CN111417385A

CN111417385A - 减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法

Info

Publication number: CN111417385A
Application number: CN201880073692.9A
Authority: CN
Inventors: M·巴滕斯; J·I·马斯安特
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2017-11-15
Filing date: 2018-11-13
Publication date: 2020-07-14
Also published as: EA202091007A1; GB201718888D0; BR112020009096A2; JP2021502990A; EP3709977A1; CA3081645A1; US20200390705A1; WO2019096776A1

Abstract

本发明涉及糖和一种或多种氨基酸的组合在减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间中的用途。

Description

减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法

发明领域

本发明属于喷雾干燥药物制剂及其制造方法的领域。更具体地，本发明涉及用于减少药物用途的喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法、用途和工艺。

发明背景

单克隆抗体的液体注射剂，例如静脉内、肌内或皮下注射剂仍然是最优选的施用途径，其能够产生高全身浓度的单克隆抗体用于治疗用途(Wan等人，Technologies 9(2)，e141–e146.(2012)；Roberts，C.J.，Current Opinion in Biotechnology 30，211–217(2014)；Moroz，E.等人，Advanced Drug Delivery Reviews 101，108–121(2016))。皮下注射是上述选择的首选途径，因为它们可以使患者自我施用，从而有可能限制对患者日常生活和总体治疗费用的影响。但是，在没有专门装置或酶方法(如透明质酸酶促进的皮下输注系统)的情况下，可通过皮下施用的体积极为有限，为约1.5-2ml，使得有必要施用高度浓缩的单克隆抗体制剂(Wasserman，R.L.等人，Journal of Allergy and ClinicalImmunology 130(4)，951–957(2012))。因此，这些制剂中的高浓度单克隆抗体将增加蛋白质自相互作用的机会，并伴有不可逆聚集的风险，从而导致产品功效降低和免疫原性反应的风险增加(Roberts，C.J.，Current Opinion in Biotechnology 30，211–217(2014)；Barnett等人，Biophysical Chemistry 207，21-29(2015)；Mahler等人，Journal ofPharmaceutical Sciences 98(9)，2909-2934(2009))。

当皮下注射的单克隆抗体制剂的液体形式不够稳定时，通常会对其进行干燥，因为水的去除会显著降低蛋白质的构象迁移性并限制了小分子反应物的运输，然后降低蛋白质自相互作用和降解机制的速率，由此改善了制剂的(储存)稳定性(Cicerone，MT等人，Soft Matter 8，2983–2991(2012))。多年来已经提出了用于液态、干燥过程中和固态蛋白质稳定化的不同机理和模型。

蛋白质制剂的干燥通常通过冻干进行，因为没有将蛋白质暴露于高温的风险。然而，冻干的主要缺点在于在冷冻和干燥阶段期间产生的压力的量，潜在地导致活性的部分或完全丧失。

然而，蛋白质制剂的喷雾干燥代表了一种快速、一步、可定制的方法，其产生了具有期望形态、密度和粉末流动性的粉末。尽管喷雾干燥使用相对较高的温度，但是由于在溶剂蒸发过程中从液滴中提取热量以及喷雾干燥过程的持续时间短，因此蛋白质的热暴露最小。为减少应力因素(如剪切应力，暴露于空气/液体界面或失去水合壳时增加的热应力)的影响并进一步提高固态稳定性，添加适合的赋形剂。

然而，喷雾干燥的制剂并且与粉末形式的其他蛋白质制剂类似必须恰好在施用前进行重构，通常用水。尽管可以容易地实现喷雾干燥制剂的重构，但是完成该过程所需的时间可以大范围地变化，这取决于喷雾干燥之前添加至蛋白质制剂中的赋形剂。已经进行了大量的研究来确定这些赋形剂对蛋白质稳定性的影响，并且大多数研究集中在用于吸入的冻干或喷雾干燥，而不是集中在皮下注射用粉末。此外，关于可能影响喷雾干燥蛋白质制剂的重构时间的适合赋形剂，知之甚少。

因此，在本领域中仍然需要提供用于皮下注射的进一步改进的蛋白质制剂，其一旦喷雾干燥，则在可接受的时间内重构。

发明概述

本发明通过糖和一种或多种氨基酸的组合提供用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法、工艺和用途，解决了如上所鉴别的需求。

下面按编号描述具体实施方案：

实施方案1:用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法，其中该方法包括喷雾干燥蛋白质制剂，该蛋白质制剂包含蛋白质，存在糖和一种或多种氨基酸，其中所述的糖为二糖，且其含量为1.0-20％w/v，并且其中所述一种或多种氨基酸的含量为50mM至200mM或大于50mM至200mM。

实施方案2:根据实施方案1的方法，其中所述的蛋白质为抗体或其片段。

实施方案3:根据实施方案1或实施方案2的方法，其中所述的糖为蔗糖、海藻糖或它们的混合物。

实施方案4:根据上述实施方案任一项的方法，其中所述的一种或多种氨基酸为甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物。

实施方案5:根据上述实施方案任一项的方法，其中所述的糖为蔗糖或海藻糖，且所述的氨基酸为L-精氨酸盐酸盐、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐或它们的混合物。

实施方案6:根据上述实施方案任一项的方法，其中该方法包括喷雾干燥蛋白质制剂，该蛋白质制剂还包含表面活性剂。

实施方案7:根据实施方案6的方法，其中所述的表面活性剂为聚山梨酯，优选聚山梨酯20。

实施方案8:用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法，它包括下列步骤：

a.制备包含蛋白质、糖和一种或多种氨基酸的蛋白质制剂；

b.喷雾干燥步骤a)中制备的蛋白质制剂；

c.回收步骤b)的喷雾干燥的蛋白质制剂；

d.在重构时间RT1内重构，优选用水重构所回收的喷雾干燥的蛋白质制剂；

其中重构时间RT1少于在没有糖和一种或多种氨基酸存在下制备的相同蛋白质制剂的重构时间，其中所述的糖为为二糖，且其含量为1.0-20％w/v，并且其中所述一种或多种氨基酸的含量为50mM至200mM或大于50mM至200mM。

实施方案9:根据实施方案8的方法，其中所述的蛋白质为抗体或其片段。

实施方案10:根据实施方案8或9的方法，其中所述的糖为蔗糖、海藻糖或它们的混合物。

实施方案11:根据实施方案8-10任一项的方法，其中所述的氨基酸为甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物。

