ES2712648T3

ES2712648T3 - Conjugados de fármaco de anticuerpo anti-CD70

Info

Publication number: ES2712648T3
Application number: ES13732069T
Authority: ES
Inventors: Richard Barnett; Nick Knudsen; Ying Sun; Sandra Biroc; Timothy Buss; Tsotne Javahishvili; Damien Bresson; Shailaja Srinagesh; Amha Hewet; Jason Pinkstaff
Original assignee: Ambrx Inc
Current assignee: Ambrx Inc
Priority date: 2012-06-19
Filing date: 2013-06-19
Publication date: 2019-05-14
Anticipated expiration: 2033-06-19
Also published as: KR20200140399A; JP2018168155A; CN104619351A; US12037405B2; AU2013277169B2; MX2014015878A; IL236323A0; EP2861262B1; EP4406612A2; KR102332435B1; MX359449B; KR20150032716A; JP7183215B2; US20150141624A1; SG11201408494UA; CN111499684A; US20190338039A1; IL236323B; EP3488870A1; US11459392B2

Abstract

Un compuesto que comprende la Fórmula (VIII) o (IX), en donde el compuesto es un anticuerpo αCD70 conjugado con una dolastatina, en donde la conjugación ocurre a través de un aminoácido no codificado naturalmente en el anticuerpo, en donde la Fórmula (VIII) y (IX) corresponden a: **Fórmula** en donde: A es opcional, y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heteroalquileno, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heterocalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o sustituidos)alquileno)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)K- donde k es 1, 2 o 3, -S(O)K (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno 50 sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, - N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)KN (R)")-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y - C(R')2-N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; R1 y/o R2 es un anticuerpo anti-CD70 (αCD70), en donde el anticuerpo αCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 1, en donde el aminoácido 119 de la SEQ ID NO. 1 está sustituido con el aminoácido no codificado de forma natural, o en donde el anticuerpo αCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 10, en donde el aminoácido 122 de la SEQ ID NO. 10 está sustituido con el aminoácido no codificado de forma natural; o 60 en donde el anticuerpo αCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 17, en donde el aminoácido 119 de la SEQ ID NO. 17 está sustituido con el aminoácido no codificado de forma natural; R3 y R4 son cada uno independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; Z tiene la estructura de: **Fórmula** R5 es H, COR8, alquilo C1-C6 o tiazol; R8 es OH; R6 es OH o H; Ar es fenilo o piridina; R7 es alquilo C1-C6 o hidrógeno; L es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en -alquileno-, -alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-alquileno- , -(alquileno-O)n-alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-(CH2)n'-NHC(O)-(CH2)n'-C(Me)2-S- S-(CH2)n'"-NHC(O)-(alquileno- O)n"'-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W-, -alquileno-C(O)-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(O)-, y- (alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-; W tiene la estructura de: **Fórmula** U tiene la estructura de: **Fórmula** y cada n, n', n", n'" y n"" son independientemente enteros mayores o iguales a uno; en donde alquilo inferior significa un grupo alquilo con ocho o menos átomos de carbono; en donde alquileno inferior significa un grupo 50 alquileno que tiene ocho o menos átomos de carbono; o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo

Description

DESCRIPCION

Conjugados de farmaco de anticuerpo anti-CD70

CAMPO DE LA INVENCION

[0001] Esta invencion se refiere a anticuerpos anti-CD70 y conjugados de farmaco de anticuerpo que comprenden al menos un aminoacido no codificado de forma natural. En el presente documento se describen los anticuerpos aCD70 con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural y se describen adicionalmente los conjugados de farmaco de anticuerpo en los que los anticuerpos aCD70 de la invencion se conjugan con una o mas toxinas. Ademas, se describen metodos para usar dichos conjugados de farmacos de anticuerpos de aminoacidos no naturales, incluidos los usos terapeuticos, de diagnostico y otros de biotecnologfa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0002] CD70 es un miembro de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF) de moleculas unidas a la membrana celular y secretadas que se expresan por una variedad de tipos de celulas normales y malignas. La secuencia de aminoacidos primarios (AA) de CD70 predice una protema transmembrana de tipo II con su extremo carboxilo expuesto al exterior de las celulas y su extremo amino encontrado en el lado citosolico de la membrana plasmatica (Bowman et al., 1994, J Immunol 152).: 1756-61; Goodwin et al., 1993, Cell 73: 447-56). El CD70 humano esta compuesto por un dominio citoplasmico de 20 AA, un dominio transmembrana de 18 AA y un dominio extracitoplasmico de 155 AA con dos sitios potenciales de glicosilacion unidos a N (Bowman et al., Supra; Goodwin et al., Supra). La inmunoprecipitacion espedfica de celulas que expresan CD70 marcadas con radioisotopos por anticuerpos anti-CD70 produce polipeptidos de 29 y 50 kDa (Goodwin et al., Supra; Hintzen et al., 1994, J Immunol 152: 1762-73). Basandose en su homologfa con TNF-alfa y TNF-beta, especialmente en las cadenas estructurales C, D, h y I, se predice una estructura trimerica para CD70 (Petsch et al., 1995, Mol Immunol 32: 761-72).

[0003] Los estudios inmunohistologicos originales revelaron que CD70 se expresa en celulas B del centro germinal y celulas T raras en amfgdalas, piel y tripas (Hintzen et al., 1994, Int Immunol 6: 477-80). Posteriormente, se informo que CD70 se expresaba en la superficie celular de los linfocitos T y B recientemente activados por antfgeno, y su expresion disminuye despues de la eliminacion de la estimulacion antigenica (Lens et al., 1996, Eur J Immunol 26: 2964-71; Lens et al., 1997. Immunology 90: 38-45). Dentro del sistema linfoide, las celulas asesinas naturales (Orengo et al., 1997. Clin Exp Immunol 107: 608-13) y las celulas dendnticas perifericas maduras de raton (Akiba et al., 2000, J Exp Med 191: 375-80) tambien se expresan CD70. En linajes no linfoides, se ha detectado CD70 en celulas epiteliales medulares del timo (Hintzen et al., 1994, supra; Hishima et al., 2000, Am J Surg Pathol 24: 742 46).

[0004] Ademas de la expresion en celulas normales, la expresion de CD70 se ha informado en diferentes tipos de cancer, incluidos linfomas, carcinomas y tumores de origen neural. En celulas B malignas, el 71% de los linfomas difusos de celulas B grandes, el 33% de los linfomas del centro del folmulo, el 25% de los linfomas del manto y el 50% de las B-CLL expresan CD70 (Lens et al., 1999, Br J Haematol 106: 491-503). CD70 se expresa frecuentemente junto con otros marcadores de activacion linfoides en las celulas malignas de Hodgkin y Reed-Sternberg de la enfermedad de Hodgkin (Gruss y Kadin, 1996, Bailieres Clin Haematol 9: 417-46). Un informe demuestra la expresion de CD70 en 88% (7 de 8 casos) de carcinomas tfmicos y 20% (1 de 5 casos) de timomas atfpicos (Hishima et al., 2000, supra). El segundo tipo de carcinoma en el que se ha detectado CD70 es el carcinoma nasofarmgeo. Un estudio informa la presencia de CD70 en el 80% (16 de 20 casos) de biopsias de tumores congelados obtenidos a partir de carcinomas nasofarmgeos indiferenciados (Agathanggelou et al., 1995, Am J Path 147: 1152-60). CD70 tambien se ha detectado en celulas de tumores cerebrales, especialmente lmeas celulares de glioma, gliomas humanos solidos y meningiomas (Held-Feindt y Mentlein, 2002, Int J Cancer 98: 352-56; Wischlusen et al., 2002, Can Res 62: 2592-99).

[0005] Se ha propuesto que los virus de transformacion que incluyen el virus de Epstein-Barr (eBV) y el virus de leucemia T humano 1 (HTLV-1) pueden inducir CD70 en celulas como las celulas epiteliales que normalmente no expresan CD70 (Agathanggelou et al., supra; Stein et al., 1989, Oxford University Press, p. 446). Por lo tanto, la expresion de CD70 en celulas B malignas podna ser un reflejo de la transformacion oncogenica (Lens et al., 1999, supra). Ademas, dado que la expresion de CD70 se induce en las celulas B despues del encuentro con el antfgeno (Maurer et al., 1990, Eur J Immunol 20: 2679-84; Lens et al., 1996, supra), la expresion estable de CD70 podna reflejar una estimulacion antigenica prolongada. Se ha postulado que esto ocurre en linfomas foliculares no Hodgkin basados en hipermutacion somatica en curso (Bahler y otros, 1992, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 89: 6770-74; Bahler y otros, 1992, Cancer Res 52: suppl. 5547S -51^s).

[0006] El receptor para CD70 es CD27, una protema transmembrana de tipo I glicosilada de aproximadamente 55 kDa (Goodwin et al., 1993, Cell 73: 447-56; Hintzen et al., 1994, supra). CD70 se refiere a veces como CD27L. CD27. que existe como un homodfmero en la superficie celular (Gravestein et al., 1993, Eur J Immunol 23: 943-50), es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF como se define en las repeticiones ricas en cistema de aproximadamente 40 aminoacidos en el dominio extracelular (Smith et al., 1990, Science 248: 1019-23; Locksley et al., 2001, Cell 104: 487-501). La CD27 se expresa tipicamente por timocitos, celulas NK, T y B (Hintzen et al., 1994, Immunol Today 15: 307-11; Lens et al., 1998, Semin Immunol 10: 491-99). En las celulas T en reposo, CD27 se expresa de forma constitutiva, pero el desencadenante antigenico regula aun mas la expresion de c D27 (de Jong et al., 1991, J Immunol 146: 2488-94; Hintzen et al., 1993, J Immunol. 151: 2426-35). Ademas, la activacion de las celulas T a traves de su complejo de receptor de antigeno de celulas T solo o en combinacion con la molecula accesoria CD28 libera CD27 soluble de celulas T activadas (Hintzen et al., 1991, J Immunol 147: 29-35). Las celulas B naive no expresan CD27, pero su expresion se induce y, a diferencia de CD70, se mantiene despues del desencadenante antigenico de las celulas B (Jacquot S et al., 1997 J Immunol 159: 2652-57; Kobata T et al., 1995, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 92: 11249-53).

[0007] En marcado contraste con la expresion restringida de CD27 y CD70 en celulas de linaje B normal, tanto CD27 como CD70 se expresan frecuentemente en muchos linfomas y leucemias de celulas B no Hodgkin. Esto podna potencialmente conducir a interacciones CD27-CD70 funcionales en estas celulas en forma de un bucle autocrino, dando como resultado la senalizacion de CD27 y la proliferacion inducida por CD70, proporcionando asf una ventaja de crecimiento para las celulas malignas (Lens et al., 1999, supra).

[0008] Los datos disponibles apoyan un modelo en el que la ligadura de CD27 en linfocitos activados por CD70 emite senales a las celulas que expresan CD27, incluidas senales coestimuladoras en celulas T, B y NK. (Ver, por ejemplo, Goodwin y otros, supra; Hintzen y otros, 1995, J Immunol 154: 2612-23; Oshina y otros, 1998, Int Immunol 10: 517-26; Smith y otros, supra; Van Lier et al., 1987. J Immunol 139: 1589-96; Gravestein et al., 1995, Int Immunol 7: 551-7; Tesselaar et al., 1997. J Immunol 159: 4959-65; Jacquot et al. supra; Agematsu et al., 1998, Blood 91: 173 80; Kobata et al., supra; Agematsu et al., 1997. Eur J Immunol 27: 2073-79; Sugita et al., 1992, J Immunol 149: 1199-1203; Orengo et al., 1997. Clin Exp Immunol 107: 608-13). Se ha demostrado que los anticuerpos contra CD70 murino y humano inhiben tales actividades, probablemente al bloquear la interaccion CD70/CD27 (Hintzen et al., 1994, supra; Hintzen et al., 1995, supra; Oshima et al., Supra).

[0009] Se dispone de informacion limitada sobre la modulacion de las funciones celulares a traves de la senalizacion de ^cD70 en la interaccion CD70/CD27, es decir, “senalizacion inversa”. Algunos anticuerpos CD70 tienen la capacidad de aumentar la proliferacion de celulas T cuando se presentan a celulas T que expresan CD70, ya sea reticuladas con un anticuerpo secundario o inmovilizadas en placas de cultivo de tejidos (Bowman et al., 1994, J Immunol 152: 1756-61).; Brugnoni, 1997. Immunol Lett 55: 99-104). Dicha “senalizacion inversa” tambien se ha descrito en un subconjunto de celulas de leucemia linfocftica cronica B (B-CLL), y el CD70 puede funcionar como un receptor para transducir senales para facilitar la proliferacion de celulas B-CLL purificadas estimuladas con PMA (Lens et al., 1999, supra). Estas observaciones sugieren situaciones en las que el compromiso de CD27 y CD70 puede resultar en la administracion de senales agomsticas a las celulas que expresan CD27 y CD70.

[0010] El papel de la coestimulacion con CD70/CD27 en enfermedades autoinmunes mediadas por celulas se ha investigado en un modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) (Nakajima et al., 2000, J Neuroimmunol 109: 188-96). La administracion in vivo de un mAb CD70 anti-raton particular (clon FR-70) suprimio notablemente la aparicion de EAE al inhibir la produccion de TNF-alfa inducida por antfgeno sin afectar el cebado de las celulas T, la produccion de Ig o el equilibrio celular T^h-ⁱ/T^h2. Sin embargo, tal tratamiento tuvo poca eficacia en la enfermedad establecida. Se ha informado de que la expresion de CD70 en las celulas T se mejoro con TNF-alfa e IL-12 y se regula a la baja por IL4 (Lens et al., 1998, supra). Por lo tanto, las interacciones de las celulas f-T mediadas por CD70/CD27 pueden jugar un papel en la mejora de las respuestas inmunes mediadas por Tm en lugar de las respuestas mediadas por T^h2. Apoyando esta hipotesis, el anti-raton CD70 mAb FR-70 tambien es eficaz para inhibir la artritis inducida por colageno mediada por Tm (Nakajima et al., 2000, supra). En contraste, el mismo mAb CD70 anti-raton no mostro ninguna eficacia en la modulacion del lupus en ratones NZB/NZW F1 y en Leishmania mayor infeccion experimental en ratones BALB/c susceptibles, los cuales son predominantemente respuesta autoinmune mediada por Th²(Nakajima et al., 1997. J Immunol 158, 1466-72; Akiba et al., 2000, J Exp Med 191: 375-380).

[0011] El papel de CD70 aun no se ha investigado en la enfermedad aguda de injerto contra huesped (aGVHD), otra respuesta inmune mediada por Tm. La GVHD es una consecuencia importante y a menudo letal de la terapia alogenica de trasplante de medula osea (TMO) que ocurre cuando hay diferencias de antfgeno de histocompatibilidad entre el donante de MO y el receptor del trasplante (den Haan et al., 1995, Science 268: 1476). La GVHD es causada por celulas T maduras presentes en la medula transplantada, asf como por otras poblaciones celulares menores (Giralt y Champlin, 1994, Blood 84: 3603). Cabe destacar que CD70 se ha detectado in vivo en celulas CD4+ en condiciones caracterizadas por una reaccion alogenica, como en los casos de injerto de celulas T maternas en pacientes con deficiencia inmunitaria combinada grave (Brugnoni et al., Immunol Lett 55: 99-104). La profilaxis de la GVHD se logra mediante agentes inmunosupresores de celulas pan-T, como ciclosporina, corticosteroides o metotrexato. Ademas de la falta de especificidad, estos agentes tambien estan asociados con efectos secundarios adversos significativos. Para limitar estos efectos indeseables y la interrupcion de las funciones normales de las celulas T, es muy necesario realizar otras intervenciones terapeuticas basadas en la seleccion selectiva de las celulas T que participan directamente en el reconocimiento y el rechazo del injerto.

[0012] El CD70 es un objetivo potencialmente util para la inmunoterapia dirigida por anticuerpos. Como se indico anteriormente, CD70 tiene un patron de expresion restringido en celulas normales: la expresion de CD70 se restringe principalmente a las celulas T y B activadas por antigeno en condiciones fisiologicas, y su expresion se regula a la baja cuando cesa la estimulacion antigenica. Se cree que el papel clave de c D70 es facilitar la diferenciacion de las celulas plasmaticas y contribuir a la generacion y mantenimiento de la memoria de celulas T a largo plazo. Ademas, la evidencia de modelos animales sugiere que la interaccion no regulada de CD70/CD27 puede contribuir a los trastornos inmunologicos y, en humanos, los datos experimentales tambien apuntan hacia una posible regulacion anormal de la via de CD70/CD27 en los trastornos inmunitarios mediados por T^hicomo, por ejemplo, artritis reumatoide, psoriasis y esclerosis multiple. Es de particular interes que CD70 se exprese en una variedad de celulas transformadas que incluyen linfoma B, celulas Hodgkin y Reed-Sternberg, celulas malignas de origen neural y varios carcinomas.

[0013] Varios grupos han demostrado el efecto inhibitorio de mAb anti-CD70 tanto en modelos in vitro de activacion de linfocitos como en modelos animales de respuestas mediadas por Thi. El enfoque se ha centrado en el uso de anticuerpos para bloquear la via de coestimulacion de CD70/CD27 para lograr una eficacia terapeutica. Sin embargo, una deficiencia principal de tal enfoque es el gran numero de receptores de senalizacion, por ejemplo, la via co-estimuladora CD28/CD80/CD86, conocida por participar en enfermedades inmunologicas. En consecuencia, el bloqueo de una via de senalizacion espedfica solo puede tener un impacto mmimo en el desarrollo de la enfermedad. Esto esta respaldado por las observaciones de que el mAb anti-CD70 solo puede inhibir parcialmente la activacion de celulas T in vitro inducida por celulas estimuladoras alogenicas (Hintzen et al., 1995, supra) y un mAb anti-CD70 no mostro eficacia terapeutica en EAE una vez que la enfermedad esta establecida (Nakajima et al., 2000, supra).

[0014] Por lo tanto, existe la necesidad en la tecnica de desarrollar un enfoque para agotar o inhibir el crecimiento de celulas que expresan CD70 implicadas en canceres y/o enfermedades inmunologicas por medios distintos o ademas de bloquear la interaccion CD70/CD27. Al expresarse CD70 en la superficie del antfgeno maduro que presenta celulas dendnticas, celulas T activadas y celulas B activadas, los agentes que pueden atacar e inhibir o agotar las celulas CD70 pueden demostrar ser efectivos en la eliminacion de celulas presentadoras de antfgenos que presentan autoantigenos y autorreactivos. Las celulas T o B activadas, asf como las celulas tumorales que expresan CD70.

[0015] Los enfoques que se han usado para aumentar la eficacia terapeutica de los anticuerpos son radiomarcaje y combinacion con quimioterapia; sin embargo, estos enfoques incluyen asociados con efectos secundarios indeseables. Por ejemplo, la terapia isotopica esta asociada con la mielosupresion (Witzig, 2001, Cancer Chemother Pharmacol 48 (Suppl 1): S91-5), y la combinacion de terapia con anticuerpos y quimioterapeuticos esta asociada con la inmunosupresion. Ademas, las sustancias marcadas con isotopos son diffciles de producir, y los pacientes a menudo experimentan recafdas despues del tratamiento inicial con sustancias marcadas con isotopos.

[0016] El documento WO2004/073656 describe anticuerpos anti-CD70 conjugados con un agente citotoxico, en particular dolastatinas. El conjugado se forma mediante la union covalente de un compuesto citotoxico de maleimida a una cistema del anticuerpo.

[0017] Por consiguiente, existe la necesidad de ADC anti-CD70 que se construyan de tal manera que sean capaces de ejercer un efecto citotoxico, citostatico o inmunosupresor clmicamente util sobre celulas que expresan CD70, particularmente sin ejercer efectos indeseables sobre celulas que expresan CD70. Tales compuestos senan agentes terapeuticos utiles contra los canceres que expresan CD70 o trastornos inmunitarios que estan mediados por las celulas que expresan CD70. Mas recientemente, se han identificado MAbs como 2H5. Por lo tanto, se necesitan conjugados de anticuerpo-farmaco de anti-CD70 que pueden utilizarse para imagenes, diagnosticos y/o usos terapeuticos. La presente invencion proporciona dichos conjugados anticuerpo-farmaco para uso en inmunologfa y oncologfa.

RESUMEN DE LA INVENCION

[0018] En el presente documento se describen anticuerpos anti-CD70 unidos a restos toxicos a traves de uno o mas aminoacidos no naturales con uno o mas enlazadores, y metodos para elaborar tales aminoacidos y polipeptidos no naturales.

[0019] Algunas realizaciones de la presente invencion proporcionan un anticuerpo anti-CD70 que comprende uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD70 comprende un aminoacido no codificado de forma natural. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD70 comprende dos aminoacidos no codificados de forma natural. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD70 comprende dos o mas aminoacidos no codificados de forma natural. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD70 comprende 3, 4, 5 o 6 aminoacidos mas codificados de forma no natural o mas modificaciones postraduccionales. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD70 comprende la secuencia de la cadena pesada dada en la SEQ ID NO. 1. En algunas realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo anti-CD70 comprende las SEQ ID NO. 1 y 2. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD70 esta unido a un enlazador, polfmero o molecula biologicamente activa. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD70 esta unido a un enlazador, polfmero o molecula biologicamente activa a traves de un aminoacido no codificado de forma natural en el anticuerpo anti-CD70.

[0020] La presente invencion proporciona un compuesto que comprende la Formula (VIII) o (IX) en donde el compuesto es un anticuerpo aCD70 conjugado con una dolastatina, en donde la conjugacion se produce a traves de un aminoacido no codificado de forma natural en el anticuerpo, en donde Formula (VIII) y (IX) corresponden a:

en donde:

A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno inferior, heteroalquileno inferior, heterocicloalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno; heterarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido;

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- donde K es 1, 2 o 3, -S(O)K(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(0)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R>N=N- y -C (R > N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo anti-CD70 (aCD70),

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 1, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 1 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural, o

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 10, en donde el aminoacido 122 de la SEQ ID NO. 10 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; o

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 17. en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 17 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural;

R3 y R4 son cada uno independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo;

Z tiene la estructura de:

R5 es H, CO²H, Alquilo C¹-C^{6 0}tiazol;

R6 es OH o H;

RA es fenilo o piridina;

R7 es Alquilo C¹-C⁶o hidrogeno;

L es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en -alquileno-, -alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-(CH²)n-NHC(O)-(CH²)n'-C(Me)²-S-S-(CH²)n"-NHC(O)-(alquileno-O)n'-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W-, -alquileno-C(O)-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(O)-, y -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-;

W tiene la estructura de:

U tiene la estructura de:

y

cada n, n', n', n''' y n"" son independientemente enteros mayores o iguales a uno;

o un metabolite activo, o un profarmaco o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo.

[0021] En algunas realizaciones, R¹es un polipeptido. En realizaciones espedficas, el polipeptido es un anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es anti-CD70. En otras realizaciones, R²es un polipeptido. En realizaciones espedficas, el polipeptido es un anticuerpo anti-CD70. En ciertas realizaciones espedficas, el anticuerpo es CD70-2H5-HA119-NCA1.

[0022] La presente invencion tambien proporciona un compuesto, o sal del mismo, que comprende la Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), en donde el compuesto es un anticuerpo aCD70 conjugado con una dolastatina, en donde la conjugacion se produce a traves de un aminoacido no codificado de forma natural en el anticuerpo en el que las formulas (X), (XI), (XII) y (XIII) corresponden a:

en donde:

A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido,

heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido;

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)^k- donde K es 1, 2 o 3, -S(0)^k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)^kN (R)”)-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R>N=N-, y -C(R')²-N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo aCD70,

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 1, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 1 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural, o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 10, en donde el aminoacido 122 de la SEQ ID NO. 10 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 17. en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 17 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; R³y R⁴son cada uno independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o R³y R⁴o dos grupos R³forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo;

Z tiene la estructura de:

R⁵es H, CO²H, alquilo C¹-C⁶o tiazol;

R⁶es OH o H;

Ar es fenilo o piridina;

R⁷es Alquilo C¹-C⁶o hidrogeno;

L¹, L², L³y L⁴son cada uno de ellos enlazadores seleccionados independientemente del grupo que consiste en un enlace, alquileno, -(alquileno-O)n-alquileno-J-, alquileno'-J-(alquileno-O)n-alquileno-, -J-(alquileno-O)nalquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-(alquileno-O)n-alquileno-J'-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno'-, -W-, -alquileno-W-, alquileno'-J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J-alquileno-NMealquileno'-NMe-alquileno'-W-, y -alquileno-J-alquileno'-NMe-alquileno'-NMe-alquileno'''-W-;

W tiene la estructura de:

cada J y J' independientemente tienen la estructura de:

y

cada n y n' son independientemente numeros enteros mayores o iguales a uno.

[0023] En algunas realizaciones, Ri es un polipeptido. En realizaciones espedficas, el polipeptido es un anticuerpo. En ciertas realizaciones espedficas, el anticuerpo es herceptina. En otras realizaciones, R²es un polipeptido. En realizaciones espedficas, el polipeptido es un anticuerpo. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es aCD70. En algunas realizaciones, el anticuerpo se deriva de cualquier anticuerpo aCD70 conocido. En ciertas realizaciones espedficas, el anticuerpo es ARX-aCD70.

[0024] La invencion tambien proporciona un metodo para derivar un analogo de dolastatina que comprende la Formula (I), (III), (IV), (V) o (VI), en donde el analogo de dolastatina derivatizado es un anticuerpo aCD70 conjugado con una dolastatina, en donde la conjugacion ocurre a traves de un aminoacido no codificado naturalmente en el anticuerpo, en donde el metodo comprende poner en contacto el analogo de dolastatina con un reactivo de Formula (XXXVII), en donde la Formula (I), (III), (IV), (V)), o (VI) corresponden a:

Ċ

en donde:

Z tiene la estructura de:

Rs es OH o -NH-(alquileno-O)n-NH²;

R6 es OH o H;

Ar es fenilo o piridina;

R⁷es alquilo C¹-C⁶o hidrogeno;

Y es NH²-O- y V es NH²-O-;

L, Li, L², L³y L⁴son cada uno de los enlazadores seleccionados del grupo que consiste en un enlace, alquileno, alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno) O)n-alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-(CH²)n-NHC(O)-(CH²)n-C(Me)²-S- S-(CH²)n" -NHC(O)-(alquileno-o)n""-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W-, -alquileno-C(O)-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-, alquileno’-J-(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno’, -J-(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-(alquileno-O)n-alquileno-J’-, -W-, alquileno-W-, alquileno’-J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, y J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-; -J-alquileno-NMe-alquileno’-NMe-alquileno’-W- y alquileno-J-alquileno’-NMe-alquileno’-NMe-alquileno’’’-W-;

W tiene la estructura de:

U tiene la estructura de:

cada J y J’ independientemente tienen la estructura de:

o L esta ausente, Y es metilo, R⁵es COR8 y Rg es -NH-(alquileno-O)n-NH²; y

cada n, n’, n”, n....y n’’’’ son independientemente enteros mayores o iguales a uno;

en donde Formula (XXXVII) corresponde a:

en donde:

A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido;

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, - S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- donde k es 1,2 o 3, -S(O)k (alquileno o sustituido alquileno)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)^kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)^kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')²-N=N-, y -C(R')²-N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

K es

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

R¹y/o R²es un anticuerpo aCD70,

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 17. en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 17 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; y

R³y R⁴son cada uno independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o R³y R⁴o dos grupos R³forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo.

[0025] En algunas realizaciones, el analogo de dolastatina derivatizado comprende al menos un aminoacido que contiene oxima que tiene la estructura de Formula (VIII), (IX), (X), (XI), (XII) o (XIII):

En realizaciones espedficas, el analogo de dolastatina se pone en contacto con el reactivo de Formula (XXXVII) en solucion acuosa en condiciones ligeramente acidas.

[0026] En ciertas realizaciones, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende cualquiera de los compuestos descritos y un vedculo, excipiente o aglutinante farmaceuticamente aceptable.

[0027] En realizaciones adicionales o alternativas se encuentran metodos para detectar la presencia de un polipeptido en un paciente, el metodo que comprende administrar un polipeptido que comprende al menos un aminoacido no natural que contiene heterociclo y el polipeptido de aminoacido no natural que contiene heterociclo resultante modula la inmunogenicidad del polipeptido en relacion con el polipeptido de aminoacido de origen natural homologo.

[0028] Debe entenderse que los metodos y composiciones descritas en este documento no se limitan a la metodologfa, protocolos, lmeas celulares, construcciones y reactivos particulares descritos en este documento y, como tales, pueden variar. Tambien debe entenderse que la terminologfa utilizada en este documento tiene el proposito de describir solo realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de los metodos y composiciones descritas en este documento, que estaran limitados solo por las reivindicaciones adjuntas.

[0029] Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", “una”, "el" y "ella" incluyen una referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0030] A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que pertenecen las invenciones descritas en el presente documento. Aunque cualquier metodo, dispositivo y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden usar en la practica o en el ensayo de las invenciones aqrn descritas, ahora se describen los metodos, dispositivos y materiales preferidos.

[0031] Las expresiones "enlace basado en aldol" o "enlace basado en aldol mixto" se refieren a la condensacion catalizada por acido o base de un compuesto carbonilo con el enolato/enol de otro compuesto carbonilo, que puede o no ser lo mismo, para generar un compuesto p-hidroxicarbonilo-un aldol.

[0032] El termino "etiqueta de afinidad", como se usa en este documento, se refiere a una etiqueta que se une de forma reversible o irreversible a otra molecula, ya sea para modificarla, destruirla o formar un compuesto con ella. A modo de ejemplo, las etiquetas de afinidad incluyen enzimas y sus sustratos, o anticuerpos y sus antigenos.

[0033] Los terminos "alcoxi", "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) se usan en su sentido convencional, y se refieren a aquellos grupos alquilo unidos a moleculas a traves de un atomo de oxfgeno, un grupo amino o un atomo de azufre. respectivamente.

[0034] El termino "alquilo", por sf mismo o como parte de otra molecula, significa, a menos que se indique lo contrario, un radical de hidrocarburo dclico o de cadena lineal o ramificada, o una combinacion de los mismos, que puede estar completamente saturado, mono o poliinsaturado y puede incluir radicales di y multivalentes, que tienen el numero de atomos de carbono designados (es decir, C¹-C¹⁰significa de uno a diez carbonos). Los ejemplos de radicales hidrocarbonados saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-Butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexilo)metilo, ciclopropilmetilo, homologos e isomeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o mas enlaces dobles o enlaces triples. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo y los homologos e isomeros superiores. El termino "alquilo", a menos que se indique lo contrario, tambien pretende incluir aquellos derivados de alquilo definidos con mas detalle en el presente documento, tales como "heteroalquilo", "haloalquilo” y "homoalquilo".

[0035] El termino "alquileno" por sf mismo o como parte de otra molecula significa un radical divalente derivado de un alcano, como se ejemplifica, por (-CH²-)n, en donde n puede ser de 1 a aproximadamente 24. Solo a modo de ejemplo, tales grupos incluyen, pero no se limitan a, grupos que tienen 10 o menos atomos de carbono tales como las estructuras -CH²CH²- y -CH²CH²CH²CH²-. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena mas corta, que generalmente tiene ocho o menos atomos de carbono.

[0036] El termino "alquileno", a menos que se indique lo contrario, tambien pretende incluir aquellos grupos descritos en el presente documento como "heteroalquileno". El termino "aminoacido" se refiere a aminoacidos naturales y no naturales, asf como a analogos de aminoacidos y mimeticos de aminoacidos que funcionan de manera similar a los aminoacidos naturales. Los aminoacidos codificados naturalmente son los 20 aminoacidos comunes (alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistema, glutamina, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina) y pirolisina y selenocistema. Los analogos de aminoacidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura qmmica basica que un aminoacido natural, solo a modo de ejemplo, un a-carbono que esta unido a un hidrogeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R. Dichos analogos pueden tener grupos R modificados (a modo de ejemplo, norleucina) o pueden tener esqueletos peptfdicos modificados mientras aun conservan la misma estructura qmmica basica que un aminoacido natural. Los ejemplos no limitantes de analogos de aminoacidos incluyen homoserina, norleucina, sulfoxido de metionina, sulfonio de metilo de metionina.

[0037] Se puede hacer referencia a los aminoacidos en el presente documento ya sea por su nombre, sus sfmbolos de tres letras conocidos comunmente o por los sfmbolos de una letra recomendados por la Comision de Nomenclatura Bioqmmica IUPAC-IUB. Ademas, los nucleotidos pueden ser referidos por sus codigos de una sola letra comunmente aceptados.

[0038] Un "grupo de modificacion del termino amino" se refiere a cualquier molecula que puede unirse a un grupo amino terminal. A modo de ejemplo, dichos grupos amino terminales pueden estar en el extremo de las moleculas polimericas, en donde tales moleculas polimericas incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos, polinucleotidos y polisacaridos. Los grupos de modificacion del termino incluyen, pero no se limitan a, diversos polfmeros, peptidos o protemas solubles en agua. Solo a modo de ejemplo, los grupos de modificacion terminal incluyen polietilenglicol o albumina serica. Los grupos de modificacion terminal se pueden usar para modificar las caractensticas terapeuticas de la molecula polimerica, que incluyen, entre otros, el aumento de la vida media en suero de los peptidos.

[0039] Por "anticuerpo" en el presente documento se entiende una protema que consiste en uno o mas polipeptidos sustancialmente codificados por la totalidad o parte de los genes del anticuerpo. Los genes de inmunoglobulina incluyen, pero no se limitan a, los genes de region constante kappa, lambda, alfa, gamma (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), delta, epsilon y mu, asf como los innumerables genes de la region variable de inmunoglobulina. El anticuerpo en este documento pretende incluir anticuerpos de longitud completa y fragmentos de anticuerpos, e incluye anticuerpos que existen naturalmente en cualquier organismo o estan disenados (por ejemplo, son variantes).

[0040] El termino "anticuerpo" se refiere a anticuerpos intactos, anticuerpos monoclonales o policlonales. El termino "anticuerpo" tambien abarca anticuerpos multiespedficos tales como anticuerpos biespedficos. Los anticuerpos humanos generalmente estan formados por dos cadenas ligeras y dos pesadas que comprenden regiones variables y regiones constantes. La region variable de la cadena ligera comprende 3 CDR, identificadas aqm como CDRL1, CDRL2 y CDRL3 flanqueadas por regiones marco. La region variable de la cadena pesada comprende 3 CDR, identificadas aqm como CDRH1, CDRH2 y CDRH3 flanqueadas por regiones marco.

[0041] Los anticuerpos anti-CD70 conocidos en la tecnica son adecuados para uso con esta invencion. Los ejemplos no limitantes de anticuerpos incluyen los anticuerpos monoclonales 2H5, 10B4, 8B5, 18E7. 69A7. 69A7Y y 1F4, y las secuencias de aminoacidos se dan en la solicitud de patente publicada de EE.UU. 20100150950. Las secuencias de aminoacidos VH de 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y y 1F4 se muestran en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 73 y 6, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos Vl de 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y y 1F4 se muestran en las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 11 y 12, respectivamente, de la solicitud de patente publicada de EE.UU.

20100150950 (con 69A7 y 69A7Y que tienen la secuencia de aminoacidos V^lde la SEQ ID NO: 11). Cualquier secuencia de cadena pesada conocida puede combinarse con secuencias de cadena ligera y en algunas realizaciones de la presente invencion hay un aminoacido no codificado de forma natural en la region constante de los anticuerpos. En algunas realizaciones de la presente invencion, hay dos o mas aminoacidos no codificados de forma natural en la region constante de los anticuerpos. Por consiguiente, en un aspecto, esta descripcion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o parte de union a antfgeno del mismo que comprende:

(a) una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 73; y

(b) una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 8, 9, l0, 11 y 12; y

(c) un aminoacido no codificado de forma natural; en el que el anticuerpo se une espedficamente a CD70.

[0042] Los anticuerpos anti-CD70 (aCD70) conocidos en la tecnica son adecuados para su uso en la presente invencion. Por ejemplo, las secuencias para el anticuerpo 2H5 se dan en la patente de EE.UU. 8.124.738.

[0043] El termino "fragmento de union a antigeno", como se usa en el presente documento, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse a un antigeno. Se ha demostrado que la funcion de union a antigeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de union abarcados dentro del termino "fragmento de union a antigeno" de un anticuerpo incluye (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Cm; (ii) un fragmento F(ab')², un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Cm; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio V^h; (vi) una region determinante de complementariedad aislada (CDR), por ejemplo, V^hCDR3 que comprende o no una secuencia adicional (enlazador, region(es) marco etc.) y (v) una combinacion de dos a seis CDR aisladas que comprenden o no una secuencia adicional (enlazador, region(s) marco, etc.). Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V^ly V^h, estan codificados por genes separados, se pueden unir, usando metodos recombinantes, mediante un enlazador sintetico que les permita fabricarse como una sola cadena polipeptfdica en la que Vl y Vh se unen para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv); ver, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl Acad Sci. EE.UU.

85: 5879-5883). Tambien se pretende que tales anticuerpos de cadena unica esten abarcados dentro del termino "fragmento de union a antfgeno" de un anticuerpo. Ademas, los fragmentos de union a antfgeno incluyen protemas de fusion de inmunoglobulina de dominio de union que comprenden (i) un polipeptido de dominio de union (como una region variable de cadena pesada, una region variable de cadena ligera o una region variable de cadena pesada fusionada a una region variable de cadena ligera a traves de un peptido enlazador) que se fusiona a un polipeptido de region bisagra de inmunoglobulina, (ii) una region constante CH²de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a la region bisagra, y (iii) una region constante CH³de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a la region constante CH². La region bisagra puede modificarse reemplazando uno o mas residuos de cistema con residuos de serina para evitar la dimerizacion. Dichas protemas de fusion de inmunoglobulina de dominio de union se describen adicionalmente en los documentos US 2003/0118592 y US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica, y los fragmentos se examinan para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

[0044] Un sitio de union a antfgeno tfpico comprende las regiones variables formadas por el emparejamiento de una inmunoglobulina de cadena ligera y una inmunoglobulina de cadena pesada. La estructura de las regiones variables del anticuerpo es muy consistente y exhibe estructuras muy similares. Estas regiones variables estan compuestas tfpicamente por regiones marco relativamente homologas (FR) interpuestas con tres regiones hipervariables denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR). La actividad de union global del fragmento de union a antfgeno a menudo esta dictada por la secuencia de las CDR. Los FR a menudo desempenan un papel en el posicionamiento y la alineacion adecuados en tres dimensiones de las CDR para la union optima del antfgeno.

[0045] De hecho, debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoria de las interacciones anticuerpo-antfgeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que muestran las propiedades de los anticuerpos naturales espedficos mediante la construccion de vectores de expresion que incluyen secuencias CDR del anticuerpo natural espedfico injertado en secuencias marco de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (ver, por ejemplo, Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332: 323-327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321: 522-525; y Queen, C, et al., 1989, Proc. Natl. Acad. See. EE.UU. 86: 10029-10033). Dichas secuencias marco se pueden obtener a partir de bases de datos publicas de ADN que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la lmea germinal. Estas secuencias de lmeas germinales diferiran de las secuencias de genes de anticuerpos maduros porque no incluiran genes variables completamente ensamblados, que se forman por la union de V(D)J durante la maduracion de celulas B. Las secuencias de genes de la lmea germinal tambien diferiran de las secuencias de un anticuerpo de repertorio secundario de alta afinidad que contiene mutaciones en todo el gen variable, pero generalmente se agrupan en las CDR. Por ejemplo, las mutaciones somaticas son relativamente infrecuentes en la porcion amino terminal de la region estructural 1 y en la porcion carboxi terminal de la region estructural 4, Ademas, muchas mutaciones somaticas no alteran significativamente las propiedades de union del anticuerpo. Por esta razon, no es necesario obtener la secuencia completa de ADN de un anticuerpo particular para recrear un anticuerpo recombinante intacto que tenga propiedades de union similares a las del anticuerpo original. La secuencia parcial de las cadenas pesada y ligera que abarca las regiones CDR suele ser suficiente para este proposito. La secuencia parcial se usa para determinar que variable de la lmea germinal y que segmentos de genes de union contribuyeron a los genes de la variable del anticuerpo recombinado. La secuencia de la lmea germinal se usa para completar las partes faltantes de las regiones variables. Las secuencias lfder de las cadenas pesada y ligera se escinden durante la maduracion de la protema y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Para agregar secuencias faltantes, las secuencias de ADNc clonadas se pueden combinar con oligonucleotidos sinteticos mediante ligacion o amplificacion por PCR. Alternativamente, la region variable completa se puede sintetizar para crear un clon de region variable completamente sintetico. Este proceso tiene ciertas ventajas, como la eliminacion o inclusion de sitios de restriccion particulares, u optimizacion de codones particulares.

[0046] Por supuesto, la totalidad o las porciones de la region marco del anticuerpo descrito en el presente documento se pueden usar junto con las CDR para optimizar la afinidad, especificidad o cualquier otra propiedad deseada del anticuerpo. Por ”anticuerpo" en el presente documento se entiende una protema que consiste en uno o mas polipeptidos sustancialmente codificados por la totalidad o parte de los genes del anticuerpo. Los genes de inmunoglobulina incluyen, pero no se limitan a, los genes de region constante kappa, lambda, alfa, gamma (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), delta, epsilon y mu, asf como los innumerables genes de la region variable de inmunoglobulina. El anticuerpo en este documento pretende incluir anticuerpos de longitud completa y fragmentos de anticuerpos, e incluye anticuerpos que existen naturalmente en cualquier organismo o estan disenados (por ejemplo, son variantes).

[0047] Por “fragmento de anticuerpo" se entiende cualquier forma de un anticuerpo que no sea la forma de longitud completa. Los fragmentos de anticuerpos en este documento incluyen anticuerpos que son componentes mas pequenos que existen dentro de los anticuerpos de longitud completa, y los anticuerpos que se han disenado. Los fragmentos de anticuerpos incluyen, entre otros, Fv, Fc, Fab y (Fab')2, Fv de cadena simple (scFv), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos tnbridos bifuncionales, CDR1, CDR2, CDR3, combinaciones de CDR, regiones variables, regiones marco, regiones constantes, cadenas pesadas, cadenas ligeras y regiones variables, y moleculas de andamiaje alternativas sin anticuerpos, y anticuerpos biespedficos (Maynard y Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2: 339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 395-402). Otra subestructura funcional es una Fv de una sola cadena (scFv), que comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, conectadas covalentemente por un conector peptfdico (Sz Hu et al., 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061). Estas protemas pequenas (Mr 25.000) generalmente retienen la especificidad y afinidad por el antfgeno en un solo polipeptido y pueden proporcionar un bloque de construccion conveniente para moleculas mas grandes, espedficas de antfgeno. A menos que se indique espedficamente lo contrario, las declaraciones y afirmaciones que usan el termino "anticuerpo" o "anticuerpos" incluyen espedficamente "fragmento de anticuerpo" y "fragmentos de anticuerpo".

[0048] Por “conjugado de anticuerpo-farmaco", o “ADC”, como se usa en este documento, se refiere a una molecula de anticuerpo, o fragmento de la misma, que esta unida covalentemente a una o mas moleculas biologicamente activas. La molecula biologicamente activa puede ser conjugada al anticuerpo a traves de un enlazador, polfmero u otro enlace covalente.

[0049] El termino "aromatico" o "arilo", como se usa en el presente documento, se refiere a una estructura de anillo cerrado que tiene al menos un anillo que tiene un sistema de electrones pi conjugado e incluye grupos de arilo carbodclico y arilo heterodclico (o "heteroarilo" o "heteroaromaticos"). El grupo aromatico carbodclico o heterodclico puede contener de 5 a 20 atomos en el anillo. El termino incluye anillos monodclicos unidos covalentemente o anillos polidclicos fusionados (es decir, anillos que comparten pares adyacentes de atomos de carbono). Un grupo aromatico puede estar sin sustituir o sustituido. Los ejemplos no limitantes de grupos "aromaticos" o "arilo" incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, antracenilo y fenantracenilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillo arilo y heteroarilo indicados anteriormente se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables descritos en el presente documento.

[0050] Para mayor brevedad, el termino "aromatico" o "arilo" cuando se usa en combinacion con otros terminos (incluidos, entre otros, ariloxi, ariltioxi, aralquilo) incluye anillos arilo y heteroarilo como se definio anteriormente. Por lo tanto, el termino "aralquilo” o "alcarilo" pretende incluir aquellos radicales en los que un grupo arilo esta unido a un grupo alquilo (incluidos, entre otros, bencilo, fenetilo y piridilmetilo), incluidos los grupos alquilo en los que un atomo de carbono (incluyendo pero no limitado a, un grupo metileno) ha sido reemplazado por un heteroatomo, solo a modo de ejemplo, por un atomo de oxfgeno. Los ejemplos de tales grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenoximetilo, 2-piridilximetilo y 3-(1-naftiloxi)propilo.

