrogenó (globo) durante una noche a TA. Después de varios ciclos de purga al vacío con nitrógeno, la mezcla de reacción se filtró cuidadosamente y se lavó con EtOH. El filtrado se concentró y se secó a alto vacío para ofrecer (31) 18-((6-amino-1-(terc-butoxi)-1-oxohexan-2-il)amino)-18-oxooctadecanoato de (S)-terc-butilo (0,67 g, 1,2 mmol, 100% de rendimiento) en forma de líquido incoloro, que se usó directamente en la siguiente etapa. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 5 ppm 6,40 - 6,59 (m, 1 H), 4,30 -4,50 (m, 1 H), 3,16 -3,37 (m, 2 H), 2,65 -2,81 (m, 2 H), 2,10 -2,25 (m, 4 H), 1,72 - 1,84 (m, 1 H), 1,47 - 1,67 (m, 7 H), 1,43 (s, 9 H), 1,41 (s, 9 H), 1,22 -1,36 (m, 26 H). 13C RMN (CDCh) 5 ppm 173,53, 173,48, 171,90, 82,10, 79,95, 52,47, 50,19, 40,80, 36,50, 35,62, 32,11, 30,66, 29,63, 29,60, 29,56, 29,48, 29,44, 29,33, 29,25, 29,05, 28,07, 27,94, 25,66, 25,09, 22,41. [MH]+ 555,63.

(S)-19-(terc-butoxicarbonil)-1-(9H-fluoren-9-il)-3,13,21-trioxo-2,7,10-trioxa-4,14,20-triazaoctatriacontan-38-oato de terc-butilo (32). Se añadió NaHCO3 (0,202 g, 2,40 mmol) a una mezcla de 1-(9H-fluoren-9-il)-3-oxo-2,7,10-trioxa-4-azatridecan-13-oato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (0,715 g, 1,44 mmol), 18-((6-amino-1-(terc-butoxi)-1-oxohexan-2-il)amino)-18-oxooctadecanoato de (S)-terc-butilo (31) (0,67 g, 1,2 mmol) en DME (15 ml) y agua (5). Después de agitar a TA durante una noche, todos los componentes volátiles se eliminaron al vacío y el residuo se sometió a cromatografía instantánea, eluyendo EtOAc/CH2Ch para ofrecer 19-(terc-butoxicarbonil)-1-(9H-fluoren-9-il)-3,13,21-trioxo-2,7,10-trioxa-4,14,20-triazaoctatriacontan-38-oato de (S)-terc-butilo (32) (1,12 g, 1,20 mmol, 100 % de rendimiento) en forma de líquido viscoso incoloro. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 5 ppm 7,78 (d,J= 7,58 Hz, 2 H), 7,63 (d,J= 7,34 Hz, 2 H), 7,37 - 7,47 (m, 2 H), 7,30 - 7,36 (m, 2 H), 6,21 - 6,37 (m, 1 H), 6,00 - 6,17 (m, 1 H), 5,43 - 5,63 (m, 1 H), 4,40 - 4,54 (m, 3 H), 4,19 - 4,33 (m, 1 H), 3,75 (t,J= 5,87 Hz, 2 H), 3,53 - 3,68 (m, 6 H), 3,42 (d a,J= 4,89 Hz, 2 H), 3,22 (c,J= 6,28 Hz, 2 H), 2,44 (t a,J= 5,38 Hz, 2 H), 2,22 (t,J= 7,58 Hz, 4 H), 1,75 - 1,89 (m, 1 H), 1,55 - 1,69 (m, 7 H), 1,47 (s, 9 H), 1,46 (s, 9 H), 1,20 - 1,35 (m, 26 H). 13C RMN (101 MHz, CDCh) 5 ppm 173,34, 173,01, 171,82, 171,38, 156,56, 143.99, 141,34, 127,70, 127,05, 125,06, 119,98, 82,07, 79,87, 70,25, 70,12, 70,05, 67,29, 66,63, 52,27, 47,33, 40,86, 38.99, 37,03, 36,67, 35,67, 32,45, 29,70, 29,67, 29,64, 29,63, 29,53, 29,51, 29,38, 29,33, 29,13, 29,03, 28,15, 28,04, 25,68, 25,16, 22,47. [MH]+ 936,80.

(S)-1-amino-15-(terc-butoxicarbonil)-9,17-dioxo-3,6-dioxa-10,16-diazatetratriacontan-34-oato de terc-butilo (33). Se añadió Et3N (2,5 ml, 18 mmol) a una mezcla de 19-(terc-butoxicarbonil)-1-(9H-fluoren-9-il)-3,13,21-trioxo-2,7,10-trioxa-4,14,20-triazaoctatriacontan-38-oato de (S)-terc-butilo (32) (1,12 g, 1,20 mmol) en DMF (10 ml). Después de que la mezcla se agitara a TA durante una noche, se añadió más Et3N (1,0 ml, 7,2 mmol). La mezcla se agitó a TA durante otras 7 h. Todos los componentes volátiles se eliminaron al vacío y el residuo se secó a alto vacío para ofrecer 1-amino-15-(terc-butoxicarbonil)-9,17-dioxo-3,6-dioxa-10,16-diazatetratriacontan-34-oato de (S)-terc-butilo (33) (0,857 g, 1,20 mmol, 100 % de rendimiento) en forma de líquido incoloro, que se usó directamente en la siguiente etapa. [MH]+ 714,70.

