KR20080074924A - 생합성 폴리펩티드 융합 저해제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 변형된 생합성 폴리펩티드 융합 저해제, 이의 제조 방법 및 이의 용도를 제공한다.

Description

생합성 폴리펩티드 융합 저해제{BIOSYNTHETIC POLYPEPTIDE FUSION INHIBITORS}

본 발명은 막 융합 과정을 저해하며 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하거나 이를 사용하여 제조한 생합성 폴리펩티드 및 융합 단백질에 관한 것이다.

호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 파라믹소비리대(Paramyxoviridae) 과에 속한다. RSV는 유아, 성인 및 면역 손상 개체(이식 환자를 포함하나 이로 한정되지 않음)에서 저 호흡 감염의 주원인이다. 효과적인 치료법 또는 백신은 여전히 없다. RSV는 11종의 단백질을 코딩하는 단일 가닥 음성 센스 RNA 바이러스이고, 상기 단백질들 중 9종은 구조 단백질이며 2종은 바이러스 복제를 위한 조절 단백질이다. RSV는 2종의 주요 표면 당단백질, 바이러스가 숙주 수용체에 부착할 수 있게 하는 수용체 결합 단백질(G), 및 바이러스가 숙주 세포로 들어갈 수 있게 하는 융합(F) 단백질을 함유한다. 중성 pH에서 일어나는 RSV 외피의 융합은 감염된 세포와 방관자 비감염 세포 사이의 거대한 합포체(syncytia) 형성을 유도한다. F 단백질은 절단되어, F1 및 F2로 명명된 2개의 이황화 결합 폴리펩티드를 각각 C 말단 및 N 말단으로부터 발생시킨다. 바이러스 막과 숙주 세포 막 사이의 융합을 가능하게 하는 헤어핀 유사 구조의 삼량체를 형성하는 HR-C 및 HR-N으로 명명된 2개의 헵타드(heptad) 반복 서열이 상기 2개의 영역에 인접하여 존재한다. 상기 헵타드 영역은 HR-N에 결합하여 헤어핀 구조 형성 및 후속 융합을 방해하는 억제제 펩티드를 디자인하는 데 있어서 잠재적 표적이다. RSV 융합 과정은 HIV 융합 기작과 매우 유사하다.

두 독립적인 연구 라인이 RSV 도입을 저해하는 펩티드의 개발에 촛점을 두고 있다. HR-C 영역으로부터 유래된 펩티드는 HIV 융합을 차단하는 제품 푸제온(FUZEON)^®(Roche)과 개념적인 면에서 유사하다. 일반적인 음이온성 특징을 가진 펩티드 예컨대, GTPase RhoA로부터 유래된 펩티드도 RSV에 대한 항바이러스 활성을 나타낸다. 이 RhoA 유래 펩티드들은 명백히 바이러스 세포 표면 접촉을 저해하는 별도의 기작을 통해 작용한다.

펩티드는 연구 및 의료 분야에서 널리 사용되고 있고, 펩티드 생성물의 제조 및 성능에 대한 과제가 해결되기 때문에 펩티드의 중요성이 증가될 것이라고 예측할 수 있다. 치료 펩티드 예컨대, 본원에 기재된 펩티드는 생합성 폴리펩티드 융합 저해제(BPFI)로 지칭된다.

천연 펩티드 또는 그의 유사체가 치료에 사용되는 경우, 일반적으로 이들은 높은 분해 및/또는 제거 속도를 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 치료제의 높은 제거 속도는 장기간에 걸쳐 치료제의 혈중 농도를 유지하는 것이 바람직한 경우 불리한데, 이는 반복된 투여가 필요할 것이기 때문이다. 일부 경우, 적절한 약학 조성물을 적 용함으로써 펩티드의 방출 프로필에 영향을 줄 수 있지만, 이 방법은 다양한 단점을 가지며 일반적으로 적용될 수 없다.

펩티다제는 펩티드 내의 펩티드 결합 사이에 물 분자를 삽입함으로써 상기 펩티드 결합을 파괴한다. 일반적으로, 대부분의 펩티드는 수분 이내에 체내의 펩티다제에 의해 분해된다. 또한, 일부 펩티다제는 특정 유형의 펩티드들에 대해 특이적이기 때문에 이 펩티드들의 분해가 훨씬 더 빨라진다. 따라서, 펩티드가 치료제로서 사용되는 경우, 펩티드는 펩티다제의 작용으로 인해 체내에서 신속히 분해되기 때문에 그의 활성은 일반적으로 감소된다.

이 단점을 극복하기 위한 한 방법은 원하는 치료 펩티드의 일부가 분해되더라도 치료적으로 유효하기에 충분한 양의 펩티드가 잔존할 수 있도록 많은 투여량의 원하는 치료 펩티드를 환자에게 투여하는 것이다. 그러나, 이 방법은 환자에게 상당히 불편하다. 대부분의 치료 펩티드들이 경구 투여될 수 없기 때문에, 치료 펩티드가 일정하게 관주되거나, 정맥내 주사에 의해 자주 투여되거나, 또는 불편한 피하 주사 경로에 의해 자주 투여되어야 한다. 또한, 빈번한 투여의 필요는 많은 잠재적 펩티드 치료제에 대한 치료 과정 당 허용불가능한 정도의 높은 예산 비용을 초래한다. 상당량의 분해된 펩티드의 존재 또한 원치 않는 부작용을 발생시킬 수 있다.

PEG로 약칭되는 친수성 중합체 폴리(에틸렌 글리콜)의 공유 결합은 단백질, 펩티드 및 특히 소수성 분자를 비롯한 많은 생물학적 활성 분자들의 수용성, 생체이용성, 혈청 반감기 또는 치료 반감기를 증가시키거나, 면역원성 또는 생물학적 활성을 조절하거나, 순환 시간을 연장시키는 방법이다. PEG는 약학 분야, 및 인공 이식재(implant), 및 생체적합성, 독성의 결핍 및 면역원성의 결핍이 중요한 다른 분야에서 광범위하게 사용되고 있다. PEG의 원하는 성질을 최대화하기 위해, PEG 중합체, 또는 생물학적 활성 분자에 부착된 PEG 중합체의 총 분자량 및 수화 상태는, 모분자(parent molecule)의 생체활성(bioactivity)에 악영향을 주지 않으면서, PEG 중합체 부착과 전형적으로 관련되어 있는 유리한 특성 예컨대, 증가된 수용성 및 순환 반감기를 부여할 정도로 충분히 높아야 한다.

PEG 유도체는 라이신, 시스테인 및 히스티딘 잔기와 같은 반응성 화학 작용기, N-말단 및 탄수화물 부분(moiety)을 통해 생물학적 활성 분자에 종종 결합된다. 단백질 및 다른 분자들은 종종 중합체 부착에 이용가능한 한정된 수의 반응성 부위를 가진다. 종종, 중합체 부착을 통한 변형에 가장 적합한 부위는 수용체 결합에 있어서 중요한 역할을 하고 그 분자의 생물학적 활성의 보유를 위해 필수적이다. 그 결과, 생물학적 활성 분자 상의 이러한 반응성 부위에 중합체쇄가 무차별적으로 부착됨으로써 중합체 변형 분자의 생물학적 활성의 상당한 감소 또는 심지어 완전한 상실이 초래된다[R. Clark et al., (1996), J. Biol. Chem.. 271: 21969-21977]. 표적 분자에 원하는 이점을 부여하기에 충분한 중합체 분자량을 가진 접합체(conjugate)를 형성하기 위해, 선행 기술의 방법은 전형적으로 다수의 중합체 아암(arm)을 분자에 무작위적으로 부착시키는 단계를 포함함으로써 모 분자의 생체활성의 감소 또는 심지어 완전한 상실의 위험을 증가시킨다.

PEG 유도체가 단백질에 부착되기 위한 위치를 형성하는 반응성 부위는 단백 질의 구조에 의해 결정된다. 효소를 포함하는 단백질은 일반 구조 H₂N--CHR--COOH를 가지는 알파-아미노산의 다양한 서열로 구성된다. 하나의 아미노산의 알파 아미노 부분(H₂N--)은 인접 아미노산의 카르복시 부분(--COOH)에 연결되어 --(NH--CHR--CO)_n--로서 표시될 수 있는 아미드 결합을 형성하는데, 이때 아래첨자 "n"은 수백 또는 수천일 수 있고, R로 표시되는 단편은 단백질의 생물학적 활성 및 PEG 유도체의 부착을 위한 반응성 부위를 함유할 수 있다.

예를 들어, 아미노산 라이신의 경우, 알파 위치뿐만 아니라 엡실론 위치에서 --NH₂ 부분이 존재한다. 엡실론 --NH₂는 염기성 pH의 조건 하의 반응에 대해 자유롭다. PEG를 사용한 단백질 유도체화 분야에서 많은 기법이 단백질에 존재하는 라이신 잔기의 엡실론 --NH₂ 부분에 부착될 PEG 유도체의 개발에 관한 것이다("Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17). 그러나, 이 PEG 유도체들은 모두 그들이 단백질의 표면 상에 존재하는 아주 많은 라이신 잔기들 중에서 일부에만 선택적으로 부착될 수 없다는 공통된 한계를 가진다. 이는 예를 들어, 효소 활성 부위에 존재하는 라이신 잔기가 단백질 활성에 중요한 경우, 또는 수용체 결합 부위의 경우와 같이 라이신 잔기가 단백질과 다른 생물학적 분자의 상호작용을 매개하는 데 있어서 일정한 역할을 수행하는 경우 상당한 한계일 수 있다.

단백질 PEG화에 대한 기존 방법들의 두 번째로 동등하게 중요한 문제점은 PEG 유도체가 원하는 잔기들 외의 잔기와 원하지 않는 부반응을 할 수 있다는 점이다. 히스티딘은 --N(H)--로서 구조적으로 표시되는 반응성 이미노 부분을 함유하지만, 엡실론 --NH₂와 반응하는 많은 화학적 반응성 종 역시 --N(H)--와 반응할 수 있다. 유사하게, 아미노산 시스테인의 측쇄는 -SH로서 구조적으로 표시되는 자유 설프히드릴 기를 보유한다. 일부 경우, 라이신의 엡실론 --NH₂ 기에서 유도된 PEG 유도체는 시스테인, 히스티딘 또는 다른 잔기들과도 반응할 수 있다. 이는 PEG-유도체화 생체활성 분자의 복잡한 불균질 혼합물을 생성시킬 수 있고 표적이 되는 생체활성 분자의 활성을 파괴할 수 있다. 명확하고 예측가능한 단백질 표면 상의 특정 부위에서 생체활성 분자에 하나 이상의 PEG 중합체를 선택적으로 커플링시킬 수 있는 단백질 내의 단일 부위에 화학적 작용기가 도입될 수 있게 하는 PEG 유도체를 개발하는 것이 바람직하다.

라이신 잔기 이외에, 당업계에서 시스테인, 히스티딘 및 N-말단을 비롯한 다른 아미노산 측쇄를 표적화하는 활성화된 PEG 시약의 개발을 위해 상당히 노력하고 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,610,281호 및 문헌["Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17]을 참조한다. 시스테인 잔기는 부위 지정 돌연변이유발 및 당업계에 공지된 다른 기법들을 이용하여 단백질의 구조 내로 부위 선택적으로 도입될 수 있고, 생성된 자유 설프히드릴 부분은 티올-반응성 작용기를 보유하는 PEG 유도체와 반응할 수 있다. 그러나, 이 방법은 자유 설프 히드릴 기의 도입이 생성된 단백질의 발현, 폴딩(folding) 및 안정성을 복잡하게 할 수 있다는 점에서 문제가 있다. 따라서, 설프히드릴, 및 단백질에서 전형적으로 발견되는 다른 화학적 작용기들과 상용가능하면서 (즉, 원하지 않는 부반응에 참여하지 않으면서) 동시에 하나 이상의 PEG 중합체를 단백질에 선택적으로 커플링시킬 수 있는 생체활성 분자 내로 화학적 작용기를 도입하는 수단을 가지는 것이 바람직하다.

당업계의 샘플링으로부터 알 수 있는 바와 같이, 단백질의 측쇄, 특히 라이신 아미노산 측쇄 상의 --NH₂ 부분 및 시스테인 측쇄 상의 -SH 부분에 부착시키기 위해 개발된 이들 유도체들의 대다수는 이들의 합성 및 사용에 있어서 문제점이 있는 것으로 입증되었다. 일부 유도체들은 혈류와 같은 수성 환경에서 가수분해되어 분해되거나, 질이 저하되거나 아니면 불안정한 단백질과의 불안정한 결합을 형성한다. 일부 유도체들은 보다 안정한 결합을 형성하지만, 결합이 형성되기 전에 가수분해되는데, 이는 PEG 유도체 상의 반응성 기가 단백질이 부착될 수 있기 전에 불활성화될 수 있다는 것을 의미한다. 일부 유도체들은 다소 독성을 나타내므로 생채 내에서 사용하기에 덜 적합하다. 일부 유도체들은 실용적으로 유용하기에는 너무 느리게 반응한다. 일부 유도체들은 단백질의 활성을 책임지는 부위에 부착함으로써 단백질의 활성을 상실시킨다. 일부 유도체들은 이들이 부착될 부위에 대해 특이적이지 않기 때문에 원하는 활성을 상실할 수도 있고 결과의 재현가능성이 없다. 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 사용한 단백질의 변형과 관련된 문제점을 극복하기 위 해, 보다 안정하거나(예를 들어, 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,602,498호), 분자 상의 티올 잔기 또는 표면과 선택적으로 반응하는 PEG 유도체가 개발되었다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,610,281호). 안정한 화학 결합을 형성하도록 선택적으로 반응될 것이 요구될 때까지 생리학적 환경에서 화학적으로 불활성을 나타내는 PEG 유도체가 당업계에서 명백히 필요하다.

최근, 단백질의 부위 특이적 변형과 관련된 한계의 대부분을 극복할 것이라고 기대되는 완전히 새로운 기술이 단백질 과학에서 보고된 바 있다. 구체적으로, 생체내에서 비유전적으로 코딩된 아미노산을 단백질 내로 도입할 수 있는, 원핵생물 대장균(이. 콜라이(E. coli))[예를 들어, 문헌(L. Wang, et al., (2001), Science 292: 498-500)] 및 진핵생물 사카로마이세스 세레비지애(에스. 세레비지애(S. cerevisiae))[예를 들어, 문헌(J. Chin et al., Science 301: 964-7 (2003)]의 단백질 생합성 기구(machinery)에 새로운 성분들을 첨가한다. 광친화성 표지 및 광이성질체화가능한 아미노산, 케토 아미노산 및 글리코실화된 아미노산을 비롯하여 신규 화학적, 물리적 또는 생물학적 성질을 가진 다수의 새로운 아미노산이 이 방법에 의해 앰버(amber) 코돈인 TAG에 반응하여 이. 콜라이 및 효모에서 높은 신뢰도로 효율적으로 단백질 내로 도입되었다. 예를 들어, 문헌[J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124: 9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11): 1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99: 11020-11024; and, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1: 1-11]을 참조한다. 이 연구들은, 단백질에서 발견되지 않으며 유전적으로 코딩된 20종의 일반 아미노산(common amino acid)에서 발견된 모든 작용기에 대해 화학적 불활성을 나타내고 효율적 및 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하는 데 사용될 수 있는 화학적 작용기 예컨대, 케톤 기, 알킨 기 및 아지드 부분을 선택적 및 통상적으로 도입할 수 있다는 것을 입증하였다.

비유전적으로 코딩된 아미노산을 단백질 내로 도입하는 능력은 천연-발생 작용기 예컨대, 라이신의 엡실론 -NH₂, 시스테인의 설프히드릴 -SH, 히스티딘의 이미노 기 등에 대한 귀중한 대안을 제공할 수 있는 화학적 작용기의 도입을 허용한다. 일부 화학적 작용기는 유전적으로 코딩된 20종의 일반 아미노산에서 발견된 작용기에 대해 불활성을 나타내지만 명백히 효율적으로 반응하여 안정한 결합을 형성하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 아지드 및 아세틸렌 기는 촉매량의 구리의 존재 하에 수성 조건에서 휘스겐(Huisgen)[3 + 2] 시클로부가(cycloaddition) 반응에 참여하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67: 3057-3064; and, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596-2599]을 참조한다. 예를 들어, 당업자는 아지드 부분을 단백질 구조 내로 도입함으로써, 단백질에서 발견된 아민, 설프히드릴, 카르복실산, 히드록실 기에 대해 화학적 불활성을 나타내지만 아세틸렌 부분과 원활히 효율적으로 반응하여 시클로부가 생성물을 형성하는 작용기를 도입할 수 있다. 중요하 게는, 아세틸렌 부분의 부재 하에, 아지드는 다른 단백질 측쇄의 존재 및 생리학적 조건 하에 화학적 불활성을 나타내며 반응되지 않은 상태로 남아있다.

본 발명은, 특히 BPFI의 활성 및 제조와 관련된 문제점을 다루고, 개선된 생물학적 또는 약리학적 성질 예컨대, 개선된 치료 반감기를 가진 BPFI의 제조를 다룬다.

발명의 개요

본 발명은 HR-C 유래 펩티드의 개선된 나선형 성향을 가진 RSV 도입 저해제를 제공한다. 또한, 본 발명은 융합 저해제의 활성과 음이온성 펩티드 활성을 겸비하는 RSV 도입 저해제를 제공한다. 또한, 본 발명은 펩티드의 약리학적 성질을 개선시키는 부위 특이적 PEG화를 가진 BPFI를 제공한다. 본 발명은 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 막 융합 저해 펩티드 및 음이온성 펩티드를 포함하나 이들로 한정되지 않는 생합성 펩티드 융합 저해제(BPFI)를 제공한다. 치료 활성을 가진 임의의 BPFI, 이의 단편, 이의 유사체 또는 이의 변이체가 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 BPFI의 수많은 예가 제공된다. 그러나, 제공된 목록은 전부가 아니며, 본 발명에서 사용될 수 있는 BPFI의 수 또는 종류를 어떠한 방식으로든 한정하지 않는다. 따라서, 신규 BPFI를 비롯한 임의의 BPFI로부터 제조된 임의의 BPFI 및/또는 단편, 유사체 및 변이체는 본 발명에 따라 변형될 수 있고 치료적으로 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, BPFI는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI는 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 결합된다. 일부 실시 양태에서, BPFI는 이작용성 중합체, 이작용성 링커, 또는 하나 이상의 추가 BPFI에 결합된다.

일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 이작용성 중합체이다. 일부 실시양태에서, 이작용성 중합체는 제2 폴리펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 BPFI이다.

일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 링커를 통해 수용성 중합체에 결합되거나 수용성 중합체에 직접 결합된다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 생분해성 링커를 통해 수용성 중합체에 결합된다. 일부 실시양태에서, 생분해성 링커는 BPFI를 포함하는 프로드러그를 형성하는 데 사용될 수 있다. 이 프로드러그 방법의 일례에서, 수용성 중합체는 BPFI 활성을 차단하고, 링커의 분해는 활성 BPFI를 방출시킨다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 아실 잔기 또는 아실 쇄에 결합된다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 링커에 의해 아실 잔기 또는 아실 쇄에 결합된다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 폴리(에틸렌 글리콜) 링커 또는 프로드러그에 의해 아실 잔기 또는 아실 쇄에 결합된다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 혈청 알부민에 결합된다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 링커에 의해 혈청 알부민에 결합된다. 일부 실시양태에서, 상기 링커는 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 프로드러그이다. 일부 실시양태에서, 링커는 2단계 절단 프로드러그이고, 이때 단계 1은 알부민과 같은 분자의 조절 방출이고, 단계 2는 링커 또는 이의 일부를 방출시키는 제2 절단이다.

일부 실시양태에서, BPFI는 BPFI에 존재하는 2개의 아미노산 사이의 분자내 가교(bridge)를 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI는 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 2개의 가교된 잔기들 중 하나는 비-천연적으로 코딩된 아미노산 또는 천연적으로 코딩된 아미노산일 수 있다. 비-천연 아미노산은 링커, 중합체 또는 생물 활성 분자에 의해 연결될 수 있다.

일부 실시양태에서, BPFI는 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 포함하는 수용성 중합체에 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산은 비-천연적으로 코딩된 아미노산이다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 BPFI 예컨대, HR-C, HR-N 또는 음이온성 펩티드, 임의의 하나 이상의 이들 펩티드의 융합체, 또는 임의의 하나 이상의 이들 펩티드의 단편 내의 임의의 위치, (아미노 말단의) 첫 번재 아미노산 앞에, 카르복시 말단에서의 부가 또는 이들의 임의의 조합에서 도입된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 BPFI의 아미노산 서열 내의 임의의 위치에서 도입된다.

일부 실시양태에서, 이 위치들 중 하나 이상의 위치에 있는 비-천연 발생 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 BPFI 폴리펩티드는 길항제를 제공하는 BPFI 서열에 인접한 하나 이상의 아미노산 위치 또는 상기 서열 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 하나 이상의 비-천연 발생 아미노산을 포함한다.

일부 실시양태에서, BPFI는 단백질, 폴리펩티드, 소분자, 지질 또는 핵산을 포함하는 이들로 한정되지 않는 BPFI 수용체 또는 결합 파트너에 대한 BPFI의 친화성을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI는 치환, 부가 또는 결실을 갖지 않는 상응하는 BPFI의 안정성에 비해 BPFI의 안정성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI는 치환, 부가 또는 결실을 갖지 않는 상응하는 BPFI의 면역원성에 비해 BPFI의 면역원성을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI는 치환, 부가 또는 결실을 갖지 않는 상응하는 BPFI의 혈청 반감기 또는 순환 시간에 비해 BPFI의 혈청 반감기 또는 순환 시간을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.

일부 실시양태에서, BPFI는 치환, 부가 또는 결실을 갖지 않는 상응하는 BPFI의 수용성에 비해 BPFI의 수용성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI는 치환, 부가 또는 결실을 갖지 않는 상응하는 BPFI의 가용성에 비해 숙주 세포에서 생성된 BPFI의 가용성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI는 치환, 부가 또는 결실을 갖지 않는 상응하는 BPFI의 발현 또는 합성에 비해 숙주 세포에서의 BPFI의 발현을 증가시키거나 시험관내에서의 합성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI는 치환, 부가 또는 결실을 갖지 않는 상응하는 BPFI의 펩티다제 또는 단백질분해효소(protease) 감수성에 비해 BPFI의 펩티다제 또는 단백질 분해효소 감수성을 감소시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI는 치환, 부가 또는 결실을 갖지 않는 상응하는 BPFI의 활성에 비해 BPFI 수용체 또는 결합 파트너의 신호 전달도입 활성을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI는 치환, 부가 또는 결실을 갖지 않는 상응하는 BPFI의 결합에 비해 수용체와 같은 또 다른 분자와 BPFI의 결합을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI는 치환, 부가 또는 결실을 갖지 않는 상응하는 BPFI의 결합 후 결합 파트너의 입체구조 또는 생물학적 활성에 비해 그의 결합 파트너의 입체구조 또는 1종 이상의 생물학적 활성을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.

일부 실시양태에서, BPFI 내의 아미노산 치환은 천연 발생 또는 비-천연 발생 아미노산으로의 치환일 수 있되, 하나 이상의 치환이 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로의 치환이어야 한다.

일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기, 아미노옥시 기, 히드라진 기, 히드라지드 기, 세미카르바지드 기, 아지드 기 또는 알킨 기를 포함한다.

일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 하기 화학식으로 표시된다:

상기 식에서,

n은 0 내지 10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이고; R₂는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이며; R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고; R₄는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다.

일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 아미노옥시 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 히드라지드 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 히드라진 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 세미카르바지드 기를 포함한다.

일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 아지드 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 하기 화학식으로 표시된다:

상기 식에서,

n은 0 내지 10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고; X는 O, N 또는 S이거나, 존재하지 않으며; m은 0 내지 10이고; R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고; R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다.

일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 알킨 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 하기 화학식으로 표시된다:

상기 식에서,

n은 0 내지 10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이며; X는 O, N 또는 S이거나, 존재하지 않으며; m은 0 내지 10이고; R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고; R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 BPFI 작용제, 불완전 작용제, 길항제, 불완전 길항제, 또는 역(inverse) 작용제이다. 일부 실시양태에서, BPFI 작용제, 불완전 작용제, 길항제, 불완전 길항제 또는 역 작용제는 수용성 중합체에 결합된 비 -천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI 작용제, 불완전 작용제, 길항제, 불완전 길항제 또는 역 작용제는 비-천연적으로 코딩된 아미노산, 및 하나 이상의 번역 후 변형, 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 결합된 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 BPFI의 수용체 결합 영역 내에 존재하거나 BPFI의 수용체 결합을 방해한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 결합된 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 결합 파트너에 결합하거나 BPFI와 결합 파트너의 결합을 방해하는 BPFI의 영역 내에 존재한다.

또한, 본 발명은 엄격한(stringent) 조건 하에 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화하며 하나 이상의 셀렉터 코돈(selector codon)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된(isolated) 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 셀렉터 코돈은 앰버(amber) 코돈, 오커(ochre) 코돈, 오팔(opal) 코돈, 특이(unique) 코돈, 희귀(rare) 코돈 및 4-염기 코돈으로 구성된 군으로부터 선택되는다.

또한, 본 발명은 수용성 중합체에 결합된 BPFI를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 단리된 BPFI를, 비-천연적으로 코딩된 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 수용성 중합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI 내로 도입된 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산들 중 임의의 아미노산에 대해 달리 반응성을 나타내지 않는 수용성 중합체에 대해 반응성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, BPFI 내로 도입된 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산 중 임의의 아미노산에 대해 달리 반응성을 나타내지 않는 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 대해 반응성을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 결합된 BPFI는 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 BPFI를, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조한다. 일부 실시양태에서, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 결합된다.

일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 결합된 BPFI는 카르보닐 기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기를 포함하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 반응시킴으로써 제조한다.

일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 결합된 BPFI는 알킨 함유 아미노산을 포함하는 BPFI를, 아지드 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조한다. 일부 실시양태에서, 아지드 또는 알킨 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 결합된다.

일부 실시양태에서, 수용성 중합체에 결합된 BPFI는 아지드 함유 아미노산을 포함하는 BPFI를, 알킨 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조한다. 일부 실시양태에서, 아지드 또는 알킨 기는 아미드 결합을 통해 폴 리(에틸렌 글리콜) 분자에 결합된다.

일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자의 분자량은 약 0.1 내지 약 100 kDa이다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자의 분자량은 0.1 kDa 내지 50 kDa이다.

일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지형(branch) 중합체이다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분지형 중합체의 분지 각각의 분자량은 1 kDa 내지 100 kDa, 또는 1 kDa 내지 50 kDa이다.

일부 실시양태에서, BPFI에 결합된 수용성 중합체는 폴리알킬렌 글리콜 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI 내로 도입된 비-천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 카르보닐 기, 아미노옥시 기, 히드라지드 기, 히드라진, 세미카르바지드 기, 아지드 기 또는 알킨 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI 내로 도입된 비-천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 카르보닐 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 아미노옥시, 히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI 내로 도입된 비-천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 알킨 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 아지드 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI 내로 도입된 비-천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 아지드 부분을 포함하고 수용성 중합체는 알킨 부분을 포함한다.

또한, 본 발명은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합된다.

또한, 본 발명은 셀렉터 코돈을 포함하는 BPFI를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 BPFI 내로 치환시키기 위한 오르토고날(orthogonal) RNA 합성효소 및/또는 오르토고날 tRNA를 포함한다.

또한, 본 발명은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 BPFI, 오르토고날 RNA 합성효소 및/또는 오르토고날 tRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 세포를 BPFI의 발현이 허용되는 조건 하에 배양하는 단계; 및 상기 세포 및/또는 배양 배지로부터 BPFI를 정제하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 BPFI의 치료 반감기, 혈청 반감기 또는 순환 시간을 증가시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 BPFI의 면역원성을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법들은 천연 발생 BPFI에서 하나 이상의 임의의 아미노산을 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시키는 단계, 및/또는 BPFI를 링커, 중합체, 수용성 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 결합시키는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 유효량의 본 발명의 BPFI 분자를 사용한 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 결합되어 있다.

본 발명은 하나 이상의 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 BPFI를 제공하는데, 이때 상기 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자는 리보좀(ribosome)에 의해 폴리펩티드 내로 도입된 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 작용기를 통해 폴리펩티드에 부착된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 단일PEG화되어 있다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 부착된 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 BPFI를 제공하는데, 이때 상기 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 리보좀에 의해 소정의 부위에서 폴리펩티드 내로 도입된다.

또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 발생 아미노산을 포함하는 BPFI와, PEG를 포함하나 이로 한정되지 않는 또 다른 분자의 접합(conjugation)은 비-천연 아미노산과의 접합에 이용되는 독특한 화학 반응으로 인해 실질적으로 정제된 BPFI를 제공한다. 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI와 또 다른 분자 예컨대, PEG의 접합은 접합 단계 전에 또는 후에 수행되는 다른 정제 기법과 함께 수행하여 실질적으로 순수한 BPFI를 제공할 수 있다.

도 1 - T20 및 TEX의 클로닝이 나타나 있다.

도 2 - BPFI의 제조 개요가 나타나 있다.

도 3 - TEX의 나선형 분석이 나타나 있다.

도 4 - 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 셀렉터 코돈의 억제가 나타나 있다.

도 5 - BPFI를 제공하는, CNBr에 의한 펩티드의 절단이 나타나 있다.

도 6 - BPFI 활성 분석이 나타나 있다.

도 7의 패널 A 및 패널 B - 바이러스 감염의 BPFI 저해가 나타나 있다.

도 8 - BPFI와 PEG의 접합이 나타나 있다.

도 9 - 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 T-20 및 TEX 내로 도입하기 위한 구성체(construct)가 나타나 있다(도 9, 패널 A). 도 9의 패널 B는 CNBr 절단 전 및 후의 T-20 폴리펩티드를 보여준다.

도 10 - 야생형 T-20 서열과 TEX 서열의 비교가 도 10에 나타나 있고, 앰버 코돈으로 치환된 코돈에 의해 코딩된 잔기들이 별표로 표시되어 있다.

도 11 - T-20 및 TEX 항바이러스 활성을 시험하기 위한 시험관내 융합 분석이 나타나 있다.

도 12의 패널 A 및 패널 B - T20 651 억제(도 12, 패널 A) 및 TEX 636 억제(도 12, 패널 B)의 쿠마시 염색 폴리아크릴아미드 겔이 나타나 있다. 패널 A 및 B에 나타낸 샘플의 웨스턴(항-His)은 도 12의 패널 C 및 D에 나타나 있다. 도 12의 패널 E는 T-20(T-20-Mut651) 및 TEX(TEX-Mut636)에서 별표로 표시된 p-아세틸-페닐알라닌으로 치환된 잔기를 보여준다.

도 13 - 펩티드 융합 저해제를 가진 RSV F 단백질이 도식적으로 나타나 있다.

정의

본 발명이 본 명세서에 기재된 특정한 방법, 프로토콜, 세포주, 구성체 및 시약으로 한정되지 않으므로 다양할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이지 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니고 본 발명의 범위는 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한되어야 함을 이해할 것이다.

본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태의 용어는 그 문맥에서 명백히 달리 명시되지 않는 한 복수 형태에 대한 언급도 포함한다. 따라서, 예를 들어, "BPFI"에 대한 언급은 하나 이상의 BPFI 폴리펩티드에 대한 언급이고 당업계에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 그의 균등물 등을 포함한다.

달리 정의되어 있지 않은 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법, 장치 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용할 수 있다 하더라도, 바람직한 방법, 장치 및 재료가 이하에서 기재된다.

본 명세서에서 언급된 모든 문헌 및 특허는 예를 들어, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는, 문헌에 기재된 구성체 및 방법을 기술하고 개시하기 위해 참고로 본 명세서에 도입된다. 본 명세서에서 논의된 문헌들은 본원의 출원일 전 이들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본 명세서에서 어떠한 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시내용을 예상할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

"BPFI"는 셀렉터 코돈을 가진 mRNA로부터 생성된, 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산 잔기들로 이루어진 중합체를 지칭한다. BPFI는 HR-C, HR-N 및 음이온성 펩티드를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. BPFI는 약 100개 아미노산 길이보다 더 긴 중합체의 단편일 수 있고 추가 아미노산 예컨대, 리더 서열 또는 분비 신호 서열(이들로 한정되지 않음)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. BPFI는 HR-C 영역의 단편, HR-N 영역의 단편, 또는 음이온성 펩티드의 단편 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 펩티드를 포함한다. 또한, BPFI는 하나 이상의 HR-C 유래 펩티드 및 음이온성 펩티드를 포함하는 이종이량체 또는 다량체 펩티드를 포함한다. BPFI 분자는 융합체를 포함한다. 이러한 융합체는 RhoA 펩티드 ---아미노산 링커---HR-C 펩티드; HR-C 펩티드---아미노산 링커---RhoA 펩티드를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 스페이서는 크기 면에서 다양할 수 있고 Gly-Ser 링커를 포함하나 이로 한정되지 않는다. 링커 자체가 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유할 수 있다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 중합체, 생물학적 활성 분자, PEG 또는 다른 화학적 링커를 포함하나 이들로 한정되지 않는 분자의 부착을 위한 RhoA 펩티드 또는 HR-C 펩티드에서 치환될 수 있다. 링커는 RhoA 펩티드와 HR-C 펩티드를 결합시키는 T 형태일 수 있을 뿐만 아니라, 중합체, 생물학적 활성 분자, PEG 또는 다른 화학적 링커를 포함하나 이들로 한정되지 않는 분자에 대한 부착점 자체를 제공할 수도 있다.

"폴리펩티드"에 대한 설명은 "펩티드"에 대한 설명과 동일하게 적용되고, 반대의 경우도 성립한다. 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-천연적으로 코딩된 아미노산인 아미노산 중합체뿐만 아니라 천 연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. 당업자는 단백질에 대한 기법 및 변형이 폴리펩티드, 펩티드 및 이에 따라 BPFI에 적용될 수 있음을 이해할 것이다.

용어 "실질적으로 정제된"은 천연 발생 환경 즉, 천연 세포에서 발견된 성분들로서 BPFI 단백질과 함께 발견된 성분들, 또는 재조합 제조된 BPFI의 경우 숙주 세포에서 발견된 성분들이 일반적으로 동반되지 않거나 상기 단백질과 상호작용하는 성분들이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 BPFI를 말한다. 세포 유래의 물질을 실질적으로 갖지 않을 수 있는 BPFI에는 (건조 중량 기준으로) 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만의 오염 단백질을 갖는 단백질 제제가 포함된다. BPFI 또는 이의 변이체가 숙주 세포에 의해 재조합 제조되는 경우, 상기 단백질은 세포의 건조 중량을 기준으로 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1% 미만으로 존재할 수 있다. BPFI 또는 이의 변이체가 숙주 세포에 의해 재조합 제조되는 경우, 상기 단백질은 세포의 건조 중량을 기준으로 약 5 g/ℓ, 약 4 g/ℓ, 약 3 g/ℓ, 약 2 g/ℓ, 약 1 g/ℓ, 약 750 mg/ℓ, 약 500 mg/ℓ, 약 250 mg/ℓ, 약 100 mg/ℓ, 약 50 mg/ℓ, 약 10 mg/ℓ 또는 약 1 mg/ℓ 미만으로 배양 배지 중에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 "실질적으로 정제된" BPFI의 순도는 SDS-PAGE 분석, RP-HPLC, SEC 및 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)과 같은 적절한 방법에 의한 측정 시 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상 또는 약 70% 이상, 구체적으로, 약 75%, 80% 또는 85% 이상, 보다 구체적으로, 약 90% 이상, 약 95% 이상 또는 약 99% 이상일 수 있다.

"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는 삽입에 이용된 방법 예를 들어, 직접 섭취(uptake), 형질도입, f-교배(mating), 또는 재조합 숙주 세포를 만들기 위한 당업계에 공지된 다른 방법과 관계없이 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 말한다. 상기 외인성 폴리뉴클레오티드는 비삽입(nonintegrated) 벡터 예를 들어, 플라스미드로서 유지될 수 있거나, 숙주 게놈 내로 삽입될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "배지"는 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진핵 숙주 세포, 포유동물 숙주 세포, CHO 세포 또는 이. 콜라이를 포함하는 임의의 숙주 세포 및 세포 내용물을 지지할 수 있거나 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함한다. 따라서, 상기 용어는 숙주 세포가 증식되어 있는 배지 예를 들어, 증식 단계 전 또는 후의 배지를 비롯한, BPFI가 분비되어 있는 배지를 포함할 수 있다. 또한, 상기 용어는 BPFI가 세포 내에서 생성되고 숙주 세포가 용해되거나 파괴되어 BPFI를 방출하는 경우에서와 같이 숙주 세포 용해물을 함유하는 완충제 또는 시약을 포함할 수 있다.

단백질 리폴딩(refolding)에 대하여 본 명세서에서 사용된 "환원제"는 환원된 상태에서 설프히드릴 기를 유지하고 분자내 또는 분자간 이황화 결합을 환원시키는 임의의 화합물 또는 물질로서 정의된다. 적절한 환원제에는 디티오쓰레이톨(DTT), 2-머캡토에탄올, 디티오에리쓰리톨, 시스테인, 시스테아민(2-아미노에탄 티올) 및 환원된 글루타치온을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 매우 다양한 환원제가 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기에 적합하다는 것이 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 명백히 자명하다.

단백질 리폴딩에 대하여 본 명세서에서 사용된 "산화제"는 산화될 화합물로부터 전자를 제거할 수 있는 임의의 화합물 또는 물질로서 정의된다. 적절한 산화제는 산화된 글루타치온, 시스틴, 시스타민, 산화된 디티오쓰레이톨, 산화된 에리쓰레이톨 및 산소를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 매우 다양한 산화제가 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다는 것이 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 명백히 자명하다.

본 발명에서 사용된 "변성화제(denaturing agent)" 또는 "변성제(denaturant)"는 폴리펩티드의 가역적 언폴딩(unfolding)을 야기할 임의의 화합물 또는 물질로서 정의된다. 변성화제 또는 변성제의 강도는 구체적인 변성화제 또는 변성제의 성질 및 농도 둘다에 의해 결정될 것이다. 적절한 변성화제 또는 변성제는 카오트로프(chaotrope), 세제, 유기 용매, 수 혼화성 용매, 인지질, 또는 둘 이상의 상기 물질들의 조합물일 수 있다. 적절한 카오트로프에는 우레아, 구아니딘 및 소듐 티오시아네이트가 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 유용한 세제에는 소듐 도데실 설페이트, 폴리옥시에틸렌 에테르(예컨대, 트윈 또는 트리톤 세제), 사르코실(Sarkosyl)과 같은 강한 세제, 약한 비-이온성 세제(예컨대, 디지토닌), 약한 양이온성 세제 예컨대, N->2,3-(디올레이옥시(Dioleyoxy))-프로필-N,N,N-트리메틸암모늄, 약한 이온성 세제(예컨대, 소듐 콜레이트 또는 소듐 데옥시콜레이트), 또는 설포베테인(쯔비터전트), 3-(3-클로르아미도프로필)디메틸암모니오-1-프로판 설페이트(CHAPS) 및 3-(3-클로로아미도프로필)디메틸암모니오-2-히드록시-1-프로판 설포네이트(CHAPSO)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 쯔비터이온성 세제가 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 유기 수 혼화성 용매 예컨대, 아세토니트릴, 저급 알칸올(특히, C₂-C₄ 알칸올 예컨대, 에탄올 또는 이소프로판올), 또는 저급 알칸디올(특히, C₂-C₄ 알칸디올 예컨대, 에틸렌-글리콜)을 변성제로서 사용할 수 있다. 본 발명에서 유용한 인지질은 천연 발생 인지질 예컨대, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜이노시톨 또는 합성 인지질 유도체 또는 변이체 예컨대, 디헥사노일포스파티딜콜린 또는 디헵타노일포스파티딜콜린일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "리폴딩"은 이황화 결합 함유 폴리펩티드가 이황화 결합에 대하여 부적절하게 폴딩된 또는 언폴딩된 상태에서 천연 또는 적절하게 폴딩된 구조로 변환되는 임의의 과정, 반응 또는 방법을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 "코폴딩(cofolding)"은 구체적으로 서로 상호작용하는 2개 이상의 폴리펩티드를 사용하며 언폴딩 또는 부적절하게 폴딩된 폴리펩티드를 천연 폴리펩티드 또는 적절하게 폴딩된 폴리펩티드로 변환시키는 리폴딩 과정, 반응 또는 방법을 말한다.

본 명세서에서 사용된 "BPFI"는 융합 저해제의 1종 이상의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드 및 단백질뿐만 아니라, 이들의 생물학적 활성 및 이들의 합성 또 는 제조 방법[재조합 합성(cDNA로부터 제조되든, 게놈 DNA로부터 제조되든, 합성 DNA로부터 제조되든 아니면 다른 형태의 핵산으로부터 제조되든 관계없이), 형질전환 방법 및 유전자 활성화 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않음]과 관계없이 이들의 유사체, 이소폼, 모사체(mimetics), 단편, 하이브리드 단백질, 융합 단백질, 올리고머 및 다량체, 상동체, 글리코실화 패턴 변이체 및 뮤테인(mutein)을 포함한다. 문헌(Maniatis, T., et al., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982))에 개시된 바와 같은 재조합 DNA 기술을 이용하여 BPFI를 수득할 수 있고, 당업자에게 공지된 방법으로 숙주 세포 내에서 BPFI를 제조할 수 있다.

용어 "BPFI"는 천연-발생 HR-C, HR-N 및/또는 음이온성 펩티드의 약학적으로 허용가능한 염 및 프로드러그, 상기 염의 프로드러그, 다형체(polymorph), 수화물, 용매화물, 생물학적 활성 단편, 생물학적 활성 변이체 및 입체이성질체뿐만 아니라 천연-발생 HR-C, HR-N 및/또는 음이온성 펩티드 및 이들의 폴리펩티드 융합체의 작용제, 모사체 및 길항제 변이체도 포함한다. 아미노 말단, 카르복실 말단 또는 이들 둘다에서 추가 아미노산을 포함하는 융합체는 용어 "BPFI"에 포함된다. 예시적 융합체에는 예를 들어, 메티오닌이 정제용 BPFI 융합체의 재조합 발현으로부터 생성된 BPFI의 N-말단((폴리-히스티딘 또는 친화성 에피토프를 포함하나 이들로 한정되지 않음)에 결합된 메티오닐 BPFI; 혈청 알부민 결합 펩티드와의 융합체; 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질과의 융합체; Fc와 같은 면역글로불린 분자의 불변 영역과의 융합체; 및 지방산과의 융합체가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 단일 아 미노산 변이체 또는 스플라이스 변이체와 같은 변이체와 마찬가지로, 다양한 형태를 위한 천연-발생 HR-C, HR-N, 및 음이온성 펩티드 핵산 및 아미노산 서열이 공지되어 있다.

다양한 참고문헌이 중합체 접합 또는 글리코실화에 의한 폴리펩티드의 변형을 개시한다. 용어 BPFI는 PEG와 같은 중합체에 접합된 폴리펩티드를 포함하며 시스테인, 라이신 또는 다른 잔기의 하나 이상의 추가 유도체화를 포함할 수 있다. 또한, BPFI는 링커 또는 중합체를 포함할 수 있으며, 이때 상기 링커 또는 중합체에 접합되는 아미노산은 본 발명에 따른 비-천연 아미노산일 수 있거나, 라이신 또는 시스테인에의 커플링과 같은 당업계에 공지된 기법을 이용하여 천연적으로 코딩된 아미노산에 접합될 수 있다.

폴리펩티드의 중합체 변형은 보고되어 있다. 미국 특허 제4,904,584호는 PEG화된 라이신이 없는 폴리펩티드를 개시하는데, 상기 폴리펩티드에서 하나 이상의 라이신 잔기가 결실되어 있거나 임의의 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있다. 국제특허공보 공개 제WO 99/67291호는 단백질과 PEG를 접합시키는 방법을 개시하는데, 이 방법에서 단백질 상의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되고 단백질이 PEG와 상기 단백질의 접합을 달성하기에 충분한 조건 하에 PEG와 접촉된다. 국제특허공보 공개 제WO 99/03887호는 성장 호르몬 수퍼패밀리에 속하는 폴리펩티드의 PEG화된 변이체를 개시하는데, 상기 변이체에서 시스테인 잔기가 상기 폴리펩티드의 특정 영역에 위치된 비-필수 아미노산 잔기로 치환되어 있다. 국제특허공보 공개 제WO 00/26354호는 상응하는 모 폴리펩티드와 비교할 때 하나 이상의 추가 글리코실화 부위를 포함하는, 감소된 알레르기유발성(allergenicity)을 가진 글리코실화된 폴리펩티드 변이체의 제조 방법을 개시한다. 미국 특허 제5,218,092호는 천연 폴리펩티드와 비교할 때 하나 이상의 추가 탄수화물쇄를 도입하기 위한 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 및 다른 폴리펩티드의 변형을 개시한다. PEG화 펩티드의 예에는 GW395058, PEG화 펩티드 트롬보포이에틴 수용체(TPOr) 작용제(de Serres M., et al., Stem Cells. 1999; 17(4):203-9), 및 성장 호르몬 방출 인자의 PEG화 유사체(PEG-GRP; D'Antonio M, et al., Growth Horm IGF Res. 2004 Jun; 14(3):226-34)가 포함된다.

또한, 용어 BPFI는 글리코실화된 BPFI, 예컨대, 임의의 아미노산 위치에서 글리코실화된 BPFI, 및 상기 폴리펩티드의 N-결합 또는 O-결합 글리코실화된 형태를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 단일 뉴클레오티드 변경을 포함하는 변이체도 BPFI의 생물학적 활성 변이체로서 간주된다. 또한, 스플라이스 변이체도 포함된다. 또한, 용어 BPFI는 화학적 수단에 의해 결합되거나 융합 단백질로서 발현되는, 하나 이상의 BPFI와 임의의 다른 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 중합체, 소분자, 링커, 리간드 또는 임의의 유형의 다른 생물학적 활성 분자의 BPFI 이종이량체, 동종이량체, 이종다량체 또는 동종다량체뿐만 아니라, 예를 들어, 여전히 생물학적 활성을 유지하는 특정한 결실 또는 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드 유사체를 포함한다.

용어 BPFI는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 BPFI를 포함한다. 본 발명의 BPFI는 하나 이상의 비-천연 아미노산 변형과 함께 하나 이상 의 천연 아미노산을 사용한 변형을 포함할 수 있다. BPFI의 1종 이상의 생물학적 활성을 조절하는 치환 예컨대, 작용제 활성을 증가시키는 치환, 상기 폴리펩티드의 가용성을 증가시키는 치환, 상기 폴리펩티드를 길항제로 전환시키는 치환, 펩티다제 또는 단백질분해효소에 대한 감수성을 감소시키는 치환 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 천연-발생 BPFI의 매우 다양한 아미노산 위치에서의 예시적 치환이 보고되어 있고 용어 BPFI에 포함된다.

일부 실시양태에서, BPFI는 BPFI의 생물학적 활성을 조절하는 부가, 치환 또는 결실을 추가로 포함한다. 예를 들면, 상기 부가, 치환 또는 결실은 BPFI의 1종 이상의 성질 또는 활성을 조절할 수 있다. 예를 들면, 상기 부가, 치환 또는 결실은 BPFI 수용체 또는 결합 파트너에 대한 친화성을 조절할 수 있거나, 수용체 이량체화를 조절할 수 있거나(수용체 이량체화의 증가 또는 감소를 포함하나, 이로 한정되지 않음), 수용체 이량체를 안정화시키거나, 결합 파트너의 입체구조 또는 1종 이상의 생물학적 활성을 조절하거나, 순환 반감기를 조절하거나, 치료 반감기를 조절하거나, 폴리펩티드의 안정성을 조절하거나, 펩티다제 또는 단백질분해효소에 의한 절단을 조절하거나, 투여량을 조절하거나, 방출 또는 생체이용성을 조절하거나, 정제를 용이하게 하거나, 구체적인 투여 경로를 개선시키거나 변경시킬 수 있다. 유사하게, BPFI는 폴리펩티드의 검출(GFP를 포함하나, 이로 한정되지 않음), 정제 또는 다른 특성을 개선시키는 단백질분해효소 절단 서열, 반응성 기, 항체 결합 도메인(FLAG 또는 폴리-His를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 다른 친화성 기초 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음) 또는 결합된 분자 (바이오틴을 포함하나 이로 한정되지 않음)를 포함할 수 있다.

또한, 용어 BPFI는 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 통해 동일하거나 상이한 비-천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄 또는 천연적으로-코딩된 아미노산 측쇄에 직접 결합되거나 링커를 통해 간접적으로 결합된 것들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 및 이종다량체를 포함한다. 예시적 링커에는 작은 유기 화합물, 다양한 길이의 수용성 중합체 예컨대, 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리덱스트란, 또는 다양한 길이의 폴리펩티드가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.

"비-천연적으로 코딩된 아미노산"은 20종의 일반 아미노산 중 하나, 피로라이신(pyrrolysine) 또는 셀레노시스테인(selenocysteine)이 아닌 아미노산을 말한다. 용어 "비-천연적으로 코딩된 아미노산"과 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어는 "비-천연 아미노산", "비천연 아미노산", "비-천연 발생 아미노산" 및 하이픈으로 결합된 이들의 다양한 버젼 및 하이픈으로 결합되지 않은 이들의 다양한 버젼이다. 용어 "비-천연적으로 코딩된 아미노산"은 천연적으로 코딩된 아미노산(20종의 일반 아미노산 또는 피로라이신 및 셀레노시스테인을 포함하나, 이들로 한정되지 않음)의 변형(예컨대, 번역 후 변형)에 의해 생성되지만 그 자체가 번역 복합체(translation complex)에 의해 성장하는 폴리펩티드 쇄 내로 천연적으로 도입되지 않는 아미노산을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 이러한 비-천연 발생 아미노산의 예에는 N-아세틸글루코스아미닐-L-세린, N-아세틸글루코스아미닐-L-트레오닌 및 O-포스포티로신이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.

"아미노 말단 변형 기"는 폴리펩티드의 아미노 말단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 말한다. 유사하게, "카르복시 말단 변형 기"는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 말한다. 말단 변형 기에는 다양한 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질 예컨대, 혈청 알부민, Fc와 같은 면역글로불린 불변 영역의 일부, 또는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 다른 부분들이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.

용어 "작용기", "활성 잔기", "활성화 기", "이탈기", "반응성 부위", "화학적 반응성 기" 및 "화학적 반응성 부분"은 당업계 및 본 명세서에서 분자의 구별가능한 특정 부위 또는 단위체(unit)를 지칭하기 위해 사용된다. 상기 용어들은 화학 분야에서 다소 동일한 의미를 가지고, 일정한 기능 또는 활성을 수행하며 다른 분자와 반응하는 분자의 일부를 나타내기 위해 사용된다.

용어 "결합(linkage)" 또는 "링커(linker)"는 일반적으로 화학 반응의 결과로서 형성되며 전형적으로 공유 결합인 기 또는 결합을 지칭하기 위해 사용된다. 가수분해적으로 안정한 결합은 결합이 물 중에서 실질적으로 안정하고 생리학적 조건 하의 pH를 포함하나 이로 한정되지 않는 이용가능한 pH에서 연장된 기간 동안, 아미도 심지어 무기한 동안 물과 반응하지 않는 것을 의미한다. 가수분해적으로 불안정한 또는 분해가능한 결합은 결합이 예컨대, 혈액을 비롯한 수용액 중에서 또는 물 중에서 분해될 수 있는 것을 의미한다. 효소적으로 불안정한 또는 분해가능한 결합은 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있다는 것을 의미한다. 당업계에서 이해되고 있는 바와 같이, PEG 및 관련 중합체는 중합체 골격(backbone) 내의 분해가능한 결합, 또는 중합체 골격과 중합체 분자의 하나 이상의 말단 작용기 사이의 링커 기 내의 분해가능한 결합을 포함할 수 있다. 예를 들면, PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산과 생물학적 활성제 상의 알콜 기의 반응에 의해 형성된 에스테르 결합은 일반적으로 생리학적 조건 하에 가수분해되어 상기 활성제를 방출한다. 다른 가수분해적으로 분해가능한 결합에는 탄산염 결합; 아민과 알데히드의 반응으로부터 발생된 이민 결합; 알콜과 포스페이트 기를 반응시킴에 의해 형성된 포스페이트 에스테르 결합; 히드라지드와 알데히드의 반응 생성물인 히드라존 결합; 알데히드와 알콜의 반응 생성물인 아세탈 결합; 포름산염과 알콜의 반응 생성물인 오르토에스테르 결합; PEG와 같은 중합체의 말단에 있는 아민 기를 포함하나 이로 한정되지 않는 아민 기와 펩티드의 카르복실 기에 의해 형성된 펩티드 결합; 및 중합체의 말단에 있는 포스포르아미다이트(phosphoramidite) 기를 포함하나 이로 한정되지 않는 포스포르아미다이트 기와 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실 기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 결합이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "생물학적 활성 분자", "생물학적 활성 부분" 또는 "생물학적 활성제"는 바이러스, 박테리아, 박테리오파지, 트랜스포존(transposon), 프리온, 곤충, 진균, 식물, 동물 및 인간을 포함하나 이들로 한정되지 않는 유기체에 관한 생물학적 시스템, 경로, 분자 또는 상호작용의 임의의 물리적 또는 생화학적 성질에 영향을 줄 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 생물학적 활성 분자는 인간 또는 다른 동물에서 질 환을 진단하거나, 치유하거나, 완화하거나, 치료하거나, 예방하기 위한, 또는 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 복지를 증가시키기 위한 임의의 물질을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 생물학적 활성 분자의 예에는 펩티드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 경질 약물, 연질 약물, 탄수화물, 무기 원자 또는 분자, 안료, 지질, 뉴클레오시드, 방사성핵종(radionuclide), 올리고뉴클레오티드, 독소, 세포, 바이러스, 리포좀, 마이크로입자 및 마이셀(micelle)이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 생물학적 활성제의 부류에는 약물, 프로드러그, 방사성핵종, 조영제(imaging agent), 중합체, 항생제, 진균제, 항바이러스제, 소염제, 항-종양제, 심혈관제, 항-불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드제, 미생물로부터 유래된 독소 등이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.

"이작용성(bifunctional) 중합체"는 다른 부분(아미노산 측면 기를 포함하나, 이로 한정되지 않음)과 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 2개의 분리된 작용기를 포함하는 중합체를 말한다. 특정한 생물학적 활성 성분 상의 기와 반응하는 하나의 작용기, 및 제2 생물학적 성분 상의 기와 반응하는 또 다른 기를 가진 이작용성 링커를 사용하여, 제1 생물학적 활성 성분, 이작용성 링커 및 제2 생물학적 활성 성분을 포함하는 접합체를 형성할 수 있다. 다양한 화합물을 펩티드에 부착시키기 위한 많은 방법 및 링커 분자가 공지되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 도입되는 유럽 특허출원 제188,256호; 미국 특허 제4,671,958호; 미국 특허 제4,659,839호; 미국 특허 제4,414,148호; 미국 특허 제4,699,784호; 미국 특허 제4,680,338호; 미국 특허 제4,569,789호; 및 미국 특허 제4,589,071호를 참조한다. "다작용성 중합체"는 다른 부분(아미노산 측쇄를 포함하나, 이로 한정되지 않음)과 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 2개 이상의 분리된 작용기를 포함하는 중합체를 말한다. 이작용성 중합체 또는 다작용성 중합체는 임의의 원하는 길이 또는 분자량을 가질 수 있고, BPFI에 결합된 하나 이상의 분자와 그의 결합 파트너 또는 BPFI 사이에 특정한 소정의 공간 또는 입체구조를 제공하도록 선택될 수 있다.