实施方案12:根据实施方案8-11任一项的方法，其中所述的糖为蔗糖或海藻糖，且所述的氨基酸为L-精氨酸盐酸盐、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐或它们的混合物。

实施方案13:根据实施方案8-12任一项的方法，其中该方法包括喷雾干燥蛋白质制剂，该蛋白质制剂还包含表面活性剂。

实施方案14:根据实施方案13的方法，其中所述的表面活性剂为聚山梨酯，优选聚山梨酯20。

实施方案15:通过根据实施方案8-14任一项的方法得到的蛋白质制剂。

实施方案16:根据实施方案15的蛋白质制剂，用于疗法或诊断。

附图简述

图1.包含糖和氨基酸的组合的制剂的重构时间。氨基酸组合的影响与单独的2.5％蔗糖比较。

图2.来自DoE的喷雾干燥的制剂的扩展参数估计图。使用在5℃下存储的样品测量的值(n＝3)计算模型。空心棒条标识非显著性参数，而阴影棒条标识在0.05水平统计学显著的参数。误差棒条描绘了每个估计参数的估计标准误差。截距估算值＝18.69±0.45(SE)分钟。

图3.包含mAb1的喷雾干燥的制剂的重构时间。包含选定的氨基酸和蔗糖和表面活性剂(黑色棒条)与单独的表面活性剂(白色棒条)的制剂的重构时间比较。

图4.包含mAb1的喷雾干燥的制剂的重构时间。单独的蔗糖对比蔗糖和单一或组合的氨基酸。无表面活性剂存在。

图5.包含mAb1的喷雾干燥的制剂的重构时间。仅蔗糖和表面活性剂对比蔗糖、表面活性剂和单一或组合的氨基酸。

图6.包含mAb1的喷雾干燥的制剂的重构时间。单独的海藻糖对比蔗糖和单一或组合的氨基酸。无表面活性剂存在。

图7.包含mAb1的喷雾干燥的制剂的重构时间。仅海藻糖和表面活性剂对比蔗糖、表面活性剂和单一或组合的氨基酸。

图8.包含Fab’-PEG抗体的喷雾干燥的制剂的重构时间。使用单独的蔗糖对比蔗糖与增加浓度的甘氨酸组合对Fab’-PEG抗体制剂的重构时间的影响。

图9.包含Fab’-PEG抗体的喷雾干燥的制剂的重构时间。使用不同的1％氨基酸与2.5％蔗糖组合对Fab’-PEG抗体制剂的重构时间的影响。

图10.包含mAb1、二糖和精氨酸的喷雾干燥的制剂的重构时间。A)无论精氨酸的浓度如何，海藻糖的影响。B)无论海藻糖的浓度如何，精氨酸的影响。C)精氨酸和海藻糖的累积量的影响。

图11.包含mAb1、二糖和甘氨酸的喷雾干燥的制剂的重构时间。A)无论甘氨酸的浓度如何，海藻糖的影响。B)无论海藻糖的浓度如何，甘氨酸的影响。C)甘氨酸和海藻糖的累积量的影响。

图12.包含mAb1、二糖和赖氨酸的喷雾干燥的制剂的重构时间。A)无论赖氨酸的浓度如何，海藻糖的影响。B)无论海藻糖的浓度如何，赖氨酸的影响。C)赖氨酸和海藻糖的累积量的影响。

图13.包含mAb1、二糖和脯氨酸的喷雾干燥的制剂的重构时间。A)无论脯氨酸的浓度如何，海藻糖的影响。B)无论海藻糖的浓度如何，脯氨酸的影响。C)脯氨酸和海藻糖的累积量的影响。

图14.包含mAb2的喷雾干燥的制剂的重构时间。使用100mM不同的氨基酸与2.5％海藻糖组合对mAb2制剂的重构时间的影响。

发明详述

根据本发明用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法包括在糖和一种或多种氨基酸的存在下喷雾干燥蛋白质制剂。

据报道二糖和氨基酸，例如L-精氨酸在冻干期间和固态形式下稳定蛋白质(Ohtake等人，Advanced Drug Delivery Reviews 63(13)，1053–1073(2011)；Kamerzell等人，Advanced Drug Delivery Reviews 63(13)，1118–1159(2011)以及

和Vila，Advanced Drug Delivery Reviews 93，25–41(2015))。然而，一直没有关于如本申请中所述的可以减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的赋形剂和方法的研究，所述的制剂包含蛋白质。

因此，本发明还提供了一种或多种氨基酸和糖，例如二糖，优选蔗糖或海藻糖或它们的混合物的组合在减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间中的用途。

在另一方面，本发明还提供了用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法，它包括下列步骤：

a.制备包含蛋白质、糖和一种或多种氨基酸的蛋白质制剂；

b.喷雾干燥步骤a)中制备的蛋白质制剂；

c.回收步骤b)的喷雾干燥的蛋白质制剂；

其中重构时间RT1少于在没有糖和一种或多种氨基酸存在下制备的相同蛋白质制剂的重构时间。

本申请中所用的术语“在...的存在下”意指糖和一种或多种氨基酸在喷雾干燥蛋白质制剂之前是该制剂的组成部分，并且意味着对如何和在何时添加它们或添加顺序没有限制，只要喷雾干燥前蛋白质制剂包含它们。

将可接受的重构时间视为在30分钟内，优选在25分钟内，或更优选在20分钟内或更早。本申请中所用的术语“重构时间”意指在期望体积的溶剂(例如水)中重构喷雾干燥的蛋白质制剂所花费的时间。在本公开发明内，当考虑某些赋形剂是否令人意外地优于其他赋形剂时，比较相同喷雾干燥的蛋白质制剂但研究的不同赋形剂的重构时间。令人意外优良的赋形剂在至少约10％或更多的这些极限内减少重构时间。