(S)-39-(terc-butoxicarbonil)-1-(9H-fluoren-9-il)-3,13,23,33,41-pentaoxo-2,7,10,17,20,27,30-heptaoxa-4,l4,24,34,40-pentaazaocctapentacontan-58-oato de terc-butilo (34). Se añadió NaHCO3 (0,20 g, 2,4 mmol) a una mezcla de 1-(9H-fluoren-9-il)-3-oxo-2,7,10-trioxa-4-azatridecan-13-oato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (0,715 g, 1,44 mmol), 1-amino-15-(ferc-butoxicarbonil)-9,17-dioxo-3,6-dioxa-10,16-diazatetratriacontan-34-oato de (S)-terc-butilo (33) (0,857 g, 1,20 mmol) en DME (15 ml) y agua (5 ml). Después de que la mezcla se agitara a TA durante una noche, todos los componentes volátiles se eliminaron al vacío y se añadió HCl acuoso (1 M, 2,4 ml, 2,4 mmol) para ajustar el pH a 2-3. La mezcla resultante se extrajo con EtOAc (200 ml, 100 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se sometió a cromatografía instantánea (gel de sílice) eluyendo con M eOH/C^Ch para ofrecer (S)-ferc-butilo 29-(ferc-butoxicarbonil)-1-(9H-fluoren-9-il)-3,13,23,3 1-tetraoxo-2,7,10,17,20-pentaoxa-4,14,24,30-tetraazaoctatetracontan-48 -avena (34) (1,03 g, 0,940 mmol, 78 % de rendimiento) como sustancia incolora, líquido viscoso. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 5 ppm 7,78 (d,J = 7,58Hz, 2 H), 7,63 (d a,J = 7,34Hz, 2 H), 7,39 - 7,46 (m, 2 H), 7,30 - 7,36 (m, 2 H), 6,74 (s a, 1 H), 6,27 - 6,39 (m, 1 H), 6,05 - 6,24 (m, 1 H), 5,60 - 5,78 (m, 1 H), 5,19 - 5,40 (m, 3 H), 4,38 - 4,55 (m, 3 H), 4,17 - 4,32 (m, 1 H), 3,74 - 3,79 (m, 2 H), 3,72 (t,J= 5,99 Hz, 2 H), 3,61 - 3,67 (m, 4 H), 3,54 - 3,61 (m, 8 H), 3,48 - 3,54 (m, 6 H), 3,37 - 3,47 (m, 4 H), 3,17 - 3,29 (m, 2 H), 2,49 (t a,J= 5,87 Hz, 2 H), 2,43 (t,J= 5,87 Hz, 2 H), 2,18 - 2,26 (m, 4 H), 1,76 - 1,90 (m, 1 H), 1,51 - 1,73 (m, 7 H), 1,48 (s, 9 H), 1,46 (s, 9 H), 1,18 - 1,37 (m, 26 H). 13C RMN (101 MHz, CDCI3) 8 ppm 173,34, 173,04, 171,80, 171,43, 171,34, 156,62, 144,00, 141,35, 127,69, 127,05, 125,04, 119,97, 82,05, 79,87, 77,55, 70,22, 70,18, 70,16, 70,07, 69,92, 67,23, 66,51, 53,40, 52,29, 50,86, 47,34, 40,99, 39,18, 39,04, 37,04, 36,95, 36,67, 35,67, 32,42, 29,70 (s a), 29,68 (s a), 29,65 (s a), 29,63 (s a), 29,54, 29,51, 29,38, 29,34, 29,32, 29,12, 29,01, 28,15, 28,0, 25,68, 25,16, 22,51. [MH]+ 1254,90.

íerc-butil (S)-1-ammo-25-(íerc-butoxicarboml)-9,19,27-trioxo-3,6,13,16-tetraoxa-10,20,26-triazatetratracontan-44-oato (35).y3Se añadió N (1,2 ml, 8,61 mmol) a una mezcla de (S)-terc-butilo 29-(terc-butoxicarbonil)-1-(9H-fluoren-9-il)-3,13,23,31-tetraoxo-2,7,10,17,20-pentaoxa-4,14,24,30-tetraazaoctatetracontan-48- avena (34) (330 mg, 0,301 mmol) en DMF (3 ml). Después de que la mezcla se agitara a TA durante 20 h, todos los componentes volátiles se eliminaron en alto vacío. El residuo se sometió a cromatografía instantánea, eluyendo con 2M NH3-MeOH/CH2Ch (1:9), para ofrecer 1 -amino-25-(terc-butoxicarbonil)-9,19,27-trioxo-3,6,13,16-tetraoxa-10,20,26-triazatetratracontan-44-oato de (S)-terc-butilo (35) (164 mg, 0,188 mmol, rendimiento 62,3%) en forma de líquido incoloro. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 ppm 6,78 - 6,92 (m, 1 H), 6,48 - 6,62 (m, 1 H), 6,15 - 6,35 (m, 1 H), 4,35 - 4,53 (m, 1 H), 3,75 (c,J= 6,11Hz, 4 H), 3,59 - 3,68 (m, 8 H), 3,54 - 3,59 (m, 2 H), 3,49 - 3,54 (m, 2 H), 3,40 - 3,48 (m, 3 H), 3,16 - 3,29 (m, 2 H), 2,80 -2,92 (m, 2 H), 2,38 -2,57 (m, 4 H), 2,12 -2,32 (m, 4 H), 1,75 - 1,87 (m, 1 H), 1,49 - 1,75 (m, 8 H), 1,47 (s, 9 H), 1,45 (s, 9 H), 1,20 - 1,38 (m, 26 H).13C RMN (101 MHz, CDCh) 8 ppm 173,32, 173,04, 171,80, 171,47, 171,37, 81.99, 79,85, 74,86, 73,34, 70,30, 70,23, 70,12, 70,08, 69,88, 67,30, 52,31, 50,60, 41,74, 39,18, 39,00, 37,05, 37,00, 36,64, 35,65, 32,35, 29,67, 29,66, 29,61, 29,52, 29,48, 29,33, 29,31, 29,31, 29,11, 29,04, 28,13, 28,03, 25,68, 25,13, 22,51. [MH]+ 873,75.

Ácido (S)-23-(ferc-butoxicarboml)-2,2-dimetil-4,21,29,39,49-pentaoxo-3,32,35,42,45-pentaoxa-22,28,38,48-tetraazazadopentacontan-52-oico (36). Se añadió piridina (5,0 ml) a una mezcla de 1-amino-25-(terc-butoxicarbonil)-9,19,27-trioxo-3,6,13,16-tetraoxa-10,20,26-triazatetratracontan-44-oato de (S)-terc-butilo (35) (164 mg, 0,188 mmol) y dihidrofuran-2,5-diona (94 mg, 0,939 mmol) a TA. Después de que la mezcla se agitara a TA durante una noche, todos los componentes volátiles se eliminaron en alto vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de fase inversa de presión media en una columna C-18, eluyendo con MeCN/ac. TFA (controlado por ELSD-MS). Se combinaron las fracciones que contenían el producto deseado y se eliminaron los componentes orgánicos volátiles usando un flujo de nitrógeno. La solución acuosa resultante que contenía el producto deseado se liofilizó para ofrecer el compuesto del título ácido (S)-23-(terc-butoxicarbonil)-2,2-dimetil-4,21,29,39,49-pentaoxo-3,32,35,42,45-pentaoxa-22,28,38,48-tetraazazadopentacontan-52-oico (36) (123 mg, 0,126 mmol, 67,3% de rendimiento) en forma de líquido incoloro.

[MH]+ 973,81.

(S)-3,13,23,31-tetraoxo-7,10,17,20-tetraoxa-4,14,24,30-tetraazaheptatetracontano-1,29,47-tricarboxilato de 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de 29,47-di-íerc-butilo (37).A una mezcla de ácido (S)-23-(terc-butoxicarbonil)-2,2-dimetil-4,21,29,39,49-pentaoxo-3,32,35,42,45-pentaoxa-22,28,38,48-tetraazazadopentacontan-52-oico (36) (123 mg, 0,126 mmol), 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (21,8 mg, 0,190 mmol) y EDC (31,5 mg, 0,164 mmol), se añadió CH2Ch (5 ml). Después de que la solución transparente resultante se agitara a TA durante una noche, LC/ELSD-MS mostró aproximadamente un 70 % de conversión. Se añadieron más 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (21,8 mg, 0,190 mmol) y EDC (31,5 mg, 0,164 mmol) y la mezcla se agitó a TA durante 3,5 h. LC/ELSD-MS mostró una conversión completa. La mezcla se diluyó con CH2Ch (150 ml) y se lavó con agua/salmuera (2:1), se secó sobre Na2SO4, se filtró, se concentró a alto vacío para ofrecer 3,13,23,31-tetraoxo-7,10,17,20-tetraoxa-4,14,24,30-tetraazaheptatetracontano-1,29,47-tricarboxilato de 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) de (S)-29,47-di-terc-butilo (37) (135 mg, 0,126 mmol, 100% de rendimiento) en forma de líquido incoloro, que se usó directamente en la siguiente etapa. [MH]+ 1070,93.

