CN115708810A

CN115708810A - 含有抗cd70-药物偶联物的冻干组合物、冻干制剂及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN115708810A
Application number: CN202211369670.1A
Authority: CN
Inventors: 肖礼海; 陈佳丽; 张凤霞; 万烁烁; 王谦; 郭箭
Original assignee: Zhejiang New Code Biomedical Co ltd
Current assignee: Zhejiang New Code Biomedical Co ltd
Priority date: 2022-11-03
Filing date: 2022-11-03
Publication date: 2023-02-24
Also published as: CN117643577A

Abstract

本发明提供了一种含有抗CD70‑药物偶联物的冻干组合物，其包括ARX305以及药学上可接受的缓冲液、表面活性剂和冻干保护剂，其中，所述冻干组合物的pH值为5.5～6.0。本发明还提供了一种含有抗CD70‑药物偶联物的冻干制剂及其制备方法。本发明还提供了所述冻干组合物和冻干制剂的用途。本发明提供的冻干组合物和冻干制剂具有优异的产品性能，能够用于治疗多种癌症，而且制备方法简便，可操作性强，生产效率高，具有十分重要的经济和社会价值。

Description

含有抗CD70-药物偶联物的冻干组合物、冻干制剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种含有抗CD70-药物偶联物的冻干组合物、由所述冻干组合物制得的冻干制剂及其制备方法和用途。

背景技术

CD70是一种II型跨膜蛋白，是由193个氨基酸组成的三聚体，包括胞外结合区、跨膜区、短的胞内序列及两个N末端糖基化序列，是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员之一。CD70与其受体CD27在调控T细胞和B细胞活化、增殖及分化能力、维持机体免疫应答过程中起着重要作用。CD70蛋白表达和CD70基因扩增与临床预后不佳有关，研究显示，CD70在血液瘤和实体瘤中都有一定的表达，不同癌种CD70的阳性率存在差异。目前CD70已经成为抗肿瘤药物的潜在靶点之一，有多项CD70靶向药物在临床试验阶段。对于CD70阳性肿瘤患者，CD70靶向药物的治疗有望提高其生活质量、延长其生存时间。

抗体偶联药物(Antibody-Drug Conjugate，ADC)是一类由单克隆抗体通过连接子与细胞毒类小分子药物连接而成的抗肿瘤药物，兼具单抗药物高度的靶向性和小分子药物强大的杀伤力，因此疗效更好、副作用更小，是癌症治疗的热门领域。与普通生物制品相比，ADC结构更复杂，不稳定因素更多：首先，偶联的细胞毒类小分子药物在长期储存中可能发生小分子药物掉落，从而导致药物抗体比例下降以及游离小分子含量升高；其次，ADC中的裸抗部分可能发生聚集、沉淀或吸附等物理降解，还可能发生脱酰胺、氧化、水解、电荷异质性变化以及碎片化等化学降解；再次，小分子药物通常是疏水的，ADC作为整体可能比未偶联单抗更加易于聚集，形成微粒和表面吸附。因此，为提供在贮藏和运输过程中稳定的ADC药物，必须谨慎选择药物制剂的剂型、载体、pH值、缓冲体系、赋形剂和/或稳定剂、制备工艺等等。

重组人源化抗CD70单抗-AS269偶联物(ARX305)是新一代的单克隆抗体偶联药物，用于治疗CD70表达的晚期肿瘤，其结构式如图1所示，其中，使用密码子扩展技术将抗CD70单体的重链第119位氨基酸突变为对乙酰苯丙氨酸残基，然后与含有羟胺基团的小分子毒素发生肟化反应，定点偶联得到主要药抗比为1：2的偶联物(中国专利CN 104619351B对此有详细描述)。

对于ARX305而言，目前尚未有其制剂相关的技术被报道。

发明内容

为弥补现有技术中ARX305制剂相关领域的空白，本发明的一个目的是提供一种含有抗CD70-药物偶联物的冻干组合物，其具有非常优异的稳定性。

本发明的另一个目的是提供一种含有抗CD70-药物偶联物的冻干制剂及其制备方法。

本发明的还一个目的是提供所述冻干组合物以及所述冻干制剂的用途。

本发明提供的含有抗CD70-药物偶联物的冻干组合物包括：ARX305以及药学上可接受的缓冲液、表面活性剂和冻干保护剂，其中，所述冻干组合物的pH值为5.5～6.0。