优选地，根据本发明方法、用途和工艺的蛋白质制剂中的蛋白质为抗体或其抗原结合片段。

本申请中所用的术语“抗体(antibody)或(antibodies)”是指单克隆抗体或多克隆抗体，并且不限于通过本领域中已知的重组技术产生的重组抗体。

优选地，根据本发明方法、用途和工艺的蛋白质制剂中包含的抗体为单克隆抗体。

“抗体”包括任何物种，特别是哺乳动物物种的抗体，其具有两个基本上完整的重链和两个基本上完整的轻链，任何同种型的人抗体，包括IgA₁、IgA₂、IgD、IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgG₄、IgE和IgM及其修饰的变体，非人灵长类动物抗体，例如来自黑猩猩、狒狒、恒河猴或猕猴，啮齿动物抗体，例如来自小鼠、大鼠或兔，羊或马抗体及其衍生物，或禽类物种的抗体诸如鸡抗体或鱼类物种的抗体诸如鲨鱼抗体。术语“抗体”还指“嵌合”抗体，其中至少一个重链和/或轻链抗体序列的第一部分来自第一物种，且该重链和/或轻链抗体序列的第二部分来自第二物种。本申请中的目的嵌合抗体包括包含源自非人灵长类动物(例如旧大陆猴，诸如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”的抗体。“人源化”抗体是含有源自非人抗体的序列的嵌合抗体。对于大部分，人源化抗体是人抗体(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基被替换为具有期望特异性、亲和力和活性的来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类动物的高变区[或互补决定区(CDR)的残基。在大多数情况下，CDR以外的人(受体)抗体的残基；即，在构架区(FR)中，额外被替换为相应的非人残基。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。人源化降低非人抗体在人类中的免疫原性，因此有利于应用抗体以治疗人疾病。人源化抗体和生成它们的几种不同的技术是本领域中众所周知的。术语“抗体”还指可以作为人源化的备选方案生成的人抗体。例如，可能产生转基因动物(例如，小鼠)，其在免疫后能够在不产生内源性鼠抗体的情况下产生人抗体的完整所有组成成分。例如，已经描述嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链连接区(JH)基因的纯合子缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。此种系突变小鼠中的人种系免疫球蛋白基因阵列的转移将导致在用所述抗原使携带人种系免疫球蛋白基因的转基因动物免疫时产生具有针对特定抗原的特异性的人抗体。用于产生此类转基因动物的技术和用于从此类转基因动物分离和产生人抗体的技术是本领域中已知的。或者，在转基因动物(例如小鼠)中，只有编码小鼠抗体的可变区的免疫球蛋白基因被替换为相应的人可变免疫球蛋白基因序列。编码抗体恒定区的小鼠种系免疫球蛋白基因保持不变。以该方式，转基因小鼠的免疫系统中的抗体效应物功能和因此B细胞发育基本上不变，这可导致在体内抗原攻击时改善的抗体应答。一旦从此类转基因动物分离编码特定目的抗体的基因，编码恒定区的基因就可以被替换为人恒定区基因，以便获得完全人抗体。本申请中所用的术语“抗体”也指非糖基化的抗体。

本申请中所用的术语“其片段”或其语法变化形式是指抗体片段。抗体的片段包含至少一个本领域中已知的重链或轻链免疫球蛋白结构域且与一个或多个抗原结合。根据本发明的抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂以及Fv和scFv片段；以及双抗体，三抗体，四抗体，微型抗体，结构域抗体(dAbs)，例如sdAbs、VHH或骆驼抗体(例如来自骆驼或美洲驼，例如Nanobodies^TM)和VNAR片段，单链抗体，由抗体片段或抗体形成的双特异性、三特异性、四特异性或多特异性抗体，包括但不限于Fab-Fv或Fab-Fv-Fv构建体。如上定义的抗体片段是本领域中已知的。如果期望，可以将抗体或抗原结合片段缀合至一个或多个效应分子。将被理解的是，效应分子可以包含单个效应分子或两个或更多个这样的分子，其如此连接而形成可以连接至本发明的抗体的单一部分。当期望得到与效应分子连接的抗体片段时，这可以通过标准化学或重组DNA方法进行制备，其中抗体片段直接或通过偶联剂与效应分子连接。使这类效应分子与抗体缀合的技术是本领域中熟知的(参见，Hellstrom等人，Controlled Drug Delivery，第2版，Robinson等人，eds.，1987，pp.623-53；Thorpe等人，1982，Immunol.Rev.，62:119-58，和Dubowchik等人，1999，Pharmacology andTherapeutics，83，67-123)。具体的化学方法包括，例如，描述在WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476和WO 03/031581中的那些。或者，如果效应分子为蛋白质或多肽，则可以使用重组DNA方法实现连接，例如，如WO 86/01533和EP0392745中所述。

本申请中所用的术语效应分子包括例如抗癌剂，药物，毒素，生物活性蛋白，例如酶，其他抗体或抗体片段，抗原结合剂，合成(包括PEG)或天然存在的聚合物，核酸及其片段，例如DNA、RNA及其片段，放射性核素，特别是放射性碘化物，放射性同位素，螯合金属，纳米粒和报道基团例如荧光化合物或可以通过NMR或ESR光谱法检测的化合物。

效应分子可以增加抗体在体内的半衰期，和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体穿过上皮屏障向免疫系统的递送。这种类型的适合效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，例如WO05/117984中所述的那些。

如果效应分子是聚合物，其通常可以是合成或天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链的聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化烯聚合物或支链或无支链的多糖，例如同多糖或杂多糖。

可以存在于上述举出的合成聚合物上的特定的任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。

合成聚合物的具体实例包括任选取代的直链或支链聚(乙二醇)，聚(丙二醇)聚(乙烯醇)或其衍生物，特别是任选取代的聚(乙二醇)例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。

具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。

在一个实施方案中，聚合物为白蛋白或其片段，例如人血清白蛋白或其片段。在一个实施方案中，聚合物为PEG分子。

天然或合成聚合物的大小可以根据需要进行改变，但是通常将在500Da-50000Da，例如5000-40000Da，例如20000-40000Da的平均分子量范围内。聚合物的大小可以特别地基于产品的预期用途例如定位在某些组织例如肿瘤或延长循环半衰期的能力进行选择(有关综述，参见Chapman，2002，Advanced Drug Delivery Reviews，54，531-545)。因此，例如，如果预期使产品离开循环并渗透组织，例如用于治疗肿瘤，则使用小分子量聚合物，例如具有约5000Da的分子量的聚合物可能是有利的。对于产物保留在循环中的应用，使用更高分子量聚合物，例如具有20000Da-40000Da分子量的聚合物可能是有利的。

适合的聚合物包括聚亚烷基聚合物，例如聚(乙二醇)，或尤其是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其是具有约15000Da至约40000Da范围内的分子量的聚合物。