(S)-39-(íerc-butoxicarboml)-2,2-dimetil-4,10,13,23,33,41-hexaoxo-3,6,17,20,27,30-hexaoxa-5,9,14,24,34,40-hexaazaocctapentacontan-58-oato de ferc-butilo (38).Se añadió NaHCO3 (21,2 mg, 0,252 mmol) a una mezcla de 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) 3,13,23,31-tetraoxo-7,10,17,20-tetraoxa-4,14,24,30-tetraazaheptatetracontano-1,29,47-tricarboxilato de (S)-29,47-di-terc-butilo (37) (135 mg, 0,126 mmol) y clorhidrato 2-aminoetoxicarbamato de terc-butilo (53,6 mg, 0,252 mmol) en DME (4,5 ml) y agua (1,5 ml). La solución resultante se agitó a TA durante una noche. Todos los componentes volátiles se eliminaron al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía de fase inversa de presión media en una columna C-18, eluyendo con MeCN/TFA ac (controlado por ELSD-MS). Se combinaron las fracciones que contenían el producto deseado y se eliminaron los componentes orgánicos volátiles usando un flujo de nitrógeno. La solución acuosa resultante que contenía el producto deseado se liofilizó para ofrecer el compuesto del título 39-(terc-butoxicarbonil)-2,2-dimetil-4,10,13,23,33,41-hexaoxo-3,6,17,20,27,3 0-hexaoxa-5,9,14,24,34,40 -hexaazaocctapentacontan-58-oato de (S)-terc-butilo (38) (118 mg, 0,104 mmol, 83,0% de rendimiento). [MH]+ 1131.99.

Ácido (S)-1-(aminooxi)-33-carboxi-4,7,17,27,35-pentaoxo-11,14,21,24-tetraoxa-3,8,18,28,34-pentaazadopentacontan-52-oico (39).Se añadió TFA (2 ml) a 0 °C a una mezcla de 39-(terc-butoxicarbonil)-2,2-dimetil-4,10,13,23,33,41-hexaoxo-3,6,17,20,27,30-hexaoxa-5,9,14,24,34,40-hexaazaocctapentacontan-58-oato de (S)-terc-butilo (38) (118 mg, 0,104 mmol) y 1,4-dimetoxibenceno (144 mg, 1,043 mmol) en CH2Ch (2 ml). La mezcla se agitó a 0 °C durante 5 min y a continuación, a TA durante 2 h. La mezcla se concentró y a continuación, se secó a alto vacío durante 30 min. El residuo se purificó mediante cromatografía de fase inversa de presión media en una columna C-18, eluyendo con MeCN/ac. t Fa (controlado por ELSD-MS). Se combinaron las fracciones que contenían el producto deseado y se eliminaron los componentes orgánicos volátiles usando un flujo de nitrógeno. La solución acuosa resultante que contenía el producto deseado se enfrió a -78 °C bajo un flujo de nitrógeno y se liofilizó para ofrecer ácido (S)-1-(aminooxi)-33-carboxi-4,7,17,27,35-pentaoxo-11,14,21,24-tetraoxa-3,8,18,28,34-pentaazadopentacontan-52-oico (39) (60,0 mg, 0,064 mmol, 61,3 % de rendimiento) en forma de sólido blanco. Se determinó que su pureza de LC-CAD fue de un 98,0 % utilizando el Análisis de UHPLC-CAD Condición D. [MH]+ 919,88, [M+2H]+/2460,69.

Ejemplo 7: Ensayo de acumulación de AMPc intracelular

Los efectos de la relaxina H2 están mediados a través de su receptor acoplado a la proteína G afín, El receptor peptídico de la familia de la relaxina (RXFP1), que conduce a la estimulación de una combinación de rutas de señalización celular que dependen del tipo de célula y que pueden incluir adenilato ciclasa, proteína quinasa A, proteína quinasa C, fosfatidilinositol 3-quinasa y quinasa regulada por señalización extracelular (Erk1/2). Bathgate,et al.,2006. Pharmacol. Rev. 58, 7-31. El ensayo de acumulación de AMPc intracelular descrito en el presente documento se utilizó para evaluar la bioactividad y la potencia de la relaxina. Los compuestos de prueba se basaron en TS-RLX (Fig. 1), AQ1 (Fig. 2) y BM25/AN1 (Fig. 3). Los extensores PK como se muestran se conjugaron con la para-acetilfenilalanina contenida en AQ1 y BM25/AN1 mediante un enlace de oxima, como se ha descrito en el Ejemplo 3.

Se sembraron células CHO-K1 (ATCC; N.° de catálogo CRL-9618) que expresan establemente el receptor RXFP1 humano (número de locus LOC59350) (10.000/pocillo) en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante una noche a 37 °C y CO2 al 5 %. Al día siguiente, se retiró el medio de los pocillos y las células se estimularon con la adición de ligando (polipéptido de relaxina) en 50 uL de tampón (1X HBSS, HEP<e>S 5 mM (7,2), IBMX 0,5 mM, BSA al 0,1 %); la incubación fue durante 10 min a 37 °C. Se utilizaron células no estimuladas como controles de referencia. Las reacciones se terminaron y los niveles de AMPc celular se midieron utilizando el kit de AMPc dinámico 2 de fluorescencia homogénea resuelta en tiempo (Homogeneous Time Resolved Fluorescence, HTRF) (CisBio, n.° 62AM4PEC) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las placas se analizaron utilizando un lector multietiqueta EnVision 2104 (PerkinElmer). La señal se expresó en términos de la relación de intensidad de fluorescencia a 665 nm/intensidad de fluorescencia a 620 nm * 10.000. La concentración de AMPc en la muestra se determinó comparándola con curvas patrón generadas a partir de concentraciones conocidas de AMPc. La potencia de cada relaxina se determinó utilizando curvas de respuesta a la concentración de diez puntos que se realizaron por duplicado. Los datos se analizaron utilizando Microsoft Excel, software Xlfit, versión 2013. Los valores de concentración eficaz 50 (CE50), el punto en el que la respuesta fue la mitad del máximo, se calcularon utilizando una ecuación logística de cuatro parámetros que permitió una pendiente variable (Tabla 3).