通过不同pH值下的稳定性考察，本发明的发明人发现，pH值较低的情况下抗体偶联物易发生小分子药物AS269的掉落，而pH值较高的情况下则更容易发生CEX主峰下降、酸性峰和碱性峰增长。在5.5～6.0的pH值范围内，所得的冻干组合物能够达到最佳的稳定性。所述冻干组合物的pH值包括但不限于约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9或约6.0。在一些优选的实施方式中，所述冻干组合物的pH值为5.6～5.8，例如，pH值为5.7。

本发明所述的药学上可接受的缓冲液、表面活性剂、冻干保护剂可以为药学领域常见的种类，尤其是ADC制剂中常用的种类。在一些优选的实施方式中，所述缓冲液包括但不限于组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液等；所述表面活性剂包括但不限于聚山梨酯20、聚山梨酯80等；所述冻干保护剂包括但不限于蔗糖、海藻糖等。

在一些优选的实施方式中，所述的冻干组合物包括10～20mg/ml的ARX305、15～25mM的缓冲液(缓冲盐浓度总和)、0.2～0.6mg/ml的表面活性剂以及60～100mg/ml的冻干保护剂。此时，所述冻干组合物的pH值为5.5～6.0，优选为5.6～5.8，例如5.7。

在一些更优选的实施方式中，所述冻干组合物包括10～20mg/ml的ARX305、15～25mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、0.2～0.6mg/ml的聚山梨酯80以及60～100mg/ml的海藻糖。此时，所述冻干组合物的pH值为5.5～6.0，优选为5.6～5.8，例如5.7。

在一些进一步优选的实施方式中，所述冻干组合物包括以下组合物1)-6)中的任一种：

组合物1)：10mg/ml的ARX305、20mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、0.2mg/ml的聚山梨酯80以及80mg/ml的海藻糖；

组合物2)：10mg/ml的ARX305、20mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、0.4mg/ml的聚山梨酯80以及80mg/ml的海藻糖；

组合物3)：10mg/ml的ARX305、20mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、0.6mg/ml的聚山梨酯80以及80mg/ml的海藻糖；

组合物4)：20mg/ml的ARX305、20mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、0.2mg/ml的聚山梨酯80以及80mg/ml的海藻糖；

组合物5)：20mg/ml的ARX305、20mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、0.4mg/ml的聚山梨酯80以及80mg/ml的海藻糖；以及

组合物6)：20mg/ml的ARX305、20mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、0.6mg/ml的聚山梨酯80以及80mg/ml的海藻糖。

本发明还提供了一种含有抗CD70-药物偶联物的冻干制剂，其由上述技术方案任一项所述的冻干组合物制得。

本发明还提供了所述含有抗CD70-药物偶联物的冻干制剂的制备方法，由上述技术方案任一项所述的冻干组合物依次经过预冷冻、一次升华干燥和二次升华干燥制得，其中，所述预冷冻过程中进行退火处理，退火温度下所述冻干组合物的电导率为预冷冻温度下所述冻干组合物的电导率的10～30％(包括但不限于约10％、约12％、约15％、约18％、约20％、约22％、约25％、约28％或约30％)。

本发明的发明人发现，在预冷冻过程中，电导率能够反映出冻干组合物的结冰状态，通常，溶液状态下电导率基本为0％，完全结冰后电导率则接近100％，如图3所示。在不同的退火温度下，会发生不同程度的冰晶融化，从而发生电导率不同程度的下降，退火温度较低时，冰晶融化较少，此时电导率下降程度较小，反之退火温度较高时，冰晶融化较多，电导率下降程度则变大。本发明提供的制备方法通过控制冰晶融化的程度(反映为电导率的变化程度)，可以控制并改善冰晶的微观形貌，在其中形成疏松孔道，不仅能够提高后续升华干燥的效率，还能够显著改善所得冻干制剂产品的外观、复溶效果、水分含量等性质，并且还能够大幅提高成品收率。

在一些优选的实施方式中，所述预冷冻温度为-50～-40℃，预冷冻时间为5～12h。此时，退火温度可以根据预冷冻温度结合前述电导率的变化限定来相应得出(例如为-3～-10℃)，退火处理的时间为2～6h。例如，预冷冻温度为-45℃时，退火温度可以为-5～-9℃。