치환기가 좌측부터 우측으로 기재된 통상의 화학식에 의해 특정되는 경우, 치환기는 우측부터 좌측으로 구조를 기재함으로써 발생되는 화학적으로 동일한 치환기도 동등하게 포함하는데, 예를 들면, 식 -CH₂O-는 식 -OCH₂-와 동등하다.

용어 "치환기"에는 "비-간섭 치환기"가 포함되지만, 이로 한정되지 않는다. "비-간섭 치환기"는 안정한 화합물을 생성하는 기이다. 적절한 비-간섭 치환기 또는 라디칼에는 할로, C₁-C₁₀ 알킬, C₂-C₁₀ 알케닐, C₂-C₁₀ 알키닐, C₁-C₁₀ 알콕시, C₁-C₁₂ 아르알킬, C₁-C₁₂ 알크아릴, C₃-C₁₂ 시클로알킬, C₃-C₁₂ 시클로알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 톨루오일, 크실레닐, 비페닐, C₂-C₁₂ 알콕시알킬, C₂-C₁₂ 알콕시아릴, C₇-C₁₂ 아릴옥시알킬, C₇-C₁₂ 옥시아릴, C₁-C₆ 알킬설피닐, C₁-C₁₀ 알킬설포닐, --(CH₂)_m--O--(C₁-C₁₀ 알킬)(이때, m은 1 내지 8임), 아릴, 치환된 아릴, 치환된 알콕시, 플루오로알킬, 헤테로시클릭 라디칼, 치환된 헤테로시클릭 라디칼, 니트로알킬, --NO₂, --CN, --NRC(O)--(C₁-C₁₀ 알킬), --C(O)--(C₁-C₁₀ 알킬), C₁-C₁₀ 알킬 티오알킬, -- C(O)O--(C₁-C₁₀ 알킬), --OH, --SO₂, =S, --COOH, --NR₂, 카르보닐, --C(O)--(C₁-C₁₀ 알킬)-CF₃, --C(O)--CF₃, --C(O)NR₂, --(C₁-C₁₀ 아릴)-S--(C₆-C₁₀ 아릴), --C(O)--(C₁-C₁₀ 아릴), --(CH₂)_m--O--(--(CH₂)_m--O--(C₁-C₁₀ 알킬)(이때, m은 각각 1 내지 8임), --C(O)NR₂, --C(S)NR₂, --SO₂NR₂, --NRC(O)NR₂, --NRC(S)NR₂, 이들의 염 등이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 여기서 사용된 각각의 R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴, 아르알킬 또는 알크아릴이다.

용어 "할로겐"에는 불소, 염소, 요오드 및 브롬이 포함된다.

그 자체로서 또는 또 다른 치환기의 일부로서 용어 "알킬"은 달리 명시되지 않는 한 완전 포화, 단일 포화 또는 다중 포화될 수 있는 직쇄, 분지쇄 또는 환형 탄화수소 라디칼 또는 이들의 조합물을 의미하며, 표시된 수의 탄소 원자를 가진 (즉, C₁-C₁₀은 1 내지 10개의 탄소를 의미함) 2가 또는 다가 라디칼을 포함할 수 있다. 포화 탄화수소 라디칼의 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 이들의 상동체 및 이성질체, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등과 같은 기가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 불포화 알킬 기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 가진 알킬 기이다. 불포화 알킬 기의 예에는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1-프로피닐, 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급 상동체 및 이성질체가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 용어 "알킬"은 달리 명시되지 않는 한 하기에 보다 상세히 정의된 알킬의 유도체들 예컨대, "헤테로알킬"을 포함한다. 탄화수소 기로 한정되는 알킬 기는 "동종알킬(homoalkyl)"로 지칭된다.

그 자체로서 또는 또 다른 치환기의 일부로서 용어 "알킬렌"은 식 -CH₂CH₂- 및 -CH₂CH₂CH₂CH₂-에 의해 예시된 바와 같은 (그러나, 이로 한정되지 않음) 알칸으로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하고, "헤테로 알킬렌"으로서 하기에 기재된 기들을 추가로 포함한다. 전형적으로, 알킬 (또는 알킬렌) 기는 1 내지 24개의 탄소 원자를 가질 것이며, 10개 이하의 탄소 원자를 가진 이들 기가 본 발명에서 바람직하다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 가진 보다 짧은 쇄의 알킬 또는 알킬렌 기이다.

용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오" (또는 티오알콕시)는 이들의 통상적인 의미로 사용되며, 산소 원자, 아미노 기 또는 황 원자 각각을 통해 분자의 나머지 부분에 부착된 알킬 기를 말한다.

그 자체로서 또는 또 다른 용어와 함께 사용되는 용어 "헤테로알킬"은 달리 명시되지 않은 한 기재된 수의 탄소 원자, 및 O, N, Si 및 S로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자로 구성된 안정한 직쇄, 분지쇄 또는 환형 탄화수소 라디칼 또는 이들의 조합물을 의미하며, 이때 상기 질소 및 황 원자는 경우에 따라 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 경우에 따라 4차화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N, S 및 Si는 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치에 존재할 수 있거나, 알킬 기가 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치에 존재할 수 있다. 예에는 -CH₂-CH₂-O-CH₃, -CH₂-CH₂-NH-CH₃, -CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃, -CH₂-S-CH₂-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃, -CH=CH-O-CH₃, -Si(CH₃)₃, -CH₂-CH=N-OCH₃, 및 -CH=CH-N(CH₃)-CH₃이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, -CH₂-NH-OCH₃ 및 -CH₂-O-Si(CH₃)₃과 같이 2개 이하의 헤테로원자가 연속적으로 존재할 수 있다. 유사하게, 그 자체로서 또는 또 다른 치환기의 일부로서 용어 "헤테로알킬렌"은 -CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂- 및 -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-에 의해 예시된 바와 같은 (그러나, 이들로 한정되지 않음) 헤테로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌 기의 경우, 동일하거나 상이한 헤테로원자가 쇄의 말단 중 하나 또는 쇄의 말단 양쪽에 존재할 수도 있다(알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 아미노옥시알킬렌 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않음). 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 결합 기의 경우, 결합 기의 배향은 결합 기의 화학식이 기재된 방향에 의해 전혀 암시되지 않는다. 예를 들면, 화학식 -C(O)₂R'-는 -C(O)₂R'- 및 -R'C(O)₂- 둘다를 표시한다.

그 자체로서 또는 다른 용어와 함께 사용되는 용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은 달리 명시되지 않는 한 "알킬" 및 "헤테로알킬" 각각의 환형 버젼을 나타낸다. 따라서, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬은 포화 및 불포화 고리 결합을 포함한다. 추가로, 헤테로시클로알킬의 경우, 헤테로원자는 헤테로시클이 분자 의 나머지 부분에 부착된 위치를 차지할 수 있다. 시클로알킬의 예에는 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 헤테로시클로알킬의 예에는 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 추가로, 상기 용어는 2환 및 3환 고리 구조를 포함한다. 유사하게, 그 자체로서 또는 또 다른 치환기의 일부로서 용어 "헤테로시클로알킬렌"은 헤테로시클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하고, 그 자체로서 또는 또 다른 치환기의 일부로서 용어 "시클로알킬렌"은 시클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "수용성 중합체"는 수성 용매 중에서 용해될 수 있는 임의의 중합체를 말한다. 수용성 중합체와 BPFI의 결합은 비-변형 형태에 비해 상대적으로 증가하거나 조절된 혈청 반감기 또는 증가하거나 조절된 치료 반감기, 조절된 면역원성, 조절된 물리적 결합 특성 예컨대, 응집 및 다량체 형성, 변경된 수용체 결합, 하나 이상의 결합 파트너와의 변경된 결합, 변경된 수용체 이량체화 또는 다량체화를 포함하나 이들로 한정되지 않는 변화를 일으킬 수 있다. 수용성 중합체는 그 자신의 생물학적 활성을 가질 수 있거나 갖지 않을 수 있으며, 하나 이상의 BPFI 또는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 물질에 BPFI를 부착시키기 위한 링커로서 활용될 수 있다. 적절한 중 합체에는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 모노 C₁-C₁₀ 알콕시 또는 이의 아릴옥시 유도체(본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,252,714호에 기재됨), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴릴비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 유도체(덱스트란 설페이트를 포함함), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 글리칸, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체(메틸셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 전분, 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜과 이의 유도체의 공중합체, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 알파-베타-폴리[(2-히드록시에틸)-DL-아스파르트아미드 등, 또는 이들의 혼합물이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 수용성 중합체의 예에는 폴리에틸렌 글리콜 및 혈청 알부민이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "폴리알킬렌 글리콜" 또는 "폴리(알켄 글리콜)"은 폴리에틸렌 글리콜(폴리(에틸렌 글리콜)), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜 및 이들의 유도체를 말한다. 용어 "폴리알킬렌 글리콜"은 평균 분자량이 0.1 kDa 내지 100 kDa인 선형 및 분지형 중합체 둘다를 포함한다. 다른 예시적 실시양태는 예를 들어, 쉐어워터 코포레이션(Shearwater Corporation)의 카달로그("Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001)) 와 같은 시판 공급자의 카달로그에 기재되어 있다.

달리 명시되지 않는 한, 용어 "아릴"은 단일 고리, 또는 함께 융합되어 있거나 공유 결합되어 있는 다수의 고리(바람직하게는, 1 내지 3개의 고리)일 수 있는 다불포화 방향족 탄화수소 치환기를 의미한다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 아릴 기(또는 고리)를 말하며, 이때 상기 질소 및 황 원자는 경우에 따라 산화되어 있고, 상기 질소 원자(들)은 경우에 따라 4차화되어 있다. 헤테로아릴 기는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 기의 비제한적 예에는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴이 포함된다. 전술한 아릴 및 헤테로아릴 고리계 각각에 대한 치환기는 하기 허용가능한 치환기들로 구성된 군으로부터 선택되는다.

간결히 기재하기 위해, 다른 용어와 함께 사용되는 경우(아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬을 포함하나, 이들로 한정되지 않음) 용어 "아릴"은 상기 정의된 바와 같은 아릴 및 헤테로아릴 고리 둘다를 포함한다. 따라서, 용어 "아릴알킬"은 탄소 원자(메틸렌 기를 포함하나, 이로 한정되지 않음)가 예를 들어 산소 원자로 치환된 알킬 기(페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않음)를 포함하는 알킬 기에 아릴 기가 부착되어 있는 라디칼(벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않음)을 포함한다.

상기 용어들("알킬", "헤테로알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴"을 포함하나, 이들로 한정되지 않음) 각각은 기재된 라디칼의 치환 형태 및 비치환 형태 둘다를 포함한다. 각각의 유형의 라디칼에 대한 예시적 치환기는 하기에 기재되어 있다.

알킬 및 헤테로알킬 라디칼(종종, 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알키닐, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐 및 헤테로시클로알케닐로서 지칭되는 기들을 포함함)에 대한 치환기는 0 내지 (2m' + 1) 범위 내의 수(이때, m'는 이러한 라디칼에서 탄소 원자의 총수임)의 -OR', =0, =NR', =N-0R', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"', -NR"C(O)₂R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -NRSO₂R', -CN 및 -NO₂로부터 선택되나 이들로 한정되지 않는 다양한 기들 중 하나 이상의 기일 수 있다. R', R", R"' 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴(1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하나 이들로 한정되지 않음), 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시, 티오알콕시 기, 또는 아릴알킬 기를 말한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 포함할 때, 예를 들면, R 기는 R', R", R"' 및 R"" 기 중 하나 이상의 기가 존재하는 경우 각각의 R', R", R"' 및 R"" 기 와 마찬가지로 각각 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 조합되어 5-원, 6-원 또는 7-원의 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 치환기에 대한 상기 설명으로부터, 당업자는 용어 "알킬"이 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기 예컨대, 할로알킬(-CF₃ 및 -CH₂CF₃을 포함하나, 이들로 한정되지 않음) 및 아실(-C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않음)을 포함한다는 것을 이해할 것이다.

알킬 라다칼에 대해 기재된 치환기와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환기는 다양하고, 0 내지 방향족 고리계 상의 개방 원자가의 총수 범위 내의 수의 할로겐, -OR', -O, =NR', =N-0R' -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(0)NR"R"' -NR"C(O)₂R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -NRSO₂R', -CN, -NO₂, -R', -N₃, -CH(Ph)₂, 플루오로(C₁-C₄)알콕시 및 플루오로(C₁-C₄)알킬로부터 선택되나, 이들로 한정되지 않으며, 이때 R', R", R"' 및 R""는 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 포함할 때, 예를 들면, R 기는 R', R", R"' 및 R"" 기 중 하나 이상의 기가 존재하는 경우 각각의 R', R", R"' 및 R"" 기와 마찬가지로 각각 독립적으로 선택된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "조절된 혈청 반감기"는 비-변형 형태와 비교할 때 변형 BPFI의 순환 반감기에서의 양(positive)의 또는 음(negative)의 변화를 의미한다. 혈청 반감기는 BPFI의 투여 후 다양한 시점에서 혈액 샘플을 채취하여 각 샘플 중의 해당 분자의 농도를 결정함으로써 측정된다. 혈청 농도와 시간의 상관관계는 혈청 반감기의 계산을 가능하게 한다. 혈청 반감기는 바람직하게는 약 2배 이상 증가하나, 예를 들어, 더 적은 증가가 만족스러운 투여 섭생법을 가능하게 하거나 독성 효과를 피하는 경우 더 적은 증가가 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 증가는 약 3배 이상, 약 5배 이상, 또는 약 10배 이상이다.

본 명세서에 사용된 용어 "조절된 치료 반감기"는 비-변형 형태와 비교할 때 치료 유효량의 BPFI의 반감기에서의 양의 또는 음의 변화를 의미한다. 치료 반감기는 투여 후 다양한 시점에서 분자의 약동학적 및/또는 약력학적 성질 및/또는 치료 효과를 측정함으로써 측정된다. 증가된 치료 반감기는 바람직하게는 유리한 특정 투여 섭생법 또는 유리한 특정 총 투여량을 허용하거나, 원치않는 효과를 피한다. 일부 실시양태에서, 증가된 치료 반감기는 증가된 효능, 변형 분자와 그의 표적의 증가된 또는 감소된 결합, 단백질분해효소와 같은 효소에 의한 분자에 대한 증가된 또는 감소된 분해, 또는 비-변형 분자의 또 다른 매개변수 또는 작용 기작의 증가 또는 감소로부터 비롯된다.

핵산 또는 단백질에 적용될 때 용어 "단리된"은 핵산 또는 단백질이 천연 상태에서 결합되어 있는 다른 세포 성분들의 적어도 일부를 실질적으로 갖지 않는 것을 의미한다. 이는 균질한 상태일 수 있다. 단리된 물질은 건조 또는 반건조 상태 이거나, 또는 수용액을 포함하나 이로 한정되지 않는 용액 중에 존재할 수 있다. 전형적으로, 순도 및 균질성은 분석 화학 기술, 예를 들면 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 측정한다. 제제 중에 존재하는 우세한 종인 단백질은 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 유전자는, 유전자에 측접하고 원하는 유전자 외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로부터 분리되어 있다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 한 밴드를 생성하는 것을 의미한다. 특히, 이는 핵산 또는 단백질의 순도가 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상인 것을 의미한다.

용어 "핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 달리 명시하지 않은 한, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 명시하지 않은 한, 이 용어는 PNA(펩티도핵산)를 포함하는 올리고뉴클레오티드 유사체, 안티센스 기법에 사용되는 DNA의 유사체(포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등) 또한 지칭한다. 달리 명시하지 않은 한, 특정 핵산 서열은 명시적으로 표시된 서열뿐만 아니라, 보존적으로 변형된 그의 변이체(축퇴 코돈 치환을 포함하나 이로 한정되지 않음) 및 상보적 서열도 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 수행될 수 있다(문헌[Batzer et al., Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); and Cassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)] 참조).

용어 "아미노산"은 천연 발생 및 비-천연 발생 아미노산 뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 지칭한다. 천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린) 및 피로라이신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소에 결합된 α 탄소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기를 가진 화합물, 예를 들면 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들면, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다.

본 명세서에서 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학적 학명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장되는 통상적으로 공지된 3-문자 또는 1-문자 기호로 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드도 통상적으로 허용되는 1-문자 코드로 지칭될 수 있다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘다에 적용된다. 특정한 핵산 서열에 대해, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나 또는 본질적으 로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 한 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변화시키지 않으면서 전술한 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종인 "침묵 변이(silent variation)"이다. 또한, 본 명세서에서 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 당업자는 핵산 중의 각각의 코돈(통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 기재된 각 서열에 함축되어 있다.

아미노산 서열에 대해, 당업자는 단일 아미노산 또는 코딩된 서열 중 적은 %의 아미노산을 변경시키거나, 부가하거나 또는 결실시키는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가가 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 경우, "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 이해할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 공지되어 있다. 본 발명의 다형 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자 외에도 이러한 보존적으로 변형된 변이체가 존재하며, 이러한 변이체는 본 발명의 다형 변 이체, 종간 상동체 및 대립유전자를 배제하지 않는다.

하기 8개의 군 각각은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:

1) 알라닌(A), 글리신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라진(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 라이신(K);

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M).

(예를 들면, 문헌[Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd Edition (December 1993)] 참조)

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 내용 중에서 용어 "동일한" 또는 "% 동일성"은 동일한 2개 이상의 서열 또는 부분 서열(subsequence)을 지칭한다. 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 또는 수동 정렬 및 육안 조사에 의한 측정 시 비교 창, 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 상응에 대해 비교하고 정렬할 때, 서열이 일정한 %의 동일성(즉, 특정된 영역에 걸쳐 약 60% 동일성, 경우에 따라 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일성)을 갖는 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는 경우, 서열은 "실질적으로 동일하다". 또한, 이 정의는 시험 서열의 상보체를 지칭한다. 동일성은 약 50개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이를 갖는 영역, 또는 75 내지 100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이를 갖는 영역에 걸쳐 존재할 수 있거나, 또는 특정되지 않은 경우, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 서열, 또는 50개 미만의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이에 걸쳐 존재할 수 있다.

서열 비교 시, 전형적으로 한 서열이 기준 서열로서 작용하고, 이 기준 서열과 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 시험 서열 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하는 경우, 부분 서열 배위가 지정되고, 필요에 따라, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트(Default) 프로그램 매개변수를 사용하거나, 대체가능한 매개변수를 지정할 수 있다. 그 다음, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수를 기초로 기준 서열에 대한 시험 서열의 % 서열 동일성을 계산한다.

본 명세서에 사용된 "비교 창"은 20 내지 600개, 통상적으로 약 50 내지 약 200개, 더욱 통상적으로 약 100 내지 약 150개로 구성된 군으로부터 선택되는 인접 위치들의 수 중 어느 하나를 갖는 절편에 대한 언급을 포함하며, 이때 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치를 갖는 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 문헌[Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c]의 국소(local) 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 85; 2444]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터 화된 실행([Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 육안 조사(예를 들면, 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 참조)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 수단에 의해 수행될 수 있다.

% 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 한 예로는 각각 문헌[Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]에 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있다. BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 단어길이(wordlength; W) 11, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어길이 3 및 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌[Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10915] 참조) 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 전형적으로, BLAST 알고리즘은 턴 오프된(turned off) "낮은 복잡도(low complexity)" 필터를 사용하여 수행한다.

또한, BLAST 알고리즘은 2개의 서열 사이의 유사성을 통계적으로 분석한다(예를 들면, 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 기준은 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치(match)가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들면, 기준 핵산에 대해 시험 핵산을 비교할 때 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.

어구 "∼에 선택적으로 (또는 특이적으로) 혼성화한다"는 서열이 복합 혼합물(전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하나, 이들로 한정되지 않음) 중에 존재하는 경우 엄격한 혼성화 조건 하에 분자가 특정 뉴클레오티드 서열에만 결합하거나, 이중가닥을 형성하거나 또는 혼성화하는 것을 지칭한다.

어구 "엄격한 혼성화 조건"은 당업계에 공지된 바와 같은 낮은 이온 강도 및 고온 조건을 지칭한다. 전형적으로, 프로브는 엄격한 조건 하에 핵산의 복합 혼합물(전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하나, 이들로 한정되지 않음) 중의 그의 표적 부분 서열에 혼성화하지만, 복합 혼합물 중의 다른 서열에는 혼성화하지 않는다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고, 상이한 환경에서 상이할 수 있다. 서열이 길수록 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침은 문헌[Tijssen, Techzques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 발견된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정해진 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대한 융점(T_m)보다 약 5 내지 10 ℃ 더 낮도록 선택된다. T_m은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 (정해진 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에) 평형 상태에서 (표적 서열이 과량으로 존재하므로, T_m에서 프로브의 50%가 평형 상태로 존재함) 표적 서열에 혼성화하는 온도이다. 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M의 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고, 짧은 프로브(10 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함하나 이로 한정되지 않음)의 경우 온도가 약 30℃ 이상이고, 긴 프로브(50개 초과의 뉴클레오티드를 포함하나 이로 한정되지 않음)의 경우 온도가 약 60℃ 이상인 조건일 수 있다. 또한, 엄격한 조건은 탈안정화제, 예를 들면 포름아미드를 첨가하여 얻을 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화의 경우, 양(positive)의 신호는 배경(background) 혼성화의 2 배 이상, 경우에 따라 10 배일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 다음과 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5 X SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 항온처리, 또는 5 X SSC, 1% SDS, 65℃에서 항온처리와 65℃에서 0.2 X SSC 및 0.1% SDS로 세척. 이러한 세척은 5, 15, 30, 60 또는 120분 이상 동안 수행될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "진핵생물"은 계통발생적 도메인 진핵생물류(Eucarya), 예를 들면 동물(포유동물, 곤충, 파충류, 조류 등을 포함하나 이로 한정되지 않음), 섬모충, 식물(외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물, 해조류 등을 포함하나 이로 한정되지 않음), 진균류, 효모, 편모충, 미포자충, 원생생물 등에 속하는 유기체를 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "비-진핵생물"은 비-진핵생물 유기체를 지칭한다. 예를 들면, 비-진핵생물 유기체는 진정세균(Eubacteria)(대장균), 써머스 써모필러스(thermus thermophilus), 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 등을 포함하나 이로 한정되지 않음) 계통발생적 도메인, 또는 고세균(Archaea)(메타노코커스 잔나스키이(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움(Halobacterium), 예를 들면 할로페락스 볼카니이(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아키오글로버스 풀기더스(Archaeoglobus fulgidus), 피로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus), 피로코커스 호리코쉬이(Pyrococcus horikoshii), 애우로피룸 페르닉스(Aeuropyrum pernix) 등을 포함하나 이로 한정되지 않음) 계통발생적 도메인에 속할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "피험체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물, 바람직하게는, 포유동물, 보다 바람직하게는, 인간을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "유효량"은 치료될 질환, 병태 또는 장애의 증상 중 하나 이상을 일정한 정도로 경감시키는 투여될 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 양을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 예방 치료, 증강 치료 및/또는 치유적 치료의 목적으로 투여될 수 있다.

용어 "증강시키다" 또는 "증강"은 원하는 효과의 효능 또는 기간을 증가시키거나 연장하는 것을 의미한다. 따라서, 치료제의 효과를 증강시키는 것과 관련하여, 용어 "증강"은 한 시스템에 대한 다른 치료제의 효과를 효능 또는 기간 면에서 증가시키거나 연장시킬 수 있는 능력을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "증강-유효량"은 원하는 시스템에서 또 다른 치료제의 효과를 증강시키는 데 적합한 양을 지칭한다. 환자에게 사용되는 경우, 이러한 용도에 유효한 양은 질환, 장애 또는 병태의 심각도 및 경과, 선행 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료 의사의 판단에 달려 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "변형된"은 소정의 폴리펩티드에 가해진 임의의 변화 예컨대, 폴리펩티드의 길이, 아미노산 서열, 아미노산 조성 또는 화학적 구조에 대한 변화, 폴리펩티드의 번역과 동시에 일어나는 변형 또는 번역 후 변형을 지칭한다. "(변형된)"의 형태로 사용되는 용어는 논의되는 폴리펩티드가 경우에 따라 변형되는 것, 즉 논의되는 폴리펩티드가 변형되거나 또는 변형되지 않을 수 있다는 것을 의미한다.

용어 "번역 후 변형된"은 천연 또는 비-천연 아미노산이 폴리펩티드 쇄에 도입된 후 상기 아미노산에 발생하는 천연 또는 비-천연 아미노산의 임의의 변형을 지칭한다. 이 용어는 예를 들면, 생체내에서 번역과 동시에 일어나는 변형, 시험관내에서 번역과 동시에 일어나는 변형(예컨대, 세포-무함유 번역 시스템 내에서의 변형), 생체내에서의 번역 후 변형 및 시험관내에서의 번역 후 변형을 포함한다.

예방을 위한 적용에 있어서, (변형된) 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유 하는 조성물을 특정 질환, 장애 또는 병태를 앓기 쉽거나 또는 앓을 위험이 있는 환자에게 투여한다. 이러한 양은 "예방 유효량"으로 정의된다. 이러한 용도에 있어서, 정확한 양은 환자의 건강 상태, 체중 등에 따라 좌우된다. 이러한 예방 유효량이 통상의 실험(예를 들면, 투여량 증가(dose escalation) 임상 시험)에 의해 결정된다는 것은 당업계의 지식 내에 속하는 것으로 간주된다

용어 "보호된"은 특정한 반응 조건 하에 화학적 반응성 작용기의 반응을 방지하는 "보호기" 또는 부분의 존재를 지칭한다. 보호기는 보호될 화학적 반응성 기의 종류에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 화학적 반응성 기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 화학적 반응성 기가 티올인 경우, 보호기는 오르토피리딜디설피드일 수 있다. 화학적 반응성 기가 카르복실산, 예를 들면 부탄산 또는 프로피온산, 또는 히드록실 기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬 기, 예를 들면 메틸, 에틸, 또는 tert-부틸일 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 다른 보호기들도 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.

예를 들어, 차단기/보호기는 하기 기들로부터 선택될 수 있다:

다른 보호기는 완전히 본 명세서에 참고로 도입되는 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999]에 기재되어 있다.

치료를 위한 적용에 있어서, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 질환, 병태 또는 장애를 이미 앓고 있는 환자에게 질환, 장애 또는 병태의 증상을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키기 충분한 양으로 투여된다. 이러한 양은 "치료 유효량"으로 정의되고, 질환, 장애 또는 병태의 심도 및 경과, 선행 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료 의사의 판단에 달려 있다. 이러한 치료 유효량이 통상의 실험(예를 들면, 투여량 증가 임상 시험)에 의한 결정된다는 것은 당업계의 지식 내에 속하는 것으로 간주된다.

용어 "치료하는"은 예방적 치료 및/또는 치유적 치료를 지칭하는 데 사용된다.

달리 명시되지 않는 한, 당업계의 기술에 속하는 질량 분광법, NMR, HPLC, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 통상적 방법이 사용된다.

I. 도입부

본 발명에서 사용될 수 있는 BPFI 또는 이의 단편의 비제한적 예에는 하기 것들이 포함된다. 특정 BPFI 또는 임의의 단백질의 활성의 일부 또는 전부를 보유하는 다른 변이체, 유사체, 단편 및/또는 유사체 단편도 본 발명의 실시양태에서 사용될 수 있음을 이해할 것이다.

본 발명에서 유용한 폴리펩티드의 대표적 비제한적 부류에는 HR-C, HR-N 및 음이온성 펩티드가 포함된다.

파라믹소바이러스 및 렌티바이러스는 임상적 및 수의학적 질환의 중요한 병인이다. 이 바이러스들에는 중요한 인간 병원체 예컨대, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 파라인플루엔자 바이러스, 홍역, 볼거리, HIV-1 및 HIV-2, 및 수의학적 병원체 예컨대, 소 RSV, 칠면조 비기관염 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 우역 바이러스, 개 홍역 바이러스, 바다표범 및 말에서 보고된 신규 홍역 바이러스, 및 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)가 포함된다.

유아 및 면역억제 개체에서 심각한 저 호흡 질환의 주원인은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)로서 공지된 파라믹소바이러스이다. 세계적으로, RSV는 매년 6천 5백만 건의 감염 및 1백만 건의 사망을 야기한다. RSV 감염에 의한 질환의 최대 발병시기는 생후 6주 내지 6개월이고, 미국에서 해마다 대략 90,000명의 입원 어린이가 RSV에 의해 야기된 감염을 가진다. 이 어린이들 중 4500명이 사망한다. 또한, 유아 시기의 RSV 기관지염 동안 악화된 RSV IgE 반응은 어린이에서 재발 천식이라는 널리 퍼진 문제점과 관련되어 있다.

RSV에 의한 재감염은 대다수의 다른 호흡기 바이러스보다 더 빈번하다. 심각한 질환은 통상적으로 일차 또는 이차 감염과 관련되어 있다. 질환 심각도가 반복된 감염에 따라 감소하더라도, RSV에 의한 이전 감염은 후속 감염에서 질환을 예방하지 못한다. 면역은 명백히 불완전하다. 일반적으로, 생 바이러스 백신은 이 백신이 어떠한 임상적 질환을 초래하지 않기에 충분한 수준으로 약독화될 때까지 부적절한 면역원성을 나타내는 것으로 입증되어 있다. 1960대에 개발된 포르말린-불활성화 백신은 바이러스에 대한 보호 반응을 나타내지 못할 뿐만 아니라, 후속 전염 동안에 백신 투여를 받은 어린이에서 악화된 질환을 유도하였고, 일부 약독화된 RSV 균주는 인간 계대(passage) 후 독성을 회복할 잠재력을 가진다. 그러므로, 유아 및 어린이들에서 RSV 질환을 예방하기 위한 노력이 불활성화된 백신, 생 약독화 바이러스 백신 또는 서브유니트 백신을 사용한 능동 면역화, 및 인간 단일클론 RSV 항체 또는 과다면역 RSV 면역글로불린을 사용한 모체의 능동 면역화에 의한 태아의 수동 면역화를 표적화하는 방향으로 계속 진행되고 있다 하더라도, 백신 개발은 조심스럽게 접근되고 있다.

위험이 높은 유아는 RSV에 대해 보호하기 위해 면역글로불린(IG)으로 치료되지만, 정맥내 RSV IG는 매우 값비싸며, 투여는 허용가능한 항체 역가를 유지하기 위해 7시간 이상 지속되는 월 단위의 관주를 필요로 한다.

현재, 시나기스(Synagis)(팔리비주마브) 또는 리바비린과 같은 약물이 환자 집단에게 투여된다.

본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,814,968호에는 시험관내 또는 생체내에서 감수성 세포에서 감염을 저해하는 데 있어서 RhoA 단백질의 바이러스 융합 단백질 결합 도메인 또는 바이러스 융합 단백질의 RhoA 결합 도메인에 결합하는 단리된 펩티드, 펩티드모사체 및 항체의 용도가 기재되어 있다. 기재된 바이러스 중에는 파라믹소바이러스 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 및 렌티바이러스 인간 면역결핍 바이러스(HIV)가 있다.

문헌(Pastey et al. in Nature Medicine 2000 January; 6(1):35-40 and J. of Virology 1999; 73(9):7262-7270)에는 RSV의 F 단백질(융합 단백질)과 GTPase RhoA 사이의 상호작용, 및 RSV 및 파라-인플루엔자 바이러스 타입 3에 의한 합포체 형성에 대한 RhoA 펩티드의 효과를 조사하는 연구가 기재되어 있다.

문헌(Budge et al. in J. of Antimicrobial Chemotherapy 2004; 54:299-302 and in J. of Virology 2004; 78(10):5015-5022)에는 GTPase RhoA로부터 유래된 펩티드 및 이의 항바이러스 활성이 기재되어 있다. 바이러스 감염 및 바이러스 부착의 저해가 분자 세트에 대해 측정되었다. 구체적으로, RhoA의 아미노산 77-95로부터 유래된 펩티드의 총 음 전하, 및 펩티드의 말단절단 형태(아미노산 80-94)의 분자간 이황화 결합이 항-RSV 활성에 결정적으로 중요한 것으로 밝혀졌다. 5 kDa 초과의 다가음이온성 분자는 외피를 가진 바이러스를 저해하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 분자들에는 가용성 헤파린, 덱스트란 설페이트, 음으로 하전된 단백질, 및 합성 다가음이온성 중합체가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 문헌(Budge et al.)은 항바이러스 활성이 RSV F 단백질-GTPase RhoA 상호작용의 저해로 인한 것이 아님을 시사한다. 문헌(Lambert et al. in PNAS 1196 93:2186-2191)에는 DP-178 및 DP-107과 유사한 RSV로부터 유래된 펩티드의 바이러스 융합 저해제로서의 용도가 기재되어 있다.

T-20은 바이러스 융합 저해제로서 작용함으로써 HIV가 세포 내로 도입되는 것을 저해한다. HIV의 융합 과정의 특징은 잘 규명되어 있다. HIV는 gp120을 통해 CD4 수용체에 결합하고, 그의 수용체와의 결합 시, gp120은 그 자신이 그의 보조수용체인 CCR5 또는 CXCR4에 결합하게 하는 일련의 입체구조적 변화를 받는다. 수용체 및 보조수용체 둘다에 결합된 후, gp120은 gp41을 노출시켜 융합 과정을 개시한다. gp41은 헵타드 반복부 1 및 2(HR1 및 HR2)로 명명된 2개의 영역을 가진다. HR1로서 확인된 세포외 도메인은 제안된 지퍼 도메인의 아미노 말단인 α-나선형 영역이다. HR1은 gp41의 HR2와 함께 헤어핀을 형성한다. 형성된 구조는 HIV 외피를 2개의 막 사이의 융합을 초래하는 세포막 근처에 배치시키는 6-나선 다발이다. T-20은 gp41 경막 당단백질의 제1 헵타드 반복부(HR1)에 결합함으로써 바이러스 융합에 필요한 입체구조적 변화를 방해한다. 따라서, 6-나선 다발의 형성은 gp41의 HR1 영역에 결합하는 T-20에 의해 차단된다. HIV gp41 단백질의 DP107 도메인과 DP178 도메인(즉, HR1 도메인과 HR2 도메인)은 서로 비공유적으로 결합하고, 이들의 상호작용은 바이러스의 정상적인 감염에 필요하다. DP107과 DP178 사이, 및/또는 DP107-유사 펩티드와 DP178-유사 펩티드 사이의 상호작용을 파괴하는 화합물은 항바이러스 활성을 비롯한 항-융합유발성을 나타낸다.

DP-178은 HIV-1 매개 CD-4⁺ 세포-세포 융합(즉, 합포체 형성) 및 세포-부재 바이러스에 의한 CD-4⁺ 세포의 감염의 잠재적 저해제로서 작용한다. 이러한 항-레트로바이러스 활성에는 HIV가 비감염 CD-4⁺ 세포를 전염시키는 것을 저해하는 것이 포함되나 이로 한정되지 않는다. DP-178은 저농도에서 작용하며, 시험관내 및 동물내에서 무독성을 나타내는 것으로 입증되어 있다. HIV-1 및 HIV-2의 DP-178--상응 영역 내의 아미노산 보존은 보고되어 있다.

DP-178 펩티드의 잠재적 용도는 HIV 전염과 관련된 융합 과정의 저해에서의 용도에 대한 미국 특허 제6,750,008호 및 제6,824,783호뿐만 아니라 미국 특허 제5,464,933호 및 제6,133,418호(이들 모두는 본 명세서에 참고로 도입됨)에도 기재되어 있다.

항바이러스 활성을 보이고/보이거나, 항-막 융합 능력을 보이거나, HIV-1을 제외한 레트로바이러스 및 비레트로바이러스성 바이러스에서 코일 형태로 감겨진-코일 펩티드 구조를 수반하는 세포내 과정을 조절하는 능력을 보이는, DP178/DP107, DP178-유사/DP107-유사 또는 HR1/HR2 상호작용의 조절제뿐만 아니라 DP-178 및 DP-107의 일부, 상동체 및 유사체도 연구되었다. 이러한 연구에서 바이러스는 원숭이 면역결핍 바이러스(미국 특허 제6,017,536호), 호흡기 세포융합 바이러스(미국 특허 제6,228,983호; 제6,440,656호; 제6,479,055호; 제6,623,741호), 엡스테인-바 바이러스(미국 특허 제6,093,794호; 제6,518,013호), 파라인플루엔자 바이러스(미국 특허 제6,333,395호). 인플루엔자 바이러스(미국 특허 제6,068,973호; 제6,060,065호) 및 홍역 바이러스(미국 특허 제6,013,263호)를 포함한다. 상기 특허들 전부는 본 명세서에 참고로 도입된다.

DP-178의 시판 형태는 푸제온^®(엔푸비르티드(enfuvirtide), Roche Laboratories Inc. and Trimeris, Inc.)이다. 푸제온^®은 아세틸화된 N-말단 및 C-말단으로서의 카르복스아미드를 가지며, 하기 일차 아미노산 서열로 기재된다: CH₃CO-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂. 푸제온^®은 계속되는 항-레트로바이러스 요법에도 불구하고 HIV-1 복제를 보이는 HIV-1 환자에서 다른 항바이러스제와 함께 사용된다.

본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,464,933호 및 제6,824,783호에는 아미노 및/또는 카르복시 말단에 존재하는 소수성 기와 같은 화학적 기를 가진 DP-178 분자뿐만 아니라 아미노 및 카르복시 말단 절단, 치환, 삽입, 결실, 부가 또는 거대분자 담체 기를 가진 분자를 포함하나 이들로 한정되지 않는 DP-178, DP-178 단편, 유사체 및 상동체가 기재되어 있다. 추가 변이체에는 미국 특허 제6,830,893호에 기재된 것들, 및 미국 특허 제6,861,059호에 개시된 DP-178의 유도체가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. T-20 하이브리드 폴리펩티드 세트는 미국 특허 제6,656,906호, 제6,562,787호, 제6,348,568호 및 제6,258,782호에 기재되어 있고, DP-178-독소 융합체는 미국 특허 제6,627,197호에 기재되어 있다.

HAART(고 활성 항-레트로바이러스 요법)는 바이러스 적재를 감소시키는 소수의 항-레트로바이러스제 부류로부터 선택된 약물을 병용하는 HIV에 대한 표준 요법이다. 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,861,059호는 하나 이상의 다른 항바이러스 치료제 예컨대, 역전사 저해제(예를 들어, AZT, ddI, ddC, ddA, d4T, 3TC, 또는 다른 디데옥시뉴클레오티드 또는 디데옥시플루오로뉴클레오시드) 또는 HIV 단백질분해효소 저해제(예를 들어, 인디나비르; 리토나비르)와 함께 DP-178 또는 DP-107 또는 이들의 유도체를 사용하여 HIV-1 감염을 치료하거나 HIV-1 복제를 저해하는 방법을 개시한다. 다른 항바이러스제에는 사이토카인(예를 들어, rIFNα, rIFNβ, rIFNγ), 바이러스 mRNA 캡핑의 저해제(예를 들어, 리바비린), HIV 단백질분해효소 저해제(예를 들어, ABT-538 및 MK-639), 항-HIV 활성을 가진 지질-결합 분자로서의 앰포테리신 B, 및 당단백질 프로세싱의 저해제로서의 캐스타노스퍼민(castanospermine)이 포함된다. 역전사 저해제, 인테그라제(integrase) 저해제, 단백질분해효소 저해제, 사이토카인 길항제 및 케모카인 수용체 조절제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 항바이러스제와 T-20의 잠재적 병용 요법은 미국 특허 제6,855,724호; 제6,844,340호; 제6,841,558호; 제6,833,457호; 제6,825,210호; 제6,811,780호; 제6,809,109호; 제6,806,265호; 제6,768,007호; 제6,750,230호; 제6,706,706호; 제6,696,494호; 제6,673,821호; 제6,673,791호; 제6,667,314호; 제6,642,237호; 제6,599,911호; 제6,596,729호; 제6,593,346호; 제6,589,962호; 제6,586,430호; 제6,541,515호; 제6,538,002호; 제6,531,484호; 제6,511,994호; 제6,506,777호; 제6,500,844호; 제6,498,161호; 제6,472,410호; 제6,432,981호; 제6,410,726호; 제6,399,619호; 제6,395,743호; 제6,358,979호; 제6,265,434호; 제6,248,755호; 제6,245,806호; 및 제6,172,110호를 비롯한 다수의 참고문헌에 기재되어 있다.

DP-178에 대한 잠재적 전달 시스템에는 미국 특허 제6,844,324호 및 제6,706,892호에 기재된 것들이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 봉입체 형태로 T-20을 제조하는 방법은 미국 특허 제6,858,410호에 기재되어 있다.

증강된 면역 반응을 불러 일으킬 수 있는 항원성 폴리펩티드는 질환 및/또는 질환 원인 물질(호흡기 세포융합 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)를 포함하나 이들로 한정되지 않음)에 대한 면역 반응을 상승시키고/시키거나 면역적으로 효과적인 반응을 일으킨다.

본 발명은 짧은 혈장 반감기를 가진 BPFI를 전달하는 것과 관련된 문제점을 해결한다. 본 발명의 화합물은 긴 순환 반감기를 가진 또 다른 단백질 예컨대, 면역글로불린의 Fc 부위 또는 알부민에 융합된 BPFI를 포함한다.

HIV 수명 주기의 여러 단계가 치료적 개재에 대한 표적으로 간주된다(Mitsuya, H. et al., 1991, FASEB J. 5:2369-2381). 상기 개재는 HIV가 세포막에 결합하는 것, HIV RNA 게놈이 DNA로 역전사되는 것, 또는 바이러스가 숙주 세포를 빠져 나와 새로운 세포 표적을 감염시키는 것을 잠재적으로 저해할 수 있다.

세포 내로의 바이러스의 도입, 즉 HIV 감염의 최초 단계를 저해할 수 있는 약물을 개발하기 위한 시도가 있다. T-20은 다른 항바이러스 치료제와 상이한 기작으로 HIV를 표적화하는, CD4⁺ 세포와 HIV-1의 융합 저해제로서 작용한다. 미국 특허 제6,861,059호는 하나 이상의 다른 항바이러스 치료제 예컨대, 역전사효소 저해제(예를 들어, AZT, ddI, ddC, ddA, d4T, 3TC, 또는 다른 디데옥시뉴클레오티드 또는 디데옥시플루오로뉴클레오시드) 또는 HIV-1 단백질분해효소의 저해제(예를 들어, 인디나비르; 리토나비르)와 함께 DP-178 또는 DP-107 또는 이들의 유도체를 사용하여 HIV-1 감염을 치료하거나 HIV-1 복제를 저해하는 방법을 개시한다. 다른 항바이러스제에는 사이토카인(예를 들어, rIFNα, rIFNβ, rIFNγ), 바이러스 mRNA 캡핑의 저해제(예를 들어, 리바비린), HIV 단백질분해효소의 저해제(예를 들어, ABT-538 및 MK-639), 항-HIV 활성을 가진 지질 결합 분자로서의 앰포테리신 B, 및 당단백질 프로세싱의 저해제로서의 캐스타노스퍼민이 포함된다.

본 발명의 화합물은 N-말단 및 C-말단을 가진 제2 폴리펩티드에 융합된 N-말단 및 C-말단을 가진 제1 폴리펩티드를 포함하는 이종 융합 단백질을 포함하는데, 이때 상기 제1 폴리펩티드는 BPFI 예컨대, 음이온성 펩티드, HR-C 또는 HR-N이고, 상기 제2 폴리펩티드는 a) 인간 알부민; b) 인간 알부민 유사체; 및 c) 인간 알부민의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되고, 이때 제1 폴리펩티드의 C-말단은 제2 폴리펩티드의 N-말단에 융합되어 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 N-말단 및 C-말단을 가진 제2 폴리펩티드에 융합된 N-말단 및 C-말단을 가진 제1 폴리펩티드를 포함하는 이종 융합 단백질을 포함하는데, 이때 제1 폴리펩티드는 BPFI 예컨대, 음이온성 펩티드, HR-C 또는 HR-N이고, 상기 제2 폴리펩티드는 a) 인간 알부민; b) 인간 알부민 유사체; 및 c) 인간 알부민의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되고, 이때 제1 폴리펩티드는 링커, 펩티드 링커, 프로드러그 링커 또는 수용성 중합체를 통해 제2 폴리펩티드에 융합되어 있다. 펩티드 링커는 a) 글리신 풍부 펩티드; b) 서열 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_n을 가진 펩티드(이때, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상임); 및 c) 서열 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]₃을 가진 펩티드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 추가 화합물은 N-말단 및 C-말단을 가진 제2 폴리펩티드에 융합된 N-말단 및 C-말단을 가진 제1 폴리펩티드를 포함하는 이종 융합 단백질을 포함하는데, 이때 상기 제1 폴리펩티드는 BPFI 예컨대, 음이온성 펩티드, HR-C 또는 HR-N이고, 상기 제2 폴리펩티드는 a) 면역글로불린의 Fc 부분; b) 면역글로불린의 Fc 부분의 유사체; 및 c) 면역글로불린의 Fc 부분의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되고, 이때 제1 폴리펩티드의 C 말단은 제2 폴리펩티드의 N-말단에 융합되어 있다. BPFI 예컨대, 음이온성 펩티드, HR-C 또는 HR-N은 펩티드 링커 프로드러그 링커 또는 수용성 중합체를 통해 제2 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 펩티드 링커는 a) 글리신 풍부 펩티드; b) 서열 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_n을 가진 펩티드(이때, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상임); c) 서열 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]₃을 가진 펩티드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

이종 융합 단백질의 일부인 음이온성 펩티드, HR-C 또는 HR-N은 다수의 아미노산 치환을 가질 수 있고, 분자의 천연 형태와 상이한 6개, 5개 4개, 3개, 2개 또는 1개 이상의 아미노산을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 이종 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 본원에 기재된 벡터로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포를 포함한다. 이종 융합 단백질이 검출가능한 양으로 발현되는 조건 하에서 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 전사하고 번역하는 단계를 포함하는 이종 융합 단백질의 제조 방법도 포함된다.

본 발명은 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 BPFI 분자를 제공한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산을 갖는 BPFI는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 번역 후 변형은 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 방사성핵종; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터(chelator); 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 수용성 덴드리머(dendrimer); 시클로덱스트린; 저해성 리보핵산; 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광발색단; 금속 함유 부분; 방사성 부분; 새로운 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된(photocaged) 부분; 광이성질체화성 부분; 바이오틴; 바이오틴의 유도체; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성(photocleavable) 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위 원소-표지 부분; 생체물리적 프로브; 형광 기; 화학발광 기; 전자 조밀 기; 자성 기; 인터킬레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 또는 상기 물질 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 제2 반응성 기를 포함하는 분자를 특정 반응성 기에 적합한 것으로 당업자에게 공지되어 있는 화학적 방법을 이용하여 제1 반응성 기를 포함하는 하나 이상의 비-천연 아미노산에 부착시킨 단계를 포함한다. 예를 들면, 제1 반응성 기는 알키닐 잔기(비-천연 아미노산인 p-프로파길옥시페닐알라닌을 포함하나 이로 한정되지 않으며, 이때 프로파길 기는 때때로 아세틸렌 부분으로도 지칭됨)이고, 제2 반응성 기는 아지도 부분이고, [3 + 2] 시클로부가 화학적 방법이 이용된다. 또 다른 예에서, 제1 반응성 기는 아지도 부분(비-천연 아미노산인 p-아지도-L-페닐알라닌 내의 아지도 부분을 포함하나 이로 한정되지 않음)이고, 제2 반응성 기는 알키닐 부분이다. 본 발명의 변형된 BPFI의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하는 하나 이상의 비-천연 아미노산(케토 작용기를 함유하는 비-천연 아미노산을 포함하나 이로 한정되지 않음)은 하나 이상의 번역 후 변형이 사카라이드 부분을 포함하는 경우 사용된다. 일부 실시양태에서, 번역 후 변형은 진핵세포 또는 비-진핵세포 중에서 생체내에서 제조된다.

일부 실시양태에서, 단백질은 한 숙주 세포에 의해 생체내에서 만들어지는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 이때 번역 후 변형은 또 다른 유형의 숙주 세포에 의해서는 정상적으로 만들어지지 않는다. 일부 실시양태에서, 단백질은 진핵세포에 의해 생체내에서 만들어진 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 이때 번역 후 변형은 비-진핵세포에 의해서는 정상적으로 만들어지지 않는다. 번역 후 변형의 예는 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 인산화, 당지질-결합 변형 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라진 결합에 의해 올리고사카라이드를 아스파라진에 부착시킨 단계를 포함한다(올리고사카라이드가 (GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc 등을 포함하는 경우를 포함하나 이들로 한정되지 않음). 또 다른 실시양태에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린, GalNAc-트레오닌, GlcNAc-세린, 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 올리고사카라이드(Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하나 이로 한정되지 않음)를 세린 또는 트레오닌에 부착시킨 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 분비 또는 국소화 서열 또는 펩티드, 에피토프 태그(tag), FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 태그 또는 링커의 예로는 폴리펩티드, 중합체, 친화성 태그, 항원, 검출 태그, 이미징 태그, 다수의-구성원 결합 복합체의 구성원 및 방사성-동위원소 태그가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 친화성 태그 및 검출 태그의 예로는 폴리-His 태그, 바이오틴, 아비딘, 단백질 A, 단백질 G, 및 면역글로불린 에피토프를 포함하나 이로 한정되지 않는 항원이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

용어 "국소화 펩티드"는 분비 신호 서열의 예들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 분비 신호 서열의 예로는 원핵 분비 신호 서열, 진핵 분비 신호 서열, 박테리아 발현을 위해 5'-최적화된 진핵 분비 신호 서열, 새로운 분비 신호 서열, 펙테이트 라이아제(pectate lyase) 분비 신호 서열, Omp A 분비 신호 서열, 및 파지 분비 신호 서열이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 분비 신호 서열의 예로는 STII(원핵), Fd GIII 및 M13(파지), Bgl2(효모), 및 트랜스포존으로부터 유도된 신호 서열 bla가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 분비 신호 서열로는 박테리아 분비 신호 서열, 효모 분비 신호 서열, 곤충 분비 신호 서열, 포유동물 분비 신호 서열 및 독특한 분비 신호 서열이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. "국소화 서열"의 또 다른 예로는 TrpLE 서열이 있으나, 이로 한정되지 않는다.

원하는 단백질 또는 폴리펩티드는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 비-천연 아미노산을 함유할 수 있다. 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있으며, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 상이한 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 상이한 부위가 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 천연-발생 형태의 단백질로 존재하는 1개 이상의 (그러나, 아미노산 전부보다 적은 수의) 특정 아미노산이 비-천연 아미노산으로 치환된다.

치료 활성을 가진 임의의 BPFI 또는 이의 단편이 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 BPFI의 다수의 예가 제공되어 있다. 그러나, 제공된 목록은 전부가 아니며 본 발명에서 사용될 수 있는 BPFI의 수 또는 종류를 어떠한 방식으로든 한정하지 않는다. 따라서, 임의의 BPFI, 및/또는 신규 BPFI를 비롯한 임의의 BPFI로부터 제조된 단편이 본 발명에 따라 변형되어 치료적으로 사용될 수 있다.

본 발명은 비-천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 BPFI를 기초로 하는 방법 및 조성물을 제공한다. 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 일반적으로 발생되는 20종의 아미노산과 반응하지 않으면서, 비-천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산을 포함하나 이로 한정되지 않는 아미노산과 특이적으로 화학 반응하는 것을 포함하는 화학적 접합 기법을 이용하여 BPFI 내로 도입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI 예컨대, 음이온성 펩티드, HR-C 또는 HR-N은 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄를 통해 수용성 중합체, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 결합된다. 본 발명은 케톤, 아지드 또는 아세틸렌 부분을 포함하나 이들로 한정되지 않는 20종의 천연적으로 도입된 아미노산에서는 발견되지 않는 작용기 또는 치환기를 함유하는 아미노산을 포함하나 이들로 한정되지 않는 비-유전적으로 코딩된 아미노산을 셀렉터 코돈에 반응하여 단백질 내로 선택적으로 도입한 후, 이러한 아미노산을 적절한 반응성 PEG 유도체를 사용하여 변형시키는 단계를 포함하는, PEG 유도체를 사용한 단백질의 선택적 변형에 매우 효과적인 방법을 제공한다. 일단 아미노산 측쇄가 도입되면, 아미노산 측쇄는 천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 특정 작용기 또는 치환기에 적합한 것으로 당업자에게 공지된 화학적 방법을 이용하여 변형시킬 수 있다. 수용성 중합체를 단백질 내로 도입하기 위한 매우 다양한 공지된 화학적 기법들이 본 발명에서 사용되기에 적합하다. 이러한 방법은 각각 아세틸렌 또는 아지드 유도체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 것과의 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 반응(예를 들면, 문헌[Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; and, Huisgen, R. in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176] 참조)을 포함하나 이로 한정되지 않는다.

휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 방법은 친핵성 치환 반응이 아닌 시클로부가 반응을 포함하기 때문에, 단백질은 매우 선택적으로 변형될 수 있다. 반응은 촉매량의 Cu(I) 염을 반응 혼합물에 첨가함으로써 실온에서 우수한 위치선택성(regioselectivity)(1,4 > 1,5)을 나타내면서 수성 조건 하에 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Tornoe, et al., (2002) Org. Chem. 67: 3057-3064; and, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596-2599]; 및 국제특허공보 공개 제WO 03/101972호를 참조할 수 있다. [3 + 2] 시클로부가를 통해 본 발명의 단백질에 부가될 수 있는 분자는 아지도 또는 아세틸렌 유도체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 적합한 작용기 또는 치환기를 갖는 거의 모든 분자를 포함한다. 이러한 분자들은 각각 p-아지도-페닐알라닌을 포함하나 이로 한정되지 않는 아지도 기, 또는 p-프로파길옥시페닐알라닌을 포함하나 이로 한정되지 않는 아세틸렌기를 갖는 비-천연 아미노산에 부가될 수 있다.

일반적으로, 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가로부터 생기는 5원 고리는 환원 환경 하에 일반적으로 가역성을 나타내지 않고, 장기간 동안 수성 환경 하에 가수분해에 대해 안정하다. 결과적으로, 매우 다양한 물질의 물리적 및 화학적 특성은 본 발명의 활성 PEG 유도체를 사용하여 적합한 수성 조건 하에 변형시킬 수 있다. 훨씬 더 중요하게는, 아지드 및 아세틸렌 부분이 서로 특이적이기 때문에(그리고, 예를 들면, 유전적으로 코딩된 20종의 일반 아미노산 중 어느 것과도 반응하지 않기 때문에), 단백질은 극도로 높은 선택성을 나타내면서 하나 이상의 특정 부위에서 변형될 수 있다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 아세틸렌 또는 아지드 부분을 갖는 PEG 유도체 및 관련된 친수성 중합체의 가수분해적으로 안정한 수용성 유도체를 제공한다. 아세틸렌 부분을 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈에 반응하여 단백질 내로 선택적으로 도입된 아지드 부분과의 커플링에 대해 매우 선택적이다. 유사하게, 아지드 부분을 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈에 반응하여 단백질 내로 선택적으로 도입된 아세틸렌 부분과의 커플링에 대해 매우 선택적이다.