Tabla 3. Resultados del ensayo de acumulación de AMPc intracelular. Abreviaturas utilizadas en esta tabla: dK: D-lisina; Sar: sarcosina (N-metilglicina); dGlu: ácido D-glutámico; PEG 20kDa: poli(etilenglicol), peso molecular de 20 kDa; PEGn (por ejemplo, n es 2, 12, 24 o 36): -(O-CH2-CH2)n-O-; -C13-: -(C=O)-(CH2)12-; -C14-: -(C=O)-(CH2)13-; -C15-: -(C=O)-(CH2)14- (estas abreviaturas son ilustrativas, pero no limitan, el -Cn- de la Fórmula I o usos de estos términos fuera de esta tabla). En GluY-C13-, GluY-C14-, GluY-C15- y GluY-C17- en la Tabla 3, el primer carbono del carbonilo del ácido graso está unido al resto de Glu (gamma) mediante un puente de amida.

(continuación)

(continuación)

o

AQ1 -Relaxi

(Fórmula III).

Ejemplo 8: Estudios farmacocinéticos (PK)in vivo

Ratas macho Sprague-Dawley (n=3) recibieron una única dosis intravenosa (IV) o subcutánea (SC) (1 mg/kg) de construcciones de relaxina (como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 7) formuladas en un tampón adecuado (por ejemplo, histidina 20 mM, NaCl 750 mM, pH 6,0). Se recogieron muestras de sangre a través de la vena yugular en diferentes momentos, hasta las 72 horas. Las muestras de sangre se dejaron coagular a temperatura ambiente (30-60 min) y a continuación, se centrifugaron (1500-2000) a 4 °C para obtener suero. Después de la centrifugación, las muestras de suero se transfirieron a placas de 96 pocillos y se almacenaron a -80 °C hasta el bioanálisis. Las concentraciones de relaxina se midieron en suero mediante ELISA.

Para el análisis se utilizaron los perfiles de concentración-tiempo de relaxina de animales individuales. Los parámetros farmacocinéticos se calcularon mediante métodos no compartimentales utilizando Phoenix WinNonlin (versión 6.4) o Kinetica (versión 5). Se notificaron las medias de los parámetros farmacocinéticos Cmáx, AUCinf, C24 y semivida (Tabla 4).

Tabla 4. Datos PKin vivoabreviaturas como en la Tabla 3.

Ejemplo 9: Estudios de flujo sanguíneo renal en ratas

Se anestesiaron ratas macho Sprague Dawley (~250-300 g) con pentobarbital sódico (50 mg/kg), se introdujo una cánula en la tráquea con tubo PE-205 para mantener la permeabilidad de las vías respiratorias y la temperatura se mantuvo a 37 °C con una placa quirúrgica calentada. Se hizo avanzar un catéter de presión de 1,4 F (Millar Inc., Houston, Texas) hacia la arteria carótida derecha para medir la presión arterial aórtica. Se introdujo una cánula en la vena yugular derecha con un tubo PE-50 para la administración de los artículos de ensayo. El riñón izquierdo quedó expuesto mediante una incisión retroperitoneal y se unió una sonda de flujo Doppler (Modelo 0,5 VB, Transonic System Inc., Ithaca, Nueva York) a la arteria renal izquierda para controlar el flujo sanguíneo. Se suplemento pentobarbital sódico (15 mg/kg, vía intraperitoneal) después de finalizar estos procedimientos quirúrgicos. Después de un equilibrio de 10-15 min, la relaxina se administró a 1 mg/kg por vía intravenosa en un volumen de dosificación de 0,15 a 1,82 ml/kg durante 30 segundos a través de una bomba de infusión (Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts). La tensión arterial, la frecuencia cardiaca y el flujo sanguíneo renal, se registraron continuamente durante 45 minutos después de la administración de relaxina, utilizando una unidad de acondicionamiento de ultraseñal MPVS de Millar conectada a un ordenador de mesa que ejecuta el software de adquisición de datos LabChart 7-Pro (ADInstruments, Dunedin, Nueva Zelanda) (Tabla 5).

Tabla 5. Cambios en el fluo san uíneo renal de rata abreviaturas como en la Tabla 3.

continuación

Los resultados tabulados anteriormente ilustran la compleja relación entre la estructura y la posición del conjugado y el flujo sanguíneo renal resultante. TS-RLX solo provocó un aumento de aproximadamente un 25 % en el flujo sanguíneo renal con respecto al valor inicial, que era lo esperado, dada la actividad vascular conocida de la relaxina. Se esperaba que los diversos compuestos de prueba, al ser agonistas de relaxina (ver Ejemplo 7), también debieran provocar un aumento en el flujo sanguíneo renal. Sorprendentemente, sin embargo, se observó que algunos de los compuestos provocaron disminuciones en el flujo sanguíneo renal. Tal alteración del flujo sanguíneo renal podría ser una contraindicación clínicamente significativa, especialmente en insuficiencia cardiaca, en la que a menudo se observa insuficiencia renal. Los compuestos BM25/AN1, BM25/AN1-C13-CH3, BM25/AN1- PEG36-C13-CH3, BM25/AN1- PEG36-Glu-C13-CH3, AQ1 y AQ1-Glu-C13-CH3 dieron como resultado un flujo sanguíneo renal deteriorado (Tabla 5, anterior).

Estos resultados fueron inesperados e impredecibles. Los compuestos estructuralmente relacionados presentaron efectos divergentes sobre el flujo sanguíneo renal. El LEVEMIR®, aprobado por la FDA, forma comercializada de insulina de acción prolongada para el tratamiento de la diabetes, es un conjugado insulina-C13-CH3 que ha demostrado seguridad (NDA 21-878 de Novo Nordisk A/S, página 1). En cambio, la administración de BM25/AN1-C13-CH3, que es estructuralmente similar a LEVEMIR®, resultó fatal en las ratas y la necropsia mostró riñones pálidos, lo que indica que se bloqueó el flujo sanguíneo renal. Además, la relaxina AQ1, que contiene una única sustitución de aminoácidos con para-acetil-fenilalanina en la posición 1 de la cadena A, disminuyó el flujo sanguíneo renal, al tiempo que el compuesto PEG-AQ1 20 kDa, que contiene la misma sustitución de aminoácidos no naturales pero que está conjugado con un PEG de 20 kDa, aumentó del flujo sanguíneo renal. Además, BM25/AN1-PEG36-Glu-C13-CH3 disminuyó el flujo sanguíneo renal, pero AQ1-PEG36-Glu-C13-CH3 aumentó el flujo sanguíneo renal. Varios de los compuestos anteriormente mencionados que causan una disminución del flujo sanguíneo renal, contenían un potenciador PK que termina en un grupo metilo, por ejemplo, BM25/AN1-C13-CH3, BM25/AN1-PEG36-C13-CH3 y AQ1-Glu-C13-CH3. Sin embargo, los animales tratados con AQ1-EEEGGG-GluY-C15-CH3 y AQ1-PEG36-Glu-C13-CH3 mostraron un buen flujo sanguíneo renal, lo que indica que el grupo metilo no siempre causaba un flujo sanguíneo renal deficiente. En cambio, AQ1-GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH y otras moléculas de relaxina AQ1 probadas conjugadas con un potenciador PK que comprende un componente peptídico y un ácido graso de -C13-COOH, -C14-COOH o -C15-COOH, generalmente mostraron una mejora en el flujo sanguíneo renal (Tabla 5, anterior).