在一些更优选的实施方式中，所述预冷冻包括以下过程：将所述冻干组合物(例如在0.5～1.5h内)降温至3～8℃并保温0.5～1.5h，(例如在20～50min内)再降温至-50～-40℃并保温1～3h，然后在退火温度(例如在20～50min内升温至退火温度)下退火处理2～6h，(例如在20～50min内)再次降温至-50～-40℃继续保温3～8h。

在一些进一步优选的实施方式中，所述预冷冻包括以下过程：将所述冻干组合物(例如在0.5～1.5h内)降温至4～6℃并保温0.8～1.2h，(例如在20～50min内)再降温至-47～-43℃并保温1.8～2.5h，然后在-5～-9℃下(例如在20～50min内升温至此温度)退火处理2.5～3.5h，(例如在20～50min内)再次降温至-47～-43℃继续保温4～6h。例如，所述预冷冻包括以下过程：将所述冻干组合物降温至5℃并保温1h，再降温至-45℃并保温2h，然后在-5～-9℃退火处理3h，再次降温至-45℃继续保温5h。

在一些优选的实施方式中，所述一次升华干燥的升温温度为-23～-18℃，真空度为10～15Pa，保温时间为30～50h。在一些更优选的实施方式中，所述一次升华干燥包括以下过程：将所述冻干组合物经预冷冻后的所得物在3～6h内升温至-23～-18℃(优选-20℃)，在此温度下以及10～15Pa(优选13Pa)的真空度下保温30～50h(优选40h)。

在一些优选的实施方式中，所述二次升华干燥的升温温度为35～40℃，真空度为10～15Pa，保温时间为10～18h。在一些更优选的实施方式中，所述二次升华干燥包括以下过程：将所述冻干组合物经预冷冻、一次升华干燥后的所得物在3～6h内升温至35～40℃(优选37℃)，在此温度下以及10～15Pa(优选13Pa)的真空度下保温10～18h(优选12h)。

本发明还提供了上述技术方案任一项所述的冻干组合物或上述技术方案任一项所述的冻干制剂在制备治疗癌症的药物中的用途。

本发明所述的用途中，所述癌症包括常见的实体瘤和血液瘤，包括但不限于肾癌(尤其是晚期肾癌)、鼻咽癌、卵巢癌、脑胶质瘤、肝细胞癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、胆道癌、复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤、复发/难治性滤泡淋巴瘤、复发/难治性霍奇金淋巴瘤、复发/难治性急性髓系白血病等。

本发明提供的技术方案具有以下优点：

本发明提供的冻干组合物针对新型的ADC药物ARX305而设计，通过特定的pH值、组合物配方等设置，能够有效减少小分子药物的掉落以及CEX主峰的下降，所得的冻干产品具有非常优异的稳定性，能够长期、稳定储存。

本发明提供的冻干制剂在制备过程中采用了通过电导率控制的退火工艺，得到的冻干制剂产品不仅外观优良、水分含量低，复溶效果好(复溶时间短、复溶后溶液澄清)，而且成品收率高，极大降低了生产成本、提高了生产效率。

总之，本发明提供的冻干组合物和冻干制剂具有优异的产品性能，能够用于治疗多种癌症，而且制备方法简便，可操作性强，生产效率高，因此具有十分重要的经济和社会价值。

附图说明

图1为ADC药物ARX305的结构示意图，其中一个抗体蛋白偶联两个小分子化合物。

图2为实施例3中不同工艺下制备的冻干制剂样品的典型外观图(左侧：外观完好；右侧：表面起皮/底部萎缩)。

图3为实施例3中的工艺-13在预冷冻阶段的冻干曲线图(箭头所指为电导率曲线)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。