在一个实例中，用于本发明的抗体连接至聚(乙二醇)(PEG)部分。在另一个实例中，抗体为抗体片段，且PEG部分可以通过位于抗体片段上的任意可利用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团，例如任意游离氨基、亚氨基、巯基、巯基或羧基连接。这类氨基酸可以天然出现在抗体片段中或可以使用重组DNA方法被改造成片段(参见例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971；WO2008/038024)。在一个实例中，本发明的抗体分子为修饰的Fab片段，其中修饰为将一种或多种氨基酸添加至其重链的C-末端，以便能够连接效应分子。适合地，额外的氨基酸形成修饰的铰链区，其包含可以与效应分子连接的一个或多个半胱氨酸残基。多个位点可以用于连接两个或更多个PEG分子。

适合地，PEG分子通过位于抗体片段上的至少一个半胱氨酸残基的巯基共价连接。连接至修饰的抗体片段的每个聚合物分子可以共价连接至位于片段上的半胱氨酸残基的硫原子。所述的共价连接通常为二硫键，或特别地，为硫-碳键。例如，如果巯基用作适当活化的效应分子的连接点，则可以使用巯基选择性衍生物，例如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。活化的聚合物可以用作如上所述的聚合物修饰的抗体片段制备中的原料。

活化的聚合物可以为包含巯基反应基团的任意聚合物，所述巯基反应基团例如α-卤代羧酸或酯，例如碘代乙酰胺，酰亚胺，例如马来酰亚胺，乙烯基砜或二硫化物。这类原料可以商购得到(例如从Nektar，以前的Shearwater Polymers Inc.，Huntsville，AL，USA)，或可以由商购原料、使用常规化学方法进行制备。特定的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可获自Nektar，以前的Shearwater；Rapp Polymere；以及SunBio)和M-PEG-SPA(可获自Nektar，以前的Shearwater)。

在一个实施方案中，抗体为修饰的Fab片段、Fab’片段或diFab，其被聚乙二醇化，即具有与之共价连接的PEG(聚(乙二醇))，例如根据EP0948544或EP1090037中公开的方法[另外参见"Poly(ethyleneglycol)Chemistry，Biotechnical and BiomedicalApplications"，1992，J.Milton Harris(ed)，Plenum Press，New York，"Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications"，1997，J.Milton Harris和S.Zalipsky(eds)，American Chemical Society，Washington DC and"BioconjugationProtein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences"，1998，M.Aslam和A.Dent，Grove Publishers，New York；Chapman，A.2002，Advanced Drug DeliveryReviews 2002，54:531-545]。在一个实例中，PEG连接至铰链区中的半胱氨酸。在一个实例中，PEG修饰的Fab片段具有共价连接至修饰的铰链区中的单一巯基的马来酰亚胺基团。赖氨酸残基可以共价连接至马来酰亚胺基团，且赖氨酸残基上的每一个胺基可以连接具有约20,000Da的分子量的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此，连接至Fab片段的PEG的总分子量可以为约40,000Da。

具体的PEG分子包括N,N’-双(甲氧基聚(乙二醇)MW 20,000)修饰的赖氨酸的2-[3-(N-马来酰亚氨基)丙酰氨基]乙酰胺，也称作PEG2MAL40K(可获自Nektar，以前的Shearwater)。

PEG连接体的可替代来源包括供应GL2-400MA3(其中如下结构中的m为5)和GL2-400MA(其中m为2)且n为约450的NOF：

即每个PEG为约20,000Da。

因此，在一个实施方案中，PEG为2,3-双(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-{[3-(6-马来酰亚氨基-1-氧代己基)氨基]丙氧基}己烷(2臂支化PEG，-CH2)3NHCO(CH2)5-MAL，Mw 40,000，其被称作SUNBRIGHT GL2-400MA3。

如下类型的另外的可替代的PEG效应分子：

可获自Dr Reddy、NOF和Jenkem。

在一个实施方案中，提供了本发明抗体，其被聚乙二醇化(例如具有本申请中所述的PEG)，通过链上的第226位或约第226位氨基酸上的半胱氨酸氨基酸残基，例如重链的氨基酸226(通过顺序编号)连接。

在一个实施方案中，本公开发明提供Fab’PEG分子，其包含一个或多个PEG聚合物，例如1或2个聚合物，例如40kDa聚合物。根据本公开发明的Fab’-PEG分子可以特别有利，因为它们具有不依赖于Fc片段的半衰期。在一个实例中，本发明提供了用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法，其中该方法包括在糖和一种或多种氨基酸存在下喷雾干燥包含蛋白质的蛋白质制剂，其中蛋白质为缀合至聚合物例如PEG的Fab’片段。在本发明的另一个实施方案中，提供了用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法，它包括下列步骤：

a.制备包含蛋白质、糖和一种或多种氨基酸的蛋白质制剂；

b.喷雾干燥步骤a)中制备的蛋白质制剂；

c.回收步骤b)的喷雾干燥的蛋白质制剂；

其中重构时间RT1少于在没有糖和一种或多种氨基酸存在下制备的相同蛋白质制剂的重构时间，并且其中蛋白质为缀合至聚合物例如PEG的Fab’片段，其中所述的糖为二糖，且含量为1.0-20％w/v，且其中一种或多种氨基酸的含量为50mM至200mM或大于50mM至200mM。

根据本发明方法、用途和工艺的蛋白质制剂中包含的抗体或其片段优选为人或人源化单克隆抗体，优选人源化单克隆全长抗体。

可以典型地通过下列步骤生产抗体分子：在适合于导致从编码本发明抗体分子的DNA表达蛋白质的条件下培养包含编码抗体序列的载体的宿主细胞，并且分离抗体分子。

抗体分子可以仅包含重链或轻链多肽，在这种情况下，仅需重链或轻链多肽编码序列被用于转染宿主细胞。为了生产同时包含重链和轻链的产物，可以用两种载体转染细胞系，第一载体编码轻链多肽，第二载体编码重链多肽。或者，可以使用单一载体，该载体包括编码轻链和重链多肽的序列。