보다 구체적으로, 아지드 부분은 알킬 아지드, 아릴 아지드 및 이들 아지드의 유도체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 알킬 및 아릴 아지드의 유도체는, 아세틸렌-특이적 반응성이 유지되는 한, 다른 치환기를 포함할 수 있다. 아세틸렌 부분은 알킬 및 아릴 아세틸렌, 및 이들 각각의 유도체를 포함한다. 알킬 및 아릴 아세틸렌의 유도체는, 아지드-특이적 반응성이 유지되는 한, 다른 치환기를 포함할 수 있다.

본 발명은 매우 다양한 작용기, 치환기 또는 부분을 갖는 물질과, 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 방사성핵종; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 저해성 리보핵산; 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광발색단; 금속 함유 부분; 방사성 부분; 새로운 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 광이성질체화성 부분; 바이오틴; 바이오틴의 유도체; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위 원소-표지 부분; 생체물리적 프로브; 형광 기; 화학발광 기; 전자 조밀 기; 자성 기; 인터킬레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 또는 상기 물질 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 물질의 접합체를 제공한다. 또한, 본 발명은 아지드 또는 아세틸렌 부분을 갖는 물질과 상응하는 아세틸렌 또는 아지드 부분을 갖는 PEG 중합체 유도체의 접합체를 포함한다. 예를 들면, 아지드 부분을 함유하는 PEG 중합체는 아세틸렌 작용기를 보유하는 비-유전적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 단백질 내의 한 위치에서 생물학적 활성 분자에 커플링될 수 있다. PEG와 생물학적 활성 분자를 커플링시키는 결합은 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 생성물을 포함하나 이로 한정되지 않는다.

PEG가 생체물질의 표면을 변형시키는 데 사용될 수 있다는 것은 당업계에 잘 확립되어 있다(예를 들면, 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,610,281호, 및 문헌[Mehvar, R., J. Pharmaceut. Sci., 3 (1); 125-136 (2000)] 참조). 또한, 본 발명은 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 결합을 통해 표면에 커플링된 본 발명의 아지드 함유 중합체 또는 아세틸렌 함유 중합체 중 하나 이상 및 하나 이상의 반응성 아지드 또는 아세틸렌 부위를 갖는 표면을 포함하는 생체물질을 포함한다. 또한, 생체물질 및 다른 물질들이 아지드 또는 아세틸렌 결합 이외의 결합, 예를 들면 카르복실산, 아민, 알콜 또는 티올 잔기를 포함하는 결합을 통해 아지드 활성화 중합체 유도체 또는 아세틸렌 활성화 중합체 유도체에 커플링되어 후속 반응에 이용가능한 아지드 또는 아세틸렌 부분을 남길 수 있다.

본 발명은 본 발명의 아지드 함유 중합체 또는 아세틸렌 함유 중합체를 합성하는 방법을 포함한다. 아지드 함유 PEG 유도체의 경우, 아지드는 중합체의 탄소 원자에 직접 결합될 수 있다. 별법으로, 아지드 함유 PEG 유도체는 생성되는 중합체가 그의 말단에서 아지드 부분을 갖도록 한 말단에서 아지드 잔기를 갖는 결합제를 통상의 활성화된 중합체에 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 아세틸렌 함유 PEG 유도체의 경우, 아세틸렌은 중합체의 탄소 원자에 직접 결합할 수 있다. 별법으로, 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 생성되는 중합체가 그의 말단에서 아세틸렌 부분을 갖도록 한 말단에서 아세틸렌 부분을 갖는 결합제를 통상의 활성화된 중합체에 부착시킴으로써 제조될 수 있다

보다 구체적으로, 아지드 함유 PEG 유도체의 경우, 하나 이상의 활성 히드록실 부분을 갖는 수용성 중합체는 그 위에 하나 이상의 반응성 부분, 예를 들면 메실레이트, 트레실레이트, 토실레이트 또는 할로겐 이탈기를 갖는 치환된 중합체를 생성하도록 반응한다. 설포닐 산 할로겐화물, 할로겐 원자 및 다른 이탈기를 함유하는 PEG 유도체의 제조 및 용도는 당업자에게 공지되어 있다. 그 다음, 생성되는 치환된 중합체는 중합체의 말단에서 더 많은 반응성 기가 아지드 잔기로 치환되도록 반응한다. 별법으로, 하나 이상의 활성 친핵성 또는 친전자성 부분을 갖는 수용성 중합체는 공유 결합이 PEG 중합체와 결합제 사이에서 형성되고, 아지드 부분이 중합체의 말단에 위치하도록 한 말단에서 아지드를 갖는 결합제와 반응한다. 아민, 티올, 히드라지드, 히드라진, 알콜, 카르복실레이트, 알데히드, 케톤, 티오에스테르 등을 비롯한 친핵성 및 친전자성 부분은 당업자에게 공지되어 있다.

보다 구체적으로, 아세틸렌 함유 PEG 유도체의 경우, 하나 이상의 활성 히드록실 부분을 갖는 수용성 중합체는 아세틸렌 부분을 함유하는 전구체로부터 할로겐 또는 다른 활성화된 이탈기가 이탈되도록 반응한다. 별법으로, 하나 이상의 활성 친핵성 또는 친전자성 부분을 갖는 수용성 중합체는 공유 결합이 PEG 중합체와 결합제 사이에서 형성되고, 아세틸렌 부분이 중합체의 말단에 위치하도록 한 말단에서 아세틸렌를 갖는 결합제와 반응한다. 유기 합성 및 PEG 유도체의 제조 및 용도에 대한 내용에서 할로겐 부분, 활성화된 이탈기, 친핵성 및 친전자성 부분의 용도 역시 당업자들에게 잘 확립되어 있다.

또한, 본 발명은 수용성 중합체, 예를 들면 아지드 또는 아세틸렌 부분을 함유하는 PEG 및 PEG 유도체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 변형된 단백질에 다른 물질을 부가하기 위한 단백질의 선택적 변형 방법을 제공한다. 생체적합성, 안정성, 용해도, 및 면역원성 결여가 중요하고, 동시에 종래 당업계에 공지된 것보다 선택적인 PEG 유도체와 단백질의 결합 수단이 제공되는 경우, 아지드- 및 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 표면 및 분자의 성질을 개질하는 데 사용될 수 있다.

II. 펩티드 및 폴리펩티드

본 발명의 방법을 사용하여 제조할 수 있는 BPFI는 천연적으로 발생하든 아니면 비-천연적으로 코딩되든 임의의 길이 또는 서열을 가진, 아미노산들의 임의의 조합물일 수 있다. 한 가지 요건은 BPFI 쇄 내의 하나 이상의 아미노산이 비-천연적으로 코딩된 아미노산이어야 한다는 것이다. 폴리펩티드가 생합성적으로 제조되는 경우, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 mRNA로부터 번역될 때 펩티드 쇄 내로 도입된다. 화학적 합성에 의해 제조될 수 있는 본 발명의 신규 BPFI는 합성 과정 동안 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 도입할 수 있다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 아미노산 쇄 내의 임의의 위치에 배치될 수 있고, 생물 활성 펩티드, 링커 또는 융합 파트너 예컨대, 알부민 또는 Fc를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 최종 BPFI의 임의의 부분 내에 위치될 수도 있다.

본원에서 음이온성 펩티드, HR-C 또는 HR-N 폴리펩티드에 대한 언급은 본 발명에서 사용하기에 적합한 펩티드 또는 폴리펩티드의 일례로서 이들을 사용한다는 것을 의미한다. 따라서, 음이온성 펩티드, HR-C 또는 HR-N에 대해 본원에 기재된 변형 및 화학적 기법은 본원에 구체적으로 나열된 것들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 다른 BPFI에 동일하게 적용될 수 있다.

합성 비-천연 아미노산, 치환된 아미노산 또는 하나 이상의 D-아미노산을 비롯한 비-천연 아미노산을 본 발명의 이종 융합 단백질 내로 도입하는 것은 다수의 다양한 면에서 유리할 수 있다. D-아미노산 함유 펩티드 등은 L-아미노산 함유 대응물에 비해 시험관내 또는 생체내에서 증가된 안정성을 나타낸다. 따라서, D-아미노산을 포함하는 펩티드 등의 구축은 보다 높은 세포내 안정성이 바람직하거나 필요할 때 특히 유용할 수 있다. 보다 구체적으로, D-펩티드 등은 내인성 펩티다제 및 단백질분해효소에 대한 내성을 가짐으로써, 분자의 개선된 생체이용성 및 생체내 연장된 수명이 필요한 경우 이러한 성질을 제공한다. 또한, D-펩티드 등은 T 헬퍼 세포에의 주요 조직적합성 복합체 클래스 II-제한 제시를 위해 효율적으로 프로세싱될 수 없으므로, 온전한 유기체 내에서 체액성 면역 반응을 유도할 가능성이 낮다.

III. 본 발명에서 사용하기 위한 일반적인 재조합 핵산 방법

본 발명의 다수의 실시양태에서, 본 발명의 BPFI를 코딩하는 핵산은 단리하고, 클로닝하고, 종종, 재조합 방법을 이용하여 변경시킨다. 이러한 실시양태는 단백질 발현을 위해, 또는 변이체, 유도체, 발현 카세트(cassette), 또는 BPFI로부터 유도된 다른 서열을 생성하는 동안에 이용되나, 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 이종 프로모터에 작동가능하게 결합된다. 음이온성 펩티드, HR-C 또는 HR-N의 단리 및 숙주 세포에서의 음이온성 펩티드, HR-C 또는 HR-N의 제조는 예를 들면, 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제[ ]호에 기재되어 있다.

비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 모 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 합성된 후, 관련 아미노산 잔기(들)의 도입(즉, 도입 또는 치환) 또는 제거(즉, 결실 또는 치환)에 영향을 주기 위해 뉴클레오티드 서열을 변화시킴으로써 생성된다. 뉴클레오티드 서열은 통상적인 방법에 따라 부위-지정 돌연변이유발에 의해 편리하게 변형될 수 있다. 별법으로, 뉴클레오티드 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기의 사용을 포함하나 이로 한정되지 않는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있으며, 이때 상기 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 하여, 바람직하게는, 재조합 폴리펩티드가 생성되는 숙주 세포에서 유리한 코돈을 선택하여 디자인한다. 예를 들면, 원하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 몇몇 작은 올리고뉴클레오티드 코딩은 PCR, 결찰(ligation) 또는 결찰 연쇄 반응에 의해 합성되어 조립될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 참고로 도입되는 문헌[Barany, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193(1991)], 및 미국 특허 제6,521,427호를 참조할 수 있다.

본 발명은 재조합 유전체학 분야의 통상의 기술을 이용한다. 본 발명에 이용되는 일반적 방법을 개시하는 기본 교재는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)]을 포함한다.

분자 생물학적 기법을 설명하는 일반 교재는 문헌[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques. Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) ("Ausubel")]을 포함한다. 이러한 교재들은 비-천연 아미노산, 오르토고날 tRNA, 오르토고날 합성효소 및 그들의 쌍을 포함하는 단백질을 생성하기 위한 셀렉터 코돈을 포함하는 유전자의 생성을 포함하나 이로 한정되지 않는 것과 관련된 돌연변이유발, 벡터의 사용, 프로모터 및 많은 다른 관련 주제를 기술하고 있다. 프로모터로는 원핵세포 프로모터, 진핵세포 프로모터, 박테리아 프로모터, 효모 프로모터, 곤충 프로모터, 포유동물 프로모터, 독특한 프로모터 및 유도가능한 프로모터가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

다양한 유형의 돌연변이유발은, tRNA의 라이브러리 생성, 합성효소의 라이브러리 생성, 셀렉터 코돈의 생성, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드에서 비-천연 아미노산을 코딩하는 셀렉터 코돈의 삽입을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 본 발명에서 사용된다. 이들은 부위-지정, 랜덤 점 돌연변이유발, 상동 재조합, DNA 셔플링(shuffling) 또는 다른 반복적(recursive) 돌연변이유발 방법, 키메라 구축, 우라실 함유 주형을 사용한 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발, 포스포로티오에이트-변형 DNA 돌연변이유발, 갭을 가진(gapped) 이중체 DNA를 사용한 돌연변이유발 등, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 적합한 방법은 점 미스매치 복구(point mismatch repair), 복구능-결핍 숙주 균주를 사용한 돌연변이유발, 제한-선택 및 제한-정제, 결실 돌연변이유발, 총 유전자 합성에 의한 돌연변이유발, 이중 가닥 절단 복구(double-strand break repair) 등을 포함한다. 키메라 구성체를 사용하는 돌연변이유발을 포함하나 이들로 한정되지 않는 돌연변이유발도 본 발명에 포함된다. 한 실시양태에서, 돌연변이유발은 서열, 서열 비교, 물성, 3차 또는 4차 구조, 결정 구조 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 천연 발생 분자, 또는 변경된 또는 돌연변이된 천연 발생 분자의 공지된 정보에 의해 결정될 수 있다.

본 명세서에 기재된 교재 및 예에는 이러한 절차가 개시되어 있다. 하기 문헌 및 그에 인용된 참고문헌에서 추가 정보를 발견할 수 있다: 문헌[Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254 (2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57: 369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19: 423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229: 1193-1201 (1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237: 1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242: 240-245 (1988); Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease NciI cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16: 791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154: 350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38: 879-887 (1984); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Carter, Improved oligotiucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al., Importance of Hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the α-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34: 315-323 (1985); Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455 (1993); Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19: 456-460 (2001); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); and, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)]. 또한, 많은 상기 방법에 대한 더 상세한 설명은 다양한 돌연변이유발 방법을 이용한 과제 해결에 대한 유용한 제어를 기술하는 문헌[Methods in Enzymology Volume 154]에서 찾을 수 있다.

또한, 본 발명은 오르토고날 tRNA/RS 쌍을 통한 비-천연 아미노산의 생체내 도입을 위한 진핵 숙주 세포, 비-진핵 숙주 세포 및 유기체에 관한 것이다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구성체를 사용하여 유전적으로 조작한다(형질전환, 형질도입 또는 형질감염을 포함하나 이로 한정되지 않음). 벡터는 예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 파지, 박테리아, 바이러스, 네이키드(naked) 폴리뉴클레오티드 또는 접합된 폴리뉴클레오티드의 형태일 수 있다. 벡터는 전기천공법(electroporation)(문헌[Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5824 (1985)] 참조), 바이러스 벡터에 의한 감염, 작은 비드 또는 입자의 매트릭스 내에 또는 표면 상에 핵산을 가진 소립자에 의한 고속 탄두 침투(ballistic penetration)(문헌[Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)] 참조)를 비롯한 표준 방법에 의해 세포 및/또는 미생물 내로 도입된다.

유전적으로 조작된 숙주 세포는 예를 들면, 스크리닝 단계, 프로모터의 활성화 또는 형질전환체(transformant)의 선별과 같은 단계에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 경우에 따라, 이러한 세포들은 형질전환 유기체 내에서 배양될 수 있다. 세포 단리 및 배양(예를 들면, 후속 핵산 단리)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 것에 대한 다른 유용한 참고문헌은 문헌[Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third Edition, Wiley-Liss, New York] 및 여기서 인용된 참고문헌[Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell. Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL]을 포함한다.

표적 핵산을 세포 내로 도입하는 몇몇 공지된 방법이 이용가능하며, 이들 중 임의의 방법을 본 발명에서 사용할 수 있다. 이들 방법은 수용 세포와, DNA를 함유하는 박테리아 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격(projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 (이하에서 추가로 논의됨) 등을 포함한다. 박테리아 세포는 본 발명의 DNA 구성체를 함유하는 다수의 플라스미드를 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 박테리아는 대수기(log phase)까지 생장하고, 박테리아 내의 플라스미드는 당업계에 공지된 다양한 방법(예를 들면, 문헌[Sambrook] 참조)에 의해 단리될 수 있다. 또한, 박테리아으로부터 플라스미드를 정제하기 위한 다수의 키트가 시판되고 있다(예를 들면, 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech)로부터 시판되는 이지프렙(EasyPrep)^TM 및 플렉시프렙(FlexiPrep)^TM; 스트라타진(Stratagene)으로부터 시판되는 스트라타클린(StrataClean)^TM; 및 퀴아젠(Qiagen)으로부터 시판되는 퀴아프렙(QIAprep)^TM). 그 다음, 단리되고 정제된 플라스미드를 추가로 조작하여, 세포를 형질감염시키는 데 사용되거나 유기체를 감염시키는 다른 관련 벡터 내로 도입되는 다른 플라스미드를 생성한다. 전형적인 벡터는 전사 및 번역 종결서열(terminator), 전사 및 번역 개시 서열, 및 특정 표적 핵산의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유한다. 경우에 따라, 벡터는 하나 이상의 독립된 종결서열, 진핵생물, 원핵생물 또는 이들 둘다(셔틀(shuttle) 벡터를 포함하나 이로 한정되지 않음)에서 카세트의 복제를 허용하는 서열, 및 원핵 및 진핵 시스템 둘다에 대한 선별 마커(marker)를 함유하는 일반 발현 카세트를 포함한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물 또는, 바람직하게는, 이들 둘다에서 복제 및 도입에 적합하다. 문헌[Giliman & Smith, Gene 8: 81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328: 731 (1987); Schneider, E., et al., Protein Expr. Purif. 6(1): 10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (all supra)]을 참조할 수 있다. 클로닝에 유용한 박테리아 및 박테리오파지(bacteriophage)의 카달로그는 예를 들면, ATCC에 의해 제공되며, 그 예로는 ATCC에 의해 공개된 카달로그[The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds)]가 있다. 또한, 시퀀싱, 클로닝 및 분자 생물학의 다른 측면에 대한 추가 기본 절차 및 기초적인 이론적 고려사항은 문헌[Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY]에서 찾을 수 있다. 또한, 필수적으로 임의의 핵산(및, 표준이든 비표준이든 사실상 임의의 모든 표지 핵산)을 다양한 시판 공급원 중 임의의 공급원, 예를 들면, 밀란드 써티파이드 리젼트 캄파니(Midland Certified Reagent Company)(텍사스 미들랜드 소재, 월드 와이드 웹(World Wide Web) mcrc.com에서 이용가능함), 더 크레이트 아메리칸 진 캄파니(The Great American Gene Company)(캘리포니아주 라모마 소재, 월드 와이드 웹 genco.com에서 이용가능함), 익스프레스젠 인코포레이티드(ExpressGen Inc.)(일리노이주 시카고 소재, 월드 와이드 웹 expressgen.com에서 이용가능함), 오페론 테크놀로지스 인코포레이티드(Operon Technologies Inc.)(캘리포니아주 알라메다 소재) 및 많은 다른 공급원으로부터 특별 주문받거나 일반 주문받을 수 있다.

셀렉터 코돈

본 발명의 셀렉터 코돈은 단백질 생합성 기구의 유전자 코돈 골격(framework)을 확장시킨다. 예를 들면, 셀렉터 코돈은 독특한 3 염기 코돈, 넌센스(nonsense) 코돈, 예를 들면 앰버 코돈(UAG) 또는 오팔 코돈(UGA)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 정지 코돈, 비-천연 코돈, 4개 이상의 염기로 구성된 코돈, 희귀 코돈 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. BPFI의 적어도 일부를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드에서 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 원하는 유전자 내로 도입될 수 있는 셀렉터 코돈의 수가 광범위하게 달라질 수 있다는 것이 당업자에게 자명하다.

한 실시양태에서, 본 방법은 비-천연 아미노산을 진핵세포 내에서 생체내로 도입하기 위한 정지 코돈인 셀렉터 코돈의 사용을 포함한다. 예를 들면, UAG를 포함하나 이들로 한정되지 않는 정지 코돈을 인식하며 원하는 비-천연 아미노산을 가진 O-RS에 의해 아미노아실화된 O-tRNA가 생성된다. 이 O-tRNA는 천연 발생 숙주의 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 인식되지 않는다. 통상적인 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 원하는 폴리펩티드 내의 원하는 부위에, TAG를 포함하나 이들로 한정되지 않는 정지 코돈을 도입할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Sayers, J.R., et al. (1988), 5'-3' Exonuclease if a phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16:791-802]을 참조할 수 있다. O-RS, O-tRNA, 및 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 생체내에서 조합되는 경우, 비-천연 아미노산은 UAG 코돈에 반응하여 도입되어 특정 위치에서 비-천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제공한다.

생체내 비-천연 아미노산의 도입은 진핵 숙주 세포에 유의한 영향을 주지 않으면서 수행할 수 있다. 예를 들면, UAG 코돈에 대한 억제 효율은 엠버 억제자 tRNA를 포함하나 이로 한정되지 않는 O-tRNA와 진핵 방출 인자(eRF를 포함하나 이로 한정되지 않음)(이는 정지 코돈에 결합하여, 리보좀으로부터 성장 펩티드의 방출을 개시함) 사이의 경쟁에 달려 있기 때문에, 이러한 억제 효율은 O-tRNA 및/또는 억제자 tRNA의 발현 수준 증가를 포함하나 이들로 한정되지 않는 수단에 의해 조절될 수 있다.

또한, 셀렉터 코돈은 4개 이상의 염기 코돈, 예를 들면, 4개, 5개 또는 6개 이상의 염기로 구성된 코돈을 포함하나 이들로 한정되지 않는 연장된 코돈을 포함한다. 4개의 염기로 구성된 코돈의 예는 AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 5개의 염기로 구성된 코돈의 예는 AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 한 특징은 프레임쉬프트(frameshift) 억제를 기초로 하여 연장된 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 4개 이상의 염기로 구성된 코돈은 하나 또는 다수의 비-천연 아미노산을 포함하나 이들로 한정되지 않는 아미노산을 동일한 단백질 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 안티코돈(anticodon) 루프, 예를 들면 8 내지 10개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 안티코돈 루프를 갖는 특수 프레임쉬프트 억제자 tRNA를 포함하나 이들로 한정되지 않는 돌연변이된 O-tRNA의 존재 하에서, 4개 이상의 염기로 구성된 코돈은 단일 아미노산으로 판독된다. 다른 실시양태에서, 안티코돈 루프는 4개 이상의 염기로 구성된 코돈, 5개 이상의 염기로 구성된 코돈, 또는 6개 이상의 염기로 구성된 코돈을 포함하나 이들로 한정되지 않는 코돈을 해독(decoding)할 수 있다. 256개의 가능한 4 염기 코돈이 존재하기 때문에, 다수의 비-천연 아미노산은 4개 이상의 염기로 구성된 코돈의 사용에 의해 동일한 세포에서 코딩될 수 있다. 문헌[Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9: 237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769]을 참조할 수 있다.

예를 들면, 4 염기 코돈은 시험관내 생합성 방법을 이용하여 비-천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는 데 사용된다. 예를 들면, 문헌[Ma et al., (1993) Biochemistry. 32: 7939; and Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121: 34]을 참조할 수 있다. CGGG 및 AGGU는 시험관내에서 2개의 화학적으로 아실화된 프레임쉬프트 억제자 tRNA를 사용하여 2-나프틸알라닌 및 라이신의 NBD 유도체를 동시에 스트렙타비딘(streptavidin) 내로 도입하는 데 사용되었다. 예를 들면, 문헌[Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 12194]을 참조할 수 있다. 생체내 연구에서, 무어(Moore) 등은 UAGN 코돈(N은 U, A, G 또는 C일 수 있음)을 억제하는 NCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu 유도체의 능력을 조사하였고, 4개의 염기로 구성된 UAGA가 0 또는 -1 프레임(frame)으로 거의 해독되지 않으면서 13 내지 26%의 효율로 UCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu에 의해 해독될 수 있다는 것을 발견하였다. 문헌[Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298: 195]을 참조할 수 있다. 한 실시양태에서, 희귀 코돈 또는 넌센스 코돈을 기초로 한 연장된 코돈이 본 발명에서 사용될 수 있으며, 이는 다른 원치 않는 부위에서의 미스센스 리드쓰루(missense readthrough) 및 프레임쉬프트 억제를 감소시킬 수 있다.

또한, 소정의 시스템의 경우, 셀렉터 코돈은 3개의 천연 염기로 구성된 코돈 중 하나를 포함할 수 있으며, 이때 내인성 시스템은 천연 염기 코돈을 사용하지 않는다(또는 거의 사용하지 않음). 예를 들면, 이는 3개의 천연 염기로 구성된 코돈을 인식하는 tRNA가 결여된 시스템, 및/또는 3 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함한다.

경우에 따라, 셀렉터 코돈은 비-천연 염기쌍을 포함한다. 이러한 비-천연 염기쌍은 현존하는 유전자 알파벳을 더 연장시킨다. 여분의 1개 염기쌍은 3 염기 코돈의 수를 64개에서 125개로 증가시킨다. 세 번째 염기쌍의 성질은 안정한 선택적 염기페어링(paring), 높은 신뢰도에서의 중합효소에 의한 DNA 내로의 효율적인 효소적 도입, 및 초기(nascent) 비-천연 염기쌍의 합성 후 효율적인 연속 프라이머 연장을 포함한다. 본 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 비-천연 염기쌍에 대한 설명은 예를 들면, 문헌[Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology. 20: 177-182]을 참조한다. 다른 관련 문헌은 하기에 나열된다.

생체내에서 사용하는 경우, 비-천연 뉴클레오시드는 막 투과성을 갖고, 인산화되어 상응하는 트리포스페이트를 형성한다. 또한, 증가된 유전 정보는 안정하고 세포 효소에 의해 파괴되지 않는다. 베너(Benner) 및 다른 사람들에 의해 이루어진 종래의 연구는 정규 와슨-크릭(Watson-Crick) 쌍에서의 수소 결합 패턴과 상이한 수소 결합 패턴을 이용하였는데, 이중 가장 주목할 만한 예는 이소-C:이소-G 쌍이다. 예를 들면, 문헌[Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc., 111: 8322; and Piccirilli et al., (1990) Nature, 343: 33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602]을 참조할 수 있다. 일반적으로, 이들 염기는 어는 정도 천연 염기와 미스페어링(mispairing)하고, 효소적으로 복제될 수 없다. 쿨(Kool) 및 그의 동료들은 염기들 사이의 소수성 팩킹(packing) 상호작용이 수소 결합을 대체하여 염기쌍의 형성을 유도할 수 있다는 점을 입증하였다. 문헌[Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602; and Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825]을 참조할 수 있다. 모든 상기 요건을 만족시키는 비-천연 염기쌍을 개발하려는 노력으로, 슐츠(Schultz), 로메스버그(Romesberg) 및 그의 동료들은 일련의 비-천연 소수성 염기들을 체계적으로 합성하여 연구하였다. PICS:PICS 자가 쌍(self-pair)은 천연 염기쌍보다 안정한 것으로 밝혀졌고, 대장균 DNA 중합효소 I의 클레나우(Klenow) 단편(KF)에 의해 DNA 내로 효율적으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 문헌[McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 11586; and Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 3274]을 참조할 수 있다. 3MN:3MN 자가 쌍은 생물학적 기능에 충분한 효율 및 선택성을 갖는 KF에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc. 122: 8803]을 참조할 수 있다. 그러나, 양쪽 염기 둘다 추가 복제를 위한 사슬 종결제로 작용한다. 최근, 돌연변이 DNA 중합효소는 PICS 자가 쌍을 복제하는 데 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 7AI 자가 쌍도 복제될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc., 123: 7439]을 참조할 수 있다. 또한, 새로운 메탈로염기쌍인 Dipic:Py도 개발되었으며, 상기 염기쌍은 Cu(II) 결합 시 안정한 쌍을 형성한다. 문헌[Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 10714]을 참조할 수 있다. 연장된 코돈 및 비-천연 코돈은 본질적으로 천연 코돈에 오르토고날하기 때문에, 본 발명의 방법은 이 성질을 이용하여 이들에 대한 오르토고날 tRNA를 생성할 수 있다.

또한, 번역 우회(translational bypassing) 시스템을 사용하여 원하는 폴리펩티드 내로 비-천연 아미노산을 도입할 수 있다. 번역 우회 시스템에서, 큰 서열은 유전자 내로 도입되지만, 단백질로 번역되지 않는다. 이 서열은 리보좀이 서열 상에서 호핑하여(hopping), 삽입 부위의 다운스트림(downstream)의 번역을 재개하는 신호(cue)로서 작용하는 구조를 포함한다.

특정한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및/또는 조성물에서 원하는 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그의 일부)는 핵산에 의해 코딩된다. 전형적으로, 핵산은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다.

원하는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 당업자에게 공지되어 있으며 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여, 예를 들면, 비-천연 아미노산의 도입을 위한 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 돌연변이시킬 수 있다. 예를 들면, 원하는 단백질에 대한 핵산은 하나 이상의 비-천연 아미노산을 도입하기 위해 제공되는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 돌연변이된다. 본 발명은 예를 들면, 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는, 임의의 단백질의 돌연변이체 형태를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 변이체를 포함한다. 유사하게, 본 발명은 상응하는 핵산, 즉 하나 이상의 비-천연 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 갖는 임의의 핵산을 포함한다.

BPFI 예를 들면, 음이온성 펩티드, HR-C 또는 HR-N을 코딩하는 핵산 분자는 폴리펩티드의 임의의 원하는 위치에서 시스테인이 도입되도록 용이하게 돌연변이될 수 있다. 시스테인은 반응성 분자, 수용성 중합체, 단백질 또는 매우 다양한 다른 분자를 원하는 단백질 내로 도입하는 데 널리 사용된다. 시스테인을 폴리펩티드의 원하는 위치에 도입하기에 적합한 방법 예컨대, 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,608,183호에 기재된 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 표준 돌연변이유발 기법을 포함한다.

IV. 비-천연적으로 코딩된 아미노산

매우 광범위한 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 임의의 수의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 BPFI 내로 도입할 수 있다. 일반적으로, 도입된 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 유전적으로-코딩된 20종의 일반 아미노산(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)에 대해 실질적으로 화학적 불활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산에서 발견되지 않는 작용기(아지도, 케톤, 알데히드 및 아미노옥시 기를 포함하나 이로 한정되지 않음)와 효율적 및 선택적으로 반응하여 안정한 접합체를 형성하는 측쇄 작용기를 포함한다. 예를 들면, 아지도 작용기를 함유하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI는 중합체(폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하나 이로 한정되지 않음) 또는, 별법으로, 알킨 부분을 함유하는 제2 폴리펩티드와 반응하여 안정한 접합체를 형성함으로써 아지드 및 알킨 작용기의 선택적 반응이 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 생성물을 형성할 수 있게 한다.

알파-아미노산의 일반적 구조는 하기와 같이 표시된다(화학식 I):

[화학식 I]

전형적으로, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 상기 화학식을 갖는 임의의 구조이며, 상기 식 중, R기는 20종의 천연 아미노산에서 사용되는 치환기 이외의 임의의 치환기이고, 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 측쇄의 구조에서만 천연 아미노산과 상이하기 때문에, 천연 발생 폴리펩티드에서 형성되는 것과 동일한 방식으로 (천연적으로 또는 비-천연적으로 코딩된 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는) 다른 아미노산과 아미드 결합을 형성한다. 그러나, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 이들이 천연 아미노산과 구별되게 하는 측쇄 기를 갖는다. 예를 들면, R은 경우에 따라 알킬-, 아릴-, 아실-, 케토-, 아지도-, 히드록실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 셀레노-, 설포닐-, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 에논(enone), 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 아미노 기 등 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 다른 비-천연 발생 아미노산은 광활성화성 가교-링커를 포함하는 아미노산, 스핀-표지 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속 함유 아미노산, 방사능 아미노산, 새로운 작용기를 갖는 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 광케이징되고/되거나 광이성질체화가능한 아미노산, 바이오틴 또는 바이오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 예를 들면 당 치환된 세린, 다른 탄수화물에 의해 변형된 아미노산, 케토 함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자로 치환된 아미노산, 화학적으로 절단될 수 있고/있거나 광절단될 수 있는 아미노산, 약 5개 이상 또는 약 10개 이상의 탄소를 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리에테르 또는 장쇄 탄화수소를 포함하나 이들로 한정되지 않는 천연 아미노산에 비해 연장된 측쇄를 갖는 아미노산, 탄소 결합 당 함유 아미노산, 산화환원 활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산 및 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있고 수용성 중합체와의 반응에 유용한 예시적인 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드, 세미카르바지드, 아지드 및 알킨 반응성 기를 갖는 아미노산들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 사카라이드 부분을 포함한다. 이러한 아미노산의 예로는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라진 및 O-만노사미닐-L-세린이 있다. 또한, 이러한 아미노산의 예로는 아미노산과 사카라이드 사이의 천연 발생 N-결합 또는 0-결합이 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 천연 상태에서 통상적으로 발견되지 않는 공유 결합에 의해 교체되어 있는 예시적 아미노산들이 있다. 또한, 이러한 아미노산의 예로는 천연 발생 단백질에서는 통상적으로 발견되지 않는 사카라이드, 예를 들면 2-데옥시-글루코스, 2-데옥시갈락토스 등이 있다.

본 명세서에 제공된 많은 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 예를 들면, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재), 노나바이오켐(Novabiochem)(독일 다름스타드트 소재의 이엠디 바이오사이언시즈(EMD Biosciences)의 분사), 또는 펩테크(Peptech)(미국 메세사추세츠주 버링톤 소재)로부터 시판된다. 시판되지 않는 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 경우에 따라 본 명세서에 기재된 바와 같이 또는 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 합성된다. 유기 합성기법의 경우, 예를 들면, 문헌[Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, NewYork); and Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참조할 수 있다. 또한, 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2003/0082575호 및 제2003/0108885호를 참조할 수 있다. 또한, 새로운 측쇄를 함유하는 비-천연 아미노산 외에도, 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 비-천연 아미노산은 하기 화학식 II 및 화학식 III으로 표시되는 골격 구조를 포함하나 이들로 한정되지 않는 변형된 골격 구조를 포함한다:

[화학식 II]

[화학식 III]

상기 식 중,

Z는 전형적으로 OH, NH₂, SH, NH-R' 또는 S-R'를 포함하고, X 및 Y는 동일하거나 상이할 수 있으며 전형적으로 S 또는 O를 포함하고, R 및 R'는 경우에 따라 동일하거나 상이할 수 있으며 전형적으로 화학식 I을 갖는 비-천연 아미노산에 대해 전술한 R 기에 대한 치환기들 및 수소로부터 선택된다. 예를 들면, 본 발명의 비-천연 아미노산은 경우에 따라 화학식 II 및 화학식 III으로 표시되는 아미노 또는 카르복실 기에서의 치환을 포함한다. 이러한 유형의 비-천연 아미노산은 20종의 일반 천연 아미노산에 상응하는 측쇄 또는 비-천연 측쇄를 포함하나 이들로 한정되지 않는 것을 갖는 α-히드록시산, α-티오산, α-아미노티오카르복실레이트를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 또한, α-탄소에서의 치환은 경우에 따라 L, D 또는 α-α-이치환 아미노산, 예를 들면 D-글루타메이트, D-알라닌, D-메틸-O-티로신, 아미노부티르산 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 구조적 대체물은 시클릭 아미노산, 예를 들면, 프롤린 유사체 뿐만 아니라, 3, 4, 6, 7, 8 및 9원 고리 프롤린 유사체, β 및 γ 아미노산, 예를 들면, 치환된 β-알라닌 및 γ-아미노 부티르산을 포함한다.

많은 비-천연 아미노산은 천연 아미노산, 예를 들면 티로신, 글루타민, 페닐알라닌 등을 기초로 한 것이고, 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 티로신 유사체는 파라-치환된 티로신, 오르토-치환된 티로신 및 메타-치환 티로신을 포함하며 이들로 한정되지 않으며, 이때 치환된 티로신은 케토 기(아세틸 기를 포함하나 이로 한정되지 않음), 벤조일 기, 아미노 기, 히드라진, 히드록시아민, 티올 기, 카르복시 기, 이소프로필 기, 메틸 기, C₆-C₂₀ 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소, 포화 또는 불포화 탄화수소, O-메틸 기, 폴리에테르 기, 니트로 기, 알키닐 기 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 또한, 다-치환 아릴 고리도 고려된다. 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 글루타민 유사체는 α-히드록시 유도체, γ-치환된 유도체, 시클릭 유도체 및 아미드 치환된 글루타민 유도체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 예시적인 페닐알라닌 유사체는 파라-치환된 페닐알라닌, 오르토-치환된 페닐알라닌, 및 메타-치환된 페닐알라닌을 포함하며 이들로 한정되지 않으며, 이때 치환기는 히드록시 기, 메톡시 기, 메틸 기, 알릴 기, 알데히드, 아지도, 요오도, 브로모, 케토 기(아세틸 기를 포함하나 이로 한정되지 않음), 벤조일, 알키닐 기 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 비-천연 아미노산의 구체적인 예로는 p-아세틸-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-도파(L-Dopa), 불소화된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌 및 p-프로파길옥시-페닐알라닌 등이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있는 다양한 비-천연 아미노산의 구조의 예는 예를 들면, 국제특허공보 공개 제WO 2002/085923호[발명의 명칭: "비-천연 아미노산의 생체내 도입]에 기재되어 있다. 또한, 추가 메티오닌 유사체에 대해서는 문헌[Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudifzger ligation, PNAS 99: 19-24]을 참조할 수 있다.

한 실시양태에서, 비-천연 아미노산(예를 들면, p-(프로파길옥시)-페닐알라닌)을 포함하는 BPFI의 조성물이 제공된다. 또한, p-(프로파길옥시)-페닐알라닌을 포함하는 조성물, 단백질 및/또는 세포가 제공된다. 한 측면에서, p-(프로파길옥시)-페닐알라닌 비-천연 아미노산을 포함하는 조성물은 오르토고날 tRNA를 추가로 포함한다. 비-천연 아미노산은 아미노-아실 결합을 통한 오르토고날 tRNA에의 공유 결합, 오르토고날 tRNA의 말단 리보오스 당의 3' OH 또는 2' OH에의 공유 결합 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 방식으로 오르토고날 tRNA에 결합할 수 있다(공유 결합을 포함하나 이로 한정되지 않음).

비-천연 아미노산을 통해 단백질 내로 도입될 수 있는 화학적 부분은 다양한 이점 및 단백질의 조작을 제공한다. 예를 들면, 케토 작용기의 독특한 반응성 때문에, 임의의 다수의 히드라진 함유 시약 또는 히드록실아민 함유 시약을 사용하여 단백질을 시험관내 및 생체내에서 선택적으로 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 중원자 비-천연 아미노산은 X선 구조 데이터를 위상화하는 데 유용할 수 있다. 또한, 비-천연 아미노산을 사용한 중원자의 부위 특이적 도입은 중원자의 위치를 선택하는 데 있어서 선택성 및 융통성을 제공한다. 예를 들면, 광반응성 비-천연 아미노산(벤조페논 및 아릴아지드(페닐아지드를 포함하나 이로 한정되지 않음) 측쇄를 갖는 아미노산을 포함하나 이로 한정되지 않음)은 단백질의 효율적인 생체내 및 시험관내 광가교결합(photocrosslinking)을 가능하게 한다. 광반응성 비-천연 아미노산의 예로는 p-아지도-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 그 다음, 광반응성 기 제공 일시적 조절(temporal control)의 흥분에 의해 광반응성 비-천연 아미노산을 갖는 단백질을 마음대로 가교 결합시킬 수 있다. 일례로, 비-천연 아미노의 메틸 기는 핵 자기 공명 및 진동 분광학의 사용을 포함하나 이들로 한정되지 않는 국소 구조적 및 역학적 프로브로서 동위원소로 표지된 메틸 기를 포함하나 이들로 한정되지 않는 기로 치환될 수 있다. 예를 들면, 알키닐 또는 아지도 작용기는 [3 + 2] 시클로부가 반응을 통해 분자를 사용한 단백질의 선택적 변형을 허용한다.

아미노 말단에서 폴리펩티드 내로 도입된 비-천연 아미노산은 20종의 천연 아미노산에서 사용된 기 이외의 임의의 치환기인 R 기(일반적으로 α-아미노산에 존재하는 NH₂ 기와 상이한 제2 반응성 기)로 구성될 수 있다(화학식 I 참조). 유사한 비-천연 아미노산은 일반적으로 α-아미노산에 존재하는 COOH 기와 상이한 제2 반응성 기를 갖는 카르복실 말단에서 도입될 수 있다(화학식 I 참조).

비-천연 아미노산의 화학적 합성

본 발명에서 사용하기에 적합한 비-천연 아미노산들의 대부분이 예를 들면, 시그마(미국) 또는 알드리치(미국 위스콘신 밀워키 소재)로부터 시판된다. 시판되지 않는 비-천연 아미노산은 경우에 따라 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 다양한 문헌에서 제공된 바와 같이, 또는 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 합성한다. 유기 합성기법의 경우, 예를 들면, 문헌[Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York); and Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참조할 수 있다. 비-천연 아미노산의 합성을 기술하는 추가 문헌은 예를 들면, 국제특허공보 공개 제WO 2002/085923호(발명의 명칭: "비-천연 아미노산의 생체내 도입"), 및 문헌[Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F. E. & Kidd, D. A. A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Internediates. J. Chem. Soc., 3315-3319; Friedman, O. M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J. C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Ayatimalarials,. Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A. M. P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B. D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from LAsparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 1989: 1859-1866; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel α-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-α-Amino-Adipic Acids, L-α-aminopinelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron Lett. 43: 4297-4308; and, Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35: 4602-7]을 포함한다. 또한, 2003년 12월 22일 출원된 특허출원 (발명의 명칭: "단백질 어레이"), 특허출원 제10/744,899호, 및 2002년 12월 22일 출원된 특허출원 제60/435,821호를 참조한다.

A. 카르보닐 반응성 기

카르보닐 반응성 기를 갖는 아미노산은 다양한 반응, 특히 친핵성 부가 또는 알돌 축합 반응을 통해 분자(PEG 또는 다른 수용성 분자를 포함하나 이로 한정되지 않음)가 결합될 수 있게 한다.

예시적인 카르보닐 함유 아미노산은 하기와 같이 표시될 수 있다:

상기 식 중,

n은 0 내지 10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이고, R₂는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R₄는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이고, R₂는 단순 알킬 (즉, 메틸, 에틸, 또는 프로필)이고, 케톤 부분은 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 위치한다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이고, R₂는 단순 알킬(즉, 메틸, 에틸 또는 프로필)이고, 케톤 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 메타 위치에 위치한다.

p-아세틸-(+/-)-페닐알라닌 및 m-아세틸-(+/-)-페닐알라닌의 합성은 본 명세서에 참고로 도입되는 문헌[Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 다른 카르보닐 함유 아미노산은 당업자에 의해 유사하게 제조될 수 있다.

일부 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 화학적으로 변형되어 반응성 카르보닐 작용기를 생성한다. 예를 들면, 접합 반응에 유용한 알데히드 작용기는 인접 아미노 및 히드록실 기를 갖는 작용기로부터 생성될 수 있다. 생물학적 활성 분자가 폴리펩티드인 경우, 예를 들면, N-말단 세린 또는 트레오닌(이는 정상적으로 존재하거나 화학적 또는 효소적 분해를 통해 노출될 수 있음)을 사용하여, 페리오데이트를 사용한 온화한 산화 절단 조건 하에 알데히드 작용기를 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[Gaertner, et al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3: 138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269: 7224-7230 (1994)]을 참조할 수 있다. 그러나, 당업계에 공지된 방법은 펩티드 또는 단백질의 N-말단에서의 아미노산에 한정된다.

본 발명에서, 인접 히드록실 및 아미노 기를 갖는 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 "차폐된(masked)" 알데히드 작용기로서 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 5-히드록시라이신은 엡실론 아민에 인접한 히드록실 기를 갖는다. 전형적으로, 알데히드 생성 반응 조건은 폴리펩티드 내의 다른 부위에서의 산화를 방지하는 온화한 조건 하에 과량의 몰의 소듐 메타페리오데이트를 첨가하는 것을 포함한다. 산화 반응의 pH는 전형적으로 약 7.0이다. 전형적인 반응은 약 1.5 몰의 과량의 소듐 메타 페리오데이트를 폴리펩티드의 완충 용액에 첨가한 후, 약 10분 동안 암실에서 항온처리하는 것을 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,423,685호를 참조할 수 있다.

카르보닐 작용기는 온화한 조건 하에 수용액 중에서 히드라진 함유 시약, 히드라지드 함유 시약, 히드록실아민 함유 시약 또는 세미카르바지드 함유 시약과 선택적으로 반응하여 생리학적 조건 하에 안정한 상응하는 히드라존, 옥심, 또는 세미카르바존 결합을 각각 형성할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. and Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899 (1995)]을 참조할 수 있다. 더욱이, 카르보닐 기의 독특한 반응성은 다른 아미노산 측쇄의 존재 하에 선택적 변형을 가능하게 한다. 예를 들면, 문헌[Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3: 138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276: 1125-1128 (1997)]을 참조할 수 있다.

B. 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 반응성 기

친핵성 기, 예를 들면 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드를 함유하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다양한 친전자성 기와 반응하여 (PEG 또는 다른 수용성 중합체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 중합체와의) 접합체를 형성한다.

예시적인 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 함유 아미노산은 하기와 같이 표시될 수 있다:

상기 식 중,

n은 0 내지 10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고, X는 O, N 또는 S이거나, 존재하지 않고, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다.

일부 실시양태에서, n은 4이고, R₁은 존재하지 않고, X는 N이다. 일부 실시양태에서, n은 2이고, R₁은 존재하지 않고, X는 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이고, X는 O이고, 산소 원자는 아릴 고리 상의 지방족 기에 대해 파라 위치에 존재한다.

히드라지드 함유 아미노산, 히드라진 함유 아미노산 및 세미카르바지드 함유 아미노산은 시판 공급원으로부터 입수가능하다. 예를 들면, L-글루타메이트-γ-히드라지드는 시그마 케미칼(Sigma Chemical)(미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수가능하다. 시판되지 않는 다른 아미노산은 당업자에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,281,211호를 참조할 수 있다.

히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 작용기를 갖는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드는 유사한 화학적 반응성을 갖는 알데히드 또는 다른 작용기를 함유하는 다양한 분자와 효율적 및 선택적으로 반응할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899 (1995)]을 참조할 수 있다. 히드라지드, 히드라진 및 세미카르바지드 작용기의 독특한 반응성은 이들 기가 20종의 일반 아미노산(세린 또는 트레오닌의 히드록실 기 또는 라이신 및 N-말단의 아미노 기를 포함하나 이로 한정되지 않음)에 존재하는 친핵성 기에 비해 알데히드, 케톤 및 다른 친전자성 기에 대한 훨씬 더 강한 반응성을 갖게 한다.

C. 아미노옥시 함유 아미노산

아미노옥시(히드록실아민으로도 지칭됨) 기를 함유하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 다양한 친전자성 기와 반응하여 (PEG 또는 다른 수용성 중합체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 중합체와의) 접합체를 형성한다. 히드라진, 히드라지드 및 세미카르바지드와 마찬가지로, 아미노옥시 기의 강화된 친핵성은 아미노옥시 기가 유사한 화학적 반응성을 갖는 알데히드 또는 다른 작용기를 함유하는 다양한 분자와 효율적 및 선택적으로 반응할 수 있게 한다. 예를 들면, 문헌[Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899 (1995); H. Hang and C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001)]을 참조할 수 있다. 그러나, 히드라진 기와의 반응 결과는 상응하는 히드라존인 반면, 일반적으로 옥심은 아미노옥시 기와 카르보닐 함유 기, 예를 들면 케톤의 반응으로부터 발생한다.

아미노옥시 기를 함유하는 예시적인 아미노산은 하기와 같이 표시될 수 있다:

상기 식 중,

n은 0 내지 10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고, X는 O, N, S이거나, 존재하지 않고, m은 0 내지 10이고, Y는 C(O)이거나, 존재하지 않고, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이고, X는 O이고, m은 1이고, Y는 존재한다. 일부 실시양태에서, n은 2이고, R₁ 및 X는 존재하지 않고, m은 0이고, Y는 존재하지 않는다.

아미노옥시 함유 아미노산은 용이하게 입수가능한 아미노산 전구체(호모세린, 세린 및 트레오닌)로부터 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌(M. Carrasco and R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003))을 참조할 수 있다. 일부 아미노옥시 함유 아미노산, 예를 들면 L-2-아미노-4-(아미노옥시)부티르산은 천연 공급원으로부터 단리되었다(Rosenthal, G., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997)). 다른 아미노옥시 함유 아미노산은 당업자에 의해 제조될 수 있다.

D. 아지드 및 알킨 반응성 기

아지드 및 알킨 작용기는 이들의 독특한 반응성으로 인해 폴리펩티드 및 다른 생물학적 분자의 선택적 변형에 극히 유용하다. 유기 아지드, 특히 지방족 아지드, 및 알킨은 일반 반응 화학 조건에 대해 일반적으로 안정하다. 특히, 아지드 및 알킨 작용기 둘다가 천연 발생 폴리펩티드에서 발견되는 20종의 일반 아미노산의 측쇄(즉, R 기)에 대해 불활성을 나타낸다. 그러나, 좀더 면밀히 살펴보면, 아지드 및 알킨 기의 "스프링 로딩(spring-loaded)" 특성이 드러나며, 이들은 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 반응을 통해 선택적 및 효율적으로 반응하여 상응하는 트리아졸을 생성한다. 예를 들면, 문헌[Chin J., et al., Science 301: 964-7 (2003); Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027 (2002)]을 참조할 수 있다.

휘스겐 시클로부가 반응은 친핵성 치환이 아닌 선택적 시클로부가 반응을 포함하기 때문에 (예를 들면, 문헌[Padwa, A., in COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109; Huisgen, R. in 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176] 참조), 아지드- 및 알킨 함유 측쇄를 갖는 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입은 생성된 폴리펩티드가 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 위치에서 선택적으로 변형되게 한다. 아지드 또는 알킨 함유 BSP를 수반하는 시클로부가 반응은 Cu(II)를 Cu(I)로 환원시키는 환원제의 존재 하에 동일 반응계에서 촉매량의 Cu(II)(촉매량의 CuSO₄의 형태를 포함하나 이로 한정되지 않음)를 첨가함으로써 실온에서 수성 조건 하에 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Tornoe, C. W., et al., J. Org. Chem. 67: 3057-3064 (2002); Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596-2599 (2002)]을 참조할 수 있다. 예시적인 환원제는 아스코르베이트, 금속성 구리, 퀴닌, 히드로퀴논, 비타민 K, 글루타치온, 시스테인, Fe²⁺, Co²⁺ 및 인가된 전기 전위를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

일부 경우, 아지드와 알킨 사이의 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 반응이 바람직한 경우, BSP는 알킨 부분을 포함하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하고, 이 아미노산에 부착될 수용성 중합체는 아지드 부분을 포함한다. 별법으로, 역(converse) 반응(즉, 아미노산 상에 아지드 부분이 존재하고 수용성 중합체 상에 알킨 부분이 존재함)도 수행할 수 있다.

아지드 작용기는, 아릴 에스테르를 함유하고 아릴 포스핀 부분으로 적절하게 작용화된 수용성 중합체와 선택적으로 반응하여 아미드 결합을 생성할 수도 있다. 아릴 포스핀 기는 동일 반응계에서 아지드를 환원시킨 다음, 생성된 아민은 근접한 에스테르 결합과 효율적으로 반응하여 상응하는 아미드를 생성시킨다. 예를 들면, 문헌[E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000)]을 참조할 수 있다. 아지드 함유 아미노산은 알킬 아지드(2-아미노-6-아지도-1-헥사노산을 포함하나 이로 한정되지 않음) 또는 아릴 아지드(p-아지도-페닐알라닌)일 수 있다.

아릴 에스테르 및 포스핀 부분을 함유하는 예시적인 수용성 중합체는 하기와 같이 표시될 수 있다:

상기 식 중,

X는 O, N 또는 S이거나, 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이고, R은 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴 기일 수 있다. 예시적인 R 기는 -CH₂, -C(CH₃)₃, -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)R', -CONR'R", -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -CN 및 -NO₂를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. R', R", R"' 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 1-3개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하나 이들로 한정되지 않는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시 기, 티오알콕시 기 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 포함할 때, 예를 들면, R 기는 R', R", R"' 및 R"" 기 중 하나 이상의 기가 존재하는 경우 각각의 R', R", R"' 및 R"" 기와 마찬가지로 각각 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 조합되어 5원, 6원 또는 7원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들면, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나 이들로 한정되지 않는 기를 의미한다. 치환기의 상기 설명으로부터, 당업자는 용어 "알킬"이 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예를 들면 할로알킬(-CF₃ 및 -CH₂CF₃를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 및 아실(-C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 포함하는 기를 의미한다는 것을 이해할 것이다.

아지드 작용기는, 티오에스테르를 함유하고 아릴 포스핀 부분으로 적절하게 작용화된 수용성 중합체와 선택적으로 반응하여 아미드 결합을 생성할 수도 있다. 아릴 포스핀 기가 동일 반응계에서 아지드를 환원시킨 다음, 생성된 아민이 티오에스테르 결합과 효율적으로 반응하여 상응하는 아미드를 형성한다. 티오에스테르 및 포스핀 부분을 함유하는 예시적인 수용성 중합체는 하기와 같이 표시될 수 있다:

상기 식 중,

n은 1 내지 10이고, X는 O, N 또는 S이거나, 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이다.

예시적인 알킨 함유 아미노산은 하기와 같이 표시될 수 있다:

상기 식 중,

n은 0 내지 10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고, X는 O, N 또는 S이거나, 존재하지 않고, m은 0 내지 10이고, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이고, X는 존재하지 않고, m은 0이고, 아세틸렌 부분은 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 위치한다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이고, X는 O이고, m은 1이고, 프로파길옥시 기는 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 위치한다(즉, O-프로파길-티로신). 일부 실시양태에서, n은 1이고, R₁ 및 X는 존재하지 않고, m은 0이다(즉, 프로파길글리신).

알킨 함유 아미노산은 상업적으로 입수가능하다. 예를 들면, 프로파길글리신은 펩테크(메세사추세츠주 버링톤 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다. 별법으로, 알킨 함유 아미노산은 표준 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, p-프로파길옥시페닐알라닌은 예를 들면, 문헌[Deiters, A., et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003)]에 기재된 바와 같이 합성될 수 있고, 4-알키닐-L-페닐알라닌은 문헌[Kayser, B., et al., Tetrahedron 53 (7): 2475-2484 (1997)]에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다. 다른 알킨 함유 아미노산은 당업자에 의해 제조될 수 있다.