[0051] El termino "arileno", como se usa en el presente documento, se refiere a un radical arilo divalente. Los ejemplos no limitantes de "arileno" incluyen fenileno, piridinileno, pirimidinileno y tiofenileno. Los sustituyentes para grupos arileno se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables descritos en el presente documento.

[0052] Un "polfmero bifuncional", tambien denominado "enlazador bifuncional", se refiere a un polfmero que comprende dos grupos funcionales que son capaces de reaccionar espedficamente con otros restos para formar enlaces covalentes o no covalentes. Dichos restos pueden incluir, pero no se limitan a, los grupos laterales en aminoacidos naturales o no naturales o peptidos que contienen tales aminoacidos naturales o no naturales. Los otros restos que pueden estar enlazados al enlazador bifuncional o polfmero bifuncional pueden ser restos iguales o diferentes. Solo a modo de ejemplo, un enlazador bifuncional puede tener un grupo funcional reactivo con un grupo en un primer peptido, y otro grupo funcional que es reactivo con un grupo en un segundo peptido, formando un conjugado que incluye el primer peptido, el bifuncional enlazador y el segundo peptido. Se conocen muchos procedimientos y moleculas enlazadoras para la union de diversos compuestos a peptidos. Vease, por ejemplo, la solicitud de patente europea N° 188.256; las patentes de EE.UU. N° 4.671.958, 4.659.839, 4.414.148, 4.699.784; 4.680.338; y 4.569.789. Un "poffmero multifuncional", tambien denominado "enlazador multifuncional", se refiere a un poffmero que comprende dos o mas grupos funcionales que son capaces de reaccionar con otros restos. Tales fracciones pueden incluir, pero

no se limitan a los grupos laterales en aminoacidos naturales o no naturales o peptidos que contienen tales aminoacidos naturales o no naturales (incluyendo pero no limitado a, grupos laterales de aminoacidos) para formar enlaces covalentes o no covalentes. Un poffmero bifuncional o un poffmero multifuncional puede tener cualquier longitud o peso molecular deseados, y puede seleccionarse para proporcionar una separacion o conformacion deseada particular entre una o mas moleculas unidas a un compuesto y las moleculas a las que se une o al compuesto.

[0053] El termino "biodisponibilidad", como se usa en el presente documento, se refiere a la velocidad y el grado en que una sustancia o su resto activo se libera de una forma de dosificacion farmaceutica y esta disponible en el sitio de accion o en la circulacion general. El aumento de la biodisponibilidad se refiere al aumento de la velocidad y el grado en que una sustancia o su resto activo se administra desde una forma de dosificacion farmaceutica y esta disponible en el sitio de accion o en la circulacion general. A modo de ejemplo, un aumento en la biodisponibilidad se puede indicar como un aumento en la concentracion de la sustancia o su resto activo en la sangre cuando se compara con otras sustancias o restos activos. Un ejemplo no limitativo de un metodo para evaluar los incrementos en la biodisponibilidad se da en los ejemplos 21-25. Este metodo se puede utilizar para evaluar la biodisponibilidad de cualquier polipeptido.

[0054] El termino "molecula biologicamente activa", "grupo biologicamente activo" o "agente biologicamente activo" cuando se usa aqrn significa cualquier sustancia que pueda afectar a cualquier propiedad ffsica o bioqmmica de un sistema biologico, via, molecula o interaccion relacionada con un organismo, incluidos, entre otros, virus, bacterias, bacteriofagos, transposones, priones, insectos, hongos, plantas, animales y seres humanos. En particular, como se usa en este documento, las moleculas biologicamente activas incluyen, pero no se limitan a, cualquier sustancia destinada para el diagnostico, cura, mitigacion, tratamiento o prevencion de enfermedades en humanos u otros animales, o para mejorar el bienestar ffsico o mental de los humanos o animales. Los ejemplos de moleculas biologicamente activas incluyen, entre otros, peptidos, protemas, enzimas, farmacos de moleculas pequenas, farmacos duros, farmacos blandos, profarmacos, hidratos de carbono, atomos o moleculas inorganicos, colorantes, ffpidos, nucleosidos, radionuclidos, oligonucleotidos, toxinas, celulas, virus, liposomas, micropartmulas y micelas. Las clases de agentes biologicamente activos que son adecuados para su uso con los metodos y composiciones descritas en este documento incluyen, entre otros, medicamentos, profarmacos, radionuclidos, agentes de imagen, poffmeros, antibioticos, fungicidas, agentes antivirales, agentes antiinflamatorios, agentes antitumorales, agentes cardiovasculares, agentes contra la ansiedad, hormonas, factores de crecimiento, agentes esteroideos y toxinas derivadas de los microbios.

[0055] Por “actividad biologica moduladora" se entiende aumentar o disminuir la reactividad de un polipeptido, alterar la selectividad del polipeptido, aumentar o disminuir la selectividad del sustrato del polipeptido. El analisis de la actividad biologica modificada se puede realizar comparando la actividad biologica del polipeptido no natural con la del polipeptido natural.

[0056] El termino "biomaterial", como se usa en el presente documento, se refiere a un material derivado biologicamente, que incluye, entre otros, material obtenido de biorreactores y/o metodos y tecnicas recombinantes.

[0057] El termino "sonda bioffsica", como se usa en el presente documento, se refiere a las sondas que pueden detectar o monitorear cambios estructurales en las moleculas. Dichas moleculas incluyen, pero no se limitan a, protemas y la "sonda bioffsica" se puede usar para detectar o monitorear la interaccion de protemas con otras macromoleculas. Los ejemplos de sondas bioffsicas incluyen, pero no se limitan a, marcadores de espm, fluoroforos y grupos fotoactivables.

[0058] El termino "biosinteticamente", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier metodo que utiliza un sistema de traduccion (celular o no celular), incluido el uso de al menos uno de los siguientes componentes: un polinucleotido, un codon, un ARNt y un ribosoma. A modo de ejemplo, los aminoacidos no naturales pueden ser "incorporados biosinteticamente" en polipeptidos de aminoacidos no naturales utilizando los metodos y tecnicas descritos aqrn, "Generacion de polipeptidos in vivo que comprenden aminoacidos no naturales", y en ejemplo no limitativo 20. Ademas, los metodos para la seleccion de aminoacidos no naturales utiles que pueden ser "incorporados biosinteticamente" en polipeptidos de aminoacidos no naturales se describen en los ejemplos no limitativos 20.

[0059] El termino "analogo de biotina", o tambien denominado "imitador de biotina", como se usa en este documento, es cualquier molecula, distinta de la biotina, que se une con alta afinidad a la avidina y/o estreptavidina.

[0060] El termino "carbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo que contiene un resto que selecciona del grupo que consiste en -C(O)-, -S(O)-, -S(O)2- y -C(S)-, incluidos, entre otros, grupos que contienen al menos un grupo cetona y/o al menos un grupo aldetndo, y/o al menos un grupo ester, y/o al menos un grupo acido carboxflico, y/o al menos un grupo tioester. Tales grupos carbonilo incluyen cetonas, aldetndos, acidos carbox^licos, esteres y tioesteres. Ademas, dichos grupos pueden ser parte de moleculas lineales, ramificadas o dclicas.

[0061] El termino "grupo de modificacion del extremo carboxi" se refiere a cualquier molecula que puede unirse a un grupo carboxi terminal. A modo de ejemplo, dichos grupos carboxi terminales pueden estar en el extremo de las moleculas polimericas, en donde dichas moleculas polimericas incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos, polinucleotidos y polisacaridos. Los grupos de modificacion del termino incluyen, pero no se limitan a, diversos polfmeros, peptidos o protemas solubles en agua. Solo a modo de ejemplo, los grupos de modificacion terminal incluyen polietilenglicol o albumina serica. Los grupos de modificacion terminal se pueden usar para modificar las caractensticas terapeuticas de la molecula polimerica, incluyendo, entre otros, aumentar la vida media en suero de los peptidos.

[0062] El termino "grupo qmmicamente escindible", tambien denominado "qmmicamente labil", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo que se rompe o escinde tras la exposicion a acido, base, agentes oxidantes, agentes reductores, iniciadores qmmicos o iniciadores radicales.

[0063] El termino "grupo quimioluminiscente", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo que emite luz como resultado de una reaccion qmmica sin la adicion de calor. Solo a modo de ejemplo, el luminol (5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalaziniona) reacciona con oxidantes como el peroxido de hidrogeno (H²O²) en presencia de una base y un catalizador metalico para producir un producto en estado excitado (3-aminoftalato, 3-APA).

[0064] El termino "cromoforo", como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula que absorbe luz de longitudes de onda visibles, longitudes de onda UV o longitudes de onda IR.

[0065] El termino "cofactor", como se usa en el presente documento, se refiere a un atomo o molecula esencial para la accion de una molecula grande. Los cofactores incluyen, pero no se limitan a, iones inorganicos, coenzimas, protemas o algun otro factor necesario para la actividad de las enzimas. Los ejemplos incluyen hemo en hemoglobina, magnesio en clorofila e iones metalicos para protemas.

[0066] "Coplegamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a procesos de replegamiento, reacciones o metodos que emplean al menos dos moleculas que interactuan entre sf y dan como resultado la transformacion de moleculas desplegadas o plegadas incorrectamente en moleculas adecuadamente plegadas, por medio de solo el ejemplo, "coplegamiento", emplea al menos dos polipeptidos que interactuan entre sf y dan como resultado la transformacion de polipeptidos desplegados o plegados incorrectamente en polipeptidos nativos, correctamente plegados. Dichos polipeptidos pueden contener aminoacidos naturales y/o al menos un aminoacido no natural.

[0067] Una "ventana de comparacion", como se usa en este documento, se refiere a un segmento de cualquiera de las posiciones contiguas usadas para comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo numero de posiciones contiguas despues de que las dos secuencias estan alineadas de manera optima. Dichas posiciones contiguas incluyen, pero no se limitan a un grupo que consta de aproximadamente 20 a aproximadamente 600 unidades secuenciales, incluidas aproximadamente 50 a aproximadamente 200 unidades secuenciales, y aproximadamente 100 a aproximadamente 150 unidades secuenciales. A modo de ejemplo, tales secuencias incluyen polipeptidos y polipeptidos que contienen aminoacidos no naturales, con las unidades secuenciales incluyen, pero no se limitan a aminoacidos naturales y no naturales. Ademas, solo a modo de ejemplo, tales secuencias incluyen polinucleotidos con nucleotidos que son las unidades secuenciales correspondientes. Los metodos de alineacion de secuencias para comparacion son bien conocidos en la tecnica. La alineacion optima de las secuencias para la comparacion se puede realizar, entre otras, mediante el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman (1970) Adv. Apl. Mates. 2: 482c, por el algoritmo de alineacion de homologfa de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, por el metodo de busqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat”l. Acad Sci. EE.UU. 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de genetica de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por alineacion manual e inspeccion visual (ver, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (suplemento de 1995)).

[0068] A modo de ejemplo, un algoritmo que se puede usar para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res, 25: 3389-3402, y Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente, el software para realizar analisis de BLAST esta disponible publicamente a traves del Centro Nacional de Informacion Biotecnologica. Los parametros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineacion. El programa BLASTN (para secuencias de nucleotidos) utiliza como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M = 5, N = -4 y una comparacion de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoacidos, el programa BLASTP utiliza como valor predeterminado una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 10915) alineaciones (b) de 50, expectativa (e) de 10, M = 5, N = -4, y una comparacion de ambas cadenas. El algoritmo BLAST se realiza normalmente con el filtro de "baja complejidad" desactivado.

[0069] El algoritmo BLAST tambien realiza un analisis estad^stico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 5873-5787), una medida de similitud proporcionada por El algoritmo BLAST es la probabilidad de suma mas pequena (P(N)), que proporciona una indicacion de la probabilidad por la cual una coincidencia entre dos secuencias de nucleotidos o aminoacidos se producina por casualidad. Por ejemplo, un acido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma mas pequena en una comparacion del acido nucleico de prueba con el acido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,2, o menor que aproximadamente 0,01, o menor que aproximadamente 0,001.

[0070] El termino "variantes modificadas de manera conservativa" se aplica a aminoacidos tanto naturales como no naturales y a secuencias de acidos nucleicos naturales y no naturales, y combinaciones de las mismas. Con respecto a las secuencias de acido nucleico particulares, "variantes modificadas de manera conservativa" se refiere a aquellos acidos nucleicos naturales y no naturales que codifican secuencias de aminoacidos naturales y no naturales identicas o esencialmente identicas, o donde el acido nucleico natural y no natural no codifica una secuencia de aminoacidos natural y no natural, a secuencias esencialmente identicas. A modo de ejemplo, debido a la degeneracion del codigo genetico, un gran numero de acidos nucleicos funcionalmente identicos codifican cualquier protema dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoacido alanina. Por lo tanto, en cada posicion donde se especifica una alanina por un codon, el codon puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipeptido codificado. Dichas variaciones de acido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas conservativamente. Asf, a modo de ejemplo, cada secuencia de acido nucleico natural o no natural en el presente documento que codifica un polipeptido natural o no natural tambien describe cada posible variacion silenciosa del acido nucleico natural o no natural. Un experto en la tecnica reconocera que cada codon en un acido nucleico natural o no natural (excepto AUG, que normalmente es el unico codon para metionina, y TGG, que normalmente es el unico codon para triptofano) se puede modificar para producir una molecula funcionalmente identica. Por consiguiente, cada variacion silenciosa de un acido nucleico natural y no natural que codifica un polipeptido natural y no natural esta implfcita en cada secuencia descrita.

[0071] En cuanto a las secuencias de aminoacidos, sustituciones individuales, deleciones o adiciones a un acido nucleico, peptido, polipeptido o secuencia de protema que altera, agrega o elimina un solo aminoacido natural y no natural o un pequeno porcentaje de y los aminoacidos no naturales en la secuencia codificada son una "variante modificada conservativamente" en la que la alteracion produce la eliminacion de un aminoacido, la adicion de un aminoacido o la sustitucion de un aminoacido natural y no natural por aminoacidos qmmicos similares. Las tablas de sustitucion conservativa que proporcionan aminoacidos naturales funcionalmente similares son bien conocidas en la tecnica. Tales variantes modificadas de manera conservativa son ademas y no excluyen variantes polimorficas, homologos interespecies y alelos de los metodos y composiciones descritas en este documento.

[0072] Las tablas de sustitucion conservativa que proporcionan aminoacidos funcionalmente similares son conocidas por los expertos en la tecnica. Los siguientes ocho grupos contienen aminoacidos que son sustituciones conservativas entre sf:

1) Alanina (A), Glicina (G);

2) Acido aspartico (D), Acido glutamico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W);

7) Serina(s), Treonina (T); y

8) Cistema (C), Metionina (M)

(ver, por ejemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (WH Freeman & Co.; 2a edicion (diciembre de 1993).

[0073] Los terminos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", por sf mismos o en combinacion con otros terminos, representan, a menos que se indique lo contrario, las versiones dclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Por lo tanto, un cicloalquilo o heterocicloalquilo incluyen enlaces anulares saturados, parcialmente insaturados y completamente insaturados. Ademas, para heterocicloalquilo, un heteratoma puede ocupar la posicion en la que el heterociclo esta unido al resto de la molecula. El heteroatomo puede incluir, pero no se limita a, oxfgeno, nitrogeno o azufre. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, y cicloheptilo. Los ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridilo), 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofurano-2-ilo, tetrahidrofurano-3-ilo, tetrahidrotieno-2-ilo, tetrahidrotieno-3-ilo, 1 -piperazinilo y 2-piperazinilo. Adicionalmente, el termino abarca estructuras multidclicas, que incluyen, entre otras, estructuras de anillos bidclicos y tridclicos. De manera similar, el termino "heterocicloalquileno" por sf mismo o como parte de otra molecula significa un radical divalente derivado de heterocicloalquilo, y el termino "cicloalquileno" por s^ mismo o como parte de otra molecula significa un radical divalente derivado de cicloalquilo.

[0074] El termino "ciclodextrina", como se usa en el presente documento, se refiere a carbohidratos dclicos que consisten en al menos seis a ocho moleculas de glucosa en una formacion de anillo. La parte exterior del anillo contiene grupos solubles en agua; en el centro del anillo hay una cavidad relativamente no polar capaz de acomodar moleculas pequenas.

[0075] El termino "citotoxico", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que dana las celulas.

[0076] "Agente desnaturalizante" o "desnaturalizante", como se usa en este documento, se refiere a cualquier compuesto o material que causara un despliegue reversible de un polfmero. Solo a modo de ejemplo, el "agente desnaturalizante" o "desnaturalizantes" puede causar un despliegue reversible de una protema. La fuerza de un agente desnaturalizante o desnaturalizante se determinara tanto por las propiedades como por la concentracion del agente desnaturalizante particular o desnaturalizante. A modo de ejemplo, los agentes desnaturalizantes o desnaturalizantes incluyen, pero no se limitan a, caotropos, detergentes, disolventes organicos, miscibles con agua, fosfolfpidos, o una combinacion de los mismos. Los ejemplos no limitantes de caotropos incluyen, entre otros, urea, guanidina y tiocianato de sodio. Los ejemplos no limitantes de detergentes pueden incluir, entre otros, detergentes fuertes como el dodecilo sulfato de sodio o los eteres de polioxietileno (por ejemplo, detergentes Tween o Triton), Sarkosyl, detergentes suaves no ionicos (por ejemplo, digitonina), detergentes cationicos suaves.

tales como N-> 2,3-(Dioleyoxi)-propilo-N,N,N-trimetilamonio, detergentes ionicos suaves (por ejemplo, colato de sodio o desoxicolato de sodio) o detergentes bipolares, que incluyen, entre otros, sulfobetamas (Zwittergent), 3-(3-cloridopropilo)dimetilamonio-1-propano sulfato (CHAPS), y 3-(3-cloidopropilo)dimetilamonio-2-hidroxi-1-propano sulfonato (CHAPSO). Los ejemplos no limitantes de disolventes organicos miscibles con agua incluyen, entre otros, acetonitrilo, alcanoles inferiores (especialmente alcanoles C2 - C4 como etanol o isopropanol), o alcandioles inferiores (alcandioles C2 - C4 como etilenglicol) pueden utilizarse como desnaturalizantes. Los ejemplos no limitantes de fosfolfpidos incluyen, pero no se limitan a, fosfolfpidos naturales, tales como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidilinositol o derivados de fosfolfpidos sinteticos o variantes tales como dihexanoilfosfatidilcolina o diheptanoilfosfatidilcolina.

[0077] El termino "funcionalidad deseada", como se usa en este documento, se refiere a cualquier grupo seleccionado de una etiqueta; un tinte, un polfmero, un polfmero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un reticulador fotografico; un compuesto citotoxico; una droga; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda protema o polipeptido o analogo de polipeptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelante de metal; un cofactor; un acido graso; un carbohidrato; un polinucleotido; un ADN; un ARN; un polinucleotido antisentido; un sacarido, un dendnmero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartmula; una etiqueta de giro; un fluoroforo; un resto que contiene metal; una fraccion radiactiva; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactua covalente o no covalentemente con otras moleculas; un resto fotocurado; una fraccion excitable de radiacion actmica; un ligando un resto fotoisomerizable; biotina un analogo de biotina; un resto que incorpora un atomo pesado; un grupo qmmicamente escindible; un grupo fotoescalable; una cadena lateral alargada; un azucar ligado al carbono; un agente redox activo; un amino tioacido; un resto toxico; un resto isotopicamente marcado; una sonda bioffsica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnetico; un grupo intercalante; un cromoforo un agente de transferencia de energfa; un agente biologicamente activo (en cuyo caso, el agente biologicamente activo puede incluir un agente con actividad terapeutica y el polipeptido de aminoacido no natural o aminoacido no natural modificado puede servir como agente co-terapeutico con el agente terapeutico adjunto o como un medio para administrar el agente terapeutico a un sitio deseado dentro de un organismo); una etiqueta detectable; una pequena molecula; un inhibidor de acido ribonucleico; un radionucleotido; un agente de captura de neutrones; un derivado de la biotina; puntos cuanticos); un nanotransmisor; un radiotransmisor, un abzima, un activador complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglicano, un alergano, un angiostatina, un antihormona, un antioxidante, un aptamero, un ARN gma, una saponina, un vector lanzadera, una macromolecula, un mimotopo, un receptor, una micela inversa, y cualquier combinacion de los mismos.

[0078] El termino "diamina", como se usa en el presente documento, se refiere a grupos/moleculas que comprenden al menos dos grupos funcionales amina, que incluyen, entre otros, un grupo hidrazina, un grupo amidina, un grupo imina, un grupo 1,1-diamina, un grupo 1,2-diamina, un grupo 1,3-diamina y un grupo 1,4-diamina. Ademas, dichos grupos pueden ser parte de moleculas lineales, ramificadas o dclicas.

[0079] El termino "etiqueta detectable", como se usa en el presente documento, se refiere a una etiqueta que puede observarse utilizando tecnicas analtticas que incluyen, entre otras, fluorescencia, quimioluminiscencia, resonancia de espm de electrones, espectroscopfa de absorbancia ultravioleta/visible, espectrometna de masas, resonancia nuclear magnetica, resonancia magnetica y metodos electroqmmicos.

[0080] El termino "dicarbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo que contiene al menos dos restos seleccionados del grupo que consiste en -C(O)-, -S(O)-, -S(O)²-, y C(S)-, incluidos, entre otros, grupos 1,2-dicarbonilo, grupos 1,3-dicarbonilo y grupos 1,4-dicarbonilo, y grupos que contienen al menos un grupo cetona, y/o al menos un grupo aldetndo, y/o al menos un grupo ester, y/o al menos un grupo acido carboxflico, y/o al menos un grupo tioester. Dichos grupos dicarbonilo incluyen dicetonas, cetoaldetndos, cetoacidos, cetoesteres y cetotioesteres. Ademas, dichos grupos pueden ser parte de moleculas lineales, ramificadas o dclicas. Los dos restos en el grupo dicarbonilo pueden ser iguales o diferentes, y pueden incluir sustituyentes que producinan, solo a modo de ejemplo, un ester, una cetona, un aldetndo, un tioester o una amida, en cualquiera de los dos restos.

[0081] El termino "farmaco", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier sustancia utilizada en la prevencion, diagnostico, alivio, tratamiento o cura de una enfermedad o afeccion.

[0082] El termino "colorante", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia colorante soluble que contiene un cromoforo.

[0083] El termino "cantidad efectiva", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad suficiente de un agente o un compuesto que se esta administrado que aliviara en cierta medida uno o mas de los smtomas de la enfermedad o afeccion que se esta tratando. El resultado puede ser la reduccion y/o el alivio de los signos, smtomas o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteracion deseada de un sistema biologico. A modo de ejemplo, un agente o un compuesto que se administra incluye, pero no se limita a, un polipeptido de aminoacido natural, polipeptido de aminoacido no natural, polipeptido de aminoacido natural modificado o polipeptido de no aminoacido modificado. Las composiciones que contienen tales polipeptidos de aminoacidos naturales, polipeptidos de aminoacidos no naturales, polipeptidos de aminoacidos naturales modificados, o polipeptidos de aminoacidos no naturales modificados pueden administrarse para tratamientos profilacticos, potenciadores y/o terapeuticos. Una cantidad "efectiva" apropiada en cualquier caso individual puede determinarse utilizando tecnicas, como un estudio de aumento de dosis.

[0084] El termino "grupo denso de electrones", como se usa en este documento, se refiere a un grupo que dispersa electrones cuando se irradia con un haz de electrones. Dichos grupos incluyen, pero no se limitan a, molibdato de amonio, subnitrato de bismuto yoduro de cadmio, 99%, carbohidracida, hexahidrato de cloruro ferrico, hexametilentetramina, 98,5%, tricloruro de indio anhidro, nitrato de lantano, trihidrato de acetato de plomo, trihidrato de citrato de plomo, nitrato de plomo, acido periodico, acido fosfomolfbdico, acido fosfotungstico, ferricianuro de potasio, ferrocianuro de potasio, rojo de rutenio, nitrato de plata, proteinato de plata (ensayo de Ag: 8,0-8,5%) "Fuerte", tetrafenilporfina de plata (S-TPPS), cloroaurato de sodio, tungstato de sodio, nitrato de talio, tiosemicarbazida (TSC), acetato de uranilo, nitrato de uranilo y sulfato de vanadilo.

[0085] El termino "agente de transferencia de energfa", como se usa en este documento, se refiere a una molecula que puede donar o aceptar energfa de otra molecula. Solo a modo de ejemplo, la transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia (FRET) es un proceso de acoplamiento dipolo-dipolo mediante el cual la energfa del estado excitado de una molecula donante de fluorescencia se transfiere de manera no radiativa a una molecula aceptora no excitada que luego emite fluorescentemente la energfa donada a una longitud de onda mas larga.

[0086] Los terminos "potenciar" o "potenciado" significan aumentar o prolongar, en potencia o duracion, un efecto deseado. A modo de ejemplo, "potenciar" el efecto de los agentes terapeuticos se refiere a la capacidad de aumentar o prolongar, ya sea en potencia o en duracion, el efecto de los agentes terapeuticos durante el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afeccion. Una "cantidad de mejora de la eficacia", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad adecuada para mejorar el efecto de un agente terapeutico en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afeccion. Cuando se utiliza en un paciente, las cantidades efectivas para este uso dependeran de la gravedad y el curso de la enfermedad, trastorno o afeccion, la terapia previa, el estado de salud del paciente y la respuesta a los medicamentos, y el criterio del medico tratante.

[0087] Como se usa en el presente documento, el termino "eucariota" se refiere a organismos que pertenecen al dominio filogenetico Eucarya, que incluyen pero no se limitan a animales (incluidos, entre otros, mairnferos, insectos, reptiles, aves, etc.), ciliados, plantas (incluidos, entre otros, monocots, dicots y algas), hongos, levaduras, flagelados, microsporidios y protistas.

[0088] El termino "acido graso", como se usa en el presente documento, se refiere a acidos carboxflicos con una cadena lateral de hidrocarburo aproximadamente C6 o mas larga.

[0089] El termino "fluoroforo", como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula que, por excitacion, emite fotones y, por lo tanto, es fluorescente.

[0090] Los terminos "grupo funcional", "grupo activo", "grupo activador", "grupo saliente", "sitio reactivo", "grupo qmmicamente reactivo" y "grupo qmmicamente reactivo", como se usan en este documento, se refieren a porciones o unidades de una molecula en la que se producen reacciones qrnmicas. Los terminos son en cierto modo sinonimos en las tecnicas qrnmicas y se usan en este documento para indicar las porciones de moleculas que realizan alguna funcion o actividad y son reactivas con otras moleculas.

[0091] El termino “halogeno” incluye fluor, cloro, yodo y bromo.

[0092] El termino "haloacilo", como se usa en el presente documento, se refiere a grupos acilo que contienen restos halogenos, que incluyen, pero no se limitan a, -C(O)CH³, -C(O)CF³, y -C(O)CH²OCH³,

[0093] El termino "haloalquilo", como se usa en este documento, se refiere a grupos alquilo que contienen restos de halogeno, que incluyen, pero no se limitan a, -CF³y -CH²CF³,

[0094] El termino "heteroalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a la cadena lineal o ramificada, o radicales hidrocarbonados dclicos, o combinaciones de los mismos, que consiste en un grupo alquilo y al menos un heteroatomo seleccionado del grupo que consiste en O, N, Si y S, y en donde los atomos de nitrogeno y azufre pueden estar oxidados opcionalmente y el heteroatomo de nitrogeno puede estar opcionalmente cuaternizado. El (los) heteroatomo(s) O, N y S y Si pueden colocarse en cualquier posicion interior del grupo heteroalquilo o en la posicion en la que el grupo alquilo esta unido al resto de la molecula. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)²-CH³, -CH=CH-O-CH³, -Si(CH³)³, -CH²-CH=N-OCH³, y -CH=CH-N(CH³)-CH³, Ademas, hasta dos heteroatomos pueden ser consecutivos, como, por ejemplo, -CH²-NH-OCH³y -CH²-O-Si(CH³)³,

[0095] Los terminos "enlace basado en heterodclico" o "enlace heterociclo" se refieren a un resto formado a partir de la reaccion de un grupo dicarbonilo con un grupo diamina. El producto de reaccion resultante es un heterociclo, que incluye un grupo heteroarilo o un grupo heterocicloalquilo. El grupo heterociclo resultante sirve como un enlace qmmico entre un aminoacido no natural o un polipeptido de aminoacido no natural y otro grupo funcional. En una realizacion, el enlace heterociclo incluye un enlace heterociclo que contiene nitrogeno, incluyendo a modo de ejemplo solo un enlace pirazol, un enlace pirrol, un enlace indol, un enlace benzodiazepina y un enlace pirazalona.

[0096] De manera similar, el termino "heteroalquileno" se refiere a un radical divalente derivado de heteroalquilo, como se ejemplifica, pero no se limita a, -CH²-CH²-S²-CH²- y -CH²-S-CH²-CH²-NH-CH²-. Para los grupos heteroalquileno, los mismos o diferentes heteroatomos tambien pueden ocupar uno o ambos de los extremos de la cadena (incluidos, entre otros, alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquilendiamino y aminooxialquileno). Aun mas, para los grupos de enlace alquileno y heteroalquileno, ninguna orientacion del grupo de enlace esta implicada por la direccion en la que esta escrita la formula del grupo de enlace. A modo de ejemplo, la formula -C(O)²R'-representa tanto -C(O)²R'- como -R'C(O)²-.

[0097] El termino "heteroarilo" o "heteroaromatico", como se usa en el presente documento, se refiere a grupos arilo que contienen al menos un heteroatomo seleccionado de N, O y S; en donde los atomos de nitrogeno y azufre pueden estar oxidados opcionalmente, y el atomo de nitrogeno puede estar opcionalmente cuaternizado. Los grupos heteroarilo pueden estar sustituidos o no sustituidos. Un grupo heteroarilo puede unirse al resto de la molecula a traves de un heteroatomo. Los ejemplos no limitantes de grupos heteroarilo incluyen 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenilo-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1 -isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo, y 6-quinolilo.

[0098] El termino "homoalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a grupos alquilo que son grupos hidrocarburo.

[0099] El termino "identico", como se usa en el presente documento, se refiere a dos o mas secuencias o subsecuencias que son iguales. Ademas, el termino "sustancialmente identico", como se usa en este documento, se refiere a dos o mas secuencias que tienen un porcentaje de unidades secuenciales que son iguales cuando se comparan y alinean para obtener una correspondencia maxima en una ventana de comparacion, o region designada segun lo medido usando algoritmos de comparacion o por alineacion manual e inspeccion visual. Solo a modo de ejemplo, dos o mas secuencias pueden ser "sustancialmente identicas" si las unidades secuenciales son aproximadamente 60% identicas, aproximadamente 65% identicas, aproximadamente 70% identicas, aproximadamente 75% identicas, aproximadamente 80% identicas, aproximadamente 85% identicas, aproximadamente el 90% identicas, o aproximadamente 95% identicas en una region espedfica. Tales porcentajes para describir el "porcentaje de identidad" de dos o mas secuencias. La identidad de una secuencia puede existir sobre una region que tiene al menos aproximadamente 75-100 unidades secuenciales de longitud, sobre una region que tiene aproximadamente 50 unidades secuenciales de longitud, o, cuando no se especifique, en toda la secuencia. Esta definicion tambien se refiere al complemento de una secuencia de prueba. Solo a modo de ejemplo, dos o mas secuencias polipeptfdicas son identicas cuando los residuos de aminoacidos son iguales, mientras que dos o mas secuencias polipeptfdicas son "sustancialmente identicas" si los residuos de aminoacidos son aproximadamente 60% identicas, aproximadamente 65% identicas, aproximadamente 70% identicas, aproximadamente 75% identicas, aproximadamente 80%

identicas, aproximadamente 85% identicas, aproximadamente 90% identicas, o aproximadamente 95% identicas en una region espedfica. La identidad puede existir sobre una region que tiene al menos aproximadamente 75 a aproximadamente 100 aminoacidos de longitud, sobre una region que tiene aproximadamente 50 aminoacidos de longitud, o, cuando no se especifica, a traves de la secuencia completa de una secuencia polipeptfdica, solo a modo de ejemplo, dos o mas secuencias de polinucleotidos son identicas cuando los residuos de acido nucleico son iguales, mientras que dos o mas secuencias de polinucleotidos son "sustancialmente identicas" si los residuos de acido nucleico son aproximadamente el 60% identicos, aproximadamente el 65% identicos, aproximadamente el 70% identicos, aproximadamente el 75% identico, aproximadamente el 80% identico, aproximadamente el 85% identico, aproximadamente el 90% identico, o aproximadamente el 95% identico en una region espedfica. La identidad puede existir sobre una region que tiene al menos aproximadamente 75 a aproximadamente 100 acidos nucleicos de longitud, sobre una region que tiene aproximadamente 50 acidos nucleicos de longitud, o, cuando no se especifica, a traves de la secuencia completa de una secuencia de polinucleotidos.

[0100] Para la comparacion de secuencias, tfpicamente una secuencia actua como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de prueba y referencia se ingresan en una computadora, las coordenadas de la subsecuencia se designan, si es necesario, y se designan los parametros del programa de algoritmo de secuencia. Se pueden usar los parametros predeterminados del programa, o se pueden designar parametros alternativos. El algoritmo de comparacion de secuencia calcula luego el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba en relacion con la secuencia de referencia, en funcion de los parametros del programa.

[0101] El termino "inmunogenicidad", como se usa en el presente documento, se refiere a una respuesta de anticuerpos a la administracion de un farmaco terapeutico. La inmunogenicidad frente a polipeptidos de aminoacidos no naturales terapeuticos puede obtenerse utilizando ensayos cuantitativos y cualitativos para la deteccion de anticuerpos de polipeptidos de aminoacidos no naturales en fluidos biologicos. Dichos ensayos incluyen, pero no se limitan a, radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo luminiscente (LIA) e inmunoensayo fluorescente (FIA). El analisis de la inmunogenicidad hacia polipeptidos de aminoacidos no naturales terapeuticos implica comparar la respuesta de anticuerpos en la administracion de polipeptidos de aminoacidos no naturales terapeuticos con la respuesta de anticuerpos en la administracion de polipeptidos de aminoacidos naturales terapeuticos.

[0102] El termino "agente de intercalacion", tambien denominado "grupo de intercalacion", como se usa en el presente documento, se refiere a un producto qmmico que se puede insertar en el espacio intramolecular de una molecula o el espacio intermolecular entre las moleculas. A modo de ejemplo, solo un agente o grupo intercalador puede ser una molecula que se inserta en las bases apiladas de la doble helice del ADN.

[0103] El termino "aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a separar y eliminar un componente de interes de componentes que no son de interes. Las sustancias aisladas pueden estar en estado seco o semiseco, o en solucion, incluyendo pero sin limitarse a una solucion acuosa. El componente aislado puede estar en un estado homogeneo o el componente aislado puede ser parte de una composicion farmaceutica que comprende vehmulos y/o excipientes farmaceuticamente aceptables adicionales. La pureza y la homogeneidad se pueden determinar utilizando tecnicas de qmmica analftica que incluyen, entre otras, electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatograffa lfquida de alto rendimiento. Ademas, cuando un componente de interes se afsla y es la especie predominante presente en una preparacion, el componente se describe aqm como sustancialmente purificado. El termino "purificado", como se usa en este documento, puede referirse a un componente de interes que es al menos un 85% puro, al menos un 90% puro, al menos un 95% puro, al menos un 99% o mas puro. Solo a modo de ejemplo, los acidos nucleicos o protemas se "aislan" cuando dichos acidos nucleicos o protemas estan libres de al menos algunos de los componentes celulares con los que esta asociado en el estado natural, o cuando el acido nucleico o la protema se han concentrado a un nivel mayor que la concentracion de su produccion in vivo o in vitro, tambien, a modo de ejemplo, se afsla un gen cuando se separa de los marcos de lectura abiertos que flanquean el gen y codifican una protema distinta del gen de interes.

[0104] El termino "etiqueta", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que se incorpora a un compuesto y se detecta facilmente, por lo que su distribucion ffsica se puede detectar y/o monitorear.

[0105] El termino "enlace", como se usa en este documento para referirse a enlaces o restos qmmicos formados a partir de una reaccion qmmica entre el grupo funcional de un enlazador y otra molecula. Tales enlaces pueden incluir, pero no estan limitados a, enlaces covalentes y enlaces no covalentes, mientras que tales restos qmmicos pueden incluir, pero no estan limitados a, esteres, carbonatos, esteres de fosfato de iminas, hidrazonas, acetales, ortoesteres, enlaces peptfdicos y enlaces oligonucleotidicos. Los enlaces hidroltticamente estables significan que los enlaces son sustancialmente estables en el agua y no reaccionan con el agua a valores de pH utiles, que incluyen, entre otros, condiciones fisiologicas durante un penodo prolongado de tiempo, tal vez incluso indefinidamente. Los enlaces hidroltticamente inestables o degradables significan que los enlaces son degradables en agua o en soluciones acuosas, incluyendo, por ejemplo, sangre. Los enlaces enzimaticamente inestables o degradables significa que el enlace puede ser degradado por una o mas enzimas. Solo a modo de ejemplo, PEG y polfmeros relacionados pueden incluir enlaces degradables en el esqueleto polimerico o en el grupo enlazador entre el esqueleto polimerico y uno o mas de los grupos funcionales terminales de la molecula de polfmero. Tales enlaces degradables incluyen, pero no se limitan a, enlaces ester formados por la reaccion de acidos carboxflicos PEG o acidos carboxflicos PEG activados con grupos alcohol en un agente biologicamente activo, en donde dichos grupos ester generalmente se hidrolizan bajo condiciones fisiologicas para liberar el agente biologicamente activo. Otros enlaces hidroltticamente degradables incluyen, entre otros, enlaces carbonato; los enlaces imina resultaron de la reaccion de una amina y un aldetndo; enlaces ester de fosfato formados por reaccion de un alcohol con un grupo fosfato; enlaces hidrazona que son producto de reaccion de una hidrazida y un aldetndo; enlaces acetal que son el producto de reaccion de un aldetndo y un alcohol; enlaces ortoester que son el producto de reaccion de un formato y un alcohol; enlaces peptidicos formados por un grupo amina, que incluyen pero no se limitan a, en un extremo de un polfmero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un peptido; y enlaces oligonucleotidicos formados por un grupo fosforamidita, que incluyen pero no se limitan al final de un polfmero, y un grupo hidroxilo 5' de un oligonucleotido.

[0106] Los terminos "medio" o "medios", como se usan en el presente documento, se refieren a cualquier medio de cultivo utilizado para cultivar y recolectar celulas y/o productos expresados y/o secretados por dichas celulas. Tales "medio" o "medios" incluyen, pero no se limitan a, soluciones, soportes solidos, semisolidos o ngidos que pueden soportar o contener cualquier celula huesped, incluidas, a modo de ejemplo, celulas huesped bacterianas, celulas huesped de levadura, celulas huesped de insecto, celulas huesped de planta, celulas huesped eucariotas, celulas huesped de mairnfero, celulas CHO, celulas huesped procarioticas, E. coli o celulas huesped de Pseudomonas, y contenido celular. Dicho "medio" o "medios" incluyen, pero no se limitan al medio o medios en que se ha desarrollado la celula huesped en la que se ha secretado un polipeptido, incluido el medio antes o despues de una etapa de proliferacion. Dichos "medio" o "medios" tambien incluyen, pero no se limitan a, tampones o reactivos que contienen lisados de celulas huesped, a modo de ejemplo, un polipeptido producido intracelularmente y las celulas huesped se lisan o se rompen para liberar el polipeptido.

[0107] El termino "metabolito", como se usa en el presente documento, se refiere a un derivado de un compuesto, a modo de ejemplo, un polipeptido de aminoacido natural, un polipeptido de aminoacido no natural, un polipeptido de aminoacido natural modificado o un polipeptido no modificado de aminoacido natural, que se forma cuando se metaboliza el compuesto, a modo de ejemplo polipeptido de aminoacido natural, polipeptido de aminoacido no natural, el polipeptido de aminoacido natural modificado, o el polipeptido de aminoacido no natural modificado. El termino "metabolito farmaceuticamente activo" o "metabolito activo" se refiere a un derivado biologicamente activo de un compuesto, a modo de ejemplo, un polipeptido de aminoacido natural, un polipeptido de aminoacido no natural, un polipeptido de aminoacido natural modificado o un polipeptido de aminoacido no modificado natural, que se forma cuando se metaboliza dicho compuesto, a modo de ejemplo, un polipeptido de aminoacido natural, polipeptido de aminoacido no natural, polipeptido de aminoacido natural modificado o polipeptido de aminoacido no natural modificado.

[0108] El termino "metabolizado", como se usa en el presente documento, se refiere a la suma de los procesos mediante los cuales un organismo modifica una sustancia en particular. Tales procesos incluyen, pero no se limitan a reacciones de hidrolisis y reacciones catalizadas por enzimas. Puede obtenerse mas informacion sobre el metabolismo en The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a Edicion, McGraw-Hill (1996). Solo a modo de ejemplo, los metabolitos de los polipeptidos de aminoacidos naturales, los polipeptidos de aminoacidos no naturales, los polipeptidos de aminoacidos naturales modificados o los polipeptidos de aminoacidos no naturales modificados pueden identificarse mediante la administracion de los polipeptidos de aminoacidos naturales, no naturales. polipeptidos de aminoacidos, polipeptidos de aminoacidos naturales modificados, o polipeptidos de aminoacidos no naturales modificados a un huesped y analisis de muestras de tejido del huesped, o por incubacion de polipeptidos de aminoacidos naturales, polipeptidos de aminoacidos no naturales, aminoacidos naturales modificados polipeptidos, o polipeptidos de aminoacidos no naturales modificados con celulas hepaticas in vitro y analisis de los compuestos resultantes.

[0109] El termino "quelante de metal", como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula que forma un complejo metalico con iones metalicos. A modo de ejemplo, tales moleculas pueden formar dos o mas enlaces de coordinacion con un ion metalico central y pueden formar estructuras anulares.

[0110] El termino "resto que contiene metal", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo que contiene un ion metalico, atomo o partfcula. Tales restos incluyen, pero no se limitan a, cisplatino, iones de metales quelados (tales como mquel, hierro y platino) y nanopartfculas metalicas (tales como mquel, hierro y platino).

[0111] El termino "resto que incorpora un atomo pesado", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo que incorpora un ion de atomo que suele ser mas pesado que el carbono. Dichos iones o atomos incluyen, entre otros, silicio, tungsteno, oro, plomo y uranio.

[0112] El termino "modificado", como se usa en el presente documento, se refiere a la presencia de un cambio en un aminoacido natural, un aminoacido no natural, un polipeptido de aminoacido natural o un polipeptido de aminoacido no natural. Dichos cambios, o modificaciones, pueden obtenerse mediante modificaciones posteriores a la smtesis de aminoacidos naturales, aminoacidos no naturales, polipeptidos de aminoacidos naturales o polipeptidos de aminoacidos no naturales, o por co-traduccion, o por modificacion postraduccional de aminoacidos naturales, aminoacidos no naturales, polipeptidos de aminoacidos naturales o polipeptidos de aminoacidos no naturales. La forma "modificada o no modificada" significa que el aminoacido natural, el aminoacido no natural, el polipeptido de aminoacido natural o el polipeptido de aminoacido no natural que se estan discutiendo estan opcionalmente modificados, es decir, el aminoacido natural, aminoacido no natural, el polipeptido de aminoacido natural o el polipeptido de aminoacido no natural en discusion pueden ser modificados o no modificados,

[0113] Como se usa en este documento, el termino "vida media en suero modulada" se refiere a cambios positivos o negativos en la vida media en circulacion de una molecula biologicamente activa modificada en relacion con su forma no modificada. A modo de ejemplo, la celula biologica modificada las moleculas activas incluyen, pero no se limitan a, aminoacidos naturales, aminoacidos no naturales, polipeptidos de aminoacidos naturales o polipeptidos de aminoacidos no naturales. A modo de ejemplo, la vida media en suero se mide tomando muestras de sangre en varios puntos de tiempo despues de la administracion de la molecula biologicamente activa o molecula modificada biologicamente activa, y determinando la concentracion de esa molecula en cada muestra. La correlacion de la concentracion serica con el tiempo permite el calculo de la vida media serica. A modo de ejemplo, la vida media en suero modulada puede ser un aumento en la vida media en suero, lo que puede permitir una mejora de los regfmenes de dosificacion o evitar efectos toxicos. Tales aumentos en el suero pueden ser al menos aproximadamente dos veces, al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cinco veces, o al menos aproximadamente diez veces. Los metodos para evaluar la vida media en suero son conocidos en la tecnica y se pueden usar para evaluar la vida media en suero de anticuerpos y conjugados de farmaco de anticuerpo de la presente invencion.