Ejemplo 10: Estudios de toxicidad en ratas

Se dio AQ1-20kDa-PEG a las ratas mediante administración subcutánea en dosis de 1, 5 y 15 mg/kg/día durante 10 días. Después de la dosis final, se sacrificó a los animales, se diseccionaron y se realizó la histopatología renal. Se observaron vacuolas en las células epiteliales tubulares renales en todas las dosis (Fig. 7C). En cambio, no se observaron vacuolas en células epiteliales tubulares renales de ratas a las que se administró vehículo (Arg 150 mM en tampón citrato 10 mM, pH 5,5) por vía subcutánea durante 10 días (Fig. 7A).

Se dio AQ1-PEG36-Glu-C13-COOH a las ratas mediante administración subcutánea en dosis de 10 y 40 mg/kg/día durante 7 días. Después de la dosis final, se sacrificó a los animales, se diseccionaron y se realizó la histopatología renal. Se observaron vacuolas en células epiteliales tubulares renales en todas las dosis (Fig. 7B).

Se dio AQ1-GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139) -C14-COOH a las ratas mediante administración subcutánea en dosis de 5, 20 y 40 mg/kg/día durante 7 días. Después de la dosis final, se sacrificó a los animales, se diseccionaron y se realizó la histopatología renal. En todas las dosis, las células epiteliales tubulares renales parecieron normales sin evidencia de vacuolas relacionadas con el artículo de ensayo (Fig. 7D).

El compuesto AQ1-GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH también mostró buenos resultados de flujo sanguíneo renal (Ejemplo 9), perfil de solubilidad favorable (datos no mostrados) y viscosidad significativamente menor que AQ1-PEG 20 kDa.

Ejemplo 11: Efecto de la relaxina sobre fibroblastos cardiacos primarios humanos

Los fibroblastos cardiacos humanos primarios (NHCF-V) se adquirieron de Lonza, Fairlawn, Nueva Jersey (N.° de catálogo: CC-2904). Se aislaron células NHCF-V del ventrículo de tejido cardiaco normal adulto. Las células se tiñeron positivamente para la a-actina del músculo liso y expresaron > 90 % de colágeno I y < 10 % de factor VIII de von Willibrand. Las células en los pases 3 a 6 se utilizaron para los estudios cuantitativos de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR). Las células se cultivaron en FGM™-3 BulletKit™ (N.° de catálogo: CC-4526, Lonza) que contiene medio completo FBS al 10 %. En la confluencia, las células se dividieron y se cultivaron en placas de 6 pocillos a una densidad de 150.000/pocillo durante 24 h en medio completo. Posteriormente, las células se cambiaron a medio sin suero (N.° de catálogo: CC-3131, Fibroblast Basal Medium, Lonza) durante 24 h, a continuación, se trató con relaxina H2 humana (N.° de catálogo: 3596-RN, R&D Systems) o AQ1-GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH en presencia de 0,5 ng/ml de TGF-p (N.° de catálogo: 240-B, R&D Systems) durante otras 24 horas. La selección de las concentraciones de TGF-p para el perfilado y la duración del tratamiento se basó en informes previos. Las células se recogieron en placas de 6 pocillos para la extracción de ARN total y el análisis de qRT-PCR.

El ARN total se extrajo utilizando el kit RNeasy Mini (N.° de catálogo: 74106, Qiagen) de acuerdo con los protocolos del fabricante, incluida la eliminación en columna del ADNc genómico. La qRT-PCR en tiempo real se realizó en dos etapas; la síntesis de ADNc y la detección en tiempo real se llevaron a cabo en un ciclador térmico PTC-100 (MJ Research) y en un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700 (Applied Biosystems), respectivamente. Se utilizó TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) en reacciones de PCR posteriores de acuerdo con los protocolos del fabricante. Todas las reacciones qRT-PCR se realizaron por duplicado. Cebadores específicos de secuencia para alfa-actina del músculo liso (Sentido: 5'-AAATACTCTGTCTGGATCGGTGGCTCC-3' (Se Q ID NO:51); Antisentido: 5'-CACATAGGTAACGAGTCAGAGCTTTGGCTA-3' (SEQ ID NO:52)) y gen constitutivo L30 (Sentido: 5'-GCTGGAGTCGATCAACTCTAGG-3' (SEQ ID NO:53); Antisentido: 5'-CCAATTTCGCTTTGCCTTGTC-3' (SEQ ID NO:54)) se diseñaron usando el software Primer Express, versión 2 (Applied Biosystems) basado en secuencias publicadas (www.ncbi.nlm.nih.gov). Los niveles de expresión de alfa actina del músculo liso se normalizaron respecto a los niveles de expresión del gen constitutivo L30. Los fibroblastos cardiacos humanos tratados con AQ1-GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH se analizaron para detectar diferencias significativas de las células tratadas con vehículo utilizando una prueba t de Student (Microsoft Excel, versión 2013), considerando un valorp< 0,05 como significativo.

Se demostró que AQ1-GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH que reduce la expresión del gen alfa-actina de músculo liso profibrótico, en fibroblastos cardiacos humanos primarios tratados con TGF-beta (0,5 ng/ml; 24 h). Como se muestra en las Figs. 6A-6B, las disminuciones en la expresión genética resultaron dependientes de la concentración y fueron igualmente robustas tanto para la relaxina H2 humana como para AQ1-GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH. Puede utilizarse AQ1-GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH como agente antifibrótico para tratar enfermedades fibróticas, por ejemplo, fibrosis cardiaca.

Ejemplo 12: Ejemplos adicionales de potenciadores PK

Se producen potenciadores PK como se muestra en la Tabla 6 a continuación, en general, de acuerdo con los métodos descritos anteriormente en los Ejemplos 4, 5 y 6. Estos potenciadores PK se conjugan con polipéptidos de relaxina modificados que comprenden un aminoácido codificado de forma no natural (por ejemplo, en la posición 1 de la cadena A, tal como RLX-AQ1), usando los métodos descritos en el Ejemplo 3 y se caracterizan, incluyendo pruebas de actividad biológica, las propiedades farmacocinéticas, los efectos sobre el flujo sanguíneo renal, la formación de vacuolas y los efectos sobre los fibroblastos cardiacos, como se ha descrito en los Ejemplos 7-11.

Tabla 6. Potenciadores PK ilustrativos abreviaturas como en la Tabla 3 como se indica a continuación .