예시적인 아지드 함유 아미노산은 하기와 같이 표시될 수 있다:

상기 식 중,

n은 0 내지 10이고, R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고, X는 O, N 또는 S이거나, 존재하지 않고, m은 0 내지 10이고, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이고, X는 존재하지 않고, m은 0이고, 아지드 부분은 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 위치한다. 일부 실시양태에서, n은 0 내지 4이고, R₁ 및 X는 존재하지 않고, m은 0이다. 일부 실시양태에서, n은 1이고, R₁은 페닐이고, X는 O이고, m은 2이고, β-아지도에톡시 부분은 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 위치한다.

아지드 함유 아미노산은 시판 공급원으로부터 입수가능하다. 예를 들면, 4-아지도페닐알라닌은 켐-임프렉스 인터내셔날, 인코포레이티드(Chem-Impex International, Inc.)(일리노이주 우드 데일 소재)로부터 입수할 수 있다. 상업적으로 입수가능하지 않은 아지드 함유 아미노산의 경우, 아지드 기는 적합한 이탈기(할라이드, 메실레이트, 토실레이트를 포함하나 이로 한정되지 않음)의 치환 또는 적절하게 보호된 락톤의 개방을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 비교적 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)]을 참조할 수 있다.

E. 아미노티올 반응성 기

베타-치환된 아미노티올 작용기는 이들의 독특한 반응성으로 인해 티아졸리딘의 형성을 통해 알데히드 기를 함유하는 폴리펩티드 및 다른 생물학적 분자의 선택적 변형에 극히 유용하다. 예를 들면, 문헌[J. Shao and J. Tam, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899]을 참조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 베타-치환된 아미노티올 아미노산은 BSP 내로 도입된 후, 알데히드 작용기를 포함하는 수용성 중합체와 반응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체, 약물 접합체 또는 다른 페이로드(payload)는 티아졸리딘의 형성을 통해 베타-치환된 아미노티올 아미노산을 포함하는 BSP에 커플링될 수 있다.

비-천연 아미노산의 세포 흡수( uptake )

세포에 의한 비-천연 아미노산 흡수는 비-천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 목적을 포함하나 이로 한정되지 않는 목적을 위해 비-천연 아미노산을 디자인하고 선택하는 경우 전형적으로 고려되는 문제이다. 예를 들면, α-아미노산의 높은 전하 밀도는 이러한 화합물들이 세포를 투과할 수 없을 수 있음을 암시한다. 천연 아미노산은 단백질-기재 수송 시스템의 수집을 통해 진핵세포 내로 흡수된다. 존재한다면 어떤 비-천연 아미노산이 세포에 의해 흡수되는지 평가하는 신속한 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들면, 2003년 12월 22일 출원된 특허출원(발명의 명칭: "단백질 어레이"), 특허출원 제10/744,899호, 및 2002년 12월 22일 출원된 특허출원 제60/435,821호; 및 문헌[Liu, D. R. & Schultz, P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96: 4780-4785]에서의 독성 분석을 참조할 수 있다. 흡수는 다양한 분석을 이용하여 용이하게 분석되지만, 세포 흡수 경로를 따라 흡수될 수 있는 비-천연 아미노산을 디자인하는 것에 대한 대안은 생체내에서 아미노산을 생성하는 생합성 경로를 제공하는 것이다.

비-천연 아미노산의 생합성

아미노산 및 다른 화합물을 생성하는 많은 생합성 경로들이 세포에 이미 존재한다. 특정 비-천연 아미노산에 대한 생합성 방법이 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는 자연계에 존재할 수 있으며, 본 발명은 이러한 방법을 제공한다. 예를 들면, 비-천연 아미노산에 대한 생합성 경로는 경우에 따라 새로운 효소를 첨가하거나 존재하는 숙주 세포 경로를 변경함으로써 숙주 세포에서 생성된다. 새로운 추가 효소로는 경우에 따라 천연 발생 효소 또는 인공적으로 유도된 효소가 있다. 예를 들면, p-아미노페닐알라닌의 생합성(국제특허공보 공개 제WO 2002/085923호(발명의 명칭: "비-천연 아미노산의 생체내 도입")의 실시예에서 제공됨)은 다른 유기체로부터의 공지된 효소의 조합물의 첨가에 의존한다. 이들 효소에 대한 유전자는 이 유전자를 포함하는 플라스미드를 사용하여 세포를 형질전환시킴으로써 진핵세포 내로 도입될 수 있다. 유전자는 세포에서 발현되는 경우, 원하는 화합물을 합성하는 효소적 경로를 제공한다. 경우에 따라 첨가되는 효소 종류의 예는 하기 실시예에서 제공된다. 추가 효소 서열은 예를 들면, 진뱅크(Genbank)에서 찾을 수 있다. 또한, 인공적으로 유도된 효소는 경우에 따라 동일한 방식에 의해 세포 내로 첨가된다. 이 방식으로, 세포 기구 및 세포 자원을 활용하여 비-천연 아미노산을 생산한다.

신규 효소를 제조하기 위한 다양한 방법들이 생합성 경로에서의 사용 또는 현존하는 경로의 진화를 위해 이용가능하다. 경우에 따라, 예를 들면, 멕시겐, 인코포레이티드(Maxygen, Inc.)(월드 와이드 웹 maxygen.com에서 입수가능)에 의해 개발된 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는 반복적 재조합을 사용하여 새로운 효소 및 경로를 개발한다. 예를 들면, 문헌[Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370 (4): 389-391; and, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91: 10747-10751]을 참조할 수 있다. 유사하게, 제넨코르(Genencor)(월드 와이드 웹 genencor.com에서 입수가능함)에 의해 개발된 디자인패쓰(DesignPath)^TM는 경우에 따라 세포 내에서 0-메틸-L-티로신을 생성하는 경로를 조작하는 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는 대사 경로 조작에 사용된다. 이 기법은 기능 유전체학 및 분자의 진화 및 디자인을 통해 확인된 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는 신규 유전자의 조합물을 사용하여 숙주 유기체 내에서 기존 경로를 재구성한다. 또한, 다이버사 코퍼레이션(Diversa Corporation)(월드 와이드 웹 상의 diversa.com에서 입수가능)도 새로운 경로를 찾기 위한 목적을 포함하나 이로 한정되지 않는 목적을 위한 유전자 및 유전자 경로의 라이브러리의 신속한 스크리닝을 제공한다.

전형적으로, 본 발명의 유전적으로 조작된 생합성 경로를 사용하여 생성된 비-천연 아미노산은 다른 아미노산의 농도에 영향을 미치거나 세포 자원을 고갈시키는 정도는 아니지만 천연 세포 내에서의 양을 포함하나 이로 한정되지 않는 효율적인 단백질 생합성에 충분한 농도로 생성된다. 이 방식으로 생체내에서 생성되는 전형적인 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다. 일단 세포가 특정 경로에 바람직한 효소를 생성하는 데 사용되는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환되고, 비-천연 아미노산이 생성되면, 경우에 따라, 생체내 선별을 이용하여 리보좀 단백질 합성 및 세포 생장 둘다를 위한 비-천연 아미노산의 생성을 더 최적화시킨다.

비-천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드

비-천연 아미노산의 도입은 단백질 구조 및/또는 기능 변화의 조정(tailoring), 크기, 산도, 친핵성, 수소 결합, 소수성, 단백질분해효소 표적 부위의 접근용이성의 변화; 부분에 대한 표적화(단백질 어레이의 경우를 포함하나 이로 한정되지 않음)의 변화; 생물학적 활성 분자의 부가; 중합체의 부착; 방사성핵종의 부착; 혈청 반감기의 조절; 조직 침투(예컨대, 종양)의 조절; 활성 수송의 조절; 조직, 세포 또는 기관 특이성 또는 분포의 조절; 면역원성의 조절; 단백질분해효소 내성의 조절 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 수행될 수 있다. 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질은 증강되거나 또는 심지어 완전히 새로운 촉매적 성질 또는 생체물리적 성질을 가질 수 있다. 예를 들면, 경우에 따라 비-천연 아미노산을 단백질 내로 포함시킴으로써 하기 성질들을 변화시킨다. 독성, 생체분포(biodistribution), 구조적 성질, 분광학적 성질, 화학적 및/또는 광화학적 성질, 촉매 능력, 반감기(혈청 반감기를 포함하나 이로 한정되지 않음), 공유 결합 또는 비공유 결합을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 분자와 반응할 수 있는 능력 등. 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물은 신규한 치료제, 진단제, 촉매 효소, 공업용 효소, 결합 단백질(항체를 포함하나 이로 한정되지 않음), 및 단백질 구조 및 기능의 연구 등에 유용하다. 예를 들면, 문헌[Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4: 645-652]을 참조할 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상을 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함한다. 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있고, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 상이한 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 상이한 부위가 존재할 수 있다. 또 다른 측면에서, 조성물은 단백질 내에 존재하는 1개 이상(그러나, 전체 아미노산보다 적은 수)의 특정 아미노산이 비-천연 아미노산으로 치환된 단백질을 포함한다. 하나 이상의 비-천연 아미노산을 갖는 소정의 단백질에 있어서, 비-천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다(예를 들면, 상기 단백질은 2개 이상의 상이한 유형의 비-천연 아미노산을 포함할 수 있거나, 2개의 동일한 비-천연 아미노산을 포함할 수 있음). 2개를 초과하는 비-천연 아미노산을 갖는 소정의 단백질에 있어서, 비-천연 아미노산은 동일하거나, 상이하거나 또는 하나 이상의 상이한 비-천연 아미노산을 갖는 동일한 종류의 다수의 비-천연 아미노산의 조합물일 수 있다.

하나 이상의 비-천연 아미노산을 갖는 원하는 단백질 또는 폴리펩티드는 본 발명의 한 측면을 이룬다. 또한, 본 발명은 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 생성한 하나 이상의 비-천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 또한, 부형제(약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하나 이로 한정되지 않음)도 단백질과 함께 존재할 수 있다.

단백질 또는 폴리펩티드는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 갖는 원하는 단백질 또는 폴리펩티드를 진핵세포 내에서 생성함에 의해 전형적으로 진핵세포에서의 번역 후 변형을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 하나 이상의 비-천연 아미노산, 및 진핵세포에 의해 생체내에서 만들어진 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 이때 이러한 번역 후 변형은 원핵세포에 의해서는 만들어지지 않는다. 예를 들면, 변역 후 변형은 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 인산화, 당지질-결합 변형, 글리코실화 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 변형을 포함한다. 한 측면에서, 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라진 결합에 의해 올리고사카라이드((GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc)를 포함하나 이로 한정되지 않음)를 아스파라진에 부착시키는 단계를 포함한다. 진핵세포 단백질의 N-결합 올리고사카라이드의 일부 예를 나열한 하기 표 1을 참조할 수 있다(추가 잔기도 존재할 수 있으나, 이는 나타내지 않음). 또 다른 측면에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린 또는 GalNAc-트레오닌 결합, 또는 GlcNAc-세린 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 올리고사카라이드(Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)를 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 단계를 포함한다.

또한, 또 다른 측면에서, 변역 후 변형은 전구체(칼시토닌 전구체, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 전구체, 전전구부갑상선(preproparathyroid) 호르몬, 전전구인슐린(preproinsulin), 전구인슐린(proinsulin), 전전구-오피오멜라노코르틴(prepro-opiomelanocortin), 전구-오피오멜라노코르틴(pro-opiomelanocortin) 등을 포함하나 이로 한정되지 않음)의 단백질분해 처리, 다중서브유닛(multisubunit) 단백질 또는 거대분자 조립체(assembly)로의 조립, 세포 내의 또 다른 부위(소기관, 예를 들면 소포체, 골기체, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포 등으로 또는 분비성 경로를 통한 이동을 포함하나 이들로 한정되지 않음)로의 이동을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 분비 또는 국소화 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함한다.

비-천연 아미노산의 한 이점은 추가 분자를 부가시키는 데 사용될 수 있는 추가 화학적 부분을 제공한다는 점이다. 이러한 변형은 진핵세포 또는 비-진핵세포의 생체내에서, 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 번역 후 변형은 비-천연 아미노산을 통해 이루어진다. 예를 들면, 번역 후 변형은 친핵성-친전자성 반응을 통해 이루어질 수 있다. 현재, 단백질의 선택적 변형에 사용되는 대부분의 반응은 α-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄의 반응을 포함하나 이들로 한정되지 않는 친핵성 반응 파트너와 친전자성 반응 파트너 사이의 공유 결합 형성을 포함한다. 이러한 경우, 선택성은 단백질 내의 친핵성 잔기의 수 및 접근용이성에 의해 결정된다. 본 발명의 단백질에서 다른 더 많은 선택적 반응들, 예를 들면 시험관내 및 생체내에서 비-천연 케토-아미노산과 히드라지드 또는 아미노옥시 화합물의 반응을 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Cornish, et al., (1996) J. Am. Chem. Soc., 118: 8150-8151; Mahal, et al., (1997) Science, 276: 1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292: 498-500; Chin, et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., 99: 11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci., 100: 56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42: 6735-6746; and, Chin, et al., (2003) Science, 301:964-7]을 참조할 수 있다. 이는 형광 발색단, 가교결합제, 사카라이드 유도체 및 세포독성 분자를 비롯한 시약 호스트(host)를 사용하여 사실상 임의의 단백질을 선택적으로 표지화할 수 있게 한다. 또한, 본 명세서에 참고로 도입되는, 2002년 10월 16일 출원된 미국 가특허출원 제60/419,265호, 2002년 10월 23일 출원된 미국 가특허출원 제60/420,990호 및 2003년 1월 16일 출원된 미국 가특허출원 제60/441,450호에 기초하여 2003년 10월 15일 출원된 미국 특허출원 제10/686,944호(발명의 명칭: "당단백질 합성")를 참조한다. 또한, 아지도 아미노산을 통한 번역 후 변형을 포함하나 이들로 한정되지 않는 번역 후 변형은 스타우딩거 결합(Staudinger ligation)(트리아릴포스핀 시약을 사용한 결합을 포함하나 이로 한정되지 않음)을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 문헌[Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24]을 참조한다.

본 발명은 아지드 또는 알키닐 부분을 포함하나 이들로 한정되지 않는 부분을 함유하는 비-천연 아미노산을 셀렉터 코돈에 반응하여 단백질 내로 유전적으로 도입하는 단계를 포함하는, 단백질의 선택적 변형을 위한 또 다른 매우 효율적인 방법을 제공한다. 그 다음, 이 아미노산 측쇄는 알키닐 또는 아지드 유도체 각각을 포함하나 이들로 한정되지 않는 유도체를 사용하는 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 반응을 포함하나 이들로 한정되지 않는 반응에 의해 변형될 수 있다(예를 들면, 문헌[Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; and, Huisgen, R. in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176] 참조). 이 방법은 친핵성 치환이 아닌 시클로부가를 포함하기 때문에, 단백질은 극히 높은 선택성으로 변형될 수 있다. 이 반응은 촉매량의 Cu(I) 염을 반응 혼합물에 첨가함으로써 실온에서 수성 조건 하에 우수한 위치선택성(1,4 > 1,5)을 나타내면서 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67: 3057-3064; and, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596-2599]을 참조할 수 있다. 이용될 수 있는 또 다른 방법은 테트라시스테인 모티프를 가진 비스비소성(bisarsenic) 화합물 상에서의 리간드 교환이다(예를 들면, 문헌[Griffin, et al., (1998) Science 281: 269-272] 참조).

[3 + 2] 시클로부가를 통해 본 발명의 단백질에 부가될 수 있는 분자는 아지드 또는 알키닐 유도체를 갖는 사실상 임의의 분자를 포함한다. 이 분자는 염료, 형광발색단, 가교결합제, 사카라이드 유도체, 중합체(폴리에틸렌 글리콜의 유도체를 포함하나 이로 한정되지 않음), 광가교결합제, 세포독성 화합물, 친화성 표지, 바이오틴의 유사체, 수지, 비드, 제2 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그 이상), 폴리뉴클레오티드(들)(DNA, RNA 등을 포함하나 이로 한정되지 않음), 금속 킬레이터, 보조인자, 지방산, 탄수화물 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 분자들은 각각 p-프로파길옥시페닐알라닌을 포함하나 이들로 한정되지 않는 알키닐 기 또는 p-아지도-페닐알라닌을 포함하나 이들로 한정되지 않는 아지도 기를 갖는 비-천연 아미노산에 부가될 수 있다.

V. 비-유전적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI의 생체내 생성

천연 발생 시스템에서는 코딩되지 않는 아미노산을 부가하거나 이것으로 치환시키기 위해 변형된 tRNA 및 tRNA 합성효소를 사용하여 본 발명의 BPFI를 생체내에서 생성할 수 있다.

천연 발생 시스템에서 코딩되지 않는 아미노산을 사용하는 tRNA 및 tRNA 합성효소를 생성하는 방법은 예를 들면, 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2003/0082575호(출원 제10/126,927호) 및 제2003/0108885호(출원 제10/126,931호)에 기재되어 있다. 이러한 방법은 번역 시스템에 대해 내인성을 갖는 합성효소 및 tRNA와 독립적으로 작용하는(따라서, 때때로 "오르토고날"이라고도 지칭됨) 번역 기구의 생성을 포함한다. 전형적으로, 번역 시스템은 오르토고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함한다. 전형적으로, O-RS는 번역 시스템에서 하나 이상의 비-천연 발생 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하고, O-tRNA는 이 시스템에서 다른 tRNA에 의해 인식되지 않는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 인식한다. 따라서, 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 반응하여 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 상기 시스템에서 생성된 단백질 내에 삽입함으로써 코딩된 폴리펩티드 내의 특정 위치에서 아미노산을 "치환"시킨다.

특정한 합성 아미노산을 폴리펩티드 내에 삽입하기 위한 매우 다양한 오르토고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소가 당업계에 공지되어 있으며, 이들은 일반적으로 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 예를 들면, 케토-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소는 문헌[Wang, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100; 56-61 (2003) and Zhang, Z. et al., Biochem. 42 (22): 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 예시적 O-RS 또는 이의 일부는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 각각 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2003/0082575호 및 제2003/0108885호에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 또한, O-RS와 함께 사용되는 상응하는 O-tRNA 분자도 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2003/0082575호(출원 제10/126,927호) 및 제2003/0108885호(출원 제10/126,931호)에 기재되어 있다.

아지드-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 시스템의 예는 문헌[Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027 (2002)]에 기재되어 있다. p-아지도-L-Phe에 대한 예시적인 O-RS 서열은 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2003/0108885호(출원 제10/126,931호)에 개시된 뉴클레오티드 서열 서열번호 14 내지 16 및 29 내지 32 및 아미노산 서열 서열번호 46 내지 48 및 61 내지 64를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 예시적인 O-tRNA 서열은 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2003/0108885호(출원 제10/126,931호)에 개시된 뉴클레오티드 서열 서열번호 1 내지 3을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 특정한 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 특이적인 한 쌍의 0-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소의 다른 예는 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2003/0082575호(출원 제10/126,927호)에 기재되어 있다. 에스. 세레비지애에서 케토 함유 아미노산 및 아지드 함유 아미노산 둘다를 도입하는 O-RS 및 O-tRNA는 문헌[Chin, J. W., et al., Science 301: 964-967 (2003)]에 기재되어 있다.

O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소의 사용은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 코딩하는 특정한 코돈의 선택을 포함한다. 임의의 코돈을 사용할 수 있지만, 일반적으로는 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 발현되는 세포에서 거의 사용되지 않거나 전혀 사용되지 않는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 예시적인 코돈은 넌센스 코돈, 예를 들면 정지 코돈(엠버, 오커 및 오팔), 4개 이상의 염기로 구성된 코돈, 및 거의 사용되지 않거나 전혀 사용되지 않는 다른 천연 3 염기 코돈을 포함한다.

특정한 셀렉터 코돈(들)은 당업계에 공지된 돌연변이유발 방법(부위 특이적 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 제한 선택 돌연변이유발 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 이용하여 BPFI 코딩 서열 내의 적절한 위치에 도입할 수 있다.

비-천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 데 사용될 수 있는 단백질 생합성 기구의 성분, 예를 들면 O-RS, OtRNA, 및 오르토고날 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법은 문헌[Wang, L., et al., Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 생체내 도입을 위한 방법 및 조성물은 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2003/0082575호(출원 제10/126,927호)에 기재되어 있다. 또한, 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용하기 위한 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선택하는 방법은 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2003/0082575호(출원 제10/126,927호) 및 제2003/0108885호(출원 제10/126,931호)에 기재되어 있다.

하나 이상의 재조합 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 생성하는 방법은 (a) 원핵생물 유기체, 예를 들면, 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 대장균, 에이. 풀기더스, 피. 푸리오서스, 피. 호리코쉬이, 에이. 페르닉스, 티. 써모필루스 등, 또는 진핵생물 유기체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 제1 유기체로부터의 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)로부터 유도된 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리를 생성하는 단계, (b) (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리 중에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에 오르토고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화시키는 구성원을 선별 (및/또는 스크리닝)함으로써, 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 제공하는 단계, 및/또는 (c) 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 부재 하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 활성 RS(돌연변이체 RS를 포함하나 이로 한정되지 않음)에 대한 풀을 (경우에 따라, 음성 선별을 통해) 선별함으로써 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 RS는 비활성 RS이다. 이러한 비활성 RS는 활성 RS를 돌연변이시킴으로써 생성할 수 있다. 예를 들면, 비활성 RS는 약 1개 이상, 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 5개 이상, 약 6개 이상 또는 약 10개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산(알라닌을 포함하나 이들로 한정되지 않음)으로 돌연변이시킴으로써 생성할 수 있다.

돌연변이체 RS의 라이브러리는 단백질의 3차원적 RS 구조에 기초한 합리적(rational) 디자인을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업계에 공지된 다양한 기법, 또는 무작위적 또는 합리적 디자인 기법을 이용한 RS 뉴클레오티드의 돌연변이유발을 이용하여 생성할 수 있다. 예를 들면, 돌연변이체 RS는 부위 특이적 돌연변이, 무작위적 돌연변이, 다양성(diversity) 발생 재조합 돌연변이, 키메라 구성체, 합리적 디자인, 및 본 명세서에 기재되거나 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 생성될 수 있다.

한 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에 오르토고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화시키는 단계를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 활성을 가진 구성원을 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리로부터 선별(및/또는 스크리닝)하는 단계는, 항생제 내성 유전자 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 양성 선별 또는 스크리닝 마커(이때, 양성 선별 및/또는 스크리닝 마커는 엠버, 오커, 및 오팔 코돈을 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함) 및 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리를 다수의 세포 내로 도입하는 단계; 선별제의 존재 하에 다수의 세포를 생장시키는 단계; 및 양성 선별 또는 스크리닝 마커의 존재 하에 하나 이상의 셀렉터 코돈을 억제하여 선별제 및/또는 스크리닝제의 존재 하에 생존하는 (또는 특이적 반응을 나타내는) 세포를 확인함으로써 활성(경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 함유하는 양성적으로 선별된 세포로 구성된 하위세트를 제공하는 단계를 포함한다. 경우에 따라, 선별제 및/또는) 스크리닝제 농도는 변할 수 있다.

한 측면에서, 양성 선별 마커는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase; CAT) 유전자이고, 셀렉터 코돈은 CAT 유전자 내의 엠버 정지 코돈이다. 경우에 따라, 양성 선별 마커는 β-락타마제(lactamase) 유전자이고, 셀렉터 코돈은 β-락타마제 유전자 내의 엠버 정지 코돈이다. 또 다른 측면에서, 양성 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성-기초 스크리닝 마커(세포 표면 마커를 포함하나 이로 한정되지 않음)를 포함한다.

한 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 부재 하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 활성 RS(경우에 따라, 돌연변이체)에 대한 풀을 음성적으로 선별하거나 스크리닝하는 과정은, 양성 선별 또는 스크리닝으로부터의 활성(경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 사용하여 음성 선별 또는 스크리닝 마커(이때, 음성 선별 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈(클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자를 포함하나 이들로 한정되지 않는 항생제 내성 유전자를 포함하나 이로 한정되지 않음)을 포함함)를 제2 유기체의 다수의 세포 내로 도입하는 단계; 및 비-천연적으로 코딩된 아미노산 및 스크리닝제 또는 선별제로 보충된 제1 배지에서 생존하거나 특이적 스크리닝 반응을 나타내지만 비-천연적으로 코딩된 아미노산 및 선별제 또는 스크리닝제로 보충되지 않는 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 또는 특이적 반응을 나타내지 않는 세포를 확인하여 생존하는 세포 또는 스크리닝된 세포에 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계를 포함한다. 예를 들면, CAT 확인 프로토콜은 경우에 따라 적합한 O-RS 재조합체의 결정에 있어서 양성 선별 및/또는 음성 스크리닝으로서 작용한다. 예를 들면, 클론의 풀은 경우에 따라 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 갖거나 갖지 않는 CAT(이는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함)를 함유하는 생장 플레이트 상에서 복제된다. 따라서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 플레이트 상에서만 생장하는 콜로니는 재조합 O-RS를 함유하는 콜로니로 간주된다. 한 측면에서, 선별제(및/또는 스크리닝제)의 농도는 변할 수 있다. 일부 측면에서, 제1 유기체와 제2 유기체는 상이하다. 따라서, 제1 유기체 및/또는 제2 유기체는 경우에 따라 원핵생물, 진핵생물, 포유동물, 대장균, 진균류, 효모, 원시세균(archaebacterium), 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물(protist) 등을 포함한다. 다른 실시양태에서, 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성-기초 스크리닝 마커를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS에 대한 풀을 스크리닝하거나 또는 선별(음성 선별을 포함하나 이로 한정되지 않음)하는 과정은 양성 선별 단계 (b)로부터 활성 돌연변이체 RS의 풀을 단리시키는 단계; 음성 선별 또는 스크리닝 마커(이때, 음성 선별 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈(하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 리보뉴클레아제 바르나제(ribonuclease barnase) 유전자를 포함하나 이들로 한정되지 않는 독성 마커 유전자를 포함하나 이로 한정되지 않음)을 포함함), 및 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 제2 유기체의 다수의 세포 내로 도입하는 단계; 및 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 보충되지 않은 제1 배지에서 생존하거나 특이적 스크리닝 반응을 나타내지만, 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 보충된 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 특이적 스크리닝 반응을 나타내지 않는 세포를 확인함으로써 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 특이적인 하나 이상의 재조합 O-RS를 생존하거나 스크리닝된 세포에 제공하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 셀렉터 코돈은 약 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다. 경우에 따라, 이러한 실시양태는 하나 이상의 셀렉터 코돈이 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하고, 제1 유기체와 제2 유기체가 상이한(이때, 각각의 유기체는 경우에 따라, 원핵생물, 진핵생물, 포유동물, 대장균, 진균류, 효모, 원시세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함하나 이로 한정되지 않음) 경우를 포함할 수 있다. 또한, 일부 측면은 음성 선별 마커가 리보뉴클레아제 바르나제 유전자(하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함)를 포함하는 경우를 포함한다. 다른 측면은 스크리닝 마커가 경우에 따라 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성-기초 스크리닝 마커를 포함하는 경우를 포함한다. 본 명세서의 실시양태에서, 스크리닝 및/또는 선별은 경우에 따라, 스크리닝 및/또는 선별 엄격도(stringency)의 변경을 포함한다.

한 실시양태에서, 하나 이상의 재조합 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 생성하는 방법은 (d) 하나 이상의 재조합 O-RS를 단리시키는 단계; (e) 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유도된 O-RS(경우에 따라, 돌연변이됨)의 제2 세트를 생성하는 단계; 및 (f) O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 능력을 포함하는 돌연변이된 O-RS가 얻어질 때까지 단계 (b) 및 단계 (c)를 반복하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 경우에 따라, 단계 (d) 내지 (f)를 약 2회 이상 반복한다. 한 측면에서, 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유도된 돌연변이된 O-RS의 제2 세트는 무작위적 돌연변이유발, 부위 특이적 돌연변이유발, 재조합 또는 이들의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않는 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다.

전술한 방법들에서 양성 선별/스크리닝 단계 (b), 음성 선별/스크리닝 단계 (c) 또는 양성 및 음성 선별/스크리닝 단계 (b) 및 (c) 둘다를 포함하나 이들로 한정되지 않는 선별/스크리닝 단계의 엄격도는 경우에 따라 선별/스크리닝 엄격도를 변화시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 양성 선별/스크리닝 단계 (b), 음성 선별/스크리닝 단계 (c) 또는 양성 및 음성 선별/스크리닝 단계 (b) 및 (c) 둘다는 리포터(reporter)의 사용을 포함하며, 이때 리포터는 형광활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting; FACS)에 의해 검출되거나 또는 발광에 의해 검출된다. 경우에 따라, 리포터는 세포 표면 상, 파지 디스플레이(phage display) 상 등에서 나타나고, 비-천연적으로 코딩된 아미노산 또는 유사체를 수반하는 친화성 또는 촉매 활성에 기초하여 선별된다. 한 실시양태에서, 돌연변이된 합성효소는 세포 표면 상, 파지 디스플레이 상 등에서 나타난다.

재조합 오르토고날 tRNA(O-tRNA)를 생성하는 방법은 (a) 제1 유기체로부터 억제자 tRNA를 포함하나 이로 한정되지 않는 하나 이상의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계, (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재 하에 제2 유기체로부터의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화된 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA에 대한 라이브러리를 선별(음성 선별을 포함하나 이로 한정되지 않음)하거나 또는 스크리닝하여 tRNA(경우에 따라, 돌연변이체)의 풀을 제공하는 단계; 및 (c) 도입된 오르토고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대한 tRNA(경우에 따라, 돌연변이체)의 풀을 선별하거나 스크리닝함으로써 하나 이상의 재조합 O-tRNA(이때, 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체로부터의 RS에 의해 효율적으로 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화됨)를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 tRNA는 억제자 tRNA이고/이거나 천연 및/또는 비-천연 염기로 된 독특한 3 염기 코돈을 포함하거나, 넌센스 코돈, 희귀 코돈, 비-천연 코돈, 4개 이상의 염기로 구성된 코돈, 앰버 코돈, 오커 코돈 또는 오팔 정지 코돈이다. 한 실시양태에서, 재조합 O-tRNA는 개선된 오르토고날성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 경우에 따라 O-tRNA를 변형시킬 필요 없이 제2 유기체로부터 제1 유기체 내로 도입할 수 있음을 인식할 것이다. 다양한 실시양태에서, 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 또는 상이하고, 경우에 따라 원핵생물(메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 대장균, 할로박테리움 등을 포함하나 이로 한정되지 않음), 진핵생물, 포유동물, 진균류, 효모, 고세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 것들로부터 선택된다. 또한, 재조합 tRNA는 경우에 따라 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 아미노아실화되며, 이때 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 천연적으로 또는 유전자 조작을 통해 생체내에서 생합성된다. 경우에 따라, 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 적어도 제1 유기체 또는 제2 유기체에 대한 생장 배지에 첨가한다.

한 측면에서, 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 아미노아실화된 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA에 대한 라이브러리를 선별(음성 선별을 포함하나 이로 한정되지 않음)하거나 스크리닝하는 단계(단계 (b))는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 독성 마커 유전자(이때, 독성 마커 유전자, 또는 독성 또는 세포증식 저해 물질을 생성하는 유전자 또는 유기체에 필수적인 유전자) 및 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 라이브러리를 제2 유기체의 다수의 세포 내로 도입하는 단계; 및 하나 이상의 오르토고날 tRNA 또는 비기능적 tRNA를 포함하는 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 함유하는 생존 세포를 선별하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 생존 세포는 비교 비율 세포 밀도 분석을 이용함으로써 선별할 수 있다.

또 다른 측면에서, 독성 마커 유전자는 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함할 수 있다. 본 방법의 또 다른 실시양태에서, 독성 마커 유전자는 리보뉴클레아제 바르나제 유전자이며, 이때 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 하나 이상의 앰버 코돈을 포함한다. 경우에 따라, 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 2개 이상의 앰버 코돈을 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 도입된 오르토고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대해 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 선별하거나 스크리닝하는 단계는, 양성 선별 또는 스크리닝 마커 유전자(이때, 양성 마커 유전자는 약물 내성 유전자(하나 이상의 셀렉터 코돈, 예를 들면 하나 이상의 엠버 정지 코돈을 포함하는 β-락타마아제 유전자를 포함하나 이로 한정되지 않음), 유기체에 필수적인 유전자, 또는 O-RS와 함께 독성 물질의 해독화를 이끌어내는 유전자), 및 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 제2 유기체로부터의 다수의 세포 내로 도입하는 단계; 및 항생제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 선별제 또는 스크리닝제의 존재 하에 생장하는 생존 세포 또는 스크리닝된 세포를 확인함으로써 하나 이상의 재조합 tRNA(이때, 하나 이상의 재조합 tRNA는 O-RS에 의해 아미노아실화되고, 하나 이상의 셀렉터 코돈에 반응하여 양성 마커 유전자에 의해 코딩된 번역 생성물 내에 아미노산을 삽입함)를 갖는 세포의 풀을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 선별제 및/또는 스크리닝제의 농도는 변화한다.

특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법이 제공된다. 이 방법은 (a) 제1 유기체로부터의 하나 이상의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재 하에 제2 유기체로부터의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화된 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA에 대해 라이브러리를 음성적으로 선별하거나 스크리닝함으로써 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 제공하는 단계; 및 (c) 도입된 오르토고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대해 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 선별하거나 스크리닝함으로써 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체로부터의 RS에 의해 효율적으로 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화된다. 또한, 이 방법은 (d) 제3 유기체로부터의 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)로부터 유도된 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리를 생성하는 단계; (e) 비-천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 구성원에 대해 돌연변이체 RS의 라이브러리를 선별하거나 스크리닝하여 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 제공하는 단계; 및 (f) 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 부재 하에 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 활성(경우에 따라, 돌연변이체) RS에 대해 풀을 음성적으로 선별하거나 스크리닝함으로써, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍(이때, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 비-천연적으로 코딩된 아미노산, 및 하나 이상의 재조합 O-tRNA에 특이적인 하나 이상의 재조합 O-RS를 포함함)을 제공하는 단계를 포함한다. 이 방법에 의해 생성된 특이적인 0-tRNA/O-RS 쌍이 포함된다. 예를 들면, 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 mutRNATyr-mutTyrRS 쌍, 예를 들면 mutRNATyr-SS12TyrRS 쌍, mutRNALeu-mutLeuRS 쌍, mutRNAThr-mutThrRS 쌍, mutRNAGlu-mutGluRS 쌍 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 것들을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 제1 유기체와 제 3 유기체가 동일한 (메타노코커스 잔나스키이를 포함하나 이로 한정되지 않음) 경우를 포함한다.

또한, 제2 유기체의 생체내 번역 시스템에 사용하기 위한 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선별하는 방법도 본 발명에 포함된다. 이 방법은 마커 유전자, tRNA, 및 제1 유기체로부터 단리되거나 또는 유도된 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)를 제2 유기체로부터의 세포로 구성된 제1 세트 내로 도입하는 단계; 상기 마커 유전자 및 tRNA를 제2 유기체로부터의 중복(duplicate) 세포 세트 내로 도입하는 단계; 및 중복 세포 세트에서는 생존하지 못하지만 제1 세트에서는 생존하는 세포를 선별하거나 중복 세포 세트에서는 제공하지 못하는 특이적 스크리닝 반응을 나타내는 세포에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이때 상기 제1 세트 및 중복 세포 세트는 선별제 또는 스크리닝제의 존재 하에 생장하고, 상기 생존 세포 또는 스크리닝된 세포는 제2 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용하기 위한 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 포함한다. 한 실시양태에서, 비교 및 선별 또는 스크리닝은 생체내 상보성 분석을 포함한다. 선별제 또는 스크리닝제의 농도는 변할 수 있다.

본 발명의 유기체는 다양한 유기체 및 다양한 조합물을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 방법의 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 상이할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 유기체는 경우에 따라 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 대장균, 에이. 풀기더스, 피. 푸리오서스, 피. 호리코쉬이, 에이. 페르닉스, 티. 써모필루스 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 원핵생물 유기체이다. 별법으로, 이러한 유기체는 경우에 따라 식물(복합 식물, 예를 들면 외떡잎 식물, 또는 쌍떡잎 식물을 포함하나 이로 한정되지 않음), 해조류, 원생생물, 진균류(효모 등을 포함하나 이로 한정되지 않음), 동물(포유동물, 곤충, 절지 동물 등을 포함하나 이로 한정되지 않음)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 진핵생물 유기체 등을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제2 유기체는 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 대장균, 에이. 풀기더스, 할로박테리움, 피. 푸리오서스, 피. 호리코쉬이, 에이. 페르닉스, 티. 써모필루스 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 원핵생물 유기체이다. 별법으로, 제2 유기체는 효모, 동물 세포, 식물 세포, 진균류, 포유동물 세포 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 진핵생물 유기체일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 제1 유기체와 제2 유기체는 상이하다.

VI. BPFI 내에서의 비-천연 발생 아미노산의 위치

본 발명은 하나 이상의 비-천연 발생 아미노산을 BPFI 내로 도입하는 것에 관한 것이다. 하나 이상의 비-천연 발생 아미노산은 폴리펩티드의 활성을 파괴하지 않는 특정 위치에서 도입될 수 있다. 이는 소수성 아미노산을 소수성 아미노산으로, 용적이 큰(bulky) 아미노산을 용적이 큰 아미노산으로, 친수성 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환하는 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는 "보존적" 치환을 수행하고/하거나 비-천연 발생 아미노산을 활성에 필요하지 않은 위치에 삽입시킴으로써 달성될 수 있다.

다양한 생화학적 및 구조적 방법을 이용하여, BPFI 내에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하고자 하는 원하는 부위를 선별할 수 있다. 폴리펩티드 쇄 내의 임의의 위치가 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하기 위한 선별에 적합하고, 이러한 선별이 합리적 디자인을 기초로 하여 행해질 수 있거나 임의의 또는 불특정한 소정의 목적을 위한 무작위 선별에 의해 행해질 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 원하는 부위의 선별은 작용제, 수퍼-작용제(super-agonist), 역 작용제, 길항제, 수용체 결합 조절제, 수용체 활성 조절제, 결합 파트너와의 결합 조절제, 결합 파트너 활성 조절제, 결합 파트너 입체구조 조절제, 이량체 또는 다량체 형성을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 원하는 성질 또는 활성을 갖는 BPFI 분자를 생성하거나, 천연 분자에 비해 활성 또는 성질을 변화시키지 않거나, 또는 폴리펩티드의 임의의 물리적 또는 화학적 성질, 예를 들면 가용성, 응집, 또는 안정성을 개질시키기 위한 것일 수 있다. 예를 들면, BPFI의 생물학적 활성에 요구되는 폴리펩티드 내의 위치는 당업계에 공지된 점 돌연변이 분석, 알라닌 스캐닝 또는 상동체 스캐닝 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 알라닌 또는 상동체 스캐닝 돌연변이유발에 의해 생물학적 활성에 중요한 것으로 확인된 잔기들 이외의 잔기는 폴리펩티드로부터 얻고자 하는 원하는 활성에 따라 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환을 위한 우수한 후보일 수 있다. 별법으로, 생물학적 활성에 중요한 것으로 확인된 부위도 폴리펩티드로부터 얻고자 하는 원하는 활성에 따라 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환을 위한 우수한 후보일 수 있다. 또 다른 대안은 폴리펩티드 쇄 상의 각각의 위치에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 단순히 연속 치환하고, 폴리펩티드의 활성에 대한 영향을 관찰하는 것이다. 비-천연 아미노산을 임의의 폴리펩티드 내로 치환하기 위한 위치를 선별하기 위한 임의의 수단, 기법 또는 방법이 본 발명에서 사용되기에 적합하다는 것은 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 자명하다.

또한, 결실을 포함하는 BPFI의 천연 발생 돌연변이체의 구조 및 활성을 조사하여 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환을 허용하기 쉬운 단백질의 영역을 결정할 수 있다. 유사한 방식으로, 단백질분해효소에 의한 분해 및 단일클론 항체를 사용하여 BPFI 수용체 또는 결합 파트너와의 결합을 담당하는 BPFI의 영역을 확인할 수 있다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환을 허용하지 않을 것 같은 잔기를 일단 제거하면, 각각의 잔여 위치에서 제안된 치환의 영향이 BPFI 및 이의 수용체 또는 결합 파트너의 구조로부터 조사될 수 있다. 따라서, 당업자는 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환될 수 있는 아미노산 위치를 용이하게 확인할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 BPFI는 폴리펩티드의 나선형 또는 베타 시트 2차 구조를 파괴하지 않는 단백질의 영역에 위치한 하나 이상의 비-천연 발생 아미노산을 포함한다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 HR-N, HR-C 또는 음이온성 펩티드 내의 임의의 위치, 첫 번째 아미노산 앞(아미노 말단), 카르복시 말단에의 부가 또는 이들의 임의의 조합에서 도입된다.

일부 실시양태에서, 이들 위치 또는 다른 위치에 존재하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 분자에 결합되어 있다.

비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입의 예시적인 잔기는 잠재적 수용체 결합 영역 또는 결합 파트너와의 결합을 위한 영역에 포함되거나 이 영역들로부터 배제된 잔기일 수 있거나, 완전히 또는 부분적으로 용매에 노출될 수 있거나, 인접 잔기와의 최소한의 수소 결합 상호작용을 갖거나 수소결합 상호작용을 전혀 갖지 않을 수 있거나, 인접 반응성 잔기에 최소한으로 노출될 수 있거나, BPFI의 노출된 면 중 하나 이상의 면 상에 존재할 수 있거나, 그의 수용체 또는 결합 파트너에 결합되거나 결합되지 않은 BPFI, 또는 또 다른 BPFI 또는 다른 생물학적 활성 분자에 커플링되거나 커플링되지 않은 BPFI의 3차원적 결정 구조, 2차 구조, 3차 구조 또는 4차 구조에 의해 예측되는 바와 같은 높은 유연성 또는 구조적 강성을 나타내는 영역에 존재할 수 있거나, 완전한 구조의 유연성 또는 강성을 원하는 바대로 변경시킴으로써 BPFI 자체 또는 하나 이상의 BPFI를 포함하는 이량체 또는 다량체의 입체구조를 조절할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 방법은 제1 반응성 기를 포함하는 비-천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는 단계; 단백질을 제2 반응성 기를 포함하는 분자(표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 방사성핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이터, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 저해성 리보핵산, 생체물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사성 부분, 새로운 작용기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 광케이징된 부분, 광이성질체화성 부분, 바이오틴, 바이오틴의 유도체, 바이오틴 유사체, 중원자를 도입하는 부분, 화학적 절단성 기, 광절단성 기, 연장된 측쇄, 탄소-결합 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위 원소-표지 부분, 생체물리적 프로브, 형광 기, 화학발광 기, 전자 조밀 기, 자성 기, 인터킬레이팅 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 또는 상기 물질 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합물을 포함하나 이로 한정되지 않음)와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 제1 반응성 기는 제2 반응성 기와 반응하여 [3 + 2] 시클로부가를 통해 분자를 비-천연 아미노산에 부착시킨다. 한 실시양태에서, 제1 반응성 기는 알키닐 또는 아지도 부분이고, 제2 반응성 기는 아지도 또는 알키닐 부분이다. 예를 들면, 제1 반응성 기는 알키닐 부분(비-천연 아미노산 p-프로파길옥시페닐알라닌 내의 알키닐 부분을 포함하나 이로 한정되지 않음)이고, 제2 반응성 기는 아지도 부분이다. 또 다른 예에서, 제1 반응성 기는 아지도 부분(비-천연 아미노산인 p-아지도-L-페닐알라닌 내의 아지도 부분을 포함하나 이로 한정되지 않음)이고, 제2 반응성 기는 알키닐 부분이다.

일부 경우, 비-천연적으로 코딩된 아미노산 치환은 BPFI 내의 다른 부가, 치환 또는 결실과 조합되어 BPFI의 다른 생물학적 특징에 영향을 줄 것이다. 일부 경우, 상기 다른 부가, 치환 또는 결실은 BPFI의 안정성(단백질분해에 대한 내성을 포함하나 이로 한정되지 않음)을 증가시키거나 그의 수용체 또는 결합 파트너에 대한 BPFI의 친화성을 증가시킬 수 있다. 일부 경우, 상기 다른 부가, 치환 또는 결실은 BPFI의 가용성(이. 콜라이 또는 다른 숙주 세포에서 발현되는 경우를 포함하나 이로 한정되지 않음)을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 부가, 치환 또는 결실은 이. 콜라이 또는 다른 재조합 숙주 세포에서 발현 후 폴리펩티드의 가용성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이. 콜라이 재조합 숙주 세포에서 발현 후 폴리펩티드의 가용성을 증가시키는 비-천연 아미노산의 도입을 위한 또 다른 부위 이외에 천연적으로 코딩된 또는 비-천연 아미노산을 사용한 치환을 위한 부위를 선택한다. 일부 실시양태에서, BPFI는 BPFI 수용체 또는 결합 파트너에 대한 친화성을 조절하는, 수용체 이량체화를 조절하는(증가시키거나 감소시키는 것을 포함하나 이로 한정되지 않음), 수용체 이량체를 안정화시키는, 결합 파트너의 입체구조 또는 1종 이상의 생물학적 활성을 조절하는, 순환 반감기를 조절하는, 방출 또는 생체이용성을 조절하는, 정제를 용이하게 하는, 또는 특정한 투여 경로를 개선하거나 변경하는 또 다른 부가, 치환 또는 결실을 포함한다. 유사하게, BPFI는 검출(GFP를 포함하나 이로 한정되지 않음), 정제, 조직 또는 막을 통한 수송, 프로드러그 방출 또는 활성화, BPFI 크기 감소, 또는 폴리펩티드의 다른 특징을 개선하는 단백질분해효소 절단 서열, 반응성 기, 항체 결합 도메인(FLAG 또는 폴리-His를 포함하나 이로 한정되지 않음), 또는 다른 친화성 기초 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하나 이로 한정되지 않음) 또는 결합된 분자(바이오틴을 포함하나 이로 한정되지 않음)를 포함할 수 있다.

VII. 비-진핵세포 및 진핵세포 내에서의 발현

클로닝된 BPFI의 고도 발현을 얻기 위해서는, 전형적으로 본 발명의 BPFI를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 전사를 지시하는 강한 프로모터, 전사/번역 종결서열, 및 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위(단백질을 코딩하는 핵산의 경우)를 포함하는 발현 벡터를 서브클로닝(subcloning)한다. 적합한 박테리아 프로모터는 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[Sambrook et al. and Ausubel et al.]에 기재되어 있다. 본 발명의 BPFI의 발현을 위한 발현 벡터를 구축하기에 적합한 방법으로는 도 2에 나타낸 방법이 있으나 이로 한정되지 않는다.

본 발명의 BPFI 발현용 박테리아 발현 시스템은 이. 콜라이, 바실러스 종(Bacillus sp.) 및 살모넬라(Salmonella)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 균주에서 이용가능하다(문헌[Palva et al., Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302: 543-545 (1983)] 참조). 이러한 발현 시스템용 키트는 상업적으로 입수가능하다. 포유동물 세포, 효모 및 곤충 세포용 진핵 발현 시스템은 당업계에 잘 공지되어 있고, 또한 상업적으로도 입수가능하다. 오르토고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소(상기한 바와 같음)를 사용하여 본 발명의 BPFI를 발현시키는 경우, 발현을 위한 숙주 세포는 오르토고날 성분을 사용할 수 있는 그의 능력을 기초로 선택된다. 예시적인 숙주 세포는 그람 양성(Gram-positive) 박테리아(비. 브레비스(B. brevis), 비. 서브틸리스(B. subtilis), 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 및 그람 음성 박테리아(이. 콜라이, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 애루기노사, 슈도모나스 푸티다) 뿐만 아니라, 효모 및 다른 진핵세포를 포함한다. O-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.

본 발명의 진핵 숙주 세포 또는 비-진핵 숙주 세포는 비-천연 아미노산을 많은 유용한 양으로 포함하는 단백질을 합성할 수 있는 능력을 제공한다. 한 측면에서, 경우에 따라 조성물은 10 ㎍ 이상, 50 ㎍ 이상, 75 ㎍ 이상, 100 ㎍ 이상, 200 ㎍ 이상, 250 ㎍ 이상, 500 ㎍ 이상, 1 ㎎ 이상, 10 ㎎ 이상, 100 ㎎ 또는 1 그램 이상의 비-천연 아미노산 함유 단백질, 또는 생체내 단백질 생성 방법(재조합 단백질 생성 및 정제에 대한 상세한 설명은 본 명세서에 제공됨)을 이용하여 얻어질 수 있는 양의 비-천연 아미노산 함유 단백질을 포함한다. 또 다른 측면에서, 단백질은 경우에 따라 세포 용해물, 완충제, 약학적 완충제 또는 다른 액체 현탁액을 포함하나 이들로 한정되지 않는 액체(약 1 nl 내지 약 100 ℓ의 임의의 부피를 포함하나 이로 한정되지 않는 부피를 가짐) 중의 1 ℓ 당 10 ㎍ 이상, 50 ㎍ 이상, 75 ㎍ 이상, 100 ㎍ 이상, 200 ㎍ 이상, 250 ㎍ 이상, 500 ㎍ 이상, 1 ㎎ 이상 또는 10 ㎎ 이상의 단백질 농도를 포함하나 이로 한정되지 않는 농도로 조성물 중에 존재한다. 진핵세포에서 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질을 대량 (전형적으로, 시험관내 번역을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 방법을 이용하여 얻을 수 있는 양보다 많은 양을 포함하나 이로 한정되지 않음) 제조하는 것은 본 발명의 한 특징이다.

본 발명의 진핵 숙주 세포 또는 비-진핵 숙주 세포는 비-천연 아미노산을 포함하는 많은 유용한 양의 단백질을 생합성하는 능력을 제공한다. 예를 들면, 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질은 세포 추출물, 세포 용해물, 배양 배지, 완충제 등 중의 10 ㎍/ ℓ 이상, 50 ㎍/ ℓ 이상, 75 ㎍/ ℓ 이상, 100 ㎍/ ℓ 이상, 200 ㎍/ ℓ 이상, 250 ㎍/ ℓ 이상, 또는 500 ㎍/ ℓ 이상, 1 mg/ ℓ 이상, 2 mg/ ℓ 이상, 3 mg/ ℓ 이상, 4 mg/ ℓ 이상, 5 mg/ ℓ 이상, 6 mg/ ℓ 이상, 7 mg/ ℓ, 8 mg/ ℓ 이상, 9 mg/ ℓ 이상, 10 mg/ ℓ 이상, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/ ℓ, 1 g/ ℓ, 5 g/ ℓ, 10 g/ ℓ 이상의 단백질 농도를 포함하나 이들로 한정되지 않는 농도로 생성될 수 있다.

I. 발현 시스템, 배양 및 단리

BPFI는 예를 들면, 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 및 박테리아를 비롯한 임의의 다수의 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 예시적인 발현 시스템에 대한 설명을 이하에 제공한다.

효모

본 명세서에 사용된 용어 "효모"는 BPFI를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 임의의 다양한 효모를 포함한다. 이러한 효모는 자낭포자형성(ascosporogenous) 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자포자(basidiosporogenous) 효모 및 불완전 진균류(Fungi imperfecti)(블라스토마이세테스(Blastomycetes)) 군에 속하는 효모를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 자낭포자형성 효모는 2개의 과(family), 즉 스퍼모프토라세애(Spermophthoraceae)와 사카로마이세타세애(Saccharomycetaceae)로 나뉜다. 사카로마이세타세애는 4개의 하위과(subfamily), 스키조사카로마이코이데애(Schizosaccharomycoideae)(예를 들면, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속), 나드소니오이데애(Nadsonioideae), 리포마이코이데애(Lipomycoideae) 및 사카로마이코이데애(Saccharomycoideae)(예를 들면, 피치아(Pichia) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 속)를 포함한다. 담자포자 효모는 류코스포리디움(Leucosporidium) 속, 로도스포리디움(Rhodosporidium) 속, 스포리디오볼루스(Sporidiobolus) 속, 필로바시디움(Filobasidium) 속 및 필로바시디엘라(Filobasidiella) 속을 포함한다. 불완전 진균류(블라스토마이세테스) 군에 속하는 효모는 2개의 과, 스포로볼로마이세타세애(Sporobolomycetaceae)(예를 들면, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces) 속 및 불레라(Bullera) 속) 및 크립토코카세애(Cryptococcaceae)(예를 들면, 칸디다(Candida) 속)로 나뉜다.

본 발명에 사용하기에 특히 적합한 종으로는 피. 파스토리스(P. pastoris), 피. 귈러리몬디이(P. guillerimondii), 에스. 세레비지애(cerevisiae), 에스. 칼스버겐시스(carlsbergensis), 에스. 디아스타티쿠스(S. diastaticus), 에스. 더글라시이(S. douglasii), 에스. 클루이베리(S. kluyveri), 에스. 노르벤시스(S. norbensis), 에스. 오비포르미스(S. oviformis), 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis), 씨. 알비칸스(C. albicans), 씨. 말토사(C. maltosa) 및 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 피치아 속, 클루이베로마이세스 속, 사카로마이세스 속, 스키조사카로마이세스 속, 한세눌라(Hansenula) 속, 토룰롭시스(Torulopsis) 속 및 칸디다 속에 속하는 종이 있다.

BPFI의 발현에 적합한 효모의 선택은 당업자의 기술 내에 속한다. 발현용 효모 숙주의 선택 시, 적합한 숙주는 예를 들면, 우수한 분비 용량, 낮은 단백질분해 활성, 우수한 가용성 단백질 생성 및 전체적인 강인성(robustness)을 갖는 것으로 입증된 숙주들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 효모는 캘리포니아 대학(University of California)(캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부(Department of Biophysics and Medical Physics) 이스트 제네틱 스톡 센터(Yeast Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; "ATCC")(버지니아주 마나사스 소재)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 입수가능하다.

용어 "효모 숙주" 또는 "효모 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용체(recipient)로서 사용될 수 있거나 사용되는 효모를 포함한다. 이 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA를 수용한 원(original) 효모 숙주 세포의 자손을 포함한다. 단일 모세포의 자손이 우연한 돌연변이 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원 모세포와 형태학적으로 완전히 동일하거나 게놈 또는 총 DNA 보체 면에서 완전히 동일할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 관련 성질, 예를 들면 BPFI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모세포와 충분히 유사한 모세포의 자손은 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.

염색체외 레플리콘(extrachromosomal replicon) 또는 도입 벡터를 비롯한 발현 벡터 및 형질전환 벡터가 많은 효모 숙주 내로의 형질전환을 위해 개발되었다. 예를 들면, 에스. 세레비지애(문헌[Sikorski et al., GENETICS (1998) 112: 19; Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153: 163; Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. (1978) 75: 1929] 참조); C. 알비칸스(문헌[Kurtz et al., Mol. CELL. BIOL. (1986) 6: 142] 참조); 씨. 말토사(문헌[Kunze et al., J. BASIC MOL. MICROBIOL. (1985) 25: 141] 참조); 에이치. 폴리모르파(문헌[Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132: 3459; Roggenkamp et al., MOL. GEN. GENET. (1986) 202: 302] 참조); 케이. 프라길리스(문헌[Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158: 1165] 참조): 케이. 락티스(문헌[De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154: 737; Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY (1990) 8: 135] 참조); 피. 귈러리몬디이(문헌[Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25: 141] 참조); 피. 파스토리스(미국 특허 제5,324,639호, 제4,929,555호 및 제4,837,148호; 문헌[Cregg et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5: 3376] 참조); 스키조사카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe)(문헌[Beach and Nurse, NATURE (1981) 300: 706] 참조); 및 와이. 리폴리티카(lipolytica)(Davidow et al., CURR. GENET. (1985) 10:380 (1985); Gaillardin et al., CURR. GENET. (1986) 10:49); 에이. 니둘란스(A. nidulans)(문헌[Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112: 284-89; Tilburn et al., GENE (1983) 26: 205-221; and Yelton et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. (1984) 81: 1470-74] 참조); 에이. 니게르(A. niger)(문헌[Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475479] 참조); 티. 레시아(T. reesia)(유럽 특허 제0 244 234호); 및 섬사상 진균류, 예를 들면 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)(국제특허공보 공개 제WO 91/00357호)(상기 각각의 문헌은 본 명세서에 참고로 도입됨)에 대한 발현 벡터가 개발되었다.