实施例中的所使用的ARX305(抗CD70-ADC)和ADC参比品(RS)来源于浙江新码生物医药有限公司，其他试剂或原料如无特别说明均为市售产品。

实施例中的所使用的检测项目和检测条件如下：

外观：澄明度检测仪下目测。

蛋白浓度：Cary 100紫外可见分光光度计检测。

pH值：Mettler

Micro Pro pH计检测。

水分：Mettler Toledo C30D Karl Fischer水分测定仪检测。

浊度：Nano Drop 2000检测UV340nm下的吸收。

阳离子交换色谱CEX-HPLC：

采用Agilent 1260HPLC仪器测定样品中酸性峰、主峰及碱性峰并采用面积归一化法计算各自的百分含量，色谱条件如下：

AS269(小分子毒素)残留量：

采用HPLC检测样品中AS269残留量，色谱条件如下：

实施例1不同pH值下的稳定性研究

设计不同pH值的制剂配方1-10(见表1)。

表1不同pH值的制剂配方

制剂样品配制如下：

(1)按照表1所示的组成分别配制缓冲液，必要时采用盐酸或氢氧化钠调节至目标pH值；

(2)采用缓冲液分别配制辅料浓溶液，其中的聚山梨酯80和蔗糖浓度分别为14mg/ml(目标浓度的70倍)和800mg/ml(目标浓度的10倍)；

(3)取10份ADC溶液，加入到预先处理过的超滤离心管(型号：30k,15ml)中，离心20min，分别加入缓冲液后离心20min进行换液，重复换液浓缩操作四次，分别得到含有目标缓冲液的ADC浓缩溶液(浓度约为20mg/ml)；

(4)测定换液浓缩后ADC溶液的蛋白浓度，按计算值加入相应量的辅料浓溶液，采用缓冲液定容至目标体积；

(5)所得样品通过0.22μm无菌过滤器过滤、分装(6ml)后加塞、轧盖。

稳定性考察：

将样品放置25℃条件下进行考察共2个月。考察结果如表2所示，其中，T0表示样品开始放置时的时间点，25℃-1M表示样品放置一个月时的时间点，25℃-2M表示样品放置两个月时的时间点。

表2不同pH值下制剂配方稳定性考察结果汇总

结果分析：

由AS269残留结果可知，pH值＜5.5的配方在25℃条件下考察，均观察到AS269残留增长趋势，pH越低AS269残留越高，说明在pH值小于5.5条件下容易发生小分子掉落。

由CEX结果可知，在pH值＞6.0条件下更容易发生CEX主峰下降、酸性峰和碱性峰增长。

由此可见，冻干组合物的pH值对于产品稳定性至关重要，本发明的冻干组合物的pH值优选在5.5～6.0之间，更优选在5.7左右。

实施例2不同的ADC浓度和聚山梨酯80(PS80)浓度下的配方稳定性研究

将ADC浓度设置10mg/ml和20mg/ml两个梯度，聚山梨酯80浓度设置0.2mg/ml、0.4mg/ml和0.6mg/ml三个梯度，组合成6个配方(表3)。将制备的样品置25℃条件下300rpm振摇1天和3天、反复冻融(-80℃冷冻6h，然后25℃融化2h)3轮和5轮后分别取样检测。检测结果(表4)表明，配方11-16的样品振摇、冻融前后各项指标均无明显变化，因此，在pH值约为5.7的条件下，蛋白浓度为10-20mg/ml、聚山梨酯80浓度为0.2-0.6mg/ml范围内，蛋白稳定性均较好。

表3ADC浓度及PS80浓度筛选的制剂配方汇总

表4ADC浓度及PS80浓度筛选稳定性考察结果

实施例3冻干工艺研究

1.平台冻干工艺考察及优化

如实施例2所示，抗CD70-ADC浓度为10-20mg/ml、PS80浓度为0.2-0.6mg/ml范围内，配方稳定性均较好，鉴于低浓度PS80已达到较好的稳定效果，且较低浓度蛋白具有的稳定性风险较低，因此ADC浓度及PS80浓度分别确定为10mg/ml和0.2mg/ml，用于冻干工艺研究。

使用配方11，即10mg/ml的抗CD70-ADC(ARX305)、20mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、80mg/ml的蔗糖以及0.2mg/ml的聚山梨酯80，考察冻干工艺(冻干机板层面积均为0.1m²，每次冻干放置20支ADC制剂，每支6ml，其余以安慰剂填充板层，冻干机为德国ChristALPHA 2-4 LSC冷冻干燥机)。

由表5可见，采用平台工艺(工艺-1)冻干，样品出现一定比例表面起皮/底部萎缩、塌陷、回熔等缺陷(如图2右侧所示)，同时复溶效果不佳(复溶时间较长、复溶后溶液浊度值较高)。通过对一次干燥板层温度和真空度进行优化(工艺-2至工艺-9)，冻干效果未得到明显改善。