可通过培养用一种或多种编码重组抗体片段的表达载体转染的真核宿主细胞来生产可根据工业规模生产的抗体或其抗原结合片段。真核宿主细胞优选是哺乳动物细胞，更优选中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。哺乳动物细胞可以在支持其生长和表达重组蛋白的任何培养基中培养，优选地，该培养基是化学确定的培养基，其不含动物来源的产物，例如动物血清和蛋白胨。存在本领域技术人员可以利用的不同细胞培养基，其包含以适当的浓度存在以使细胞能够生长和蛋白质能够产生的维生素，氨基酸，激素，生长因子，离子，缓冲剂，核苷，葡萄糖或等效能量来源的不同组合。在本领域技术人员已知的细胞培养周期过程中的不同时间可以在细胞培养基中以适合的浓度包括另外的细胞培养基成分。

哺乳动物细胞培养可以在任意适合的容器例如摇瓶或生物反应器中进行，根据所需的生产规模，可以或可以不以分批补料模式操作。这些生物反应器可以是搅拌罐或气升反应器。可以利用容量大于1,000L-50,000L，优选5,000L-20,000L之间，或至10,000L的各种大规模生物反应器。或者，也可以使用较小规模的生物反应器，例如2L-100L之间制造抗体或抗体片段。

典型地在哺乳动物宿主细胞培养物，典型地为CHO细胞培养物的上清液中发现抗体或其抗原结合片段。对于CHO培养过程，其中目的蛋白质例如抗体或其抗原结合片段被分泌在上清液中，通过本领域中已知的方法收集，典型地通过离心收集所述上清液。

或者，宿主细胞是原核细胞，优选是革兰氏阴性细菌。更优选地，宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞。用于蛋白表达的原核宿主细胞是本领域中熟知的(Terpe，K.ApplMicrobiol Biotechnol 72，211-222(2006))。宿主细胞是重组细胞，其已被遗传改造以产生目标蛋白质，例如抗体的抗原结合片段。重组大肠杆菌宿主细胞可以衍生自任何适合的大肠杆菌菌株，包括来自MC4100、TG1、TG2、DHB4、DH5α、DH1、BL21、K12、XL1Blue和JM109。一个实例为大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)，其为重组蛋白发酵的常用宿主菌株。抗体片段也可以通过培养改良的大肠杆菌菌株，例如代谢突变体或缺乏蛋白酶的大肠杆菌菌株来产生。

根据蛋白质的性质、生产规模和所使用的大肠杆菌菌株，典型地在大肠杆菌宿主细胞的周质或宿主细胞培养物上清液中发现抗体片段。将蛋白质靶向这些区室的方法是本领域中熟知的(Makrides，S.C.；Microbiol Rev 60，512-538(1996))。使蛋白质定向于大肠杆菌周质的适合信号序列的实例包括大肠杆菌PhoA、OmpA、OmpT、LamB和OmpF信号序列。可以通过依赖于自然分泌途径或通过诱导外膜的有限渗漏导致蛋白质分泌，将蛋白质靶向上清液，其实例为例如使用pelB前导区，蛋白质A前导区，共表达细菌素释放蛋白、丝裂霉素诱导的细菌素释放蛋白连同添加甘氨酸至培养基和用于膜渗透的kil基因的共表达。最优选地，重组蛋白在宿主大肠杆菌的周质中表达。

重组蛋白在大肠杆菌宿主细胞中的表达也可以处于诱导型系统的控制下，从而重组抗体在大肠杆菌中的表达处于诱导型启动子的控制下。许多适用于大肠杆菌中使用的诱导型启动子在本领域中是熟知的，并且根据启动子，重组蛋白的表达可以通过变化因素，例如温度或生长培养基中特定物质的浓度进行诱导。诱导型启动子的实例包括可被乳糖或不可水解的乳糖类似物异丙基-b-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导的大肠杆菌lac、tac和trc启动子，以及分别被磷酸、色氨酸和L-阿拉伯糖诱导的phoA、trp和araBAD启动子。例如，可以通过添加诱导物或温度变化(如果诱导是温度依赖性的)来诱导表达。在通过向培养物中添加诱导物来实现重组蛋白表达的诱导的情况下，根据发酵系统和诱导物，可以通过任何合适的方法添加诱导物，例如，通过单次或多次快速添加或通过进料器逐步添加诱导物来进行。将被理解的是，在诱导物的添加与蛋白质表达的实际诱导之间可能存在延迟，例如，如果诱导物为乳糖，则在蛋白质表达的诱导发生之前可能存在延迟，同时在乳糖之前利用任何预先存在的碳源。

可以在任意支持大肠杆菌生长和重组蛋白表达的培养基中培养大肠杆菌宿主细胞培养物(发酵)。所述培养基可以是例如在Durany O等人(2004)(Process Biochem 39，1677-1684)中描述的任何化学限定的培养基。

可以根据需要的生产规模，在任意适合的容器中，例如摇瓶或发酵罐中进行大肠杆菌宿主细胞的培养。各种大型发酵罐都可以利用，其容量从大于1,000升到约100,000升。优选地，使用1,000-50,000升的发酵罐，更优选1,000-25,000、20,000、15,000、12,000或10,000升的发酵罐。也可以使用容量在0.5-1,000升之间的较小规模发酵罐。

可以在任意适合的系统中，例如连续、分批或分批补料模式进行发酵，这取决于蛋白质和所需的收率。分批模式可以在需要时使用，快速添加营养物或诱导物。或者，可以使用分批补料培养，并且以最大比生长速率以分批模式预培养使培养物生长，该最大比生长速率可以使用发酵罐中最初存在的营养物和用于控制生长速率的一种或多种营养物进料方案来维持，直至发酵完成。分批补料模式也可用于诱导前，以控制大肠杆菌宿主细胞的代谢并允许达到更高的细胞密度。

如果期望，则可以从发酵培养基中收集宿主细胞。例如，可以通过离心、过滤或通过浓缩从样品中收集宿主细胞。在这种情况下，该方法典型地包含在提取蛋白质之前进行离心和细胞回收的步骤。

对于大肠杆菌发酵过程，其中在宿主细胞的周质空间中发现目的蛋白质，例如抗体或抗体的抗原结合片段，需要从宿主细胞中释放蛋白质。释放可以通过任意适合的方法进行，例如通过机械或压力处理、冻-融处理、渗透冲击、萃取剂或热处理使细胞裂解。这种用于蛋白质释放的提取方法是本领域中熟知的。因此，在一个特定的实施方案中，生产过程包含在蛋白质纯化之前另外的蛋白质提取步骤。