효모 벡터에 대한 조절 서열은 당업자에게 공지되어 있고, 알콜 데히드로게나제(ADH)(유럽 특허 제0 284 044호); 에놀라제; 글루코키나제; 글루코스-6-포스페이트 이소머라제; 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제(GAP 또는 GAPDH); 헥소키나제; 포스포프럭토키나제; 3-포스포글리세레이트 뮤타제; 및 피루베이트 키나제(PyK)(유럽 특허 제0 329 203호)와 같은 유전자로부터의 프로모터 영역을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 또한, 산 포스파타제를 코딩하는 효모 PH05 유전자도 유용한 프로모터 서열을 제공할 수 있다(문헌[Myanohara et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. (1983) 80: 1] 참조). 효모 숙주에 사용될 수 있는 다른 적합한 프로모터 서열은 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 해당 효소, 예를 들면 피루베이트 데카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 및 포스포글루코스 이소머라제(문헌[Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17: 4900; Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (1968) 7: 149] 참조)에 대한 프로모터를 포함할 수 있다(문헌[Hitzeman et al., J. BIOL. CHEM. (1980) 255: 2073] 참조). 전사가 생장 조건에 의해 조절된다는 추가 이점을 갖는 유도성 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2; 이소사이토크롬 C; 산 포스파타제; 메탈로티오네인(metallothionein); 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제; 질소 대사와 관련된 분해성 효소; 및 말토스 및 갈락토스 사용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 효모 발현에서 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터는 유럽 특허 제0 073 657호에 추가로 기재되어 있다.

또한, 효모 인핸서(enhancer)를 효모 프로모터와 함께 사용할 수 있다. 또한, 합성 프로모터도 효모 프로모터로서 기능할 수 있다. 예를 들면, 효모 프로모터의 업스트림 활성화 서열(UAS)이 또 다른 효모 프로모터의 전사 활성화 영역과 연결되어 합성 하이브리드 프로모터를 생성할 수 있다. 이러한 하이브리드 프로모터의 예는 GAP 전사 활성화 영역에 결합된 ADH 조절 서열을 포함한다. 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,880,734호 및 제4,876,197호를 참조할 수 있다. 하이브리드 프로모터의 다른 예는 원하는 효소 유전자, 예를 들면 GAP 또는 PyK의 전사 활성화 영역과 조합된 ADH2, GAL4, GAL10 또는 PH05 유전자의 조절 서열로 이루어진 프로모터를 포함한다. 유럽 특허 제0 164 556호를 참조할 수 있다. 나아가, 효모 프로모터는 효모 RNA 중합효소에 결합하는 능력 및 전사를 개시하는 능력을 갖는 비-효모로부터 유래된 천연 발생 프로모터를 포함할 수 있다.

효모 발현 벡터의 일부를 포함할 수 있는 다른 조절 요소는 예를 들면, GAPDH 또는 에놀라제 유전자로부터 유래된 종결서열을 포함한다(문헌[Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256: 1385] 참조). 또한, 2 μ의 플라스미드로부터 유래된 복제기점은 효모에 적합하다. 효모에 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드에 존재하는 trp1 유전자이다. 문헌[Tschumper et al., GENE (1980) 10: 157; Kingsman et al., GENE (1979) 7: 141]을 참조할 수 있다. 이러한 trp1 유전자는 트립토판에서 생장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주에게 선별 마커를 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 갖는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.

외인성 DNA를 효모 숙주 내로 도입하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 전형적으로 스페로플라스트(spheroplast)의 형질전환 또는 알칼리 양이온으로 처리된 온전한 효모 숙주 세포의 형질전환을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 효모의 형질전환은 문헌[Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. (1979) 76: 3829 and Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130: 946]에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 그러나, DNA를 세포에 도입하는 다른 방법, 예를 들면, 핵 주입, 전기천공법 또는 원형질체 융합도 일반적으로 문헌[SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 그 다음, 효모 숙주 세포를 당업자에게 공지된 표준 기술을 이용하여 배양할 수 있다.

효모 숙주 세포에서 이종 단백질을 발현시키는 다른 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 미국 특허출원 공개 제20020055169호, 미국 특허 제6,361,969호, 제6,312,923호, 제6,183,985호, 제6,083,723호, 제6,017,731호, 5,674,706호, 제5,629,203호, 제5,602,034호 및 제5,089,398호; 재심사된 미국 특허 제RE37,343호 및 제RE35,749호; 국제특허공보 공개 제WO 99/078621호; 제WO 98/37208호; 및 제WO 98/26080호; 유럽 특허출원 제0 946 736호; 제0 732 403호; 제0 480 480호; 제0 460 071호; 제0 340 986호; 제0 329 203호; 제0 324 274호; 및 제0 164 556호를 참조할 수 있다. 또한, 각각 본 명세서에 참고로 도입되는 문헌[Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62 (1-2): 79-93; Romanes et al., YEAST (1992) 8 (6): 423-488; Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185: 3-7]을 참조할 수 있다.

효모 숙주 균주는 당업자에게 잘 공지되어 있는 표준 공급 회분식 발효 방법을 이용하여 증폭 단계 동안 발효기에서 생장시킬 수 있다. 발효 방법은 특정한 효모 숙주의 탄소 이용 경로 또는 발현 조절 방식에서의 차이를 고려하여 적절하게 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 사카로마이세스 효모 숙주의 발효는 단일 글루코스 공급물, 복합 질소 공급원(예를 들면, 카세인 가수분해물) 및 다양한 비타민 보충을 필요로 할 수 있다. 대조적으로, 메틸오트로픽(methylotrophic) 효모인 피. 파스토리스는 글리세롤, 메탄올 및 미량의 무기질 공급물을 필요로 할 수 있지만, 최적의 생장 및 발현을 위해서는 오직 단순한 암모늄(질소) 염만을 필요로 할 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,324,639호, 문헌[Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9: 95] 및 문헌[Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987) 29: 1113]을 참조할 수 있다

그러나, 이러한 발효 방법은 사용되는 효모 숙주 균주와는 관계없는 일부 공통된 특징을 가질 수 있다. 예를 들면, 생장 제한 영양분, 전형적으로 탄소를 증식기 동안 발효기에 첨가하여 최대 생장을 유발시킬 수 있다. 또한, 일반적으로 발효 방법은 적합한 양의 탄소, 질소, 기저 염, 인, 및 다른 소수의 영양분(비타민, 미량의 무기질 및 염 등)을 함유하도록 디자인된 발효 배지를 사용한다. 피치아를 사용하는 데 적합한 발효 배지의 예는 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,324,639호 및 제5,231,178호에 기재되어 있다.

바큘로바이러스(Baculovirus)-감염 곤충 세포

용어 "곤충 숙주" 또는 "곤충 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용체(recipient)로서 사용될 수 있거나 사용되는 곤충을 지칭한다. 이 용어는 형질감염된 원 곤충 숙주 세포의 자손을 포함한다. 단일 모세포의 자손이 우연한 돌연변이 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원 모세포와 형태학적으로 완전히 동일하거나 게놈 또는 총 DNA 보체 면에서 완전히 동일할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 관련 성질, 예를 들면 BPFI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모세포와 충분히 유사한 모세포의 자손은 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.

BPFI의 발현에 적합한 곤충 세포의 선택은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 애데스 애깁티(Aedes aegypti), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 및 트리초플루시아 니(Trichoplusia ni)를 비롯한 몇몇 곤충 종은 당 분야에서 잘 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하다. 발현을 위해 곤충 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주는 특히, 우수한 분비 용량, 낮은 단백질분해 활성 및 전체적인 강인성을 갖는 것으로 입증된 숙주들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 곤충은 캘리포니아 대학(캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 인섹트 제네틱 스톡 센터(Insect Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션("ATCC")(버지니아주 마나사스 소재)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 입수가능하다.

일반적으로, 바큘로바이러스-감염 곤충 발현 시스템의 구성성분들은 전이 벡터, 통상 바큘로바이러스 게놈의 단편 및 발현될 이종 유전자 삽입에 편리한 제한 부위 둘다를 함유하는 박테리아 플라스미드; 전이 벡터 내의 바큘로바이러스-특이적 단편과 서열 상동성을 나타내는 야생형 바큘로바이러스(이는 바큘로바이러스 게놈 내에서의 이종 유전자의 상동 재조합을 가능하게 함); 및 적합한 곤충 숙주 세포 및 생장 배지를 포함한다. 벡터의 구축, 세포의 형질감염, 플라크(plaque)의 픽킹(picking), 배양물 중에서의 세포의 생장 등에 사용되는 물질, 방법 및 기법은 당업계에 공지되어 있고, 이러한 기법들이 기재된 메뉴얼도 이용가능하다.

이종 유전자를 전이 벡터에 삽입시킨 후, 벡터 및 야생형 바이러스 게놈을 곤충 숙주 세포 내로 형질감염시키는데, 이때 벡터와 바이러스 게놈은 재조합된다. 팩키징된 재조합 바이러스를 발현시키고, 재조합 플라크를 확인하고 정제한다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템용 물질 및 방법은 예를 들면, 인비트로겐 코퍼레이션(Invitrogen Corp.)(캘리포니아주 칼스버드 소재)으로부터 키트 형태로 상업적으로 입수가능하다. 이러한 기법들은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있고, 본 명세서에 참고로 도입되는 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]에 충분히 기재되어 있다. 또한, 문헌[RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16. 9-16. 11 (1994); KING AND POSSEE, BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); and O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조할 수 있다.

실제로, 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 이용한 다양한 이종 단백질의 제조는 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,368,825호, 제6,342,216호, 제6,338,846호, 제6,261,805호, 제6,245,528호, 제6,225,060호, 제6,183,987호, 제6,168,932호, 제6,126,944호, 제6,096,304호, 제6,013,433호, 제5,965,393호, 제5,939,285호, 제5,891,676호, 제5,871,986호, 제5,861,279호, 제5,858,368호, 제5,843,733호, 제5,762,939호, 제5,753,220호, 제5,605,827호, 제5,583,023호, 제5,571,709호, 제5,516,657호, 제5,290,686호; 국제특허공보 공개 제WO 02/06305호, 제WO 01/90390호, 제WO 01/27301호, 제WO 01/05956호, 제WO 00/55345호, 제WO 00/20032 제WO 99/51721호, 제WO 99/45130호, 제WO 99/31257호, 제WO 99/10515호, 제WO 99/09193호, 제WO 97/26332호, 제WO 96/29400호, 제WO 96/25496호, 제WO 96/06161호, 제WO 95/20672호, 제WO 93/03173호, 제WO 92/16619호, 제WO 92/03628호, 제WO 92/01801호, 제WO 90/14428호, 제WO 90/10078호, 제WO 90/02566호, 제WO 90/02186호, 제WO 90/01556호, 제WO 89/01038호, 제WO 89/01037호 및 제WO 88/07082호를 참조할 수 있다.

바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 유용한 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 헬퍼(helper)-독립적 바이러스 발현 벡터인 바큘로바이러스 오토그라파칼리포르니카(Autographacalifornica) 핵 폴리헤드로시스(polyhedrosis) 바이러스(AcNPV)로부터 유도된 곤충 발현 및 전이 벡터를 포함한다. 통상, 이 시스템으로부터 유도된 바이러스 발현 벡터는 강한 바이러스 폴리헤드린(polyhedrin) 유전자 프로모터를 사용하여 이종 유전자를 발현시킨다. 일반적으로, 문헌[O' Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조할 수 있다.

외래 유전자를 바큘로바이러스 게놈 내에 삽입시키기 전에, 프로모터, 리더(leader)(필요에 따라), 원하는 코딩 서열 및 전사 종결서열을 포함하는 전술한 성분들을 전형적으로 중간체 전위 구성체(intermediate transplacement construct)(전이 벡터)로 조립한다. 종종, 중간체 전위 구성체는 숙주, 예를 들면 박테리아에서 안정하게 유지될 수 있는 레플리콘, 예를 들면 염색체 외부 요소(예를 들면, 플라스미드)에서 유지된다. 레플리콘은 복제 시스템을 갖기 때문에, 클로닝 및 증폭에 적합한 숙주에서 유지될 수 있다. 더욱 구체적으로, 플라스미드는 폴리헤드린 폴리아데닐화 신호(문헌[Miller et al., ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42: 177] 참조), 및 이. 콜라이 중에서의 선별 및 증식을 위한 원핵 앰피실린-내성(amp) 유전자 및 복제기점을 함유할 수 있다.

외래 유전자를 AcNPV 내로 도입하는 데 통상 사용되는 전이 벡터는 pAc373이다. 또한, 예를 들면, 폴리헤드린 출발 코돈을 ATG에서 ATT로 변화시키고, ATT로부터 32개 염기쌍만큼 떨어진 다운스트림 위치 내로 BamHI 클로닝 부위를 도입하는 pVL985를 비롯한 당업자에게 공지된 많은 다른 벡터들이 디자인되었다. 문헌[Luckow and Summers, 17 VIROLOGY 31 (1989)]을 참조할 수 있다. 다른 시판되는 벡터는 예를 들면, PBlueBac4.5/V5-His; pBlueBacHis2; pMelBac; 및 pBlueBac4.5(인비트로겐 코퍼레이션, 캘리포니아주 칼스버드 소재)를 포함한다.

이종 유전자의 삽입 후, 전이 벡터 및 야생형 바큘로바이러스 게놈은 곤충 세포 숙주 내로 동시에 형질감염된다. 이종 DNA를 바큘로바이러스 바이러스 내의 원하는 부위로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987); Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156; Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 17: 31]을 참조할 수 있다. 예를 들면, 상동 이중 교차 재조합에 의해 유전자, 예를 들면 폴리헤드린 유전자 내에 삽입될 수 있고, 원하는 바큘로바이러스 유전자 내로 도입된 제한 효소 부위 내에 삽입될 수 있다. 문헌[Miller et al., BIOESSAYS (1989) 4: 91]을 참조할 수 있다.

형질감염은 전기천공법에 의해 수행될 수 있다. 문헌[TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70: 3501]을 참조할 수 있다. 별법으로, 재조합 발현 벡터 및 바큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포를 형질감염시키기 위해 리포좀을 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Liebman et al., BIOTECHNIQUES (1999) 26 (1): 36; Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998) 37: 6050; Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273 (22): 13570; Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12: 323; Siffert et al., NATURE GENETICS (1998) 18: 45; TILICNS et al., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10: 263; Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17: 491; Kost et al., GENE (1997) 190: 139; Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271: 22203; Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (37): 22376; Reversey et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (39): 23607-10; Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270: 4121; Sisk et al., J. VIROL. (1994) 68 (2): 766; and Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14(2); 274]을 참조할 수 있다. 시판되는 리포좀은 예를 들면, 셀펙틴(Cellfectin)^® 및 리포펙틴(Lipofectin)^®(인비트로겐 코퍼레이션, 캘리포니아주 칼스버드 소재)을 포함한다. 또한, 인산칼슘 형질감염도 이용할 수 있다. 문헌[TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18 (19): 5667; and Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70: 3501]을 참조할 수 있다.

통상, 바큘로바이러스 발현 벡터는 바큘로바이러스 프로모터를 포함한다. 바큘로바이러스 프로모터는, 바큘로바이러스 RNA 중합효소에 결합할 수 있으며 코딩 서열(예를 들면, 구조 유전자)의 mRNA로의 다운스트림(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 갖게 된다. 전형적으로, 이 전사 개시 영역은 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 바큘로바이러스 프로모터는, 통상 구조 유전자와 멀리 떨어져 위치하는 인핸서(존재하는 경우)로 불리는 제2 도메인을 가질 수 있다. 더욱이, 발현은 조절될 수 있거나 일정한 수준으로 유지될 수 있다.

감염 주기의 후기에서 풍부하게 전사되는 구조 유전자는 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예는 바이러스 폴리헤드린 단백질을 코딩하는 유전자(문헌[FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)]; 유럽 특허 제0 127 839호 및 제0 155 476호 참조) 및 p10 단백질을 코딩하는 유전자(문헌[Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69: 765] 참조)로부터 유도된 서열을 포함한다.

새로이 형성된 바큘로바이러스 발현 벡터는 감염성 재조합 바큘로바이러스로 팩키징된 후, 성장한 플라크를 당업자에게 공지되어 있는 기술로 정제한다. 문헌[Miller et al., BIOESSAYS (1989) 4: 91; SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]을 참조할 수 있다.

몇몇 곤충 세포의 감염을 위한 재조합 바큘로바이러스 발현 벡터가 개발되었다. 예를 들면, 특히, 애데스 애깁티(ATCC 번호 CCL-125), 봄빅스 모리(ATCC 번호 CRL-8910), 드로소필라 멜라노가스터(ATCC 번호 1963), 스포돕테라 프루기페르다 및 트리초플루시아 니에 대한 재조합 바큘로바이러스가 개발되었다. 국제특허공개 공보 제WO 89/046,699호; 및 문헌[Wright, NATURE (1986) 321: 718; Carbonell et al., J. VIROL. (1985) 56: 153; Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156]을 참조할 수 있다. 일반적으로, 문헌[Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25: 225]을 참조할 수 있다. 보다 구체적으로, 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템에 사용되는 세포주는 통상적으로 Sf9(스포돕테라 프루기페르다)(ATCC 번호 CRL-1711), Sf21(스포돕테라 프루기페르다)(인비트로겐 코퍼레이션, 카달로그 번호 11497-013(캘리포니아주 칼스버드 소재)), Tri-368(트리초풀시아 니(Trichopulsia ni)) 및 하이-파이브(High-Five)^TM BTI-TN-5B1-4(트리초풀시아 니)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

바큘로바이러스/발현에서의 이종 폴리펩티드의 직접 발현 및 융합 발현 둘다를 위한 세포 및 배양 배지는 상업적으로 입수가능하고, 일반적으로 세포 배양 기술은 당업자에게 공지되어 있다.

이. 콜라이, 슈도모나스 종, 및 다른 원핵세포

박테리아 발현 기법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 박테리아 숙주에 사용하기 위한 매우 다양한 벡터들이 이용가능하다. 벡터는 단일 카피 벡터이거나 낮은 또는 높은 다중카피 벡터일 수 있다. 벡터는 클로닝 및/또는 발현을 위해 사용될 수 있다. 벡터에 관한 풍부한 문헌, 많은 벡터들의 상업적 이용가능성, 및 심지어 벡터 및 이의 제한 맵(map) 및 특징이 기재된 메뉴얼이 존재한다는 점을 고려할 때, 본 명세서에서 광범위한 논의는 불필요하다. 공지된 바와 같이, 벡터는 일반적으로 선별을 가능하게 하는 마커를 포함하며, 이때 마커는 세포독성제 내성, 야생성(prototrophy) 또는 면역성을 제공할 수 있다. 종종, 다양한 특징을 제공하는 다수의 마커가 존재한다.

박테리아 프로모터는, 박테리아 RNA 중합효소에 결합할 수 있으며 코딩 서열(예를 들면, 구조 유전자)의 mRNA로의 다운스트림(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 가질 것이다. 전형적으로, 이 전사 개시 영역은 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 박테리아 프로모터는 RNA 합성이 시작되는 인접 RNA 중합효소 결합 부위와 중첩될 수 있는 오퍼레이터(operator)로 불리는 제2 도메인을 가질 수 있다. 유전자 리프레서(repressor) 단백질이 오퍼레이터에 결합함으로써 특정 유전자의 전사를 억제할 수 있기 때문에 오퍼레이터는 음성 조절(유도성) 전사를 허용한다. 일정한 수준으로 유지되는 발현은 음성 조절 요소, 예를 들면 오퍼레이터의 부재 하에 일어날 수 있다. 또한, 양성 조절은 통상 RNA 중합효소 결합 서열에 근접한 (5') 유전자 활성화제 단백질 결합 서열(존재하는 경우)에 의해 수행될 수 있다. 유전자 활성활제 단백질의 일례는 대장균(이. 콜라이)에서 lac 오페론(operon)의 초기 전사를 돕는 이화생성물 활성화제 단백질(CAP)이다(문헌[Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18: 173] 참조). 따라서, 조절된 발현은 양성 또는 음성 조절이므로 전사를 증가시키거나 감소시킨다.

대사 경로 효소를 코딩하는 서열은 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예는 당 대사 효소, 예를 들면 갈락토스, 락토스(lac)(문헌[Chang et al., NATURE (1977) 198: 1056] 참조) 및 말토스로부터 유도된 프로모터 서열을 포함한다. 추가 예는 생합성 효소, 예를 들면 트립토판(trp)으로부터 유도된 프로모터 서열을 포함한다(본 명세서에 참고문헌으로 도입되는 문헌[Goeddel et al., NUC. ACIDS RES. (1980) 8: 4057; Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9: 731]; 미국 특허 제4,738,921호; 유럽 특허 제036 776호 및 제121 775호 참조). 또한, β-갈락토시다아제(bla) 프로모터 시스템(본 명세서에 참고로 도입되는 문헌[Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (Ed. I. Gresser)] 참조), 박테리오파지 람다 PL(본 명세서에 참고로 도입되는 문헌[Shimatake et al., NATURE (1981) 292: 128] 참조) 및 T5(본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,689,406호 참조) 프로모터 시스템도 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 본 발명의 바람직한 방법은 강한 프로모터, 예를 들면 T7 프로모터를 사용하여 높은 수준으로 BPFI를 유도한다. 이러한 벡터의 예는 당업자에게 공지되어 있고, 노바겐(Novagen)으로부터 시판되는 pET29 계열, 및 본 명세서에 참고로 도입되는 국제특허공보 공개 제WO 99/05297호에 기재된 pPOP 벡터를 포함한다. 이러한 발현 시스템은 숙주 세포의 생존 능력 또는 생장 매개변수에 악영향을 주지 않으면서 숙주에서 BPFI를 높은 수준으로 생성한다.

또한, 자연계에서 발견되지 않는 합성 프로모터도 박테리아 프로모터로서 기능한다. 예를 들면, 한 박테리아 또는 박테리오파지 프로모터의 전사 활성화 서열을 또 다른 박테리아 또는 박테리오파지 프로모터의 오페론 서열과 결합하여 합성 하이브리드 프로모터를 생성할 수 있다(본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,551,433호 참조). 예를 들면, tac 프로모터는 trp 프로모터, 및 lac 리프레서에 의해 조절되는 lac 오페론 서열 둘다를 포함하는 하이브리드 trp-lac 프로모터이다(문헌[Amaml et al., GENE (1983) 25: 167; de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80; 21] 참조). 나아가, 박테리아 프로모터는, 박테리아 RNA 중합효소에 결합할 수 있으며 전사를 개시할 수 있는 능력을 갖는, 비박테리아로부터 유래된 천연 발생 프로모터를 포함할 수 있다. 또한, 비박테리아로부터 유래된 천연 발생 프로모터를 상용가능한 RNA 중합효소와 커플링하여 원핵생물에서 일부 유전자를 높은 수준으로 발현시킬 수 있다. 박테리오파지 T7 RNA 중합효소/프로모터 시스템은 커플링된 프로모터 시스템의 일례이다(문헌[Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189: 113; Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1985) 82: 1074] 참조). 또한, 하이브리드 프로모터도 박테리오파지 프로모터 및 이. 콜라이 오퍼레이터 영역을 포함할 수 있다(유럽 특허 제267 851호 참조).

기능성 프로모터 서열 외에도, 효율적인 리보좀 결합 부위도 원핵생물에서의 외래 유전자의 발현에 유용하다. 이. 콜라이에서, 리보좀 결합 부위는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno; SD) 서열로 불리고, 개시 코돈(ATG) 및 개시 코돈으로부터 3 내지 11개 뉴클레오티드만큼 업스트림 부위에 위치한 3 내지 9개의 뉴클레오티드로 구성된 서열을 포함한다(문헌[Shine et al., NATURE (1975) 254: 34] 참조). 상기 SD 서열은 이. 콜라이 16S rRNA의 3' 말단과 SD 서열 사이의 염기 페어링에 의해 mRNA와 리보좀의 결합을 촉진시키는 것으로 생각된다(문헌[Steitz et al., "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)] 참조). 약한 리보좀 결합 부위를 사용하여 진핵 유전자 및 원핵 유전자를 발현시키는 것은 문헌[Sambrook et al., "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989]을 참조할 수 있다.

용어 "박테리아 숙주" 또는 "박테리아 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나 사용되는 박테리아를 지칭한다. 이 용어는 형질감염된 원 박테리아 숙주 세포의 자손을 포함한다. 단일 모세포의 자손이 우연한 돌연변이 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원 모세포와 형태학적으로 완전히 동일하거나 게놈 또는 총 DNA 보체 면에서 완전히 동일할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 관련 성질, 예를 들면 BPFI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모세포와 충분히 유사한 모세포의 자손은 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.

BPFI의 발현에 적합한 숙주 박테리아의 선택은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 발현을 위한 박테리아 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주는 특히, 우수한 봉입체(inclusion body) 형성 능력, 낮은 단백질분해 활성 및 전체적인 강인성을 갖는 것으로 입증된 것들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 박테리아 숙주는 캘리포니아 대학(캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 박테리얼 제네틱 스톡 센터(Bacterial Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션("ATCC")(버지니아주 마나사스 소재)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 입수가능하다. 일반적으로, 공업적/약학적 발효는 K 균주(예를 들면, W3110)로부터 유도된 박테리아 또는 B 균주(예를 들면, BL21)로부터 유도된 박테리아를 사용한다. 이러한 균주들은 이들의 생장 매개변수가 널리 공지되어 있고 강인하기 때문에 특히 유용하다. 또한, 이러한 균주는 병원성을 나타내지 않으며, 안전성 및 환경상의 이유로 상업적으로 중요하다. 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 이. 콜라이 숙주는 BL21 균주이다. 본 발명의 방법의 또 다른 실시양태에서, 이. 콜라이 숙주는 OMP- 및 LON-을 포함하나 이들로 한정되지 않는 단백질분해효소 결핍 균주이다. 본 발명의 방법의 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포 균주는 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 애루기노사, 및 슈도모나스 푸티다 종을 포함하나 이들로 한정되지 않는 슈도모나스 종일 수 있다. 균주 MB101로 명명된 슈도모나스 플루오레센스 바이오바르 1(fluorescens biovar 1)은 재조합 제조 공정에서 유용한 것으로 공지되어 있고 치료 단백질의 제조 공정에서 이용가능하다. 슈도모나스 발현 시스템의 예로는 다우 케미칼 캄파니(Dow Chemical Company)(미시간주 미드랜드 소재, 월드 와이드 웹 dow.com 상에서 이용가능함)로부터 입수가능한 시스템을 포함한다. 본 명세서에 도입되는 미국 특허 제4,755,465호 및 제4,859,600호는 hGH 제조용 숙주 세포로서 슈도모나스 균주의 사용을 개시한다.

일단 재조합 숙주 세포 균주가 확립되면(즉, 발현 구성체가 숙주 세포 내로 도입되었고, 적합한 발현 구성체를 갖는 숙주 세포가 단리되면), 재조합 숙주 세포 균주를 BPFI 제조에 적합한 조건 하에 배양한다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 재조합 숙주 세포 균주의 배양 방법은 사용되는 발현 구성체의 성질 및 숙주 세포의 종류에 달려 있다. 일반적으로, 재조합 숙주 균주는 당업자에게 잘 공지되어 있는 방법을 이용하여 배양한다. 전형적으로, 재조합 숙주 세포는 탄소, 질소 및 무기 염의 동화가능한(assimilatable) 공급원, 및 경우에 따라, 비타민, 아미노산, 성장 인자 및 당업계에 잘 공지되어 있는 다른 단백질성 배양 보충물을 함유하는 액체 배지 중에서 배양한다. 경우에 따라, 숙주 세포 배양용 액체 배지는 바람직하지 못한 미생물의 생장을 방지하는 항생제 또는 항진균제; 및/또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선별을 위한 항생제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 화합물을 함유할 수 있다.

재조합 숙주 세포는 회분식 또는 연속식으로 세포를 수거하거나(BPFI가 세포내에 축적되는 경우) 또는 배양 상청액을 수거하면서 회분식 또는 연속식으로 배양할 수 있다. 원핵 숙주 세포에서 제조하는 경우, 회분식 배양 및 세포 수거가 바람직하다.

일반적으로, 본 발명의 BPFI는 재조합 시스템에서의 발현 후 정제된다. BPFI는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 통상적으로, 박테리아 숙주 세포에서 생성된 BPFI는 낮은 가용성 또는 불용성(봉입체의 형태의 경우)을 나타낸다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 방법 뿐만 아니라 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 재조합 제조된 단백질의 가용성을 증가시키기 위한 목적으로 선별된 아미노산 치환은 BPFI 내에서 용이하게 이루어질 수 있다. 불용성 단백질의 경우, 단백질은 원심분리 후 세포의 균질화에 의해 숙주 세포 용해물로부터 수집될 수 있다. 가용성이 낮은 단백질의 경우, 폴리에틸렌 이민(PEI)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 화합물을 첨가하여 부분적으로 가용성을 갖는 단백질의 침전을 유도할 수 있다. 그 다음, 침전된 단백질을 원심분리에 의해 편리하게 수집할 수 있다. 재조합 숙주 세포를 파괴하거나 균질화하여, 당업자에게 잘 공지되어 있는 다양한 방법을 이용하여 세포내로부터 봉입체를 방출시킬 수 있다. 숙주 세포 파괴 또는 균질화는 효소적 세포 파괴, 초음파 처리, 다운스(dounce) 균질화 또는 고압 방출 파괴를 포함하나 이들로 한정되지 않는 공지된 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 고압 방출 기술을 이용하여 이. 콜라이 숙주 세포를 파괴시켜 BPFI의 봉입체를 방출시킬 수 있다. BPFI의 봉입체를 취급하는 경우, 가용화, 기계적 전단 또는 단백질분해와 같은 인자로 인한 손실 없이 봉입체의 수율을 최대화시키기 위해 반복 시 균질화 시간을 최소화하는 것이 유리하다. 봉입체 형성 경향은 표적 단백질과 특정한 다른 단백질들 예컨대, TrpLE의 융합[Georgiou, G. (1996) in Protein engineering: Principles and Practice (Cleland, J. L. and Craik, C. S., eds.), pp. 101-127, Wiley-Liss, New York, Ford, C. F., Suominen, I. and Glatz, C. E. (1991) Protein Expression Purif. 2, 95-107], 또는 승온 또는 7.0 외의 pH에서의 배양에 의해 상승될 수 있다.

그 다음, 당업계에 공지된 임의의 다수의 적절한 가용화제를 사용하여 불용성 또는 침전된 BPFI를 가용화시킬 수 있다. 바람직하게는, BPFI는 우레아 또는 구아니딘 히드로클로라이드로 가용화시킬 수 있다. 편리하게 취급할 수 있는 회분 크기를 이용하여 큰 회분을 생산할 수 있도록 가용화된 BPFI의 부피를 최소화해야 한다. 이 인자는 재조합 숙주가 부피가 수천 리터인 회분에서 생장할 수 있는 대규모 상업적 셋팅에서 의미가 있을 수 있다. 또한, 특히 인간의 약학적 용도를 위해 대규모 상업적 셋팅에서 BPFI를 제조하는 경우, 기구 및 용기, 또는 단백질 생성물 자체에 손상을 줄 수 있는 독한 화학 물질은 가능하면 피해야 한다. 보다 독한 변성화제인 구아니딘 히드로클로라이드 대신에 더욱 순한 변성화제인 우레아를 사용하여 BPFI 봉입체를 가용화시킬 수 있다는 점이 본 발명의 방법에서 밝혀졌다. 우레아의 사용은 BPFI 봉입체를 효율적으로 가용화시키면서 BPFI의 제조 및 정제 공정에서 사용되는 스테인레스 강철 장치에 대한 손상 위험을 현저히 감소시킨다.

가용성 BPFI 단백질의 경우, BPFI는 세포주위질 공간 또는 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 또한, 가용성 BPFI는 숙주 세포의 세포질 내에 존재할 수 있다. 정제 단계를 수행하기 전에 가용성 BPFI를 농축시키는 것이 바람직할 수 있다. 당업계에서 숙련된 기술을 가진 자에게 공지된 표준 기법을 이용하여 예를 들어, 세포 용해물 또는 배양 배지로부터 가용성 BPFI 형태를 농축시킬 수 있다. 또한, 당업계에서 숙련된 기술을 가진 자에게 공지된 표준 기법을 이용하여 숙주 세포를 파괴하고 숙주 세포의 세포질 또는 세포질주위 공간으로부터 가용성 BPFI를 방출시킬 수 있다.

BPFI가 융합 단백질로서 생성되는 경우, 융합 서열을 제거할 수 있다. 융합 서열의 제거는 효소적 또는 화학적 절단을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 조건 하에 달성될 수 있다. 융합 서열의 효소적 제거는 당업자에게 잘 공지되어 있는 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 융합 서열의 제거를 위한 효소의 선택은 융합의 종류에 의해 결정되게 되며, 반응 조건은 당업자에게 자명한 바와 같이 효소의 선택에 의해 특정될 것이다. 화학적 절단은 당업자에게 잘 공지되어 있는 시약을 사용하여 달성할 수 있다. 이러한 시약 중 하나는 메티오닌 잔기를 절단하는 시아노겐 브로마이드이다. 절단된 BPFI는 바람직하게는 절단된 융합 서열로부터 잘 공지되어 있는 방법에 의해 정제된다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 이러한 방법은 융합 서열 및 BPFI의 본질(identity) 및 성질에 의해 결정될 것이다. 예를 들면, 융합 서열의 제거를 위해, 펩티드 결합을 광자 에너지, 증가된 온도, 감소된 온도, 증가된 pH, 감소된 pH, 서브-원자 입자에의 노출, 촉매의 첨가, 효소와의 항온처리, 또 다른 화학적 작용기와의 접촉 및/또는 다른 조건 하에 절단할 수 있다. 하나 이상의 이들 조건 하에 펩티드 결합을 절단하기 위해, 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 광활성화 작용기, pH 활성화 작용기, 온도 활성화 작용기, 촉매를 요구하는 작용기, 및 단백질분해효소, 효소 또는 또 다른 화학적 작용기에 의해 인식되는 작용기를 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 특징을 가진 작용기를 가질 수 있다. 정제 방법은 크기-배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 투석, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

또한, BPFI는 바람직하게는 단백질 용액으로부터 DNA를 제거하기 위해 정제된다. DNA는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들면 침전 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있으며, 바람직하게는, 예를 들면, 프로타민(protamine) 설페이트에 한정되지 않는 핵산 침전제를 사용한 침전에 의해 제거된다. BPFI는 원심분리 또는 여과를 포함하나 이들로 한정되지 않는 공지된 표준 방법을 사용하여 침전된 DNA로부터 분리할 수 있다. 숙주 핵산 분자의 제거는 BPFI가 인간을 치료하는 데 사용되는 셋팅에서 중요한 인자이며, 본 발명의 방법은 숙주 세포 DNA를 약학적으로 허용가능한 수준으로 감소시킨다.

또한, 발효기, 진탕 플라스크, 유동층 생물반응기(bioreactor), 중공 섬유 생물반응기, 롤러 병 배양 시스템 및 교반 탱크 생물반응기 시스템을 포함하나 이들로 한정되지 않는 소규모 또는 대규모 발효 방법을 단백질 발현에 사용할 수 있다. 이러한 방법들 각각은 회분식, 공급-회분식 또는 연속식 방법으로 수행될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 인간 BPFI는 당업계의 표준 방법을 사용하여 회수할 수 있다. 예를 들면, 배양 배지 또는 세포 용해물을 원심분리하거나 여과하여 세포 데브리스(debris)를 제거할 수 있다. 상청액을 원하는 부피로 눙축시키거나 희석시키거나, 추가 정제를 위해 제제를 컨디셔닝하는 데 적합한 완충제로 투석여과할 수 있다. 본 발명의 BPFI의 추가 정제는 온전한 형태로부터 BPFI 변이체의 탈아미드화 형태 및 단축 형태를 분리하는 단계를 포함한다.

하기 예시적인 절차 중 임의의 절차를 본 발명의 BPFI의 정제에 사용할 수 있다: 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스의 사용을 포함하나 이로 한정되지 않음); 실리카 상에서의 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스(SEPHADEX) G-75의 사용을 포함하나 이로 한정되지 않음); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기-배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/투석여과: 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱(chromatofocusing); 치환 크로마토그래피(displacement chromatography); 전기영동 절차(분취형 등전위 포커싱(isoelectric focusing)을 포함하나 이로 한정되지 않음), 차등 가용성(differential solubility) 이용법(황산암모늄 침전을 포함하나 이로 한정되지 않음), SDS-PAGE 또는 추출.

비-천연 아미노산을 포함하는 단백질, 비-천연 아미노산을 포함하는 펩티드, 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 항체, 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 결합 파트너 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 본 발명의 단백질은 당업자에게 공지되어 있고 당업자에 의해 사용되는 표준 절차에 따라 부분적으로 또는 실질적으로 균질한 정도까지 정제될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 또는 염기 추출, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 컬럼 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피, 렉틴(lectin) 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업계에 잘 공지되어 있는 임의의 다수의 방법에 의해 회수되고 정제될 수 있다. 필요에 따라, 정확하게 폴딩된 성숙 단백질을 제조하고자 하는 경우 단백질 리폴딩 단계를 이용할 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화성 크로마토그래피 또는 다른 적합한 방법을 고순도가 바람직한 최종 정제 단계에 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 비-천연 아미노산(또는 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질 또는 펩티드)에 대항하여 생성된 항체는 하나 이상의 비-천연 아미노산(들)을 포함하는 단백질 또는 펩티드의 친화성-기초 정제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 정제를 위한 정제 시약으로서 사용된다. 일단 폴리펩티드가 부분적으로 또는 균질한 정도로 정제되면, 필요에 따라, 경우에 따라 분석 성분, 치료제, 예방, 진단제, 연구 시약 및/또는 항체 제조용 면역원을 포함하나 이들로 한정되지 않는 매우 다양한 용도로 사용된다.

본 명세서에 언급된 다른 참고문헌 외에도, 문헌[R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y. (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principles. High Resolution Methods and Applications. Second Edition Wiley-VCH, NY; and Walker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ] 및 상기 문헌들에서 인용된 참고문헌에 기재된 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 정제/단백질 폴딩 방법이 당업계에 잘 공지되어 있다.

전형적으로, 진핵 숙주 세포 또는 비-진핵 숙주 세포에서 비-천연 아미노산을 사용하여 원하는 단백질 또는 폴리펩티드를 제조함에 있어서의 이점은 단백질 또는 폴리펩티드가 그의 원 구조로 폴딩된다는 점이다. 그러나, 본 발명의 일부 실시양태에서, 당업자는 합성, 발현 및/또는 정제 후, 단백질 또는 펩티드가 관련 폴리펩티드의 원하는 구조와는 상이한 구조를 가질 수 있다는 점을 인식할 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 발현된 단백질을 경우에 따라 변성시킨 다음, 복원시킨다. 이는 샤페로닌(chaperonin)을 원하는 단백질 또는 폴리펩티드에 첨가하는 방법, 단백질을 무질서 유발제(chaotropic agent), 예를 들면 구아니딘 HCl 중에서 가용화시키는 방법, 단백질 디설피드 이소머라제를 사용하는 방법 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 달성한다.

일반적으로, 발현된 폴리펩티드를 변성시키고 환원시킨 다음, 폴리펩티드를 바람직한 구조로 리폴딩(re-folding)시키는 것이 종종 바람직하다. 예를 들면, 구아니딘, 우레아, DTT, DTE 및/또는 샤페로닌을 원하는 번역 생성물에 첨가할 수 있다. 단백질의 환원, 변성 및 복원 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다(상기 참고문헌들 및 문헌[Debinski, et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; and Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270] 참조). 예를 들면, 데빈스키(Debinski) 등은 구아니딘-DTE 중에서의 봉입체 단백질의 변성 및 환원을 개시한다. 단백질은 산화된 글루타치온 및 L-아르기닌을 포함하나 이들로 한정되지 않는 물질을 함유하는 산화환원 완충제 중에서 리폴딩될 수 있다. 리폴딩 시약은 유동하거나 이동하여 하나 이상의 폴리펩티드 또는 다른 발현 생성물과 접촉할 수 있거나, 반대로 하나 이상의 폴리펩티드 또는 다른 발현 생성물이 유동하거나 이동하여 리폴딩 시약과 접촉할 수 있다.

BPFI를 원핵생물에서 제조하는 경우, 제조된 BPFI는 미스폴딩(misfolding)되어 생물학적 활성을 갖지 않거나 감소된 생물학적 활성을 가질 수 있다. 단백질의 생체활성은 "리폴딩"에 의해 회복될 수 있다. 일반적으로, 미스폴딩된 BPFI는 예를 들면, 하나 이상의 무질서 유발제(예를 들면, 우레아 및/또는 구아니딘), 및 디설피드 결합을 환원시킬 수 있는 환원제(예를 들면, 디티오트레이톨, DTT 또는 2-머캅토에탄올, 2-ME)를 사용하여 폴리펩티드 쇄를 가용화시키고(이때, BPFI도 불용성을 가짐), 언폴딩하고, 환원시킴으로써 리폴딩한다. 그 다음, 중간 정도의 무질서 상태에서, 디설피드 결합을 재형성시키는 산화제(예를 들면, 산소, 시스틴 또는 시스타민)를 첨가한다. 당업계에 공지된 표준 방법, 예를 들면 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,511,502호, 제4,511,503호 및 제4,512,922호에 기재된 방법을 이용하여 BPFI를 리폴딩할 수 있다. 또한, BPFI를 다른 단백질과 코폴딩하여 이종이량체 또는 이종다량체를 형성할 수 있다. 리폴딩 또는 코폴딩 후, BPFI는 바람직하게는 더 정제된다.

일반적 정제 방법

친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC"), 역상-HPLC("RP-HPLC"), 확장된 층(expanded bed) 흡착, 또는 이들의 임의의 조합 및/또는 임의의 적합한 순서로의 이들 방법의 반복을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 단리 단계로부터 발생하는 BPFI를 포함하는 세포 용해물 또는 임의의 BPFI 혼합물에 대해 다양한 단리 단계 중 임의의 하나를 수행할 수 있다.

본 명세서에 기재된 기법을 수행하는 데 사용되는 장치 및 다른 필요한 물질은 상업적으로 입수가능하다. 펌프, 분획 수집기(fraction collector), 모니터(monitor), 기록기(recorder) 및 전체 시스템은 예를 들면, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)(캘리포니아주 포스터 시티 소재), 바이오-라드 라보라토리즈, 인코포레이티드(Bio-Rad Laboratories, Inc.)(캘피로니아주 허큘레스 소재), 및 아머샴 바이오사이언시즈, 인코포레이티드(Amersham Biosciences, Inc.)(뉴 저지주 피스카타웨이 소재)로부터 입수가능하다. 또한, 교환 매트릭스 물질, 배지 및 완충제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 크로마토그래피 물질들도 이러한 회사들로부터 입수가능하다.

평형화, 및 본 명세서에 기재된 컬럼 크로마토그래피 방법에서의 다른 단계, 예를 들면 세척 및 용출은 특수 장치, 예를 들면 펌프를 사용하여 더욱 신속하게 수행할 수 있다. 시판되는 펌프는 하이로드(HILOAD)^® 펌프 P-50, 페리스탈틱 펌프(Peristaltic Pump) P-1, 펌프 P-901, 및 펌프 P-903(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

분획 수집기의 예는 레디프락(RediFrac) 분획 수집기인 FRAC-100 분획 수집기, FRAC-200 분획 수집기 및 슈퍼프랙(SUPERFRAC)^® 분획 수집기(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다. 또한, pH 및 선형 농도 구배를 형성하는 혼합기도 입수가능하다. 시판되는 혼합기는 그라디안트 믹서(Gradient Mixer) GM-1 및 인-라인 혼합기(In-Line Mixer)(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다.

임의의 시판되는 모니터를 사용하여 크로마토그래피 방법을 모니터링할 수 있다. 이러한 모니터는 UV, pH 및 전도성과 같은 정보를 모으는 데 사용될 수 있다. 검출기의 예는 모니터(Monitor) UV-1, 유니코드(UVICORD)^® S II, 모니터 UV-M II, 모니터 UV-900, 모니터 UPC-900, 모니터 pH/C-900 및 컨덕티비티 모니터(Conductivity Monitor)(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다. 실제로, 아머샴 바이오사이언시즈(뉴 저지주 피스카타웨이 소재)로부터의 다양한 AKTA^® 시스템을 비롯한 전체 시스템이 상업적으로 입수가능하다.

본 발명의 한 실시양태에서, 예를 들면, BPFI는 먼저 생성된 정제된 BPFI를 우레아 중에서 변성시킨 후, 적합한 pH에서 환원제(예를 들면, DTT)를 함유하는 TRIS 완충제로 희석시킴에 의해 환원되고 변성될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, BPFI를 약 2 M 내지 약 9 M의 농도의 우레아 중에서 변성시킨 후, pH가 약 5.0 내지 약 8.0인 TRIS 완충제 중에서 희석시킨다. 그 다음, 이 실시양태의 리폴딩 혼합물을 항온처리할 수 있다. 한 실시양태에서, 리폴딩 혼합물을 실온에서 4 내지 24시간 동안 항온처리한다. 그 다음, 환원되고 변성된 BPFI 혼합물을 추가로 단리할 수 있거나 정제할 수 있다.

본 명세서에 언급된 바와 같이, 임의의 후속 단리 단계를 수행하기 전에 제1 BPFI 혼합물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 제1 BPFI 혼합물 또는 이들의 임의의 후속 혼합물을 당업계에 공지되어 있는 기술을 사용하여 농축시킬 수 있다. 나아가, 당업자에게 잘 공지되어 있는 기술을 사용하여 제1 BPFI 혼합물 또는 이의 임의의 후속 혼합물을 포함하는 용출 완충제를 다음 단리 단계에 적합한 완충제로 교환할 수 있다.

이온 교환 크로마토그래피

한 실시양태에서, 선택적 추가 단계로서 이온 교환 크로마토그래피를 제1 BPFI 혼합물에 대해 수행할 수 있다. 일반적으로, 문헌[ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS](카달로그 번호 18-1114-21, 아머샴 바이오사이언시즈(뉴 저지주 피스카타웨이 소재))을 참조할 수 있다. 시판되는 이온 교환 컬럼은 하이트랩(HITRAP)^®, 하이프랩(HIPREP)^® 및 하이로드^® 컬럼(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함한다. 이러한 컬럼은 강한 음이온 교환기, 예를 들면 Q 세파로스^® 패스트 플로우(Fast Flow), Q 세파로스^® 하이 퍼포먼스(High Performance) 및 Q 세파로스^® XL; 강한 양이온 교환기, 예를 들면 SP 세파로스^® 하이 퍼포먼스, SP 세파로스^® 패스트 플로우 및 SP 세파로스^® XL; 약한 음이온 교환기, 예를 들면 DEAE 세파로스^® 패스트 플로우; 및 약한 양이온 교환기, 예를 들면 CM 세파로스^® 패스트 플로우(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 사용한다. 정제 과정 중 임의의 단계에서 BPFI에 대해 음이온 또는 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 실질적으로 정제된 BPFI를 단리할 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 임의의 적합한 양이온 교환 매트릭스를 사용하여 수행할 수 있다. 유용한 양이온 교환 매트릭스는 섬유질, 다공성, 비-다공성, 미세구형(microgranular), 비드형 또는 가교 결합된 양이온 교환 매트릭스 물질을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 양이온 교환 매트릭스 물질은 셀룰로오스, 아가로오스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리스티렌, 실리카, 폴리에테르, 또는 이들의 임의의 복합체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

양이온 교환 매트릭스는 강한 양이온 교환기 및 약한 양이온 교환기를 포함하는 임의의 적합한 양이온 교환기일 수 있다. 강한 양이온 교환기는 넓은 pH 범위에 걸쳐 이온화된 상태를 유지할 수 있으므로, 넓은 pH 범위에 걸쳐 BPFI에 결합할 수 있다. 그러나, 약한 양이온 교환기는 pH의 함수로서 이온화를 상실할 수 있다. 예를 들면, 약한 양이온 교환기는 pH가 약 pH 4 또는 pH 5 미만으로 떨어진 경우 전하를 상실할 수 있다. 적합한 강한 양이온 교환기로는 하전된 작용기 예컨대, 설포프로필(SP), 메틸 설포네이트(S) 또는 설포에틸(SE)이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 양이온 교환 매트릭스는 바람직하게는 BPFI 결합 pH 범위가 약 2.5 내지 약 6.0인 강한 양이온 교환기일 수 있다. 별법으로, 강한 양이온 교환기의 BPFI 결합 pH 범위는 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.5일 수 있다. 양이온 교환 매트릭스는 BPFI 결합 pH가 약 3.0인 강한 양이온 교환기일 수 있다. 별법으로, 양이온 교환 매트릭스는 바람직하게는 BPFI 결합 pH 범위가 약 6.0 내지 약 8.0인 강한 양이온 교환기일 수 있다. 양이온 교환 매트릭스는 바람직하게는 BPFI 결합 pH 범위가 약 8.0 내지 약 12.5인 강한 양이온 교환기일 수 있다. 별법으로, 강한 양이온 교환기의 BPFI 결합 pH 범위는 약 pH 8.0 내지 약 pH 12.0일 수 있다.

BPFI를 로딩하기 전, 양이온 교환 매트릭스는 예를 들어, 수배 컬럼 부피의 묽은 약산, 예를 들어, 4배 컬럼 부피의 20 mM 아세트산(pH 3)을 사용하여 평형화시킬 수 있다. 평형화 후, BPFI를 첨가할 수 있고, 실질적으로 정제된 BPFI를 용출하기 전에 약산 용액 예컨대, 약한 아세트산 또는 인산 용액을 사용하여 컬럼을 1 내지 수회 세척할 수 있다. 예를 들어, 대략 2 내지 4배 컬럼 부피의 20 mM 아세트산(pH 3)을 사용하여 컬럼을 세척할 수 있다. 2 내지 4배 컬럼 부피의 0.05 M 아세트산나트륨(pH 5.5) 또는 0.1 M 염화나트륨과 혼합된 0.05 M 아세트산나트륨(pH 5.5)을 사용한 추가 세척도 이용할 수 있다. 별법으로, 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여, 양이온 교환 매트릭스를 수배 컬럼 부피의 묽은 약 염기로 평형화시킬 수 있다.

별법으로, 실질적으로 정제된 BPFI는 매트릭스로부터 BPFI를 제거하기에 충분히 낮은 pH 또는 이온 강도를 가진 완충제와 양이온 교환 매트릭스를 접촉시킴으로써 용출할 수 있다. 용출 완충제의 pH 범위는 약 pH 2.5 내지 약 pH 6.0일 수 있다. 보다 구체적으로, 용출 완충제의 pH 범위는 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.5, 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.0일 수 있다. 용출 완충제의 pH는 약 3.0일 수 있다. 또한, 용출 완충제의 양은 매우 다양할 수 있고, 일반적으로 약 2 내지 약 10배 컬럼 부피일 것이다.

BPFI를 양이온 교환 매트릭스에 흡착시킨 후, 실질적으로 정제된 BPFI는, 매트릭스로부터 BPFI를 치환시키기 충분히 높은 pH 또는 이온 강도를 갖는 완충제와 매트릭스를 접촉시킴으로써 용출할 수 있다. 실질적으로 정제된 BPFI를 높은 pH에서 용출하는 데 사용하기에 적합한 완충제는 약 5 mM 이상 내지 약 100 mM 이상의 농도 범위의 시트레이트, 포스페이트, 포르메이트, 아세테이트, 헤페스 및 MES 완충제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

역상 크로마토그래피

당업자에게 공지되어 있는 적합한 프로토콜에 따라 RP-HPLC를 수행하여 단백질을 정제할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124: 217-230 (1982); Rivier et al., J. CHROM. (1983) 268: 112-119; Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359: 391-402]을 참조할 수 있다. RP-HPLC를 BPFI에 대해 수행하여 실질적으로 정제된 BPFI를 단리할 수 있다. 이와 관련하여, 약 C₃ 이상 내지 약 C₃₀ 이상, 약 C₃ 이상 내지 약 C₂₀ 이상, 또는 약 C₃ 이상 내지 약 C₁₈ 이상을 포함하나 이들로 한정되지 않는 매우 다양한 길이를 갖는 알킬 작용기를 갖는 실리카 유도체화 수지를 사용할 수 있다. 별법으로, 중합체 수지를 사용할 수 있다. 예를 들면, 스티렌 중합체 수지인 토소하스 암버크롬(TosoHaas Amberchrome) CG1000sd 수지를 사용할 수 있다. 또한, 매우 다양한 알킬 쇄 길이를 갖는 시아노 또는 중합체 수지를 사용할 수 있다. 나아가, RP-HPLC 컬럼을 용매, 예를 들면 에탄올로 세척할 수 있다. 소스(Source) RP 컬럼은 RP-HPLC 컬럼의 또 다른 예이다.