[0114] El termino "vida media terapeutica modulada", como se usa en este documento, se refiere a un cambio positivo o negativo en la vida media de la cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula biologicamente activa modificada, en relacion con su forma no modificada. A modo de ejemplo, las moleculas biologicamente activas modificadas incluyen, pero no se limitan a, aminoacidos naturales, aminoacidos no naturales, polipeptidos de aminoacidos naturales o polipeptidos de aminoacidos no naturales. A modo de ejemplo, la vida media terapeutica se mide midiendo las propiedades farmacocineticas y/o farmacodinamicas de la molecula en diversos puntos de tiempo despues de la administracion. El aumento de la vida media terapeutica puede permitir un regimen de dosificacion beneficioso particular, una dosis total beneficiosa particular, o evita un efecto no deseado. A modo de ejemplo, el aumento de la vida media terapeutica puede resultar de una mayor potencia, un aumento o disminucion de la union de la molecula modificada a su objetivo, un aumento o disminucion en otro parametro o mecanismo de accion de la molecula no modificada, o un aumento de o disminucion de la descomposicion de las moleculas por enzimas como, por ejemplo, solo proteasas. Los metodos para evaluar la vida media terapeutica son conocidos en la tecnica y se pueden usar para evaluar la vida media terapeutica de anticuerpos y conjugados de farmaco de anticuerpos de la presente invencion.

[0115] El termino "nanopartmula", como se usa en el presente documento, se refiere a una partmula que tiene un tamano de partmula entre aproximadamente 500 nm a aproximadamente 1 nm.

[0116] El termino "casi estequiometrico", como se usa en el presente documento, se refiere a la relacion de los moles de compuestos que participan en una reaccion qmmica que es de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 1,5.

[0117] Como se usa en el presente documento, el termino "no eucariotas" se refiere a organismos no eucariotas. A modo de ejemplo, un organismo no eucariotico puede pertenecer a las Eubacterias (que incluyen pero no se limitan a Escherichia coli, Thermus thermophilus o Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida), dominio filogenetico, o la Archaea, que incluye, pero no se limita a, Metanococcus jannaschii, Metanobacterium thermoautotrophicum, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshi o todas las personas que participan en este artfculo.

[0118] Un "aminoacido no natural" se refiere a un aminoacido que no es uno de los 20 aminoacidos comunes o pirolisina o selenocistema. Otros terminos que se pueden usar de manera sinonima con el termino "aminoacido no natural" son "aminoacido no codificado de forma natural", "aminoacido no natural", "aminoacido de origen no natural", versiones de los mismos. El termino "aminoacido no natural" incluye, pero no se limita a, aminoacidos que aparecen naturalmente por modificacion de un aminoacido codificado naturalmente (incluidos, entre otros, los 20 aminoacidos comunes o pirrolisina y selenocistema) pero no estan incorporados en una cadena polipeptfdica en crecimiento por el complejo de traduccion. Los ejemplos de aminoacidos naturales que no estan codificados naturalmente incluyen, entre otros, N-acetilglucosaminilo-L-serina, N-acetilglucosaminilo-L-treonina y O-fosfotirosina. Ademas, el termino "aminoacido no natural" incluye, pero no se limita a, aminoacidos que no se producen naturalmente y pueden obtenerse sinteticamente o pueden obtenerse por modificacion de aminoacidos no naturales.

[0119] El termino "acido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere a desoxirribonucleotidos, desoxirribonucleosidos, ribonucleosidos o ribonucleotidos y polfmeros de los mismos en forma de cadena sencilla o doble. Solo a modo de ejemplo, tales acidos nucleicos y polfmeros de acido nucleico incluyen, pero no se limitan a, (i) analogos de nucleotidos naturales que tienen propiedades de union similares a las del acido nucleico de referencia y se metabolizan de manera similar a los nucleotidos naturales; (ii) analogos de oligonucleotidos que incluyen, pero no se limitan a, ANP (acido peptidonucleico), analogos de ADN usados en tecnologfa antisentido (fosforotioatos, fosforoamidatos y similares); (iii) sus variantes modificadas de manera conservativa (incluidas, entre otras, las sustituciones de codones degenerados) y las secuencias complementarias y las secuencias explfcitamente indicadas. A modo de ejemplo, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr generando secuencias en las que la tercera posicion de uno o mas codones seleccionados (o todos) esta sustituida con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605 2608 (1985); y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)).

[0120] El termino "agente oxidante", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o material que es capaz de eliminar un electron de un compuesto que esta siendo oxidado. A modo de ejemplo, los agentes oxidantes incluyen, pero no se limitan a, glutation oxidado, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado y oxfgeno. Una amplia variedad de agentes oxidantes son adecuados para uso en los metodos y composiciones descritas en el presente documento.

[0121] El termino "farmaceuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a un material, que incluye pero no se limita a una sal, vehfculo o diluyente, que no anula la actividad o propiedades biologicas del compuesto, y es relativamente no toxico, es decir, el material puede administrarse a un individuo sin causar efectos biologicos indeseables o interactuar de manera perjudicial con cualquiera de los componentes de la composicion en la que esta contenido,

[0122] El termino "etiqueta de fotoafinidad", como se usa en el presente documento, se refiere a una etiqueta con un grupo que, al exponerse a la luz, forma un enlace con una molecula por la cual la etiqueta tiene una afinidad. Solo a modo de ejemplo, dicho enlace puede ser covalente o no covalente.

[0123] El termino "resto fotocurado", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo que, tras la iluminacion en ciertas longitudes de onda, se une de forma covalente o no covalente a otros iones o moleculas.

[0124] El termino "grupo fotoescindible", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo que se rompe tras la exposicion a la luz.

[0125] El termino "foto-reticulador", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que comprende dos o mas grupos funcionales que, al exponerse a la luz, son reactivos y forman un enlace covalente o no covalente con dos o mas moleculas monomericas o polimericas.

[0126] El termino "resto fotoisomerizable", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo en el que tras la iluminacion cambia la luz de una forma isomerica a otra.

[0127] El termino "polialquilenglicol", como se usa en el presente documento, se refiere a polioles polieter polimericos lineales o ramificados. Tales polialquilenglicoles, que incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol, polipropilenglicol, polibutilenglicol y derivados de los mismos. Otras realizaciones ejemplares se enumeran, por ejemplo, en catalogos de proveedores comerciales, como el catalogo de Shearwater Corporation "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001). Solo a modo de ejemplo, tales polioles polieter polimericos tienen pesos moleculares medios entre aproximadamente 0,1 kDa y aproximadamente 100 kDa. A modo de ejemplo, tales polioles polieter polimericos incluyen, pero no se limitan a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100.000 Da o mas. El peso molecular del polfmero puede estar entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100.000 Da, incluyendo pero no limitado a, aproximadamente 100.000 Da, aproximadamente 95.000 Da, aproximadamente 90.000 Da, aproximadamente 85.000 Da, aproximadamente 80.000 Da, aproximadamente 75.000 Da, aproximadamente 70.000 Da aproximadamente 65.000 Da, aproximadamente 60.000 Da, aproximadamente 55.000 Da, aproximadamente 50.000 Da, aproximadamente 45.000 Da, aproximadamente 40.000 Da, aproximadamente 35.000 Da, aproximadamente 30.000 Da, aproximadamente 25.000 Da, aproximadamente 20.000 Da, aproximadamente 15.000 Da, aproximadamente 10.000 Da, aproximadamente 9.000 Da, aproximadamente 8.000 Da, aproximadamente 7.000 Da, aproximadamente 6.000 Da, aproximadamente 5.000 Da, aproximadamente 4.000 Da, aproximadamente 3.000 Da, aproximadamente 2.000 Da, aproximadamente 1.000 Da, aproximadamente 900 Da, aproximadamente 800 Da, aproximadamente 700 Da, aproximadamente 600 Da, aproximadamente 500 Da, 400 Da, aproximadamente 300 Da, aproximadamente 200 Da y aproximadamente 100 Da En algunas realizaciones, el peso molecular del polfmero esta entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 50.000 Da. En algunas realizaciones, el peso molecular del polfmero esta entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 40.000 Da. En algunas realizaciones, el peso molecular del polfmero esta entre aproximadamente 1.000 Da y aproximadamente 40.000 Da. En algunas realizaciones, el peso molecular del polfmero esta entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 50.000 Da. En algunas realizaciones, el peso molecular del polfmero esta entre aproximadamente 5.000 Da y aproximadamente 40.000 Da. En algunas realizaciones, el peso molecular del polfmero esta entre aproximadamente 10.000 Da y aproximadamente 40.000 Da. En algunas realizaciones, la molecula de poli(etilenglicol) es un polfmero ramificado. El peso molecular del PEG de cadena ramificada puede estar entre aproximadamente 1.000 Da y aproximadamente 100.000 Da, incluidos, entre otros, aproximadamente 100.000 Da, aproximadamente 95.000 Da, aproximadamente 90.000 Da, aproximadamente 85.000 Da, aproximadamente 80.000 Da, aproximadamente 75.000 Da, aproximadamente 70.000 Da, aproximadamente 65.000 Da, aproximadamente 60.000 Da, aproximadamente 55.000 Da, aproximadamente 50.000 Da, aproximadamente 45.000 Da, aproximadamente 40.000 Da, aproximadamente 35.000 Da, aproximadamente 30.000 Da, aproximadamente 25.000 Da, aproximadamente 20.000 Da, aproximadamente 15.000 Da, aproximadamente 10.000 Da, aproximadamente 9.000 Da, aproximadamente 8.000 Da, aproximadamente 7.000 Da, aproximadamente 6.000 Da, aproximadamente 5.000 Da, aproximadamente 4.000 Da, aproximadamente 3.000 Da, aproximadamente 2.000 Da y aproximadamente 1.000 Da. En algunas realizaciones, el peso molecular del PEG de cadena ramificada esta entre aproximadamente 1.000 Da y aproximadamente 50.000 Da. En algunas realizaciones, el peso molecular del PEG de cadena ramificada esta entre aproximadamente 1.000 Da y aproximadamente 40.000 Da. En algunas realizaciones, el peso molecular del PEG de cadena ramificada esta entre aproximadamente 5.000 Da y aproximadamente 40.000 Da. En algunas realizaciones, el peso molecular del PEG de cadena ramificada esta entre aproximadamente 5.000 Da y aproximadamente 20.000 Da. En otras realizaciones, el peso molecular del PEG de cadena ramificada esta entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 50.000 Da.

[0128] El termino "polfmero", como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula compuesta por subunidades repetidas. Dichas moleculas incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos, polinucleotidos o polisacaridos o polialquilenglicoles.

[0129] Los terminos "polipeptido", "peptido" y "protema" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polfmero de residuos de aminoacidos. Es decir, una descripcion dirigida a un polipeptido se aplica igualmente a una descripcion de un peptido y una descripcion de una protema, y viceversa. Los terminos se aplican a los polfmeros de aminoacidos de origen natural, asf como a los polfmeros de aminoacidos en los que uno o mas residuos de aminoacidos son aminoacidos no naturales. Ademas, tales "polipeptidos", "peptidos" y "protemas" incluyen cadenas de aminoacidos de cualquier longitud, incluyendo protemas de longitud completa, en donde los residuos de aminoacidos estan unidos por enlaces peptfdicos covalentes.

[0130] El termino "modificado despues de la traduccion" se refiere a cualquier modificacion de un aminoacido natural o no natural que se produce despues de que dicho aminoacido se haya incorporado de forma translacional en una cadena polipeptfdica. Dichas modificaciones incluyen, entre otras, modificaciones co-traduccionales in vivo, modificaciones co-traduccionales in vitro (como en un sistema de traduccion libre de celulas), modificaciones postraduccionales in vivo y modificaciones postraduccionales in vitro.

[0131] Los terminos "profarmaco" o "profarmaco farmaceuticamente aceptable", como se usan en este documento, se refieren a un agente que se convierte en el farmaco principal in vivo o in vitro, en el que no anula la actividad biologica o las propiedades del farmaco original, y es relativamente no toxico, es decir, el material puede administrarse a un individuo sin causar efectos biologicos indeseables o interactuar de forma perjudicial con cualquiera de los componentes de la composicion en la que esta contenido. Los profarmacos son generalmente precursores de farmacos que, despues de la administracion a un sujeto y su posterior absorcion, se convierten en una especie activa o mas activa a traves de algun proceso, como la conversion por una ruta metabolica. Algunos profarmacos tienen un grupo qmmico presente en el profarmaco que lo hace menos activo y/o confiere solubilidad o alguna otra propiedad al farmaco. Una vez que el grupo qmmico se ha separado y/o modificado del profarmaco, se genera el farmaco activo. Los profarmacos se convierten en un farmaco activo dentro del cuerpo a traves de reacciones enzimaticas o no enzimaticas. Los profarmacos pueden proporcionar propiedades fisicoqmmicas mejoradas, como mejor solubilidad, caractensticas de administracion mejoradas, como dirigirse espedficamente a una celula, tejido, organo o ligando en particular, y valor terapeutico mejorado del medicamento. Los beneficios de tales profarmacos incluyen, entre otros, (i) facilidad de administracion en comparacion con el farmaco original; (ii) el profarmaco puede estar biodisponible por administracion oral, mientras que el progenitor no lo esta; y (iii) el profarmaco tambien puede tener una solubilidad mejorada en composiciones farmaceuticas en comparacion con el farmaco original. Un profarmaco incluye un derivado farmacologicamente inactivo o de actividad reducida de un farmaco activo. Los profarmacos pueden disenarse para modular la cantidad de un farmaco o molecula biologicamente activa que alcance un sitio de accion deseado mediante la manipulacion de las propiedades de un farmaco, como las propiedades fisicoqmmicas, biofarmaceuticas o farmacocineticas. Un ejemplo, sin limitacion, de un profarmaco sena un polipeptido de aminoacido no natural que se administra como un ester (el "profarmaco") para facilitar la transmision a traves de una membrana celular donde la solubilidad en agua es perjudicial para la movilidad pero que luego se hidroliza metabolicamente para el acido carboxflico, la entidad activa, una vez dentro de la celula donde la solubilidad en agua es beneficiosa. Los profarmacos pueden disenarse como derivados reversibles de medicamentos, para usarlos como modificadores para mejorar el transporte de medicamentos a tejidos espedficos del sitio.

[0132] El termino "cantidad profilacticamente eficaz", como se usa en este documento, se refiere a esa cantidad de una composicion que contiene al menos un polipeptido de aminoacido no natural o al menos un polipeptido de aminoacido no natural modificado aplicado profilacticamente a un paciente que aliviara en cierta medida uno o mas de los smtomas de una enfermedad, afeccion o trastorno que se trata. En tales aplicaciones profilacticas, tales cantidades pueden depender del estado de salud del paciente, peso, y similares. Se considera bien dentro de la experiencia de la tecnica que uno determine tales cantidades profilacticamente eficaces mediante experimentacion de rutina, que incluye, entre otros, un ensayo clmico de aumento de la dosis.

[0133] El termino "protegido", como se usa en el presente documento, se refiere a la presencia de un "grupo protector" o resto que previene la reaccion del grupo funcional qmmicamente reactivo bajo ciertas condiciones de reaccion. El grupo protector variara dependiendo del tipo de grupo qmmicamente reactivo que se este protegiendo. Solo a modo de ejemplo, (i) si el grupo qmmicamente reactivo es una amina o una hidrazida, el grupo protector se puede seleccionar entre terc-butilxicarbonilo (f-Boc) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc); (ii) si el grupo qmmicamente reactivo es un tiol, el grupo protector puede ser ortopididisulfuro; y (iii) si el grupo qmmicamente reactivo es un acido carboxflico, como el acido butanoico o propionico, o un grupo hidroxilo, el grupo protector puede ser bencilo o un grupo alquilo tal como metilo, etilo o terc-butilo.

[0134] Solo a modo de ejemplo, los grupos de bloqueo/proteccion pueden seleccionarse de:

[0135] Adicionalmente, los grupos protectores incluyen, entre otros, grupos fotolabiles como Nvoc y MeNvoc y otros grupos protectores conocidos en la tecnica. Otros grupos protectores se describen en Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a edicion, John Wiley & Sons, New York, NY, 1999.

[0136] El termino "resto radioactivo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo cuyos nucleos emiten espontaneamente radiacion nuclear, como partfculas alfa, beta o gamma; en donde, las partfculas alfa son nucleos de helio, las partfculas beta son electrones y las partfculas gamma son fotones de alta energfa.

[0137] El termino "compuesto reactivo", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que, en condiciones apropiadas, es reactivo hacia otro atomo, molecula o compuesto.

[0138] La expresion "celula huesped recombinante", tambien denominada "celula huesped", se refiere a una celula que incluye un polinucleotido exogeno, en donde los metodos utilizados para insertar el polinucleotido exogeno en una celula incluyen, entre otros, captacion directa, transduccion, apareamiento de celulas u otros metodos conocidos en la tecnica para crear celulas huesped recombinantes. Solo a modo de ejemplo, dicho polinucleotido exogeno puede ser un vector no integrado, que incluye pero no se limita a un plasmido, o puede integrarse en el genoma del huesped.

[0139] El termino "agente activo redox", como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula que oxida o reduce otra molecula, por lo que el agente activo redox se reduce u oxida. Los ejemplos de agente activo redox incluyen, pero no se limitan a, ferroceno, quinonas, complejos Ru2+/3+, complejos CO2+/3+y complejos OS2+/3+.

[0140] El termino "agente reductor", como se usa en este documento, se refiere a un compuesto o material que es capaz de agregar un electron a un compuesto que se esta reduciendo. A modo de ejemplo

los agentes reductores incluyen, pero no se limitan a, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, ditioeritritol, cistema, cistema (2-aminoetanotiol) y glutation reducido. Dichos agentes reductores pueden usarse, solo a modo de ejemplo, para mantener los grupos sulfhidrilo en el estado reducido y para reducir los enlaces disulfuro intra o intermoleculares.

[0141] El "replegamiento", como se usa en este documento, describe cualquier proceso, reaccion o metodo que transforma un estado plegado o desplegado incorrectamente en una conformacion nativa o plegada adecuadamente. Solo a modo de ejemplo, el replegamiento transforma el enlace disulfuro que contiene polipeptidos de un estado plegado o desplegado incorrectamente a una conformacion nativa o plegada correctamente con respecto a los enlaces disulfuro. Dichos polipeptidos que contienen enlaces disulfuro pueden ser polipeptidos de aminoacidos naturales o polipeptidos de aminoacidos no naturales.

[0142] El termino "resina", como se usa en el presente documento, se refiere a perlas de polfmero insoluble de alto peso molecular. A modo solo de ejemplo, tales perlas pueden usarse como soportes para la smtesis de peptidos en fase solida, o sitios para la union de moleculas antes de la purificacion.

[0143] El termino "sacarido", como se usa en el presente documento, se refiere a una serie de carbohidratos que incluyen, entre otros, azucares, monosacaridos, oligosacaridos y polisacaridos.

[0144] El termino "seguridad" o "perfil de seguridad", como se usa en el presente documento, se refiere a los efectos secundarios que podnan estar relacionados con la administracion de un farmaco en relacion con el numero de veces que se ha administrado el farmaco. A modo de ejemplo, se dice que un medicamento que se ha administrado muchas veces y que produce solo efectos secundarios leves o no tiene un excelente perfil de seguridad. En el ejemplo 26 se proporciona un ejemplo no limitativo de un metodo para evaluar el perfil de seguridad. Este metodo se puede usar para evaluar el perfil de seguridad de cualquier polipeptido.

[0145] La frase "hibrida selectivamente a" o "hibrida espedficamente a", como se usa en este documento, se refiere a la union, duplex o hibridacion de una molecula a una secuencia de nucleotidos particular en condiciones de hibridacion rigurosas cuando esa secuencia esta presente en una mezcla compleja que incluye, pero no se limita a, ADN o ARN celular total o de biblioteca.

[0146] El termino "marca de espm", como se usa en este documento, se refiere a las moleculas que contienen un atomo o un grupo de atomos que exhiben un espm de electrones no pareado (es decir, un grupo paramagnetico estable) que puede ser detectado por espectroscopia de resonancia de espm de electrones y puede ser unido a otra molecula. Dichas moleculas de marca giratoria incluyen, pero no se limitan a, radicales de nitrilo y nitroxidos, y pueden ser etiquetas de rotacion unica o etiquetas de rotacion doble.

[0147] El termino "estequiometrico", como se usa en el presente documento, se refiere a la relacion de los moles de compuestos que participan en una reaccion qmmica que es de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 1,1.

[0148] El termino "de tipo estequiometrico", como se usa en el presente documento, se refiere a una reaccion qmmica que se vuelve estequiometrica o casi estequiometrica ante cambios en las condiciones de reaccion o en presencia de aditivos. Tales cambios en las condiciones de reaccion incluyen, entre otros, un aumento de la temperatura o un cambio en el pH. Tales aditivos incluyen, pero no se limitan a, acelerantes.

[0149] La frase “condiciones de hibridacion rigurosas" se refiere a la hibridacion de secuencias de ADN, ARN, ANP u otros mimeticos de acido nucleico, o combinaciones de los mismos, en condiciones de baja fuerza ionica y alta temperatura. A modo de ejemplo, en condiciones rigurosas, una sonda se hibridara con su subsecuencia diana en una mezcla compleja de acido nucleico (que incluye, entre otros, ADN o ARN celular total o de biblioteca), pero no se hibrida con otras secuencias en la mezcla compleja. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y seran diferentes en diferentes circunstancias. A modo de ejemplo, las secuencias mas largas se hibridan espedficamente a temperaturas mas altas. Las condiciones de hibridacion rigurosas incluyen, pero no se limitan a, (i) aproximadamente 5-10°C por debajo del punto de fusion termico (Tm) para la secuencia espedfica a una fuerza ionica y pH definidos; (ii) la concentracion de sal es de aproximadamente 0,01 M a aproximadamente 1,0 M a aproximadamente pH 7,0 a aproximadamente pH 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (incluidas, entre otras, aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleotidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (incluidas, entre otras, mas de 50 nucleotidos); (iii) la adicion de agentes desestabilizantes que incluyen, entre otros, formamida, (iv) 50% de formamida, 5X SSC y 1% de SDS, incubando a 42°C, o 5X SSC, aproximadamente 1% de SDS, incubando a 65°C, con lavado en 0,2X SSC, y aproximadamente SDS al 0,1% a 65°C durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 120 minutos. Solo a modo de ejemplo, la deteccion de hibridacion selectiva o espedfica, incluye, pero no se limita a, una senal positiva al menos dos veces en segundo plano. Una gma extensa para la hibridacion de acidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993).

[0150] El termino "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a un animal que es objeto de tratamiento, observacion o experimento. Solo a modo de ejemplo, un sujeto puede ser, pero no se limita a, un mairnfero que incluye, pero no se limita a, un ser humano.

[0151] El termino "sustancialmente purificado", como se usa en el presente documento, se refiere a un componente de interes que puede estar sustancialmente o esencialmente libre de otros componentes que normalmente acompanan o interactuan con el componente de interes antes de la purificacion. Solo a modo de ejemplo, un componente de interes puede estar "sustancialmente purificado" cuando la preparacion del componente de interes contiene menos de aproximadamente el 30%, menos de aproximadamente el 25%, menos de aproximadamente el 20%, menos de aproximadamente el 15%, menos de aproximadamente el 10%, menos de aproximadamente el 5%, menos de aproximadamente el 4%, menos de aproximadamente el 3%, menos de aproximadamente el 2%, o menos de aproximadamente el 1% (en peso seco) de componentes contaminantes. Por lo tanto, un componente de interes "sustancialmente purificado" puede tener un nivel de pureza de aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o mas. Solo a modo de ejemplo, un polipeptido de aminoacido natural o un polipeptido de aminoacido no natural puede purificarse a partir de una celula nativa, o celula huesped en el caso de polipeptidos de aminoacidos naturales producidos de forma recombinante o polipeptidos de aminoacidos no naturales. A modo de ejemplo, una preparacion de un polipeptido de aminoacido natural o un polipeptido de aminoacido no natural puede "purificarse sustancialmente" cuando la preparacion contiene menos de aproximadamente el 30%, menos de aproximadamente el 25%, menos de aproximadamente el 20%, menos de aproximadamente el 15%, menos de aproximadamente el 10%, menos de aproximadamente el 5%, menos de aproximadamente el 4%, menos de aproximadamente el 3%, menos de aproximadamente el 2%, o menos de aproximadamente el 1% (en peso seco) de material contaminante. A modo de ejemplo, cuando las celulas huesped producen un polipeptido de aminoacido natural o un polipeptido de aminoacido no natural, el polipeptido de aminoacido natural o el polipeptido de aminoacido no natural pueden estar presentes en aproximadamente el 30%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 2%, o aproximadamente el 1% o menos del peso seco de las celulas. A modo de ejemplo, cuando un polipeptido de aminoacido natural o un polipeptido de aminoacido no natural se produce de forma recombinante por las celulas huesped, el polipeptido de aminoacido natural o el polipeptido de aminoacido no natural puede estar presente en el medio de cultivo a aproximadamente 5 g/L, aproximadamente 4 g/L, aproximadamente 3 g/L, aproximadamente 2 g/L, aproximadamente 1 g/L, aproximadamente 750 mg/l, aproximadamente 500 mg/l, aproximadamente 250 mg/l, aproximadamente 100 mg/L, aproximadamente 50 mg/L, aproximadamente 10 mg/L, o aproximadamente 1 mg/L o menos del peso seco de las celulas. A modo de ejemplo, los polipeptidos de aminoacidos naturales "sustancialmente purificados" o los polipeptidos de aminoacidos no naturales pueden tener un nivel de pureza de aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 55%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 65%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 99% o mas, segun lo determinen los metodos apropiados, incluidos, entre otros, analisis de SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC y electroforesis capilar.

[0152] El termino "sustituyentes" tambien denominado "sustituyentes no interferentes" se refiere a grupos que pueden usarse para reemplazar otro grupo en una molecula. Dichos grupos incluyen, entre otros, halo, alquilo C¹-C¹⁰, alquenilo C²-C¹⁰, alquinilo C²-C¹⁰, alcoxi C¹-C¹⁰, aralquilo C⁵-C¹², cicloalquilo C³-C¹², cicloalquenilo C⁴-C¹², fenilo, fenilo sustituido, toluilo, xilenilo, bifenilo, alcoxialquilo C²-C¹², alcoxialquilo C⁵-C¹²alcoxiarilo, ariloxialquilo C⁵-C¹², oxiaril C⁷-C¹², alquilosulfinilo C¹-C⁶, alquilosulfonilo C¹-C¹⁰, -(CH²)m-O-(alquilo C¹-C¹⁰) en donde m es de 1 a 8, arilo, arilo sustituido, alcoxi sustituido, fluoroalquilo, radical heterodclico, radical heterodclico sustituido, nitroalquilo, -NO², -CN, -NRC(O)-(alquilo C¹-C¹⁰), -C(O)-(alquilo C¹-C¹⁰), alquiltioalquilo C²-C¹⁰, -C(O)O-(alquilo C¹-C¹⁰), -OH, -SO², = S, -COOH, -NR², carbonilo, -C(O)-(alquilo C¹-C¹⁰)-CF³, -C(O)-CF3, -C(O)NR², -(arilo C¹-C¹⁰)-S-(arilo C⁶-C¹⁰), -C(O)-(arilo C⁶-C¹⁰), -(CH²)m-O-(CH²)m-O-(alquilo C¹-C¹⁰) en donde cada m es de 1 a 8, - C(O)NR², -C(S)NR², -SO²NR², -NRC(O)NR², -NRC(S)NR², sales de los mismos, y similares. Cada grupo R en la lista anterior incluye, pero no se limita a, H, alquilo o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido, o alcarilo. Cuando los grupos sustituyentes se especifican por sus formulas qmmicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, abarcan igualmente los sustituyentes qdmicamente identicos que resultanan de escribir la estructura de derecha a izquierda; por ejemplo, -CH²O- es equivalente a -OCH²-.

[0153] Solo a modo de ejemplo, los sustituyentes de radicales alquilo y heteroalquilo (incluidos los grupos denominados alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquileno) incluyen, pero no se limitan a: -OR, =O, =NR, = N-OR, -NR², -SR, -halogeno, -SiR3, -OC(O)R, -C(O)R, - CO²R, -CONR², -OC(O)NR², -NRC(O)R, -NRC(O)NR², -NR (O)²R, -NR-C (NR²) = NR, -S(O)R, -^s(^o)²R, -S(O)²NR², -NRSO²R, -CN y -NO². Cada grupo R en la lista anterior incluye, pero no se limita a, hidrogeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, que incluye, entre otros, arilo sustituido con 1-3 halogenos, grupos alquilo, alcoxi o tioalcoxi sustituido o no sustituido, o grupos aralquilo. Cuando dos grupos R se unen al mismo atomo de nitrogeno, se pueden combinar con el atomo de nitrogeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR²pretende incluir, pero no se limita a, 1 -pirrolidinilo y 4-morfolinilo.

[0154] A modo de ejemplo, los sustituyentes para grupos arilo y heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, -OR, =O, =NR, =N-OR, -NR², -SR, -halogeno, -SiR³, -OC(O)R, -C(O)R, - CO²R, -CONR², -OC(O)NR², -NRC(O)R, -NRC(O)NR², -NR(O)²R, -NR-C(NR²)=NR, -S(O)R, -S(O)²R, -S(O)²NR², -NRSO²R, -CN, -NO², -R, -N³, -CH(Ph)², fluor (C¹-C⁴) alcoxi y fluor (C¹-C⁴) alquilo, en un numero que oscila entre cero y el numero total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromatico; y donde cada grupo R en la lista anterior incluye, pero no se limita a, hidrogeno, alquilo, heteroalquilo, arilo y heteroarilo.

[0155] La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de una composicion que contiene al menos un polipeptido de aminoacido no natural y/o al menos un polipeptido de aminoacido no natural modificado administrado a un el paciente ya sufre una enfermedad, afeccion o trastorno, suficiente para curar o al menos detener parcialmente, o aliviar en cierta medida uno o mas de los srntomas de la enfermedad, trastorno o afeccion que se esta tratando. La efectividad de tales composiciones depende de condiciones que incluyen, entre otras, la gravedad y el curso de la enfermedad, trastorno o condicion, la terapia previa, el estado de salud del paciente y la respuesta a los medicamentos, y el juicio del medico que lo trata. Solo a modo de ejemplo, las cantidades terapeuticamente efectivas se pueden determinar mediante la experimentacion de rutina, que incluye, entre otros, un ensayo clrnico de aumento de la dosis.

[0156] El termino "tioalcoxi", como se usa en el presente documento, se refiere a grupos alquilo que contienen azufre unidos a moleculas a traves de un atomo de ox^geno.

[0157] El termino "punto de fusion termico" o Tm es la temperatura (con una fuerza ionica, pH y concentracion nucleica definidas) a la que el 50% de las sondas complementarias a una diana se hibridan con la secuencia diana en equilibrio.

[0158] El termino "resto toxico" o "grupo toxico", como se usa en este documento, se refiere a un compuesto que puede causar danos, perturbaciones o la muerte. Los restos toxicos incluyen, pero no se limitan a, NCA1, auristatina, agente de union al surco menor del ADN, agente alquilante del surco menor del ADN, enedina, lexitropsina, duocarmicina, taxano, puromicina, dolastatina, maytansinoide, alcaloide vinca, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB, auristatina E, paclitaxel, docetaxel, CC-1065, SN-38, topotecano, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfino-doxorrubicina, dolastatina-10, equinomicina, combretatstatina, calicheamicina, maitansina, DM-1, netropsina, podofilotoxina (p.ej. etoposido, teniposido, etc.), baccatina y sus derivados, agentes anti-tubulina, criptofisina, combretastatina, auristatina E, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorelbina, VP-16, camptotecina, epotilona A, epotilona B, nocodacoles, colcimid, estramustina, cemadotina, discodermolido, maytansina, eleuterobina, mecloretamina, ciclofosfamida, melfalan, carmustina, lomustina, semustina, etc. trietilenemelamina, trietilenotiofosforamina, busulfan, dacarbazina y temozolomida, itarabina, citosina arabinosida, fluorouracilo, floxuridina, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina, pentostatina, 5-fluorouracilo, metotrexato, 10-propargilo-5,8-dideazafolato, acido 5,8-dideazatetrahidrofolico, leucovorina, fosfato de fludarabina, pentostatina, gemcitabina, Ara-C, paclitaxel, docetaxel, deoxicoformicina, mitomicina-C, L-asparaginasa, azatioprina, brequinar, antibioticos (p.ej., antraciclina, gentamicina, cefalotina, vancomicina, telavancina, daptomicina, azitromicina, eritromicina, rocitromicina, furazolidona, amoxicilina, ampicilina, carbenicilina, flucloxacilina, meticilina, penicilina, ciprofloxacina, moxifloxacina, ofloxacina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina, estreptomicina, rifabutina, etambutol, rifaximina, etc.), medicamentos antivirales (p. ej., abacavir, aciclovir, ampligeno, cidofovir, delavirdina, didanosina, efavirenz, entecavir, fosfonet, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, inosina, lopinavir, metisazona, nexavir, nevirapina, oseltamivir, penciclovir, estavudina, trifluridina, truvada, valaciclovir, zanamivir, etc.), hidrocloruro de daunorubicina, daunomicina, rubidomicina, cerubidina, idarubicina, doxorubicina, epirubicina y derivados de morfolino, bisciclopeptidos de fenoxizona (p. ej., dactinomicina), glucopeptidos basicos (p. ej., bleomicina), glucosidos de antraquinona (p. ej., plicamicina, mitramicina), antracenodionas (p. ej., mitoxantrona), indoledionas de azirinopirrolo (p. ej., mitomicina), inmunosupresores macrodclicos (p. ej. ciclosporina, FK-506, tacrolimus, prograf, rapamicina, etc.), navelbeno, CPT-11, anastrazol, letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida, ifosamida, droloxafina, alocolchicina, Halicondrina B, cochicina, derivados de colchicina, maitansina, rizoxina, paclitaxel, derivados de paclitaxel, docetaxel, tiocolchicina, cisterina de tritilo, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, cisplatino, carboplatino, hidroxiurea, N-metilhidrazina, epidofilotoxina, procarbazina, mitoxantrona, leucovorina y tegegur. Los "taxanos" incluyen paclitaxel, asf como cualquier derivado activo de taxano o profarmaco, agentes quimioterapeuticos como erlotinib (TARCEVA.^rT^m., Genentech/OSI Pharm.), bortezomib (VELCADE.RTM., Millenium Pharm.) fulvestrant (FASLODEX.RTM., AstraZeneca), sutent (SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA.RTM., Novartis), mesilato de imatinib (GLEEVEC.RTM., Novartis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), oxaliplatina (Eloxatin.RTM., Sanofi), 5-FU (5-fluorouracilo), leucovorina, Rapamicina (Sirolimus, RApAm UNE.Rt M., Wyeth), lapatinib (TYKERB.RTM., GSK572016, GlaxoSmithKline), Lonafarnib (SCH 66336), sorafenib (BAY43-9006, Bayer Labs.), y gefitinib (IRESSA.RTM., AstraZeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), agentes alquilantes tales como tiotepa y CYTOXAN.RTM. ciclosfosfamida; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; antineoplastico de antifolato como pemetrexado (ALIMTA.RTM, Eli Lilly), aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilaminaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilmelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluido el topotecan analogo sintetico); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluidos sus analogos sinteticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluidos los analogos sinteticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina una sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de oxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibioticos como los antibioticos de enediino, calicheamicina, calicheamicina gamma1I y calicheamicina omegaI1; dinemina, incluyendo dinemina A; bifosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; asf como cromoforos de neocarzinostatina y cromoforos relacionados con el cromoprotema enedina, aclacinomisinas, actinomicina, antramicina, azeraserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinis, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN.RTM. doxorubicina (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); analogos del acido folico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamprina, tioguanina; analogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenador de acido folico, tal como acido frolmico; aceglatona; glucosido de aldofosfamida; acido aminolevulmico; eniluracilo; amsacrina bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina demecolcina diaziquona; elformitina; acetato de elliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; phenamet pirarubicina; losoxantrona; acido podofilmico; 2-etilhidracida; procarbazina; PSK.RTM. complejo de polisacaridos (JHS Natural Products, Eugene, Oregon); razoxano; rizoxina; sizofuran espirogermanio; acido tenuazonico; triaziquona; 2,2',2”-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manacustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosido ("Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL.RTM., Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), ABRAXANE.TM. Libre de Cremophor, albumina, formulacion de nanopartfculas de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.), y TAXOTERE.RTM. doxetaxel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; GEMZAR.RTM. gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; analogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina, platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE.RTM. vinorelbina; novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000, difluorometilomitina (DMFO); retinoides tales como acido retinoico, capecitabina; y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

[0159] Los terminos "tratar", "tratado" o "tratamiento", como se usan en este documento, incluyen aliviar, atenuar o mejorar una enfermedad o smtomas de afeccion, prevenir smtomas adicionales, mejorar o prevenir las causas metabolicas subyacentes de los smtomas, inhibir la enfermedad o afeccion, por ejemplo, detener el desarrollo de la enfermedad o afeccion, aliviar la enfermedad o afeccion, causar la regresion de la enfermedad o afeccion, aliviar una afeccion causada por la enfermedad o afeccion, o detener los smtomas de la enfermedad o afeccion. Los terminos "tratar", "tratado" o "tratamiento", incluyen, entre otros, tratamientos profilacticos y/o terapeuticos.

[0160] Como se usa en el presente documento, el termino "polfmero soluble en agua" se refiere a cualquier polfmero que sea soluble en disolventes acuosos. Dichos polfmeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol, polietilenglicol propionaldetudo, monoalcoxi C¹-C¹⁰o sus derivados ariloxi (descritos en la patente de EE.UU. N° 5.252.714), monometoxi-polietilenglicol, polivinilpirrolidona, alcohol polivimlico, acidos de poliamino, anhfdrido maleico divinileter, N-(2-hidroxipropilo-metilo)-metacrilamida, dextrano, derivados de dextrano que incluyen sulfato de dextrano, polipropilenglicol, oxido de polipropileno/copolfmero de oxido de etileno, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polisacaridos, oligosacaridos, glicanos, celulosa, y derivados de celulosa, incluidos, entre otros, metilcelulosa y carboximetilcelulosa, albumina de suero, derivados de almidon y almidon, polipeptidos, polialquilenglicol y derivados de los mismos, copolfmeros de polialquilenglicoles y derivados de los mismos, polivinilo etilo eteres y alfa-beta poli[(2-hidroxietilo)-DL-aspartamida, o mezclas de los mismos. Solo a modo de ejemplo, el acoplamiento de dichos polfmeros solubles en agua a polipeptidos de aminoacidos naturales o polipeptidos no naturales puede producir cambios que incluyen, entre otros, aumento de la solubilidad en agua, vida media en suero aumentada o modulada, vida media terapeutica aumentada o modulada relativa a la forma no modificada, mayor biodisponibilidad, actividad biologica modulada, tiempo de circulacion extendido, inmunogenicidad modulada, caractensticas de asociacion ffsica moduladas que incluyen, entre otras, agregacion y formacion de multfmeros, enlace al receptor alterado, enlace alterado a una o mas parejas de enlace y alteracion de la dimerizacion del receptor o multimerizacion. Ademas, tales polfmeros solubles en agua pueden o no tener su propia actividad biologica.

[0161] A menos que se indique lo contrario, se emplean metodos convencionales de espectroscopfa de masas, RMN, HPLC, qrnmica de protemas, bioqmmica, tecnicas de ADN recombinante y farmacologfa, dentro de los conocimientos de la tecnica.

[0162] Los compuestos (incluidos, entre otros, aminoacidos no naturales, polipeptidos de aminoacidos no naturales, polipeptidos de aminoacidos no naturales modificados y reactivos para producir los compuestos mencionados anteriormente) presentados aqrn incluyen compuestos marcados isotopicamente, que son identicos a los enumerados en las diversas formulas y estructuras presentadas en este documento, pero por el hecho de que uno o mas atomos se reemplazan por un atomo que tiene una masa atomica o un numero de masa diferente de la masa atomica o el numero de masas que se encuentra generalmente en la naturaleza. Los ejemplos de isotopos que pueden incorporarse en los presentes compuestos incluyen isotopos de hidrogeno, carbono, nitrogeno, oxfgeno, fluor y cloro, tales como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 35S, 18F, 36Cl, respectivamente. Ciertos compuestos marcados con isotopos descritos en el presente documento, por ejemplo, aquellos en los que se incorporan isotopos radiactivos tales como 3H y 14C, son utiles en ensayos de distribucion de tejido de sustrato y/o farmaco. Ademas, la sustitucion con isotopos como el deuterio, es decir, 2H, puede proporcionar ciertas ventajas terapeuticas que resultan de una mayor estabilidad metabolica, por ejemplo, un aumento de la vida media in vivo o requisitos de dosificacion reducida.

[0163] Algunos de los compuestos en este documento (que incluyen, pero no se limitan a, aminoacidos no naturales, polipeptidos de aminoacidos no naturales y polipeptidos de aminoacidos no naturales modificados, y reactivos para producir los compuestos mencionados anteriormente) tienen atomos de carbono asimetricos y, por lo tanto, pueden existir como enantiomeros o diastereomeros, las mezclas diastomericas se pueden separar en sus diastereomeros individuales en base a sus diferencias qmmicas y ffsicas mediante metodos conocidos, por ejemplo, por cromatograffa y/o cristalizacion fraccionada. Los enantiomeros pueden separarse convirtiendo la mezcla enantiomerica en una mezcla diastereomerica por reaccion con un compuesto opticamente activo apropiado (por ejemplo, alcohol), separando los diastereoisomeros y convirtiendo (por ejemplo, hidrolizando) los diastereoisomeros individuales en los enantiomeros puros correspondientes. Todos estos isomeros, incluidos los diastereomeros, enantiomeros y mezclas de los mismos se consideran parte de las composiciones descritas en el presente documento.

[0164] En realizaciones adicionales o adicionales, los compuestos descritos en el presente documento (que incluyen, entre otros, aminoacidos no naturales, polipeptidos de aminoacidos no naturales y polipeptidos de aminoacidos no naturales modificados, y reactivos para producir los compuestos mencionados anteriormente) son utilizados en forma de profarmacos. En realizaciones adicionales o adicionales, los compuestos descritos en el presente documento ((incluidos, entre otros, aminoacidos no naturales, polipeptidos de aminoacidos no naturales y polipeptidos de aminoacidos no naturales modificados, y reactivos para producir los compuestos mencionados anteriormente) se metabolizan en la administracion a un organismo que necesita producir un metabolito que luego se usa para producir un efecto deseado, incluido un efecto terapeutico deseado. En realizaciones adicionales o adicionales, son metabolitos activos de aminoacidos no naturales y polipeptidos de aminoacidos no naturales modificados o no modificados.

[0165] Los metodos y formulaciones descritos aqrn incluyen el uso de N-oxidos, formas cristalinas (tambien conocidas como polimorfos) o sales farmaceuticamente aceptables de aminoacidos no naturales, polipeptidos de aminoacidos no naturales y polipeptidos de aminoacidos no naturales modificados. En ciertas realizaciones, los aminoacidos no naturales, los polipeptidos de aminoacidos no naturales y los polipeptidos de aminoacidos no naturales modificados pueden existir como tautomeros. Todos los tautomeros estan incluidos dentro del alcance de los aminoacidos no naturales, los polipeptidos de aminoacidos no naturales y los polipeptidos de aminoacidos no naturales modificados presentados en el presente documento. Ademas, los aminoacidos no naturales, los polipeptidos de aminoacidos no naturales y los polipeptidos de aminoacidos no naturales modificados descritos en el presente documento pueden existir en formas no solvatadas y solvatadas con disolventes farmaceuticamente aceptables tales como agua, etanol y similares. Las formas solvatadas de los aminoacidos no naturales, los polipeptidos de aminoacidos no naturales y los polipeptidos de aminoacidos no naturales modificados presentados en el presente documento tambien se consideran descritos en el presente documento.

[0166] Algunos de los compuestos de este documento (incluidos, entre otros, aminoacidos no naturales, polipeptidos de aminoacidos no naturales y polipeptidos y reactivos de aminoacidos no naturales modificados para producir los compuestos mencionados anteriormente) pueden existir en varios compuestos formas tautomericas. Todas estas formas tautomericas se consideran parte de las composiciones descritas en este documento. Ademas, por ejemplo, todas las formas enol-ceto de cualquier compuesto (incluidos, entre otros, aminoacidos no naturales, polipeptidos de aminoacidos no naturales y polipeptidos y reactivos de aminoacidos no naturales modificados para producir los compuestos mencionados anteriormente) se consideran aqrn como parte de las composiciones descritas en este documento.