(continuación)

(continuación)

(continuación)

Los potenciadores PK que se muestran en la Tabla 7 a continuación se sintetizaron, generalmente, de acuerdo con los métodos descritos en los Ejemplos 3-5 del presente documento. Estos potenciadores PK se conjugan con polipéptidos de relaxina modificados que comprenden un aminoácido codificado de forma no natural (por ejemplo, en la posición 1 de la cadena A, tal como en RLX-AQ1), usando los métodos descritos en el Ejemplo 3 y se caracterizan, incluyendo pruebas de actividad biológica, las propiedades farmacocinéticas, los efectos sobre el flujo sanguíneo renal, la formación de vacuolas y los efectos sobre los fibroblastos cardiacos, como se ha descrito en los Ejemplos 7-11.

Tabla 7. Potenciadores PK ilustrativos (abreviaturas: N-MeK: 6-N-metillisina; Dap: ácido 2,3-diaminopropiónico; otros como en la Tabla 3.

continuación

Se entiende que los ejemplos y las realizaciones descritos en el presente documento tienen únicamente fines ilustrativos y que se sugerirán diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos a las personas normalmente versadas en la materia. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es con el fin de describir únicamente realizaciones ilustrativas y no se pretende que limite el alcance de la presente descripción, las cuales están limitadas únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido de relaxina modificado que comprende un aminoácido codificado de forma no natural, en donde: (a) el polipéptido de relaxina modificado comprende el polipéptido de cadena A de relaxina de la SEQ ID NO: 4 y el polipéptido de cadena B de relaxina de la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6, sustituido por un aminoácido codificado de forma no natural en el resto 1 de la cadena A y el polipéptido de relaxina modificado tiene 0, 1 o 2 sustituciones, inserciones y/o deleciones adicionales de aminoácidos en dicha cadena A de relaxina y/o cadena B de relaxina; (b) dicho aminoácido codificado de forma no natural tiene la estructura:

   en donde el grupo R es cualquier sustituyente distinto de la cadena lateral encontrada en la alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina o valina; (c) dicho aminoácido codificado de forma no natural está unido a un potenciador farmacocinético que comprende un componente peptídico de entre 2 y 30 aminoácidos y un resto prolongador de semivida; y (d) dicho componente peptídico comprende GGGGS-GluY (S<e>Q ID NO: 139), DRDD<r>D (SEQ ID NO: 102), KKKKKK-GluY (SEQ ID NO: 103), RGGEEKKKEKEK-GluY (SEQ ID NO: 104), GGGEEE-GluY (SEQ ID NO: 105), EEEGGG-GluY (SEQ ID NO: 106), KKKGGG-GluY (SEQ ID NO: 107), GGGKKK-GluY (SEQ ID NO: 109), GSHHHHHGS-GluY (SEQ ID NO: 110), Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-GluY (SEQ ID NO: 112), Sar-Sar-Sar-Glu-Glu-GluY (SEQ ID NO: 113) o KSGGSGG-GluY (Se Q ID NO: 117) o preferiblemente comprende GluY, más preferentemente comprende GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139); y en donde dicho polipéptido de relaxina modificado es biológicamente activo.
2. 2. El polipéptido de relaxina modificado de la reivindicación 1, en donde: (a) dicho polipéptido de la cadena A de relaxina comprende la SEQ ID NO: 4 sustituida por dicho aminoácido codificado de forma no natural en el resto 1 y que opcionalmente tiene una sustitución, inserción y/o deleción adicional de aminoácidos; (b) dicho polipéptido de cadena B de relaxina comprende la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6 que tiene opcionalmente una sustitución, inserción y/o deleción adicional de aminoácidos; o (c) dicho polipéptido de cadena A de relaxina comprende la SEQ ID NO: 4 sustituida por dicho aminoácido codificado de forma no natural en el resto 1 y dicho polipéptido de cadena B de relaxina comprende la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6.
3. 3. El polipéptido de relaxina modificado de la reivindicación 1 o 2, en donde: (a) dicho aminoácido codificado de forma no natural comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazida, un grupo hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino; (b) dicho aminoácido codificado de forma no natural comprende un derivado de fenilalanina; (c) dicho aminoácido codificado de forma no natural se selecciona de fenilalanina para-sustituida, orto-sustituida o meta-sustituida; (d) dicho aminoácido codificado de forma no natural se selecciona de fenilalanina para-sustituida, orto-sustituida o meta-sustituida que comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazida, un grupo hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino; o (e) dicho aminoácido codificado de forma no natural comprende para-acetil-L-fenilalanina.
4. 4. El polipéptido de relaxina modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde: (a) dicho aminoácido codificado de forma no natural está unido a dicho componente peptídico; o (b) dicho aminoácido codificado de forma no natural está unido a dicho potenciador farmacocinético a través de un enlace de oxima o de un enlace de triazol, preferentemente, un enlace de oxima.
5. 5. El polipéptido de relaxina modificado de la reivindicación 1, en donde: (a) dicho polipéptido de cadena A de relaxina comprende la SEQ ID NO: 4 sustituida por dicho aminoácido codificado de forma no natural en el resto 1 y que opcionalmente tiene una sustitución, inserción o deleción adicional de aminoácidos y dicho polipéptido de cadena B de relaxina comprende la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6 que tiene opcionalmente una sustitución, inserción o deleción adicional de aminoácidos; (b) dicho aminoácido codificado de forma no natural está unido a dicho potenciador farmacocinético a través de un enlace de oxima y el polipéptido de relaxina modificado comprende un polipéptido de cadena A de relaxina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a la SEQ ID NO: 35 y un polipéptido de cadena B de relaxina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a la SEQ ID NO: 5 o a la SEQ ID NO: 6; (c) dicho aminoácido codificado de forma no natural está unido a dicho potenciador farmacocinético a través de un enlace de oxima y el polipéptido de relaxina modificado comprende un polipéptido de cadena A de relaxina que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a la SEQ ID NO: 35 y un polipéptido de cadena B de relaxina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a la SEQ ID NO: 5 o a la SEQ ID NO: 6; (d) dicho aminoácido codificado de forma no natural está unido a dicho potenciador farmacocinético a través de un enlace de oxima y el polipéptido de relaxina modificado comprende un polipéptido de cadena A de relaxina que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a la SEQ ID NO: 35 y un polipéptido de cadena B de relaxina que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a la SEQ ID NO: 5 o a la SEQ ID NO: 6; o (e) dicho aminoácido codificado de forma no natural está unido a dicho potenciador farmacocinético a través de un enlace de oxima y el polipéptido de relaxina modificado comprende un polipéptido de cadena A de relaxina que comprende la SEQ ID NO: 35 y un polipéptido de cadena B de relaxina que comprende la SEQ ID NO: 5 o la<s>E<q>ID NO: 6.
6. 6. El polipéptido de relaxina modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde: (a) dicho componente peptídico comprende entre 2 y 25 aminoácidos; (b) dicho componente peptídico comprende entre 2 y 20 aminoácidos; (c) dicho componente peptídico comprende entre 3 y 10 aminoácidos; o (d) dicho componente peptídico comprende entre 4 y 8 aminoácidos.
7. 7. El polipéptido de relaxina aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho componente peptídico comprende GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139).
8. 8. El polipéptido de relaxina modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el polipéptido de relaxina comprende el polipéptido de cadena A de relaxina de la SEQ ID NO: 4 y el polipéptido de cadena B de relaxina de la SEQ<i>D NO: 5 o la SEQ ID NO: 6, sustituido por un aminoácido codificado de forma no natural en el resto 1 de la cadena A, en donde dicho aminoácido codificado de forma no natural está unido a dicho potenciador farmacocinético y dicho potenciador farmacocinético comprende el componente peptídico GGGGS-GluY (SEQ ID NO: 139).
9. 9. El polipéptido de relaxina modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde: (a) dicho resto prolongador de semivida comprende un ácido graso o un derivado del mismo, en donde el ácido graso o derivado del mismo está unido covalentemente al componente peptídico; (b) dicho resto prolongador de semivida comprende un ácido graso saturado o un derivado del mismo; (c) dicho resto prolongador de semivida comprende un ácido graso terminado con un ácido carboxílico; (d) dicho resto prolongador de semivida comprende un ácido graso de Fórmula I: -Cn-COOH (Fórmula I) en donde n está entre 10 y 18, en donde opcionalmente (i) n está entre 12 y 17; o (ii) n es 13, 14 o 15; (e) dicho resto prolongador de semivida comprende -C14-COOH; (f) dicho potenciador farmacocinético comprende:

   GGGGS-GluY-C14-COOH (Fórmula II) en donde el grupo aminooxi está unido al aminoácido codificado de forma no natural en dicho polipéptido de relaxina modificado; o (g) dicho resto prolongador de semivida se conjuga con dicho componente peptídico a través de un puente de amida.
10. 10. El polipéptido de relaxina modificado de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de relaxina comprende:

    en donde dicha AQ1-Relaxina comprende un polipéptido de cadena A de relaxina de la SEQ ID NO: 35 y un polipéptido de cadena B de relaxina de la SEQ ID NO: 6, en donde la para-acetil-L-fenilalanina modificada representada en la Fórmula III se sitúa en el extremo N terminal de dicho polipéptido de la cadena A de relaxina.
11. 11. El polipéptido de relaxina modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde: (a) dicho polipéptido de relaxina modificado es terapéuticamente eficaz para el tratamiento de una o más enfermedades o afecciones asociadas con la relaxina; (b) dicho polipéptido de relaxina modificado da como resultado una menor formación de vacuolas renales en comparación con AQ1-PEG 20 kDa; (c) dicho polipéptido de relaxina modificado da como resultado un deterioro nulo o disminuido de la función renal en comparación con AQ1-PEG 20 kDa, opcionalmente en donde dicha función renal se mide determinando una o más de la tasa de filtración glomerular estimada, aclaramiento de creatina, tasa de filtración glomerular de insulina o tasa de filtración glomerular isotópica; (d) dicho polipéptido de relaxina modificado no disminuye el flujo sanguíneo renal después de la administración, opcionalmente en donde dicho flujo sanguíneo renal se mide determinando el aclaramiento de para-aminohipurato; (e) dicho polipéptido de relaxina modificado es capaz de aumentar el flujo sanguíneo renal después de la administración, opcionalmente en donde dicho flujo sanguíneo renal se mide determinando el aclaramiento de para-aminohipurato; (f) dicho polipéptido de relaxina modificado presenta una semivida aumentada; y/o (g) dicha semividain vivose aumenta en al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces o al menos 50 veces.
12. 12. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de relaxina modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, que opcionalmente comprende una cantidad eficaz de un polipéptido de relaxina modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para el tratamiento de un trastorno asociado a la relaxina.
13. 13. Un polipéptido de relaxina modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o una composición de acuerdo con la reivindicación 12 para usar en un método para tratar una enfermedad asociada con relaxina en un/a paciente que lo necesita, opcionalmente en donde dicha enfermedad es: (a) una enfermedad cardiovascular, tal como la arteriopatía coronaria, ataque cardiaco, arritmia, insuficiencia cardiaca, miocardiopatía y enfermedad vascular; o (b) un síntoma de insuficiencia cardiaca, tal como insuficiencia cardiaca avanzada, síndrome cardio-renal, insuficiencia cardiaca con función renal deteriorada, insuficiencia cardiaca crónica, insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección de rango medio (HFmEF), insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca postaguda, insuficiencia cardiaca compensada, insuficiencia cardiaca descompensada, insuficiencia cardiaca derecha, insuficiencia cardiaca izquierda, insuficiencia cardiaca global, miocardiopatía isquémica, miocardiopatía dilatada, insuficiencia cardiaca asociada con defectos cardiacos congénitos, insuficiencia cardiaca asociada con defectos de las válvulas cardiacas, insuficiencia cardiaca asociada con defectos combinados de las válvulas cardiacas, insuficiencia cardiaca diabética, miocardiopatía alcohólica, insuficiencia cardiaca asociada con trastornos de almacenamiento cardiaco, insuficiencia cardiaca diastólica, insuficiencia cardiaca sistólica, remodelación posmiocárdica, insuficiencia cardiaca con fracción de eyección conservada (HFpEF), insuficiencia cardiaca con fracción de eyección reducida (HFrEF), angina de pecho, hipertensión, hipertensión pulmonar incluyendo hipertensión arterial pulmonar, preferentemente (i) insuficiencia cardiaca crónica, insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca postaguda, insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección reducida (HFrEF), insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección conservada (HFpEF), insuficiencia cardiaca crónica con fracción de eyección de rango medio (HFmEF), insuficiencia cardiaca diastólica, insuficiencia cardiaca sistólica, remodelación posmiocárdica, angina de pecho, hipertensión, hipertensión pulmonar e hipertensión arterial pulmonar; o (ii) insuficiencia cardiaca posaguda, insuficiencia cardiaca avanzada, síndrome cardio-renal e insuficiencia cardiaca con función renal deteriorada, en donde opcionalmente dicho método comprende además administrar en combinación, simultánea o secuencialmente, con dicho polipéptido de relaxina modificado, al menos un agente terapéutico adicional seleccionado de inhibidores de ACE, p-bloqueantes, diuréticos, antagonistas de los receptores de mineralocorticoides, moduladores del receptor de rianodina, activadores de SERCA2a, inhibidores de la renina, bloqueantes de los canales de calcio, agonistas del receptor de adenosina A1, agonistas del receptor de adenosina A1 parciales, inhibidores de dopamina p-hidroxilasa, antagonistas del receptor de angiotensina II, antagonistas del receptor de angiotensina II con agonismo sesgado para rutas de señalización celular seleccionadas, combinaciones de antagonistas del receptor de angiotensina II e inhibidores de la enzima neprilisina, inhibidores de la enzima neprilisina, activadores solubles de guanilato ciclasa, activadores de miosina ATPasa, inhibidores de rho-quinasa 1, inhibidores de rho-quinasa 2, agonistas del receptor de la apelina, compuestos donantes de nitroxilo, inhibidores de quinasa