이온 페어링 시약(ion pairing agent) 및 유기 개질제, 예를 들면, 메탄올, 이소프로판올, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 또는 에탄올을 함유하는 적합한 용출 완충제를 사용하여 RP-HPLC 컬럼으로부터 BPFI를 용출할 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 이온 페어링 시약은 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 트리에틸아민, 테트라메틸암모늄, 테트라부틸암모늄, 트리에틸암모늄 아세테이트를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 하나 이상의 구배 또는 등용매 조건을 이용하여 용출을 수행할 수 있으며, 구배 조건은 분리 시간 및 피크 폭을 감소시키기에 바람직한 구배 조건이다. 또 다른 방법은 상이한 용매 농도 범위를 갖는 2종의 구배를 이용하는 것을 포함한다. 본원에서 사용하기에 적합한 용출 완충제의 예는 암모늄 아세테이트 및 아세토니트릴 용액을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

소수성 상호작용 크로마토그래피 정제 기법

소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 BPFI에 대해 수행할 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 참고로 도입되는 문헌[HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS(분류 번호 18-1020-90, 아머샴 바이오사이언시즈(뉴 저지주 피스카타웨이 소재))]을 참조할 수 있다. 적합한 HIC 매트릭스는 아가로오스, 가교 결합된 아가로오스, 세파로스, 셀룰로오스, 실리카, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 비롯한 알킬-치환 매트릭스 또는 아릴-치환 매트릭스, 예를 들면 부틸-, 헥실-, 옥틸- 또는 페닐-치환 매트릭스; 및 폴리에틸렌아민 수지 또는 부틸-치환 또는 페닐-치환 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 포함하나 이들로 한정되지 않는 혼합된 형태의 수지를 포함할 수 있으며 이들로 한정되지 않는다. 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피에 대한 시판되는 공급원은 하이트랩^®, 하이프랩^® 및 하이로드^® 컬럼(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

요약하면, 로딩(loading) 전, HIC 컬럼을 당업자에게 공지된 표준 완충제, 예를 들면 아세트산/염화나트륨 용액 또는 황산암모늄을 함유하는 헤페스를 사용하여 평형화시킬 수 있다. 그 다음, BPFI를 로딩시킨 후, 컬럼을 표준 완충제를 사용하여 세척하고, BPFI를 HIC 컬럼 상에서 보유하면서 원치 않는 물질을 제거하도록 컨디셔닝할 수 있다. 약 3 내지 약 10 컬럼 부피의 표준 완충제, 예를 들면 EDTA, 및 평형 완충제보다 낮은 농도의 황산암모늄을 함유하는 헤페스 완충제, 또는 아세트산/염화나트륨 완충제 등을 사용하여 BPFI를 용출할 수 있다. 또한, 예를 들면, 인산칼륨의 구배를 이용하는, 감소하는 선형 염 구배를 이용하여 BPFI 분자를 용출할 수 있다. 그 다음, 예를 들면, 여과, 예를 들면 투석여과 또는 한외여과에 의해 용출물을 농축할 수 있다. 투석여과를 이용하여 BPFI를 용출하는 데 사용되는 염을 제거할 수 있다.

다른 정제 기법

또한, 예를 들면, 겔 여과(본 명세서에 참고로 도입되는 문헌[GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS], 카달로그 번호 18-1022-18, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(적절한 매트릭스는 HA-울크로겔, 고해상(칼바이오켐), CHT 세라믹 하이드록시아파타이트(바이오라드), 바이오-겔 HTP 하이드록시아파타이트(바이오라드)), HPLC, 확장된 층 흡착, 한외여과, 투석여과, 동결건조 등을 사용하여 또 다른 단리 단계를 제1 BPFI 혼합물 또는 이의 임의의 후속 혼합물에 대해 수행함으로써, 임의의 과량의 염을 제거하고, 완충제를 다음 단리 단계 또는 심지어 최종 약품의 제형화에 적합한 완충제로 교체할 수 있다.

본 명세서에 기재된 각 단계에서 당업자에게 공지되어 있는 기법을 사용하여, 실질적으로 정제된 BPFI를 비롯한 BPFI의 수율을 모니터링할 수 있다. 또한, 이러한 기법은 마지막 단리 단계 후 실질적으로 정제된 BPFI의 수율을 평가하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 다양한 알킬 쇄 길이를 갖는 몇몇 역상 고압 액체 크로마토그래피 컬럼, 예를 들면 시아노 RP-HPLC, C₁₈RP-HPLC 뿐만 아니라, 양이온 교환 HPLC 및 겔 여과 HPLC 중 임의의 기법을 사용하여 BPFI의 수율을 모니터링할 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 각 정제 단계 후의 BPFI의 수율은 각 정제 단계 후 출발 물질 중의 BPFI의 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.9% 이상 또는 약 99.99% 이상일 수 있다.

순도는 표준 기법, 예를 들면 SDS-PAGE를 사용하거나 웨스턴 블롯(Western blot) 및 ELISA 분석을 이용하여 BPFI를 측정함으로써 결정할 수 있다. 예를 들면, 음성 조절 효모 발효 및 양이온 교환 회수로부터 단리된 단백질에 대한 다클론 항체를 생성할 수 있다. 또한, 오염 숙주 세포 단백질의 존재를 검출하기 위해 항체를 사용할 수 있다.

RP-HPLC 물질 비다크(Vydac) C4(비다크)는 그 표면이 C4-알킬 쇄를 보유하는 실리카 겔 입자로 이루어져 있다. 단백질 불순물로부터의 BPFI의 분리는 소수성 상호작용의 강도의 차이를 기초로 한다. 묽은 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴 구배를 사용하여 용출을 수행한다. 스테인레스 강철 컬럼(2.8 내지 3.2 리터의 비다크 C4 실리카 겔로 충전됨)을 사용하여 분취형 HPLC를 수행한다. 트리플루오로아세트산을 첨가함으로써 히드록시아파타이트 울트로겔 용출액을 산성화시키고, 비다크 C4 컬럼에 로딩한다. 세척 및 용출을 위해, 묽은 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴 구배를 사용한다. 분획을 수거하고, 즉시 포스페이트 완충제로 중성화시킨다. IPC 한계 내에 존재하는 BPFI 분획을 풀링한다.

DEAE 세파로스(파마시아) 물질은 세파로스 비드의 표면에 공유 결합된 디에틸아미노에틸(DEAE)-기로 이루어져 있다. DEAE 기와 BPFI의 결합은 이온성 상호작용에 의해 매개된다. 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산은 보유되지 않으면서 컬럼을 통과한다. 이들 물질들을 세척한 후, 낮은 pH에서 아세테이트 완충제로 컬럼을 세척하여 미량의 불순물을 제거한다. 그 다음, 컬럼을 중성 포스페이트 완충제로 세척하고, BPFI를 증가된 이온 강도를 갖는 완충제로 용출한다. 컬럼을 DEAE 세파로스 패스트 플로우로 팩킹한다. 컬럼 부피는 겔 1 ㎖ 당 3 내지 10 mg의 BPFI 범위 내의 BPFI 로딩이 이루어지도록 조정한다. 컬럼을 물 및 평형화 완충제(인산나트륨/인산칼륨)로 세척한다. HPLC 용출액의 풀링된 분획을 로딩하고, 컬럼을 평형화 완충제로 세척한다. 그 다음, 컬럼을 세척 완충제(아세트산나트륨 완충제)로 세척한 후, 평형화 완충제로 세척한다. 그 후, 용출 완충제(염화나트륨, 인산나트륨/인산칼륨)를 사용하여 BPFI를 컬럼으로부터 용출하고, 마스터 용출 프로파일에 따라 단일 분획으로 수집한다. DEAE 세파로스 컬럼의 용출액은 특정한 전도성을 갖도록 조정한다. 생성되는 약물을 멸균 여과하여 테플론(Teflon) 병에 넣고, -70 ℃에서 저장한다.

이용될 수 있는 추가 방법에는 내독소를 제거하는 단계가 포함되나, 이로 한정되지 않는다. 내독소는 그람 음성 숙주 세포 예컨대, 대장균의 외막 상에 위치된 리포폴리사카라이드(LPS)이다. 내독소 수준을 감소시키는 방법은 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있고, 실리카 지지체, 유리 분말 또는 하이드록시아파타이트를 사용한 정제 기법, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 음이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이 방법들의 조합 방법 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 변형 방법 또는 추가 방법이 원하는 폴리펩티드로부터 오염물질 예컨대, 동시 이동하는 단백질을 제거하기 위해 필요할 수 있다.

브래드포드(Bradford) 분석, SDS-PAGE, 은 염색 SDS-PAGE, 쿠마시 염색 SDS-PAGE, 질량 분석(MALDI-TOF를 포함하나 이로 한정되지 않음) 및 당업자에게 공지되어 있는, 단백질의 특징규명에 이용되는 다른 방법들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 매우 다양한 방법 및 절차들이 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI 단백질의 수율 및 순도를 평가하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 이종 융합 단백질의 특징규명

본 발명의 융합 단백질의 특징을 규명할 수 있는 다수의 방법이 존재한다. 이들 방법들 중 일부 방법으로는 단백질 염색 방법과 커플링된 SDS-PAGE 또는 항-IgG 또는 항-HSA 항체를 사용한 면역블롯팅이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 다른 방법으로는 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화-질량 분광계(MALDI-MS), 액체 크로마토그래피/질량 분광법, 등전위 포커싱, 분석 음이온 교환, 크로마토포커싱 및 원평광 이색성 분광 분석(circular dichroism)이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

VIII. 대체 시스템에서의 발현

비-재조합 숙주 세포, 돌연변이된 숙주 세포 또는 무세포 시스템에서 비-천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위해 몇몇 방법들이 사용되었다. 또한, 이러한 시스템은 본 발명의 BPFI를 제조하는 데 사용하기에 적합하다. 반응성 측쇄, 예를 들면 Lys, Cys 및 Tyr을 사용한 아미노산의 유도체화는 라이신을 N₂-아세틸-라이신으로 전환시켰다. 또한, 화학적 합성은 비-천연 아미노산을 도입하는 직접적인 방법을 제공한다. 효소에 의한 펩티드 단편의 결합 및 펩티드 단편의 천연 화학적 결합이 최근에 개발되었기 때문에, 더 큰 단백질을 제조하는 것이 가능하다. 예를 들면, 문헌[P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem., 69: 923 (2000)]을 참조할 수 있다. 원하는 비-천연 아미노산으로 화학적으로 아실화된 억제자 tRNA를, 단백질 생합성을 지지할 수 있는 시험관내 추출물에 첨가하는 일반적인 시험관내 생합성 방법을 이용하여 100개 초과의 비-천연 아미노산을 사실상 임의의 크기의 다양한 단백질 내로 부위 특이적으로 도입하였다. 예를 들면, 문헌[V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34; 621 (1995); C. J. Noren, S. J. Anthony-Cahill, M. C. Griffith, P. G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244: 182-188 (1989); and, J. D. Bain, C. G. Glabe, T. A. Dix, A. R. Chamberlin, E. S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111: 8013-8014 (1989)]을 참조할 수 있다. 단백질 안정성, 단백질 폴딩, 효소 기전 및 신호 전달도입의 연구를 위해 매우 다양한의 작용기가 단백질 내로 도입되었다. 선택적 압력 도입으로 지칭되는 생체내 방법을 개발하여 야생형 합성효소의 무차별 혼합(promiscuity)을 실시하였다. 예를 들면, 문헌[N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J., 13: 41 (1999)]을 참조할 수 있다. 세포에 특정한 천연 아미노산을 공급하는 관련 대사 경로가 작동하지 않는(switched off) 영양요구성 균주는 제한된 농도의 천연 아미노산을 함유하는 최소 배지에서 생장하지만, 표적 유전자의 전사는 억제된다. 정체 생장기의 개시 시점에서, 천연 아미노산은 고갈되고, 비-천연 아미노산 유사체로 교체된다. 재조합 단백질의 발현 유도는 비-천연 유사체를 함유하는 단백질을 축적시킨다. 예를 들면, 이 방법에 의해, o, m 및 p-플루오로페닐알라닌은 단백질 내로 도입되고, 용이하게 확인될 수 있는 UV 스펙트럼 중의 2개의 특징적인 숄더(shoulder)를 나타내며(예를 들면, 문헌[C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal. Biochem., 284: 29 (2000)] 참조), ¹⁹F NMR을 이용하여 키토올리고사카라이드 리간드와 메티오닌의 상호작용을 연구하기 위해 박테리오파지 T4 리소자임(lysozyme)에서 메티오닌을 트리플루오로메티오닌으로 치환하는 데 사용되었고(예를 들면, 문헌[H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry. 36: 3404 (1997)] 참조), 트리플루오로류신을 류신 대신에 도입하여, 류신-지퍼(zipper) 단백질의 열적 안정성 및 화학적 안정성을 증가시켰다. 예를 들면, 문헌[Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40: 1494 (2001)]을 참조할 수 있다. 나아가, 셀레노메티오닌(selenomethionine) 및 텔루로메티오닌(telluromethionine)을 다양한 재조합 단백질 내로 도입하여 X선 결정학에서의 위상의 해석을 용이하게 한다. 예를 들면, 문헌[W. A. Hendrickson, J.R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9: 1665 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct. Biol., 1: 283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem., 230: 788 (1995); and, N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol. Biol. 270; 616 (1997)]을 참조할 수 있다. 또한, 알켄 또는 알킨 작용기를 갖는 메티오닌 유사체를 유효하게 도입함으로써 화학적 수단에 의한 단백질의 추가 변형을 가능하게 하였다. 예를 들면, 본 명세서에 참고로 도입되는 문헌[J. C. M. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428: 68 (1998); J. C. M. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc., 122: 1282 (2000); and, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56: 9487 (2000)]; 미국 특허 제6,586,207호; 미국 특허출원 공개 제2002/0042097호를 참조할 수 있다.

이 방법의 성공은 아미노아실-tRNA 합성효소에 의한 비-천연 아미노산 유사체의 인식에 달려 있고, 이는 일반적으로, 단백질 번역의 신뢰도를 보증하기 위해 높은 선별성을 필요로 한다. 이 방법의 범위를 확장하는 한 방법은 아미노아실-tRNA 합성효소의 기질 특이성을 완화시키는 것이며, 이는 제한된 수의 경우에서 달성되었다. 예를 들면, 대장균 페닐알라닐-tRNA 합성효소(PheRS)에서 Gly에 의한 Ala²⁹⁴의 치환은 기질 결합 포켓의 크기를 증가시켜 p-Cl-페닐알라닌(p-Cl-Phe)에 의한 tRNAPhe의 아실화를 일으킨다. 문헌[M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry. 33: 7107 (1994)]을 참조할 수 있다. 이 돌연변이체 PheRS를 보유하는 대장균 균주는 페닐알라닌 대신에 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌을 도입한다. 예를 들면, 문헌[M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett., 364: 272 (1995); and, N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467: 37 (2000)]을 참조할 수 있다. 유사하게, 대장균 티로실-tRNA 합성효소의 아미노산 결합 부위 근처의 점 돌연변이 Phel30Ser는 티로신보다 아자티로신을 더 효율적으로 도입하는 것으로 밝혀졌다. 문헌[F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll and S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275: 40324 (2000)]을 참조할 수 있다.

비-천연 아미노산을 생체내에서 단백질 내로 도입하는 또 다른 방법은 교정(proofreading) 기전을 갖는 합성효소를 개질시키는 것이다. 이러한 합성효소는 식별할 수 없기 때문에 동족 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산을 활성화시킨다. 이 오류는 분리된 부위에서 정정되며, tRNA로부터 잘못 충전된(mischarged) 아미노산을 데아실화하여 단백질 번역의 신뢰도를 유지시킨다. 상기 합성효소의 교정 활성이 작용하지 못하는 경우, 잘못 활성화된 구조적 유사체는 수정(editing) 기능을 벗어나 도입될 수 있다. 최근, 이 방법은 발릴-tRNA 합성효소(VaIRS)를 사용하여 입증되었다. 문헌[V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292: 501 (2001)]을 참조할 수 있다. ValRS는 Cys, Thr 또는 아미노부티레이트(Abu)로 tRNAVal을 잘못 아미노아실화시킬 수 있고, 이러한 비-동족 아미노산들은 추후 교정 도메인에 의해 가수분해된다. 대장균 염색체의 무작위적 돌연변이유발 후, ValRS의 교정 부위에서 돌연변이를 갖는 돌연변이된 대장균 균주를 선별하였다. 이러한 교정-결핍 ValRS는 부정확하게 tRNAVal을 Cys로 충전시킨다. Abu는 입체적으로 Cys와 유사하기 때문에, Cys의 -SH 기는 Abu의 -CH₃로 치환되고 돌연변이체 ValRS도 이 돌연변이체 대장균 균주가 Abu의 존재 하에 생장하는 경우 Abu를 단백질 내로 도입한다. 질량 분광 분석은 천연 단백질 내의 각각의 발린 위치에서 발린의 약 24%가 Abu로 치환된다는 것을 보여준다.

또한, 고체상 합성 및 반합성 방법도 새로운 아미노산을 함유하는 다수의 단백질을 합성할 수 있게 하였다. 예를 들면, 하기 문헌 및 이 문헌에서 인용된 참고문헌을 참조할 수 있다: 문헌[Crick, F. J. C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192: 1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of prazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am. Chem., 88 (24): 5914-5919 (1966); Kaiser, E. T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enzymes, Acc Chem Res, 47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E. T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 256 (5054): 221-225 (1992); Chaiken, I. M. Seniisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev. Biochem., 11 (3): 255-301 (1981); Offord, R. E. Protein engineering by chemical means, Protein Eng., 1 (3): 151-157 (1987); and, Jackson, D. Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J. A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266 (5183): 243 (1994)].

화학적 변형은 보조인자, 스핀 표지 및 올리고뉴클레오티드를 비롯한 다양한 비-천연 측쇄를 시험관내에서 단백질에 도입하는 데 사용되어 왔다. 예를 들면, 문헌[Corey, D. R., Schultz, P. G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238 (4832): 1401-1403 (1987); Kaiser, E. T., Lawrence D. S., Rokita, S. E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev. Biochem., 54: 565-595 (1985); Kaiser, E. T., Lawrence, D. S. Chemical mutation of enzyme active sites, Science, 226 (4674): 505-511 (1984); Neet, K. E., Nanci A, Koshland, D. E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem, 243 (24): 6392-6401 (1968); Polgar, L. B., M. L. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J Am. Chem. Soc., 3153-3154 (1966); and, Pollack, S. J., Nakayama, G. Schultz, P. G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242 (4881): 1038-1040 (1988)]을 참조할 수 있다.

별법으로, 화학적으로 변형된 아미노아실-tRNA를 사용하는 생합성 방법을 사용하여 몇몇 생체물리적 프로브를 시험관내에서 합성된 단백질 내로 도입하였다. 하기 문헌 및 이 문헌에서 인용된 참고문헌을 참고할 수 있다: 문헌[Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev. Biochem., 62: 483-514 (1993); and, Krieg, U. C., Walter, P., Hohnson, A. E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci., 83 (22): 8604-8608 (1986)].

종래, 화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA를, 원하는 앰버 넌센스 돌연변이를 함유하는 유전자로 프로그래밍된 단백질 합성 반응에 첨가함으로써 비-천연 아미노산을 시험관내에서 부위 특이적으로 도입할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 방법을 사용하여, 특정 아미노산에 대해 영양요구성을 갖는 균주를 사용하여 다수의 20종의 일반 아미노산을 유사한 구조의 상동체로 치환시킬 수 있고, 예를 들면, 페닐알라닌의 경우 플루오로페닐알라닌으로 치환시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[Noren, C. J., Anthony-Cahill, Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acid into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak, et al., Science 268: 439-42 (1995); Bain, J. D., Glabe, C. G., Dix, T. A., Chamberlin, A. R., Diala, E. S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a nonnatural amino acid into a polypeptide, J Am. Chem. Soc., 111: 8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13: 41-51 (1999); Ellman, J. A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J., Schultz, P. G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acid site-specifically into proteins, Methods in Enz., 301-336 (1992); and, Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P. G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24, 435-62 (1995)]을 참조할 수 있다.

예를 들면, 정지 코돈 UAG를 인식하고, 비-천연 아미노산으로 화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA를 제조하였다. 통상적인 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 단백질 유전자 내의 원하는 부위에서 정지 코돈 TAG를 도입하였다. 예를 들면, 문헌[Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonuclease in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagenesis, Nucleic Acids Res, 16 (3): 791-802 (1988)]을 참조할 수 있다. 아실화된 억제자 tRNA 및 돌연변이체 유전자가 시험관내 전사/번역 시스템에서 조합된 경우, 특정한 위치에서 그 아미노산을 함유하는 단백질을 제공하는 UAG 코돈에 반응하여 비-천연 아미노산이 도입되었다. [³H]-Phe을 사용한 실험 및 α-히드록시산을 사용한 실험은 원하는 아미노산만이 UAG 코돈에 의해 특정한 위치에서만 도입되고, 이 아미노산이 단백질 내의 임의의 다른 부위에서는 도입되지 않는다는 것을 입증하였다. 예를 들면, 문헌[Noren, et al, supra: Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10 (6): 425-432; and, Ellman, J. A., Mendel, D., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255 (5041): 197-200 (1992)]을 참조할 수 있다.

또한, 미세주사(microinjection) 기법을 사용하여 비-천연 아미노산을 단백질에 도입하였다. 예를 들면, 문헌[M. W. Nowak, P. C. Kearney, J.R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science, 268: 439 (1995); and, D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 645 (2000)]을 참조할 수 있다. 시험관내에서 제조된 2개의 RNA 종(원하는 아미노산 위치에서 UAG 정지 코돈을 갖는 표적 단백질을 코딩하는 mRNA, 및 원하는 비-천연 아미노산으로 아미노아실화된 엠버 억제자 tRNA)을 제노푸스(Xenopus) 난모세포에 주사하였다. 그 다음, 난모세포의 번역 기구는 UAG에 의해 특정된 위치에서 비-천연 아미노산을 삽입시킨다. 이 방법은 일반적으로 시험관내 발현 시스템에서 생성되지 않는 일체형(integral) 막 단백질의 생체내 구조-기능 연구를 가능하게 하였다. 그 예는 형광 아미노산을 태치키닌(tachykinin) 뉴로키닌(neurokinin)-2 수용체 내로 도입하여 형광 공명 에너지 전달에 의한 거리를 측정하는 것(예를 들면, 문헌[G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J. Biol. Chem., 271: 19991 (1996)] 참조); 이온 채널에서 표면-노출된 잔기를 확인하기 위해 바이오티닐화 아미노산을 도입하는 것(예를 들면, 문헌[J. P. Gallivan, H. A. Lester and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4: 739 (1997)] 참조); 실시간으로 이온 채널의 구조적 변화를 모니터링하기 위해 케이징된 티로신 유사체를 사용하는 것(예를 들면, 문헌[J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Neuron, 20: 619 (1998)] 참조), 및 관문(gating) 기전을 프로빙(probing)하기 위해 알파 히드록시 아미노산을 사용하여 이온 채널 골격을 변화시키는 것을 포함한다(예를 들면, 문헌[P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96: 89 (1999); and, T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci., 4: 239 (2001) 참조].

생체내에서 비-천연 아미노산을 단백질 내로 직접 도입하는 능력은 돌연변이체 단백질의 고 수율, 기술적 용이성, 세포, 또는, 가능한 경우, 살아있는 유기체에서의 돌연변이체 단백질의 연구 가능성, 및 치유적 치료에 있어서의 이러한 돌연변이체 단백질의 사용이라는 이점을 제공한다. 다양한 크기, 산도, 친핵성, 소수성 및 다른 성질을 갖는 비-천연 아미노산을 단백질 내로 도입할 수 있는 능력은 단백질의 구조를 합리적 및 체계적으로 조작하는 능력 및 단백질 기능을 프로빙하고, 새로운 성질을 갖는 신규 단백질 또는 유기체를 생성할 수 있는 능력을 크게 확장시킬 수 있다. 그러나, 단백질 번역에 있어서 고도의 신뢰도를 달성하는 데 필요한 tRNA-합성효소 상호작용의 복잡한 성질 때문에 상기 방법은 어렵다.

파라-F-Phe를 부위 특이적으로 도입하려는 한 시도에서, 효모 앰버 억제자 tRNAPheCUA/페닐알라닐-tRNA 합성효소 쌍을 p-F-Phe 내성 Phe 영양요구성 대장균 균주에서 사용하였다. 예를 들면, 문헌[R. Furter, Protein Sci. 7: 419 (1998)]을 참조할 수 있다.

무세포(시험관내) 번역 시스템을 사용하여 본 발명의 BPFI 폴리뉴클레오티드의 발현을 얻을 수도 있다. 주형(시험관내 번역의 경우)으로서의 mRNA 또는 주형(시험관내 전사와 번역이 조합되는 경우)으로서의 DNA를 포함할 수 있는 이러한 시스템에서, 시험관내 합성은 리보좀에 의해 지시된다. 무세포 단백질 발현 시스템을 개발하기 위한 상당한 노력이 이루어졌다. 예를 들면, 본 명세서에 참고로 도입되는 문헌[Kim, D. M. and J.R. Swartz, BiotechnologBiotechnologneering, 74: 309-316 (2001); Kim, D. M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D. M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D. M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineerng, 66, 180-188, (1999); and Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechnology 24, 862-868, (1998)]; 미국 특허 제6,337,191호; 미국 특허출원 공개 제2002/0081660호; 국제특허공보 공개 제WO 00/55353호 및 제WO 90/05785호]를 참조할 수 있다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI의 발현에 적용될 수 있는 또 다른 방법은 mRNA-펩티드 융합 기술을 포함한다. 예를 들면, 문헌[R. Roberts and J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 94: 12297-12302 (1997); A. Frankel, et al., Chemistry & Biology 10: 1043-1050 (2003)]을 참조할 수 있다. 이 방법에서, 퓨로마이신(puromycin)에 결합된 mRNA 주형은 리보좀 상에서 펩티드로 번역된다. 하나 이상의 tRNA 분자가 변형된 경우, 비-천연 아미노산 역시 펩티드 내로 도입될 수 있다. 마지막 mRNA 코돈이 판독된 후, 퓨로마이신은 펩티드의 C-말단을 포획한다. 생성된 mRNA-펩티드 접합체가 시험관내 분석에서 흥미로운 성질을 갖는 것으로 발견된 경우, 그의 본질은 mRNA 서열로부터 용이하게 밝혀질 수 있다. 이 방식으로, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI의 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 성질을 갖는 폴리펩티드를 확인할 수 있다. 보다 최근에, 정제된 성분을 사용한 시험관내 리보좀 번역이 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 펩티드의 합성을 가능하게 하는 것으로 보고되었다. 예를 들면, 문헌[A. Forster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 100: 6353 (2003)]을 참조할 수 있다.

IX. BPFI에 커플링된 거대분자 중합체

본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 기술 및 방법을 사용하여 본 명세서에 기재된 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 다양한 변형을 수행할 수 있다. 이러한 변형은 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 방사성핵종; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 저해성 리보핵산; 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광발색단; 금속 함유 부분; 방사성 부분; 새로운 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 광이성질체화성 부분; 바이오틴; 바이오틴의 유도체; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 산화환원 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위 원소-표지 부분; 생체물리적 프로브; 형광 기; 화학발광 기; 전자 조밀 기; 자성 기; 인터킬레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 또는 상기 물질 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 성분 상에 추가 작용기를 도입하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 기술 및 방법의 예시적인 비제한적인 예로서, 하기 설명은 거대분자 중합체를 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 부가하는 것에 초점을 맞출 것이지만, 이때 본 명세서에 기재된 조성물, 기법 및 방법(필요에 따라, 당업자가 본 명세서의 개시내용에 근거하여 실시할 수 있는 적절한 변형을 포함함)은 전술한 것들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 작용기를 부가하는 것도 적용될 수 있음을 이해해야 한다.

매우 다양한 거대분자 중합체 및 기타 다른 분자를 본 발명의 BPFI에 결합시켜 BPFI의 생물학적 성질을 조절하고/하거나 BPFI 분자에 새로운 생물학적 성질을 부여할 수 있다. 이러한 거대분자 중합체는 천연적으로 코딩된 아미노산, 비-천연적으로 코딩된 아미노산, 천연 또는 비-천연 아미노산의 임의의 작용성 치환기, 또는 천연 또는 비-천연 아미노산에 부가되는 임의의 치환기 또는 작용기를 통해 BPFI에 결합될 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상을 포함하나 이로 한정되지 않는 넓은 범위 내의 분자량일 수 있다. 중합체의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 40,000 Da이다.

본 발명은 중합체:단백질 접합체로 이루어진 실질적으로 균질한 제제를 제공한다. 본 명세서에 사용된 "실질적으로 균질한"은 중합체:단백질 접합체 분자가 총 단백질의 절반을 초과하는 정도의 수준으로 관찰되는 것을 의미한다. 중합체:단백질 접합체는 생물학적 활성을 가지며, 본 명세서에 제공된 본 발명의 "실질적으로 균질한" PEG화된 BPFI 제제는 균질한 제제의 이점, 예를 들면, 롯 투 롯(lot to lot) 약동학을 예측할 수 있다는 점에서 임상적 적용의 용이성을 나타내기에 충분히 균질한 제제이다.

또한, 당업자는 중합체:단백질 접합체 분자의 혼합물을 제조하는 방법을 선택할 수 있으며, 이때 제공되는 이점은 혼합물 중에 포함되는 단일-중합체:단백질 접합체의 비율을 선택할 수 있다는 것이다. 따라서, 당업자는 필요에 따라, 다양한 수의 부착된 중합체 잔기(즉, 디-, 트리-, 테트라- 등)를 갖는 다양한 단백질의 혼합물을 제조할 수 있고, 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 모노-중합체:단백질 접합체와 상기 접합체를 조합할 수 있고, 소정의 비율의 모노-중합체:단백질 접합체를 갖는 혼합물을 수득할 수 있다.

선택된 중합체는 부착되는 단백질이 수성 환경, 예를 들면 생리학적 환경 중에서 침전되지 않도록 수용성을 나타낼 수 있다. 중합체는 분지형 또는 비분지형 중합체일 수 있다. 바람직하게는, 최종 생성물 제제의 치료적 사용을 위해, 중합체는 약학적으로 허용가능한 것이다.

단백질 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율은 반응 혼합물 중 그들의 농도처럼 변하게 된다. 일반적으로, (최소한의 잔류 미반응 단백질 또는 중합체가 존재한다는 점에서 반응 효율에 비추어) 최적 비는 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 및 이용가능한 반응성 기에 의해 결정될 수 있다. 분자량의 경우, 전형적으로 중합체의 분자량이 높을수록, 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자의 수는 적다. 유사하게, 이들 매개변수를 최적화하는 경우 중합체의 분지화를 고려해야 한다. 일반적으로, 분자량이 높을수록 (또는 분지가 많을수록) 중합체:단백질 비가 높다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, PEG:BPFI 접합체를 고려하는 경우 용어 "치료 유효량"은 환자에게 유리한 효과를 주는 바이러스 농도에서의 감소를 제공하는 양을 말한다. 예를 들어, 용어 "치료 유효량"은 환자에게 이점을 제공하는, 바이러스 수준을 조절하는 양을 말한다. 이 양은 개인마다 다르고, 환자의 전체적인 신체 조건 및 치료될 증상의 병인을 비롯한 다수의 인자에 달려 있다. 치료에 사용되는 BPFI의 양은 허용가능한 변화 속도를 제공하고 원하는 반응을 유리한 수준으로 유지시킨다. 본 발명의 조성물의 치료 유효량은 공개적으로 입수가능한 물질 및 절차를 사용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

수용성 중합체는 선형, 갈래형(forked) 또는 분지형을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 구조 형태일 수 있다. 전형적으로, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 예를 들면, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이지만, 다른 수용성 중합체도 사용할 수 있다. 예로써, 본 발명의 특정한 실시양태를 기술하는 데 있어서 PEG를 사용한다.

PEG는 상업적으로 입수가능하거나 또는 당업계에 공지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환(ring-opening) 중합에 의해 제조될 수 있는 공지된 수용성 중합체이다(문헌[Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161] 참조). 용어 "PEG"는 크기 또는 PEG 말단에서의 변형과 관계없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포괄하는 용어로서 널리 사용되며, 하기 화학식으로 표시되는 바와 같이 BPFI에 결합되는 것으로서 나타낼 수 있다:

XO-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Y

상기 식 중,

n은 2 내지 10,000이고, X는 H이거나, C_1-4 알킬, 보호기 또는 말단 작용기를 포함하나 이로 한정되지 않는 말단 변형이다.

일부 경우, 본 발명에 사용되는 PEG는 히드록시 또는 메톡시(즉, X는 H 또는 CH₃임)를 갖는 한 말단 상에서 종결된다("메톡시 PEG"). 별법으로, PEG는 반응성 기로 종결되어 이작용 중합체를 형성할 수 있다. 전형적인 반응성 기는 20종의 일반 아미노산에서 발견되는 작용기와 반응하는 데 통상적으로 사용되는 반응성 기(말레이미드 기, 활성화된 카르보네이트(p-니트로페닐 에스테르를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 활성화된 에스테르(N-히드록시석신이미드, p-니트로페닐 에스테르를 포함하나 이로 한정되지 않음) 및 알데히드를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 뿐만 아니라, 20종의 일반 아미노산에 대해 불활성을 나타내지만 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 상보적 작용기(아지드 기 및 알킨 기를 포함하나 이들로 한정되지 않음)와 특이적으로 반응하는 작용기를 포함할 수 있다. 상기 화학식에서 Y로 표시되는 PEG의 다른 말단이 천연 발생 아미노산 또는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 BPFI에 직·간접적으로 부착된다는 점이 주목된다. 예를 들면, Y는 폴리펩티드의 아민 기(라이신의 엡실론 아민 또는 N-말단을 포함하나 이로 한정되지 않음)에 대한 아미드, 카르바메이트 또는 우레아 결합일 수 있다. 별법으로, Y는 티올 기(시스테인의 티올 기를 포함하나 이로 한정되지 않음)에 대한 말레이미드 결합일 수 있다. 별법으로, Y는 20종의 일반 아미노산을 통해 접근할 수 없는 잔기와의 결합일 수 있다. 예를 들면, PEG 상의 아지드 기는 BPFI 상의 알킨 기와 반응하여 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 생성물을 형성할 수 있다. 별법으로, PEG 상의 알킨 기는 비-천연적으로 코딩된 아미노산 중에 존재하는 아지드 기와 반응하여 유사한 생성물을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 강한 친핵성 물질(히드라진, 히드라지드, 히드록실아민, 세미카르바지드를 포함하나 이들로 한정되지 않음)은 비-천연적으로 코딩된 아미노산 중에 존재하는 알데히드 또는 케톤 기와 반응하여 히드라존, 옥심 또는 세미카르바존을 형성할 수 있으며, 일부 경우 히드라존, 옥심 또는 세미카르바존은 적절한 환원제의 처리에 의해 더 환원될 수 있다. 별법으로, 강한 친핵성 물질은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 BPFI 내로 도입될 수 있으며, 수용성 중합체 중에 존재하는 케톤 또는 알데히드 기와 우선적으로 반응하는 데 사용될 수 있다.

실제 필요에 따라 약 100 달톤(Da) 내지 100,000 Da을 포함하나 이들로 한정되지 않는 (때때로 0.1 내지 50 kDa 또는 10 내지 40 kDa를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 임의의 분자량의 PEG가 사용될 수 있다. MW가 1 내지 100 kDa(1 내지 50 kDa 또는 5 내지 20 kDa)인 각 쇄를 가진 PEG 분자를 포함하나 이로 한정되지 않는 분지쇄 PEG를 사용할 수도 있다. 매우 다양한 PEG 분자가 본 명세서에 참고로 도입되는 문헌[Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog]을 포함하나 이로 한정되지 않는 문헌에 기재되어 있다.

일반적으로, PEG 분자의 하나 이상의 말단은 비-천연적으로 코딩된 아미노산과의 반응에 이용가능하다. 예를 들면, 아미노산 측쇄와의 반응을 위해 알킨 및 아지드 부분을 갖는 PEG 유도체를 사용하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 PEG를 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 부착시킬 수 있다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 아지드를 포함하는 경우, PEG는 전형적으로 알킨 부분을 함유하여 [3 + 2] 시클로부가 생성물을 형성하거나, 포스핀 기를 함유하는 활성화된 PEG 종(즉, 에스테르, 카르보네이트)을 함유하여 아미드 결합을 형성한다. 별법으로, 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 알킨을 포함하는 경우, PEG는 전형적으로 아지드 부분을 함유하여 [3 + 2] 휘스겐 시클로부가 생성물을 형성한다. 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐 기를 포함하는 경우, PEG는 각각 상응하는 히드라존, 옥심 및 세미카르바존 결합을 형성하기 위해 전형적으로 강력한 친핵성 물질(히드라지드, 히드라진, 히드록실아민 또는 세미카르바지드 작용기를 포함하나 이로 한정되지 않음)을 포함한다. 별법으로, 전술한 반응성 기의 역 배향을 사용할 수 있다. 즉, 비-천연적으로 코딩된 아미노산 중의 아지드 부분을 알킨을 함유하는 PEG 유도체와 반응시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, PEG 유도체를 갖는 BPFI 변이체는 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 화학적 작용기와 반응하는 화학적 작용기를 함유한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 골격을 포함하는 아지드 함유 중합체 유도체 및 아세틸렌 함유 중합체 유도체를 제공한다. 수용성 중합체의 중합체 골격은 폴리(에틸렌 글리콜)일 수 있다. 그러나, 또한, 폴리(에틸렌) 글리콜, 및 폴리(덱스트란) 및 폴리(프로필렌 글리콜)을 포함하는 다른 관련된 중합체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 매우 다양한 수용성 중합체들도 본 발명을 실시하기에 적합하고, 용어 PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)의 사용은 모든 이러한 분자를 포괄하고 포함하기 위한 것이라는 점을 이해해야 한다. 용어 PEG는 이작용성 PEG, 멀티아암형(multiarmed) PEG, 유도체화된 PEG, 갈래형 PEG, 분지형 PEG, 현수 PEG(즉, 중합체 골격에 현수된 하나 이상의 작용기를 갖는 PEG 또는 관련된 중합체), 또는 분해가능한 결합을 갖는 PEG를 비롯한 임의의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

전형적으로, PEG는 투명하고, 무색 무취이고, 수용성, 열에 대한 안정성 및 많은 화학적 약제에 대한 불활성을 나타내며, 가수분해되거나 약화되지 않으며, 일반적으로 무독성을 띤다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생체적합성 물질로서 간주된다. 즉, PEG는 유해하지 않으며 생명체 조직 또는 유기체와 공존할 수 있다. 더욱 구체적으로, PEG는 실질적으로 비면역원성을 가진다. 즉, PEG는 체내에서 면역 반응을 일으키지 않는 경향을 나타낸다. PEG가 체내에서 일부 바람직한 기능을 갖는 분자, 예를 들면 생물학적 활성 물질에 부착된 경우, PEG는 상기 물질을 차폐하는 경향을 나타내며 유기체가 상기 물질의 존재에 대한 내성을 가질 수 있도록 임의의 면역 반응을 감소시키거나 제거할 수 있다. PEG 접합체는 실질적인 면역 반응을 일으키거나 응고 또는 다른 바람직하지 못한 효과를 일으키는 경향을 갖지 않는다. 화학식 --CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂--(이때, n은 약 3 내지 약 4000, 전형적으로 약 20 내지 약 2000임)을 갖는 PEG가 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 분자량을 갖는 PEG가 중합체 골격으로서 특히 유용하다.

중합체 골격은 선형 또는 분지형일 수 있다. 일반적으로, 분지형 중합체 골격은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 분지형 중합체는 중심 분지 코어 부분, 및 중심 분지 코어에 결합된 다수의 선형 중합체 쇄를 갖는다. 통상, PEG는 다양한 폴리올, 예를 들면 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리쓰리톨 및 소르비톨에 에틸렌 옥시드를 첨가함으로써 제조될 수 있는 분지 형태로 사용된다. 또한, 중심 분지 부분은 몇몇 아미노산, 예를 들면 라이신으로부터 유도될 수 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 일반적으로 화학식 R(-PEG-OH)_m(이때, R은 코어 부분, 예를 들면 글리세롤, 글리세롤 올리고머 또는 펜타에리쓰리톨로부터 유도되고, m은 다수의 아암을 나타냄)로 표시될 수 있다. 또한, 멀티아암형 PEG 분자, 예를 들면 그 전문이 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,932,462호, 제5,643,575호, 제5,229,490호 및 제4,289,872호; 미국 특허출원 공개 제2003/0143596호; 국제특허공보 공개 제WO 96/21469호; 및 제WO 93/21259호에 기재된 것들도 중합체 골격으로서 사용될 수 있다.

또한, 분지형 PEG는 PEG(--YCHZ₂)_n(이때, Y는 결합기이고, Z는 정해진 길이의 원자로 된 쇄에 의해 CH에 결합된 활성화된 말단 기임)으로 표시되는 갈래형 PEG의 형태로 존재할 수 있다.

또한, 또 다른 분지형 형태인 현수 PEG는 PEG 쇄의 말단에서가 아니라 PEG 골격을 따라 반응성 기, 예를 들면 카르복실 기를 갖는다.

또한, 이러한 PEG 형태 이외에, 골격 내에 약한 또는 분해가능한 결합을 갖는 PEG 중합체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 가수분해되기 쉬운 중합체 골격 내의 에스테르 결합을 갖는 PEG를 제조할 수 있다. 하기에 표시되는 바와 같이, 이러한 가수분해는 상기 중합체를 저 분자량의 단편으로 절단시킨다:

-PEG-CO₂-PEG- + H₂O → PEG-CO₂H + HO-PEG-

용어 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 PEG가 본 명세서에 개시된 것들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업계에 공지된 모든 형태를 나타내거나 포함한다는 점은 당업자에게 이해될 것이다.

또한, 많은 다른 중합체들도 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 일부 실시양태에서, 2 내지 약 300개의 말단을 갖는 수용성 중합체 골격은 본 발명에 특히 유용하다. 적합한 중합체의 예는 다른 폴리(알킬렌 글리콜), 예를 들면 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 이들의 공중합체(에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 이들의 삼원중합체, 이들의 혼합물 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 비록 중합체 골격의 각 쇄의 분자량은 변할 수 있지만, 전형적으로는 약 800 Da 내지 약 100,000 Da, 종종 약 6,000 Da 내지 약 80,000 Da이다.

당업자는 실질적으로 수용성을 나타내는 골격에 대한 상기 목록이 결코 전부가 아니며 단순히 예시를 위한 것이고, 전술한 질을 가진 모든 중합체 물질들이 본 발명에서 사용하기에 적합한 것으로 고려된다는 점을 인식할 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 중합체 유도체는 "다작용성" 유도체이며, 이는 중합체 골격이 작용기에 의해 작용화되거나 활성화된 2개 이상의 말단, 및, 가능한 경우, 작용기에 의해 작용화되거나 활성화된 약 300개의 말단을 갖는다는 것을 의미한다. 다작용성 중합체 유도체는 동일하거나 상이할 수 있는 작용기에 각각 결합된 2개의 말단을 갖는 선형 중합체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

한 실시양태에서, 중합체 유도체는 하기 구조를 갖는다:

X-A-POLY-B-N=N=N

상기 식 중,

N=N=N은 아지드 부분이고,

B는 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 링커 부분이고,

POLY는 수용성 및 비항원성을 나타내는 중합체이고,

A는 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며 B와 동일하거나 상이할 수 있는 링커 부분이고,

X는 제2 작용기이다.

A 및 B에 대한 링커 부분의 예로는 18개 이하, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 다작용화된 알킬 기를 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 알킬 쇄는 헤테로원자, 예를 들면 질소, 산소 또는 황을 포함할 수 있다. 또한, 알킬 쇄는 헤테로원자에서 분지될 수 있다. A 및 B에 대한 링커 부분의 다른 예로는 10개 이하, 더욱 바람직하게는 5 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 다작용화된 아릴 기를 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 아릴 기는 하나 이상의 탄소 원자, 질소, 산소 또는 황 원자로 치환될 수 있다. 적절한 결합 기의 다른 예로는 각각 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,932,462호, 제5,643,575호 및 미국 특허출원 공개 제2003/0143596호에 기재된 결합 기를 들 수 있다. 당업자는 상기 링커 부분에 대한 목록이 결코 전부가 아니며 단순히 예시를 위한 것이고, 전술한 성질을 갖는 모든 링커 부분이 본 발명에서 사용하기에 적합한 것으로 고려된다는 것을 인식할 것이다.

X로 사용하기에 적합한 작용기의 예로는 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예를 들면 N-히드록시석신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예를 들면 N-히드록시석신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄, 케톤 및 아지드를 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 선택된 X 부분은 아지드 기와의 반응이 일어나지 않도록 아지드 기와 상용가능해야 한다. 아지드 함유 중합체 유도체는 제2 작용기(즉, X)도 아지드 부분인 것을 의미하는 점에서 동종이작용성(homobifunctional) 유도체이거나, 제2 작용기가 상이한 작용기임을 의미하는 점에서 이종이작용성(heterobifunctional) 유도체일 수 있다.

용어 "보호된"은 특정한 반응 조건 하에서 화학적 반응성 작용기의 반응을 방지하는 보호기 또는 부분의 존재를 지칭한다. 보호기는 보호되는 화학적 반응성 기의 종류에 따라 달라진다. 예를 들면, 화학적 반응성 기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 화학적 반응성 기가 티올인 경우, 보호기는 오르토피리딜디설피드일 수 있다. 화학적 반응성 기가 카르복실산, 예를 들면, 부탄산, 프로피온산 또는 히드록실 기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬 기, 예를 들면 메틸, 에틸 또는 tert-부틸일 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 다른 보호기도 본 발명에서 사용될 수 있다.

문헌에 기재된 말단 작용기의 구체적인 예로는 N-석신이미딜 카르보네이트(예를 들면, 미국 특허 제5,281,698호 및 제5,468,478호 참조), 아민(예를 들면, 문헌[Buckmann et al. Makromol. Chem. 182: 1379 (1981), Zaplipsky et al. Eur. Polym. J. 19: 1177 (1983)] 참조), 히드라지드(예를 들면, 문헌[Andresz et al. Makromol. Chem. 179: 301 (1978)] 참조), 석신이미딜 프로피오네이트 및 석신이미딜 부타노에이트(예를 들면, 문헌[Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zaplipsky Eds., ACS, Washington, D. C., 1997]; 및, 미국 특허 제5,672,662호 참조), 석신이미딜 숙시네이트(예를 들면, 문헌[Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7: 175 (1984) and Joppich et al. Macromol. Chem. 180: 1381 (1979)] 참조), 석신이미딜 에스테르(예를 들면, 미국 특허 제4,670,417호 참조), 벤조트리아졸 카르보네이트(예를 들면, 미국 특허 제5,650,234호 참조), 글리시딜 에테르(예를 들면, 문헌[Pitha et al. Eur. J Biochem. 94: 11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13: 354 (1991)] 참조), 옥시카르보닐이미다졸(예를 들면, 문헌[Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131: 25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1: 251 (1985)] 참조), p-니트로페닐 카르보네이트(예를 들면, 문헌[Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); and Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27: 45 (1991)] 참조), 알데히드(예를 들면, 문헌[Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22: 341 (1984)], 미국 특허 제5,824,784호 및 미국 특허 제5,252,714호 참조), 말레이미드(예를 들면, 문헌[Goodson et al. Bio/Technology 8: 343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2: 29 (1984), and Kogan, Synthetic Comm. 22: 2417 (1992)] 참조), 오르토피리딜-디설피드(예를 들면, 문헌[Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4: 314 (1993)] 참조), 아크릴올(예를 들면, 문헌[Sawhney et al., Macromolecules, 26: 581 (1993)] 참조), 비닐설폰(예를 들면, 미국 특허 제5,900,461호 참조)을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 상기 모든 참고문헌 및 특허는 본 명세서에 참고로 도입된다.

본 발명의 특정한 실시양태에서, 본 발명의 중합체 유도체는 하기 구조를 갖는 중합체 골격을 포함한다:

X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂-N=N=N

상기 식 중,

X는 전술한 바와 같은 작용기이고,

n은 약 20 내지 약 4000이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 중합체 유도체는 하기 구조를 갖는 중합체 골격을 포함한다:

X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-W-N=N=N

상기 식 중,

W는 1 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 지방족 또는 방향족 링커 부분이고,

n은 약 20 내지 약 4000이고,

X는 전술한 바와 같은 작용기이다. m은 1 내지 10이다.

본 발명의 아지드 함유 PEG 유도체는 당업계에 공지되고/되거나 본 명세서에 개시되어 있는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 한 방법에서, 이하 나타내는 바와 같이, 제1 작용기에 결합된 제1 말단 및 적합한 이탈기에 결합된 제2 말단을 가지며 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 골격은 아지드 음이온(이는 나트륨, 칼륨, tert-부틸암모늄 등을 포함하는 임의의 다수의 적합한 반대-이온과 쌍을 이룰 수 있음)과 반응한다. 이러한 이탈기는 친핵성 치환을 받게 되고, 아지드 부분에 의해 교체되어 원하는 아지드 함유 PEG 중합체를 제공한다.

X-PEG-L + N₃ ^- → X-PEG-N₃

위에 표시된 바와 같이, 본 발명에서 사용하기에 적합한 중합체 골격은 화학식 X-PEG-L(이때, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, X는 아지드 기와 반응하지 않는 작용기이고, L은 적합한 이탈기임)로 표시된다. 적합한 작용기의 예로는 히드록실, 보호된 히드록실, 아세탈, 알케닐, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 말레이미드, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 및 케톤을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 적합한 이탈기의 예로는 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 메실레이트, 트레실레이트 및 토실레이트를 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.

본 발명의 아지드 함유 중합체 유도체를 제조하는 또 다른 방법에서, 아지드 작용기를 갖는 결합제를 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 골격과 접촉시키는데, 이때 결합제는 PEG 중합체 상에서 화학적 작용기와 선택적으로 반응하는 화학적 작용기를 보유하며 아지드 함유 중합체 유도체 생성물을 형성하고, 아지드는 결합 기에 의해 중합체 골격으로부터 분리된다.

예시적인 반응식은 하기와 같이 표시된다:

X-PEG-M + N-링커-N=N=N → PG-X-PEG-링커-N=N=N

상기 식 중,

PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고,

X는 캡핑 기, 예를 들면 알콕시 또는 전술한 바와 같은 작용기이고,

M은 N 작용기와 효율적 및 선택적으로 반응하는 아지드 작용기와 반응하지 않는 작용기이다.

적절한 작용기의 예로는 N이 아민인 경우 카르복실산, 카르보네이트 또는 활성 에스테르인 M, N이 히드라지드 또는 아미노옥시 부분인 경우 케톤인 M, N이 친핵성 물질인 경우 이탈기인 M을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.

조 생성물의 정제는 생성물을 침전시킨 후, 필요에 따라 크로마토그래피를 수행하는 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.

보다 구체적인 예로는 아민 중 하나가 보호기 부분, 예를 들면 tert-부틸-Boc에 의해 보호되는 PEG 디아민의 경우로서 하기와 같이 표시되고, 생성된 단일-보호된 PEG 디아민은 아지드 작용기를 갖는 링커 부분과 반응한다:

BocHN-PEG-NH₂ + H0₂C-(CH₂)₃-N=N=N

이 경우, 아민 기는 다양한 활성화제, 예를 들면 티오닐 클로라이드 또는 카르보디이미드 시약 및 N-히드록시석신이미드 또는 N-히드록시벤조트리아졸을 사용하여 카르복실산 기에 커플링되어, 모노아민 PEG 유도체와 아지드-보유 링커 부분 사이에 아미드 결합을 형성할 수 있다. 아미드 결합의 성공적인 형성 후, 생성된 N-tert-부틸-Boc-보호된 아지드 함유 유도체는 생체활성 분자를 변형시키는 데 직접 사용될 수 있거나 더 다듬어져 다른 유용한 작용기를 부가시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, N-t-Boc 기는 강한 산 처리에 의해 가수분해되어 오메가-아미노-PEG-아지드를 생성할 수 있다. 생성된 아민은 다른 유용한 작용기, 예를 들면, 말레이미드 기, 활성화된 디설피드, 활성화된 에스테르 등을 부가시키는 합성 핸들(handle)로서 사용되어 가치있는 이종이작용성 물질을 생성시킬 수 있다.

상이한 분자를 중합체의 각 말단에 부착시킬 필요가 있는 경우, 이종이작용성 유도체가 특히 유용하다. 예를 들면, 오메가-N-아미노-N-아지도 PEG는 활성화된 친전자성 기, 예를 들면 알데히드, 케톤, 활성화된 에스테르, 활성화된 카르보네이트 등을 갖는 분자를 PEG의 한 말단에 부착시키고, 아세틸렌 기를 갖는 분자를 PEG의 다른 말단에 부착시킨다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 중합체 유도체는 하기 구조를 갖는다:

X-A-POLY-B-C≡C-R

상기 식 중,

R은 H, 알킬, 알켄, 알킬옥시, 또는 아릴 또는 치환된 아릴 기일 수 있고,

B는 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 링커 부분이고,

POLY는 수용성 및 비항원성을 나타내는 중합체이고,

A는 존재하거나 존재하지 않을 수 있고 B와 동일하거나 상이할 수 있는 링커 부분이고,

X는 제2 작용기이다.

A 및 B에 대한 링커 부분의 예로는 18개 이하, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 다작용화된 알킬 기를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 알킬 쇄는 헤테로원자, 예를 들면 질소, 산소 또는 황을 포함할 수 있다. 또한, 알킬 쇄는 헤테로원자에서 분지될 수 있다. A 및 B에 대한 링커 부분의 다른 예로는 10개 이하, 보다 바람직하게는 5 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 다작용화된 아릴 기를 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 아릴 기는 하나 이상의 탄소 원자, 질소, 산소 또는 황 원자로 치환될 수 있다. 적절한 결합 기의 다른 예로는 각각 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,932,462호 및 제5,643,575호, 및 미국 특허출원 공개 제2003/0143596호에 기재된 결합 기를 들 수 있다. 당업자는 상기 링커 부분에 대한 목록이 결코 전부가 아니며 단순히 예시를 위한 것이고, 전술한 성질을 갖는 모든 링커 부분이 본 발명에서 사용하기에 적합한 것으로 고려된다는 것을 인식할 것이다.

X로 사용하기에 적합한 작용기의 예로는 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예를 들면 N-히드록시석신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예를 들면 N-히드록시석신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 및 트레실레이트, 알켄, 케톤 및 아세틸렌을 들 수 있다. 이해되는 바와 같이, 선택된 X 부분은 아지드 기와의 반응이 일어나지 않도록 아지드 기와 상용가능해야 한다. 아지드 함유 중합체 유도체는 제2 작용기(즉, X)도 아지드 부분인 것을 의미하는 점에서 동종이작용성 유도체이거나, 제2 작용기가 상이한 작용기임을 의미하는 점에서 이종이작용성 유도체일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 중합체 유도체는 하기 구조를 갖는 중합체 골격을 포함한다:

X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-0-(CH₂)_m-C≡CH

상기 식 중,

X는 전술한 바와 같은 작용기이고,

n은 약 20 내지 약 4000이고,

m은 1 내지 10이다.

이종이작용 PEG 중합체 각각의 구체적인 예는 이하에 기재한 바와 같다.

본 발명의 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 당업계에 공지되고/되거나 본 명세서에 개시되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 한 방법에서, 제1 작용기에 결합된 제1 말단, 및 적합한 친핵성 기에 결합된 제2 말단을 가지며 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 골격은 아세틸렌 작용기 및 PEG 상의 친핵성 기와 반응하기에 적합한 이탈기 둘다를 갖는 화합물과 반응한다. 친핵성 부분을 갖는 PEG 중합체와 이탈기를 갖는 분자가 조합되는 경우, 이탈기는 친핵성 치환을 받게 되고, 친핵성 부분으로 치환되어 원하는 아세틸렌 함유 중합체를 제공한다.

X-PEG-Nu + L-A-C → X-PEG-Nu-A-C≡CR'

상기 표시된 바와 같이, 반응에 사용하기에 바람직한 중합체 골격은 화학식 X-PEG-Nu(이때, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, Nu는 친핵성 부분이고, X는 Nu, L 또는 아세틸렌 작용기와 반응하지 않는 작용기임)로 표시된다.