[0167] Algunos de los compuestos en este documento (que incluyen, entre otros, aminoacidos no naturales, polipeptidos de aminoacidos no naturales y polipeptidos y reactivos de aminoacidos no naturales modificados para producir cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente) son acidos y pueden formar una sal con un cation farmaceuticamente aceptable. Algunos de los compuestos de la presente memoria (incluidos, entre otros, aminoacidos no naturales, polipeptidos de aminoacidos no naturales y polipeptidos de aminoacidos no naturales modificados y reactivos para producir los compuestos mencionados anteriormente) pueden ser basicos y, en consecuencia, pueden formar una sal. Con un anion farmaceuticamente aceptable. Todas estas sales, incluidas las di-sales, estan dentro del alcance de las composiciones descritas en el presente documento y pueden prepararse mediante metodos convencionales. Por ejemplo, las sales pueden prepararse poniendo en contacto las entidades acidas y basicas, ya sea en forma acuosa, no acuosa o medio parcialmente acuoso. Las sales se recuperan utilizando al menos una de las siguientes tecnicas: filtracion, precipitacion con un no disolvente seguido de filtracion, evaporacion del disolvente o, en el caso de soluciones acuosas, liofilizacion.

[0168] Las sales farmaceuticamente aceptables de los polipeptidos de aminoacidos no naturales descritos en el presente documento pueden formarse cuando un proton acido presente en los polipeptidos de aminoacidos no naturales originales se reemplaza por un ion metalico, a modo de ejemplo, un ion de metal alcalino, un ion alcalinoterreo, o un ion de aluminio; o coordenadas con una base organica. Ademas, las formas de sal de los polipeptidos de aminoacidos no naturales descritos pueden prepararse usando sales de los materiales de partida o intermedios. Los polipeptidos de aminoacidos no naturales descritos en el presente documento pueden prepararse como una sal de adicion de acido farmaceuticamente aceptable (que es un tipo de sal farmaceuticamente aceptable) haciendo reaccionar la forma de base libre de los polipeptidos de aminoacidos no naturales descritos en el presente documento con un acido inorganico u organico farmaceuticamente aceptable. Alternativamente, los polipeptidos de aminoacidos no naturales descritos en este documento pueden prepararse como sales de adicion de bases farmaceuticamente aceptables (que son un tipo de sal farmaceuticamente aceptable) haciendo reaccionar la forma de acido libre de los polipeptidos de aminoacidos no naturales descritos en este documento con una base inorganica u organica farmaceuticamente aceptable.

[0169] El tipo de sales farmaceuticamente aceptables incluye, pero no se limita a: (1) sales de adicion de acido, formadas con acidos inorganicos tales como acido clorfffdrico, acido bromfffdrico, acido sulfurico, acido mtrico, acido fosforico y similares; o formados con acidos organicos tales como acido acetico, acido propionico, acido hexanoico, acido ciclopentanopropionico, acido glicolico, acido piruvico, acido lactico, acido malonico, acido succmico, acido malico, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido cftrico, acido benzoico, acido 3-(4-hidroxibenzoMo)benzoico, acido cinamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido 1,2-etanodisulfonico, acido 2-hidroxietanosulfonico, acido bencenosulfonico, acido 2-naftalenosulfonico, acido 4-metilbiciclo-[2,2,2]oct-2-eno-1-carbox^lico, acido glucoheptonico, 4,4'-metilenobis(acido 3-hidroxi-2-eno-1-carbox^lico), acido 3-fenilpropionico, acido trimetilacetico, acido butilacetico terciario, acido laurilsulfurico, acido gluconico, acido glutamico, acido hidroxinaftoico, acido salidlico, acido estearico, acido muconico y similares; (2) sales formadas cuando un proton acido presente en el compuesto original es reemplazado por un ion metalico, por ejemplo, un ion de metal alcalino, un ion alcalinoterreo o un ion de aluminio; o coordinadas con una base organica, las bases organicas aceptables incluyen etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina y similares. Las bases inorganicas aceptables incluyen hidroxido de aluminio, hidroxido de calcio, hidroxido de potasio, carbonato de sodio, hidroxido de sodio y similares.

[0170] Los contraiones correspondientes de las sales farmaceuticamente aceptables de polipeptidos de aminoacidos no naturales pueden analizarse e identificarse utilizando diversos metodos que incluyen, entre otros, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de iones, electroforesis capilar, plasma acoplado inductivamente, espectroscopia de absorcion atomica, espectrometna de masas, o cualquier combinacion de los mismos. Ademas, la actividad terapeutica de tales sales farmaceuticamente aceptables de polipeptidos de aminoacidos no naturales se puede ensayar utilizando las tecnicas y metodos descritos en los ejemplos 87-91.

[0171] Debe entenderse que una referencia a una sal incluye las formas de adicion de solventes o formas cristalinas de las mismas, particularmente solvatos o polimorfos. Los solvatos contienen cantidades estequiometricas o no estequiometricas de un solvente, y se forman a menudo durante el proceso de cristalizacion con disolventes farmaceuticamente aceptables tales como agua, etanol y similares. Los hidratos se forman cuando el disolvente es agua, o los alcoholatos se forman cuando el disolvente es alcohol. Los polimorfos incluyen las diferentes disposiciones de empaquetamiento de cristales de la misma composicion elemental de un compuesto. Los polimorfos suelen tener diferentes patrones de difraccion de rayos X, espectros infrarrojos, puntos de fusion, densidad, dureza, forma del cristal, propiedades opticas y electricas, estabilidad y solubilidad. Varios factores, como el disolvente de recristalizacion, la velocidad de cristalizacion y la temperatura de almacenamiento pueden hacer que domine una forma de cristal unico.

[0172] La seleccion y caracterizacion de polipeptidos de aminoacidos no naturales, sales farmaceuticamente aceptables, polimorfos y/o solvatos se pueden lograr usando una variedad de tecnicas que incluyen, pero no se limitan a, analisis termico, difraccion de rayos X, espectroscopia, sorcion de vapor y microscopfa. Los metodos de analisis termico abordan la degradacion termoqmmica o los procesos termo ffsicos que incluyen, entre otros, transiciones polimorficas, y dichos metodos se utilizan para analizar las relaciones entre formas polimorficas, determinar la perdida de peso, encontrar la temperatura de transicion vftrea o para estudios de compatibilidad de excipientes. Tales metodos incluyen, pero no se limitan a, calorimetna diferencial de barrido (DSC), calorimetna diferencial de barrido modulada (MDCS), analisis termogravimetrico (TGA) y analisis termometrico e infrarrojo (TG/IR). Los metodos de difraccion de rayos X incluyen, pero no se limitan a, difractometros de monocristales y en polvo y fuentes de sincrotron. Las diversas tecnicas espectroscopicas utilizadas incluyen, pero no se limitan a, Raman, FTIR, UVIS y RMN (estado ffquido y solido). Las diversas tecnicas de microscopfa incluyen, pero no se limitan a, microscopfa de luz polarizada, microscopfa electronica de barrido (SEM) con analisis de rayos X de energfa dispersiva (EDX), microscopfa electronica de barrido ambiental con EDX (en atmosfera de gas o vapor de agua), microscopia IR, y microscopia Raman.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0173] Las caractensticas novedosas de la invencion se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendra una mejor comprension de las caractensticas y ventajas de la presente invencion haciendo referencia a la siguiente descripcion detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invencion, y los dibujos adjuntos de los cuales:

La Fig. 1 presenta una ilustracion grafica de la eficacia antitumoral del anticuerpo CD70-2H5-HA119 no conjugado ARX-aCD70 administrado en una dosis unica a ratones hembra desnudos 7 dfas despues de la implantacion de un fragmento de tumor 786-O en una dosis de 3 mg/kg) contra vefffculo de control.

La Fig. 2 presenta una ilustracion grafica del volumen del tumor en grupos de sujetos sometidos a prueba de ratones desnudos tratados con 1 mg/kg, 3 mg/kg y 10 mg/kg de dosis del farmaco de anticuerpo conjugado CD70-2H5-HA119-NCA1 en el rinon modelo de xenoinjerto de carcinoma de celulas, las mismas condiciones de la Fig. 1,

La Fig. 3A presenta una ilustracion grafica de los resultados de un ensayo de citotoxicidad de tres conjugados de farmaco ARX-anticuerpo; CD70-2H5-NCA1, CD70-69A7-NCA1, y CD70hIF6-NCA1 en celulas 786-O.

La Fig. 3B presenta una ilustracion grafica de los resultados de un ensayo de citotoxicidad de tres conjugados de farmaco ARX-anticuerpo; CD70-2H5-NCA1, CD70-69A7-NCA1, y CD70hIF6-NCA1 en celulas Caki-1,

La Fig. 4 presenta una ilustracion grafica del volumen del tumor a lo largo del tiempo despues de una inyeccion unica en el dfa 12 de la Fig. 4(A), el anticuerpo CD70-2H5-HA119 de aCD70 conjugado con AS269 (tambien denominado NCA1 en la presente solicitud); Fig. 4(B) anticuerpo CD70-8A1-HA122 de aCD70 conjugado con AS269; y la Fig. 4(C) del anticuerpo aCD70 CD70-7F2-HA119 conjugado. Los conjugados farmacologicos de anticuerpos se administraron en dosis de 0,5 mg/kg; 1 mg/kg; y 3 mg/kg y en comparacion con el vehmulo. La Fig. 5 presenta un grafico de puntos de los volumenes de tumores de los diferentes grupos de prueba, medido en el d^ a 49 despues del trasplante del fragmento de tumor 786-O.

La Fig. 6A presenta una ilustracion grafica del volumen del tumor en grupos de sujetos de prueba con ratones desnudos tratados con CD70-2H5-AS269 3 mg/kg; CD70-8A1-AS269 3 mg/kg; y CD70-7F2-AS269 3 mg/kg; administrado 12 dfas despues del trasplante de un fragmento de tumor 786-O.

La Fig. 6B presenta una ilustracion grafica del volumen del tumor en grupos de sujetos de prueba de ratones desnudos tratados con CD70-2H5-AS269 en 1 mg/kg y 3 mg/kg en comparacion con el vehmulo; Los conjugados farmacologicos de anticuerpos se administraron 12 dfas despues del trasplante de un fragmento de tumor 786-O. La Fig. 6C presenta una ilustracion grafica del volumen del tumor en grupos de sujetos de prueba de ratones desnudos tratados con 8A1-pAF1-AS269 en 1 mg/kg y 3 mg/kg en comparacion con el vehmulo; los conjugados farmacologicos de anticuerpos se administraron 12 dfas despues del trasplante de un fragmento de tumor 786-O.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

[0174] Aunque las realizaciones preferidas de la presente invencion se han mostrado y descrito en el presente documento, sera obvio para los expertos en la materia que tales realizaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo. A los expertos en la tecnica se les ocurriran numerosas variaciones, cambios y sustituciones sin apartarse de la invencion. Debe entenderse que pueden emplearse diversas alternativas a las realizaciones de la invencion descritas en el presente documento para poner en practica la invencion. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invencion y que los metodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes se cubran de ese modo.

I. Introduccion

[0175] Recientemente, se ha informado de una tecnologfa completamente nueva en las ciencias de las protemas, que promete superar muchas de las limitaciones asociadas con las modificaciones de protemas espedficas del sitio. Espedficamente, se han agregado nuevos componentes a la maquinaria biosintetica de protemas del procariota Escherichia coli (E. coli) (por ejemplo, L. Wang, et al., (2001), Science 292: 498-500) y al eucariota Sacchromices cerevisiae (S. cerevisiae) (por ejemplo, J. Chin et al., Science 301: 964-7 (2003)), que ha permitido la incorporacion de aminoacidos no naturales a protemas in vivo. Varios nuevos aminoacidos con nuevas propiedades qmmicas, ffsicas o biologicas, que incluyen etiquetas de fotoafinidad y aminoacidos fotoisomerizables, ceto aminoacidos y aminoacidos glicosilados se han incorporado de manera eficiente y con alta fidelidad a protemas en E. coli y en levaduras en respuesta al codon ambar, TAG, utilizando esta metodologfa. Vease, por ejemplo, JW Chin et al., (2002), Journal of American Chemical Society 124: 9026-9027; JW Chin, y PG Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11): 1135-1137; JW Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99(17): 11020-11024; y, L. Wang, y PG Schultz, (2002), Chem. Comm., 1-11. Estos estudios han demostrado que es posible introducir selectiva y rutinariamente grupos funcionales qrnmicos que no se encuentran en protemas, que son qmmicamente inertes a todos los grupos funcionales encontrados en los 20 aminoacidos comunes codificados geneticamente y que pueden usarse para reaccionar de manera eficiente y selectiva para formar enlaces covalentes estables.

I. Descripcion general

[0176] La presente invencion proporciona anticuerpos aCD70 que tienen un aminoacido no codificado de forma natural que facilita la conjugacion de anticuerpos a un farmaco (por ejemplo, un farmaco, una toxina, una molecula marcadora). El ADC comprende un anticuerpo aCD70 conjugado con un farmaco en el que la conjugacion se produce a traves de un aminoacido no codificado de forma natural en el anticuerpo. En una realizacion, el ADC comprende un anticuerpo aCD70 conjugado con un farmaco en el que la conjugacion se produce a traves de un aminoacido no codificado de forma natural en la cadena pesada del anticuerpo. En una realizacion, el ADC comprende un anticuerpo aCD70 conjugado con un farmaco en el que la conjugacion se produce a traves de un aminoacido no codificado de forma natural en la cadena ligera del anticuerpo. En una realizacion, el ADC comprende un anticuerpo de longitud completa conjugado con una alfombra de anuncios en el que la conjugacion se produce a traves de un aminoacido no codificado de forma natural en el anticuerpo. En una realizacion, el ADC comprende un anticuerpo de longitud completa conjugado a un farmaco en el que la conjugacion se produce a traves de un aminoacido no codificado de forma natural en la cadena pesada del anticuerpo. En una realizacion, el ADC comprende un anticuerpo de longitud completa conjugado con un farmaco en el que la conjugacion se produce a traves de un aminoacido no codificado de forma natural en la cadena ligera del anticuerpo.

[0177] En algunas realizaciones, el farmaco del ADC es un farmaco citotoxico. En algunos aspectos de la invencion, el farmaco citotoxico se selecciona del grupo que consiste en una auristatina, un agente de union al surco menor del ADN, un agente alquilante del surco menor del ADN, un enedino, una lexitropsina, una duocarmicina, un taxano, una puromicina, dolastatina, un maitansinoide y un alcaloide de la vinca. En algunos aspectos de la invencion, el farmaco citotoxico es

[0178] En otras realizaciones de la presente invencion, el farmaco citotoxico se elige del grupo que comprende:

[0179] En algunas realizaciones de la presente invencion, el farmaco citotoxico se elige del grupo que consiste en

Ċ

[0180] En otros aspectos de la presente invencion, el farmaco citotoxico se elige del grupo que consiste en:

[0181] En otros aspectos de la presente invencion, el farmaco citotoxico se elige del grupo que consiste en

[0182] En otros aspectos de la presente invencion, el farmaco citotoxico se selecciona del grupo que consiste en AFP, MMAF, MMAE, AEB, AeVb , auristatina E, paclitaxel, docetaxel, CC-1065, SN-38, topotecano, morfolinodoxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorubicina, dolastatina-10, echinomicina, combretatstatina, calicheamicina, maitansina, DM-1, o netropsina.

[0183] En algunos aspectos de la invencion, el farmaco citotoxico es un agente anti-tubulina. En algunas realizaciones, el agente antitubulina es una auristatina, un alcaloide de la vinca, una podofilotoxina, un taxano, un derivado de baccatina, una criptofisina, un maitansinoide, una combretastatina o una dolastatina. En otros aspectos de la invencion, el agente antitubulina es AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB, auristatina E, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorelbina, VP-16, camptotecina, paclitaxel, docetaxel, epotilona A, nocodazol, colchicinas, colcimid, estramustina, cemadotina, discodenolida, maytanina, DM-1, o eleuterobina.

[0184] En otros aspectos de la invencion, el farmaco citotoxico del ADC es ganciclovir, etanercept, ciclosporina, tacrolimus, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato mofetilo, metotrexato, cortisol, aldosterona, aldosterona, dexametasona, un inhibidor de ciclooxigenasa, un inhibidor de 5-ipoxigenasa, o un antagonista del receptor de leucotrienos.

[0185] En algunas realizaciones de la invencion, el anticuerpo del ADC comprende un anticuerpo de longitud completa que: (a) se une a CD70, y (b) esta conjugado con un agente citotoxico o un agente inmunosupresor, en donde el conjugado anticuerpo-farmaco ejerce: (a) un efecto citotoxico o citostatico sobre una lmea de celulas cancerosas que expresan CD70, o (b) un efecto citotoxico, citostatico o inmunosupresor sobre una celula inmunitaria que expresa CD70, en donde la conjugacion ocurre en un aminoacido codificado de forma no natural en el anticuerpo.

[0186] A un nivel, se describen en este documento las herramientas (metodos, composiciones, tecnicas) para crear y usar derivados de ligadores de dolastatina o analogos que comprenden al menos un carbonilo, dicarbonilo, oxima, hidroxilamina, aldetndo, aldetndo protegido, cetona, cetona protegida, tioester, ester, dicarbonilo, hidrazina, azida, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquino, alquino, cicloalquino o eno-diona. En otro nivel, en el presente documento se describen las herramientas (metodos, composiciones, tecnicas) para crear y utilizar derivados de enlazadores de dolastatina o analogos que comprenden al menos un aminoacido no natural o un aminoacido no natural modificado con una oxima, una amina aromatica, un heterociclo (por ejemplo, indol, quinoxalina, fenazina, pirazol, triazol, etc.).

[0187] Dichos derivados del enlazador de dolastatina que comprenden aminoacidos no naturales pueden contener una funcionalidad adicional, que incluye pero no se limita a, un polfmero; un polfmero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; una segunda protema o polipeptido o analogo de polipeptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; y cualquier combinacion de los mismos. Tenga en cuenta que las diversas funcionalidades mencionadas no pretenden implicar que los miembros de una funcionalidad no puedan clasificarse como miembros de otra funcionalidad. De hecho, habra superposicion dependiendo de las circunstancias particulares. Solo a modo de ejemplo, un polfmero soluble en agua se superpone en el alcance con un derivado de polietilenglicol, sin embargo, el solapamiento no es completo y, por lo tanto, ambas funcionalidades se citan anteriormente.

[0188] En el presente documento, en algunas realizaciones, se proporciona un derivado de enlace de grupo toxico que comprende un carbonilo, dicarbonilo, oxima, hidroxilamina, aldelddo, aldelddo protegido, cetona, cetona protegida, tioester, ester, dicarbonilo, hidrazina, azida, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquino, alquino, cicloalquino o eno-diona. En algunas realizaciones, el derivado de grupo toxico comprende cualquiera de los enlazadores descritos en el presente documento. En otras realizaciones, en el presente documento se describen las herramientas (metodos, composiciones, tecnicas) para crear y usar derivados de grupos toxicos o analogos que comprenden al menos un aminoacido no natural o un aminoacido no natural modificado con una oxima, una amina aromatica, un heterociclo (por ejemplo, indol, quinoxalina, fenazina, pirazol, triazol, etc.).

[0189] En algunas realizaciones, dichos derivados toxicos que comprenden aminoacidos no naturales pueden contener una funcionalidad adicional, que incluye, entre otros, un polfmero; un polfmero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; una segunda protema o polipeptido o analogo de polipeptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; y cualquier combinacion de los mismos. En realizaciones espedficas, el grupo toxico es un inhibidor de tubulina. En ciertas realizaciones espedficas, el grupo toxico es dolastatina o auristatina. En otras realizaciones espedficas, el grupo toxico es dolastatina o derivado de auristatina. Tenga en cuenta que las diversas funcionalidades mencionadas anteriormente no pretenden implicar que los miembros de una funcionalidad no puedan clasificarse como miembros de otra funcionalidad. De hecho, habra superposicion dependiendo de las circunstancias particulares. Solo a modo de ejemplo, un polfmero soluble en agua se solapa en el alcance con un derivado de polietilenglicol; sin embargo, el solapamiento no es completo y, por lo tanto, ambas funcionalidades se citan anteriormente.

[0190] Ciertas realizaciones de la presente invencion describen preparaciones de ciertos restos toxicos con enlazadores que reducen la toxicidad del resto in vivo mientras que el resto toxico conserva la actividad farmacologica. En algunas realizaciones, la toxicidad del grupo toxico unido, cuando se administra a un animal o humano, se reduce o elimina en comparacion con el grupo toxico libre o los derivados de grupo toxico que comprenden enlaces labiles, mientras que retienen la actividad farmacologica. En algunas realizaciones, se pueden administrar dosis elevadas del grupo toxico enlazado (por ejemplo, derivados del enlazador de dolastatina, derivados de dolastatina no ligados a aminoacidos no naturales) a animales o seres humanos con mayor seguridad. En ciertas realizaciones, los polipeptidos de aminoacidos no naturales unidos a un resto toxico (por ejemplo, derivado de dolastatina) proporcionan estabilidad in vitro e in vivo. En algunas realizaciones, los polipeptidos de aminoacidos no naturales unidos a un resto toxico (por ejemplo, inhibidor de tubulina, derivado de dolastatina-10) son eficaces y menos toxicos en comparacion con el resto toxico libre (por ejemplo, inhibidor de tubulina, dolastatina-10).

IN. Derivados del enlazador de dolastatina

[0191] A un nivel, se describen en este documento las herramientas (metodos, composiciones, tecnicas) para crear y usar un derivado de enlazador de dolastatina o analogos que comprenden al menos un aminoacido no natural o un aminoacido no natural modificado con un carbonilo, dicarbonilo, oxima o grupo hidroxilamina. Tales derivados de enlazadores de dolastatina que comprenden aminoacidos no naturales pueden contener una funcionalidad adicional, que incluye, entre otros, un polfmero; un polfmero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; una segunda protema o polipeptido o analogo de polipeptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; y cualquier combinacion de los mismos. Tenga en cuenta que las diversas funcionalidades mencionadas anteriormente no pretenden implicar que los miembros de una funcionalidad no puedan clasificarse como miembros de otra funcionalidad. De hecho, habra superposicion dependiendo de las circunstancias particulares. Solo a modo de ejemplo, un polfmero soluble en agua se superpone en el alcance con un derivado de polietilenglicol, sin embargo, el solapamiento no es completo y, por lo tanto, ambas funcionalidades se citan anteriormente.

[0192] En un aspecto, se encuentran metodos para seleccionar y disenar un derivado de enlazador de dolastatina a modificar usando los metodos, composiciones y tecnicas descritas en el presente documento. El nuevo derivado del enlazador de dolastatina se puede disenar de novo, incluso solo a modo de ejemplo, como parte del proceso de seleccion de alto rendimiento (en cuyo caso se pueden disenar, sintetizar, caracterizar y/o ensayar numerosos polipeptidos) o en funcion de los intereses del investigador. El nuevo derivado del enlazador de dolastatina tambien puede disenarse en base a la estructura de un polipeptido conocido o parcialmente caracterizado. Solo a modo de ejemplo, la dolastatina ha sido objeto de un intenso estudio por parte de la comunidad ciendfica; Se puede disenar un nuevo compuesto basado en la estructura de la dolastatina. Los principios para seleccionar los aminoacidos que sustituyen y/o modifican se describen por separado en este documento. La eleccion de que modificacion emplear tambien se describe en el presente documento, y se puede utilizar para satisfacer las necesidades del experimentador o usuario final. Dichas necesidades pueden incluir, entre otras, la manipulacion de la eficacia terapeutica del polipeptido, la mejora del perfil de seguridad del polipeptido, el ajuste de la farmacocinetica, la farmacologfa y/o la farmacodinamica del polipeptido, como, por ejemplo, unicamente, aumentando la solubilidad en agua, la biodisponibilidad, aumentando la vida media en suero, aumentando la vida media terapeutica, modulando la inmunogenicidad, modulando la actividad biologica, o extendiendo el tiempo de circulacion. Ademas, dichas modificaciones incluyen, solo a modo de ejemplo, proporcionar funcionalidad adicional al polipeptido, incorporando un anticuerpo y cualquier combinacion de las modificaciones mencionadas anteriormente.

[0193] Tambien se describen en el presente documento derivados de enlazadores de dolastatina que tienen o pueden modificarse para contener un grupo oxima, carbonilo, dicarbonilo o hidroxilamina. Con este aspecto se incluyen metodos para producir, purificar, caracterizar y utilizar dichos derivados de enlazadores de dolastatina.

[0194] El derivado del enlazador de dolastatina puede contener al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o diez o mas de un grupo carbonilo o dicarbonilo, un grupo oxima, un grupo hidroxilamina o sus formas protegidas. El derivado del enlazador de dolastatina puede ser igual o diferente, por ejemplo, puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o mas sitios diferentes en el derivado que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o mas grupos reactivos diferentes.

A. Estructura y sintesis de los derivados del enlazador de dolastatina: grupos electrofilos y nucleofilos [0195] Los derivados de dolastatina con enlazadores que contienen un grupo hidroxilamina (tambien llamado aminooxi) permiten que la reaccion con una variedad de grupos electrofflicos forme conjugados (incluidos, entre otros, PEG u otros polfmeros solubles en agua). Al igual que las hidrazinas, hidrazidas y semicarbazidas, la nucleofilicidad mejorada del grupo aminooxi le permite reaccionar de manera eficiente y selectiva con una variedad de moleculas que contienen grupos carbonilo o dicarbonilo, que incluyen, entre otros, cetonas, aldehfdos u otros grupos funcionales con similares reaccion quimica. Vease, por ejemplo, Shao, J. y Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117: 3893 - 3899 (1995); H. Hang y C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34 (9): 727-736 (2001). Mientras que el resultado de la reaccion con un grupo hidrazina es la hidrazona correspondiente, sin embargo, una oxima resulta generalmente de la reaccion de un grupo aminooxi con un grupo que contiene carbonilo o dicarbonilo tal como, a modo de ejemplo, una cetonas, aldehfdos u otros grupos funcionales con reactividad qmmica similar. En algunas realizaciones, los derivados de la dolastatina con enlazadores que comprenden una azida, alquino o cicloalquino permiten la union de moleculas mediante reacciones de cicloadicion (por ejemplo, cicloadiciones 1,3-dipolares, cicloadicion Huisgen de azidaalquino, etc.). (Descrito en la patente de EE.UU. N° 7.807.619).

[0196] Por lo tanto, en ciertas descripciones descritas en el presente documento son derivados de dolastatina con enlazadores que comprenden una hidroxilamina, aldehfdo, aldehfdo protegido, cetona, cetona protegida, tioester, ester, dicarbonilo, hidrazina, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquina, y el grupo eno-diona hidroxilamina, un grupo similar a la hidroxilamina (que tiene una reactividad similar a un grupo hidroxilamina y es estructuralmente similar a un grupo hidroxilamina), un grupo hidroxilamina enmascarado (que puede convertirse facilmente en un grupo hidroxilamina), o grupo hidroxilamina protegido (que tiene una reactividad similar a un grupo hidroxilamina tras la desproteccion). En algunas descripciones, los derivados de dolastatina con enlazadores comprenden azidas, alquinos o cicloalquinos. La presente invencion proporciona derivados de enlazadores de dolastatina que incluyen compuestos que tienen la estructura de Formula (I), (ill), (IV), (V) y (VI):

en donde:

Z tiene la estructura de:

R⁵es H, CORs, alquilo C¹-C⁶o tiazol;

R8 es OH o -NH-(alquileno-O)n-NH²;

R6 es OH o H;

Ar es fenilo o piridina;

R⁷es alquilo C¹-C⁶o hidrogeno;

Y y V se seleccionan cada uno del grupo que consiste en una hidroxilamina;

L, Li, L², L³y L⁴son cada uno de los enlazadores seleccionados del grupo que consiste en un enlace, alquileno, alquileno-C(O)-, alquileno-J-, -(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)nJ-, -(alquileno-O)nJ-alquileno-, -(alquileno-O)n-(CH2)n'-NHC(OHCH2)n'-C(Me)2-S-S-(CH2)n''-NHC(O)-(alquileno-O)n"-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W -, alquileno-C(O)-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-, alquileno'-J-(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno', -J-(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-(alquileno-O) n”alquileno-J'-, -W-, alquileno-W-, alquileno'-J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J-(alquileno-NMe)nalquileno-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-; -J-alquileno-NMe-alquileno'-NMe-alquileno'-W-, y -alquileno-J-alquileno'-NMe-alquileno'-NMe-alquileno'-W-;

W tiene la estructura de:

U tiene la estructura de:

cada J y J' independientemente tienen la estructura de:

cada n, n' n”, n"“ y n”” son independientemente enteros mayores o iguales a uno; y

o L esta ausente, Y es metilo, R⁵es COR8 y R8 es -NH-(alquileno-O)n-NH².

Dichos derivados del enlazador de dolastatina pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse a un polipeptido de aminoacido no natural, polfmero, polisacarido o polinucleotido y, opcionalmente, se pueden modificar posteriormente.

[0197] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), (III) y (V), R⁵es tiazol o acido carboxflico. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), (III) y (V), R⁵es hidrogeno. En ciertas realizaciones de los compuestos de Formula (I), (III) y (V), R⁵es metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo o hexilo. En ciertas realizaciones de los compuestos de Formula (I), (III) y (V), R⁵es -NH-(alquileno-O)n-NH², en donde alquileno es -CH²-, -CH²CH²-, -CH²CH²CH²-, CH²CH²CH²CH²-, - CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2 -, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, o CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (IV) y (VI), R⁵es -NH-(alquileno-O)n-NH², en donde n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 48, 4 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,

76, 77, 78, 79, 8 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100.

[0198] En dertas realizaciones de compuestos de Formula (I), (III) y (V), R⁶es H. En algunas realizaciones de los

compuestos de Formula (I), (III) y (V), R⁶es hidroxi.

[0199] En deltas realizaciones de compuestos de Formula (I), (III) y (V), Ar es fenilo.

[0200] En dertas realizaciones de compuestos de Formula (I), (III), (IV), (V) y (VI), R⁷es metilo, etilo, propilo,

isopropilo, butilo, sec-butilo, iso-butilo, terc-butilo, pentilo o hexilo. En dertas realizaciones de compuestos de

Formula (I), (III), (IV), (V) y (VI), R⁷es hidrogeno.

[0201] En dertas realizaciones de los compuestos de Formula (I), (III), (IV), (V) y (VI), cada L, L¹, L², L³y L⁴es

independientemente un enlazador escindible o no enlazador escindible. En dertas realizaciones de compuestos de

Formula (I), (III), (IV), (V) y (VI), cada L, L¹, L², L³y L⁴es independientemente un enlazador derivatizado de oligo

(etilenglicol).

[0202] En dertas realizaciones de compuestos de Formula (I), (III), (IV), (V) y (VI), cada alquileno, alquileno',

alquileno” y alquileno'" independientemente es -CH²-, -CH²CH²-, -CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²-, -CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-,

-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, o -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-. En ciertas

realizaciones de los compuestos de Formula (XIV), (XV), (XVI), (XVII) y (XVIII), cada n, n', n”, n'” y n”” es 0, 1,2, 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,

37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,

68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,

99 o 100.

A. Estructura y sintesis de derivados del enlazador de dolastatina: grupos hidroxilamina

[0203] Por lo tanto, en dertas realizaciones descritas en este documento son derivados de dolastatina con

enlazadores que comprenden un grupo hidroxilamina. Tales derivados del enlazador de dolastatina incluyen

compuestos que tienen la estructura de Formula (I):

en donde:

Z tiene la estructura de:

R⁵es H, CORs, alquilo C¹-C⁶o tiazol;

Re es OH o -NH-(alquileno-O)n-NH²;

R6 es OH o H;

Ar es fenilo o piridina;

R⁷es alquilo C¹-C⁶o hidrogeno;

Y es NH²-O-;

L es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en -alquileno-, -alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-(CH²)n'-NHC(O)-(CH²)n'-C(Me)²-S-S-(CH²)n'"-NHC(O)-(alquileno-O)n”” - alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W-, -alquileno-C(O)-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(O)-, y-(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-;

W tiene la estructura de:

U tiene la estructura de:

o L esta ausente, Y es metilo, R⁵es CORs y R8 es -NH-(alquileno-O)n-NH²; y cada n, n', n”, n'” y n”” son independientemente enteros mayores o iguales a uno. Dichos derivados del enlazador de dolastatina pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacido no natural, polfmero, polisacarido o polinucleotido y, opcionalmente, se pueden modificar posteriormente.

[0204] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), R⁵es tiazol. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), R⁵es hidrogeno. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), R⁵es metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo o hexilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), R⁵es -NH-(alquileno-O)n-NH², en donde alquileno es -CH²-, -CH²CH²-, -CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH², CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²- o -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), R⁵es -NH-(alquileno-O)n-NH², en donde n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100.

[0205] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), R6 es H. En algunas realizaciones de compuestos de Formula (I), R6 es hidroxi.

[0206] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), Ar es fenilo.

[0207] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), R⁷es metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, see-butilo iso-butilo, terc-butilo, pentilo o hexilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), R⁷es hidrogeno.

[0208] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), Y es hidroxilamina, aldehndo, aldehndo protegido, cetona, cetona protegida, tioester, ester, dicarbonilo, hidrazina, amidina, imina, diamina, cetoamina, ceto-alquina, o eno-diona. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), V es una hidroxilamina, metilo, aldehndo, aldehndo protegido, cetona, cetona protegida, tioester, ester, dicarbonilo, hidrazina, amidina, imina, diamina, cetoamina, cetoalina, y eno-diona.

[0209] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), cada L es independientemente un enlazador escindible o un enlazador no escindible. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), cada L es independientemente un enlazador derivado de oligo (etilenglicol).

[0210] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), el alquileno es -CH²-, -CH²CH²-, -CH²CH²CH²-, -CH2CH2CH2CH2, CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, o -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), cada n, n', n”, n'” y n”” es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,

91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100.

[0211] En dertas realizaciones, los derivados del enlazador de dolastatina incluyen compuestos que tienen la

estructura de Formula (II):

En algunas realizaciones de compuestos de Formula (II), L es -(alquileno-O)n-alquileno-. En algunas realizaciones,

cada alquileno es -CH²CH²-, n es igual a 3 y R⁷es metilo. En algunas realizaciones, L es -alquileno-. En algunas

realizaciones de compuestos de Formula (II), cada alquileno es -CH²CH²-y R⁷es metilo o hidrogeno. En algunas

realizaciones de compuestos de Formula (II), L es -(alquileno-O)n-alquileno-C(O)-. En algunas realizaciones de

compuestos de Formula (II), cada alquileno es -CH²CH²-, n es igual a 4, y R⁷es metilo. En algunas realizaciones de

compuestos de Formula (II), L es -(alquileno-O)n-(CH²)n-NHC(O)-(CH²)n-C(Me)²-S-S-(CH²)n""-NHC(O)-(alquileno-O)n""-alquileno-. En algunas realizaciones de compuestos de Formula (II), cada alquileno es -CH²CH²-, n es igual a 1,

n' es igual a 2, n" es igual a 1, n"" es igual a 2, n”” es igual a 4, y R⁷es metilo. Dichos derivados del enlazador de

dolastatina pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse a un polipeptido de aminoacido no natural,

polfmero, polisacarido o polinucleotido y, opcionalmente, se pueden modificar posteriormente.

[0212] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (II), cada L es independientemente un enlazador

escindible o un enlazador no escindible. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (II), cada L es

independientemente un enlazador derivado de oligo (etilenglicol).

[0213] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (II), R⁷es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, secbutilo, iso-butilo, terc-butilo, pentilo o hexilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (II), R⁷es

hidrogeno.

[0214] En ciertas formas de realizacion de los compuestos de Formula (II), el alquileno es -CH²-, -CH²CH²-, -CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH², CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, o -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (II), cada n,

n', n”, n'” y n”” es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,

29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 5 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 8 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100.

[0215] Tales derivados de enlazadores de dolastatina incluyen compuestos que tienen la estructura de Formula (III),

(IV), (V) o (VI):

en donde:

Z tiene la estructura de;

R⁵es H, COR8, alquilo C¹-C⁶o tiazol;

R8 es OH;

R6 es OH o H;

Ar es fenilo o piridina;

R⁷es alquilo C¹-C⁶o hidrogeno;

Y es NH²-O-;

V es O-NH²

L¹, L², L³y L⁴son cada uno de ellos enlazadores seleccionados independientemente del grupo que consiste en un enlace, alquileno, -(alquileno-O)n-alquileno-J-, alquileno'-J-(alquileno-O)n-alquileno-, -J-(alquileno-O)nalquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-(alquileno-O)n-alquileno-J'-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno'-, -W-, -alquileno-W-, alquileno'-J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J-alquileno-NMealquileno'-NMe-alquileno"-W-, y -alquileno-J-alquileno'-NMe-alquileno"-NMe-alquileno”'-W-;

W tiene la estructura de:

cada J y J' independientemente tienen la estructura de:

y

cada n yn' son independientemente numeros enteros mayores o iguales a uno.

[0216] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III), (IV), (V) o (VI), R⁵es tiazol. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III), (IV), (V) o (VI), R6 es H. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III), (IV) , (V) o (VI), RA es fenilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III), (IV), (V) o (VI), R⁷es metilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III), (IV), (V) o (VI), n y n' son numeros enteros de 0 a 20. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III), (IV), (V) o (VI), n y n' son numeros enteros de 0 a 10. En ciertas realizaciones de los compuestos de Formula (III), (IV), (V) o (VI), n y n' son numeros enteros de 0 a 5,

[0217] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III) y (V), R⁵es tiazol o acido carboxflico. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III) y (V), R⁵es hidrogeno. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III) y (V), R⁵es metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo o hexilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III) y (V), R⁵es -NH-(alquileno-O)n-NH², en donde alquileno es -CH²-, -CH²CH²-, -CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, o CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III) y (V), R⁵es -NH-(alquileno-O)n-NH², en donde n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100.

[0218] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III), (IV), (V) y (VI), R6 es H. En algunas realizaciones de los compuestos de Formula (III), (IV), (V) y (VI), R6 es hidroxi.

[0219] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III), (IV), (V) y (VI), Ar es fenilo.

[0220] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III), (IV), (V) y (VI), R⁷es metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo, iso-butilo, terc-butilo, pentilo o hexilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III), (IV), (V) y (VI), R⁷es hidrogeno.

[0221] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III) y (V), Y es hidroxilamina, aldehudo, aldehudo protegido, cetona, cetona protegida, tioester, ester, dicarbonilo, hidrazina, amidina, imina, diamina, ceto amina, cetoalquino, o eno-diona. En ciertas realizaciones de los compuestos de Formula (IV) y (VI), V es una hidroxilamina, metilo, aldetudo, aldetudo protegido, cetona, cetona protegida, tioester, ester, dicarbonilo, hidrazina, amidina, imina, diamina, cetoamina, ceto-alquino, y eno-diona.

[0222] En ciertas realizaciones de los compuestos de Formula (XIV), (XV), (XVI), (XVII) y (XVIII), cada L, L¹, L², L³y L⁴es independientemente un enlazador escindible o no enlazador escindible. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), (XV), (XVI), (XVII) y (XVIII), cada L, L¹, L², L³y L⁴es independientemente un enlazador derivatizado de oligo (etilenglicol).

[0223] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III), (IV), (V) y (VI), cada alquileno, alquileno', alquileno”, y alquileno”' independientemente es -CH²-, -CH²CH²-, -CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, o -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III), (IV), (V) y (VI), alquileno es metileno, etileno, propileno, butilenos, pentileno, hexileno o heptileno.

[0224] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (III), (IV), (V) y (VI), cada n yn ' independientemente es 0, 1, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27. 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47. 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57. 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77. 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87. 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 o 100.

[0225] En ciertas realizaciones, los derivados de enlazador de dolastatina incluyen compuestos que tienen la estructura de Formula (VII):

[0226] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VII), L¹es -(alquileno-O)n-alquileno-J-, L²es -alquileno'-J'-(alquileno-O)n'-alquileno-, L³es -J"-(alquileno-O)n"-alquileno-, alquileno es -CH²CH²-, alquileno' es -(CH²)⁴-, n es 1, n' y n" son 3, J tiene la estructura de

J' y J” tienen la estructura de

y R⁷es metilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VII), L¹es -J-(alquileno-O)n-alquileno-, L²es-(alquileno-O)n'-alquileno-J'-alquileno'-, L³es-(alquileno-O)n”-alquileno-J" -, alquileno es -CH²CH²-, alquileno' es-(CH²)⁴-, n es 1, n' y n” son 4, y J, J' y J” tienen la estructura de

[0227] En ciertas realizaciones, los compuestos de Formula (I)-(VII) son estables en solucion acuosa durante al menos 1 mes en condiciones levemente acidas. En ciertas realizaciones, los compuestos de Formula (I)-(VII) son estables durante al menos 2 semanas en condiciones ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, el compuesto de Formula (I)-(VII) es estable durante al menos 5 dfas en condiciones ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, tales condiciones acidas son pH²a 8.

[0228] Los metodos y composiciones proporcionados y descritos en el presente documento incluyen polipeptidos que comprenden un derivado de enlazador de dolastatina que contiene al menos un grupo carbonilo o dicarbonilo, un grupo oxima, un grupo hidroxilamina o formas protegidas o enmascaradas de los mismos. La introduccion de al menos un grupo reactivo en un derivado de enlazador de dolastatina puede permitir la aplicacion de qmmicas de conjugacion que involucren reacciones qmmicas espedficas, que incluyen, entre otros, uno o mas derivados de enlazador de dolastatina, mientras que no reaccionan con los que ocurren comunmente aminoacidos. Una vez incorporadas, las cadenas laterales derivadas del enlazador de dolastatina tambien pueden modificarse utilizando metodologfas qmmicas descritas en el presente documento o adecuadas para los grupos funcionales o sustituyentes particulares presentes en el derivado del enlazador de dolastatina.

[0229] Los metodos y composiciones derivados del enlazador de dolastatina descritos en el presente documento proporcionan conjugados de sustancias que tienen una amplia variedad de grupos funcionales, sustituyentes o restos, con otras sustancias que incluyen, entre otras, un polfmero; un polfmero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; una segunda protema o polipeptido o analogo de polipeptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; y cualquier combinacion de los mismos.

[0230] En ciertas realizaciones, los derivados del enlazador de dolastatina, los enlazadores y los reactivos descritos en el presente documento, incluidos los compuestos de Formulas (I)-(VII) son estables en solucion acuosa en condiciones levemente acidas (incluidos, entre otros, pH²a 8). En otras realizaciones, tales compuestos son estables durante al menos un mes en condiciones ligeramente acidas. En otras realizaciones, tales compuestos son estables durante al menos 2 semanas en condiciones ligeramente acidas. En otras realizaciones, tales compuestos son estables durante al menos 5 dfas en condiciones ligeramente acidas.

[0231] En otro aspecto de las composiciones, los metodos, las tecnicas y las estrategias descritas en el presente documento son metodos para estudiar o utilizar cualquiera de los derivados del enlazador de dolastatina de aminoacidos no naturales "modificados o no modificados" mencionados anteriormente. Se incluyen en este aspecto, solo a modo de ejemplo, los usos terapeuticos, diagnosticos, basados en ensayos, industriales, cosmeticos, de biologfa vegetal, ambientales, de produccion de energfa, de consumo y/o militares que se beneficianan de un derivado de dolastatina enlazador que comprende un polipeptido o protema de aminoacido no natural "modificado o no modificado".

[0232] Los ejemplos no limitantes de derivados de enlazadores de dolastatina incluyen:

Ċ

[0233] En otro aspecto de la presente invencion, el farmaco conjugado con el anticuerpo anti-CD70 es dexametasona. En otro aspecto de la presente invencion, el farmaco conjugado con el anticuerpo anti-CD70 es dasantinib. En otro aspecto de la presente invencion, el farmaco conjugado con el anticuerpo anti-CD70 es FK506. En otro aspecto de la presente invencion, el farmaco conjugado con el anticuerpo anti-CD70 es un derivado de dexametasona. En otro aspecto de la presente invencion, el farmaco conjugado con el anticuerpo anti-CD70 es un derivado de dasantinib. En otro aspecto de la presente invencion, el farmaco conjugado con el anticuerpo anti-CD70 es un derivado de FK506.