表5平台冻干工艺考察及优化结果汇总

2.退火工艺优化

使用配方11，即10mg/ml的抗CD70-ADC(ARX305)、20mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、80mg/ml的蔗糖以及0.2mg/ml的聚山梨酯80，采用不同退火温度进行冻干，考察退火阶段样品电导率与冻干效果的关系。

在样品中插入电导探头，由程序自动记录并计算得出退火阶段样品的电导率。由表6可知，在退火温度高于-5℃时，电导率小于10％，冰晶融化较多，相对于不采用退火工艺的工艺-7而言，冻干效果(包括水分、复溶效果)未得到明显改善；在退火温度低于-9℃时，电导率大于30％，冰晶融化不足，同样无法达到退火效果。而当退火温度在-5℃至-9℃的范围内时(电导率介于12％-22％之间)，冻干效果则取得了明显的改善，产品外观得到了大幅改善(工艺-12～工艺-14制备的产品外观如图2左侧所示，外观完好，无起皮、萎缩等缺陷)，水分含量明显下降，复溶时间由原来的3-6分钟大幅缩短至50秒、甚至40秒以内，而且复溶后的浊度也显著下降。

表6退火工艺优化结果汇总

3.工艺放大

将优化的工艺-13在不同板层面积的冻干机上进行放大。由表7结果可知，工艺-13放大效果好，在不同型号冻干机上均可以得到收率较高的合格样品，工艺稳健性好。

表7工艺-13放大结果

除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。

本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。

Claims

1.一种含有抗CD70-药物偶联物的冻干组合物，其特征在于，所述冻干组合物包括ARX305以及药学上可接受的缓冲液、表面活性剂和冻干保护剂，其中，所述冻干组合物的pH值为5.5～6.0。

2.根据权利要求1所述的冻干组合物，其特征在于，所述缓冲液选自组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中的一种或多种；和/或

所述表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80中的一种或两种；和/或

所述冻干保护剂选自蔗糖、海藻糖中的一种或两种。

3.根据权利要求1或2所述的冻干组合物，其特征在于，所述冻干组合物包括10～20mg/ml的ARX305、15～25mM的缓冲液、0.2～0.6mg/ml的表面活性剂以及60～100mg/ml的冻干保护剂；

优选地，所述冻干组合物包括10～20mg/ml的ARX305、15～25mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、0.2～0.6mg/ml的聚山梨酯80以及60～100mg/ml的海藻糖；

更优选地，所述冻干组合物的pH值为5.7。

4.根据权利要求1-3任一项所述的冻干组合物，其特征在于，所述冻干组合物包括以下组合物1)-6)中的任一种：

5.一种含有抗CD70-药物偶联物的冻干制剂，其特征在于，由权利要求1-4任一项所述的冻干组合物制得。

6.权利要求5所述的含有抗CD70-药物偶联物的冻干制剂的制备方法，其特征在于，由所述冻干组合物依次经过预冷冻、一次升华干燥和二次升华干燥制得，其中，所述预冷冻过程中进行退火处理，退火温度下所述冻干组合物的电导率为预冷冻温度下所述冻干组合物的电导率的10～30％。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述预冷冻温度为-50～-40℃，预冷冻时间为5～12h；和/或

所述退火处理的时间为2～6h；

优选地，所述预冷冻包括以下过程：将所述冻干组合物降温至3～8℃并保温0.5～1.5h，再降温至-50～-40℃并保温1～3h，然后在退火温度下退火处理2～6h，再次降温至-50～-40℃继续保温3～8h。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述一次升华干燥的升温温度为-23～-18℃，真空度为10～15Pa，保温时间为30～50h。

9.根据权利要求6-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述二次升华干燥的升温温度为35～40℃，真空度为10～15Pa，保温时间为10～18h。

10.权利要求1-4任一项所述的冻干组合物或权利要求5所述的冻干制剂在制备治疗癌症的药物中的用途；优选地，所述癌症为肾癌(尤其是晚期肾癌)、鼻咽癌、卵巢癌、脑胶质瘤、肝细胞癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、胆道癌、复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤、复发/难治性滤泡淋巴瘤、复发/难治性霍奇金淋巴瘤、或复发/难治性急性髓系白血病。