Nu의 예로는 주로 SN₂-유형 기전을 통해 반응하는 아민, 알콕시, 아릴옥시, 술프히드릴, 이미노, 카르복실레이트, 히드라지드, 아민옥시 기를 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. Nu 기의 추가 예로는 주로 친핵성 부가 반응을 통해 반응하는 작용기를 들 수 있다. L 기의 예로는 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 메실레이트, 트레실레이트, 토실레이트 및 친핵성 치환을 받을 것으로 예상되는 다른 기 뿐만 아니라, 케톤, 알데히드, 티오에스테르, 올레핀, 알파-베타 불포화된 카르보닐 기, 카르보네이트 및 친핵성 물질에 의한 부가를 받을 것으로 예상되는 다른 친전자성 기를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, A는 1 내지 10개의 탄소 원자의 지방족 링커 또는 6 내지 14개의 탄소 원자의 치환된 아릴 고리이다. X는 아지드 기와 반응하지 않는 작용기이고, L은 적합한 이탈기이다.

본 발명의 아세틸렌 함유 중합체 유도체를 제조하는 또 다른 방법에서, 한 말단에서는 보호된 작용기 또는 캡핑제를 보유하고 다른 말단에서는 적합한 이탈기를 보유하며 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 PEG 중합체는 아세틸렌 음이온에 의해 접촉된다.

예시적인 반응식은 하기에 나타낸다:

X-PEG-L + -C≡CR' → X-PEG-C≡CR'

상기 식 중,

PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, X는 캡핑 기, 예를 들면 알콕시 또는 전술한 바와 같은 작용기이고;

R'는 H, 알킬, 알콕시, 아릴, 아릴옥시 기, 치환된 알킬, 알콕실, 아릴 또는 아릴옥시 기이다.

상기 예에서, 이탈기 L은 충분한 농도의 아세틸렌 음이온과 접촉하는 경우 SN₂-유형 치환을 받기에 충분한 반응성을 나타내어야 한다. 아세틸렌 음이온에 의한 이탈기의 SN₂ 치환을 달성하는 데 필요로 하는 반응 조건은 당업계에 잘 공지되어 있다.

통상, 미정제 생성물의 정제는 생성물을 침전시킨 후, 필요에 따라, 크로마토그래피로 정제하는 방법을 포함하나 이로 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

수용성 중합체는 본 발명의 BPFI에 결합될 수 있다. 수용성 중합체는 BPFI 내로 도입된 비-천연적으로 코딩된 아미노산, 비-천연적으로 코딩 또는 천연적으로 코딩된 아미노산의 임의의 작용기 또는 치환기, 비-천연적으로 코딩 또는 천연적으로 코딩된 아미노산에 부가된 임의의 작용기 또는 치환기를 통해 결합될 수 있다. 별법으로, 수용성 중합체는 천연 발생 아미노산(시스테인, 라이신 또는 N-말단 잔기의 아민 기를 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 통해 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 BPFI에 결합된다. 일부 경우, 본 발명의 BPFI는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 비-천연 아미노산을 포함하며, 이때 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산(들)이 수용성 중합체(들)(PEG 및/또는 올리고사카라이드를 포함하나 이들로 한정되지 않음)에 결합된다. 일부 경우, 본 발명의 BPFI는 수용성 중합체에 결합된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산(들)을 추가로 포함한다. 일부 경우, 본 발명의 BPFI는 수용성 중합체에 결합된 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산(들) 및 수용성 중합체에 결합된 하나 이상의 천연 발생 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 수용성 중합체는 접합되지 않은 형태에 비해 BPFI의 혈청 반감기를 증가시킨다.

본 발명의 BPFI에 결합된 수용성 중합체의 수(즉, PEG화 또는 글리코실화 정도)를 조정하여 변경된 (증가 또는 감소를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 약리학적, 약동학적 또는 약력학적 특성, 예를 들면, 변경된 생체내 반감기를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, BPFI의 반감기는 비-변형된 폴리펩티드에 비해 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 이상, 또는 약 2배, 5배, 10 배, 50배 또는 약 100배 이상 증가된다.

강한 친핵성 기(즉, 히드라지드, 히드라진, 히드록실아민 또는 세미카르바지드)를 함유하는 PEG 유도체

본 발명의 한 실시양태에서, 카르보닐 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI는 PEG 골격에 직접 결합된 말단 히드라진, 히드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다.

일부 실시양태에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-O-NH₂

상기 식 중,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000(즉, 평균 분자량은 5 내지 40 kDa임)이다.

일부 실시양태에서, 히드라진 함유 PEG 유도체 또는 히드라지드 함유 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X-NH-NH₂

상기 식 중,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000이고, X는 경우에 따라 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 카르보닐 기(C=O)이다.

일부 실시양태에서, 세미카르바지드 함유 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

상기 식 중,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 BPFI는 아미드 결합에 의해 PEG 골격에 결합되는 말단 히드록실아민, 히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다.

일부 실시양태에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-0-NH₂

상기 식 중,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000(즉, 평균 분자량은 5 내지 40 kDa임)이다.

일부 실시양태에서, 히드라진 함유 또는 히드라지드 함유 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-X-NH-NH₂

상기 식 중,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000이고, X는 경우에 따라 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 카르보닐 기(C=O)이다.

일부 실시양태에서, 세미카르바지드 함유 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

상기 식 중,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 BPFI는 말단 히드라진, 히드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체에 의해 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각 쇄의 MW는 10 내지 40 kDa, 더욱 바람직하게는 5 내지 20 kDa이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI는 분지형 구조를 갖는 PEG 유도체에 의해 변형된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 히드라진-말단 PEG 유도체 또는 히드라지드-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-NH-NH₂

상기 식 중,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000이고, X는 경우에 따라 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 카르보닐 기(C=O)이다.

일부 실시양태에서, 세미카르바지드 기를 함유하는 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

상기 식 중,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 경우에 따라 NH, 0, S 또는 C(O)이거나 존재하지 않고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000이다.

일부 실시양태에서, 히드록실아민 기를 함유하는 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-0-NH₂

상기 식 중,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 경우에 따라 NH, O, S 또는 C(O)이거나, 존재하지 않으며, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000이다.

수용성 중합체(들)가 BPFI에 결합되는 정도 및 부위는 BPFI와 BPFI 수용체 또는 결합 파트너의 결합을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 결합은 예를 들면, 평형 결합 분석에 의한 측정 시 BPFI가 약 400 nM 이하의 K_d, 150 nM 이하의 K_d, 및, 일부 경우, 100 nM 이하의 K_d로 BPFI 수용체에 결합하도록 배열된다.

펩티드의 접합에 이용되는 방법 및 화학적 기법뿐만 아니라 중합체의 활성화에 이용되는 방법 및 화학적 기법도 문헌에 기재되어 있고, 당업계에 공지되어 있다. 중합체의 활성화에 통상 이용되는 방법은 시아노겐 브로마이드, 페리오데이트, 글루타르알데히드, 비에폭시드, 에피클로로히드린, 디비닐설폰, 카르보디이미드, 설포닐 할라이드, 트리클로로트리아진 등을 사용한 작용기의 활성화를 포함하며 이에 한정되지 않는다(문헌[R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N. Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N. Y.; Dunn, R. L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991] 참조).

PEG의 작용화 및 접합에 대한 몇몇 검토 및 논문이 이용가능하다. 예를 들면, 문헌[Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995)]을 참조할 수 있다.

또한, 중합체의 활성화 방법은 국제특허공보 공개 제WO 94/17039호, 미국 특허 제5,324,844호, 국제특허공보 공개 제WO 94/18247호 및 제WO 94/04193호, 미국 특허 제5,219,564호, 미국 특허 제5,122,614호, 국제특허공보 공개 제WO 90/13540호, 미국 특허 제5,281,698호, 및 국제특허공보 공개 제WO 93/15189호에서 찾을 수 있고, 응고인자 VIII(국제특허공보 공개 제WO 94/15625호 참조), 헤모글로빈(국제특허공보 공개 제WO 94/09027호 참조), 산소 운반 분자(미국 특허 제4,412,989호 참조), 리보뉴클레아제(ribonuclease) 및 슈퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase)(문헌[Veronese et al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)] 참조)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 효소를 사용한 중합체의 활성화 방법도 공지되어 있다. 인용된 모든 참고문헌 및 특허는 본 명세서에 참고로 도입된다.

비-천연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들면 p-아지도-L-페닐알라닌을 함유하는 BPFI의 PEG화(즉, 임의의 수용성 중합체의 부가)는 임의의 편리한 방법에 의해 수행된다. 예를 들면, BPFI는 알킨-종결 mPEG 유도체에 의해 PEG화된다. 요약하면, 실온에서 과량의 고체 mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH를 교반하면서 p-아지도-L-Phe 함유 BPFI의 수용액에 첨가한다. 전형적으로, 이 수용액은 반응이 수행되는 pH(일반적으로, 약 pH 4 내지 10) 근처에서 pKa를 갖는 완충제에 의해 완충된다. 예를 들면, pH 7.5에서 PEG화하기에 적합한 완충제의 예로는 헤페스, 포스페이트, 보레이트, TRIS-HCl, EPPS 및 TES를 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. pH를 연속적으로 모니터링하고, 필요에 따라, 조정한다. 전형적으로, 반응을 약 1 내지 48시간 동안 계속 수행한다.

그 후, 반응 생성물을 소수성 상호작용 크로마토그래피로 정제하여, 차단되지 않은 PEG가 분자의 양쪽 말단에서 활성화되어 BPFI 변이체 분자를 가교 결합시키는 경우 형성될 수 있는 PEG화된 BPFI의 임의의 고-분자량 복합체와, 유리 mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH로부터의 PEG화된 BPFI 변이체를 분리시킨다. 소수성 상호작용 크로마토그래피로 정제하는 동안의 조건은 임의의 가교 결합된 PEG화된 BPFI 변이체 복합체가 하나 이상의 PEG 기에 접합된 하나의 BPFI 변이체 분자를 함유하는 원하는 형태 다음으로 용출되는 동안 유리 mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH가 컬럼을 통해 흘러나오게 하는 조건이다. 적합한 조건은 가교 결합된 복합체 대 원하는 접합체의 상대적 크기에 따라 달라지고, 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 원하는 접합체를 함유하는 용출액을 한외여과에 의해 농축하고, 투석여과에 의해 탈염한다.

필요에 따라, 소수성 크로마토그래피로부터 얻은 PEG화된 BPFI를 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스를 사용하는 것을 포함하나 이로 한정되지 않음); 실리카 상에서의 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스 G-75를 사용하는 것을 포함하나 이로 한정되지 않음); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기-배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/투석여과: 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기영동 방법(분취형 등전위 포커싱을 포함하나 이로 한정되지 않음), 차등 용해도 이용법(황산암모늄 침전을 포함하나 이로 한정되지 않음), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업자에게 공지된 하나 이상의 공정으로 추가 정제할 수 있다. 겉보기 분자량은 구형 단백질 기준물과 비교함에 의해 GPC에 의해 추정될 수 있다(문헌[PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306] 참조). BPFI-PEG 접합체의 순도를 단백질분해성 분해(트립신 분해를 포함하나 이로 한정되지 않음) 후 질량 분광측정 분석에 의해 평가될 수 있다. 문헌[Pepinsky B., et al., J. Pharmacol. & Exp. Ther. 297 (3): 1059-66 (2001)]을 참조할 수 있다.

본 발명의 BPFI의 아미노산에 결합된 수용성 중합체는 제한 없이 추가로 유도체화되거나 치환될 수 있다.

아지드 함유 PEG 유도체

본 발명의 또 다른 실시양태에서, BPFI는 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 알킨 부분과 반응하는 아지드 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체의 평균 분자량은 1 내지 100 kDa이고, 일부 실시양태에서는 10 내지 40 kDa이다.

일부 실시양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-N₃

상기 식 중,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000(즉, 평균 분자량은 5 내지 40 kDa임)이다.

또 다른 실시양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-N₃

상기 식 중,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, p는 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000(즉, 평균 분자량은 5 내지 40 kDa임)이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 알킨 함유 아미노산을 포함하는 BPFI는 말단 아지드 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체에 의해 변형되며, 이때 이러한 분지형 PEG의 각 쇄의 MW는 10 내지 40 kDa, 더욱 바람직하게는 5 내지 20 kDa이다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 아지드-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_pN₃

상기 식 중,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, p는 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000이고, X는 경우에 따라 O, N, S 또는 카르보닐 기(C=O)이며, 각각의 경우 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.

알킨 함유 PEG 유도체

본 발명의 또 다른 실시양태에서, BPFI는 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 아지드 부분과 반응하는 알킬 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다.

일부 실시양태에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-C≡CH

상기 식 중,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000(즉, 평균 분자량은 5 내지 40 kDa임)이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 알킨 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI는 아미드 결합에 의해 PEG 골격에 결합된 말단 아지드 또는 말단 알킨 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다.

일부 실시양태에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-C≡CH

상기 식 중,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, p는 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아지드 함유 아미노산을 포함하는 BPFI는 말단 알킨 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체에 의해 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각 쇄의 MW는 10 내지 40 kDa, 더욱 바람직하게는 5 내지 20 kDa이다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 알킨-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_pC≡CH

상기 식 중,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, p는 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000이고, X는 경우에 따라 O, N, S 또는 카르보닐 기(C=O)이거나 존재하지 않는다.

포스핀 함유 PEG 유도체

본 발명의 또 다른 실시양태에서, BPFI는 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 아지드 부분과 반응하게 되는 아릴 포스핀 기를 추가로 포함하는 활성화된 작용기(에스테르, 카르보네이트를 포함하나 이들로 한정되지 않음)를 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체의 평균 분자량은 1 내지 100 kDa이고, 일부 실시양태에서 10 내지 40 kDa이다.

일부 실시양태에서, PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

상기 식 중,

n은 1 내지 10이고, X는 O, N 또는 S이거나 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이다.

일부 실시양태에서, PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

상기 식 중,

X는 O, N 또는 S이거나 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이고, R은 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴 기일 수 있다. 예시적인 R 기는 -CH₂, -C(CH₃)₃, -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)R', -CONR'R", -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -CN 및 -NO₂를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. R', R", R"' 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 1-3개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하나 이들로 한정되지 않는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R 기를 포함할 때, 예를 들면, R 기는 R', R", R"' 및 R"" 기 중 하나 이상의 기가 존재하는 경우 각각의 R', R", R"' 및 R"" 기와 마찬가지로 각각 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 조합되어 5원, 6원 또는 7원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들면, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나 이들로 한정되지 않는 기를 의미한다. 치환기에 대한 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이, 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예를 들면 할로알킬(-CF₃ 및 -CH₂CF₃를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 및 아실(-C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 포함하는 기를 의미한다는 점을 이해할 것이다.

다른 PEG 유도체 및 일반적 PEG화 기법

BPFI에 결합될 수 있는 다른 예시적인 PEG 분자 뿐만 아니라, PEG화 방법은 예를 들면, 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2004/0001838호, 제2002/0052009호, 제2003/0162949호, 제2004/0013637호, 제2003/0228274호, 제2003/0220447호, 제2003/0158333호, 제2003/0143596호, 제2003/0114647호, 제2003/0105275호, 제2003/0105224호, 제2003/0023023호, 제2002/0156047호, 제2002/0099133호, 제2002/0086939호, 제2002/0082345호, 제2002/0072573호, 제2002/0052430호, 제2002/0040076호, 제2002/0037949호, 제2002/0002250호, 제2001/0056171호, 제2001/0044526호, 제2001/0027217호 및 제2001/0021763호; 미국 특허 제6,646,110호, 제5,824,778호, 제5,476,653호, 제5,219,564호, 제5,629,384호, 제5,736,625호, 제 4,902,502호, 제5,281,698호, 제5,122,614호, 제5,473,034호, 제5,516,673호, 제5,382,657호, 제6,552,167호, 제6,610,281호, 제6,515,100호, 제6,461,603호, 제6,436,386호, 제6,214,966호, 제5,990,237호, 제5,900,461호, 제5,739,208호, 제5,672,662호, 제5,446,090호, 제5,808,096호, 제5,612,460호, 제5,324,844호, 제5,252,714호, 제6,420,339호, 제6,201,072호, 제6,451,346호, 제6,306,821호, 제5,559,213호, 제5,612,460호, 제5,747,646호, 제5,834,594호, 제5,849,860호, 제5,980,948호, 제6,004,573호 및 제6,129,912호; 국제특허공보 공개 제WO 97/32607호; 유럽 특허 제229,108호 및 제402,378호; 국제특허공보 공개 제WO 92/16555호, 제WO 94/04193호, 제WO 94/14758호, 제WO 94/17039호, 제WO 94/18247호, 제WO 94/28024호, 제WO 95/00162호, 제WO 95/11924, W0 95/13090호, 제WO 95/33490호, 제WO 96/00080호, 제WO 97/18832호, 제WO 98/41562호, 제WO 98/48837호, 제WO 99/32134호, 제WO 99/32139호, 제WO 99/32140호, 제WO 96/40791호, 제WO 98/32466호 및 제WO 95/06058호; 유럽 특허 제439 508호; 국제특허공보 공개 제WO 97/03106호, 제WO 96/21469호 및 제WO 95/13312호; 유럽 특허 제921 131호; 국제특허공보 공개 제WO 98/05363호; 유럽 특허 제809 996호; 국제특허공보 공개 제WO 96/41813호 및 제WO 96/07670호; 및 유럽 특허 제605 963호, 제510 356호, 제400 472호, 제183 503호 및 제154 316호에 기재된 것들을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 PEG 분자는 단쇄 PEG, 분지쇄 PEG, 멀티아암쇄 PEG, 일작용성 PEG, 이작용성 PEG, 다작용성 PEG 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 형태로 사용될 수 있다.

혈청 알부민에 대한 친화성 증강

또한, 다양한 분자를 본 발명의 BPFI에 융합시켜 혈청 중의 BPFI의 반감기를 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자를 본 발명의 BPFI에 결합시키거나 또는 융합시켜 동물 내의 내인성 혈청 알부민에 대한 친화성을 증강시킨다.

예를 들면, 일부 경우, BPFI와 알부민 결합 서열의 재조합 융합체가 제조된다. 예시적인 알부민 결합 서열은 연쇄상구균성(streptococcal) 단백질 G로부터의 알부민 결합 도메인(예를 들면, 문헌[Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277: 534-542 (1996) and Sjolander et al., J. Immunol. Methods 201: 115-123 (1997)] 참조), 또는 알부민 결합 펩티드, 예를 들면 문헌[Dennis, et al., J. Biol. Chem. 277: 35035-35043 (2002)]에 기재된 펩티드들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 BPFI는 지방산으로 아실화된다. 일부 경우, 지방산은 혈청 알부민에 대한 결합을 촉진시킨다. 예를 들면, 문헌[Kurtzhals, et al., Biochem. J. 312; 725-731 (1995)]을 참조할 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 BPFI는 혈청 알부민(인간 혈청 알부민을 포함하나 이로 한정되지 않음)에 직접 융합된다. 당업자는 매우 다양한 다른 분자들도 본 발명에서 BPFI에 결합되어 혈청 알부민 또는 다른 혈청 성분에 대한 결합을 조절할 수 있다는 점을 인식할 것이다.

X. BPFI의 글리코실화

본 발명은 사카라이드 잔기를 보유하는 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI를 포함한다. 사카라이드 잔기는 천연 사카라이드 잔기(N-아세틸글루코사민을 포함하나 이로 한정되지 않음) 또는 비-천연 사카라이드 잔기(3-플루오로갈락토스를 포함하나 이로 한정되지 않음)일 수 있다. 사카라이드는 N-결합 또는 O-결합 글리코시드 결합(N-아세틸갈락토스-L-세린을 포함하나 이로 한정되지 않음) 또는 비-천연 결합(옥심 또는 상응하는 C-결합 또는 S-결합 글리코시드를 포함하나 이들로 한정되지 않음)에 의해 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 결합될 수 있다.

사카라이드(글리코실을 포함하나 이로 한정되지 않음) 부분은 생체내 또는 시험관내에서 BPFI에 부가될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 카르보닐 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI를 아미노옥시 기에 의해 유도체화된 사카라이드를 사용하여 변형시켜, 옥심 결합을 통해 결합된 상응하는 글리코실화된 폴리펩티드를 생성한다. 일단 사카라이드가 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 부착되면, 글리코실트랜스퍼라제, 및 BPFI에 결합된 올리고사카라이드를 생성할 있는 다른 효소를 사용하여 추가로 처리함으로써 사카라이드를 더 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003)]을 참조할 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 카르보닐 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI는 아미노옥시 유도체로서 제조된 정해진 구조를 갖는 글리칸에 의해 직접 변형된다. 당업자는 아지드, 알킨, 히드라지드, 히드라진 및 세미카르바지드를 비롯한 다른 작용기를 사용하여 사카라이드를 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 결합시킬 수 있다는 점을 인식할 것이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 아지드 또는 알키닐 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI는 각각 알키닐 또는 아지드 유도체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 작용기와의 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가 반응을 포함하나 이들로 한정되지 않는 반응에 의해 변형될 수 있다. 이 방법은 극히 높은 선택적 방식으로 단백질을 변형시킬 수 있다.

XI. BPFI 함유 이량체 및 다량체

또한, 본 발명은 BPFI 조합물 예컨대, 동종이량체, 이종이량체, 호모다량체 또는 이종다량체(즉, 삼량체, 사량체 등)를 제공하며, 이때 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 특정 BPFI는 또 다른 BPFI, 그의 유사체 또는 그의 변이체, 또는 비-BPFI 펩티드 또는 그의 변이체인 임의의 다른 폴리펩티드의 폴리펩티드의 골격에 직접 결합되거나 또는 링커를 통해 결합된다. BPFI 이량체 또는 다량체 접합체는 단량체에 비해 증가된 분자량으로 인해, 단량체 BPFI에 비해 새로운 또는 바람직한 성질(상이한 약리학적, 약동학적, 약력학적, 조절된 치료 반감기 또는 조절된 혈장 반감기를 포함하나, 이들로 한정되지 않음)을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 접합체 또는 융합체는 BPFI와 그의 수용체 또는 결합 파트너의 상호작용을 조절할 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 BPFI 접합체, 융합체, 이량체 또는 다량체는 수용체 길항제, 작용제, 수퍼 작용제 또는 조절제로서 작용할 것이다.

일부 실시양태에서, 이량체 또는 다량체를 함유하는 BPFI 중에 존재하는 하나 이상의 BPFI 분자는 수용체 결합 영역 또는 결합 파트너와의 결합을 위한 영역 내에 존재하는 수용성 중합체에 결합된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, BPFI는 Asn-Lys 아미드 결합 또는 Cys-Cys 디설피드 결합을 포함하나 이들로 한정되지 않는 결합을 통해 직접 결합된다. 일부 실시양태에서, 결합된 BPFI는 제1 BPFI의 하나의 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 알킨과 제2 BPFI의 제2 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 아지드가 휘스겐 [3 + 2] 시클로부가를 통해 접합되는 것을 포함하나 이로 한정되지 않는 접합, 융합, 이량체화 또는 다량체화를 용이하게 하도록 다양한 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함할 것이다. 별법으로, 케톤 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 제1 BPFI, 및/또는 결합된 BPFI는 히드록실아민 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 제2 BPFI에 접합될 수 있고, 상기 폴리펩티드는 상응하는 옥심의 형성을 통해 반응한다.

별법으로, 2개의 BPFI는 링커를 통해 결합된다. 임의의 이종이작용성 또는 동종이작용성 링커를 사용하여 동일하거나 또는 상이한 1차 서열을 가질 수 있는 2개의 BPFI를 결합시킬 수 있다. 일부 경우, BPFI를 서로 결합시키는 데 사용되는 링커는 이작용성 PEG 시약일 수 있다. 링커는 넓은 범위의 분자량 또는 분자 길이를 가질 수 있다. 분자량이 보다 큰 또는 작은 링커는 가능한 경우 BPFI와 결합된 물질 사이, BPFI와 그의 결합 파트너 사이, 또는 결합된 물질과 그의 결합 파트너 사이에서 원하는 공간적 관계 또는 입체구조를 제공하는 데 사용될 수 있다. 분자 길이가 보다 큰 또는 작은 링커는 가능한 경우 BPFI와 결합된 물질 사이, BPFI와 그의 결합 파트너 사이, 또는 결합된 물질과 그의 결합 파트너 사이에서 원하는 공간 또는 유연성을 제공하는 데 사용될 수 있다. 유사하게, 특정한 형태 또는 입체구조를 가진 링커는 BPFI가 그의 표적에 도달하기 전에 또는 후에 BPFI 또는 결합된 물질에 특정한 형태 또는 입체구조를 부여하는 데 사용될 수 있다. BPFI와 결합된 물질 및 결합 파트너 사이의 공간적 관계의 이 최적화는 상기 분자에 새로운, 조절된 또는 원하는 성질을 제공할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 하기와 같은 아령 구조를 갖는 수용성 이작용성 링커를 제공한다: a) 중합체 골격의 적어도 제1 말단 상의 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 히드록실아민 또는 카르보닐 함유 부분; 및 b) 중합체 골격의 제2 말단 상의 적어도 제2 작용기. 제2 작용기는 제1 작용기와 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 작용기는 제1 작용기와 반응하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 분지형 분자 구조로 된 하나 이상의 아암을 포함하는 수용성 화합물을 제공한다. 예를 들면, 분지형 분자 구조는 수지상일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 구조를 갖는 활성화된 수용성 중합체와의 반응에 의해 형성된 하나 이상의 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원, 예를 들면, BPFI를 포함하는 다량체를 제공한다:

R-(CH₂CH₂O)_n-0-(CH₂)_m-X

상기 식 중,

n은 약 5 내지 3,000이고, m은 2 내지 10이고, X는 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 아미노옥시 기, 히드록실아민, 아세틸 또는 카르보닐 함유 부분일 수 있고, R은 X와 동일하거나 상이할 수 있는 캡핑 기, 작용기 또는 이탈기이다. R은 예를 들면, 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, N-히드록시석신이미딜 에스테르, 1-벤조트리아졸릴 에스테르, N-히드록시석신이미딜 카르보네이트, 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄, 및 케톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용기일 수 있다.

XII. BPFI 수용체 또는 결합 파트너에 대한 BPFI의 BPFI 활성 및 친화성의 측정

BPFI 활성은 표준 시험관내 또는 생체내 분석을 이용하여 측정할 수 있다.

다수의 분석이 본 발명의 BPFI의 활성을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 항원 감소 분석, 바이러스 부착 저해 분석 및 부착 후 바이러스 감염 저해 분석을 포함하나 이들로 한정되지 않는 항바이러스 활성 분석이 문헌(Budge et al. J. of Virology 2004 May; 78(10):5015-5022)에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 합포체 형성을 저해하는 BPFI의 능력을 시험하는 시험관내 분석은 문헌(Pastey et al., Nature Medicine 2000; 6(1):35-40)에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 추가 분석에는 세포-대-세포 융합 분석 및 경쟁적 ELISA 분석이 포함되고, RSV를 위한 동물 모델은 문헌(Pastey et al., Nature Medicine 2000 Jan; 6(1):35-40)에 기재된 바와 같이 BPFI 활성을 측정하는 데 사용될 수도 있다. 추가 분석으로는 RSV로 감염된 세포에 대한 세포병증성 효과(CPE)의 유도를 측정하는 세포 기재 분석, RSV 레포터 바이러스를 사용하는 감염 분석, 및 RSV의 A 및 B 균주에 대한 펩티드의 효과를 시험하는 분석이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 별법으로, 바이러스 도입 또는 바이러스 융합을 측정하는 분석을 포함하나 이로 한정되지 않는, 항바이러스 활성을 측정하는 다른 분석을 포함하나 이로 한정되지 않는, 당업자에게 공지되어 있는 다수의 다른 분석이 본 발명의 BPFI의 활성을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 항바이러스제를 사용한 병용 요법을 시험하기 위한 이들 분석에 대한 변형도 당업자에게 공지되어 있다.

또한, 당업자에게 잘 공지되어 있는 표준 방법이 비레트로바이러스 활성을 분석하는 데 사용될 수 있다. 호흡기 세포융합 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 활성 분석 기법에 대한 논의를 위해서는 예를 들어, 문헌((Pringle, C. R. et al., 1985, J. Medical Virology 17:377-386)을 참조한다. 또한, 이러한 기법들의 일반적인 검토를 위해서는 예를 들어, 문헌("Zinsser Microbiology", 1988, Joklik, W. K. et al., eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 19th ed.)을 참조한다. 이 참고문헌들은 완전히 참고로 본 명세서에 도입된다. 본 발명의 BPFI를 사용하여 동물 연구를 수행할 수 있다. 이러한 연구는 독성 연구를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

BPFI 유사체를 생성시키기 위해 어떤 방법을 이용하는지 관계없이, 상기 유사체는 생물학적 활성에 대해 분석된다. 일반적으로, 생물학적 활성에 대한 시험은 원하는 결과에 대한 분석 예컨대, (비-변형된 BPFI와 비교할 때) 생물학적 활성에서의 증가 또는 감소, (비-변형된 BPFI와 비교할 때) 상이한 생물학적 활성, 수용체 또는 결합 파트너의 친화성 분석, (비-변형된 BPFI와 비교할 때) BPFI 자체 또는 결합 파트너의 입체구조적 또는 구조적 변화 또는 혈청 반감기 분석을 제공해야 한다.

분석 방법에 대한 참고문헌의 상기 목록이 전부는 아니며, 당업자는 원하는 최종 결과에 대한 시험에 유용한 다른 분석을 인식할 것이다.

XIII. 효능, 기능적인 생체내 반감기 및 약동학적 매개변수의 측정

본 발명의 중요한 측면은 폴리펩티드를 수용성 중합체 부분에 접합시키거나 또는 접합시키지 않고 BPFI를 제조함으로써 얻은 연장된 생물학적 반감기이다. BPFI의 혈청 농도의 신속한 감소 때문에, 접합된 BPFI, 접합되지 않은 BPFI 및 이들의 변이체를 사용한 처리에 대한 생물학적 반응을 평가하는 것은 중요하다. 바람직하게는, 본 발명의 접합된 BPFI, 접합되지 않은 BPFI 및 이들의 변이체는 정맥 내로의 투여 후 연장된 혈청 반감기를 가지기 때문에, 예를 들면, ELISA 방법 또는 1차 스크리닝 분석에 의해 측정될 수 있다. 생체내 생물학적 반감기의 측정은 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행된다.

비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI에 대한 약동학적 매개변수는 정상 스프라그-다울리(Sprague-Dawley) 수컷 래트(처리군 당 N = 5 마리 동물)에서 평가될 수 있다. 동물은 래트 1 마리 당 25 ㎍의 단일 투여량을 정맥 내로 투여받거나 또는 50 ㎍의 단일 투여량을 피하로 투여받을 것이고, 정해진 기간, 일반적으로, 수용성 중합체에 접합되지 않은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI의 경우 약 6시간 동안, 수용성 중합체에 접합된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI의 경우 약 4일 동안 대략 5 내지 7개의 혈액 샘플이 채취될 것이다.

RSV의 세포 내로의 도입 또는 바이러스 융합을 저해하는 BPFI의 능력은 시험관내(예를 들어, 합포체 분석, 감염성 분석)에서 평가되거나 생체내(예를 들어, 적절한 동물 모델 또는 인간)에서 평가될 수 있다.

본 발명에 따른 BPFI의 특정한 활성은 당업계에 공지된 다양한 분석법에 의해 측정될 수 있다. 본 발명에 따라 수득되고 정제된 BPFI 뮤테인 또는 이의 단편의 생물학적 활성은 본 명세서에 기재되거나 언급된 방법 또는 당업자에게 공지된 방법에 의해 시험될 수 있다.

XIV. 투여 및 약학 조성물

경우에 따라, 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질(BPFI, 합성효소, 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 단백질 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)은 적절한 약학적 담체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 것과 함께 치료적 용도로 사용된다. 예를 들면, 이러한 조성물은 치료적 유효량의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체 또는 부형제는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및/또는 이들의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이 제제는 투여 방식에 적합하도록 만들어진다. 일반적으로, 단백질을 투여하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 본 발명의 폴리펩티드의 투여에 적용될 수 있다.

경우에 따라, 1종 이상의 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 치료용 조성물은 당업계에 잘 공지된 방법에 따라 1종 이상의 적합한 시험관내 및/또는 생체내 동물 질환 모델에서 시험하여 효능 및 조직 기전을 확인하고 투여량을 평가한다. 특히, 투여량은 즉, 관련 분석에서, 본원에서 제공된 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 활성, 안정성 또는 다른 적절한 측정치를 천연 아미노산을 포함하는 상동체의 상응하는 측정치와 비교함으로써(하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하도록 변형된 BPFI를 천연 아미노산 BPFI와 비교하는 것을 포함하나 이로 한정되지 않음) 초기에 결정할 수 있다.

투여는 분자를 최종적으로 혈액 또는 조직 세포와 접촉시키는 데 통상적으로 이용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 본 발명의 비-천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 임의의 적합한 방식에 의해 투여된다. 본 발명의 내용 중에서 이러한 폴리펩티드를 환자에게 투여하기에 적합한 방법이 이용가능하고, 비록 특정 조성물을 투여하기 위해 하나 이상의 경로를 이용할 수 있지만, 종종, 특정 경로가 또 다른 경로보다 더욱 즉각적이고 보다 효과적인 작용 또는 반응을 제공할 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로는 투여될 구체적인 조성물 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는 데 이용되는 구체적인 방법에 의해서도 결정된다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물로 된 매우 다양한 적절한 제형이 존재한다.

폴리펩티드 조성물은 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하 또는 직장 경로를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 변형되거나 변형되지 않은 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 리포좀을 통해서도 투여될 수 있다. 이러한 투여 경로 및 적합한 제형은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.

또한, 비-천연 아미노산을 단독으로 또는 다른 적절한 성분과 함께 포함하는 BPFI를 흡입을 통해 투여될 에어로졸 제형(즉, 이들은 "분사"될 수 있음)로 만들 수 있다. 에어로졸 제형을 가압된 허용가능한 추진제, 예를 들면 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 내로 위치시킬 수 있다.

예를 들면, 관절내(관절 안), 정맥내, 근육내, 진피내, 복막내 및 피하 경로에 의한 비경구 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충제, 정균제, 및 대상 수용체의 혈액과 등장성을 나타내는 제형을 제공하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증량제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. BPFI 제형은 단회 투여 또는 다회 투여 밀봉 용기, 예를 들면 앰플 및 바이알로서 제공될 수 있다.

비경구 투여 및 정맥내 투여는 투여의 바람직한 방법이다. 특히, 현재 사용되는 제형과 함께, 천연 아미노산 상동체 치료제에 대해 이미 이용되고 있는 투여 경로(GLP-1, DP-178, PYY, EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFNs, 인터루킨, 항체 및/또는 임의의 다른 약학적으로 전달되는 폴리펩티드 또는 단백질에 대해 전형적으로 이용되는 투여 경로를 포함하나 이들로 한정되지 않음)는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 바람직한 투여 경로 및 제형을 제공한다.

본 발명의 내용 중에서, 환자에게 투여되는 투여량은 시간에 따라 유익한 치료 반응을 나타내기에 충분하거나, 병원체에 의한 감염 방지를 나타내기에 충분하거나, 용도에 따라 다른 적절한 활성을 나타내기에 충분한 양이지만, 이로 한정되지 않는다. 투여량은 특정 벡터 또는 제형의 효능, 및 사용되는 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기 및 치료될 환자의 상태 뿐만 아니라, 환자의 체중 또는 표면적에 의해 결정된다. 또한, 투여량은 특정 환자에서 특정 벡터, 제형 등의 투여에 동반되는 임의의 유해한 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정된다.

질환(암, 유전 질환, 당뇨병, AIDS 등을 포함하나 이로 한정되지 않음)의 치료 또는 예방을 위해 투여되는 벡터 또는 제형의 유효량을 결정함에 있어서, 의사는 순환 혈장 수치, 제형의 독성, 질환의 진행, 및/또는, 관련되는 경우, 항-비-천연 아미노산 폴리펩티드 항체의 생성을 평가한다.

전형적으로, 예를 들면, 70 킬로그램 환자에게 투여되는 투여량은 관련 조성물의 변화된 활성 또는 혈청 반감기에 대해 조정된, 현재 사용되는 치료용 단백질의 투여량과 등가의 범위 내에 있다. 본 발명의 벡터는 항체 투여, 백신 투여, 세포독성제, 천연 아미노산 폴리펩티드, 핵산, 뉴클레오티드 유사체, 생물학적 반응 변경제 등의 투여를 비롯한 임의의 공지된 통상적인 요법에 의해 치료 상태를 보충할 수 있다.

투여에 있어서, 본 발명의 제형은 관련 제형의 LD-50 또는 ED-50, 및/또는 다양한 농도에서의 비-천연 아미노산의 임의의 부작용의 관찰, 예컨대, 환자의 체중 및 환자의 전반적인 건강 상태에 의해 결정되는 속도로 투여된다. 투여는 단일 투여 또는 분할 투여를 통해 달성될 수 있다.

제형을 주입받은 환자가 고열, 오한 또는 근육통을 일으키는 경우, 적합한 투여량의 아스피린, 이부프로펜, 아세트아미노펜 또는 다른 통증/고열 조절 약물을 투여한다. 제형을 주입하기 30분 전, 아스피린, 아세트아미노펜, 또는 디펜히드라민을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약물을 주입에 대한 반응, 예를 들면 고열, 근육통 및 오한을 보이는 환자에게 미리 처방한다. 해열제 및 항히스타민제에 빠르게 반응하지 않는 보다 심한 오한 및 근육통에 대해서는 메페리딘(meperidine)을 사용한다. 반응의 심각도에 따라 세포 주입을 늦추거나 또는 중단한다.

본 발명의 인간 BPFI는 포유동물 피험체에게 직접 투여할 수 있다. 투여는 BPFI를 피험체 내로 통상적으로 도입하는 데 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 어떠한 경우에도, 가장 적합한 경로는 치료될 병태의 특성 및 심각도에 달려 있지만, 본 발명의 실시양태에 따른 BPFI 조성물은 경구, 직장, 국소, 흡입(에어로졸을 통한 흡입을 포함하나 이들로 한정되지 않음), 협측(설하를 포함하나 이로 한정되지 않음), 질, 비경구(피하, 근육내, 진피내, 관절내, 흉막내, 복막내, 뇌내, 동맥내 또는 정맥내를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 국소(즉, 피부 및 기도 표면을 비롯한 점막 표면 양쪽 모두) 및 경피 투여에 적합한 조성물을 포함한다. 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 화합물의 제형은 단회 투여량 또는 다회 투여량 밀봉 용기, 예를 들면 앰플 및 바이알로서 제공될 수 있다. 본 발명의 BPFI는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 단위 투여량의 주사가능한 형태(용액, 현탁액 또는 에멀션을 포함하나 이들로 한정되지 않음)의 혼합물로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 BPFI는 연속 관주(미니펌프, 예를 들면, 삼투압 펌프를 사용하는 관주를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 단일 볼러스(bolus) 또는 지연 방출 데포 제형에 의해 투여될 수 있다.

투여에 적합한 제형은 제형을 등장성 제형으로 만들 수 있는 항산화제, 완충제, 정균제 및 용질을 함유할 수 있는 수용액, 비수성 용액 및 등장성 멸균 용액 뿐만 아니라, 현탁제, 가용화제, 증량제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 멸균 현탁액 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 용액 및 현탁액은 종래 공지된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로는 투여될 특정 조성물 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해서도 결정된다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물(경우에 따라, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함함)로 이루어진 매우 다양한 적절한 제형이 존재한다(예를 들면, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1985)] 참조).

적절한 담체로는 포스페이트, 보레이트, 헤페스, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저 분자량의 폴리펩티드(약 10개 미만의 잔기를 가진 폴리펩티드); 단백질 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라진, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 다른 탄수화물(글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함함); 킬레이팅제 예컨대, EDTA; 2가 금속 이온 예컨대, 아연, 코발트, 또는 구리; 당 알콜 예컨대, 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온 예컨대, 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대, 트윈^TM, 플루로닉스(Pluronics)^TM 또는 PEG를 함유하는 완충제가 있다.

수용성 중합체 예컨대, PEG에 결합된 BPFI를 포함하는 본 발명의 BPFI는 서방형 시스템에 의해 또는 이의 일부로서 투여될 수 있다. 서방형 조성물은 필름 또는 마이크로캡슐(microcapsule)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 성형품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 서방형 매트릭스는 생체적합성 물질, 예를 들면 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)(문헌[Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981): Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)] 참조), 에틸렌 비닐 아세테이트(문헌[Langer et al., supra] 참조) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(유럽 특허 제133,988호), 폴리락티드(폴리락트산)(미국 특허 제3,773,919호; 유럽 특허 제58,481호), 폴리글리콜리드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜리드(락트산과 글리콜산의 공중합체) 폴리무수물(polyanhydride), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(문헌[U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)] 참조), 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 콘트로이틴 설페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 폴리사카라이드, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산, 예를 들면 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘을 포함한다. 또한, 서방형 조성물은 리포좀에 의해 포획되는 화합물을 포함한다. 이 화합물을 함유하는 리포좀은 그 자체로 공지된 방법에 의해 제조된다: 독일 특허 제3,218,121호; 문헌[Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwanget al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)]; 유럽 특허 제52,322호, 제36,676호, 제88,046호, 제143,949호 및 제142,641호; 일본 특허출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 유럽 특허 제102,324호. 인용된 모든 참고문헌 및 특허는 본 명세서에 참고로 도입된다.

리포좀으로 포획되는 BPFI는 예를 들면, 독일 특허 제3,218,121호; 문헌[Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82; 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 77: 4030-4034 (1980)]; 유럽 특허 제52,322호, 제36,676호, 제88,046호, 제143,949호 및 제142,641호; 일본 특허출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 유럽 특허 제102,324호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 리포좀의 조성 및 크기는 공지되어 있거나 당업자에 의해 용이하게 실험적으로 결정될 수 있다. 리포좀의 일부 예는 예를 들면, 문헌[Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 1327-1331 (1995); Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998); Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8: 1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591 (1-3): 109-118 (2002); Mamot C, et al., Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)]에 기재되어 있다. 인용된 모든 참고문헌 및 특허는 본 명세서에 참고로 도입된다.

본 발명의 내용 중에서, 환자에게 투여되는 투여량은 시간이 경과함에 따라 피험체에게 유리한 반응을 일으키기에 충분해야 한다. 일반적으로, 1회 투여 당 비경구로 투여되는 본 발명의 BPFI의 총 약학적 유효량은 치료하는 의사의 재량에 달려 있지만, 환자 체중 1 kg 당 약 0.01 ㎍/일 내지 약 100 ㎍/일, 또는 약 0.05 mg/일 내지 약 1 mg/일 범위이다. 또한, 투여 빈도 역시 치료하는 의사의 재량에 달려 있지만, 인간에게 사용할 수 있는 것으로 승인된 시판되는 BPFI 생성물의 투여 빈도보다 더 적거나 더 많을 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 PEG화된 BPFI는 전술한 투여 경로 중 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다.

XV. 본 발명의 BPFI의 치료적 용도

본 발명의 BPFI는 광범위한 장애를 치료하는 데 유용하다.

본 발명의 BPFI 생성물의 투여는 인간에서 다른 BPFI 제제에 의해 입증된 활성들 중 임의의 활성을 나타낸다. BPFI 생성물을 함유하는 약학 조성물은 병태 또는 질환, 예컨대, BPFI 작용제 또는 길항제 단독 또는 일부에 의해 영향을 받을 수 있는 장애, 병태 또는 질환을 앓는 인간 환자에게 다양한 수단에 의해 투여될 때 강한 효능을 보이도록 제형화될 수 있다. BPFI 생성물의 평균 양은 변할 수 있고, 특히 일정한 자격을 갖춘 의사의 권장 및 처방을 기초로 해야 한다. BPFI의 정확한 양은 치료될 증상의 정확한 유형, 치료될 환자의 상태, 및 조성물 중의 다른 성분들과 같은 인자들에 달려 있다. 또한, 본 발명은 치료 유효량의 또 다른 활성제의 투여를 제공한다. 당업자는 BPFI를 사용한 요법을 기초로 하여 소정의 양을 용이하게 결정할 수 있다.

BPFI의 치료적 용도로는 RSV 감염의 치료, RSV 도입의 저해, 및 HIV를 포함하나 이로 한정되지 않는 다른 외피 바이러스의 도입의 저해가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 BPFI는 바람직하게는 항바이러스 활성을 나타낸다. BPFI는 RSV에 대한 예방을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 상기 펩티드는 비감염 세포로의 인간 및 비-인간 바이러스 및 레트로바이러스, 특히 HIV 전염의 저해제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드에 의해 전염이 저해될 수 있는 인간 레트로바이러스로는 HIV-1 및 HIV-2의 모든 종 및 인간 T-림프구 바이러스(HTLV-I 및 II)가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 펩티드에 의해 전염이 저해될 수 있는 비-인간 레트로바이러스로는 소 백혈증 바이러스, 고양이 육종 및 백혈병 바이러스, 원숭이 면역결핍, 육종 및 백혈병 바이러스, 및 진행성 양 폐렴 바이러스가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 펩티드에 의해 전염이 저해될 수 있는 비레트로바이러스성 바이러스로는 인간 호흡기 세포융합 바이러스가 있으나 이로 한정되지 않는다. 본 발명은 항바이러스제를 포함하나 이로 한정되지 않는 하나 이상의 다른 치료제와 함께 병용 요법에서 상기 펩티드를 사용하여 상기 비레트로바이러스성 바이러스를 치료하는 것을 추가로 포함한다.

펩티드의 또 다른 예는 HIV-1_LAI 경막 단백질(TM) gp41의 아미노산 638 내지 673, 즉 gp41의 세포외 부분의 카르복실-말단 나선형 절편에 상응하는 펩티드인 T-20(DP-178)이다. gp41의 세포외 부분은 아미노 말단 제안 지퍼 도메인인 또 다른 α-나선형 영역, 즉 DP-107을 가진다. DP-107은 바이러스 융합을 저해함으로써 강력한 항바이러스 활성을 나타낸다. 이것은 HIV-1_LAI 경막 gp41 단백질의 잔기 558 내지 595에 상응하는 38개 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. DP-107을 사용한 연구는 시험관내 연구 및 동물 둘다에서 무독성임을 입증하였다. 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,656,480호에는 DP-107 및 이의 항바이러스 활성이 기재되어 있다.

T-20은 바이러스 융합 저해제로서 작용함으로써 HIV가 세포 내로 도입되는 것을 저해한다. HIV의 융합 과정의 특징은 잘 규명되어 있다. HIV는 gp120을 통해 CD4 수용체에 결합하고, 그의 수용체와의 결합 시, gp120은 그 자신이 그의 보조수용체인 CCR5 또는 CXCR4에 결합하게 하는 일련의 입체구조적 변화를 받는다. 수용체 및 보조수용체 둘다에 결합된 후, gp120은 gp41을 노출시켜 융합 과정을 개시한다. gp41은 헵타드 반복부 1 및 2(HR1 및 HR2)로 명명된 2개의 영역을 가진다. HR1로서 확인된 세포외 도메인은 제안된 지퍼 도메인의 아미노 말단인 α-나선형 영역이다. HR1은 gp41의 HR2와 함께 헤어핀을 형성한다. 형성된 구조는 HIV 외피를 2개의 막 사이의 융합을 초래하는 세포막 근처에 배치시키는 6-나선 다발이다. T-20은 gp41 경막 당단백질의 제1 헵타드 반복부(HR1)에 결합함으로써 바이러스 융합에 필요한 입체구조적 변화를 방해한다. 따라서, 6-나선 다발의 형성은 gp41의 HR1 영역에 결합하는 T-20에 의해 차단된다. HIV gp41 단백질의 DP107 도메인과 DP178 도메인(즉, HR1 도메인과 HR2 도메인)은 서로 비공유적으로 결합하고, 이들의 상호작용은 바이러스의 정상적인 감염에 필요하다. DP107과 DP178 사이, 및/또는 DP107-유사 펩티드와 DP178-유사 펩티드 사이의 상호작용을 파괴하는 화합물은 항바이러스 활성을 비롯한 항-융합유발성을 나타낸다.

DP-178은 HIV-1 매개 CD-4⁺ 세포-세포 융합(즉, 합포체 형성) 및 세포-부재 바이러스에 의한 CD-4⁺ 세포의 감염의 잠재적 저해제로서 작용한다. 이러한 항-레트로바이러스 활성에는 HIV가 비감염 CD-4⁺ 세포를 전염시키는 것을 저해하는 것이 포함되나 이로 한정되지 않는다. DP-178은 저농도에서 작용하며, 시험관내 및 동물내에서 무독성을 나타내는 것으로 입증되어 있다. HIV-1 및 HIV-2의 DP-178--상응 영역 내의 아미노산 보존은 보고되어 있다.

DP-178 펩티드의 잠재적 용도는 HIV 전염과 관련된 융합 과정의 저해에서의 용도에 대한 미국 특허 제6,750,008호 및 제6,824,783호뿐만 아니라 미국 특허 제5,464,933호 및 제6,133,418호(이들 모두는 본 명세서에 참고로 도입됨)에도 기재되어 있다.

항바이러스 활성을 보이고/보이거나, 항-막 융합 능력을 보이거나, HIV-1을 제외한 레트로바이러스 및 비레트로바이러스성 바이러스에서 코일 형태로 감겨진-코일 펩티드 구조를 수반하는 세포내 과정을 조절하는 능력을 보이는, DP178/DP107, DP178-유사/DP107-유사 또는 HR1/HR2 상호작용의 조절제뿐만 아니라 DP-178 및 DP-107의 일부, 상동체 및 유사체도 연구되었다. 이러한 연구에서 바이러스는 원숭이 면역결핍 바이러스(미국 특허 제6,017,536호), 호흡기 세포융합 바이러스(미국 특허 제6,228,983호; 제6,440,656호; 제6,479,055호; 제6,623,741호), 엡스테인-바 바이러스(미국 특허 제6,093,794호; 제6,518,013호), 파라인플루엔자 바이러스(미국 특허 제6,333,395호). 인플루엔자 바이러스(미국 특허 제6,068,973호; 제6,060,065호) 및 홍역 바이러스(미국 특허 제6,013,263호)를 포함한다. 상기 특허들 전부는 본 명세서에 참고로 도입된다.

DP-178의 시판 형태는 푸제온^®(엔푸비르티드, Roche Laboratories Inc. and Trimeris, Inc.)이다. 푸제온^®은 아세틸화된 N-말단 및 C-말단으로서의 카르복스아미드를 가지며, 하기 일차 아미노산 서열로 기재된다: CH₃CO-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂. 푸제온^®은 계속되는 항-레트로바이러스 요법에도 불구하고 HIV-1 복제를 보이는 HIV-1 환자에서 다른 항바이러스제와 함께 사용된다.

본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,464,933호 및 제6,824,783호에는 아미노 및/또는 카르복시 말단에 존재하는 소수성 기와 같은 화학적 기를 가진 DP-178 분자뿐만 아니라 아미노 및 카르복시 말단 절단, 치환, 삽입, 결실, 부가 또는 거대분자 담체 기를 가진 분자를 포함하나 이들로 한정되지 않는 DP-178, DP-178 단편, 유사체 및 상동체가 기재되어 있다. 추가 변이체에는 미국 특허 제6,830,893호에 기재된 것들, 및 미국 특허 제6,861,059호에 개시된 DP-178의 유도체가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. T-20 하이브리드 폴리펩티드 세트는 미국 특허 제6,656,906호, 제6,562,787호, 제6,348,568호 및 제6,258,782호에 기재되어 있고, DP-178-독소 융합체는 미국 특허 제6,627,197호에 기재되어 있다.

HAART(고 활성 항-레트로바이러스 요법)는 바이러스 적재를 감소시키는 소수의 항-레트로바이러스제 부류로부터 선택된 약물을 병용하는 HIV에 대한 표준 요법이다. 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,861,059호는 하나 이상의 다른 항바이러스 치료제 예컨대, 역전사 저해제(예를 들어, AZT, ddI, ddC, ddA, d4T, 3TC, 또는 다른 디데옥시뉴클레오티드 또는 디데옥시플루오로뉴클레오시드) 또는 HIV 단백질분해효소 저해제(예를 들어, 인디나비르; 리토나비르)와 함께 DP-178 또는 DP-107 또는 이들의 유도체를 사용하여 HIV-1 감염을 치료하거나 HIV-1 복제를 저해하는 방법을 개시한다. 다른 항바이러스제에는 사이토카인(예를 들어, rIFNα, rIFNβ, rIFNγ), 바이러스 mRNA 캡핑의 저해제(예를 들어, 리바비린), HIV 단백질분해효소 저해제(예를 들어, ABT-538 및 MK-639), 항-HIV 활성을 가진 지질-결합 분자로서의 앰포테리신 B, 및 당단백질 프로세싱의 저해제로서의 캐스타노스퍼민이 포함된다. 역전사 저해제, 인테그라제 저해제, 단백질분해효소 저해제, 사이토카인 길항제 및 케모카인 수용체 조절제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 항바이러스제와 T-20의 잠재적 병용 요법은 미국 특허 제6,855,724호; 제6,844,340호; 제6,841,558호; 제6,833,457호; 제6,825,210호; 제6,811,780호; 제6,809,109호; 제6,806,265호; 제6,768,007호; 제6,750,230호; 제6,706,706호; 제6,696,494호; 제6,673,821호; 제6,673,791호; 제6,667,314호; 제6,642,237호; 제6,599,911호; 제6,596,729호; 제6,593,346호; 제6,589,962호; 제6,586,430호; 제6,541,515호; 제6,538,002호; 제6,531,484호; 제6,511,994호; 제6,506,777호; 제6,500,844호; 제6,498,161호; 제6,472,410호; 제6,432,981호; 제6,410,726호; 제6,399,619호; 제6,395,743호; 제6,358,979호; 제6,265,434호; 제6,248,755호; 제6,245,806호; 및 제6,172,110호를 비롯한 다수의 참고문헌에 기재되어 있다.

DP-178에 대한 잠재적 전달 시스템에는 미국 특허 제6,844,324호 및 제6,706,892호에 기재된 것들이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 봉입체 형태로 T-20을 제조하는 방법은 미국 특허 제6,858,410호에 기재되어 있다.