[0234] En otros aspectos de la presente invencion, la porcion de enlazador-farmaco del conjugado de farmaco con anticuerpo anti-CD7o se elige de uno de los siguientes ejemplos no limitativos:

IV. Derivados de aminoacidos no naturales

[0235] Los aminoacidos no naturales utilizados en los metodos y composiciones descritas en este documento tienen al menos una de las siguientes cuatro propiedades: (1) al menos un grupo funcional en la cadena lateral del aminoacido no natural tiene al menos una caractenstica y/o actividad y/o reactividad ortogonales a la reactividad qmmica de los 20 aminoacidos comunes codificados geneticamente (es decir, alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistema, glutamina, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina), o al menos ortogonales a la reactividad qmmica de los aminoacidos naturales presentes en el polipeptido que incluye el aminoacido no natural; (2) los aminoacidos no naturales introducidos son sustancialmente inertes qmmicamente hacia los 20 aminoacidos comunes codificados geneticamente; (3) el aminoacido no natural puede incorporarse de manera estable en un polipeptido, preferiblemente con la estabilidad proporcional a los aminoacidos naturales o en condiciones fisiologicas tipicas, y ademas, preferiblemente, dicha incorporacion puede ocurrir a traves de un sistema in vivo; y (4) el aminoacido no natural incluye un grupo funcional oxima o un grupo funcional que puede transformarse en un grupo oxima al reaccionar con un reactivo, preferiblemente en condiciones que no destruyen las propiedades biologicas del polipeptido que incluye el no aminoacido natural (a menos que, por supuesto, tal destruccion de las propiedades biologicas sea el proposito de la modificacion/transformacion), o donde la transformacion pueda ocurrir en condiciones acuosas a un pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8, o donde el sitio reactivo en el aminoacido no natural es un sitio electrofflico. Se puede introducir cualquier numero de aminoacidos no naturales en el polipeptido. Los aminoacidos no naturales tambien pueden incluir oximas protegidas o enmascaradas o grupos protegidos o enmascarados que pueden transformarse en un grupo oxima despues de la desproteccion del grupo protegido o desenmascaramiento del grupo enmascarado. Los aminoacidos no naturales tambien pueden incluir grupos carbonilo o dicarbonilo protegidos o enmascarados, que pueden transformarse en un grupo carbonilo o dicarbonilo despues de la desproteccion del grupo protegido o enmascaramiento del grupo enmascarado y, por lo tanto, estan disponibles para reaccionar con las hidroxilaminas o las oximas para formar grupos de oximas.

[0236] Los aminoacidos no naturales que pueden usarse en los metodos y composiciones descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, aminoacidos que comprenden aminoacidos con nuevos grupos funcionales, aminoacidos que interactuan de forma covalente o no covalente con otras moleculas, aminoacidos glucosilados tales como una serina sustituida con azucar, otros aminoacidos modificados con carbohidratos, aminoacidos que contienen ceto, aminoacidos que contienen aldehfdo, aminoacidos que comprenden polietilenglicol u otros polieteres, aminoacidos sustituidos con atomos pesados, aminoacidos qmmicamente escindibles y/o aminoacidos foto-liberables, aminoacidos con cadenas laterales alargadas en comparacion con los aminoacidos naturales, incluidos, entre otros, polieteres o hidrocarburos de cadena larga, incluidos, entre otros, mas de aproximadamente 5 o mas de aproximadamente 10 carbonos, aminoacidos que contienen azucares enlazados, aminoacidos activos redox, aminoacidos que contienen amino tioacidos y aminoacidos que comprenden uno o mas restos toxicos.

[0237] En algunas realizaciones, los aminoacidos no naturales comprenden un resto sacarido. Los ejemplos de tales aminoacidos incluyen N-acetilo-L-glucosaminilo-L-serina, N-acetilo-L-galactosaminilo-L-serina, N-acetilo-L-glucosaminilo-L-treonina, N-acetilo-L-glucosaminilo L-asparagina y O-manosaminilo-L-serina. Los ejemplos de tales aminoacidos tambien incluyen ejemplos en los que el enlace N- u O- que se produce naturalmente entre el aminoacido y el sacarido se reemplaza por un enlace covalente que no se encuentra comunmente en naturaleza -incluyendo pero no limitado a, un alqueno, una oxima, un tioeter, una amida y similares. Los ejemplos de tales aminoacidos tambien incluyen sacaridos que no se encuentran comunmente en protemas naturales tales como 2-desoxi-glucosa, 2-desoxigalactosa y similares.

[0238] Los restos qmmicos incorporados en polipeptidos a traves de la incorporacion de aminoacidos no naturales en tales polipeptidos ofrecen una variedad de ventajas y manipulaciones de polipeptidos. Por ejemplo, la reactividad unica de un grupo funcional carbonilo o dicarbonilo (incluido un grupo funcional ceto o aldehudo) permite la modificacion selectiva de protemas con cualquiera de una serie de reactivos que contienen hidrazina o hidroxilamina in vivo e in vitro. Un aminoacido no natural de atomo pesado, por ejemplo, puede ser util para la eliminacion de datos de estructura de rayos X. La introduccion espedfica al sitio de atomos pesados que utilizan aminoacidos no naturales tambien proporciona selectividad y flexibilidad en la eleccion de las posiciones para los atomos pesados. Aminoacidos fotorreactivos no naturales (incluidos, entre otros, aminoacidos con benzofenona y arilazidas (incluidas, entre otros, cadenas laterales de fenilazida)), por ejemplo, permiten un eficaz fotointraccion in vivo e in vitro de polipeptidos. Los ejemplos de aminoacidos no naturales fotorreactivos incluyen, pero no se limitan a, p-azidofenilalanina y p-benzono-fenilalanina. El polipeptido con los aminoacidos no naturales fotorreactivos puede entonces reticularse a voluntad mediante la excitacion del control temporal que proporciona el grupo fotorreactivo. En un ejemplo no limitativo, el grupo metilo de un amino no natural se puede sustituir con un marcador isotopico, que incluye pero no se limita a, con un grupo metilo, como una sonda de estructura y dinamica local, que incluye pero no se limita con el uso de resonancia magnetica nuclear y espectroscopia vibracional.

A. Estructura y sintesis de los derivados de aminoacidos no naturales: carbonilo, de tipo carbonilo, carbonilo enmascarado y carbonilo protegido.

[0239] Los aminoacidos con un grupo reactivo electrofilo permiten una variedad de reacciones para unir moleculas mediante diversas reacciones qmmicas, que incluyen, entre otras, reacciones de adicion nucleofflica. Dichos grupos reactivos electrofflicos incluyen un grupo carbonilo o dicarbonilo (incluido un grupo ceto o aldehido), un grupo similar a carbonilo o dicarbonilo (que tiene una reactividad similar a un grupo carbonilo o dicarbonilo y es estructuralmente similar a un grupo carbonilo o dicarbonilo), un grupo enmascarado carbonilo o dicarbonilo enmascarado (que se puede convertir facilmente en un grupo carbonilo o dicarbonilo), o un grupo carbonilo protegido o dicarbonilo protegido (que tiene una reactividad similar a un grupo carbonilo o dicarbonilo tras la desproteccion). Tales aminoacidos utilizados en la invencion incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXVII):

en donde:

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- donde K es ¹, ²o 3, -S(0)k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -Ns (O)²-, -OS(O)²-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno) o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(0)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, - C(R')=N-N=, -C(R>N=N-, y -C(R')²-N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

K es

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

cada R” es independientemente H, alquilo, alquilo sustituido o un grupo protector, o cuando mas de un grupo R" esta presente, dos R” forman opcionalmente un heterocicloalquilo;

Ri y/o R²es un anticuerpo aCD70,

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 1, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 1 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural, o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 10, en donde el aminoacido 122 de la SEQ ID NO. 10 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 17, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 17 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; y cada uno de R³y R⁴es independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o R³y R⁴o dos grupos R³forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo;

o los grupos -A-B-K-R forman juntos un cicloalquilo o heterocicloalquilo bidclico o tridclico que comprende al menos un grupo carbonilo, que incluye un grupo dicarbonilo, un grupo carbonilo protegido, que incluye un grupo dicarbonilo protegido, o un grupo carbonilo enmascarado, que incluye un grupo dicarbonilo enmascarado;

o el grupo -K-R juntos forma un cicloalquilo monodclico o bidclico o heterocicloalquilo que comprende al menos un grupo carbonilo, que incluye un grupo dicarbonilo, un grupo carbonilo protegido, que incluye un grupo dicarbonilo protegido, o un grupo carbonilo enmascarado, que incluye un grupo dicarbonilo enmascarado;

con la condicion de que cuando A sea fenileno y cada R³sea H, B este presente; y que cuando A es-(CH²)⁴- y cada R³es H, B no es -NHC(O)(CH²CH²)-; y que cuando A y B estan ausentes y cada R³es H, R no es metilo. Dichos aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacido no natural, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado de forma postraduccional.

[0240] En ciertas realizaciones, los compuestos de Formula (XXXVII) son estables en solucion acuosa durante al menos 1 mes en condiciones ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, los compuestos de Formula (XXXVII) son estables durante al menos 2 semanas en condiciones ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, el compuesto de Formula (XXXVII) es estable durante al menos 5 dfas en condiciones ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, tales condiciones acidas son pH 2 a 8,

[0241] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XXXVII), B es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(R')=N-N(R')-, -N(R')CO-, -C(O)-, -C(R')=N-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)(alquileno o alquileno sustituido)-, o -S(O)²(alquileno o alquileno sustituido)-. En

ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XXXVII), B es -O(CH²)-, -CH=N-, -CH=N-NH-, -NHCH²-, -NHCO-, -C(O)-, -C(O)-(CH²)-, -CONH-(CH²)-, -SCH²-, - S(=O)CH²-, o -S(O)²CH²-. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XXXVII), R es C^1-6alquilo o cicloalquilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XXXVII), R es -CH³, -CH(CHa)², o ciclopropilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XXXVII), Ri es H, tercbutilxicarbonilo (Boc), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), N-acetilo, tetrafluoroacetilo (TFA) o bencilxicarbonilo (Cbz). En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XXXVII), Ri es una resina, aminoacido, polipeptido, anticuerpo o polinucleotido. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XXXVII), R²es OH, O-metilo, O-etilo o O-tbutilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XXXVII), R²es una resina, aminoacido, polipeptido, anticuerpo o polinucleotido. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XXXVII), R²es un polinucleotido. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XXXVII), R²es acido ribonucleico (ARN).

[0242] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XXXVII),

se selecciona del grupo que consiste en:

(i) A es alquileno inferior sustituido, arileno C⁴, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido;

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador divalente seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S(O)-, -S(O)²-, -NS(O)²-, -OS(O)²-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)²N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)²N(R')-, -N(R')-N=, - C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')²-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-;

(ii) A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior sustituido, arileno C⁴, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido;

B es un enlazador divalente seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S(O)-, -S(O)²-, -NS(O)²-, - OS(O)²-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -c Sn (R')-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')²-N=N-, y -C(R')²-N(R')-N(R')-;

(iii) A es alquileno inferior;

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador divalente seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S(O)-, -S(O)²-, -NS(O)²-, -OS(O)²-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CSN(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')²-N=N-, y -C(R')²-N(R')-N(R')-; y

(iv) A es fenileno;

B es un enlazador divalente seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S(O)-, -S(O)²-, -NS(O)²-, -OS(O)²-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C^sN(R')-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')^c(^o)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')²-N=N-, y -C(R')²-N(R')-N(R')-;

K es

cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo aCD70,

cada R³y R⁴es independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

[0243] Ademas, los aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXVIII) se incluyen:

en donde:

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- donde K es 1, 2 o 3, -S(O)k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -Ns (O)²-, -OS(O)²-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno) o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)^kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R>N=N-, y -C (R > N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

R¹y/o R²es un anticuerpo aCD70,

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 1, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 1 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural, o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 10, en donde el aminoacido 122 de la SEQ ID NO. 10 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 17, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 17 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural;

con la condicion de que cuando A es fenileno, B esta presente; y que cuando A es-(CH²)⁴-, B no es NHC(O)(CH²CH²)-; y que cuando A y B estan ausentes, R no es metilo. Dichos aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacido no natural, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado de forma postraduccional.

[0244] Ademas, los aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXIX) se incluyen:

en donde:

B es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)^k- donde K es 1, 2 o 3, -S(O)K(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(O)²-, -OS(O)²-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -c (s )-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, - CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o

alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)^kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')²-N=N- y -C (R > N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo aCD70,

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 1, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 1 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural, o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 10, en donde el aminoacido 122 de la SEQ ID NO. 10 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 17. en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 17 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; cada RA se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')², -C(O)kR” donde K es 1, 2 o 3, -C(O)N(R')², -OR” y -S(O)^kR”, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Dichos aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacido no natural, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado de forma postraduccional.

[0245] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos:

Dichos aminoacidos no naturales pueden ser, opcionalmente, un grupo amino protegido, carboxilo protegido y/o en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacido no natural, poUmero, polisacarido o un polinucleotido y opcionalmente postraduccionalmente. modificado.

[0246] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXX):

en donde

-NS(O)²-, -OS(O)²-, opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)^k- donde K es 1, 2 o 3, -S(0)^k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')²-N=N-, y -C (R > N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo aCD70,

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 1, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 1 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural, o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 10, en donde el aminoacido 122 de la SEQ ID NO. 10 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 17, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 17 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(O)kR”

donde K es 1, 2 o 3, -C(O)N(R')², -OR', y -S(O)kR”, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; y n es 0 a 8;

con la condicion de que cuando A es-(CH²)⁴-, B no es NHC(O)(CH²CH²)-. Dichos aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacido no natural, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado de forma postraduccional.

[0247] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos:

en donde dichos compuestos estan opcionalmente protegidos con amino, opcionalmente protegidos con carboxilo, opcionalmente protegidos con amino y protegidos con carboxilo, o una sal de los mismos, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacido no natural, polfmero, polisacarido o un polinucleotido y opcionalmente postraduccionalmente modificado.

[0248] Ademas, se describen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXI):

en donde,

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)^k- donde K es 1, 2 o 3, -S(0)^k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -Ns(O)²-, -OS(O)²-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-,

-C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')²-N=N-, y -C(R>N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R²es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido.

D ichos a m ino ac id os no na tu ra les pueden e s ta r en fo rm a de una sal, o pueden in co rp o ra rse en un po lip ep tido de a m in o a c id o no na tura l, poKm ero, po lisa ca rido , o un po lin u c le o tid o y o p c io n a lm e n te m od ifica do de fo rm a po s tra du cc ion a l.

[0249] Ademas, se describen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXII):

en donde,

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- donde K es 1, 2 o 3, -S(0)k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -Ns(O)²-, -OS(O)²-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno) o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(0)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')²-N=N-, y -C (R > N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y

R²es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido;

en donde cada RA se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')², -C(O)kR” donde K es 1, 2 o 3, -C(O)N(R')², -OR', y -S(0)^kR”, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido.

Dichos aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacido no natural, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado de forma postraduccional.

[0250] Ademas, se describen los siguientes aminoacidos:

[0251] Ademas, se describen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXIV):

en donde,

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- donde K es 1, 2 o 3, -S(O)k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -Ns(O)²-, -OS(O)²-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno) o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)^kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')²-N=N-, y -C (R > N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')², -C(O)kR” donde K es 1, 2 o 3, -C(O)N(R')², -OR', y -S(0)kR”, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; y n es 0 a 8.

[0252] Ademas, se describen los siguientes aminoacidos:

y

[0253] Ademas de las estructuras de monocarbonilo, los aminoacidos no naturales descritos aqrn pueden incluir grupos tales como dicarbonilo, similares a dicarbonilo, dicarbonilo enmascarado y grupos de dicarbonilo protegidos. Por ejemplo, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXV):

en donde,

A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior sustituido, alquinileno heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido;

heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)^k- donde k es 1, 2 o 3, -S(0)^k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -N^s(O)²-, -OS(O)²-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno) o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(0)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)^kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')²-N=N-, y -C (R > N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo aCD70,

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 1, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 1 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural, o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 10, en donde el aminoacido 122 de la SEQ ID NO. 10 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 17, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 17 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural;.

[0254] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXVI):

en donde,

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)^k- donde k es 1, 2 o 3, -S(O)^k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -N^s(O)²-, -OS(O)²-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno) o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R>N=N-, y -C (R > N(R')-N(R')-,

donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo aCD70,

en donde cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')², -C(O)kR” donde k es 1, 2 o 3, -C(O)N(R')², -OR', y -S(O)kR', donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido.

[0255] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos:

en donde tales compuestos estan opcionalmente protegidos con amino y protegidos con carboxilo, o una sal de los mismos. Dichos aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacido no natural, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado de forma postraduccional.

[0256] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXVII):

en donde,

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- donde k es 1, 2 o 3, -S(O)k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -Ns (O)²-, -OS(O)²-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno) o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)^kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R>N=N-, y -C (R > N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

R¹y/o R²es un anticuerpo aCD70,

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 1, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 1 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural, o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 10, en este documento el aminoacido 122 de la SEQ ID NO. 10 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 17, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 17 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')², -C(O)kR' donde k es 1, 2 o 3, -C(O)N(R')², -OR', y -S(O)kR', donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; y

n es 0 a 8,

Dichos aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacido no natural, pokmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado de forma postraduccional.

[0257] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos

en donde tales compuestos estan opcionalmente protegidos con amino y protegidos con carboxilo, o una sal de los mismos, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacido no natural, polfmero, polisacarido o un polinucleotido y opcionalmente modificado postraduccionalmente.

[0258] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXVIII):

en donde:

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

R¹y/o R²es un anticuerpo aCD70,

X¹es C, S o S(O); y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido), donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido.

D ichos a m ino ac id os no na tu ra les pueden e s ta r en fo rm a de una sal, o pueden in co rp o ra rse en un p o lip ep tido de a m in o a c id o no na tura l, poKm ero, po lisa ca rido , o un po lin u c le o tid o y o p c io n a lm e n te m od ifica do de fo rm a po s tra du cc ion a l.

[0259] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXIX):

en donde:

A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno inferior, heteroalquileno inferior, heterocicloalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido;

heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo aCD70,

L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido), donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido.

[0260] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXX):

en donde:

A es opcional, y cuando esta presente alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno inferior, heteroalquileno inferior, heterocicloalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido; heterarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

R¹y/o R²es un anticuerpo aCD70,

[0261] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXXI):

en donde:

A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno inferior, heteroalquileno inferior, heterocicloalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno sustituido, arileno; heterarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo aCD70,

X¹es C, S o S(O); y n es 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y cada R⁸y R⁹en cada grupo CR⁸R⁹se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alcoxi, alquilamina, halogeno, alquilo, arilo, o cualquier R8 y R⁹pueden formar juntos =O o un cicloalquilo, o cualquier grupo R8 adyacente puede Juntos forman un cicloalquilo.

[0262] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXXII):

en donde:

A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno inferior, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

R¹y/o R²es un anticuerpo aCD70,

e;

n es 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y cada R8 y R⁹en cada grupo CR⁸R⁹se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alcoxi, alquilamina, halogeno, alquilo, arilo, o cualquier R8 y R⁹pueden llegar a formar =O o un cicloalquilo, o cualquiera de los grupos R8 adyacentes pueden formar juntos un cicloalquilo.

[0263] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXXIII):

en donde:

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo aCD70,

n es 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y cada R8 y R⁹en cada grupo CR⁸R⁹se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alcoxi, alquilamina, halogeno, alquilo, arilo, o cualquier R8 y R⁹pueden formar juntos =O o un cicloalquilo, o cualquier grupo R8 adyacente puede Juntos forman un cicloalquilo.

[0264] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXXIV):

en donde:

A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno inferior, heteroalquileno inferior, heterocicloalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido; heterarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

R¹y/o R²es un anticuerpo aCD70,

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 1, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 1 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural, o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 10, en donde el aminoacido 122 de la SEQ ID NO. 10 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 17, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 17 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; Xi es C, S o S(O); y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R')(alquileno) o N(R')(alquileno sustituido), donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido.

[0265] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXXV):

en donde:

A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno inferior, heteroalquileno inferior, heterocicloalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno sustituido, arileno; heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo aCD70,

L es alquileno, alquileno sustituido, N(R')(alquileno) o N(R')(alquileno sustituido), donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido.

Dichos aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacido no natural, polfmero, polisacarido o un polinucleotido y, opcionalmente, se pueden modificar posteriormente.

[0266] Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXXVI):

en donde:

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

R¹es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y

[0267] Ademas, se describen los aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXXVII):

en donde:

A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno inferior, heteroalquileno inferior, heterocicloalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno sustituido, arileno; heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; M es -C(R³)-,

donde (a) indica la union al grupo A y (b) indica la union a los grupos carbonilo respectivos, R³y R⁴se eligen independientemente de H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido, o R³y R⁴o dos R³los grupos o dos grupos R⁴forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo;

R es H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

T³es un enlace, C(R)(R), O o S, y R es H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

R²es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido.

[0268] Ademas, se describen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXXVIII):

en donde:

M es -C(Ra)-

R²es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')², -C(O)kR' donde k es 1, 2 o 3, -C(O)N(R')², -OR', y -S(O)kR', donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Dichos aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacido no natural, pobmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado de forma postraduccional.

[0269] Ademas, se describen los aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXXIX):

en donde:

R es H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; y

T³es O, o S.

Dichos aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacido no natural, pobmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado de forma postraduccional.

[0270] Ademas, los aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXXX) se describen:

en donde:

R es H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido.

[0271] Ademas, se describen los siguientes aminoacidos que tienen estructuras de Formula (XXXXXX):

[0272] La funcionalidad carbonilo o dicarbonilo se puede hacer reaccionar selectivamente con un reactivo que contiene hidroxilamina en condiciones suaves en solucion acuosa para formar el enlace de oxima correspondiente que es estable en condiciones fisiologicas. Vease, por ejemplo, Jencks, WP, J. Am. Chem. Soc. 81, 475- 48l (1959); Shao, J. y Tam, JP, J. Am. Chem. Soc. 117 (14): 3893-3899 (1995). Ademas, la reactividad unica del grupo carbonilo o dicarbonilo permite la modificacion selectiva en presencia de otras cadenas laterales de aminoacidos. Vease, por ejemplo, Cornish, VW, et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 8150-8151 (1996); Geoghegan, KF & Stroh, JG, Bioconjug. Chem. 3: 138-146 (1992); Mahal, LK, et al., Science 276: 1125-1128 (1997).

[0273] La smtesis de p-acetilo-(+/-)-fenilalanina y m-acetilo-(+/-)-fenilalanina se describe en Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Se pueden preparar de manera similar otros aminoacidos que contienen carbonilo o dicarbonilo.

[0274] En algunas realizaciones, un polipeptido que comprende un aminoacido no natural se modifica qmmicamente para generar un grupo funcional reactivo carbonilo o dicarbonilo. Por ejemplo, una funcionalidad aldehfdo util para reacciones de conjugacion puede generarse a partir de una funcionalidad que tiene grupos amino e hidroxilo adyacentes. Cuando la molecula biologicamente activa es un polipeptido, por ejemplo, se puede usar una serina N-terminal o treonina (que puede estar normalmente presente o expuesta mediante digestion qrnmica o enzimatica) para generar una funcionalidad aldehfdo en condiciones de escision oxidativa suave usando periodato. Vease, por ejemplo, Gaertner, et. al., bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. y Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3: 138 146 (1992); Gaertner y otros, J. Biol. Chem. 269: 7224-7230 (1994). Sin embargo, los metodos conocidos en la tecnica estan restringidos al aminoacido en el extremo N del peptido o protema.

[0275] Adicionalmente, a modo de ejemplo, un aminoacido no natural que lleva grupos hidroxilo y amino adyacentes puede incorporarse en un polipeptido como una funcionalidad aldehfdo "enmascarada". Por ejemplo, la 5-hidroxilisina contiene un grupo hidroxilo adyacente a la amina epsilon. Las condiciones de reaccion para generar el aldehfdo tfpicamente implican la adicion de un exceso molar de metaperyodato de sodio en condiciones suaves para evitar la oxidacion en otros sitios dentro del polipeptido. El pH de la reaccion de oxidacion es tfpicamente alrededor de 7,0. Una reaccion tfpica implica la adicion de aproximadamente 1,5 exceso molar de meta periodato de sodio a una solucion tamponada del polipeptido, seguida de incubacion durante aproximadamente 10 minutos en la oscuridad. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 6.423.685.

II. Derivados de dolastatina unidos a aminoacidos no naturales

[0276] En otro aspecto descrito en el presente documento se encuentran metodos, estrategias y tecnicas para incorporar al menos uno de tales derivados de enlazadores de dolastatina en un aminoacido no natural. Tambien se incluyen con este aspecto los metodos para producir, purificar, caracterizar y usar dichos derivados de enlazadores de dolastatina que contienen al menos uno de tales aminoacidos no naturales. Tambien se incluyen con este aspecto las composiciones y los metodos para producir, purificar, caracterizar y usar oligonucleotidos (incluidos el ADN y el ARN) que se pueden usar para producir, al menos en parte, un derivado del enlazador de dolastatina que contiene al menos un aminoacido no natural. Tambien se incluyen con este aspecto composiciones y metodos para producir, purificar, caracterizar y usar celulas que pueden expresar tales oligonucleotidos que pueden usarse para producir, al menos en parte, un derivado de enlazador de dolastatina que contiene al menos un aminoacido no natural.

[0277] Por lo tanto, los derivados del enlazador de dolastatina que comprenden al menos un aminoacido no natural o un aminoacido no natural modificado con un grupo carbonilo, dicarbonilo, alquino, cicloalquino, azida, oxima o hidroxilamina se proporcionan y se describen en el presente documento. En ciertas realizaciones, los derivados del enlazador de dolastatina con al menos un aminoacido no natural o un aminoacido no natural modificado con un grupo carbonilo, dicarbonilo, alquino, cicloalquino, azida, oxima o hidroxilamina incluyen al menos una modificacion postraduccional en alguna posicion en el polipeptido. En algunas realizaciones, la modificacion co-traduccional o postraduccional se produce a traves de la maquinaria celular (por ejemplo, glicosilacion, acetilacion, acilacion, modificacion de lfpidos, palmitoilacion, adicion de palmitato, fosforilacion, modificacion del enlace glicolfpido y similares), en muchas instancias, tales modificaciones co-traduccionales o postraduccionales basadas en maquinaria celular ocurren en los sitios de aminoacidos de origen natural en el polipeptido, sin embargo, en ciertas realizaciones, las modificaciones co-traduccionales o postraduccionales basadas en maquinaria celular se producen en el (los) sitio(s) de aminoacidos no naturales en el polipeptido.

[0278] En otras realizaciones, la modificacion postraduccional no utiliza la maquinaria celular, pero la funcionalidad se proporciona en su lugar mediante la union de una molecula (un polfmero, un polfmero soluble en agua, un derivado del polietilenglicol, una segunda protema o polipeptido o analogo de polipeptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y cualquier combinacion de los mismos, que comprende un segundo grupo reactivo al menos un aminoacido no natural que comprende un primer grupo reactivo (incluidos, entre otros, aminoacidos no naturales que contienen un grupo funcional cetona, aldetndo, acetal, hemiacetal, alquino, cicloalquino, azida, oxima o hidroxilamina, que utilizan la metodologfa qmmica descrita en este documento, u otros adecuados para los grupos reactivos particulares. En ciertas realizaciones, la modificacion co-traduccional o postraduccional se realiza in vivo en una celula eucariota o en una celula no eucariotica. En ciertas realizaciones, la modificacion postraduccional se realiza in vitro y no utiliza la maquinaria celular. Tambien se incluyen con este aspecto los metodos para producir, purificar, caracterizar y usar dichos derivados de enlazadores de dolastatina que contienen al menos uno de tales aminoacidos no naturales modificados de forma cotraduccional o postranslacional.

[0279] Tambien se incluyen dentro del alcance de los metodos, composiciones, estrategias y tecnicas descritas en el presente documento reactivos capaces de reaccionar con un derivado enlazador de dolastatina (que contiene un grupo carbonilo o dicarbonilo, grupo oxima, alquino, cicloalquino, azida, grupo hidroxilamina, o formas enmascaradas o protegidas de los mismos) que forma parte de un polipeptido para producir cualquiera de las modificaciones postraduccionales mencionadas anteriormente. En ciertas realizaciones, el derivado de enlace de dolastatina modificado postraduccional resultante contendra al menos un grupo oxima; el derivado de enlazador de dolastatina que contiene oxima modificado resultante puede sufrir reacciones de modificacion subsiguientes. Tambien se incluyen con este aspecto los metodos para producir, purificar, caracterizar y usar dichos reactivos que son capaces de realizar dichas modificaciones postraduccionales de tales derivados de enlazadores de dolastatina.

[0280] En ciertas realizaciones, el polipeptido o derivado de dolastatina unido a aminoacido no natural incluye al menos una modificacion co-traduccional o postraduccional que se realiza in vivo por una celula huesped, donde la modificacion postraduccional normalmente no es realizada por otro tipo de celula huesped. En ciertas realizaciones, el polipeptido incluye al menos una modificacion de co-traduccion o postraduccion que se realiza in vivo por una celula eucariota, donde la modificacion de co-traduccion o postraduccion normalmente no es realizada por una celula no eucariota. Los ejemplos de tales modificaciones co-traduccionales o postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, glicosilacion, acetilacion, acilacion, modificacion de lfpidos, palmitoilacion, adicion de palmitato, fosforilacion, modificacion de enlace de glicolfpidos y similares. En una realizacion, la modificacion co-traduccional o postraduccional comprende la union de un oligosacarido a una asparagina por un enlace GlcNAc-asparagina (que incluye pero no se limita a, donde el oligosacarido comprende (GlcNAc-Man)²-Man-GlcNAc-GlcNAc, y similares). En otra realizacion, la modificacion co-traduccional o postraduccional comprende la union de un oligosacarido (incluyendo pero no limitado a, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a una serina o treonina por GalNAc-serina, GalNActreonina, GlcNAc-serina, o un enlace GlcNAc-treonina. En ciertas realizaciones, una protema o polipeptido puede comprender una secuencia de secrecion o localizacion, una etiqueta de epftopo, una etiqueta FLAG, una etiqueta de polihistidina, una fusion con GST y/o similares. Tambien se incluyen con este aspecto los metodos para producir, purificar, caracterizar y usar tales polipeptidos que contienen al menos una de tales modificaciones cotraduccionales o postraduccionales. En otras realizaciones, el polipeptido de aminoacido no natural glicosilado se produce en una forma no glicosilada. Dicha forma no glicosilada de un aminoacido no natural glicosilado se puede producir mediante metodos que incluyen la eliminacion qmmica o enzimatica de grupos oligosacaridos de un polipeptido de aminoacido no natural glicosilado aislado o sustancialmente purificado o no purificado; La produccion de un aminoacido no natural en un huesped que no glicosila tal como un polipeptido de aminoacido no natural (como un huesped que incluye, procariotas o eucariotas modificados o mutados para no glicosilar dicho polipeptido), la introduccion de un inhibidor de glicosilacion en el medio de cultivo celular en el que un polipeptido de aminoacido no natural esta siendo producido por un eucariota que normalmente glicosilana tal polipeptido, o una combinacion de cualquiera de tales metodos. Tambien se describen en el presente documento tales formas no glicosiladas de polipeptidos de aminoacidos no naturales normalmente glicosilados (glicosilado normalmente significa un polipeptido que se glicosilana cuando se produjera en condiciones en las que los polipeptidos naturales se glicosilan). Por supuesto, tales formas no glicosiladas de polipeptidos de aminoacidos no naturales normalmente glicosilados (o de hecho cualquier polipeptido descrito en el presente documento) pueden estar en una forma no purificada, una forma sustancialmente purificada o en una forma aislada.

[0281] En ciertas realizaciones, el polipeptido de aminoacido no natural incluye al menos una modificacion postraduccional que se realiza en presencia de un acelerante, en el que la modificacion postraduccional es estequiometrica, similar a la estequiometrica, o casi estequiometrica. En otras realizaciones, el polipeptido se pone en contacto con un reactivo de Formula (XIX) en presencia de un acelerante. En otras realizaciones, el acelerante se selecciona del grupo que consiste en:

A. Sintesis quimica de derivados de dolastatina unidos a aminoacidos no naturales: derivados de dolastatina enlazados que contienen oxima

[0282] Los derivados unidos a dolastatina de aminoacidos no naturales que contienen un grupo oxima permiten la reaccion con una variedad de reactivos que contienen ciertos grupos carbonilo o dicarbonilo reactivos (incluidos, entre otros, cetonas, aldehfdos u otros grupos con reactividad similar)) para formar nuevos aminoacidos no naturales que comprenden un nuevo grupo oxima. Tal reaccion de intercambio de oxima permite una mayor funcionalizacion de los derivados unidos a dolastatina. Ademas, el derivado original enlazado a dolastatina que contiene un grupo oxima puede ser util por sf mismo siempre que el enlace oxima sea estable en las condiciones necesarias para incorporar el aminoacido en un polipeptido (por ejemplo, los metodos sinteticos in vivo, in vitro y qrnmicos aqrn descritos).

[0283] Por lo tanto, en ciertas realizaciones descritas aqrn estan aminoacidos no naturales unidos a derivados de dolastatina con cadenas laterales que comprenden un grupo oxima, un grupo similar a la oxima (que tiene una reactividad similar a un grupo oxima y es estructuralmente similar a un grupo oxima), un grupo oxima enmascarado (que se puede convertir facilmente en un grupo oxima), o un grupo oxima protegido (que tiene una reactividad similar a un grupo oxima en caso de desproteccion).

[0284] Tales derivados de aminoacidos no naturales unidos a dolastatina incluyen derivados unidos a dolastatina que tienen la estructura de Formula (VIII) o (IX):

en donde:

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- donde k es 1, 2 o 3, -S(0)k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)^kN (R)”)-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R>N=N-, y -C(R')²-N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo anti-CD70 (aCD70),

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 17, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 17 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural;

R³y R⁴son cada uno independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o R³y R⁴o dos grupos R³forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo;

Z tiene la estructura de:

R8 es H, COR8, alquilo C¹-C⁶o tiazol;

R8 es OH

R6 es OH o H;

Ar es fenilo o piridina;

R⁷es alquilo C¹-C⁶o hidrogeno;

L es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en -alquileno-, -alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-(CH²)n'-NHC(OHCH²)n'-C(Me)²-S-S-(CH²)n"-NHC(O)-(alquileno-O)n""-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W-, -alquileno-C(O)-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(O)-, y-(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-;

W tiene la estructura de:

U tiene la estructura de:

y

cada n, n', n”, n'” y n”” son independientemente enteros mayores o iguales a uno;

[0285] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) y (IX), R⁵es tiazol. En ciertas realizaciones de

compuestos de Formula (VIII) y (IX), R6 es H. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) y (IX), Ra es

fenilo, En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) y (IX), R⁷es metilo. En ciertas realizaciones de

compuestos de Formula (VIII) y (IX), n es un numero entero de 0 a 20. En ciertas realizaciones de compuestos de

Formula (VIII) y (IX), n es un numero entero de 0 a 10, En ciertas En realizaciones de compuestos de Formula (VIII)

y (IX), n es un numero entero de 0 a 5,

[0286] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) y (IX), R⁵es tiazol. En ciertas realizaciones de

compuestos de Formula (VIII) y (IX), R⁵es hidrogeno. En ciertas realizaciones de los compuestos de Formula (VIII) y

(IX), R⁵es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo o hexilo, en ciertas

realizaciones de compuestos de Formula (VIII) y (IX), R⁵es -NH-(alquileno-O)n-NH², en donde el alquileno es -CH²-,

-CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, o -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) y (IX),

R⁵es -NH-(alquileno-O)n-NH², en donde n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,

22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 4 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 8 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100.

[0288] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) y (IX), R6 es H.

[0289] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) y (IX), Ar es fenilo.

[0290] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) y (IX), R⁷es metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo,

sec-butilo iso-butilo, terc-butilo, pentilo o hexilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) y (IX), R⁷

es hidrogeno.

[0291] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) y (IX), cada L es independientemente un enlazador escindible o un enlazador no escindible. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) y (IX), cada L es independientemente un enlazador derivado de oligo (etilenglicol).

[0292] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) y (IX), cada alquileno, alquileno', alquileno”, y alquileno”' independientemente es -CH²-, -CH²CH²-, -CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²-, CH²CH²CH²CH²CH²-, CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, o -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) y (IX), alquileno es metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno o heptileno,

[0293] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) y (IX), cada n, n', n”, n'” y n”” independientemente es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100.

[0294] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) o (IX), R¹es un polipeptido. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) o (IX), R²es un polipeptido. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) o (IX), el polipeptido es un anticuerpo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (VIII) o (IX), el anticuerpo es herceptina.

[0295] Dichos aminoacidos no naturales unidos a dolastatina incluyen derivados unidos a dolastatina que tienen la estructura de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII):

en donde:

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)^k- donde k es 1, 2 o 3, -S(0)^k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-,

-C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(0)^kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)^kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')²-N=N- y -C (R > N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo aCD70,

Z tiene la estructura de:

R⁵es H, CO²H, alquilo C¹-C⁶o tiazol;

R6 es OH o H;

Ar es fenilo o piridina;

R⁷es alquilo C¹-C⁶o hidrogeno;

L¹, L², L³y L⁴son cada uno de ellos enlazadores seleccionados independientemente del grupo que consiste en un enlace, alquileno, -(alquileno-O)n-alquileno-J-, alquileno'-J-(alquileno-O)n-alquileno-, -J-(alquileno-O)nalquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-(alquileno-O)n-alquileno-J “-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno'-, -W-, -alquileno-W-, alquileno'-J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J-alquileno-NMealquileno'-NMe-alquileno'-W-, y -alquileno-J-alquileno'-NMe-alquileno'-NMe-alquileno”'-W-; W tiene la estructura de:

cada J y J' independientemente tienen la estructura de:

y

cada n yn' son independientemente numeros enteros mayores o iguales a uno.

[0296] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), R⁵es tiazol o acido carboxflico. En

ciertas realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), R6 es H. En ciertas realizaciones de

compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), Ar es fenilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (X),

(XI), (XII) o (XIII), R⁷es metilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), n yn ' son

numeros enteros de 0 a 20. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), n y n' son

numeros enteros de 0 a 10, En ciertas realizaciones de los compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), n y n' son

numeros enteros de 0 a 5.

[0297] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), R⁵es tiazol. En ciertas

realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), R⁵es hidrogeno. En ciertas realizaciones de

compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), R⁵es metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, tercbutilo, pentilo, o hexilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), R⁵es -NH-(alquileno-O)n-NH², en donde el alquileno es -CH²-, -CH²CH²-, -CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²--CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-,

-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, o- CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, En ciertas

realizaciones de formula (X), (XI), (XII) o (XIII), alquileno es metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno

o heptileno.

[0298] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), R⁵es -NH-(alquileno-O)n-NH², en

donde n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 2 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 6 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 9 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100.

[0299] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), R6 es H. En algunas realizaciones

de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), R6 es hidroxi.

[0300] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), Ar es fenilo.

[0301] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), R⁷es metilo, etilo, propilo,

isopropilo, butilo, sec-butilo, iso-butilo, terc-butilo, pentilo o hexilo. En ciertas realizaciones de compuestos de

Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), R⁷es hidrogeno.

[0302] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), cada L¹, L², L³y L⁴es

independientemente un enlazador escindible o un enlazador no escindible. En ciertas realizaciones de compuestos

de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), cada L¹, L², L³y L⁴es independientemente un enlazador derivado de oligo

(etilenglicol).

[0303] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), cada alquileno, alquileno',

alquileno" y alquileno'” independientemente es -CH²-, -CH²CH²-CH²CH²CH²-, -CH²CH²CH²CH²-, -CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-,

-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, o -CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²CH²-, En ciertas

realizaciones de compuestos de formula (X), (XI), (XII) o (XIII), alquileno es metileno, etileno, propileno, butileno,

pentileno, hexileno o heptileno.

[0304] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), cada n yn' independientemente es

0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 3 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 6 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 9 96, 97, 98, 99 o 100.

[0305] En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), R¹es un polipeptido. En ciertas

realizaciones de compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), R²es un polipeptido. En ciertas realizaciones de

compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), el polipeptido es un anticuerpo. En ciertas realizaciones de

compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), el anticuerpo es herceptina.

[0306] En ciertas realizaciones, los compuestos de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII) son estables en solucion acuosa

durante al menos 1 mes en condiciones ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, los compuestos de Formula

(X), (XI), (XII) o (XIII) son estables durante al menos 2 semanas en condiciones ligeramente acidas. En ciertas

realizaciones, el compuesto de Formula (X), (XI), (XII) o (XIII) son estables durante al menos 5 dfas en condiciones

ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, tales condiciones acidas son pH 2 a 8, Dichos aminoacidos no

naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacido no natural, poKmero, polisacarido o un polinucleotido y, opcionalmente, se pueden modificar posteriormente.

[0307] Los aminoacidos no naturales basados en oxima pueden sintetizarse mediante metodos ya descritos en la tecnica, o mediante los metodos descritos en el presente documento, que incluyen: (a) reaccion de un aminoacido no natural que contiene hidroxilamina con un carbonilo o dicarbonilo -con reactivo; (b) reaccion de un aminoacido no natural que contiene carbonilo o dicarbonilo con un reactivo que contiene hidroxilamina; o (c) reaccion de un aminoacido no natural que contiene oxima con ciertos reactivos que contienen carbonilo o dicarbonilo.

VI. Localizacion de aminoacidos no naturales en derivados de enlazador de dolastatina

[0308] Los metodos y composiciones descritas en este documento incluyen la incorporacion de uno o mas aminoacidos no naturales en un derivado enlazador de dolastatina. Se pueden incorporar uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones particulares que no interrumpan la actividad del derivado enlazante de dolastatina. Esto se puede lograr haciendo sustituciones "conservativas", que incluyen, entre otras, la sustitucion de aminoacidos hidrofobos con aminoacidos hidrofobos no naturales o naturales, aminoacidos voluminosos con aminoacidos voluminosos no naturales o naturales, aminoacidos hidrofilos con aminoacidos no hidrofilos aminoacidos naturales o hidrofilos naturales) y/o la insercion del aminoacido no natural en una ubicacion que no se requiere para la actividad.

[0309] Se puede emplear una variedad de enfoques bioqmmicos y estructurales para seleccionar los sitios deseados para la sustitucion con un aminoacido no natural dentro del derivado enlazante de dolastatina. En algunas realizaciones, el aminoacido no natural esta unido en el extremo C del derivado de dolastatina. En otras realizaciones, el aminoacido no natural esta unido en el extremo N del derivado de dolastatina. Cualquier posicion del derivado del enlazador de dolastatina es adecuada para que la seleccion incorpore un aminoacido no natural, y la seleccion puede basarse en un diseno racional o por seleccion aleatoria para uno o ningun proposito particular deseado. La seleccion de los sitios deseados se puede basar en la produccion de un polipeptido de aminoacido no natural (que puede modificarse aun mas o permanecer sin modificar) que tenga cualquier propiedad o actividad deseada, incluyendo pero

no se limita a un modulador de union al receptor, moduladores de la actividad del receptor, moduladores de la union a los pares aglutinantes, moduladores de la actividad del companero de union, moduladores de la conformacion del companero de union, formacion de dfmeros o multimeros, ningun cambio en la actividad o propiedad en comparacion con la molecula nativa, o la manipulacion de cualquier componente ffsico o propiedad qmmica del polipeptido como la solubilidad, agregacion o estabilidad. Alternativamente, los sitios identificados como cnticos para la actividad biologica tambien pueden ser buenos candidatos para la sustitucion con un aminoacido no natural, de nuevo dependiendo de la actividad deseada buscada para el polipeptido. Otra alternativa sena simplemente hacer sustituciones en serie en cada posicion en la cadena polipeptfdica con un aminoacido no natural y observar el efecto sobre las actividades del polipeptido. Cualquier medio, tecnica o metodo para seleccionar una posicion para la sustitucion con un aminoacido no natural en cualquier polipeptido es adecuado para uso en los metodos, tecnicas y composiciones descritas en el presente documento.

[0310] La estructura y la actividad de los mutantes de origen natural de un polipeptido que contienen deleciones tambien se pueden examinar para determinar las regiones de la protema que probablemente toleren la sustitucion con un aminoacido no natural. Una vez que se hayan eliminado los residuos que probablemente sean intolerantes a la sustitucion con aminoacidos no naturales, el impacto de las sustituciones propuestas en cada una de las posiciones restantes se puede examinar utilizando metodos que incluyen, entre otros, la estructura tridimensional de la estructura. polipeptido relevante, y cualquier ligando asociado o protemas de union. Las estructuras cristalograficas de rayos X y RMN de muchos polipeptidos estan disponibles en el Protein Data Bank (PDB, www.rcsb.org), una base de datos centralizada que contiene datos estructurales tridimensionales de grandes moleculas de protemas y acidos nucleicos, se puede emplear uno que identifique las posiciones de los aminoacidos que se pueden sustituir con aminoacidos no naturales. Ademas, se pueden hacer modelos investigando la estructura secundaria y terciaria de los polipeptidos, si no se dispone de datos estructurales tridimensionales. Por lo tanto, la identidad de las posiciones de aminoacidos que pueden sustituirse por aminoacidos no naturales se puede obtener facilmente.