其他体外获得人抗体的抗原结合片段的方法基于展示技术，例如噬菌体展示或核糖体展示技术，其中使用重组DNA文库，其至少部分人工生成或由供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因组成部分生成。用于生成人抗体的噬菌体和核糖体展示技术是本领域中熟知的。人抗体也可以从分离的人B细胞中产生，所述人B细胞用目的抗原进行离体免疫接种，随后融合以生成杂交瘤，然后可以将该杂交瘤针对最佳人抗体进行筛选。

减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法、用途和工艺。

喷雾干燥的过程涉及在将流体进料雾化成细小液滴后蒸发水分，得到干燥的粉末。由三个基本步骤组成的喷雾干燥首先是通过双流体喷嘴将液体进料分散在喷雾气体(压缩空气或N2，5-8巴)中。小液滴通过喷嘴喷射(雾化)。然后将液滴悬浮在通常由加热的并流空气流组成的干燥介质中，从而使液体蒸发和转移。在最终的步骤中，将干燥的固体从旋风分离器中的气流中分离出来。收集干燥的粉末，并将空气排放到大气中。

在下文的实施例中描述了喷雾干燥蛋白质制剂的实例。

根据作为一个整体的本发明的蛋白质制剂中包含的抗体或其片段可以以任何浓度存在，例如1-200mg/mL，优选20-150mg/mL，甚至优选30-100mg/mL，例如30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg/mL。或者，一种或多种氨基酸优选以每100mL重量(％w/v)表示的量存在于被喷雾干燥的蛋白质制剂中。在这类情况下，根据作为一个整体的本发明的蛋白质制剂中包含的抗体或其片段可以以0.1-20％w/v，优选2.0-15％w/v甚或优选3.0-10％w/v存在，例如3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10％w/v。

通过结合在先喷雾干燥糖和一种或多种氨基酸，实现减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间。

在作为一个整体的本发明的上下文中，所述的糖优选选自二糖，更优选为蔗糖、海藻糖或它们的混合物。所述的糖优选存在于喷雾干燥的蛋白质制剂中的量为1.0％-20％w/v，或1.5％-15％w/v或1.5％-10％w/v或1.5％-4.5％w/v，例如1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0、4.1、4.2或4.5％w/v，甚或优选2.5％-4.2％w/v，例如2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1或4.2％w/v。或者，所述的糖优选以摩尔浓度表示的量存在于喷雾干燥的蛋白质制剂中。在这种情况下，所述的糖优选存在于喷雾干燥的蛋白质制剂中，其量为30-600mM或45-135mM，例如45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120或135mM，甚或优选70mM至125mM，例如70、73、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120或125mM。为了达到本发明的技术效果，蔗糖或海藻糖在执行糖的性能方面等同，并且相对于混合物优选它们单独存在。

在作为一个整体的本发明的上下文中，一种或多种氨基酸可以以其D-和/或L-型存在，但L-型为典型的。一种或多种氨基酸优选为甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物。尽管没有限制，但是优选包括碱性氨基酸，即精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸或它们的混合物。氨基酸可以作为任意适合的盐存在，例如盐酸盐，例如精氨酸-HCI、赖氨酸-HCl或组氨酸-HCl。一种或多种氨基酸优选以10mM至250mM或大于10mM至250mM的量存在于喷雾干燥的蛋白质制剂中，优选50mM至200mM或大于50mM至200mM或50mM至150mM或大于50mM至150mM，例如50、51、55、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mM。或者，一种或多种氨基酸优选以每100mL重量(％w/v)表示的量存在于喷雾干燥的蛋白质制剂中。例如，如果至少一种氨基酸为精氨酸-HCl(具有210.66Da的MW)，所述精氨酸-HCl以0.2-5.25％w/v重量或大于0.2-5.25％w/v重量或1.06-4.2％w/v或大于1.06-4.2％w/v或1.06-3.2％w/v或大于1.06-3.2％w/v的量存在，例如1.1、1.15、1.2、1.5、2.0、2.2、2.5、3.0或3.2％w/v。在另一个实例中，如果至少一种氨基酸为赖氨酸-HCl(具有182.65Da的MW)，所述赖氨酸-HCl以0.1-4.5％w/v重量或大于0.1-4.5％w/v重量，或0.9-3.6％w/v或大于0.9-3.6％w/v，优选0.9-2.7％w/v或大于0.9-2.7％w/v的量存在，例如0.9、0.95、1.0、1.5、1.8、2.0、2.5或2.7％w/v。对于任何氨基酸，将目的摩尔浓度转换为％w/v完全在本领域技术人员的技能范围内。

在作为一个整体的本发明的上下文中，可以累计糖和一种或多种氨基酸的摩尔浓度。在这种情况下，糖和一种或多种氨基酸优选以60mM至400mM或大于60mM至400mM，优选70mM至300mM或大于70mM至300mM或70mM至260mM或大于70mM至260mM的累积摩尔浓度(或者也称作累积量)存在于被喷雾干燥的蛋白质制剂中，例如70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或260mM。

在一个实施方案中，根据本发明用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法包括喷雾干燥蛋白质制剂，该制剂包含蛋白质，存在蔗糖或海藻糖或它们的混合物和一种或多种氨基酸，该氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物。优选地，所述的蛋白质为抗体或其片段。所述的抗体或其片段任选地缀合至聚合物，例如PEG。

在另一个实施方案中，根据本发明用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法包括下列步骤：

a.制备蛋白质制剂，该制剂包含蛋白质、蔗糖或海藻糖或它们的混合物和一种或多种氨基酸，该氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物；

b.喷雾干燥步骤a)中制备的蛋白质制剂；

c.回收步骤b)的喷雾干燥的蛋白质制剂；

其中重构时间RT1少于在没有蔗糖或海藻糖或它们的混合物和一种或多种氨基酸存在下制备的相同蛋白质制剂的重构时间，所述的氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物，其中所述的糖为二糖，且含量为1.0-20％w/v，并且其中所述一种或多种氨基酸的含量为50mM至200mM或大于50mM至200mM。优选地，所述的蛋白质为抗体或其片段。所述的抗体或其片段任选地缀合至聚合物，例如PEG。

a.制备蛋白质制剂，该制剂包含蛋白质、1％-20％的蔗糖或海藻糖或它们的混合物和50mM至250mM或大于50mM至250mM的一种或多种氨基酸，该氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物；

b.喷雾干燥步骤a)中制备的蛋白质制剂；

c.回收步骤b)的喷雾干燥的蛋白质制剂；

其中重构时间RT1少于在没有蔗糖或海藻糖或它们的混合物和一种或多种氨基酸存在下制备的相同蛋白质制剂的重构时间，所述的氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物。优选地，所述的蛋白质为抗体或其片段。所述的抗体或其片段任选地缀合至聚合物，例如PEG。