II dependientes de calcio, agentes antifibróticos, inhibidores de galectina-3, antagonistas del receptor de vasopresina, moduladores del receptor de FPR2, agonistas del receptor del péptido natriurético, bloqueadores del canal del receptor de potencial transitorio vanilloide tipo 4, agentes antiarrítmicos, bloqueadores de canales de "corriente rara" If, nitratos, compuestos digitálicos, agentes inotrópicos, agonistas de p-receptores, agentes de resellado de membrana celular, por ejemplo, poloxámero 188, agentes antihiperlipidémicos, agentes de elevación de HDL en plasma, agentes antihipercolesterolémicos, inhibidores de la biosíntesis del colesterol (tales como inhibidores de la HMG-CoA reductasa), agonista de LXR, agonista de FXR, probucol, raloxifeno, ácido nicotínico, niacinamida, inhibidores de la absorción del colesterol, secuestrantes de ácidos biliares, resinas de intercambio aniónico, aminas cuaternarias, colestiramina, colestipol, inductores del receptor de la lipoproteína de baja densidad, clofibrato, fenofibrato, bezafibrato, ciprofibrato, gemfibrizol, vitamina B6, vitamina B12, vitaminas antioxidantes, agentes antidiabéticos, inhibidores de la agregación plaquetaria, antagonistas del receptor de fibrinógeno, aspirina o derivados de ácido fíbrico, inhibidores de PCSK9, aspirina e inhibidores de P2Y12, tal como Clopidogrel.
14. 14. Un polipéptido de relaxina modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o una composición de acuerdo con la reivindicación 12 para usar en un método para tratar una enfermedad asociada con fibrosis en un/a paciente que lo necesita, opcionalmente en donde (a) dicha enfermedad asociada con fibrosis comprende fibrosis del corazón, pulmón, riñón, médula ósea o hígado, fibrosis dermatológica o un trastorno ocular fibrótico y/o (b) dicha enfermedad asociada con fibrosis se selecciona de fibrosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica (ENA), cirrosis, precirrosis, enfermedad pulmonar parenquimatosa difusa, fibrosis quística, fibrosis pulmonar, fibrosis masiva progresiva, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis por inyección, fibrosis renal, enfermedad renal crónica, enfermedad renal diabética, glomeruloesclerosis focal y segmentaria, nefropatía membranosa, nefropatía por IgA, mielofibrosis, insuficiencia cardiaca, insuficiencia cardiaca metabólica, fibrosis cardiaca, fibrosis de cataratas, cataratas, cicatrices oculares, fibrosis pancreática, fibrosis dérmica, fibrosis intestinal, estenosis intestinales, fibrosis endomiocárdica, fibrosis auricular, fibrosis mediastínica, enfermedad de Crohn, fibrosis retroperitoneal, queloide, fibrosis sistémica nefrógena, esclerodermia, esclerosis sistémica, artrofibrosis, síndrome de Peyronie, contractura de Dupuytren, neuropatía diabética, capsulitis adhesiva, esteatosis hepática alcohólica, hepatoesteatosis, hepatitis vírica, enfermedad biliar, hemocromatosis primaria, cirrosis relacionada con fármacos, cirrosis criptogénica, enfermedad de Wilson, deficiencia de alfa 1 -antitripsina, enfermedad pulmonar intersticial (EPI), enfermedad pulmonar fibrótica humana, degeneración macular, retinopatía retiniana, retinopatía vítrea, fibrosis miocárdica, oftalmopatía de Graves, ergotismo inducido por fármacos, enfermedad cardiovascular, aterosclerosis/reestenosis, cicatrices hipertróficas, mielofibrosis primaria o idiopática, enfermedad intestinal inflamatoria y colitis ulcerosa, en donde opcionalmente dicho método comprende además administrar en combinación, simultánea o secuencialmente, con dicho polipéptido de relaxina modificado, al menos un agente antifibrosis a dicho/a paciente, tal como nintedanib, Pirfenidona, antagonistas de LPA1, antagonistas de receptores de LPA1, análogos de GLP1, tralokinumab (IL-13, AstraZeneca), vismodegib (antagonista de hedgehog, Roche), PRM-151 (pentraxina-2, TGF beta-1, Promedior), SAR-156597 (Mab biespecífico IL-4 e IL-13, Sanofi), simtuzumab ((anticuerpo anti-lisil oxidasa tipo 2 (anti-LOXL2), Gilead), CKD-942, PTL-202 (PDE inh./pentoxifilina/NAc liberación control oral., Pacific Ther.), omipalisib (inhibidor oral de PI3K/mTOR, GSK), IW-001 (sol. oral mod. de colágeno bovino tipo V, ImmuneWorks), STX-100 (integrina alfa V/hormiga beta-6, Stromedix/Biogen), Actimmune (IFN gamma), PC-SOD (midismase; inhalada, LTT Bio-Pharma / CKD Pharm), lebrikizumab (mAb humanizado anti-IL-13 SC, Roche), AQX-1125 (activador de SHIP1, Aquinox), CC-539 (inhibidor de JNK, Celgene), FG-3019 (FibroGen), SAR-100842 (Sanofi) y ácido obeticólico (OCA o INT-747, Intercept).
15. 15. Un polipéptido de relaxina modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o una composición de acuerdo con la reivindicación 12 para usar en un método para tratar o prevenir la insuficiencia renal o mejorar, estabilizar o restaurar la función renal, en un/a paciente que lo necesita.
16. 16. Un método para fabricar un polipéptido de relaxina modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende: (a) proporcionar un polipéptido que comprende dicha cadena A de relaxina y dicha cadena B de relaxina, en donde dicho polipéptido comprende dicho aminoácido codificado de forma no natural; y (b) unir dicho aminoácido codificado de forma no natural a dicho potenciador farmacocinético, opcionalmente en donde: (i) dicho aminoácido codificado de forma no natural está unido a dicho potenciador farmacocinético mediante un enlace de oxima, tal como un enlace de oxima formado por la reacción de un grupo carbonilo y un grupo aminooxi, en donde opcionalmente dicho grupo carbonilo es un sustituyente de dicho aminoácido codificado de forma no natural y dicho grupo aminooxi es un constituyente de dicho potenciador farmacocinético o dicho grupo aminooxi es un sustituyente de dicho aminoácido codificado de forma no natural y dicho grupo carbonilo es un constituyente de dicho potenciador farmacocinético; y/o (ii) dicho aminoácido codificado de forma no natural se incorpora ribosómicamente en dicho polipéptido.