[0311] Los sitios ejemplares de incorporacion de un aminoacido no natural incluyen, pero no se limitan a, aquellos que estan excluidos de las regiones de union a receptores potenciales, o las regiones para la union a protemas o ligandos de union pueden estar total o parcialmente expuestas a disolventes, tienen interacciones mmimas o nulas con enlaces de hidrogeno con residuos cercanos, pueden exponerse mmimamente a residuos reactivos cercanos, y/o pueden estar en regiones que son altamente flexibles segun lo predicho por la estructura cristalina tridimensional de un polipeptido particular con su receptor asociado, ligando o protemas de union.

[0312] Una amplia variedad de aminoacidos no naturales puede sustituirse o incorporarse a una posicion dada en un polipeptido. A modo de ejemplo, un aminoacido no natural particular puede seleccionarse para su incorporacion en base a un examen de la estructura cristalina tridimensional de un polipeptido con sus ligandos, receptores y/o protemas de union asociados, una preferencia por las sustituciones conservativas.

[0313] En una realizacion, los metodos descritos en el presente documento incluyen la incorporacion en el derivado de enlazador de dolastatina, en el que el derivado de enlazador de dolastatina comprende un primer grupo reactivo; y poner en contacto el derivado enlazador de dolastatina con una molecula (que incluye, entre otros, una segunda protema o polipeptido o analogo de polipeptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; y cualquier combinacion de los mismos) que comprende un segundo grupo reactivo. En ciertas realizaciones, el primer grupo reactivo es un resto de hidroxilamina y el segundo grupo reactivo es un resto carbonilo o dicarbonilo, por lo que se forma un enlace oxima. En ciertas realizaciones, el primer grupo reactivo es un resto carbonilo o dicarbonilo y el segundo grupo reactivo es un resto hidroxilamina, por lo que se forma un enlace oxima. En ciertas realizaciones, el primer grupo reactivo es un resto carbonilo o dicarbonilo y el segundo grupo reactivo es un resto oxima, por lo que se produce una reaccion de intercambio de oxima. En ciertas realizaciones, el primer grupo reactivo es un resto oxima y el segundo grupo reactivo es carbonilo o resto dicarbonilo, por lo que se produce una reaccion de intercambio de oxima.

[0314] En algunos casos, la incorporacion de los derivados del enlazador de dolastatina se combinara con otras adiciones, sustituciones o eliminaciones dentro del polipeptido para afectar otros rasgos qmmicos, ffsicos, farmacologicos y/o biologicos. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o deleciones pueden aumentar la estabilidad (incluida, entre otras, la resistencia a la degradacion proteolttica) del polipeptido o aumentar la afinidad del polipeptido por su receptor, ligando y/o protemas de union apropiados. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o eliminaciones pueden aumentar la solubilidad (incluyendo pero sin limitacion, cuando se expresan en E. coli u otras celulas huesped) del polipeptido. En algunas realizaciones, los sitios se seleccionan para la sustitucion con un aminoacido codificado de forma natural o no natural, ademas de otro sitio para la incorporacion de un aminoacido no natural con el proposito de aumentar la solubilidad del polipeptido despues de la expresion en E. coli, u otras celulas huesped recombinantes. En algunas realizaciones, los polipeptidos comprenden otra adicion, sustitucion o eliminacion que modula la afinidad por el ligando asociado, las protemas de union y/o el receptor, modula (incluyendo pero no limitado a, aumenta o disminuye) la dimerizacion del receptor, estabiliza los dfmeros del receptor, modula la vida media en circulacion, modula la liberacion o la biodisponibilidad, facilita la purificacion, o mejora o altera una via particular de administracion. De manera similar, el polipeptido de aminoacido no natural puede comprender secuencias de escision qmmica o enzimatica, secuencias de escision de proteasas, grupos reactivos, dominios de union a anticuerpos (incluidos, entre otros, FLAG o poli-His) u otras secuencias basadas en afinidad (incluidas pero no limitado a, FLAG, poli-His, GST, etc.) o moleculas unidas (incluyendo pero no limitado a, biotina) que mejoran la deteccion (incluyendo pero no limitado a, GFP), purificacion, transporte a traves de tejidos o membranas celulares, liberacion o activacion de profarmacos, reduccion de tamano u otros rasgos del polipeptido.

VII. Expresion de anti-CD 70 e interaccion de ligandos como ejemplo

[0315] Los metodos, composiciones, estrategias y tecnicas descritas en este documento no se limitan a un tipo, clase o familia particular de polipeptidos o protemas. De hecho, virtualmente cualquier polipeptido puede disenarse o modificarse para incluir al menos un aminoacido no natural "modificado o no modificado" que contiene un derivado de enlazador de dolastatina descrito en el presente documento. Solo a modo de ejemplo, el polipeptido puede ser homologo a una protema terapeutica seleccionada del grupo que consiste en: alfa-1 antitripsina, angiostatina, factor antihemolttico, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, anticuerpo monoclonal (por ejemplo, bevacizumab, cetuximab, panitumumab, infliximab, adalimumab, basiliximab, daclizumab, omalizumab, ustekinumab, etanercept, gemtuzumab, alemtuzumab, rituximab, trastuzumab, nimotuzumab, palivizumab, y abciximab), apolipoprotema, apoprotema, factor natriuretico atrial, polipeptido natriuretico atrial, peptido atrial, quimioquina C-X-C, T39765, NAP-2, EnA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, calcitonina, ligando c-kit, citocina, quimiocina CC, protema-1 quimioatrayente monocito, protema-2 quimioatrayente monocitos, protema-3 quimioatrayente monocitos, protema alfa-1 inflamada de monocitos, protema-i beta inflamada de monocitos, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligando CD40, ligando c-kit, colageno, colonia st factor de imitacion (LCR), factor de complemento 5a, inhibidor del complemento, receptor de complemento 1, citoquina, peptido activador de neutrofilos epiteliales-78, MIP-16, MCP-1, factor de crecimiento epidermico (eGF), peptido activador de neutrofilos epiteliales, eritropoyetina (EPO), toxina exfoliante, factor IX, factor VII, factor VIII, factor X, factor de crecimiento de fibroblastos (^fG^f), fibrinogeno, fibronectina, protema del paquete de cuatro helices, G-CSF, LPG-1, GM-CSF, glucocerebrosidasa, gonadotropina, crecimiento factor, receptor del factor de crecimiento, grf, protema hedgehog, hemoglobina, factor de crecimiento de hepatocitos (hGF), hirudina, hormona del crecimiento humano (hGH), albumina de suero humano, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferon (IFN), IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, interleucina (ILO), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, ⁱL-12, factor de crecimiento queratinocito (KGF), lactoferrina, factor inhibidor de la leucemia, luciferasa, neurturina, factor inhibidor de neutrofilos (NIF), oncostatina M, protema osteogenica, producto oncogenico, paracitonina, hormona paratiroidea, PD-ECSF, PDGF, hormona peptfdica, pleiotropina, protema A, protema G, pth, exotoxina pirogenica A, exotoxina pirogenica B, exotoxina pirogenica C, pyy, relaxina, renina, SCF, pequena protema biosintetica, receptor soluble del complemento I, I-CAM soluble, receptor soluble de la interleucina, receptor soluble de TNF, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptoquinasa, superantfgenos, enterotoxina estafilococo, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, receptor de hormonas esteroides, dismutasa de superoxido, toxina del smdrome de choque toxico, timosina alfa 1, activador de plasminogeno tisular, factor de crecimiento tumoral (TGF), factor de necrosis tumoral, factor de necrosis tumoral alfa, factor de necrosis tumoral beta, receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR), protema VLA-4, protema VCAM-1, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), uroquinasa, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, Mic, jun, myb, rel, receptor de estrogeno, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL y corticosterona.

[0316] Por lo tanto, la siguiente descripcion de un ADC ARX-anti-CD70, anti-CD70-2H5-HA119-NCA, y CD70-2H5-HA119-NCA1 se proporciona con fines ilustrativos y a modo de ejemplo no limitativo de Alcance de los metodos, composiciones, estrategias y tecnicas descritas en este documento.

[0317] CD70-2H5-HA119-NCA1 es un conjugado de farmaco con anticuerpo monoclonal humanizado que interactua con el ligando CD27 que funciona, por ejemplo no limitativo, al promover la supervivencia celular y la expansion de las celulas T CD8 cebadas con antigeno, formacion de celulas T de memoria y proliferacion de celulas B. Se han encontrado receptores CD70 en densidades altas en tejido canceroso, por ejemplo 34000-189000 copias por celula (Caki-1, 786-O, L-428, UMRC3, LP-1, DBTRG-05 MG) (anticuerpo dirigido contra CD70)-conjugado de farmaco con mdice terapeutico incrementado, Molecular Cancer Therapeutics, 2008) y en tejido no canceroso y/o tejido normal, los receptores se encuentran en 5%-15% de celulas T activadas y l0%-25% de celulas B activadas. Se ha encontrado expresion de CD70 en ~ 40% de los aislamientos de mieloma multiple (Caracterizacion preclmica de SGN-70, un anticuerpo humanizado dirigido contra CD70, Cancer Therapy; Preclinical, 2008) y confirmo la expresion de CD70 en un alto porcentaje de, por ejemplo, linfoma de Hodgkin Celulas de Reed-Sternberg, linfoma no Hodgkin y tumores de carcinoma de celulas renales. CD70 es una protema de membrana integral de tipo II de la familia TNF. Para los fines de esta invencion, es posible que el anticuerpo aCD70 sea cualquier anticuerpo CD70 conocido con un acido amino no codificado de forma natural. Para propositos de ilustracion, los anticuerpos CD70-2H5-HA119-NCA1 se describen en la Tabla 1,

[0318] En una realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende una region constante anti-CD70 que comprende la SEQ ID NO: 3 con un aminoacido no codificado de forma natural. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende una region constante anti-CD70 que comprende la SEQ ID NO: 4. En una realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende una region constante anti-CD70 que comprende la SEQ ID NO: 3 en donde un aminoacido es un aminoacido no codificado de forma natural. En una realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende una region constante anti-CD70 que comprende la SEQ ID NO: 3 en la que el primer aminoacido es un aminoacido no codificado de forma natural. En una realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende una region constante anti-CD70 que comprende la SEQ ID NO: 4 en la que un aminoacido es un aminoacido no codificado de forma natural. En una realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende una region anti-CD70 que comprende la SEQ ID NO: 4 en la que el primer aminoacido es un aminoacido no codificado de forma natural. En una realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 con una cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1, En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 con una cadena pesada variable de SEQ ID NO: 10. En una realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 con una cadena ligera variable de SEQ ID NO: 2, En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 con una cadena ligera variable de SEQ ID NO: 11, En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende una cadena pesada de SEQ ID NO. 1 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 2, en otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende una cadena pesada de SEQ ID NO. 10 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 11, En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende una cadena pesada de SEQ ID NO. 1 y una luz ligera de SEQ ID NO. 2 y una region constante. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende una cadena pesada de SEQ ID NO. 10 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 11 y una region constante. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende una cadena pesada de SEQ ID NO. 10 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 11 y una region constante que comprende la SEQ ID NO.3. En otra realizacion de la presente invencion, hay un aminoacido no codificado de forma natural en la secuencia de anticuerpo anti-CD70. En otra realizacion de la presente invencion, hay mas de un aminoacido no codificado de forma natural en la secuencia de anticuerpo anti-CD70. En otra realizacion de la presente invencion, el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 1 esta sustituido con un aminoacido no codificado de forma natural. En otra realizacion de la presente invencion, el aminoacido 122 de la SEQ ID NO. 10 esta sustituido con un aminoacido no codificado de forma natural. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende una cadena pesada de SEQ ID NO. 1 y una cadena ligera de SEQ ID NO. 2 y una region constante que comprende la SEQ ID NO. 3, En otras realizaciones de la presente invencion, mas de un aminoacido no codificado de forma natural esta sustituido en el anticuerpo anti-CD70. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada con 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoacidos no codificados de forma natural. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo aCD70 comprende la SEQ ID NO. 4 y regiones variables anti-CD70 proporcionadas en la Solicitud de patente de EE.UU. publicada 20100150950.

[0319] En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural y una homologfa del 90% con la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural y una homologfa del 90% con la SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural y un 90% de homologfa con la SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos con uno o mas aminoacidos codificados de forma no natural y 95 % de homologfa con la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural y una homologfa del 95% con la SEQ ID. NO: 2. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural y una homologfa del 95% con la SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural y un 96% de homologfa con la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural y un 96% de homologfa con la SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos con uno o mas aminoacidos codificados de forma no natural y 96% de homologfa con la SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos con uno o mas aminoacidos no codificados naturalmente y una homologfa del 97% con la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural y una homologfa del 97% con la SEQ ID. NO: 2. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural y una homologfa del 97% con la SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural y un 98% de homologfa con la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural y un 98% de homologfa con la SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural y un 98% de homologfa con la SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos de aminoacidos no codificados de forma natural y una homologfa del 99% con la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos, aminoacidos no codificados de forma natural y una homologfa del 99% con la SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoacidos, un aminoacido no codificado de forma natural y una homologfa del 99% con la SEQ ID NO: 3. La seleccion del sitio del aminoacido no codificado de forma natural se describe dentro de esta especificacion, y como se refiere espedficamente a los anticuerpos a-CD70, se seleccionaron los sitios en funcion de la exposicion a la superficie/accesibilidad al sitio dentro del anticuerpo y se seleccionaron los sitios hidrofago/aminoacido neutro para mantener la carga en el anticuerpo.

Tabla 1: SECUENCIAS DE AMINOACIDO DE ANTICUERPO Y NUCLEOTIDOS

(Continuado)

(Continuado)

(Continuado)

(Continuado)

[0320] En una realizacion, la presente invencion proporciona un conjugado de farmaco de anticuerpo aCD70 (ADC o un aCD70-ADC) en el que el anticuerpo es un aCD70 que comprende una cadena ligera y pesada. En otra realizacion de la presente invencion se proporciona un aCD70-ADC que comprende una cadena pesada (SEQ. ID NO.: 1). En otra realizacion de la presente invencion, se proporciona un aCD70-ADC que comprende una luz (SEQ. ID. NO.: 2). En otra realizacion de la presente invencion se proporciona un aCD70-ADC que comprende una cadena pesada (SEQ. ID. NO.: 10). En otra realizacion de la presente invencion se proporciona un aCD70-ADC que comprende una luz (SEQ. ID. NO.: 11). En otra realizacion de la presente invencion, se proporciona un aCD70-ADC que comprende una cadena ligera (SEQ. ID. NO.: 2) y pesada (SEQ. ID. NO.: 1). En otra realizacion de la presente invencion se proporciona un aCD70-ADC que comprende una cadena ligera (SEQ. ID. NO.: 11) y pesada (SEQ. ID. NO.: 10). En algunas realizaciones de la presente invencion, la region constante, SEQ ID NO. 3 o 4, ha mutado cualquiera de las posiciones de aminoacidos seleccionadas del grupo 115, 116, 117. En algunas realizaciones de la presente invencion, se hacen mutaciones en el anticuerpo para inhibir la funcion de ADCC. En algunas realizaciones de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural sustituidos en una o mas posiciones de la SEQ ID NO: 1, En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural sustituidos en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 1. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoacido no codificado de forma natural sustituido en una posicion en la SEQ ID NO: 1, otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoacido no codificado naturalmente sustituido en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 1. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende es un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos no codificados naturalmente sustituidos en una o mas posiciones de la SEQ ID NO: 2, En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas amino codificados de forma no natural acidos sustituidos en las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de la SEQ ID NO: 2. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoacido no naturalmente codificado sustituido en una posicion en la SEQ ID NO: 2. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoacido no codificado de forma natural sustituido en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones de SEQ ID NO: 2.

[0321] En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural sustituidos en una o mas posiciones de la SEQ ID NO: 3. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos codificados de forma no natural sustituidos en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 3. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoacido no codificado de forma natural sustituido en una posicion en la SEQ ID NO: 3. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con anticuerpos no naturalmente codificados sustituidos en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 3.

[0322] En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural sustituidos en una o mas posiciones de la SEQ ID NO: 10. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos codificados de forma no natural sustituidos en las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de la SEQ ID NO: 10. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoacido no codificado de forma natural sustituido en una posicion en la SEQ ID NO: 10. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoacido no codificado de forma natural sustituido en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 10.

[0323] En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos codificados de forma no natural sustituidos en una o mas posiciones de la SEQ ID NO: 11. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos no codificados naturalmente sustituidos en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 11. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoacido no codificado de forma natural sustituido en una posicion en la SEQ ID NO: 11. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoacido no codificado de forma natural sustituido en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 11,

[0324] En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos codificados de forma no natural sustituidos en una o mas posiciones de la SEQ ID NO: 4. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos codificados de forma no natural sustituidos en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 4. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoacido no codificado de forma natural sustituido en una posicion en la SEQ ID NO: 4. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoacido no codificado de forma natural sustituido en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 4.

[0325] En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural sustituidos en 1, 2, 3, 4 o 5 posiciones de la SEQ ID NO: 1. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos codificados de forma no natural sustituidos en 1, 2 o 3 posiciones de la SEQ ID NO: 1. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos codificados de forma no natural sustituidos en 1 o 2 posiciones de la SEQ ID NO: 1. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con dos aminoacidos codificados de forma no natural sustituidos en 2 posiciones de la SEQ ID NO: 1. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoacido no codificado de forma natural sustituido en una posicion de la SEQ ID NO: 1. En otra realizacion de la presente invencion, la al anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 3. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 4. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 5. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 6. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 7. En otra realizacion En la realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 8. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 1 y una cadena pesada del anticuerpo aCD70. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 1 y una cadena pesada de anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO. 2 en la que la cadena pesada comprende uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 1 y una cadena pesada de anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO. 2 donde la cadena pesada comprende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoacidos no codificados de forma natural. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 1 y una cadena pesada de anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO. 2 en donde la cadena pesada comprende 1, 2, 3, 4 o 5 aminoacidos no codificados de forma natural. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 1 y una cadena pesada de anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO. 2 en el que la cadena pesada comprende 1, 2 o 3 aminoacidos no codificados de forma natural. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 1 y una cadena pesada de anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO. 2 en la que la cadena pesada comprende dos aminoacidos codificados de forma no natural. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 1 y una cadena pesada de anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO. 2 en la que la cadena pesada comprende un aminoacido no codificado de forma natural. En otra realizacion, la presente invencion proporciona un aCD70-ADC que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 9. En otra realizacion, la presente invencion proporciona un aCD70-ADC que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 10. En otra realizacion, la presente invencion proporciona un aCD70-ADC que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 11. En otra realizacion, la presente invencion proporciona un aCD70-ADC que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 12, En otra realizacion, la presente invencion proporciona un aCD70-ADC que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 13, En otra realizacion, la presente invencion proporciona un aCD70-ADC que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 14.

[0326] En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos codificados de forma no natural sustituidos en una o mas posiciones de la SEQ ID NO: 2. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos codificados de forma no natural sustituidos en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 2. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos codificados de forma no natural sustituidos en las posiciones 1, 2, 3, 4 o 5 de la SEQ ID NO: 2. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos no codificados naturalmente sustituidos en 1, 2 o 3 posiciones de la SEQ ID NO: 2. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o mas aminoacidos no codificados naturalmente sustituidos en 1 o 2 posiciones de la SEQ ID NO: 2. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con dos aminoacidos no codificados naturalmente sustituidos en 2 posiciones de la SEQ ID NO: 2. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoacido no codificado de forma natural sustituido en una posicion de la SEQ ID NO: 2. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 9. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 10. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 11. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 12. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 13. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 14. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 2 y una cadena ligera de anticuerpo aCD70. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera de anticuerpo aCD70. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera de anticuerpo aCD70. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera de anticuerpo aCD70. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera de anticuerpo aCD70. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera de anticuerpo aCD70. En otra realizacion de la presente invencion, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera de anticuerpo aCD70.

[0327] Como un ejemplo adicional, no limitativo, la siguiente descripcion del trastuzumab del anticuerpo HER2 se proporciona con fines ilustrativos y solo a modo de ejemplo, y no como un lfmite en el alcance de los metodos, composiciones, estrategias y tecnicas descritas en este documento. Ademas, la referencia al trastuzumab en esta solicitud esta destinada a utilizar el termino generico como ejemplo de cualquier anticuerpo. Por lo tanto, se entiende que las modificaciones y los compuestos qmmicos descritos en el presente documento con referencia al trastuzumab pueden aplicarse igualmente a cualquier anticuerpo o anticuerpo monoclonal, incluidos los enumerados espedficamente en este documento.

[0328] Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado que se une al dominio IV del segmento extracelular del receptor HER2/neu. El gen HER2 (tambien conocido como HER2/neu y el gen ERbb2) se amplifica en 20-30% de los canceres de mama en etapa temprana, lo que lo hace sobreexpresado. Ademas, en el cancer, el HER2 puede enviar senales sin que lleguen mitogenos y se unan a cualquier receptor, haciendolo hiperactivo.

[0329] HER2 se extiende a traves de la membrana celular y transporta senales desde el exterior de la celula hacia el interior. En personas sanas, los compuestos de senalizacion llamados mitogenos llegan a la membrana celular y se unen a la parte externa de otros miembros de la familia de receptores HER. Esos receptores enlazados se enlazan (dimerizan) con HER2, activandolo. HER2 luego envfa una senal al interior de la celula. La senal pasa por diferentes vfas bioqmmicas. Esto incluye la ruta PI3K/Akt y la ruta MAPK. Estas senales promueven la invasion, la supervivencia y el crecimiento de los vasos sangumeos (angiogenesis) de las celulas.

[0330] Las celulas tratadas con trastuzumab se detienen durante la fase G1 del ciclo celular, por lo que se reduce la proliferacion. Se ha sugerido que el trastuzumab induce parte de su efecto mediante la regulacion a la baja de HER2/neu, que conduce a la interrupcion de la dimerizacion del receptor y la senalizacion a traves de la cascada PI3K en sentido descendente. P27Kip1 entonces no esta fosforilado y es capaz de entrar en el nucleo e inhibir la actividad de cdK2, causando la detencion del ciclo celular. Ademas, el trastuzumab suprime la angiogenesis mediante la induccion de factores antiangiogenicos y la represion de los factores proangiogenicos. Se cree que una contribucion al crecimiento no regulado observado en el cancer podna deberse a la escision proteolftica de los resultados de HER2/neu en la liberacion del dominio extracelular. Se ha demostrado que el trastuzumab inhibe la division de ectodominio HER2/neu en celulas de cancer de mama.

VIII. Captacion celular de aminoacidos no naturales.

[0331] La captacion de aminoacidos no naturales por una celula eucariota es una cuestion que se considera tfpicamente al disenar y seleccionar aminoacidos no naturales, que incluyen, entre otros, la incorporacion a una protema. Por ejemplo, la alta densidad de carga de los a-aminoacidos sugiere que es poco probable que estos compuestos sean permeables a las celulas. Los aminoacidos naturales son absorbidos por las celulas eucariotas a traves de una coleccion de sistemas de transporte basados en protemas. Se puede hacer un examen rapido que evalua que aminoacidos no naturales, si los hay, son captados por las celulas (los ejemplos 15 y 16 en este documento ilustran ejemplos no limitativos de pruebas que pueden realizarse con aminoacidos no naturales). Vease, por ejemplo, los ensayos de toxicidad en, por ejemplo, la Publicacion de Patente de EE.UU. N° 2004/198637 titulada "Protein Arrays" y Liu, DR & Schultz, PG (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96: 4780-4785. Aunque la captacion se analiza facilmente con varios ensayos, una alternativa al diseno de aminoacidos no naturales que son susceptibles a las vfas de captacion celular es proporcionar rutas biosinteticas para crear aminoacidos in vivo.

[0332] Tfpicamente, el aminoacido no natural producido a traves de la captacion celular como se describe en este documento se produce en una concentracion suficiente para una biosmtesis de protemas eficiente, que incluye, entre otros, una cantidad celular natural, pero no en un grado tal que afectar la concentracion de los otros aminoacidos o agotar los recursos celulares. Las concentraciones tfpicas producidas de esta manera son de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 0,05 mM.

IX. Biosmtesis de aminoacidos no naturales

[0333] Ya existen muchas rutas biosinteticas en las celulas para la produccion de aminoacidos y otros compuestos. Mientras que un metodo biosintetico para un aminoacido no natural particular puede no existir en la naturaleza, incluyendo pero no limitado a, en una celula, los metodos y composiciones descritas en el presente documento proporcionan dichos metodos. Por ejemplo, las rutas biosinteticas para aminoacidos no naturales pueden generarse en la celula huesped agregando nuevas enzimas o modificando las rutas existentes de la celula huesped. Nuevas enzimas adicionales incluyen enzimas naturales o enzimas desarrolladas artificialmente. Por ejemplo, la biosmtesis de p-aminofenilalanina (como se presenta en un ejemplo en el documento WO 2002/085923 titulado "In vivo incorporation of unnatural amino acids") se basa en la adicion de una combinacion de enzimas conocidas de otros organismos. Los genes para estas enzimas pueden introducirse en una celula eucariota transformando la celula con un plasmido que comprende los genes. Los genes, cuando se expresan en la celula, proporcionan una via enzimatica para sintetizar el compuesto deseado. En este documento se proporcionan ejemplos de los tipos de enzimas que se anaden opcionalmente. Secuencias adicionales de enzimas se encuentran, por ejemplo, en Genbank. Las enzimas desarrolladas artificialmente se pueden agregar a una celula de la misma manera. De esta manera, la maquinaria celular y los recursos de una celula se manipulan para producir aminoacidos no naturales.

[0334] Se dispone de una variedad de metodos para producir nuevas enzimas para uso en rutas biosinteticas o para la evolucion de rutas existentes. Por ejemplo, la recombinacion recursiva, que incluye pero no se limita a, segun lo desarrollado por Maxygen, Inc. (disponible en la web en www.maxygen.com), puede usarse para desarrollar nuevas enzimas y vfas. Vease, por ejemplo, Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370 (4): 389-391; y, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl Acad SCI. EE.UU., 91: 10747-10751. De manera similar, DesignPath™, desarrollado por Genencor (disponible en la red mundial en genencor.com) se usa opcionalmente para la ingeniena de vfas metabolicas, que incluye, entre otros, disenar una via para crear un aminoacido no natural en una celula. Esta tecnologfa reconstruye las rutas existentes en los organismos hospedadores utilizando una combinacion de nuevos genes, incluidos, entre otros, los identificados a traves de la genomica funcional, la evolucion molecular y el diseno. Diversa Corporation (disponible en la red mundial en diversa.com) tambien proporciona tecnologfa para seleccionar rapidamente bibliotecas de genes y vfas geneticas, incluidas, entre otras, crear nuevas rutas para la produccion bio sintetica de aminoacidos no naturales.

[0335] Tfpicamente, el aminoacido no natural producido con una ruta biosintetica disenada como se describe en este documento se produce en una concentracion suficiente para una biosmtesis de protemas eficiente, que incluye pero no se limita a una cantidad celular natural, pero no en un grado tal como afectar la concentracion de los otros aminoacidos o agotar los recursos celulares. Las concentraciones tfpicas producidas in vivo de esta manera son de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 0,05 mM. Una vez que una celula se transforma con un plasmido que comprende los genes utilizados para producir las enzimas deseadas para una ruta espedfica y se genera un aminoacido no natural, las selecciones in vivo se usan opcionalmente para optimizar aun mas la produccion del aminoacido no natural para smtesis de protemas ribosomicas y crecimiento celular.

X. Metodologia sintetica adicional.

[0336] Los aminoacidos no naturales descritos en el presente documento pueden sintetizarse usando metodologfas descritas en la tecnica o usando las tecnicas descritas en el presente documento o mediante una combinacion de las mismas. Como ayuda, la siguiente tabla proporciona varios electrofilos y nucleofilos de partida que pueden combinarse para crear un grupo funcional deseado. La informacion proporcionada pretende ser ilustrativa y no limitativa a las tecnicas sinteticas descritas en este documento.

Tabla 2: Ejemplos de enlaces covalentes y sus precursores

[0337] En general, los electrofilos de carbono son susceptibles de ser atacados por nucleofilos complementarios, in c lu ido s los nu c le o filo s de ca rbono , en donde un nu c le o filo a ta can te trae un pa r de e le c tro n e s al e lec tro filo de ca rb o n o para fo rm a r un nuevo en la ce en tre el nuc le o filo y el e le c tro filo de carbono .

[0338] Los ejemplos no limitantes de nucleofilos de carbono incluyen, pero no se limitan a reactivos de alquilo, alquenilo, arilo y alquinilo de Grignard, organolitio, organozinc, alquilo, alquenilo, arilo y alquinilo de estano (organoestananos), reactivos de alquilo, alquenilo, arilo y alquinilo-borano (organoboranos y organoboronatos); estos nucleofilos de carbono tienen la ventaja de ser cineticamente estables en agua o en disolventes organicos polares. Otros ejemplos no limitantes de nucleofilos de carbono incluyen los reactivos de iluros de fosforo, enol y enolato; estos nucleofilos de carbono tienen la ventaja de ser relativamente faciles de generar a partir de precursores bien conocidos por los expertos en la tecnica de la qmmica organica sintetica. Los nucleofilos de carbono, cuando se utilizan junto con los electrofilos de carbono, generan nuevos enlaces carbono-carbono entre el nucleofilo de carbono y el electrofilo de carbono.

[0339] Los ejemplos no limitantes de nucleofilos no carbonosos adecuados para acoplamiento a electrofilos de carbono incluyen, pero no se limitan a, aminas primarias y secundarias, tioles, tiolatos y tioeteres, alcoholes, alcoxidos, azidas, semicarbazidas y similares. Estos nucleofilos que no son carbono, cuando se usan junto con electrofilos de carbono, tipicamente generan enlaces heteroatomos (C-X-C), en donde X es un hetereoatomo, que incluye, entre otros, oxfgeno, azufre o nitrogeno.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Sintesis del Compuesto 1

[0340]

Esquema 1

[0341] Compuesto 1-3: se disolvieron tetra (etilenglicol) 1-1 (10 g, 51,5 mmol), N-hidroxiftavalimida 1-2 (8,4 g, 51,15 mmol) y trifenilfosfina (17,6 g, 67 mmol) en 300 ml de tetrahidrofurano seguido de la adicion de DIAD (12,8 ml, 61,78 mmol) a 0°C. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante la noche y luego se concentro a sequedad. El residuo se purifico por cromatograffa flash en columna para dar 5,47 g (31%) del compuesto 1-3, [0342] Compuesto 1-4: a una solucion de compuesto 1-3 (200 mg, 0,59 mmol) en 15 ml de diclorometano, se agrego Periodinano Dess-Martin (300 mg, 0,71 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche. La reaccion se detuvo con la solucion de bisulfito de sodio en 15 ml de bicarbonato de sodio saturado. La mezcla se separo. La capa organica se lavo con bicarbonato de sodio saturado y salmuera, se seco sobre sulfato de sodio, se filtro y se concentro al vado. El residuo se purifico por cromatograffa en columna ultrarrapida para dar 150 mg (75%) del compuesto 1-4,

[0343] Compuesto 1-6: a una solucion de sal de hidrocloruro de monometildolastatina 1-5 (50 mg, 0,062 mmol) en 1 ml de DMF se anadio el compuesto 1-4 (63 mg, 0,186 mmol) y 70 ml de acido acetico, seguido de la adicion de 8 mg de cianoborohidruro de sodio. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reaccion se diluyo con agua y se purifico por HPLC para dar 60 mg (80%) del compuesto 1-6, MS (ESI) m/z 547 [M+2H], 1092 [M+H].

1d.

[0344] Compuesto 1: el compuesto 1-6 (60 mg, 0,05 mmol) se disolvio en 1 ml de DMF. Se anadieron 32 pl de hidrazina. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se inactivo con solucion de hidrocloruro IN. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC para dar 33 mg (55%) del compuesto 1. MS (ESI) m/z 482 [M+2H], 962 [M+H].

Ejemplo 2: Sintesis del Compuesto 2

[0345]

Esquema 2

[0346] El compuesto 2 se sintetizo por una ruta sintetica similar a la descrita en el Ejemplo 1. MS (ESI) m/z 460 [M+2H], 918 [M+H].

Ejemplo 3: Sintesis del Compuesto 3

[0347]

Esquema 3

[0348] El compuesto 3 se sintetizo por una ruta sintetica similar al Ejemplo 1, MS (ESI) m/z 438 [M+2H], 974 [M+H].

Ejemplo 4: Sintesis del Compuesto 4

[0349] Compuesto 4-2: A una solucion de Val (OtBu)-OH.HCl 4-1 (1 g, 4,77 mmol) y bromoetanol (304,7 pl, 4,3 mmol) en 10 ml de DMF, se agregaron 1,68 ml de DIEA. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 dfas. Se anadieron 4,8 mmol de BoC²O a la mezcla de reaccion, seguido de 0,84 ml de DIEA. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 dfas. La mezcla de reaccion se concentro al vado y se extrajo con acetato de etilo y se lavo con agua y salmuera, se seco sobre sulfato de sodio y se concentro al vacfo. El residuo se purifico por cromatograffa flash en columna para dar 0,66 g de compuesto 4-2.

Esquema 4

[0350] Compuesto 4-3: A una solucion del compuesto 4-2 (500 mg, 1,58 mmol), N-hidroxiftalimida (261 mg, 1,6 mmol) y trifenilfosfina (538 mg, 2,05 mmol) en 15 ml. Se anadio THF DIAD (394 pl, 1,9 mmol) a 0°C. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante la noche y luego se concentro al vado. El residuo se purifico por cromatograffa flash en columna para dar 0,68 g del compuesto 4-3,

[0351] Compuesto 4-4: El compuesto 4-3 se disolvio en 15 ml de 4N HCl/dioxano. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 dfas y se concentro al vado. El residuo se disolvio en DMF y se trato con BoC²O (230 ml, 1 mmol) y DIEA (352 ml, 2 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 dfas. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC para dar 100 mg del compuesto 4-4.

[0352] Compuesto 4-5: a una solucion de compuesto Boc-Val-Dil-metilDap-OH en DMF se agrega phe(OtBu)-OH.HCl, HATu y N-metilmorfolina. La mezcla de reaccion se agita a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reaccion se concentra al vado y se extrae con acetato de etilo (100 mLX1, 50 mL X2). La capa organica se combina y se lava con salmuera, se seca sobre sulfato de sodio y se concentra al vado. El residuo se purifica por cromatograffa flash. El compuesto resultante se trata con HCl/EtOAC para dar el compuesto 4-5.

[0353] Compuesto 4-6: A la solucion del compuesto 4-5 en DMF se le agrega el compuesto 4-4, HATU y DIEA. La mezcla de reaccion se agita a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reaccion se concentra al vado y se extrae con acetato de etilo (100 mLX1, 50 mL X2). La capa organica se combina y se lava con salmuera, se seca sob re su lfa to de so d io y se con cen tra al v a d o. El res idu o se pu rifica po r c ro m a to g ra ffa flash pa ra d a r el com p ue s to 4-6.

[0354] Compuesto 4-7: El compuesto 4-6 se disuelve en 15 ml de 4N HCl/dioxano. La mezcla de reaccion se agita a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentra al vado para dar el compuesto 4-7.

[0355] Compuesto 4-8: A una solucion de compuesto 4-7 en 1 ml de DMF se le agrega formilaldeddo y acido acetico, seguido de la adicion de cianoborohidruro de sodio. La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reaccion se diluye con agua y se purifica por HPLC para dar el compuesto 4-8.

[0356] Compuesto 4: el compuesto 4-8 se disuelve en 1 ml de DMF. Se anade hidrazina. La solucion resultante se agita a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se interrumpe con una solucion de hidrocloruro 1N. La mezcla de reaccion se purifica por HPLC para dar el Compuesto 4.

Ejemplo 5: Sintesis del Compuesto 5

[0357] El compuesto 4-7 se disuelve en 1 ml de DMF. Se anade hidrazina. La solucion resultante se agita a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se interrumpe con una solucion de hidrocloruro 1N. La mezcla de reaccion se purifica por HPLC para dar el Compuesto 5.

Ejemplo 6: Sintesis del Compuesto 6

[0358]

Esquema 6

[0359] Compuesto 6-2: a una solucion del compuesto 6-1 (500 mg, 0,875 mmol) en 3 ml de DMF se agregaron 283 mg de hidrocloruro de fenilalanina, 433 mg de HATU y 581 ml de N-metilmorfolina. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reaccion se concentro al vado y se extrajo con acetato de etilo (100 mLX1, 50 mL X2). La capa organica se combino y se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato de sodio y se concentro al vado. El residuo se purifico por cromatograffa flash para dar 560 mg (76%) del compuesto 6-2.

[0360] Compuesto 6-3: el compuesto 6-2 se disolvio en 15 ml de 4N HCl/dioxano. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentro al vado para dar 511 mg del compuesto 6-3.

[0361] Compuesto 6-4: A una solucion del compuesto 6-3 (368 mg, 0,55 mmol) en 3 ml de DMF se agregaron 255 mg de Boc-N-Metilo valina, 314 mg de HATU y 303 ml de N-metilmorfolina. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reaccion se concentro al vado y se extrajo con acetato de etilo (100 mLX1, 50 mL X2). La capa organica se combino y se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato de sodio y se concentro al vado. El residuo se purifico por cromatograffa flash para dar 370 mg (79%) del compuesto 6-4.

[0362] Compuesto 6-5: A una solucion del compuesto 6-4 (170 mg) en 10 ml de MeOH, se agregaron 5 eq. de IN LiOH. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reaccion se acidifico con 1N HCl y se extrajo con acetato de etilo, se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato de sodio y se concentro al vado para dar 150 mg (90%) de compuesto 6-5.

[0363] Compuesto 6-6: el compuesto 6-5 se disolvio en 4N HCl/dioxano. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentro al vado y se purifico por HPLC para dar 150 mg de compuesto 6-6,

[0364] Compuesto 6-7: A una solucion del compuesto 6-6 (50 mg, 0,062 mmol) en 1 ml de DMF se agrego el compuesto 1-4 (63 mg, 0,186 mmol) y 70 ml de acido acetico, seguido de la adicion de 8 mg. de cianoborohidruro de sodio. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reaccion se diluyo con agua y se purifico por HPLC para dar 60 mg (80%) del compuesto 6-7,

[0365] Compuesto 6: el compuesto 6-7 (60 mg, 0,05 mmol) se disolvio en 1 ml de DMF. Se anadieron 32 pl de hidrazina. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se inactivo con una solucion de hidrocloruro 1N. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC para dar 33 mg (55%) del Compuesto 6. Ejemplo 7: Sintesis del Compuesto 7

[0366]

Esquema 7

[0367] El compuesto 7 se sintetizo por una ruta sintetica similar al compuesto 1, MS (ESI) m/z 440 [M+2H], 879 [M+H].

Ejemplo 8: Sintesis del Compuesto 8

[0368]

Esquema 8

[0369] El compuesto 8 se sintetizo mediante una ruta sintetica similar al compuesto 1, MS (ESI) m/z 418 [M+2H], 835 [M+H].

Ejemplo 9: Sintesis del Compuesto 9

Esquema 9

[0371] Compuesto 9-1: A una so luc io n de co m p u e s to B o c -V a l-D il-m e tilD a p -O H en D M F se le anad e 4 -(2 aminoetilo)piridina, HATU y N-metilmorfolina. La mezcla de reaccion se agita a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reaccion se concentra al vado y se extrae con acetato de etilo (100 mLX1, 50 mL X2). La capa organica se combina y se lava con salmuera, se seca sobre sulfato de sodio y se concentra al vado. El residuo se purifica por cromatograffa flash. El compuesto resultante se trata con HCl/EtOAC para dar el compuesto 9-1.

[0372] Compuesto 9-2: A la solucion del compuesto 9-1 en DMF se le agrega el compuesto 4-4, HATU y DIEA. La mezcla de reaccion se agita a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reaccion se concentra al vado y se extrae con acetato de etilo (100 mLX1, 50 mL X2). La capa organica se combina y se lava con salmuera, se seca sobre sulfato de sodio y se concentra al vado. El residuo se purifica por cromatograffa flash para dar el compuesto 9-2.

[0373] Compuesto 9-3: El compuesto 9-2 se disuelve en 15 ml de 4N HCl/dioxano. La mezcla de reaccion se agita a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentra al vado para dar el compuesto 9-3.

[0374] Compuesto 9-4: A una solucion de compuesto 9-3 en 1 ml de DMF se le agrega formilaldehffdo y acido acetico, seguido de la adicion de cianoborohidruro de sodio. La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reaccion se diluye con agua y se purifica por HPLC para dar el compuesto 9-4.

[0375] Compuesto 9: El compuesto 9-4 se disuelve en 1 ml de DMF. Se anade hidrazina. La solucion resultante se agita a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se interrumpe con una solucion de hidrocloruro IN. La mezcla de reaccion se purifica por HPLC para dar el compuesto 9.

Ejemplo 10: Sintesis del Compuesto 10

[0376]

Esquema 10

[0377] Compuesto 10: El compuesto 9-3 se disuelve en 1 ml de DMF. Se anade hidrazina. La solucion resultante se agita a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se interrumpe con una solucion de hidrocloruro IN. La mezcla de reaccion se purifica por HPLC para dar el Ejemplo 10.

Ejemplo 11: Sintesis del Compuesto 11

[0378]

[0379] Compuesto 11-3: A una solucion de tetra (etilenglicol) 11-1 (40,6 ml, 235 mmol) en 100 ml de tetraedrofurano, se agregaron 47 mg de sodio. Se anadieron 12 ml de acrilato de terc-butilo despues de disolver el sodio. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reaccion se concentro al vado y se detuvo con 2 ml de 1N HCl. El residuo se suspendio en salmuera y se extrajo con acetato de etilo (100 mLX1, 50 mL X2). La capa organica se combino y se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato de sodio y se concentro a vado para dar6,4 g (23%) del compuesto 11-3.

[0380] Compuesto 11-5: El Compuesto 11-3 (1,0 g, 3,12 mmol), la N-hidroxiftalimida 11-4 (611 mg, 3,744 mmol) y la trifenilfosfina (1,23 g, 4,68 mmol) se disolvieron en 20 ml de tetrahidrofurano seguido por adicion de DIAD (0,84 ml, 4,06 mmol) a 0°C. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante la noche y luego se concentro a sequedad. El residuo se purifico por cromatograffa flash en columna utilizando cartuchos SiliaSep (80 g), eluyendo con acetato de etilo al 0-100%/hexanos, para dar 1,0 g (100%) del compuesto 11-5.

[0381] Compuesto 11-6: El compuesto 11-5 se disolvio en 15 ml de 4N HCl/dioxano. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentro al vado para dar 1,0 g del compuesto 11-6.

[0382] Compuesto 11-8: A una solucion de 30 mg (0,0372 mmol) de hidrocloruro de monometildolastatina, se agregaron 31 mg (0,0744 mmol) de compuesto 11-6 y 38,2 mg (0,082 mmol) de PyBroP en 1 ml de DMF33 mL (0,186 mmol) de diisopropiletilamina. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC para dar 28 mg (65%) del compuesto 11-8. MS (ESI) m/z 785 [M+2H], 1164 [M+H].

[0383] Compuesto 11: El compuesto 11-8 (28 mg, 0,024 mmol) se disolvio en 1 ml de DMF. Se anadieron 23 j l (0,72 mmol) de hidrazina anhidra. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se detuvo con una solucion de hidrocloruro IN. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC preparativa, eluyendo con 20-70% de CH3CN/H2O en 20 minutos a 254 nm, para daR²⁰mg (66%) del Compuesto 11, M^s(ESI) m/z 518 [M+2H], 1034 [M+H].

Ejemplo 12: Sintesis del Compuesto 12

[0384]

Esquema 12

[0385] Compuesto 12-2: A una solucion del compuesto 12-1 (500 mg, 0,875 mmol) en 3 ml de DMF se agregaron 283 mg de hidrocloruro de fenilalanina, 433 mg de HATU y 581 j l de N-metilmorfolina. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reaccion se concentro al vado y se extrajo con acetato de etilo (100 mLX1, 50 mL X2). La capa organica se combino y se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato de sodio y se concentro al vado. El residuo se purifico por cromatograffa flash para dar 560 mg (76%) del compuesto 12-2.

[0386] Compuesto 12-3: El compuesto 12-2 se disolvio en 15 ml de 4N HCl/dioxano. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentro al vado para dar 511 mg de compuesto 12-3.