在另一个实施方案中，根据本发明用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法包括在1.5％-4.5％w/v或2.5％-4.2％w/v的蔗糖或海藻糖或它们的混合物和50mM至200mM或大于50mM至200mM的一种或多种氨基酸的存在下喷雾干燥包含蛋白质的蛋白质制剂，所述的氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物。优选地，所述的蛋白质为抗体或其片段。所述的抗体或其片段任选地缀合至聚合物，例如PEG。

a.制备蛋白质制剂，该制剂包含蛋白质，1.5％-4.5％w/v或2.5％-4.2％w/v的蔗糖或海藻糖或它们的混合物和50mM至200mM或大于50mM至200mM的一种或多种氨基酸，该氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物；

b.喷雾干燥步骤a)中制备的蛋白质制剂；

c.回收步骤b)的喷雾干燥的蛋白质制剂；

其中重构时间RT1少于在没有蔗糖或海藻糖或它们的混合物和一种或多种氨基酸存在下制备的相同蛋白质制剂的重构时间，所述的氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物。优选地，所述的蛋白质为抗体或其片段。所述的抗体或其片段任选地缀合至聚合物，例如PEG。本发明还提供了用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法，它包括喷雾干燥蛋白质制剂，该制剂包含蛋白质，存在糖、一种或多种氨基酸和表面活性剂。

另外，本发明还提供了根据本发明用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法，它包括下列步骤：

a.制备包含蛋白质、糖、一种或多种氨基酸和表面活性剂的蛋白质制剂；

b.喷雾干燥步骤a)中制备的蛋白质制剂；

c.回收步骤b)的喷雾干燥的蛋白质制剂；

其中重构时间RT1少于在没有糖和一种或多种氨基酸存在下制备的相同蛋白质制剂的重构时间。优选地，所述的蛋白质为抗体或其片段，其中所述的糖为二糖且含量为1.0-20％w/v，并且其中所述一种或多种氨基酸的含量为50mM至200mM或大于50mM至200mM。

可利用于根据本发明方法的表面活性剂包括，但不限于非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂和两性离子型表面活性剂。用于本发明的典型表面活性剂包括，但不限于脂肪酸山梨坦酯(例如单辛酸山梨坦、单月桂山梨坦、单棕榈山梨坦)、三油酸山梨坦、甘油脂肪酸酯(例如单辛酸甘油酯、单肉豆蔻酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯)、聚甘油脂肪酸酯(例如单硬脂酸十甘油酯、二硬脂酸十甘油酯、单亚油酸十甘油酯)、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐三硬脂酸酯)、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯)、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯(例如聚氧乙烯甘油单硬脂酸酯)、聚乙二醇脂肪酸酯(例如聚乙二醇二硬脂酸酯)、聚氧乙烯烷基醚(例如聚氧乙烯月桂基醚)、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(例如聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯鲸蜡基醚)、聚氧乙烯烷基苯基醚(例如聚氧乙烯壬基苯基醚)、聚氧乙烯氢化蓖麻油{例如聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油)、聚氧乙烯蜂蜡衍生物(例如聚氧乙烯山梨醇蜂蜡)、聚氧乙烯羊毛脂衍生物(例如聚氧乙烯羊毛脂)和聚氧乙烯脂肪酸酰胺(例如聚氧乙烯硬脂酸酰胺)；C₁₀-C₁₈烷基硫酸盐(例如鲸蜡基硫酸钠、月桂基硫酸钠、油基硫酸钠)、添加了平均2-4摩尔的环氧乙烷的聚氧乙烯C₁₀-C₁₈烷基醚硫酸盐(例如聚氧乙烯月桂基硫酸钠)和C₁-C₁₈烷基磺基琥珀酸酯盐(例如月桂基磺基琥珀酸酯钠)；以及天然表面活性剂，例如卵磷脂、甘油磷脂、鞘磷脂类(例如鞘磷脂)和C₁₂-C₁₈脂肪酸的蔗糖酯。优选的表面活性剂为聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯，例如聚山梨酯20、40、60或80，更优选地，为聚山梨酯20或聚山梨酯80。

表面活性剂的存在量通常为0.01％w/v至1.0％w/v，优选0.02％w/v至0.1％w/v甚或优选0.02％w/v至0.05％w/v。优选地，表面活性剂为聚山梨酯20或聚山梨酯80，且其含量为0.02％w/v至0.05％w/v，例如0.02、0.03、0.04或0.05％w/v。

在一个实施方案中，根据本发明用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法包括喷雾干燥蛋白质制剂，该制剂包含蛋白质，存在蔗糖或海藻糖或它们的混合物、一种或多种氨基酸和表面活性剂，所述的氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物，且所述表面活性剂选自聚山梨酯。优选地，所述的蛋白质为抗体或其片段，和/或所述聚山梨酯为聚山梨酯20。所述的抗体或其片段任选地缀合至聚合物，例如PEG。

a.制备蛋白质制剂，该制剂包含蛋白质、蔗糖或海藻糖或它们的混合物、一种或多种氨基酸和聚山梨酯表面活性剂，所述的氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物的；

b.喷雾干燥步骤a)中制备的蛋白质制剂；

c.回收步骤b)的喷雾干燥的蛋白质制剂；

其中重构时间RT1少于在没有蔗糖或海藻糖或它们的混合物和一种或多种氨基酸存在下制备的相同蛋白质制剂的重构时间，所述的氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物，其中所述的糖为二糖，且含量为1.0-20％w/v，并且其中所述一种或多种氨基酸的含量为50mM至200mM或大于50mM至200mM。优选地，所述的蛋白质为抗体或其片段，和/或所述的聚山梨酯表面活性剂为聚山梨酯20。所述的抗体或其片段任选地缀合至聚合物，例如PEG。