T20/DP178, T21/DP107 및 이들의 단편 또한 N-포르밀 펩티드 수용체(FPR 구성원)와 상호작용하는 것으로 발견되었다. T-20은 인간 포식세포(phagocyte)에 존재하는 N-포르밀 펩티드 수용체를 활성화시키고(Su et al. (1999) Blood 93(11):3885-3892) 단핵구 및 호중구의 화학유인제 및 활성화제이다(미국 특허 제6,830,893호 참조). FPR 부류 수용체는 화학유인제 fMLP(N-포르밀-메티오닐-류실-페닐알라닌)에 결합하는 G-단백질-커플링된 STM 수용체이고, 단핵구 화학주성 및 병원체에 대한 숙주 면역 반응의 유도에 관여한다. 원형 FPR 부류 수용체인 FPR은 높은 친화도로 fMLP에 결합하고 저농도의 fMLP에 의해 활성화된다. fMLP에 의한 FPR의 결합은 MAP 키나제 활성화 및 유전자 전사뿐만 아니라 포식세포 접착, 화학주성, 산소 중간체의 방출, 증강된 포식작용 및 박테리아 사멸도 야기하는 일련의 G 단백질-매개 신호전달 과정을 유도한다(Krump et al., J. Biol. Chem. 272:937 (1997); Prossnitz et al., Pharmacol Ther 74:73 (1997); Murphy, Annu. Rev. Immuno. 12: 593 (1994); and Murphy, The N-formyl peptide chemotactic receptors, Chemoattractant ligands and their receptors. CRC Press, Boca Raton, p. 269 (1996)). 또 다른 FPR 부류 수용체는 FPRL1(FPRH2 및 LXA4R로도 지칭됨)로 지칭되는, FPR의 고도로 상동한 변이체이다. FPRL1은 원래 오판(orphan) 수용체로서 클로닝되었지만(Murphy et al., J. Biol. Chem., 267:7637-7643 (1992); Ye et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 184:582-589 (1992); Bao et al., Genomics, 13:437-440 (1992); Gao, J. L. and P. M. Murphy, J. Biol. Chem., 268:25395-25401 (1993); and Nomura et al., Int. Immunol., 5:1239-1249 (1993)), 고농도의 fMLP에 반응하여 Ca²⁺ 이동을 매개한다는 것이 나중에 발견되었다(Ye et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 184:582-589 (1992); and Gao, J. L. and P. M. Murphy, J. Biol. Chem., 268:25395-25401 (1993)).

하기 실시예는 청구된 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 것이지 청구된 본 발명을 제한하기 위해 제공되는 것이 아니다.

실시예 1

본 실시예는 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 BPFI 내로 도입되기에 바람직한 선택에 대한 많은 가능한 기준 세트 중 소수의 세트를 상술한다. 최적의 HR-C 유래 펩티드 후보물질을 디자인하였다. 펩티드 발현, 안정성, 나선형 성향 및 항바이러스 활성과 같은 기준을 평가하여 최적 RSV 펩티드 융합 저해제를 확인하였다. 아미노산 서열의 컴퓨터 기초 분석 시 나선 형성에 대한 최적 펩티드를 발현 벡터 내로 클로닝하였다. RSV F 단백질의 HR-C 영역(위치 474부터 523까지) 내에서 변화가능한 길이의 펩티드를 생합성적으로 생성하였다. 펩티드들의 일부는 나선 말단 캡핑, 트립토판 케이지(cage) 및 염 가교 형성을 비롯한 공지된 나선화 기법을 이용하여 상승된 나선형 성향을 가지도록 조작하였다. 특정한 제한 부위를 보유하는 각각의 단일 펩티드의 DNA 코딩 영역은 발현 벡터 내로의 신속한 클로닝을 위해 상업적으로 합성하였다.

생합성적으로 제조된 펩티드는 생물학적 활성에 대해 분석하였다. 펩티드를 CD(원평광 이색성 분광 분석)로 분석하여 어떤 펩티드가 가장 높은 나선형 성향을 나타내는지를 결정하였다.

부위-지정 배치와 구조적 기작을 병용하여, 폴리에틸렌 글리콜 측쇄의 공유부착 후 RSV 저해 효능을 보유하는 HR-C 유사체 펩티드를 개발하였다. RhoA로부터 유래된 HR-C 유사체와 음이온성 펩티드 사이의 이작용성 이종이량체성 펩티드가 개발되었다. HR-C 구조적 데이타(Zhao et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2000 Dec 19; 97(26):14172-7)를 사용하여, 펩티드 또는 펩티드들 내의 PEG 부착 위치는 용 매 노출 및 노출된 나선 면에 기초하여 선별하였다. 돌연변이체도 펩티드(들) 내의 각 위치에서 pAcF를 도입하는 잠재력을 제공하는 선별된 펩티드 코딩 서열의 각 위치에서의 앰버 코돈 치환을 이용하여 구축하였다(50개 이하의 다양한 돌연변이체가 발생됨). 억제 효율은 SDS-PAGE에 의해 앰버 코돈 치환 돌연변이체에 대해 평가되었다. 각각의 위치가 억제 효율에 대해 평가되었다. pAcF(파라-아세틸 페닐알라닌) 치환 펩티드를 생합성적으로 제조하고 30 kDa PEG를 사용하여 pAcF 상에서 PEG화ㅅ시켰다. RSV 펩티드 유사체의 항바이러스 활성은 세포 기재 분석에서 시험하였다. 항바이러스 활성 및 합포체 형성의 저해를 더 평가하기 위해, 원발성 인간 호흡기 상피 세포를 사용한 세포-세포 융합 분석을 포함하나 이로 한정되지 않는 분석을 이용하였다. RSV F 단백질과 후보 펩티드의 결합을 수행하였다. pAcF 치환 및 PEG화 펩티드에 대한 원평광 이색성 분광 분석(CD) 및 시차주사열계량법(DSC)을 수행하여 상기 펩티드의 나선형 성향 및 안정성을 측정하였다.

다량체화되거나 HR-C 유사체 펩티드에 결합될 수 있는 GTPase RhoA 서열로부터 유래된 HR-C 유래 펩티드 및 작은 음이온성 펩티드(15머 내지 19머를 포함하나 이들로 한정되지 않음)로 구성된 이종이량체 또는 다량체 펩티드 분자를 디자인하였다. 가장 우수한 HR-C 후보물질과 GTPase RhoA 유래 펩티드를 사용하여 이중특이적 펩티드를 생성하였다. 변할 수 있는 길이의 생합성적으로 제조된 5개의 음이온성 RhoA 펩티드를 항바이러스 분석에서 시험하였다. 하나 이상의 RhoA 유래 펩티드는 비천연 아미노산 pAcF를 결합시키는 링커를 통해 하나 이상의 HR-C 유사체 펩티드에 결합시켰다. 가장 우수한 생물학적 활성 분자를 수득하기 위해 2개의 펩티드 사이의 결합을 변화시켰다. 이 결합(링커의 길이는 달라질 수 있음)은 특정 세포 수용체에의 RSV의 부착을 차단하고 세포막에의 바이러스 융합을 저해하는 능력을 포함하나 이로 한정되지 않는 항바이러스 활성에 대해 시험되는 이중특이적 펩티드를 형성시켰다. 이러한 종류의 이중특이적 펩티드 구성체는 2개의 별도의 저해 기작이 이용되기 때문에 증가된 항바이러스 효능을 제공할 수 있다. 이중특이적 펩티드를 제조하여 항바이러스 및 세포 융합 분석에서 시험하였다. 도 13은 RSV에 대한 BPFI의 잠재적 작용 기작의 개략도이다.

실시예 2

본 실시예는 이. 콜라이에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI의 발현을 상술한다.

오르토고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(0-RS)를 포함하는 도입된 번역 시스템을 사용하여 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 BPFI를 발현시켰다. O-RS는 우선적으로 O-tRNA를 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 아미노아실화시켰다. 이어서, 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 반응하여 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 BPFI 내에 삽입시켰다.

[표 2]

O-RS 및 0-tRNA 서열
서열번호 2	메타노코커스 잔나스키이 mtRNATyr CUA	tRNA
서열번호 3	HLAD03; 최적화된 앰버 억제자 tRNA	tRNA
서열번호 4	HL325A; 최적화된 AGGA 프레임쉬프트 억제자 tRNA	tRNA
서열번호 5	p-아지도-L-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(6)	RS
서열번호 6	p-벤조일-L-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-BpaRS(1)	RS
서열번호 7	프로파길-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파길-PheRS	RS
서열번호 8	프로파길-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파길-PheRS	RS
서열번호 9	프로파길-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파길-PheRS	RS
서열번호 10	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(1)	RS
서열번호 11	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(3)	RS
서열번호 12	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(4)	RS
서열번호 13	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(2)	RS
서열번호 14	p-아세틸-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소(LW1)	RS
서열번호 15	p-아세틸-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소(LW5)	RS
서열번호 16	p-아세틸-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소(LW6)	RS
서열번호 17	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소(AzPheRS-5)	RS
서열번호 18	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소(AzPheRS-6)	RS

변형된 BPFI 유전자 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소/tRNA 쌍(원하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 특이적임)을 함유하는 플라스미드를 사용한 이. 콜라이의 형질전환은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 BPFI 내로 부위 특이적으로 도입할 수 있었다. 0.01 내지 100 mM의 특정한 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 37℃, 배지 중에서 생장한 형질전환된 이. 콜라이는 높은 신뢰도 및 효율로 변형된 BPFI를 발현시켰다.

실시예 3

본 실시예는 카르보닐 함유 아미노산의 도입 및 아미노옥시-보유 PEG와의 후속 반응을 상술한다.

본 실시예는 대략 5,000 MW의 아미노옥시-보유 PEG와 추후 반응하는 케톤-보유 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 도입된 BPFI를 생성하는 방법을 보여준다. 예를 들어, BPFI 내의 각각의 잔기는 하기 구조를 가진 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 개별적으로 치환된다:

p-아세틸-페닐알라닌을 BPFI 내로 부위 특이적으로 도입하는 데 사용되는 서열은 서열 번호 2(muttRNA, 메타노코커스 잔나스키이 mtRNA^tyr _CUA) 및 상기 실시예 2에 기재된 서열 번호 14, 15 또는 16(TyrRSLW1, 5 또는 6)이다.

일단 변형되면, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 BPFI 변이체를 하기 형태의 아미노옥시-보유 PEG 유도체와 반응시켰다:

R-PEG(N)-0-(CH₂)_n-0-NH₂

상기 식 중, R은 메틸이고, n은 3이고, N은 대략 5,000 MW이다. p-아세틸페닐알라닌을 함유하는 정제된 BPFI를 25 mM MES(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루 이스 소재)(pH 6.0), 25 mM 헤페스(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 7.0) 및 10 mM 아세트산나트륨(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 4.5) 중에 10 mg/mL 농도로 용해시키고, 10 내지 100 배 과량의 아미노옥시 함유 PEG와 반응시킨 다음, 10 내지 16시간 동안 실온에서 교반하였다(문헌[Jencks, W. J Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475] 참조). 그 다음, 즉시 정제 및 분석을 위해 PEG-BPFI를 적절한 완충제로 희석시켰다.

실시예 4

아미드 결합을 통해 PEG에 결합된 히드록실아민 기로 이루어진 PEG를 사용한 접합

실시예 3에 기재된 절차를 사용하여 하기 구조를 갖는 PEG 시약을 케톤 함유 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 커플링시켰다:

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-0-NH₂

상기 식 중, R = 메틸이고, n = 4이고, N은 대략 20,000 MW이다. 반응, 정제 및 분석 조건은 실시예 3에 기재한 바와 같다.

실시예 5

본 실시예는 2개의 상이한 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 BPFI 내로 도입하는 것을 상술한다.

본 실시예는 실시예 1에 따라 확인된 잔기들 중 2개의 위치에서 케톤 작용기를 포함하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 도입된 BPFI의 생성 방법을 예시하 며, 이때 X^*는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 나타낸다. BPFI는 셀렉터 코돈을 핵산 내의 2개의 상이한 부위에 도입하는 것을 제외하고 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 제조하였다.

실시예 6

본 실시예는 BPFI와 히드라지드-보유 PEG의 접합 및 동일 반응계에서의 후속 환원을 상술한다.

카르보닐 함유 아미노산이 도입된 BPFI를 실시예 2 및 3에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 일단 변형되면, 하기 구조를 가진 히드라지드-보유 PEG를 BPFI에 접합시켰다:

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-X-NH-NH₂

상기 식 중, R = 메틸이고, n = 2이고, N = 10,000 MW이고, X는 카르보닐 (C=O) 기이다. p-아세틸페닐알라닌을 함유하는 정제된 BPFI를 25 mM MES(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 6.0), 25 mM 헤페스(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 7.0) 및 10 mM 아세트산나트륨(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)(pH 4.5) 중에 0.1 내지 10 mg/mL 농도로 용해시키고, 1 내지 100 배 과량의 히드라지드 함유 PEG와 반응시키고, 최종 농도가 10 내지 50 mM이 되도록, H₂O 중에 용해된 1 M NaCNBH₃ 원액(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)을 첨가함으로써 상응하는 히드라존을 동일 반응계에서 환원시켰다. 반응을 암실에서 4℃ 내지 RT에서 18 내지 24시간 동안 수행하였다. 약 pH 7.6에서 최종 트리스 농도가 50 mM이 되도록, 1 M 트리스(시그마 케미칼, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 반응액에 첨가하여 반응을 정지시키거나 즉시 정제하기 위해 적합한 완충제로 희석시켰다.

실시예 7

본 실시예는 알킨 함유 아미노산을 BPFI 내로 도입하는 과정 및 EG-아지드를 사용한 유도체화를 상술한다.

BPFI의 잔기들 중 임의의 잔기는 하기 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다:

p-프로파길-티로신을 BPFI 내로 부위 특이적으로 도입하는 데 이용된 서열은 서열 번호 2(muttRNA, 메타노코커스 잔나스키이 mtRNA^Tyr _CUA), 및 상기 실시예 2에 기재된 서열번호 7, 8 또는 9이다. 프로파길 티로신을 함유하는 BPFI를 이. 콜라이에서 발현하고 실시예 3에 기재된 조건을 이용하여 정제하였다.

프로파길-티로신을 함유하는 정제된 BPFI를 0.1 내지 10 mg/㎖의 농도로 PB 완충제(100 mM 소듐 포스페이트, 0.15 M NaCl, pH = 8)에 용해시키고 10 내지 1000 배 과량의 아지드 함유 PEG를 반응 혼합물에 첨가하였다. 그 다음, 촉매량의 CuSO₄ 및 Cu 와이어를 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 항온처리한 후(약 4시간 동안 실온 또는 37℃에서, 또는 밤새 4℃에서의 항온처리를 포함하나 이로 한정되지 않음), H₂O를 첨가하고, 혼합물을 투석 막을 통해 여과하였다. 실시예 3에 기재된 절차와 유사한 절차를 포함하나 이로 한정되지 않는 절차로 샘플을 부가에 대해 분석할 수 있었다.

본 실시예에서, PEG는 하기 구조를 갖는다:

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-N₃

상기 식 중, R은 메틸이고, n은 4이고, N은 10,000 MW이다.

실시예 8

본 실시예는 BPFI 내의 큰 소수성 아미노산을 프로파길 티로신으로 치환하는 것을 상술한다.

BPFI 내에 존재하는 Phe, Trp 또는 Tyr 잔기를 실시예 7에 기재된 바와 같이 하기 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시켰다:

일단 변형되면, PEG를 알킨 함유 아미노산을 포함하는 BPFI 변이체에 부착시켰다. PEG는 Me-PEG(N)-O-(CH₂)₂-N₃ 구조를 가지며, 커플링 절차는 실시예 7에서의 절차를 따른다. 이는 천연 발생 큰 소수성 아미노산 중 하나와 대략 등입체성을 가지며, 폴리펩티드 내의 분리된 부위에서 PEG 유도체로 변형되는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI 변이체를 생성시켰다.

실시예 9

본 실시예는 하나 이상의 PEG 링커에 의해 분리된 BPFI 동종이량체, 이종이량체, 호모다량체 또는 이종다량체의 제조를 상술한다.

실시예 7에서 생성된 알킨-보유 BPFI 변이체를 N₃-(CH₂)_n-C(O)-NH-(CH₂)₂-O-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)-(CH₂)_n-N₃(이때, n은 4이고, PEG는 대략 5,000의 평균 MW를 가짐) 형태의 이작용성 PEG 유도체와 반응시켜 2개의 BPFI 분자가 PEG에 의해 물리적으로 분리된 상응하는 BPFI 동종이량체를 제조하였다. 유사한 방식으로, BPFI를 하나 이상의 다른 폴리펩티드에 커플링시켜 이종이량체, 호모다량체 또는 이종다량체를 형성시킬 수 있다. 커플링, 정제 및 분석은 실시예 7 및 실시예 3에서와 같이 수행되었다.

실시예 10

본 실시예는 사카라이드 부분을 BPFI에 커플링시키는 것을 상술한다.

BPFI의 한 잔기를 실시예 3에 기재된 바와 같이 하기 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시켰다:

일단 변형되면, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 BPFI 변이체를 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 β-결합 아미노옥시 유사체와 반응시켰다. BPFI 변이체(10 mg/mL)와 아미노옥시 사카라이드(21 mM)를 100 mM 수성 아세트산나트륨 완충제(pH 5.5) 중에서 혼합하고, 37℃에서 7 내지 26시간 동안 항온처리하였다. 150 mM 헤페스 완충제(pH 7.4) 중에서 사카라이드-접합된 BPFI(5 mg/mL)를 UDP-갈락토스(16 mM) 및 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제(0.4 유니트/mL)와 48시간 동안 주위 온도에서 항온처리함으로써 제2 사카라이드를 효소로 먼저 커플링하였다(문헌[Schanbacher et al. J. Biol. Chem. 1970,245, 5057-5061] 참조).

실시예 11

본 실시예는 PEG화된 BPFI 길항제의 생성을 상술한다.

BPFI의 한 잔기를 실시예 3에 기재된 바와 같이 하기 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시켰다:

일단 변형되면, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 BPFI를 R-PEG(N)-O-(CH₂)_n-O-NH₂(이때, R은 메틸이고, n은 4이고, N은 20,000 MW임) 형태의 아미노옥시 함유 PEG 유도체와 반응시켜 폴리펩티드 내의 단일 부위에서 PEG 유도체로 변형된 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 BPFI 길항제를 생성시켰다. 커플링, 정제 및 분석은 실시예 3에서와 같이 수행하였다

실시예 12

BPFI 분자가 직접 결합된 BPFI 동종이량체, 이종이량체, 호모다량체 또는 이종다량체의 생성

알킨 함유 아미노산을 포함하는 BPFI 변이체를, 아지도 함유 아미노산을 포함하는 또 다른 BPFI 변이체에 직접 커플링시킬 수 있고, 이때 이들 각각은 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 유사한 방식으로, BPFI를 하나 이상의 다른 폴리펩티드에 커플링시켜 이종이량체, 호모다량체 또는 이종다량체를 형성시킬 수 있었다. 커플링, 정제, 및 분석은 실시예 3, 6 및 7에서와 같이 수행하였다.

실시예 13

PEG-OH + Br-(CH₂)_n-C≡CR' → PEG-O-(CH₂)_n-C≡CR'

A B

폴리알킬렌 글리콜(P-OH)은 알킬 할라이드(A)와 반응시켜 에테르(B)를 형성한다. 이러한 화합물에서, n은 1 내지 9의 정수이고, R'는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화 C₁ 내지 C₂₀ 알킬 또는 헤테로알킬 기일 수 있다. 또한, R'는 C₃ 내지 C₇ 포화 또는 불포화 시클릭 알킬 또는 시클릭 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴 또는 헤테로아릴 기, 또는 치환 또는 비치환 알크아릴(알킬은 C₁ 내지 C₂₀ 포화 또는 불포화 알킬임) 또는 헤테로알크아릴 기일 수 있다. 전형적으로, PEG-OH는 분자량이 800 내지 40,000 달톤(Da)인 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이다.

실시예 14

mPEG-OH + Br-CH₂-C≡CH → mPEG-O-CH₂-C≡CH

20,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-OH(mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, 썬바이오(Sunbio))를 THF(35 ㎖) 중에서 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하였다. 그 다음, 크실렌 중에 프로파길 브로마이드를 용해시켜 수득한 80 중량% 용액(0.56 ㎖, 5 mmol, 50 당량, 알드리치)에 촉매량의 KI의 용액을 첨가하고, 생성된 혼합물을 2시간 동안 가열하여 환류시켰다. 그 다음, 물(1 ㎖)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물에 CH₂Cl₂(25 ㎖)를 첨가하고, 유기층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 ㎖로 감소시켰다. 이 CH₂Cl 용액을 디에틸 에테르(150 ㎖)에 적가하였다. 생성된 침전물을 모으고, 냉각된 디에틸 에테르로 수회 나누어 세척하고, 건조시켜 프로파길-O-PEG를 얻었다.

실시예 15

mPEG-OH + Br-(CH₂)₃-C≡CH → mPEG-O-(CH₂)₃-C≡CH

20,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-OH(mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, 썬바이오)를 THF(35 ㎖) 중에서 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하였다. 그 다음, 50 당량의 5-브로모-1-펜틴(0.53 ㎖, 5 mmol, 알드리치) 및 촉매량의 KI를 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 16시간 동안 가열하여 환류시켰다. 그 다음, 물(1 ㎖)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물에 CH₂Cl₂(25 ㎖)를 첨가하고, 유기층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 ㎖로 감소시켰다. 이 CH₂Cl₂ 용액을 디에틸 에테르(150 ㎖)에 적가하였다. 생성된 침전물을 모으고, 냉각된 디에틸 에테르로 수회 나누어 세척하고, 건조시켜 상응하는 알킨을 얻었다. 5-클로로-1-펜틴을 유사한 반응에 사용할 수 있다.

실시예 16

THF(50 ㎖) 및 물(2.5 ㎖) 중의 3-히드록시벤질알콜(2.4 g, 20 mmol)의 용액에 먼저 분말 수산화나트륨(1.5 g, 37.5 mmol)을 첨가한 다음, 크실렌 중에 프로파길 브로마이드를 용해시켜 수득한 80 중량% 용액(3.36 ㎖, 30 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 6시간 동안 가열하여 환류시켰다. 혼합물에 10% 시트르산(2.5 ㎖)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트(3 × 15 ㎖) 로 추출하고, 모은 유기층을 포화된 NaCl 용액(10 ㎖)으로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 3-프로파길옥시벤질 알콜을 얻었다.

메탄설포닐 클로라이드(2.5 g, 15.7 mmol) 및 트리에틸아민(2.8 ㎖, 20 mmol)을 0℃에서 CH₂Cl₂ 중의 화합물(3)의 용액(2.0 g, 11.0 mmol)에 첨가하고, 반응물을 냉장고에 16시간 동안 두었다. 통상의 마무리처리 후 메실레이트를 연한 황색 오일로서 수득하였다. 이 오일(2.4 g, 9.2 mmol)을 THF(20 ㎖) 중에 용해시키고, LiBr(2.0 g, 23.0 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 가열하여 환류시킨 다음, 실온으로 냉각시켰다. 혼합물에 물(2.5 ㎖)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트(3 × 15 ㎖)로 추출하고, 모은 유기층을 포화된 NaCl 용액(10 ㎖)으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 원하는 브로마이드를 수득하였다.

20 kDa의 mPEG-OH(1.0 g, 0.05 mmol, 썬바이오)를 THF(20 ㎖) 중에 용해시키고, 이 용액을 빙욕조 내에서 냉각시켰다. NaH(6 mg, 0.25 mmol)를 격렬하게 교반하면서 수 분에 걸쳐 첨가한 후, 앞서 수득한 브로마이드(2.55 g, 11.4 mmol) 및 촉매량의 KI를 첨가하였다. 냉각조를 제거하고, 생성된 혼합물을 12시간 동안 가열하여 환류시켰다. 물(1.0 ㎖)을 혼합물에 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물에 CH₂Cl₂(25 ㎖)를 첨가하고, 유기층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 ㎖로 감소시켰다. 에테르 용액(150 ㎖)에 적가하여 백색 침전물을 얻었고, 이를 모아 PEG 유도체를 수득하였다.

실시예 17

mPEG-NH₂ + X-C(O)-(CH₂)_n-C≡CR' → mPEG-NH-C(O)-(CH₂)_n-C≡CR'

전술한 바와 같이, 말단 작용기를 함유하는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체를, 알킨 작용기를 함유하는 반응성 분자에 커플링시킴으로써 말단 알킨 함유 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체도 얻을 수 있었다. 상기 식 중, n은 1 내지 10이고, R'는 H 또는 C₁ 내지 C₄의 저급 알킬 기일 수 있다.

실시예 18

4-펜틴산(2.943 g, 3.0 mmol)을 CH₂Cl₂(25 ㎖) 중에 용해시켰다. N-히드록시석신이미드(3.80 g, 3.3 mmol) 및 DCC(4.66 g, 3.0 mmol)를 첨가하고, 이 용액을 밤새 실온에서 교반하였다. 생성된 미정제 NHS 에스테르(7)를 추가 정제 없이 다음 반응에 사용하였다.

5,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-NH₂(mPEG-NH₂, 1 g, 썬바이오)를 THF(50 ㎖) 중에 용해시키고, 혼합물을 4℃로 냉각시켰다. NHS 에스테르(7)(400 mg, 0.4 mmol)를 격렬하게 교반하면서 나누어 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 실온으로 가온하면서 교반하였다. 그 다음, 물(2 ㎖)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물에 CH₂Cl₂(50 ㎖)를 첨가하고, 유기층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시 키고, 부피를 대략 2 ㎖로 감소시켰다. 이 CH₂Cl₂ 용액을 에테르(150 ㎖)에 적가하였다. 생성된 침전물을 모으고, 진공에서 건조시켰다.

실시예 19

본 실시예는 폴리(에틸렌 글리콜)의 메탄설포네이트 또는 메실레이트로도 지칭될 수 있는 폴리(에틸렌 글리콜)의 메탄 설포닐 에스테르의 제조를 나타낸다. 상응하는 토실레이트 및 할라이드는 유사한 절차에 의해 제조될 수 있었다.

150 ㎖의 톨루엔 중의 mPEG-OH(MW = 3,400, 25 g, 10 mmol)를 2시간 동안 질소 하에서 공비 증류시키고, 이 용액을 실온으로 냉각시켰다. 40 ㎖의 건조 CH₂Cl₂ 및 2.1 ㎖의 무수 트리에틸아민(15 mmol)을 상기 용액에 첨가하였다. 이 용액을 빙욕조 중에서 냉각시키고, 1.2 ㎖의 증류된 메탄설포닐 클로라이드(15 mmol)를 적가하였다. 이 용액을 실온에서 질소 하에서 밤새 교반하고, 2 ㎖의 무수 에탄올을 첨가함으로써 반응을 켄칭시켰다. 혼합물을 진공 하에서 증발시켜 용매, 주로 톨루엔 이외의 용매를 제거하고, 여과시키고, 진공 하에서 또 다시 농축시킨 다음, 100 ㎖의 디에틸 에테르로 침전시켰다. 여액을 냉각된 디에틸 에테르로 수회 나누어 세척하고, 진공에서 건조시켜 메실레이트를 얻었다.

메실레이트(20 g, 8 mmol)를 75 ㎖의 THF 중에 용해시키고, 용액을 4℃로 냉각시켰다. 냉각된 용액에 소듐 아지드(1.56 g, 24 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 질소 하에서 2시간 동안 가열하여 환류시켰다. 그 다음, 용매를 증발시키고, 잔류 물을 CH₂Cl₂(50 ㎖)로 희석시켰다. 유기 분획을 NaCl 용액으로 세척하고, 무수 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 부피를 20 ㎖로 감소시키고, 150 ㎖의 냉각된 무수 에테르를 첨가함으로써 생성물을 침전시켰다.

실시예 20

4-아지도벤질 알콜은 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,998,595호에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 메탄설포닐 클로라이드(2.5 g, 15.7 mmol) 및 트리에틸아민(2.8 ㎖, 20 mmol)을 0℃에서 CH₂Cl₂ 중의 4-아지도벤질 알콜(1.75 g, 11.0 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응물을 냉장고에 16시간 동안 두었다. 통상의 마무리처리 후 메실레이트를 연한 황색 오일로서 수득하였다. 이 오일(9.2 mmol)을 THF(20 ㎖) 중에 용해시키고, LiBr(2.0 g, 23.0 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 가열하여 환류시킨 다음, 실온으로 냉각시켰다. 혼합물에 물(2.5mL)을 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트(3 × 15 ㎖)로 추출하고, 모은 유기층을 포화된 NaCl 용액(10 ㎖)으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 원하는 브로마이드를 수득하였다.

20 kDa의 mPEG-OH(2.0 g, 0.1 mmol, 썬바이오)를 THF(35 ㎖) 중의 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하고, 브로마이드(3.32 g, 15 mmol)를 촉매량의 KI와 함께 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 12시간 동안 가열하여 환류시켰다. 물(1.0 ㎖)을 혼합물에 첨가하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물에 CH₂Cl₂(25 ㎖)를 첨가하고, 유기층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 ㎖로 감소시켰다. 에테르 용액(150 ㎖)에 적가하여 침전물을 얻었고, 이를 모아 mPEG-O-CH₂-C₆H₄-N₃를 수득하였다.

실시예 21

NH₂-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H(MW 3,400 Da, 2.0 g)를 NaHC0₃(10 ㎖)의 포화된 수용액 중에 용해시키고, 이 용액을 0℃로 냉각시켰다. 3-아지도-1-N-히드록시숙신이미도 프로피오네이트(5 당량)를 격렬하게 교반하면서 첨가하였다. 3시간 후, 20 ㎖의 H₂O를 첨가하고, 혼합물을 45분 동안 실온에서 더 교반하였다. 0.5 N H₂SO₄를 사용하여 pH를 3으로 조정하고, NaCl을 대략 15 중량%의 농도로 첨가하였다. 반응 혼합물을 CH₂Cl₂(100 ㎖ × 3)로 추출하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 냉각된 디에틸 에테르를 사용하여 침전시킨 후, 생성물을 여과에 의해 모으고, 진공 하에서 건조시켜 오메가-카르복시-아지드 PEG 유도체를 얻었다.

실시예 22

당업계에 공지되어 있는 바와 같이 제조되며 THF 중에서 -78℃에서 냉각된 리튬 아세틸리드(4 당량)의 용액에 THF 중에 용해된 mPEG-OMs의 용액을 격렬하게 교반하면서 적가하였다. 3시간 후, 반응물을 실온으로 가온시키고, 1 ㎖의 부탄올을 첨가하여 켄칭시켰다. 그 다음, 20 ㎖의 H₂O를 첨가하고, 혼합물을 45분 동안 실온에서 더 교반하였다. 0.5 N H₂SO₄를 사용하여 pH를 3으로 조정하고, NaCl을 대략 15 중량%의 농도로 첨가하였다. 반응 혼합물을 CH₂Cl₂(100 ㎖ × 3)로 추출하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 냉각된 디에틸 에테르를 사용하여 침전시킨 후, 생성물을 여과에 의해 모으고, 진공 하에서 건조시켜 1-(부트-3-일옥시)-메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)을 얻었다.

실시예 23

문헌[L. Wang, et al., (2001), Science 292; 498-500, J. W. Chin et al., Science 301: 964-7 (2003)), J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124: 9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Bio. Chem. 11: 1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99: 11020-11024: and, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1:1-11]에 기재된 방법을 사용하여, 아지드 함유 아미노산 및 아세틸렌 함유 아미노산을 단백질에 부위-선택적으로 도입하였다. 일단 아미노산이 도입되면, 포스페이트 완충제(PB)(pH 8) 중에서, 2 mM PEG 유도체, 1 mM CuSO₄, 및 약 1 mg Cu 와이어의 존재 하에서 4시간 동안 37℃에서 0.01 mM 단백질을 사용하여 시클로부가 반응을 수행하였다.

실시예 24

본 실시예는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 T-20 내로 도입하기에 바람직한 부위의 많은 가능한 선택 기준 세트 중 일부를 설명한다.

본 실시예는 T-20 폴리펩티드 내의 바람직한 부위가 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위해 어떻게 선택되는 지를 보여준다. 본 실시예에 사용된 서열 넘버링은 T-20의 아미노산 서열(서열번호 22) 및 TEX의 아미노산 서열(서열번호 24)에 따른다. TEX는 T-20의 N-말단 연장 폴리펩티드이다. 달리 명시하지 않은 한, 언급된 위치 번호는 T-20의 위치 638-673 및 TEX 펩티드의 630-673에 기초한 것이다. 예를 들어, 위치 639는 서열번호 22에서 두 번째 아미노산에 상응한다. 당업자는 서열번호 22에서의 위치에 상응하는 아미노산 위치가 서열번호 24 또는 임의의 다른 T-20 분자에서 용이하게 확인될 수 있음을 인식할 것이다.

T-20의 잠재적 알파 나선형 구조의 모델링은 문헌[W. Shu, J. Liu, H. Ji, L. Rading, S. Jiang, M. Lu, Helical Interactions in the HIV-1 gp41 Core Reveal Structural Basis for the Inhibitory Activity of gp41 Peptides (Biochemistry 39:1634 (2000)]으로부터의 PDB 1DLB에 기초하여 수행하였다. 하기 기준을 사용하여, 비-천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 T-20의 각 위치를 평가하였다: 잔기가 (a) 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 의해 영향을 받지 않아야 하고, (b) 노출된 표면이어야 하며 모델링에 기초할 때 주변 잔기와 최소한의 반 데르 발스 또는 수소 결합 상호작용을 나타내어야 하고, (c) T-20 변이체에서 활성에 영향을 주지 않으면서 생존가능하거나 비-필수적일 수 있고, (d) 비-천연적으로 코딩된 아미노산으로의 치환 시 보존적 치환을 야기할 것이고, (e) 매우 유연한 영역 또는 구조적으로 강한 영역에서 발견될 수 있다. 또한, Cx 프로그램(Pintar et al. (2002) Bioinformatics, 18, pp 980)을 사용하여 T-20 분자에 대해 추가 계산을 수행함으로써 각 단백질 원자가 펩티드로부터 돌출된 정도를 평가하였다. 비-천연 아미노산 도입을 위한 TEX 아미노산 위치의 분석 결과는 도 3에 나타나 있다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 (TEX를 비롯한) T-20 내의 임의의 위치, 첫 번째 아미노산 앞, 카르복시 말단에서의 부가, 또는 이들의 임의의 조합에서 도입된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산은 하기 잔기들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 (TEX를 비롯한) T-20 내의 임의의 위치에서 도입된다: W631, D632, I635, N636, N637, Y638, T639, S640, L641, L645, N651, 또는 이들의 임의의 조합.

실시예 25

생합성적으로 T-20 및 TEX를 제조하기 위한 클로닝 방법

도 9A는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 T-20 폴리펩티드, 및 N-말단에서 연장된 T-20의 폴리펩티드 내로 도입하기 위해 디자인된 구성체를 도식적으로 보여 준다. HIV 프로바이러스(proviral) DNA는 펩티드 생성물의 N 말단에서 메티오닌을 포함하는 T-20 및 TEX를 코딩하는 서열을 증폭하는 데 사용하였다. HIV 프로바이러스 DNA로부터 T-20 서열을 증폭하는 데 사용된 프라이머는 F-T20 5' AAG CTT TGG ATG TAC ACA AGT TTA ATA CAC TCC 3'(서열번호 26) 및 R-T20 5' GCG GAT CCC ATT AAA ACC AAT TCC ACA AAC TTG C 3'(서열번호 27)이었다. HIV 프로바이러스 DNA로부터 TEX 서열을 증폭하는 데 사용된 프라이머는 F-EXT20 5' CG AAG CTT TGG ATG GAG TGG GAT AGA GAA ATT AAC AAT TAC ACA AGT TTA ATA CAC TCC 3'(서열번호 28) 및 R-T20(서열번호 27)이었다. F-T20 및 F-EXT20은 HindIII 제한 부위를 함유하고, R-T20은 클로닝을 위한 BamHI 부위를 함유하였다.

T-20 및 TEX 서열은 TrpLE 융합 파트너(FP), 및 이 융합 파트너의 N-말단에 있는 9개 히스티딘 태그를 포함하는 발현 벡터 내로 인 프레임(in frame)으로 클로닝하였다.

도 10은 야생형 T-20과 TEX 서열의 비교를 보여준다. 펩티드 T-20(TEX)의 연장된 형태는 상기 프라이머를 사용하여 gp41 헵타드 반복부 2(HR2)의 상응하는 DNA 영역을 증폭시킴으로써 발생시켰다(도 1 참조). TEX는 N-말단에서 T-20보다 8개 아미노산만큼 더 길어, 44개 아미노산 길이의 폴리펩티드를 제공한다. TEX는 HIV_NL4-3 경막 단백질(TM)의 아미노산 630 내지 673에 상응한다. T-20은 HIV_{NL4 -3} 경막 단백질(TM)의 아미노산 638 내지 673에 상응한다. 도 4는 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 펩티드 서열 내로 도입된 TEX 돌연변이체의 제조를 보여준다.

생합성적으로 제조된 T20 및 TEX 펩티드 유사체의 정제

최종 융합 펩티드는 박테리아에서 생합성적으로 제조되었다. 오르토고날 tRNA 및 이의 특이적 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소를 발현시켜 T-20 및 TEX 구성체의 억제를 수행하였다. 박테리아 세포질 내에서의 단백질 분해를 피하기 위해, 융합 펩티드가 봉입체(IB) 내로 향하도록 발현시켰다. 융합 펩티드를 함유하는 IB는 100 ㎍/㎖의 라이소자임 및 10 ㎍/㎖의 DNase를 함유하는 봉입체 재현탁 완충제(IBRB; 50 mM 트리스, pH 7.5, 200 mM NaCl, 2 mM EDTA) 중에 재현탁시켰다. 재현탁물을 6회 초음파처리한 후, 샘플을 원심분리하여 펠릿을 침강시켰다. 1% 트리톤 X-100을 함유하는 봉입체 세척 완충제(50 mM 트리스, pH 7.5, 30 mM NaCl, 1 mM EDTA)를 사용한 초음파처리 및 세척 사이의 원심분리로 IB 펠릿을 4회 세척하여 잔류 오염물질을 제거하였다. 이어서, 봉입체 세척 완충제(50 mM 트리스, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA)를 사용한 초음파처리 및 세척 사이의 원심분리로 IB 펠릿을 2회 세척하였다. 펠릿을 pH 7.8의 구아니디늄 결합 완충제(6 M 구아니딘 HCl, 20 mM NaPO₄, pH 7.8, 500 nM NaCl) 중에 가용화시키고, 융합 펩티드의 His-태그 정제를 위한 평형화된 ProBond 수지에 결합시켰다. 상기 수지를 pH 7.8의 구아니디늄 결합 완충제로 2회, pH 6.0의 구아니디늄 세척 완충제(6 M 구아디닌 HCl, 20 mM NaPO₄, pH 6.0, 500 nM NaCl)로 2회, pH 5.3의 구아니디늄 세척 완충제(6 M 구아니딘 HCl, 20 mM NaPO₄, pH 5.3, 500 nM NaCl)로 2회 세척하였다. His-태그 결합 융합 펩티드를 pH 4.0의 구아니디늄 용출 완충제(6 M 구아니딘 HCl, 200 mM 아세트산, 20 mM NaPO₄, pH 4, 500 nM NaCl)로 용출하였다.

샘플을 동결건조하기 전, 10% 포름산을 함유하는 구아니디늄 용출 완충제를 사용한 완충제 교환을 PD-10 탈염 컬럼을 사용하여 수행하였다. 그 다음, 동결건조 후, 샘플을 70% 포름산 중에 재현탁시켜 시아노겐 브로마이드(CNBr) 절단을 밤새 수행하였다. CNBr이 메티오닌에 대한 C-말단을 특이적으로 절단하기 때문에, CNBr을 사용한 절단은 T-20 또는 TEX가 그의 융합 파트너로부터 분리되어 더 정제되게 하여 항바이러스 활성 분석에서의 시험을 위한 순수한 펩티드를 수득할 수 있게 한다. 도 9, 패널 B의 레인 4는 CNBr 처리의 절단 생성물을 보여준다. T-20 및 융합 파트너(FP)는 화살표로 표시되어 있다. 다른 레인들은 다음과 같이 로딩되었다: 레인 1 - 마커, 레인 2 - 유도 전, 레인 3 - 유도 후.

CNBr로 절단한 후, 샘플을 동결건조시키고 8 M 우레아 중에 재현탁시키고, 분취형 HPLC를 통해 분리하였다. 샘플을 C8 분취형 HPLC 컬럼 상에서 런닝하여 잔류 CNBr을 제거하였다. 생성물을 동결건조시킨 후, pH 7.8의 구아니디늄 결합 완충제 중에 재현탁시켰다. 가용화된 생성물을 평형화된 ProBond 수지에 결합시키고, 유출물을 모았다. 이어서, 샘플을 C8 분취형 HPLC 컬럼 상에서 런닝하여 T-20 또는 TEX를 정제하고, 동결건조시켰다. 그 후, 정제된 펩티드를 pH 9의 완충제(22.5 mg/㎖ 만니톨, 2.39 mg/㎖ 탄산나트륨) 중에 재현탁시켰다.

T20 및 TEX를 변형시키기 위한 돌연변이

셀렉터 코돈을 T-20 및 TEX 유사체 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내 로 도입하여, 지정된 보존된 위치에서 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하였다. 각 셀렉터 코돈의 위치는 HIV 융합 과정 동안의 6-나선 다발 형성의 공개된 결정 구조에 기초하여 선택되었다. 셀렉터 코돈은 제조자((Stratagene))의 지시에 따라 퀵체인지(QuickChange) 돌연변이유발에 의해 도입되었고, 각각의 개별 돌연변이체의 시퀀싱에 의해 확인되었다.

비-천연적으로 코딩된 아미노산으로의 치환을 코딩하는 셀렉터 코돈을 가진 5종의 상이한 T-20 구성체를 발생시켰다. 도 10은 앰버 코돈으로 치환된 코돈에 의해 코딩된 T-20의 5개 잔기들의 맵을 보여준다: T20 639로 표시된 트레오닌; T20 640으로 표시된 세린; T20 641로 표시된 류신; T20 645로 표시된 류신; 및 T20 651로 표시된 아스파라진.

비-천연적으로 코딩된 아미노산으로의 치환을 코딩하는 셀렉터 코돈을 가진11종의 상이한 TEX 구성체를 발생시켰다. 도 10은 앰버 코돈으로 치환된 코돈에 의해 코딩된 TEX의 11개 잔기들의 맵을 보여준다: TEX 631로 표시된 트립토판; TEX 632로 명명된 아스파르트산; TEX 635로 표시된 이소류신; TEX 636으로 표시된 아스파라진; TEX 637로 표시된 아스파라진; TEX 638로 표시된 티로신; TEX 639로 표시된 트레오닌; TEX 640으로 표시된 세린; TEX 641로 표시된 류신; TEX 645로 표시된 류신; 및 TEX 651로 표시된 아스파라진. 도 12는 T20 651(패널 A) 및 TEX 636(패널 B) 둘다에서 일어난 억제를 보여준다. sup.는 "억제된"의 약어이다. 도 12의 패널 C 및 D는 도 12의 패널 A 및 B에 나타낸 샘플 런의 웨스턴 블롯을 보여준다. 패널 E는 T-20(T-20-Mut651) 및 TEX(TEX-Mut636)에서 별표로 표시된 p-아세틸-페닐알라 닌으로 치환된 잔기를 보여준다. 도 5는 파라-아세틸 페닐알라닌으로 치환된 TEX-W631, TEX-D632, TEX-N636 및 TEX-T639를 보여준다.

실시예 26

본 실시예는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 T-20의 생물학적 활성을 측정하는 방법을 설명한다.

T20 및 TEX의 항바이러스 활성을 시험하기 위한 시험관내 융합 분석

T20 또는 TEX의 항바이러스 활성을 평가하기 위해, 단일-주기 감염에 기초한 융합 분석을 이용하였다. 이 분석은 도 11에 도시적으로 나타나 있다. 요약하면, 293-T 세포를 2종의 플라스미드로 동시형질감염시키는데, 이때 한 플라스미드는 HIV 외피 유전자(JRFL 또는 JC2 env)만을 발현시키는 플라스미드이고, 제2 플라스미드는 HIV Nef 유전자 대신에 루시퍼라제 유전자를 보유하며 그의 내인성 내피 유전자(pHIV.Luc)를 발현하지 않는 변형된 HIV 프로바이러스 DNA를 발현시키는 플라스미드이다. 이러한 의사형(pseudotyped) env HIV-Luc 바이러스는 1회 감염으로 표적 세포를 감염시킬 수 있다. HIV는 형질감염시킨 지 48시간 후에 생성되었고, 형질감염된 세포의 상청액 중에 모아졌다. 상기 바이러스는 ELISA로 p24^gog를 측정함으로써 정량하였다. HIV 농도가 결정되면, 인간 CD4 수용체 및 2개의 인간 보조수용체 중 하나인 CCR5 또는 CXCR4를 발현하는 인간 표적 세포를 T20, TEX 및 이들의 상응하는 돌연변이체의 존재 또는 부재 하에 상이한 MOI에서 감염시켰다. 감염시킨 지 3일 후, 세포를 용해시키고, 기질과 함께 로딩하여 조도계(illuminometer)에 의 해 측정된 루시퍼라제 활성을 결정하였다. 이 분석은 정량적 분석이고, 상이한 펩티드의 HIV 융합의 저해 농도가 평가되었다. 도 6은 T20 또는 TEX 활성 분석을 도식적으로 보여준다. T-20, TEX, 및 파라-아세틸페닐알라닌으로 치환된 TEX 돌연변이체 TEX-W631, TEX-D632, TEX-N636 및 TEX-T639를 사용하여 수행한 이 분석의 결과는 푸제온과 비교하여 도 7A 및 도 7B에 나타내었다. 도 8은 실시예 3에 기재된 바와 같이 접합된, 5K 및 30K PEG를 사용한 TEX-N636의 PEG화를 보여준다.

별법으로, 당업자에게 공지되어 있는, 바이러스 도입 또는 바이러스 융합을 측정하는 분석을 포함하나 이로 한정되지 않는, 항바이러스 활성을 측정하는 다른 분석을 포함하나 이로 한정되지 않는 다수의 다른 분석을 이용하여 본 발명의 T-20 또는 TEX 폴리펩티드의 활성을 모니터링할 수 있다. 또 다른 항바이러스제와의 병용 요법을 시험하기 위한 이들 분석에 대한 변형 또한 당업자에게 공지되어 있다.

또한, 당업자에게 잘 공지되어 있는 표준 방법이 비레트로바이러스 활성을 분석하는 데 이용될 수 있다. 호흡기 세포융합 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 활성 분석 기법에 대한 논의에 대해서는 예를 들어, 문헌(Pringle, C. R. et al., 1985, J. Medical Virology 17:377-386)을 참조한다. 추가로, 이러한 기법의 일반적인 검토에 대해서는 예를 들어, 문헌("Zinsser Microbiology", 1988, Joklik, W. K. et al., eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 19th ed.)을 참조한다. 이 참고문헌들은 완전히 참고로 본 명세서에 도입된다.

동물 연구는 본 발명의 T-20 폴리펩티드를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 연구는 독성 연구를 포함하나 이로 한정되지 않는다.

본 명세서에 기재된 실시예 및 실시양태는 설명을 위해 제공되는 것이며, 이들의 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 시사될 것이고, 이는 본원의 기술적 사상 및 첨부된 청구의 범위 내에 포함된다. 본 명세서에서 인용된 모든 문헌, 특허 및 특허출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참고로 도입된다.

[표 3]

SEQUENCE LISTING <110> Mariani, Roberto Kimmel, Bruce E. <120> Biosynthetic Polypeptide Fusion Inhibitors <130> AMBX-0101.00PCT <140> PCT/US2006/042851 <141> 2006-11-01 <150> 60/733,339 <151> 2005-11-02 <160> 24 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 53 <212> PRT <213> RSV <400> 1 Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp 1 5 10 15 Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser 20 25 30 Leu Ala Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Thr 35 40 45 Gly Lys Ser Thr Thr 50 <210> 2 <211> 77 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 2 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77 <210> 3 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> optimized amber supressor tRNA <400> 3 cccagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggactctaa atccgttctc gtaggagttc 60 gagggttcga atcccttccc tgggacca 88 <210> 4 <211> 89 <212> DNA <213> artificial <220> <223> optimized AGGA frameshift supressor tRNA <400> 4 gcgagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggacttcct aatccgttct cgtaggagtt 60 cgagggttcg aatccctccc ctcgcacca 89 <210> 5 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-L-phenylalanine <400> 5 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 6 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-benzoyl-L-phenylalanine <400> 6 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Ser His 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 7 <211> 304 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of propargyl-phenylalanine <400> 7 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ala Ala Ile 20 25 30 Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln Ile 35 40 45 Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile Leu 50 55 60 Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp Glu 65 70 75 80 Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met Gly 85 90 95 Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Pro Phe Gln Leu Asp Lys Asp 100 105 110 Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys Arg 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21 atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60 gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120 ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180 atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240 ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300 aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360 catcattctt ctggtgaaaa cctgtacttc caaagcgagt gggatagaga aattaacaat 420 tacacaagtt taatacactc cttaattgaa gaatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa 480 caagaattat tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggttt 528 <210> 22 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Trx-TEV-TEX Fusion Peptide <400> 22 Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp 1 5 10 15 Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp 20 25 30 Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp 35 40 45 Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn 50 55 60 Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu 65 70 75 80 Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser 85 90 95 Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly 100 105 110 Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Glu Asn Leu 115 120 125 Tyr Phe Gln Ser Thr Glu Val Ser Ile Thr Glu Glu Trp Asp Arg Glu 130 135 140 Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln 145 150 155 160 Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp 165 170 175 Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe 180 <210> 23 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic Acid Encoding 2TEX Fusion Peptide <400> 23 atggaatggg atcgtgaaat caacaactac acaagcttaa tacacagctt aattgaggag 60 agccagaacc agcaggagaa aaatgagcag gaactgttgg aactggataa atgggcaagc 120 ctgtggaatt ggtttggtgg tggctctggc ggtggtagcg gtggcggtag tgagtgggat 180 agagaaatta acaattacac aagtttaata cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag 240 caagaaaaga atgaacaaga attattggaa ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg 300 ttt 303 <210> 24 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 2TEX Fusion Peptide <400> 24 Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser 1 5 10 15 Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu 20 25 30 Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ile Asn Lys Glu Arg Glu Trp 50 55 60 Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu 65 70 75 80 Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu 85 90 95 Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe 100 105

Claims (40)

1. 하나 이상의 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 생합성 폴리펩티드 융합 저해제(BPFI).
2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하는 BPFI.
3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 링커(linker), 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 결합된 것인 BPFI.
4. 제3항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 수용성 중합체에 결합된 것인 BPFI.
5. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 이작용성 중합체, 이작용성 링커 또는 하나 이상의 추가 BPFI에 결합된 것인 BPFI.
6. 제5항에 있어서, 상기 이작용성 링커 또는 중합체가 제2 폴리펩티드에 결합된 것인 BPFI.
7. 제6항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드가 BPFI인 BPFI.
8. 제4항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) 부분(moiety)을 포함하는 것인 BPFI.
9. 제4항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 상기 BPFI 내에 존재하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산에 결합된 것인 BPFI.
10. 제1항에 있어서, 상기 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 폴리펩티드 내의 20종의 일반 아미노산(common amino acid) 중 임의의 아미노산에 대해 달리 반응성을 나타내지 않는 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 대해 반응성을 나타내는 것인 BPFI.
11. 제1항에 있어서, 상기 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐 기, 아미노옥시 기, 히드라진 기, 히드라지드 기, 세미카르바지드 기, 아지드 기 또는 알킨 기를 포함하는 것인 BPFI.
12. 제11항에 있어서, 상기 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐 기를 포함하는 것인 BPFI.
13. 제12항에 있어서, 상기 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 하기 구조를 갖는 것인 BPFI:

    

    (상기 식 중,

    n은 0 내지 10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이고; R₂는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이고; R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고; R₄는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다).
14. 제11항에 있어서, 상기 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 아미노옥시 기를 포함하는 것인 BPFI.
15. 제11항에 있어서, 상기 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 히드라지드 기를 포함하는 것인 BPFI.
16. 제11항에 있어서, 상기 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 히드라진 기를 포함하는 것인 BPFI.
17. 제11항에 있어서, 상기 비-천연적으로 코딩된 아미노산 잔기가 세미카르바지 드 기를 포함하는 것인 BPFI.
18. 제11항에 있어서, 상기 비-천연적으로 코딩된 아미노산 잔기가 아지드 기를 포함하는 것인 BPFI.
19. 제18항에 있어서, 상기 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 하기 구조를 갖는 것인 BPFI:

    

    (상기 식 중,

    n은 0 내지 10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고; X는 O, N 또는 S이거나, 존재하지 않고; m은 0 내지 10이고; R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고; R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다).
20. 제11항에 있어서, 상기 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 알킨 기를 포함하는 것인 BPFI.
21. 제20항에 있어서, 상기 비-천연적으로 코딩된 아미노산이 하기 구조를 갖는 것인 BPFI:

    

    (상기 식 중,

    n은 0 내지 10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이고; X는 O, N 또는 S이거나, 존재하지 않고; m은 0 내지 10이고; R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 아미노 말단 변형 기이고; R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드 또는 카르복시 말단 변형 기이다).
22. 제4항에 있어서, 상기 수용성 중합체의 분자량이 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa인 BPFI.
23. 제22항에 있어서, 상기 수용성 중합체의 분자량이 약 0.1 kDa 내지 약 50 kDa인 BPFI.
24. 제4항에 있어서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 BPFI를, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기를 포함하는 수용성 중합체와 반응시 켜 제조한 BPFI.
25. 제24항에 있어서, 상기 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기가 아미드 결합을 통해 수용성 중합체에 결합된 것인 BPFI.
26. 제4항에 있어서, 카르보닐 기를 포함하는 수용성 중합체를, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기를 포함하는 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 반응시켜 제조한 BPFI.
27. 제4항에 있어서, 알킨 함유 아미노산을 포함하는 BPFI를, 아지드 부분을 포함하는 수용성 중합체와 반응시켜 제조한 BPFI.
28. 제4항에 있어서, 아지드 함유 아미노산을 포함하는 BPFI를, 알킨 부분을 포함하는 수용성 중합체와 반응시켜 제조한 BPFI.
29. 제11항에 있어서, 상기 아지드 또는 알킨 기가 아미드 결합을 통해 수용성 중합체에 결합된 것인 BPFI.
30. 제4항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 분지형(branched) 또는 멀티아암형(multiarmed) 중합체인 BPFI.
31. 제30항에 있어서, 상기 수용성 중합체의 각각의 분지의 분자량이 약 1 kDa 내지 약 100 kDa인 BPFI.
32. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 길항제인 BPFI.
33. 제32항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 하나 이상의 번역 후 변형, 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 것인 BPFI.
34. 제33항에 있어서, 상기 중합체가 수용성 중합체 및 폴리(에틸렌 글리콜)로 구성된 군으로부터 선택되는 부분을 포함하는 것인 BPFI.
35. 엄격한(stringent) 조건 하에 BPFI를 코딩하는 핵산 서열에 혼성화하며 하나 이상의 셀렉터 코돈(selector codon)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산.
36. 제35항에 있어서, 상기 셀렉터 코돈이 앰버(amber) 코돈, 오커(ochre) 코돈, 오팔(opal) 코돈, 특이(unique) 코돈, 희귀(rare) 코돈 및 4-염기 코돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 단리된 핵산.
37. 비-천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 단리된 BPFI를, 비-천연적으로 코딩된 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 제3항의 BPFI의 제조 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 중합체가 수용성 중합체 및 폴리(에틸렌 글리콜)로 구성된 군으로부터 선택되는 부분을 포함하는 것인 방법.
39. RSV에 감염된 환자를 치료하거나 RSV 감염을 예방하는 방법으로서, 치료 유효량의 제38항의 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
40. 제35항의 핵산을 포함하는 세포.

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