[0387] Compuesto 12-4: A una solucion de compuesto 12-3 (368 mg, 0,55 mmol) en 3 ml de DMF se agregaron 255 mg de Boc-N-Metilo valina, 314 mg de HATU y 303 ml de N-metilmorfolina. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reaccion se concentro al vado y se extrajo con acetato de etilo (100 mLX1, 50 mL X2). La capa organica se combino y se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato de sodio y se concentro al vado. El residuo se purifico por cromatograffa flash para dar 370 mg (79%) del compuesto 12-4.

[0388] Compuesto 12-5: A una solucion del compuesto 12-4 (170 mg) en 10 ml de MeOH, se agregaron 5 ec. de IN LiOH. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reaccion se acidifico con 1N HCl y se extrajo con acetato de etilo, se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato de sodio y se concentro al vado para dar 150 mg (90%) del compuesto 12-5.

[0389] Compuesto 12-6: El compuesto 12-5 se disolvio en 4N HCl/dioxano. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentro al vado y se purifico por HPLC para dar 150 mg de compuesto 12-6.

[0390] Compuesto 12-7: A una solucion de compuesto 12-6 en DMF se le anadio formilaldelddo (3 ec.) y 20 ec. de acido acetico, seguido de la adicion de 2 ec. de cianoborohidruro de sodio. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reaccion se diluyo con agua y se purifico por HPLC para dar el compuesto 12-7.

[0391] Compuesto 12-10: 2-(2-hidroxietoxi)etilcarbamato de terc-butilo (2,05 g, 10 mmol), N-hidroxiftavalimida (1,8 g, 11 mmol) y trifenilfosfina (3,67 g, 14 mmol) se disolvieron en 100 ml de tetrahidrofurano seguido de la adicion de DIAD (2,48 ml, 12 mmol) a 0°C. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante la noche y luego se concentro a sequedad. El residuo se trato con 50 ml de 4N HCl/dioxano. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a vado. El residuo se trato con eter, se filtro, se lavo con eter y se seco al vado para obtener 2,6 g (91%) de compuesto 12-10, MS (ESI) m/z 251 [M+H].

[0392] Compuesto 12-11: A una solucion del compuesto 12-10 (20 mg, 0,026 mmol) en 1 ml de DMF se agregaron 11,2 mg del compuesto 12-10, 15 mg de HATU y 23 ml de DIEA. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ^{am b ie n te d u ran te 2 horas. La m ezc la de reacc ion se pu rifico po r H P LC para d a R}20 ^{mg (70 % ) de l co m p u e s to} 12-4 ^,M S (E S I) m /z 490 [M 2H ], 978 [M H ].

[0393] Compuesto 12: El compuesto 12-11 (20 mg, 0,0183 mmol) se disolvio en 1 ml de DMF. Se anadieron 18 |jl (0,56 mmol) de hidrazina anhidra. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se inactivo con solucion de hidrocloruro 1N. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC preparativa, eluyendo con 20-70% de CH3CN/H2O en 20 min a 254 nm, para dar 14 mg (72%) del Compuesto 12, MS (ESI) m/z [M+2H], 848 [M+H].

Ejemplo 13: Sntesis del Compuesto 13

[0394]

[0395] Compuesto 13-2: 6-Hidroxihexanoato de terc-butilo 13-1 (1,5 g, 1,97 mmol), N-hidroxiftavalimida (1,42 g, 8,76 mmol) y trifenilfosfina (2,82 g, 10,76 mmol) se disolvieron en 50 ml de tetrahidrofurano seguido de la adicion de DIAD (2 ml, 9,564 mmol) a 0°C. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante la noche y luego se concentro a sequedad. El residuo se purifico por cromatograffa flash en columna para dar 2,5 g (95%) del compuesto 13-2.

[0396] Compuesto 13-3: El compuesto 13-2 se trato con 15 ml de 4N HCl en dioxano. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 12 horas y se concentro a sequedad a vacfo para dar 900 mg (100%) del compuesto 13-3.

[0397] Compuesto 13-4: A una solucion del compuesto 13-3 (900 mg, 3,0 mmol) en 10 ml de THF se agregaron 397 mg de N-hidroxisuccinimida, seguido de la adicion de 669 mg de DCC. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche y se filtro. La filtracion se concentro y se trato con 10 ml de DCM. La solucion de DCM se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora y se filtro. La filtracion se concentro y se purifico por cromatograffa flash en columna para dar 800 mg (71%) del compuesto 13-4.

[0398] Compuesto 13-6: La mezcla del compuesto 13-4 (435 mg, 1,16 mmol) y Val-Cit-PABOH 13-51 (400 mg, 1,054 mmol) en 12 ml de DMF se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a vado. El residuo se trato con eter, se filtro y se lavo con eter. El solido se seco al vado para dar 660 mg (98%) del compuesto 13-6.

[0399] Compuesto 13-7: A la solucion del compuesto 13-6 (200 mg, 0,313 mmol) en 6 ml de DMF se le anadio bis(p-nitrofenilo)carbonato (286 mg, 0,94 mmol), seguido de la adicion de 110,2 ml. de DIEA. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 5 horas y se concentro. El residuo se trato con eter y se filtro. El solido recogido se lavo con eter, acido dtrico al 5%, agua, eter y se seco al vado para dar 210 mg (83%) del compuesto 13-7.

[0400] Compuesto 13-9: A una solucion de sal de hidrocloruro de monometilauristatina 13-8 (100 mg, 0,1325 mmol) en 2 ml de DMF se agrego el compuesto 13-7 (159 mg, 0,2 pmol) y 10 mg de HOBt, seguido de la adicion de 35,2 pL de DIEA. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 2 dfas. La mezcla de reaccion se diluyo con agua y se purifico por HPLC para dar 93 mg (51%) del compuesto 13-9. MS (ESI) m/z 692 [M+2H], 1382 [M+H].

[0401] Compuesto 13: El compuesto 13-9 (50 mg, 0,036 mmol) se disolvio en 1 ml de DMF. Se anadieron 23 pl de hidrazina. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante 3 horas. La reaccion se inactivo con solucion de hidrocloruro IN. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC para dar 32 mg (65%) del Compuesto 13, MS (ESI) m/z 638,5 [M+Na+2H], 1253,3 [M+H], 1275,8 [M+Na].

Ejemplo 14: Sintesis del Compuesto 14

[0402]

Esquema 14

[0403] Compuesto 14-3: A una solucion de tetra (etilenglicol) 14-1 (40,6 ml, 235 mmol) en 100 ml de tetraedrofurano se le agregaron 47 mg de sodio. Se anadieron 12 ml de acrilato de terc-butilo despues de disolver el sodio. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reaccion se concentro al vado y se detuvo con 2 ml de 1N HCl. El residuo se suspendio en salmuera y se extrajo con acetato de etilo (100 mLX1, 50 mL X2). La capa organica se combino y se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato de sodio y se concentro al vado para dar 6,4 g (23%) del compuesto 14-3.

[0404] Compuesto 14-5: Compuesto 14-3 (1,0 g, 3,12 mmol), N-hidroxiftalimida 14-4 (611 mg, 3,744 mmol) y se disolvieron trifenilfosfina (1,23 g, 4,68 mmol) en 20 ml de tetrahidrofurano, seguido de la adicion de DIAD (0,84 ml, 4,06 mmol) a 0°C. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante la noche y luego se concentro a sequedad. El residuo se purifico por cromatograffa flash en columna utilizando cartuchos SiliaSep (80 g), eluyendo con acetato de etilo al 0-100%/hexanos, para dar 1,0 g (100%) del compuesto 14-5.

[0405] Compuesto 14-6: El compuesto 14-5 se disolvio en 15 ml de 4N HCl/dioxano. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentro al vado para dar 1,0 g del compuesto 14-6.

[0406] Compuesto 14-7: A una solucion del compuesto 6 (1,93 g, 4,68 mmol) y N-hidroxisuccinimida (646 mg, 5,616 mmol) en 20 ml de tetraedrofurano, se agregaron 1,062 g (5.148 mmol) de dCc . La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche y se filtro. La filtracion se concentro y se purifico por cromatograffa flash en columna utilizando cartuchos SiliaSep (80 g), eluyendo con acetato de etilo al 0-100%/hexanos para dar 2,37 g (100%) del compuesto 14-7.

[0407] Compuesto 14-8: El compuesto 14-8 se preparo de acuerdo con la bibliograffa (Bioconjugat Chem. 2002, 13 (4), 855-869).

[0408] Compuesto 14-9: A una solucion del compuesto 14-8 (200 mg, 0,527 mmol) en 2 ml de DMF se agregaron 295 mg (0,58 mmol) del compuesto 14-7. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche y se concentro al vado. El residuo se trato con eter, se filtro, se lavo con eter y se seco al vado para dar 402 mg (98%) del compuesto 14-9.

[0409] Compuesto 14-10: A una solucion del compuesto 14-9 (406 mg, 0,527 mmol) y carbonato de bis(p-nitrofenol) (481 mg, 1,58 mmol) en 10 ml de DMF, se agregaron 0,186 ml (1,054 mmol) de diisopropiletilamina. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 5 horas. El disolvente se elimino a vado. El residuo se trato con eter, se filtro, se lavo con eter, acido citrico al 5%, agua, eter y se seco a vacio para dar 350 mg (72%) del compuesto 14-10.

[0410] Compuesto 14-11: A una solucion de 50 mg (0,062 mmol) de hidrocloruro de monometildolastatina, se agregaron 87,2 mg (0,093 mmol) de compuesto 14-10 y 4,7 mg (0,031 mmol) de HOBt en 1 ml de DMF 22 pL (0,124 mmol) de diisopropiletilamina. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC para dar 41 mg (42%) del compuesto 14-11. MS (ESI) m/z 785 [M+2H].

[0411] Compuesto 14: El compuesto 14-11 (41 mg, 0,026 mmol) se disolvio en 1 ml de DMF. Se anadieron 17 pl (0,52 mmol) de hidrazina anhidra. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se inactivo con una solucion de hidrocloruro 1N. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC preparativa, eluyendo con 20-70% de CH3CN/H2O en 20 min a 254 nm, para dar 22 mg (58%) del compuesto 14. MS (ESI) m/z 720 [M+2H].

Ejemplo 15: Sintesis del Compuesto 15

[0412]

Esquema 15

[0413] Compuesto 15-2: A una solucion de 50 mg (0,062 mmol) de hidrocloruro de monometildolastatina, se agregaron 75 mg (0,093 mmol) de compuesto 13-7 y 4,7 mg (0,031 mmol) de HOBt en 1 ml de DMF 22 pL (0,124 mmol) de diisopropiletilamina. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC para dar 41 mg (42%) del compuesto 15-2, MS (ESI) m/z 718 [M+2H], 1435 [M+H].

[0414] Compuesto 15-2: El compuesto 15-2 (41 mg, 0,026 mmol) se disolvio en 1 ml de DMF. Se anadieron 17 pl (0,52 mmol) de hidrazina anhidra. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se inactivo con solucion de hidrocloruro IN. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC preparativa, eluyendo con 20-70% de CH3CN/H2O en 20 min a 254 nm, para dar 22 mg (58%) del ejemplo 15. MS (ESI) m/z 653 [M+2H], 1305 [M+H].

Ejemplo 16: Sintesis del Compuesto 16

[0415]

Esquema 16

[0416] Compuesto 16-3: A una solucion de etilenglicol 16-1 (13,1 ml, 235 mmol) en 100 ml de tetraedrofurano, se agregaron 47 mg de sodio. Se anadieron 12 ml de acrilato de terc-butilo despues de disolver el sodio. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reaccion se concentro al vado y se detuvo con 2 pl de 1N HCl. El residuo se suspendio en salmuera y se extrajo con acetato de etilo (100 mLX1, 50 mL X2). La capa organica se combino y se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato de sodio y se concentro al vado. El residuo se purifico por cromatograffa flash en columna para dar 5,2 g (24%) del compuesto 16-3.

[0417] Compuesto 16-5: El compuesto 16-3 (2,0 g, 10,5 mmol), se disolvio N-hidroxiftalimida (2,05 g, 12,6 mmol) y trifenilfosfina (3,58 g, 13,65 mmol) en 50 ml de tetrahidrofurano seguido de la adicion de DIAD (3,26 ml, 15,75 mmol) a 0°C. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante la noche y luego se concentro a sequedad. El residuo se purifico por cromatograffa flash en columna para dar el compuesto 16-5.

[0418] Compuesto 16-6: El compuesto 16-5 se disolvio en 15 ml de 4N HCl/dioxano. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentro al vado para dar el compuesto 16-6.

[0419] Compuesto 16-7: A una solucion del compuesto 16-6 (5.16 mmol) y N-hidroxisuccinimida (722 mg, 6,7 mmol) en 20 ml de tetraedrofurano se anadieron 1,28 g (6,2 mmol) de DCC. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche y se filtro. La filtracion se concentro y se purifico por cromatograffa en columna ultrarrapida para dar 500 mg de compuesto 16-7.

[0420] Compuesto 16-8: El compuesto 16-8 se preparo de acuerdo con la bibliograffa (Bioconjugat Chem. 2002, 13 (4), 855-869).

[0421] Compuesto 16-9: A una solucion del compuesto 16-8 (5,0 g, 8,3 mmol) y carbonato de bis(p-nitrofenol) (7,6 g, 25 mmol) en 100 ml de DMF se agregaron 2,92 ml (16,6 mmol)) de diisopropiletilamina. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 16 horas. El disolvente se elimino a vado. El residuo se trato con eter, se filtro, se lavo con eter, acido citrico al 5%, agua, eter y se seco a vacio para dar 5,0 g (81%) del compuesto 16-9.

[0422] Compuesto 16-10: A una solucion de 1,0 g (1,24 mmol) de hidrocloruro de monometildolastatina, se agregaron 1,42 g (1,8575 mmol) del compuesto 16-9 y 95 mg (0,62 mmol) de HOBt en 10 ml de DMF 437 mL (2,48 mmol) de diisopropiletilamina. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC para dar 1,0 g (58%) del compuesto 16-10, MS (ESI) m/z 700 [M+2H], 1398 [M+H].

[0423] Compuesto 16-11: A una solucion del compuesto 16-10 (1,0 g, 0,715 mmol) en 15 ml de tetraedrofurano, se agregaron 5 ml (48 mmol) de dietilamina. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1,5 horas y se concentro al vado. El residuo se disolvio en 20 ml de DCM, se trato con 200 ml de eter y se filtro, se seco con eter y se seco al vado para dar 860 mg del compuesto 16-11. MS (ESI) m/z 589 [M+2H], 1176 [M+H].

[0424] Compuesto 16: A una solucion de 50 mg (0,0425 mmol) del compuesto 16-11 en 1 ml de DMF se agregaron 32 mg (0,085 mmol) del compuesto 16-7. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 16 horas. La HPLC y la MS mostraron reaccion realizada. Se anadieron 27,2 ml (0,85 mmol) de hidrazina anhidra a la mezcla de reaccion. La reaccion se realizo en 2 horas. La mezcla de reaccion se acidifico con 1N HCl y se purifico por HPLC para dar 40 mg (66%) del compuesto 16. MS (ESI) m/z 654 [M+2H], 1307 [M+H].

Ejemplo 17: Sintesis del Compuesto 17

[0425]

Esquema 17

[0426] Compuesto 17-2: A una solucion del compuesto 17-1 (1,0 g, 4,52 mmol) y N-hidroxisuccinimida (572 mg, 4,97 mmol) en 20 ml de tetraedrofurano se le agregaron 1,12 g (5.424 mmol) de DCC. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche y se filtro. La filtracion se concentro para dar el compuesto 17-2.

[0427] Compuesto 17: A una solucion de 50 mg (0,0425 mmol) del compuesto 16-11 en 1 ml de DMF, se agregaron 4 l mg (0,1275 mmol) del compuesto 17-2. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 16 horas. La HPLC y la MS mostraron reaccion realizada. Se anadieron 20 pl (0,625 mmol) de hidrazina anhidra a la mezcla de reaccion. La reaccion se realizo en 2 horas. La mezcla de reaccion se acidifico con IN HCl y se purifico por HPLC para dar 35 mg (60%) del compuesto 17. MS (ESI) m/z 625 [M+2H], 1249 [M+H].

Ejemplo 18: Sintesis del Compuesto 18

[0428]

Esquema 18

[0429] Compuesto 18-1: A una solucion del compuesto 6-6, se anadieron diisopropiletilamina a una solucion de compuesto 6-6, mg (0,062 mmol) de compuesto 14-10 y HOBt en 1 ml de DMF. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC para dar el compuesto 18-1.

[0430] Compuesto 18: El compuesto 18-1 se disolvio en 1 ml de DMF. Se anadio hidrazina anhidra. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se detuvo con una solucion de hidrocloruro IN. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC preparativa, eluyendo con 20-70% de CH3CN/H2O en 20 minutos a 254 nm, para dar el compuesto 18.

Ejemplo 19: Sintesis del Compuesto 19

[0431]

Esquema 19

[0432] Compuesto 19-2: 2-(2-hidroxietoxi)etilcarbamato de terc-butilo 13 (2,05 g, 10 mmol), N-hidroxiftavalimida (1,8 g, 11 mmol) y trifenilfosfina (3,67 g, 14 mmol) se disolvieron en 100 ml de tetrahidrofurano seguido de la adicion de DIAD (2,48 ml, 12 mmol) a 0°C. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante la noche y luego se concentro a sequedad. El residuo se trato con 50 ml de 4N HCl/dioxano. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a vado. El residuo se trato con eter, se filtro, se lavo con eter y se seco al vado para obtener 2,6 g (91%) de compuesto 19-2, MS (ESI) m/z 251 [M+H].

[0433] Compuesto 19-3: A la mezcla del compuesto 19-2 (315 mg, 1,1 mmol), Boc-Lys (Boc)-OH (365 mg, 1 mmol), EDC (382 mg, 2 mmol) y HOBt (306 mg, 2 mmol) en 10 ml de DCM se agregaron 1,056 ml (6 mmol) de diisopropiloetilamina. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 3 horas y se extrajo con acetato de etilo, se lavo con acido citrico al 5%, se saturo con bicarbonate de sodio, salmuera, se seco sobre sulfato de sodio, se filtro y se concentro al vado. El residuo se purifico por cromatograffa en columna ultrarrapida utilizando cartuchos de SiliaSep (40 g), eluyendo con 0-100% de acetato de etilo/hexanos, para dar 405 mg (70%) de compuesto 19-3.

[0434] Compuesto 19-4: El compuesto 19-3 se disolvio en 15 ml de 4N HCl/dioxano. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentro al vado para dar 315 mg (98%) del compuesto 19-4, MS (ESI) m/z 379 [M+H].

[0435] Compuesto 19-5: A una solucion de compuesto 14-3 (322 mg, 1 mmol) en 20 ml de diclorometano se le anadio Periodinano Dess-Martin (636 mg, 1,5 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 3 horas. La reaccion se detuvo con una solucion de tiosulfato de sodio (1,4 g, 8,85 mmol) en 15 ml de bicarbonato de sodio saturado. La mezcla se separo. La capa organica se lavo con bicarbonato de sodio saturado y salmuera, se seco sobre sulfato de sodio, se filtro y se concentro al vado. El residuo se purifico por cromatograffa flash en columna utilizando cartuchos SiliaSep (40 g), eluyendo con 0-100% acetato de etilo/hexanos para dar 170 mg (53%) del compuesto 19-5.

[0436] Compuesto 19-6: A una solucion de hidrocloruro de monometildolastatina, se agregaron 1,19 g (3,72 mmol) del compuesto 17 a 1 g (1,24 mmol) en 20 ml de DMF, seguido de 1,4 ml (24,8 mmol) de acido acetico y 156 mg (2,48 mmol) de cianoborohidruro de sodio. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a vado. El residuo se ajusto a pH 8 con bicarbonato de sodio y se extrajo con DCM, se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato de sodio, se filtro y se concentro al vado. El residuo se purifico por cromatograffa en columna ultrarrapida usando cartuchos de SiliaSep (40 g), eluyendo con 0-5, % de metanol/DCM para dar 680 mg (51%) del compuesto 19-6, MS (ESI) m/z 538 [M+2H], 1075 [M+H].

[0437] Compuesto 19-7: A una solucion del compuesto 19-6 (680 mg, 0,632 mmol) en 5 ml de DCM se agregaron 20 ml de 4N HCl/dioxano. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentro al vado. El residuo se trato con eter, se filtro, se lavo con eter y se seco al vado para dar 660 mg (98%) del compuesto 19-7, MS (ESI) m/z 510 [M+2H], 1019 [M+H].

[0438] Compuesto 19-8: A una solucion del compuesto 19-7 (280 mg, 0,257 mmol), compuesto 19-4 (38 mg, 0,0857 mmol) y N-metilmorfolina (0,283 ml, 2,57 mmol) en 5 ml de Se anadio N-metilpirrolidinona 98 mg (0,257 mmol) de HATU. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC para dar 160 mg (71%) del compuesto 19-8, MS (ESI) m/z 596 [M+4H], 794 [M+3H], 1191 [M+2H].

[0439] Compuesto 19: El compuesto 19-8 (160 mg, 0,0613 mmol) se disolvio en 1,5 ml de DMF. Se anadieron 20 ml (0,613 mmol) de hidrazina anhidra. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se detuvo con una solucion de hidrocloruro IN. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC preparativa, eluyendo con 20-70% de CH3CN/H2O en 20 minutos a 254 nm, para daR-^0 mg (75%) del compuesto 19. Ms (ESI) m/z 451 [M+5H], 563 [M+4H], 751 [M+3H], 1126 [M+2H],

Ejemplo 20: Sintesis del Compuesto 20

[0440]

Esquema 20

[0441] Compuesto 20-2: A una solucion de tetra (etilenglicol) 20-1 (8,0 g, 41,2 mmol) en 100 ml de tetraedrofurano, se agregaron 1,65 g de hidruro de sodio a 0°C. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 30 min. Se anadieron 6,21 g de TBS-Cl a esta solucion. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reaccion se concentro al vado y se detuvo con 2 ml de 1N HCl. El residuo se suspendio en salmuera y se extrajo con acetato de etilo (100 mLX1, 50 mL X2). La capa organica se combino y se lavo con ^{salmuera, se seco sobre sulfato de sodio y se concentro al va}d ^{o. El residuo se purifico por cromatograffa flash en}columna para dar 5,7 g de compuesto 20-2.

[0442] Compuesto 20-3: A una solucion de compuesto 20-2 (500 mg, 1,62 mmol) en 30 ml de diclorometano se le anadio Periodinano Dess-Martin (1,03 g, 2,43 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 3 horas. La reaccion se detuvo con una solucion de tiosulfato de sodio (1,4 g, 8,85 mmol) en 15 ml de bicarbonato de sodio saturado. La mezcla se separo. La capa organica se lavo con bicarbonato de sodio saturado y ^{salmuera, se seco sobre sulfato de sodio, se filtro y se concentro al va}d ^{o. El residuo se purifico por cromatograffa}flash en columna para dar 400 mg de compuesto 20-3.

[0443] Compuesto 20-4: A una solucion de 213 mg hidrocloruro de monometildolastatina, se agregaron 245 mg (0,75 mmol) de compuesto 20-3 (0,263 mmol) en 4 ml de DMF seguido de 0,303 mL (5 mmol) de acido acetico y 34 mg (0,5 mmol) de cianoborohidruro de sodio. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. ^{El disolvente se elimino a va}d ^{o. Se anadieron 3 ml de acetonitrilo al 60%, seguido de 0,2 ml de HF, piridina a 0°C. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente organico se elimino a va}d ^{o. El}residuo se ajusto a pH 8 mediante bicarbonato de sodio y se extrajo con DCM, se lavo con salmuera, se seco sobre ^{sulfato de sodio, se filtro y se concentro al va}d ^{o. El residuo se purifico por cromatograffa flash en columna para dar} 160 mg de compuesto 20-4. MS (ESI) m/z 474 [M+2H], 947 [M+H].

[0444] Compuesto 20-5: A una solucion del compuesto 20-4 (50 mg, 0,062 mmol) en 4 ml de DCM, se agregaron 0,3 ml de foseno/tolueno a 0°C. La mezcla de reaccion se agito a 0°C durante 3 horas y se concentro al vado para la siguiente etapa sin purificacion.

[0445] Compuesto 20-6: A una solucion del compuesto 19-4 (7,6 mg, 0,017 mmol) y el compuesto 20-5 (0,062 mmol) se agregaron 25 pl de diisopropiletilamina. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC, eluyendo con 20-70% de CH3CN/H2O en 20 minutos a 254 nm, para dar 33 mg del compuesto 20-6, MS (ESI) m/z 582 [M+4H], 775 [M+3H], 1163 [M+2H].

[0446] Compuesto 20: El Compuesto 20-6 (33 mg, 0,014 mmol) se disolvio en 1 ml de DMF. Se anadieron 14 pl (0,43 mmol) de hidrazina anhidra. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se inactivo con solucion de hidrocloruro IN. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC preparativa, eluyendo con 20-70% de CH3CN/H2O en 20 min a 254 nm, para dar 10 mg del compuesto 20. MS (ESI) m/z 549 [M+4H], 732 [M+3H], 1098 [M+2H].

Ejemplo 21: Sintesis del Compuesto 21

[0447]

Esquema 21

[0448] Compuesto 21-2: La mezcla de W,W'-dimetileno diamina 21-1 (5 ml, 46,5 mmol) y acrilato de terc-butilo 13 ml (116 mmol) se calento a 85°C durante 1 hora. Se anadieron otros 13 ml (116 mmol) de acrilato de terc-butilo. La mezcla de reaccion se calento de forma continua a 85°C durante 1 hora y se agito a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reaccion se concentro al vado. El residuo se diluyo con hexanos y se purifico por cromatograffa en columna ultrarrapida utilizando cartuchos SiliaSep (120 g), eluyendo con metanol al 0-5%/^dC^mpara dar 10,1 g (62%) del compuesto 21-2, MS (ESI) m/z 345 [M+H].

[0449] Compuesto 21-3: A una solucion del compuesto 21-2 (5,0 g, 14,5 mmol) en 50 ml de DCM, se agregaron 40 ml de 4N HCl/dioxano. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 dfas y se concentro al vado. El residuo se trato con eter, se filtro, se lavo con eter y se seco al vado para dar 4,3 g (97%) del compuesto 21-3.

[0450] Compuesto 21-4: A una solucion de 166 mg (0,544 mmol) de compuesto 21-3 y 0,15 ml de N-metilmorfolina en 10 ml de N-metilpirralidinona, se agregaron 160 mg del compuesto 16-11, seguido de 0,068. mL (0,408 mmol) de DECP. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC preparativa, eluyendo con un 35-70% de CH3CN/H2O en 20 minutos a 254 nm, para dar 100 mg (50%) del compuesto 21-4, MS (ESI) m/z 464 [M+3H], 696 [M+2H], 1391 [M+H].

[0451] Compuesto 21-5: A una solucion del compuesto 19-4 (11 mg, 0,025 mmol), compuesto 21-4 (115 mg, 0,077 mmol) y N-metilmorfolina (0,028 mL, 0,25 mmol) en 1,5 mL de Se anadio N-metilpirrolidinona 29,3 mg (0,077 mmol) de HATU. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC, eluyendo con 20-70% de CH3CN/H2O en 20 minutos a 254 nm, para dar 60 mg (67%) del compuesto 21 5, MS (ESI) m/z 625 [M+5H], 781 [M+4H], 1041 [M+3H].

[0452] Compuesto 21: El compuesto 21-5 (60 mg, 0,014 mmol) se disolvio en 1 ml de DMF. Se anadieron 7 ml (0,21 mmol) de hidrazina anhidra. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se inactivo con solucion de hidrocloruro IN. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC preparativa, eluyendo con 20-70% de CH3CN/H2O en 20 minutos a 254 nm, para dar 29 mg (58%) del compuesto 21. Ms (ESI) m/z 599 [M+5H], 749 [M+4H], 998 [M+3H].

Ejemplo 22: Sintesis del Compuesto 22

[0453]

Esquema 22

[0454] Compuesto 22-1: A una solucion del compuesto 19-4 (7,6 mg, 0,017 mmol), el compuesto 12-7 (40 mg, 0,051 mmol) y DIEA (0,030 mL, 0,17 mmol) en 2 ml de DMF fue Se agregaron 32 mg (0,085 mmol) de ^hA^tU. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC, eluyendo con 20-70% de CH3CN/H2O en 20 minutos a 254 nm, para dar 24 mg (68%) del compuesto 22-1, MS (ESI) m/z 612 [M+3H], 917 [M+2H], 1834 [M+H].

[0455] Compuesto 22: El Compuesto 22-1 (24 mg, 0,012 mmol) se disolvio en 1 ml de DMF. Se anadieron 12 ml (0,36 mmol) de hidrazina anhidra. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se inactivo con solucion de hidrocloruro IN. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC preparativa, eluyendo con 20-70% de CH3CN/H2O en 20 min a 254 nm, para dar 15 mg (58%) del Ejemplo 21. MS (ESI) m/z 569 [M+3H], 852 [M+2H], 1726 [M+2H].

Ejemplo 23: Sintesis del Compuesto 23

[0456]

Esquema 23

[0457] Compuesto 23-1: A una solucion de compuesto 14-3 (4,0 g, 12,4 mmol) y 6,6 mL (37,2 mmol) de DIEA en 50 mL de DCM se agregaron 3,31 g de cloruro de tolunensulfonilo a 0°C. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 d^as. La mezcla de reaccion se extrajo con acetato de etilo. La capa organica se combino y se lavo con acido dtrico al 5%, agua, salmuera, se seco sobre sulfato de sodio y se concentro al vado. El residuo se purifico por cromatograffa flash en columna para dar 3,5 g del compuesto 23-1.

[0468] Compuesto 23-2: A una solucion de compuesto 23-1 (3,5 g, 7,34 mmol) en 20 mL de DMF se le anadio azida de solio (1,44 g, 22,02 mmol). La mezcla de reaccion se agito a 50°C durante 2 dfas. La mezcla de reaccion se extrajo con acetato de etilo. La capa organica se lavo con agua, salmuera, se seco sobre sulfato de sodio, se filtro y se concentro al vado. El residuo se purifico por cromatograffa flash en columna para dar 2,1 g del compuesto 23-2.

[0469] Compuesto 23-3: A una solucion del compuesto 23-2 (2,1 g, 6,05 mmol) en 50 ml de MeOH, se agregaron 400 mg (10%) de EP-C. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente bajo 1 atm H²durante 24 horas. La mezcla de reaccion se filtro y se concentro al vado para dar 2,1 g del compuesto 23-3, MS (ESI) m/z 322 [M+H].

[0460] Compuesto 23-4: A una solucion del compuesto 23-3 (33 mg, 0,102 mmol), compuesto 12-7 (40 mg, 0,051 mmol) y 54 ml de diisopropiletilamina en 1 ml de DMF se agregaron 38 mg de HATU. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC para dar 52 mg del compuesto 23-4, MS (ESI) m/z 525 [M+2H], 1049 [M+H].

[0461] Compuesto 23-5: El compuesto 23-4 (52 mg, 0,045 mmol) se disolvio en 5 ml de 4N HCl/dioxano. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentro al vado para dar 52 mg (100%) del compuesto 23-5, MS (ESI) m/z 497 [M+2H], 993 [M+H].

[0462] Compuesto 23-6: A una solucion del compuesto 19-4 (7,6 mg, 0,017 mmol), compuesto 23-6 (52 mg, 0,051 mmol) y se anadio DIEA (0,030 ml, 0,17 mmol) en 2 ml de DMF32 mg (0,085 mmol) de HATU. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC, eluyendo con 20-70% de CH3CN/H2O en 20 minutos a 254 nm, para dar 26 mg (61%) del compuesto 23-6, MS (ESI) m/z 583 [M+4H], 777 [M+3H], 1165 [M+2H].

[0463] Compuesto 23: El compuesto 23-6 (26 mg, 0,01 mmol) se disolvio en 1 ml de DMF. Se anadieron 10 ml (0,31 mmol) de hidrazina anhidra. La solucion resultante se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La reaccion se inactivo con solucion de hidrocloruro IN. La mezcla de reaccion se purifico por HPLC preparativa, eluyendo con 20-70% de CH3CN/H2O en 20 min a 254 nm, para dar 10 mg (40%) del Ejemplo 23, MS (ESI) m/z 550 [M+4H], 733 [M+3H], 1100 [M+2H].

Tabla 3. Estructuras de los compuestos 1-23

Ċ

ĨContinuado)

Ċ

ĨContinuado)

Ċ

ĨContinuado)

Ċ

ĨContinuado)

(Continuado)

Ejemplo 24: Transfeccion transitoria

[0464] El cultivo de CHO-S se siembra a 0,75x10A6/ml aproximadamente 16 horas antes de la transfeccion en medio FreeStyle Cho. Las celulas estan listas para transfectar al dfa siguiente cuando el recuento de celulas ha alcanzado 1,4-1,6x10A6/mL. Cuando las celulas alcanzan el recuento objetivo, se anaden 400 mM de stock de pAF a una concentracion de cultivo final de 1,4 mM. El complejo PEI/ADN se prepara como se describe: el ADN (1,42 ug/1x10A6 celulas) se disuelve en RPMI (5% (v/v) del volumen de cultivo total), la mezcla de ADN/RPMI se incuba a temperature ambiente durante 2 minutos. Se anade la reserva de PEI (1 mg/ml) a la solucion de ADN en una proporcion de 3:1 (ml de PEI/ug ADN) y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 5 min. El cultivo se agrega suavemente a la mezcla y se agita. Los matraces se transfieren a una incubadora a 32°C. En el dfa 6 posterior a la transfeccion, se realiza un analisis de transferencia Western. En el dfa 7 despues de la transfeccion, se recoge el sobrenadante.

Ejemplo 25: Estudio de eficacia in vivo de CD70-ADC

[0465] La eficacia antitumoral de CD70-2H5-HA119-NCA1 conjugada con NCA1 se ensayo en un modelo de raton con carcinoma de celulas renales. 786-0, celulas de carcinoma de celulas renales humanas, se transfirieron como fragmento de tumor para 2 pases in vivo a ratones hembra, de 5 semanas de edad, desnudos. Los ratones, diez por grupo de prueba, se trataron con diferentes dosis de CD70-2H5-HA119-NCA1 en una formulacion de histidina 50 mM, NaCl 100 mM, trehalosa al 5%, pH 6,0 y se midieron contra el vehnculo de prueba de la formulacion sin ADC por via intravenosa una vez en el primer dfa del estudio. Los ratones se pesaron y se midieron para determinar el tumor en tres dimensiones usando un calibrador electronico. El volumen del tumor individual se calculo como alturaXanchuraXlongitud. Los ratones con tumores vascularizados (determinados por la aparicion de los tumores) de tamanos apropiados se asignaron al azar a grupos de tratamiento y se dosificaron por peso corporal individual en el Dfa 33 (tres (3) semanas despues de la inyeccion con celulas). Los resultados de este experimento se muestran en la Fig. 2.

Tabla 4: Grupos de prueba para estudio de eficacia in vivo de CD70

Ejemplo 26: CD70-ADC en el modelo de linfoma de Burkitt

[0466] La eficacia antitumoral de ARX-aCD70 no conjugada y ARX-aCD70 conjugada ADC se midio en el modelo de tumor de Daudi (linfoma de Burkitt). Se usaron ratones hembra desnudos como sujetos de prueba, diez por grupo, y para comenzar, se administro una unica inyeccion IV el dfa 1 a todos los grupos (N = 20). Hubo cinco grupos, l0 artfculos de prueba y 10 vehfculos por grupo, asignados al azar despues de una semana.

[0467] Se administra una segunda inyeccion despues de 21 dfas (o cuando los tumores comienzan a crecer nuevamente), y los grupos que no son vehfculos se dividen en grupos iguales de 10 cada uno y se les administra una segunda inyeccion IV.

[0468] Los ratones se pesan y se miden para el tumor de forma tridimensional utilizando un calibrador electronico. El volumen del tumor individual se calcula como alturaXanchoXlongitud. Los ratones con tumores vascularizados (determinados por la aparicion de los tumores) de tamanos apropiados se asignan al azar a grupos de tratamiento y se dosifican por peso corporal individual en el Dfa 33 (tres (3) semanas despues de la inyeccion con celulas).

Ejemplo 27: Estudio de citotoxicidad de CD70-2H5-HA119-NCA1 786-O 96h

[0469] La citotoxicidad de los conjugados de farmaco de anticuerpo ARX-aCD70 se comparo con la dolastatina en celulas 786-O. La CI⁵⁰se midio y los resultados de este experimento se muestran en la Fig. 3A.

Ejemplo 28: Estudio de citotoxicidad de 96h CD70-2H5-HA119-NCA1 Caki-196h

[0470] La citotoxicidad de los conjugados de farmaco de anticuerpo ARX-aCD70 se comparo con la dolastatina en celulas Caki-1, La CI⁵⁰se midio y los resultados de este experimento se muestran en la Fig. 3B.

Ejemplo 29: Actividad antitumoral de tres CD70-AS269 en el modelo de xenoinjerto de cancer de rinon 786-0 [0471] El modelo de tumor de carcinoma de celulas renales 786-O se uso en ratones hembra desnudos. Diez grupos de diez ratones recibieron fragmentos de tumores 786-O y luego se asignaron al azar despues de una semana y media cuando los tumores crecieron entre 100-300 mm3. Los grupos, uno para cada nivel de dosis y otro para el vehuculo, se trataron de la siguiente manera:

--Vehfculo,

--CD70-2H5-HA119-NCA1-IgG1v1 a 0,5, 1 y 3 mg/kg

--CD70-7F2-HA119-NCA1-IgG1v1 a 0,5, 1 y 3 mg/kg

--CD70-8A1-HA122-NCA1-|gG1v1 a 0,5, 1 y 3 mg/kg

[0472] Se administro una inyeccion de una sola dosis por via intravenosa a los 100 ratones en el dfa 12 despues del trasplante, y los resultados de estos experimentos incluyen los datos que se dan en las Figs. 4-6,

Ejemplo 30: Ensayo clinico en humanos de CD70-2H5-HA119-NCA1 para oncolog^a

Ensayo clinico en humanos de la seguridad y/o eficacia de CD70-2H5-HA119-NCA1 para oncologfa

[0473] Objetivo: Comparar la seguridad y la farmacocinetica de la composicion administrada que comprende el derivado de dolastatina unido a ARX-aCD70.

[0474] Diseno del estudio: Este estudio sera un estudio de Fase I, de centro unico, abierto, aleatorizado de dosis, seguido de un estudio de Fase II en pacientes con cancer renal. Los pacientes no debenan haber estado expuestos al derivado de dolastatina unido a aCD70 antes del ingreso al estudio. Los pacientes no deben haber recibido tratamiento para el cancer dentro de las 2 semanas posteriores al inicio del ensayo. Los tratamientos incluyen el uso de quimioterapia, factores de crecimiento hematopoyeticos y terapia biologica como los anticuerpos monoclonales. Los pacientes deben haberse recuperado de todas las toxicidades (de grado 0 o 1) asociadas con el tratamiento previo. Se evaluo la seguridad de todos los sujetos y se recolectaron todas las colecciones de sangre para el analisis farmacocinetico segun lo programado. Todos los estudios se realizan con la aprobacion del comite de etica institucional y el consentimiento del paciente.

[0475] Fase I: Los pacientes reciben i.v. CD70-2H5-HA119-NCA1 en los dfas 1, 8 y 15 de cada ciclo de 28 dfas. Las dosis de CD70-2H5-HA119-NCA1 pueden conservarse o modificarse por su toxicidad segun las evaluaciones que se describen a continuacion. El tratamiento se repite cada 28 dfas en ausencia de toxicidad inaceptable. Cohortes de 3 6 pacientes reciben dosis crecientes de CD70-2H5-HA119-NCA1 hasta que se determina la dosis maxima tolerada (MTD) para CD70-2H5-HA119-NCA1. La MTD se define como la dosis que precede a la que 2 de 3 o 2 de 6 pacientes experimentan toxicidad limitante de la dosis. Las toxicidades limitantes de la dosis se determinan de acuerdo con las definiciones y los estandares establecidos por el National Cancer Institute (NCI) Common Terminology for Adverse Events (CTCAE) Version 3,0 (9 de agosto de 2006).

[0476] Fase II: Los pacientes reciben CD70-2H5-HA119-NCA1 como en la fase I en la MTD determinada en la fase I. El tratamiento se repite cada 4 semanas durante 2-6 ciclos en ausencia de progresion de la enfermedad o toxicidad inaceptable. Despues de completar 2 cursos de terapia de estudio, los pacientes que logran una respuesta completa o parcial pueden recibir 4 cursos adicionales. Los pacientes que mantienen la enfermedad estable durante mas de 2 meses despues de completar 6 cursos de terapia de estudio pueden recibir 6 cursos adicionales en el momento de la progresion de la enfermedad, siempre que cumplan con los criterios de elegibilidad originales.

[0477] Muestreo de sangre: Se extrae sangre en serie mediante puncion venosa directa antes y despues de la administracion de CD70-2H5-HA119-NCA1. Las muestras de sangre venosa (5 ml) para la determinacion de las concentraciones sericas se obtienen aproximadamente 10 minutos antes de la dosificacion y aproximadamente en los siguientes tiempos despues de la dosificacion: dfas 1, 8 y 15. Cada muestra de suero se divide en dos alfcuotas. Todas las muestras de suero se almacenan a -20°C. Las muestras de suero se envfan en hielo seco.

[0478] Farmacocinetica: Los pacientes se someten a recoleccion de muestras de plasma/suero para la evaluacion farmacocinetica antes del inicio del tratamiento y en los dfas 1, 8 y 15. Los parametros farmacocineticos se calculan mediante metodos independientes del modelo en un sistema informatico VAX 8600 de Digital Equipment Corporation utilizando la ultima version del software BIOAVL. Se determinan los siguientes parametros farmacocineticos: concentracion serica maxima (Cmax); tiempo hasta la concentracion maxima en suero (tmax); area bajo la curva de concentracion-tiempo (AUC) desde el tiempo cero hasta el ultimo tiempo de muestreo de sangre (AUC0-72) calculado con el uso de la regla trapezoidal lineal; y vida media de eliminacion terminal (t1/2), calculada a partir de la constante de velocidad de eliminacion. La constante de velocidad de eliminacion se estima mediante regresion lineal de puntos de datos consecutivos en la region lineal terminal de la grafica de concentracion-tiempo log-lineal. La d e sv ia c ion m ed ia e s ta n d a r (D E ) y el coe fic ie n te de v a ria c io n (C V ) de los p a ram e tro s fa rm a co c in e tico s se ca lcu lan pa ra cad a tra ta m ie n to . S e c a lcu la la re la c io n de las m ed ia s de los p a ram e tro s (fo rm u la c io n c o n se rva d a /fo rm u la c io n no con se rva da ).

[0479] Respuesta del paciente a la terapia de combinacion: la respuesta del paciente se evalua mediante imagenes con rayos X, tomograffas computarizadas y resonancia magnetica, y las imagenes se realizan antes de comenzar el estudio y al final del primer ciclo, con imagenes adicionales realizadas cada cuatro semanas o al final de los ciclos posteriores. Las modalidades de imagen se eligen segun el tipo de cancer y la viabilidad/disponibilidad, y se utiliza la misma modalidad de imagen para tipos de cancer similares, asf como a lo largo del curso de estudio de cada paciente. Las tasas de respuesta se determinan utilizando los criterios RECIST. (Therasse y otros, J. Natl. Cancer Inst. 2000, 2 de febrero; 92 (3): 205-16; http: //ctep.cancer.gov/forms/TherasseRECISTJNCl.pdf). Los pacientes tambien se someten a biopsia de cancer/tumor para evaluar los cambios en el fenotipo de las celulas cancengenas progenitoras y el crecimiento clonogenico por citometna de flujo, transferencia Western e IHC, y por los cambios en la citogenetica por FISH. Despues de completar el tratamiento del estudio, los pacientes son seguidos periodicamente durante 4 semanas,

Ensayos adicionales para actividades citotoxicas, citostaticas e inmunomoduladoras

[0480] Se conocen metodos para determinar si un anticuerpo media la funcion efectora contra una celula diana. En este documento se describen ejemplos ilustrativos y no limitativos de tales metodos.

[0481] Para determinar si un anticuerpo anti-CD70 o derivado media la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo contra celulas inmunes activadas o celulas cancerosas que expresan CD70, se puede usar un ensayo que mida la muerte de la celula diana en presencia de celulas inmunes efectoras y de anticuerpos. Un ensayo utilizado para medir este tipo de citotoxicidad puede basarse en la determinacion de la liberacion de 51Cr de las celulas diana marcadas metabolicamente despues de la incubacion en presencia de celulas efectoras y anticuerpos espedficos de la diana (ver, por ejemplo, Perussia y Loza, 2000, Methods in Molecular Biology 121: 179-92; y "51Cr Release Assay of Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC)" in Current Potocols in Immunology, Coligan et al. Eds., Wileyand Sons, 1993). Por ejemplo, las celulas inmunitarias activadas (p. ej., Linfocitos activados) o las celulas cancerosas que expresan CD70 marcadas con NA²51CrO⁴y se colocan en placas a una densidad de 5.000 celulas por pocillo de una placa de 96 pocillos se pueden tratar con concentraciones variables de anticuerpo anti-CD70 durante 30 minutos luego se mezclan con celulas mononucleares de sangre periferica humana (PBMC) normales durante 4 horas. La rotura de la membrana que acompana a la muerte de la celula diana libera 51Cr en el sobrenadante del cultivo, que se puede recolectar y evaluar para determinar la radioactividad como una medida de la actividad citotoxica. Otros ensayos para medir ADCC pueden involucrar marcadores no radioactivos o pueden estar basados en la liberacion inducida de enzimas espedficas. Por ejemplo, un ensayo no radiactivo basado en fluorometna de resolucion temporal esta disponible comercialmente (Delphia, Perkin Elmer). Este ensayo se basa en la carga de celulas diana con un ester de acetoximatilo de ligando potenciador de la fluorescencia (BATDA) que penetra en la membrana celular y luego se hidroliza para formar un ligando hidrofflico (TDA) impermeable a la membrana. Cuando se mezcla con el anticuerpo espedfico de la diana y las celulas efectoras de PBMC, el TDA se libera de las celulas lisadas y esta disponible para formar un quelato altamente fluorescente cuando se mezcla con Europio. La senal, medida con un fluorometro de resolucion temporal, se correlaciona con la cantidad de lisis celular.

[0482] Para determinar si un anticuerpo anti-CD70 o derivado media la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos contra celulas inmunes activadas o celulas cancerosas que expresan CD70, un ensayo que mide la internalizacion de celulas diana por celulas inmunes efectoras (por ejemplo, macrofagos cultivados frescos o macrofagos establecidos) (Como lmea celular) (vease, por ejemplo, Munn y Cheung, 1990, J. Exp. Med. 172: 231 37; Keler et al., 2000, J. Immunol. 164: 5746-52; Akewanlop et al., 2001, Cancer Res. 61: 4061-65). Por ejemplo, las celulas diana pueden marcarse con un tinte de membrana lipofila como PKH67 (Sigma), recubrirse con un anticuerpo espedfico de la diana y mezclarse con celulas inmunitarias efectoras durante 4-24 horas. Las celulas efectoras luego pueden identificarse mediante la contratincion con un anticuerpo marcado con fluorocromo espedfico para un marcador de superficie celular fagodtica (por ejemplo, CD14) y las celulas se pueden analizar mediante citometna de flujo de dos colores o microscopfa de fluorescencia. Las celulas positivas dobles representan celulas efectoras que tienen celulas diana internalizadas. Para estos ensayos, las celulas efectoras pueden ser monocitos derivados de PBMC que se han diferenciado en macrofagos por cultivo durante 5-10 dfas con M-CSF o GM-CSF (vease, por ejemplo, Munn y Cheung, supra), lmeas celulares humanas similares a macrofago U937 (Larrick et al., 1980, J. Immunology 125: 6-12) o THP-1 (Tsuchiya et al., 1980, Int. J. Cancer 26: 171-76) disponibles en ATCC como fuente alternativa de celulas fagocticas.

[0483] Tambien se conocen metodos para determinar si un anticuerpo media la citotoxicidad dependiente del complemento al unirse a las celulas diana. Se pueden aplicar los mismos metodos para determinar si un agente de union a CD70 media CDC en celulas inmunes activadas o celulas cancerosas que expresan CD70. A continuacion se describen ejemplos ilustrativos de tales metodos.

[0484] La fuente de complemento activo puede ser suero humano normal o purificado de animales de laboratorio, incluidos conejos. En un ensayo estandar, un agente de union a CD70 se incuba con celulas inmunes activadas que expresan CD70 (por ejemplo, linfocitos activados) o celulas cancerosas que expresan CD70 en presencia de complemento. La capacidad de dicho agente de union a CD70 para mediar la lisis celular puede determinarse mediante varias lecturas. En un ejemplo, se utiliza un ensayo de liberacion Nasup,51CrO4. En este ensayo, las celulas diana se marcan con Na51CrO⁴. El Na51CrO⁴no incorporado se lava y las celulas se colocan en placas a una densidad adecuada, tipicamente entre 5.000 y 50.000 celulas/pocillo, en una placa de 96 pocillos. La incubacion con el agente de union a CD70 en presencia de suero normal o complemento purificado suele durar de 2 a 6 horas a 37°C en una atmosfera de 5% CO². La radioactividad liberada, que indica la lisis celular, se determina en una parte alfcuota del sobrenadante del cultivo mediante el recuento de rayos gamma. La lisis celular maxima se determina liberando el tratamiento con Na51CrO⁴incorporado mediante detergente (0,5-1% NP-40 o Triton X-100). La lisis celular de fondo espontanea se determina en los pocillos donde solo esta presente el complemento sin ningun agente de union a CD70. El porcentaje de lisis celular se calcula como (lisis inducida por el agente de union a CD70 - lisis espontanea)/lisis celular maxima. La segunda lectura es una reduccion de los colorantes metabolicos, por ejemplo, Alamar Blue, por celulas viables. En este ensayo, las celulas diana se incuban con un agente de union a CD70 con complemento y se incuban como se describe anteriormente. Al final de la incubacion, se agrega 1/10 volumen de Alamar Blue (Biosource International, Camarillo, California). La incubacion continua hasta 16 horas a 37°C. en una atmosfera de 5% CO². La reduccion del azul de Alamar como una indicacion de celulas viables metabolicamente activas se determina mediante analisis fluorometrico con excitacion a 530 nm y emision a 590 nm. La tercera lectura es la permeabilidad de la membrana celular al yoduro de propidio (PI). La formacion de poros en la membrana plasmatica como resultado de la activacion del complemento facilita la entrada de PI en las celulas, donde se difundira en los nucleos y se unira al ADN. Al unirse al ADN, la fluorescencia de PI en los 600 nm aumenta significativamente. El tratamiento de las celulas diana con el agente de union a CD70 y el complemento se lleva a cabo como se describe anteriormente. Al final de la incubacion, se agrega PI a una concentracion final de 5 .mu.g/ml. La suspension celular se examina luego mediante citometna de flujo utilizando un laser de argon de 488 nm para la excitacion. Las celulas lisadas se detectan por emision de fluorescencia a 600 nm.

Modelos animales adicionales de trastornos inmunologicos o canceres que expresan CD70

[0485] Los agentes de union anti-CD70 de la presente invencion, por ejemplo, anticuerpos o derivados con uno o mas aminoacidos codificados de forma no natural y ADC de la invencion, pueden ensayarse o validarse en modelos animales de trastornos inmunologicos o en canceres CD70. El experto en la materia conoce una serie de modelos animales establecidos de trastornos inmunologicos o canceres que expresan CD70, cualquiera de los cuales puede usarse para evaluar la eficacia del anticuerpo o derivado anti-CD70. Los ejemplos no limitantes de tales modelos se describen a continuacion.

[0486] Ejemplos de modelos animales de enfermedades autoinmunes sistemicas y espedficas de organos que incluyen diabetes, lupus, esclerosis sistemica, smdrome de Sjogren, encefalomielitis autoinmune experimental (esclerosis multiple), tiroiditis, miastenia gravis, artritis, uveftis y enfermedad intestinal inflamatoria se han descrito por Bigazzi," Animal Models of Autoimmunity: Spontaneous and Induced," in The Autoimmune Diseases (Rose y Mackay eds., Academic Press, 1998) y en "Animal Models for Autoimmune and Inflammatory Disease," in Current Protocols in Immunology (Coligan et al. eds., Wiley and Sons, 1997).

[0487] Las afecciones alergicas, por ejemplo, asma y dermatitis, tambien pueden modelarse en roedores. La hipersensibilidad de las vfas respiratorias se puede inducir en ratones mediante ovalbumina (Tomkinson et al., 2001, J. Immunol. 166: 5792-800) o antfgeno de huevo de Schistosoma mansoni (Tesciuba et al., 2001, J. Immunol. 167: 1996-2003). La cepa de ratones Nc/Nga muestra un aumento marcado en la IgE serica y desarrolla espontaneamente lesiones de tipo dermatitis atopica (Vestergaard et al., 2000, Mol, Med. Today 6: 209-10; Watanabe et al., 1997. Int. Immunol 9: 461-66; Saskawa et al., 2001, Int. Arch. Allergy Immunol. 126: 239-47).

[0488] La inyeccion de linfocitos donadores inmunocompetentes en un huesped histo-incompatible con radiacion letal es un enfoque clasico para inducir GVHD en ratones. Alternativamente, el modelo murino B6D2F1 parental proporciona un sistema para inducir la GVHD aguda y cronica. En este modelo, los ratones B6D2F1 son progenie F1 de un cruce entre las cepas parentales de ratones C57BL/6 y DBA/2. La transferencia de celulas linfoides DBA/2 a ratones B6D2F1 no irradiados causa GVHD cronica, mientras que la transferencia de celulas linfoides C57BL/6, C57BL/10 o B10.D2 causa GVHD aguda (Slayback et al., 2000, Bone Marrow Transpl. 26: 931-938; Kataoka et al., 2001, Immunology 103: 310-318).

[0489] Ademas, tanto las celulas madre hematopoyeticas humanas como las celulas linfoides de sangre periferica maduras pueden injertarse en ratones SCID, y estas celulas linfo-hematopoyeticas humanas siguen siendo funcionales en los ratones SCID (McCune et al., 1988, Science 241: 1632-1639 Kamel-Reid y Dick, 1988, Science 242: 1706-1709; Mosier et al., 1988, Nature 335: 256-259). Esto ha proporcionado un sistema de modelo animal pequeno para la prueba directa de posibles agentes terapeuticos en celulas linfoides humanas. (Ver, por ejemplo, Tournoy et al., 2001, J. Immunol. 166: 6982-6991).

[0490] Ademas, se pueden crear pequenos modelos animales para examinar las eficacias in vivo de los anticuerpos o derivados anti-CD70 implantando lmeas de celulas tumorales humanas que expresan CD70 en cepas de roedores inmunodeficientes apropiadas, por ejemplo, ratones atimicos desnudos o ratones SCID. Los ejemplos de lmeas celulares de linfoma humano que expresan CD70 incluyen, por ejemplo, Daudi (Ghetie et al., 1994, Blood 83: 1329 36; Ghetie et al., 1990, Int. J. Cancer 15: 481-85; de Mont et al., 2001, Cancer Res. 61: 7654-59), HS-Sultan (Cattan y Maung, 1996, Cancer Chemother. Pharmacol. 38: 548-52; Cattan y Douglas, 1994, Leuk. Res. 18: 513-22), Raji (Ochakovskaya et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7: 1505-10; Breisto et al., 1999, Cancer Res. 59: 2944-49), y CA46 (Kreitman et al., 1999, Int. J. CanceR81: 148-55). Un ejemplo no limitante de una lmea de linfoma de Hodgkin que expresa CD70 es L428 (Drexler, 1993, Leuk. Lymphoma 9: 1-25; Dewan et al., 2005, Cancer Sci. 96: 466-473). Los ejemplos no limitantes de lmeas celulares de carcinoma de celulas renales humanas que expresan CD70 incluyen 786-O (Ananth et al., 1999, Cancer Res. 59: 2210-16; Datta et al., 2001, Cancer Res. 61: 1768-75), ACHN (Hara et al., 2001, J. Urol. 166: 2491-94; Miyake et al., 2002, J. Urol. 167: 2203-08), Caki-1 (Prewett et al., 1998, Clin Cancer Res, 4: 2957-66; Shi y Siemann, 2002, Br. J. CanceR87: 119-26), y Caki-2 (Zellweger et al., 2001, Neoplasia 3: 360 67). Los ejemplos no limitantes de lmeas celulares de carcinoma nasofarmgeo que expresan CD70 incluyen C15 y C17 (Busson et al., 1988, Int, J. Cancer 42: 599-606; Bernheim et al., 1993, Cancer Genet. Cytogenet. 66: 11 -5). Los ejemplos no limitantes de lmeas celulares de glioma humano que expresan CD70 incluyen U373 (Palma et al., 2000, Br. J. Cancer 82: 480-7) y U87MG (Johns et al., 2002, Int. J. Cancer 98: 398-408), los ejemplos no limitantes de lmeas celulares de mieloma multiple incluyen MM.1S (Greenstein et al., 2003, Experimental Hematology 31: 271 282) y L363 (Diehl et al., 1978, Blut 36: 331-338). (Ver tambien Drexler y Matsuo, 2000, Leukemia Research 24: 681 703). Estas lmeas celulares tumorales pueden establecerse en huespedes de roedores inmunodeficientes como tumores solidos mediante inyecciones subcutaneas o como tumores diseminados mediante inyecciones intravenosas. Una vez establecidos dentro de un huesped, estos modelos de tumores pueden aplicarse para evaluar las eficacias terapeuticas del anticuerpo anti-CD70 o derivados como se describen en la presente memoria sobre la modulacion del crecimiento tumoral in vivo

Trastornos Asociados por CD 70

[0491] Los anticuerpos anti-CD70 y ADC descritos en el presente documento son utiles para tratar o prevenir un cancer que expresa CD70 o un trastorno inmunologico caracterizado por la expresion de CD70 por activacion inapropiada de celulas inmunes (por ejemplo, linfocitos o celulas dendnticas). Dicha expresion de CD70 puede deberse, por ejemplo, a niveles aumentados de protema CD70 en la superficie de las celulas y/o alteracion de la antigenicidad de la CD70 expresada. El tratamiento o la prevencion del trastorno inmunologico, de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento, se logra administrando a un sujeto que necesita dicho tratamiento o prevencion una cantidad eficaz del anticuerpo o derivado anti-CD70, por lo que el anticuerpo o derivado (i) se une a las celulas inmunitarias activadas que expresan CD70 y que estan asociadas con el estado de la enfermedad y (ii) ejerce un efecto citotoxico, citostatico o inmunomodulador sobre las celulas inmunitarias activadas. En algunas realizaciones, el citotoxico, citostatico o inmunomodulador se ejerce sin conjugacion con un agente citotoxico, citostatico o inmunomodulador. En algunas realizaciones, el citotoxico, citostatico o inmunomodulador se ejerce por conjugacion con un agente citotoxico, citostatico o inmunomodulador.

[0492] Las enfermedades inmunologicas que se caracterizan por una activacion inadecuada de las celulas inmunitarias y que pueden tratarse o prevenirse mediante los metodos descritos en el presente documento pueden clasificarse, por ejemplo, por el tipo de reaccion de hipersensibilidad que subyacen al trastorno. Estas reacciones se clasifican tfpicamente en cuatro tipos: reacciones anafilacticas, reacciones citotoxicas (citolfticas), reacciones de complejos inmunes o reacciones de inmunidad mediada por celulas (CMI) (tambien denominadas reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH)). (Ver, por ejemplo, Fundamental Immunology (William E. Paul Ed., Raven Press, NY, 3a ed. 1993).)

[0493] Entre los ejemplos espedficos de dichas enfermedades inmunologicas se incluyen los siguientes: artritis reumatoide, artritis psoriasica, enfermedades desmielinizantes autoinmunes (p. ej., esclerosis multiple, encefalomielitis alergica), oftalmopatfa endocrina, uveoretinitis, lupus eritematoso sistemico, miastenia gravis, enfermedad de Grave, glomerulonafritis, trastorno hepatologico, enfermedad inflamatoria del intestino (p. ej., enfermedad de Crohn), anafilaxia, reaccion alergica, smdrome de Sjogren, diabetes mellitus tipo I, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener, fibromialgia, polimiositis, dermatomiositis, insuficiencia endocrina multiple, smdrome de Schmidt, uveitis autoinmune, enfermedad de Addison, adrenalitis, tiroiditis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad tiroidea autoinmune, anemia perniciosa, atrofia gastrica, hepatitis lupoidea, hepatitis lupoidea, aterosclerosis, lupus subcutaneo, lupus eritematoso, hipoparatiroidismo, smdrome de Dressler, trombocitopenia autoinmune, purpura trombocitopenica idiopatica, anemia hemolftica, penfigo vulgar, penfigo, desnatitis herpetiforme, alopecia arcata, penfigoide, esclerodermia, esclerosis sistemica progresiva, smdrome de CREST (calcinosis, fenomeno de Raynaud, dismotilidad esofagica, esclerodactilo), y telangiectasia), infertilidad autoinmune macho y hembra, espondolitis anquilosante, colitis ulcerosa, enfermedad mixta del tejido conectivo, poliarteritis nedosa, vasculitis necrotizante sistemica, dermatitis atopica, rinitis atopica, smdrome de Goodpasture, enfermedad de Chagas, sarcoidosis, fiebre reumatica, asma, aborto recurrente, smdrome antifosfolfpido, pulmon de granjero, eritema multiforme, smdrome de Cushing, hepatitis activa cronica autoinmune, pulmon avicultor, necrolisis epidermica toxica, smdrome de Alport, alveolitis, alveolitis alergica, alveolitis fibrosa, enfermedad pulmonar intersticial, eritema nudoso, pioderma gangrenoso, reaccion de transfusion, arteria de Takayasu, polimialgia reumatica, estraquiaria, un parche arteritis de celulas gigantes, ascariasis, aspergilosis, smdrome de Sampter, eccema, granulomatosis linfomatoide, enfermedad de Behcet, smdrome de Caplan, enfermedad de Kawasaki, dengue, encefalomielitis, endocarditis, fibrosis endomiocardico, endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, psoriasis, eritroblastosis fetalis, facilitis eosinofflica, smdrome de Shulman, smdrome de Felty, filariasis, ciclitis, ciclitis cronica, ciclitis heterocronica, ciclitis de Fuch, nefropatfa por IgA, purpura de Henoch-Schonlein, enfermedad injerto contra huesped, rechazo al trasplante, cardiomiopatfa, smdrome de Eaton-Lambert, policondritis recurrente, crioglobulinemia, macroloboboboblastia de Waldenstrom, smdrome de Even y fallo gonadal autoinmune.

[0494] Por consiguiente, los metodos descritos aqu abarcan el tratamiento de trastornos de los linfocitos B (por ejemplo, lupus eritematoso sistemico, smdrome de Goodpasture, artritis reumatoide y diabetes tipo I), linfocitos Thi (por ejemplo, artritis reumatoide, esclerosis multiple, psoriasis), el smdrome de Sjorgren, la tiroiditis de Hashimoto, la enfermedad de Grave, la cirrosis biliar primaria, la granulomatosis de Wegener, la tuberculosis o la enfermedad de injerto contra huesped (por ejemplo, la dermatitis atopica, lupus eritematoso sistemico, asma atopico, rinoconjunctivitis, rinitis alergico, smdrome de Omenn, esclerosis sistemica, o enfermedad de huesped frente a injerto cronico). En general, los trastornos que afectan a las celulas dendrfticas implican trastornos de los linfocitos Thi o linfocitos Th².

[0495] En algunas realizaciones, el trastorno inmunologico es un trastorno inmunologico mediado por celulas T, tal como un trastorno de celulas T en el que las celulas T activadas asociadas con el trastorno expresan CD70. Pueden administrarse agentes de union anti-CD70 (por ejemplo, anticuerpos o derivados) para agotar tales celulas T activadas que expresan CD70. En una realizacion espedfica, la administracion de anticuerpos anti-CD70 o derivados puede agotar las celulas T activadas que expresan CD70, mientras que las celulas T en reposo no se agotan sustancialmente por el anti-CD70 o derivado. En este contexto, "no sustancialmente agotado" significa que menos de aproximadamente el 60%, o menos de aproximadamente el 70% o menos de aproximadamente el 80% de las celulas T en reposo no se agotan,

[0496] Los anticuerpos anti-CD70 y los ADC descritos en el presente documento tambien son utiles para tratar o prevenir un cancer que exprime CD70. El tratamiento o la prevencion de un cancer que expresa CD70, de acuerdo con los metodos descritos en este documento, se logra administrando a un sujeto que necesita dicho tratamiento o prevencion una cantidad eficaz del anticuerpo o derivado anti-CD70, por lo que el anticuerpo o derivado (i) se une a las celulas cancerosas que expresan CD70 y (ii) ejerce un efecto citotoxico o citostatico para agotar o inhibir la proliferacion de las celulas cancerosas que expresan CD70. En algunas realizaciones, el citotoxico, citostatico o inmunomodulador se ejerce sin conjugacion con un agente citotoxico, citostatico o inmunomodulador. En algunas realizaciones, el citotoxico, citostatico o inmunomodulador se ejerce por conjugacion con un agente citotoxico, citostatico o inmunomodulador.

[0497] Los canceres que expresan CD70 que pueden tratarse o prevenirse mediante los metodos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, diferentes subtipos de linfoma no Hodgkin (LNH indolentes, LNH foliculares, linfomas linfodticos pequenos, LNH linfoplasmodticos o LNH de la zona marginal); enfermedad de Hodgkin (p. ej., celulas de Reed-Sternberg); canceres del linaje de celulas B, incluidos, por ejemplo, linfomas difusos de celulas B grandes, linfomas foliculares, linfoma de Burkitt, linfomas de celulas del manto, leucemias linfocfticas de celulas B (por ejemplo, leucemia linfodtica aguda, leucemia linfocftica cronica); linfomas de celulas B positivos al virus de Epstein Barr; carcinomas de celulas renales (p. ej., celulas claras y papilares); carcinomas nasofarmgeos; carcinomas timicos; gliomas; glioblastomas; neuroblastomas; astrocitomas; meningiomas; macroglobulinemia de Waldenstrom; mielomas multiples; y carcinomas de colon, estomago y recto. El cancer puede ser, por ejemplo, recien diagnosticado, pretratado o refractario o recidivante. En algunas realizaciones, un cancer que expresa c D70 tiene al menos aproximadamente 15.000, al menos aproximadamente 10.000 o al menos aproximadamente 5.000 moleculas de CD70/celula.

[0498] Con respecto a los regfmenes terapeuticos para la administracion combinatoria de anticuerpos anti-CD70 conjugados o no conjugados de la presente invencion, en una realizacion espedfica, se administra un agente de union anti-CD70 simultaneamente con un agente terapeutico. En otra realizacion espedfica, el anticuerpo anti-CD70 se conjuga con un agente terapeutico. En algunas realizaciones, el sujeto se monitoriza despues de la administracion del agente de union anti-CD70, y opcionalmente el agente terapeutico.

[0499] El agente terapeutico puede ser, por ejemplo, cualquier agente que ejerza un efecto terapeutico sobre celulas cancerosas o celulas inmunes activadas. Tfpicamente, el agente terapeutico es un agente citotoxico o inmunomodulador. Dicha administracion combinatoria puede tener un efecto aditivo o sinergico en los parametros de la enfermedad (p. ej., la gravedad de un smtoma, el numero de smtomas o la frecuencia de recafda).

[0500] Clases utiles de agentes citotoxicos o inmunomoduladores incluyen, por ejemplo, agentes antitubulina, auristatinas, ligantes de surco de ADN, inhibidores de la replicacion de ADN, agentes alquilantes (por ejemplo, complejos de platino como cis-platino, mono(platino), bis(platino) y complejos tri-nucleares de platino y carboplatino), antraciclinas, antibioticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas, etoposidos, pirimidinas fluoradas, ionoforos, lexitropsinas, nitrosasinas, platinoles, preformados de compuestos, purinas de productos y servicios, sensibilizadores de la radiacion, esteroides, taxanos, inhibidores de la topoisomerasa, alcaloides de la vinca y similares.

[0501] Los agentes citotoxicos o inmunomoduladores individuales incluyen, por ejemplo, un androgeno, antramicina (AMC), aspinasa, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfan, sulfoximina de butionina, camptotecina, carboplatino, carmustina (BSNU) CC-1065, clorambucilo, cisplatino, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, arabinosido de citidina, citotlasina B, dacarbazina, dactinomicina (actinomicina), daunorubicina, decarazina, docetaxel, doxorubicina, un estrogeno, 5-fluordeoxiuridina, 5-fluorouracilo, gramicidina D, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalan, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazol, paclitaxel, plicamicina, procarbizina, rapamicina (Sirolimus), estreptozotocina, tenoposido, 6-tioguanina, tioTEPA, topotecano, vinblastina, vincristina, vinorelbina, VP-16 y VM-26.

[0502] En algunas realizaciones tfpicas, el agente terapeutico es un agente citotoxico. Los agentes citotoxicos adecuados incluyen, por ejemplo, dolastatinas (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE), aglutinantes de surcos de ADN (por ejemplo, editinas y lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel), puromicinas, alcaloides de vincina, ^cC-1065, SN-38, topotecano, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolinodoxorrubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A y B, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, discodermolida, eleuterobina, y mitoxantrona.

[0503] En algunas realizaciones, el agente citotoxico es un quimioterapeutico convencional tal como, por ejemplo, doxoricicina, paclitaxel, melfalan, alcaloides de la vinca, metotrexato, mitomicina C o etoposido. En algunas realizaciones, el agente terapeutico puede ser una terapia combinada, como CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, prednisolona y vincristina), CHOP-R (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, prednisolona y rituximab) o ABVD (doxorubicina, bleomicina vinblastina y dacarbazina). Agentes como los analogos de CC-1065, caliqueamicina, maitansina, analogos de dolastatina 10, rizoxina y palitoxina se pueden unir a los anticuerpos anti-CD70 o derivados de los mismos.

[0504] En realizaciones espedficas, el agente citotoxico o citostatico es auristatina E (tambien conocida en la tecnica como dolastatina 10) o un derivado de la misma. Tfpicamente, el derivado de auristatina E es, por ejemplo, un ester formado entre la auristatina E y un acido ceto. Por ejemplo, la auristatina E se puede hacer reaccionar con acido benzoico de paraacetilo o acido benzoilvalerico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otros derivados tfpicos de la auristatina incluyen AFP, MMAF y MMAE. La smtesis y estructura de la auristatina E y sus derivados se describen en las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE.UU. Nos 20030083263 y 20050009751), Solicitud de Patente Internacional N° PCT/US03/24209, Solicitud de Patente Internacional N° PCT/US02/13435, y Patente de EE.UU. N° 6.323.315; 6.239.104; 6.034.065; 5.780.588; 5.665.860; 5.663.149; 5.635.483; 5.599.902; 5.554.725; 5.530.097; 5.521.284; 5.504.191; 5.410.024; 5.138.036; 5.076.973; 4.986.988; 4.978.744; 4.879.278; 4.816.444; y 4.486.414,

[0505] En realizaciones espedficas, el agente citotoxico es un agente de union al surco menor del ADN. (Vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 6.130.237). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el agente de union al surco menor es un compuesto de CBI. En otras realizaciones, el agente de union al surco menor es un enedino (por ejemplo, caliqueamicina). Los ejemplos de agentes anti-tubulina incluyen, pero no se limitan a, taxanos (por ejemplo, Taxo1.RTM. (Paclitaxel), Taxotero.RTM. (Docetaxel)), T67 (Tularik), alquiloides de la vinca (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vindesina). y vinorelbina) y dolastatina (por ejemplo, auristatina E, AFP, MMAF, ^mM^aE, AEB, AEVB). Otros agentes antitubulina incluyen, por ejemplo, derivados de baccatina, analogos de taxano (por ejemplo, epotilona A y B), nocodazol, colchicina y colcimid, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, combretastatina, discodermolida y eleuterobina.

[0506] En algunas realizaciones, el agente citotoxico es un maitansinoide, otro grupo de agentes anti-tubulina. Por ejemplo, en realizaciones espedficas, el maitansinoide es maitansina o DM-1 (ImmunoGen, Inc.; vease tambien Chari et al., 1992, Cancer Res. 52: 127-131). En algunas realizaciones, el agente terapeutico no es un radioisotopo. En algunas realizaciones, el agente terapeutico no es ricina o saporina. En ciertas realizaciones, el agente terapeutico es un agente anti-VEGF, tal como AVASTIN (bevacizumab) o NEXAVAR (Sorafenib); un bloqueador de PDGF, como SUTENT (malato de sunitinib); o un inhibidor de la quinasa, como NEXAVAR (sorafenib tosylateor), en algunas realizaciones, el agente citotoxico o inmunomodulador es un antimetabolito. El antimetabolito puede ser, por ejemplo, un antagonista de la purina (p. ej., azotioprina o mofetilo de micofenolato), un inhibidor de dihidrofolato de reductasa (p. ej., metotrexato), aciclovir, gangciclovir, zidovudina, vidarabina, ribavarina, azidotimidina, arabinosido de citidina, amantadina, dideoxiuridina, yododeoxiuridina, poscarnet, o trifluridina.

[0507] En otras formas de realizacion, el agente citotoxico es aldesleucina, alemtuzumab, alitretinoma, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozol, trioxido de arsenico, bexaroteno, bexaroteno, calusterona, capecitabina, celecoxib, cladribina, Darbepoetina alfa, Denileucina diftitox, dexrazoxano, propionato de dromostanolona, epirubicina, epoyetina alfa, estramustina, exemestano, filgrastim, floxuridina, fludarabina, fulvestrant, gemcitabina, gemtuzumab ozogamicina, goserelina, idarubicina, ifosfamida, imatinib mesilato, Interferon alfa-2a, irinotecano, letrozol, leucovorina, levamisol, mecloretamina o mostaza de nitrogeno, megestrol, mesna, metotrexato, metoxsaleno, mitomicina C, mitotano, fenpropionato de nandrolona, oprelvecina, oxaliplatino, pamidronato, pegadamasa, pegaspargasa, pegfilgrastim, pentostatino, pipobromano, plicamicina, sodio de porffmero, procarbazina, quinacrino, rasburicasa, sargramostim, estreptozocina, tamoxifeno, temozolomida, teniposido, testolactona, tioguanina, toremifeno, tositumomab, trastuzumab, tretinoina, mostaza de uracilo, valrubicina, vinblastina, vincristina, vinorelbina o zoledronato.

[0508] En realizaciones adicionales, el agente terapeutico es un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal antiHER2 humanizado, RITUXAN (rituximab; Genentech; un anticuerpo monoclonal quimerico anti CD20); OVAREX (AltaRex Corporation, MA); PAⁿO^rEX (Glaxo Wellcome, NC; un anticuerpo IgG2a murino); Cetuximab Erbitux (Imclone Systems Inc., NY; un anticuerpo quimerico anti-EGFR IgG); Vitaxin (MedImmune, Inc., MD; Campath I/H (Leukosite, MA; un anticuerpo IgG1 humanizado); Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA; un anticuerpo IgG anti-CD33 humanizado); LymphoCide (Inmunomica, Inc., NJ; un anticuerpo IgG anti-CD22 humanizado); Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA; un anticuerpo anti-HLA-DR humanizado); Oncolym (Techniclone, Inc., CA; un anticuerpo murino radiomarcado anti-HLA-DrIO); Allomune (BioTrans- plant, CA; un mAb anti-CD2 humanizado); Avastin (Genentech, Inc., CA; un anticuerpo humanizado anti-VEGF); Epratuzamab (Immunomedics, Inc., NJ y Amgen, CA; un anticuerpo anti-CD22); CEAcide (Immunomedics, NJ; un anticuerpo anti-CEA humanizado); o un anticuerpo anti-CD40 (por ejemplo, como se describe en la Patente de EE.UU. N° 6.838.261).

[0509] Otros anticuerpos adecuados incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos contra los siguientes antfgenos: CA125, CA15-3, CA19-9, L6, Lewis Y, Lewis .lamda. fetoprotema alfa, CA 242, fosfatasa alcalina placentaria, antigeno de membrana espedfico de la prostata, fosfatasa acida prostatica, factor de crecimiento epidermico, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, receptor anti-transferrina, p97. MUC1-KLH, CEA, gp100, MARTI, antigeno prostatico espedfico, receptor IL-2, CD20, CD52, CD30, CD33, CD22, gonadotropina corionica humana, CD38, CD40, mucina, P²I, MPG y producto de Oncogene Neu.

[0510] En algunas realizaciones, el agente terapeutico es un agente inmunomodulador. El agente inmunomodulador puede ser, por ejemplo, ganciclovir, etanercept, tacrolimus, ciclosporina, rapamicina, REVLIMID (lenalidomida), ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato, y, alternativamente, el agente inmunomodulador puede ser, por ejemplo, un glucocorticoide (por ejemplo, cortisol o aldosterona) o un analogo de glucocorticoide (por ejemplo, prednisona o dexametasona).

[0511] En algunas realizaciones tfpicas, el agente inmunomodulador es un agente antiinflamatorio, tal como derivados arilcarboxflicos, derivados que contienen pirazol, derivados de oxicam y derivados de acido nicotmico. Las clases de agentes antiinflamatorios incluyen, por ejemplo, los inhibidores de la ciclooxigenasa, los inhibidores de la 5-lipoxigenasa y los antagonistas de los receptores de leucotrienos. En algunas realizaciones, el agente inmodulador es una citoquina, tal como G-CSF, GM-CSF o IL-2, Los inhibidores de la ciclooxigenasa adecuados incluyen acido meclofenamico, acido mefenamico, carprofeno, diclofenaco, diflunisal, fenbufeno, fenofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, nabumetona, naproxeno, sulindac, tenoxicam, tolmetina y acido acetilsalidlico.

[0512] Los inhibidores de la lipoxigenasa adecuados incluyen inhibidores de la redox (por ejemplo, derivados de catecol butano, acido nordihidroguaiaretico (NDGA), masoprocol, fenidona, Ianopalen, indazolinonas, nafazatrom, benzofuranol, alquilhidroxilamina) y inhibidores no-redox (por ejemplo, hidroxitiazoles, metoxialquiltiazoles, benzopiranos y derivados de los mismos, metoxitetrahidropirano, acidos boswellicos y derivados acetilados de acidos boswellicos, y acidos quinolinemetoxifenilaceticos sustituidos con radicales cicloalquilo y precursores de inhibidores redox.

[0513] Otros inhibidores adecuados de la lipoxigenasa incluyen antioxidantes (por ejemplo, fenoles, galato de propilo, flavonoides y/o sustratos naturales que contienen flavonoides, derivados hidroxilados de las flavonas, flavonol, dihidroquercetina, luteolina, galangin, orobol, derivados de calcona, 4,2',4'-trihidroxicalcona, ortoaminofenoles, N-hidroxiureas, benzofuranoles, ebseleno y especies que aumentan la actividad de las selenoenzimas reductoras), agentes quelantes de hierro (por ejemplo, acidos hidroxamicos y derivados de los mismos, N-hidroxiureas, 2-bencilo-1-naftol, catecoles, hidroxilaminas, carnosol trolox C, catecol, naftol, sulfasalazina, zyleuton, acido 5-hidroxianranfflico y compuestos de 4-(omega-arilalquilo)fenilalcanoicos, compuestos que contienen acido imidazol (por ejemplo, cetoconazol y itraconazol), fenotiazinas y derivados del benzopirano.

[0514] Otros inhibidores de la lipoxigenasa adecuados incluyen inhibidores de eicosanoides (por ejemplo, acidos octadecatetraenoico, eicosatetraenoico, docosapentaenoico, eicosahexaenoico y docosahexaenoico y esteres de los mismos, PGE1 (prostaglandina E1), PGA2 (prostaglandina A2), viprostol, acidos 15-monohidroxieicosatetraenoico, 15-monohidroxi-eicosatrienoico y 15-monohidroxieicosapentaenoico, y leucotrienos B5, C5 y D5), compuestos que interfieren con los flujos de calcio, fenotiazinas, difenilbutilaminas, verapamilo, fuscosido, curcumina, acido clorogenico, acido cafeico, acido 5,8,11,14 eicosatetrayenoico (ETYA), hidroxifenilretinamida, ionapaleno, esculina, dietilcarbamazina, fenantrolina, baicalema, proxicromilo, tioeteres, sulfuro de dialilo y sulfuro de di-(1-propenilo).

[0515] Los antagonistas de los receptores de leucotrienos incluyen calcitriol, ontazolast, Bayer Bay-x-1005, Ciba-Geigy CGS-25019C, ebseleno, Leo Denmark ETH-615, Lilly LY-293111, Ono ONO-4057. Terke TMK-688, Boehringer Ingleheim BI-RM-270, Lilly LY 213024, Lilly LY 264086, Lilly LY 292728, Ono ONO LB457. Pfizer 105696, Perdue Frederick PF 10042, Rhone-Poulenc Rorer R^p 66153, SmithKline Beecham SB-201146, SmithKline Beecham SB-201993, SmithKline Bee-cham SB-209247. Searle SC-53228, Sumitamo SM 15178, American Home Products Way 121006, Bayer Bay-o-8276, Warner-Lambert CI-987. Warner-Lambert CI-987BPC-15LY 223982, Lilly LY 233569, Lilly LY-255283, MacroNex MNX-160, Merck y Co. MK-591, Merck y Co. MK-886, Ono ONO-LB-448, Purdue Frederick PF-5901, Rhone-Poulenc Rorer RG 14893, Rhone-Poulenc Rorer RP 66364, Rhone-Poulenc

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que comprende la Formula (VIII) o (IX), en donde el compuesto es un anticuerpo aCD70 conjugado con una dolastatina, en donde la conjugacion ocurre a traves de un aminoacido no codificado naturalmente en el anticuerpo, en donde la Formula (VIII) y (IX) corresponden a:

en donde:

A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heteroalquileno, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido;

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heterocalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o sustituidos)alquileno)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)^k- donde k es 1, 2 o 3, -S(0)^k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN (R)”)-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R>N=N-, y -C(R')²-N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo anti-CD70 (aCD70),

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 1, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 1 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural, o

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 10, en donde el aminoacido 122 de la SEQ ID NO. 10 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; o

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 17, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 17 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural;

R³y R⁴son cada uno independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o R³y R⁴o dos grupos R³forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo;

Z tiene la estructura de:

R⁵es H, COR8, alquilo C¹-C⁶o tiazol;

R8 es OH;

R6 es OH o H;

Ar es fenilo o piridina;

R⁷es alquilo C¹-C⁶o hidrogeno;

L es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en -alquileno-, -alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-(CH²)n-NHC(O)-(CH²)n-C(Me)²-S- S-(CH²)n-NHC(O)-(alquileno-O)n"-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W-, -alquileno-C(O)-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(O)-, y-(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-;

W tiene la estructura de:

U tiene la estructura de:

y

cada n, n', n”, n'” y n”” son independientemente enteros mayores o iguales a uno; en donde alquilo inferior significa un grupo alquilo con ocho o menos atomos de carbono; en donde alquileno inferior significa un grupo alquileno que tiene ocho o menos atomos de carbono;

o un solvato farmaceuticamente aceptable del mismo.

2. El compuesto de la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo aCD70 comprende uno o mas aminoacidos no codificados de forma natural.

3. El compuesto de la reivindicacion 2, en el que el anticuerpo aCD70 comprende al menos uno y no mas de diez aminoacidos no codificados de forma natural.

4. Un compuesto, o sal del mismo, que comprende la Formula (X), (XI), (XII) o (XIII), en donde el compuesto es un anticuerpo aCD70 conjugado a una dolastatina, en donde la conjugacion ocurre a traves de un aminoacido no codificado de forma natural en el anticuerpo en el que las formulas (X), (XI), (XII) y (XIII) corresponden a:

en donde:

A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno inferior, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno sustituido, arileno, arileno sustituido, arileno heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido;

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heterocalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o sustituidos)alquileno)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)^k- donde k es 1, 2 o 3, -S(0)^k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)KN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN (R)”)-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')²-N=N-, y -C(R')²-N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo aCD70,

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 1, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 1 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural, o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 10, en donde el aminoacido 122 de la SEQ ID NO. 10 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 17, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 17 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural;

R³y R⁴son cada uno independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o R³y R⁴o dos grupos R³forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo;

Z tiene la estructura de:

R⁵es H, CO²H, alquilo C¹-C⁶o tiazol;

R6 es OH o H;

Ar es fenilo o piridina;

R⁷es alquilo C¹-C⁶o hidrogeno;

L¹, L², L³y L⁴son, cada uno, enlazadores seleccionados independientemente del grupo que consiste en un enlace, alquileno, -alquileno-O)n-alquileno-J-, alquileno'-J-(alquileno-O)n-alquileno-, -J-(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-(alquileno-O)n-alquileno-J'-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno'-, -W-, -alquileno-W-, alquileno'- J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J-alquileno-NMe-alquileno'-NMealquileno'-W-, y -alquileno-J-alquileno'-NMe-alquileno'-NMe-alquileno”'-W-;

W tiene la estructura de:

cada J y J' tienen independientemente la estructura de:

y

cada n yn' son independientemente enteros mayores o iguales a uno;

en donde alquilo inferior significa un grupo alquilo con ocho o menos atomos de carbono;

en donde alquileno inferior significa un grupo alquileno que tiene ocho o menos atomos de carbono.

5. Un metodo para derivatizar un analogo de dolastatina que comprende la Formula (I), (III), (IV), (V) o (VI), en donde el analogo de dolastatina derivatizado es un anticuerpo aCD70 conjugado con una dolastatina, en donde ocurre la conjugacion a traves de un aminoacido no codificado de forma natural en el anticuerpo, en donde el metodo comprende poner en contacto el analogo de dolastatina con un reactivo de Formula (XXXVII),

en donde las formulas (I), (III), (IV), (V) o (VI) corresponden a:

en donde:

Z tiene la estructura de:

R⁵es H, COR8, alquilo C¹-C⁶o tiazol;

R8 es OH o -NH-(alquileno-O)n-NH²;

R6 es OH o H;

Ar es fenilo o piridina;

R⁷es alquilo C¹-C⁶o hidrogeno;

Y es NH²-O- y V es NH²-O-;

L, L¹, L², L³y L⁴son cada uno de los enlazadores seleccionados del grupo que consiste en un enlace, -alquileno-, -alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno- O)n-alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-(CH²)n-NHC(O)-(CH²)n-C(Me)²-S- S-(CH²)n""-NHC(O)-(alquileno-O)n""-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W -, alquileno-C(O)-W-, -(alquileno-O))n-alquileno-J-, alquileno'-J-(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno', -J-(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-(alquileno-O)n-alquileno-J'-, -W-, alquileno-W-, alquileno'-J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, y J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-alquileno U-alquileno-; -J-alquileno-NMe-alquileno'-NMe-alquileno'-W-, y -alquileno-J-alquileno'-NMe-alquileno'-NMe-alquileno”'-W-;

W tiene la estructura de:

U tiene la estructura de:

cada J y J' independientemente tienen la estructura de:

o L esta ausente, Y es metilo, R⁵es COR8 y R8 es -NH-(alquileno-O)n-NH²; y cada n, n', n”, n'” y n”” son independientemente enteros mayores o iguales a uno;

en donde Formula (XXXVII) corresponde a:

en donde:

A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido;

B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, - S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- donde k es 1, 2 o 3, -S(0)k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(0)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R'))-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')²-N=N -, y -C(R>N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;

K es

R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido;

Ri y/o R²es un anticuerpo aCD70,

en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 1, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 1 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural, o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 10, en donde el aminoacido 122 de la SEQ ID NO. 10 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; o en donde el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada variable de SEQ ID NO. 17, en donde el aminoacido 119 de la SEQ ID NO. 17 esta sustituido con el aminoacido no codificado de forma natural; y R³y R⁴son cada uno independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o R³y R⁴o dos grupos R³forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo;

en donde alquilo inferior significa un grupo alquilo con ocho o menos atomos de carbono;

en donde alquileno inferior significa un grupo alquileno que tiene ocho o menos atomos de carbono.

⁶. El metodo de la reivindicacion 5, en el que el analogo de dolastatina derivado comprende al menos un aminoacido que contiene oxima que tiene la estructura de Formula (VIII), (IX), (X), (XI), (XII) o (XIII):

7. Metodo segun la reivindicacion 5, en el que el analogo de dolastatina se pone en contacto con el reactivo de formula (XXXVII) en solucion acuosa en condiciones ligeramente acidas.

⁸. Un compuesto de la reivindicacion 1 o 4, en el que el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada de SEQ ID. NO: 1 y una cadena ligera de SEQ ID. NO: 2,

9. Un compuesto de la reivindicacion 1, 4 u ⁸, en el que el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada de SEQ ID. NO: 1, una cadena ligera de SEQ ID. NO: 2 y una region constante que comprende SEQ ID. NO. 3, 10. Un compuesto de la reivindicacion 1 o 4 en el que el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada de SEQ ID. NO: 10 y una cadena ligera de SEQ ID. NO: 11,

11. Un compuesto de la reivindicacion 1, 4 o 10, en el que el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada de SEQ ID. NO: 10, una cadena ligera de SEQ ID. NO: 11 y una region constante que comprende SEQ ID. NO. 3, 12. Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 4 y un portador, excipiente o aglutinante farmaceuticamente aceptables.