在另一个实施方案中，根据本发明用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法包括喷雾干燥蛋白质制剂，该制剂包含蛋白质，存在1％-20％w/v的蔗糖或海藻糖或它们的混合物、50mM至250mM的一种或多种氨基酸和0.01％w/v至1.0％w/v的聚山梨酯20，所述的氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物。优选地，所述的蛋白质为抗体或其片段。所述的抗体或其片段任选地缀合至聚合物，例如PEG。

a.制备蛋白质制剂，该制剂包含蛋白质、1％-20％的蔗糖或海藻糖或它们的混合物、10mM至250mM的一种或多种氨基酸和0.01％w/v至1.0％w/v的聚山梨酯20，所述的氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物；

b.喷雾干燥步骤a)中制备的蛋白质制剂；

c.回收步骤b)的喷雾干燥的蛋白质制剂；

在还另一个实施方案中，根据本发明用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法包括喷雾干燥蛋白质制剂，该制剂包含蛋白质，存在1.5％-4.5％w/v或2.5％-4.2％w/v的蔗糖或海藻糖或它们的混合物、50mM至200mM或大于50mM至200mM的一种或多种氨基酸和0.02％w/v至0.1％w/v的聚山梨酯20，所述的氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物。优选地，所述的蛋白质为抗体或其片段。所述的抗体或其片段任选地缀合至聚合物，例如PEG。

a.制备蛋白质制剂，该制剂包含蛋白质、1.5％-4.5％w/v或2.5％-4.2％w/v的蔗糖或海藻糖或它们的混合物、50mM至200mM或大于50mM至200mM的一种或多种氨基酸和0.02％w/v至0.1％w/v的聚山梨酯20，所述的氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物；

b.喷雾干燥步骤a)中制备的蛋白质制剂；

c.回收步骤b)的喷雾干燥的蛋白质制剂；

其中重构时间RT1少于在没有蔗糖或海藻糖和一种或多种氨基酸存在下制备的相同蛋白质制剂的重构时间，所述的氨基酸选自甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物。优选地，所述的蛋白质为抗体或其片段。所述的抗体或其片段任选地缀合至聚合物，例如PEG。

被喷雾干燥的蛋白质制剂具有4.0-7.5的pH，优选4.0-6.0，更优选5.0-6.0，例如5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。为了维持pH恒定，被喷雾干燥的蛋白质制剂包含缓冲剂。存在许多用于蛋白质制剂的制药领域中的缓冲剂，例如，但不限于柠檬酸盐、磷酸盐、乳酸盐、组氨酸、谷氨酸、马来酸盐、酒石酸盐或琥珀酸盐。优选的缓冲剂种类典型地选自具有接近(+/-1个pH单位)最佳蛋白质稳定性的优选pH的pKa的那些，以便维持高缓冲容量，并且与置于一系列改变的缓冲剂种类中时对特定蛋白质观察到的最大证实稳定性有关。制剂的适当pH范围通常选自与置于一系列改变的pH制剂中时对特定蛋白质所观察到的最大证实稳定性相关的范围。缓冲剂也可以为氨基酸或氨基酸的混合物，优选浓度为10mM至100mM，10mM至80mM，10mM至60mM，15mM至60mM，优选10mM至50mM，例如10、15、20、25、30、35、40、45或50mM。作为非限制性实例，缓冲剂可以是浓度为10mM至100mM的组氨酸缓冲剂。

在根据本发明的方法和工艺中可以使用另外的赋形剂。这些赋形剂包括，但不限于粘度增强剂，填充剂，增溶剂例如单糖，例如果糖，麦芽糖，半乳糖，葡萄糖，D-甘露糖，山梨糖等；多糖，例如棉子糖，松三糖，麦芽糊精，葡聚糖，淀粉等；以及多元醇，例如甘露糖醇，木糖醇，麦芽糖醇，乳糖醇，木糖醇山梨醇(山梨糖醇)等；聚乙二醇(例如PEG100、PEG300，PEG600、PEG1500、PEG2000、PEG3000、PEG3350、PEG4000、PEG6000、PEG8000或PEG20000)，聚乙烯吡咯烷酮，三甲胺N-氧化物，三甲基甘氨酸或它们的组合。

在将喷雾干燥的蛋白质制剂组合物施用于患者之前，需要用溶剂对其进行重构。在本发明中，优选的溶剂为含水溶剂，更优选含水溶剂为水，甚至更优选为无菌水。

本领域技术人员将理解，可以在回收根据本发明的所述喷雾干燥的蛋白质制剂后数天、数周或数月进行喷雾干燥的蛋白质制剂的重构。

用于重构的溶剂的体积决定了所得的重构喷雾干燥的蛋白质制剂中蛋白质，例如抗体或其片段的浓度。用比喷雾干燥前体积更小体积的溶剂重构提供的制剂比喷雾干燥之前更浓，反之亦然。重构比例(喷雾干燥前的蛋白质制剂的体积与用于重构喷雾干燥的蛋白质制剂的溶剂)可以在1：0.1至10：1之间变化。在一个优选的实施方案中，应用约1：0.5的比例，以使重构的喷雾干燥的蛋白质制剂中所得的蛋白质浓度是喷雾干燥之前蛋白质制剂的浓度的两倍。

本发明还提供了通过根据本发明的方法获得的喷雾干燥的蛋白质制剂。优选地，这种喷雾干燥的蛋白质制剂为抗体制剂或抗体片段的制剂。

可以将这种喷雾干燥的蛋白质制剂存储到适合的容器，例如小瓶、安瓿瓶、管、瓶或注射器(例如预装注射器)中，直到需要重构为止。所述容器可以为套件的组成部分，该套件包含一个或多个容器，所述容器包含根据本发明的方法获得的喷雾干燥的蛋白质制剂；用于重构喷雾干燥的蛋白质制剂的适合的溶剂；递送装置，例如注射器、预填充的注射器、自动注射器、无针头装置、植入物或贴剂或其他用于胃肠外施用的装置；以及使用说明书。

通过根据本发明的方法获得的蛋白质制剂或喷雾干燥的蛋白质制剂(或者一旦被重构，也称作重构蛋白质制剂)可用于疗法或诊断中。

以治疗有效量施用通过根据本发明的方法获得的重构的蛋白质制剂。本申请中所用的术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防目标疾病、障碍或病症或表现出可检测到的治疗、药理或预防作用所需的蛋白质(即抗体)的量。对于任何抗体或其抗原结合片段，可以最初在细胞培养测定法或动物模型中，通常在啮齿动物、兔、狗、猪或灵长类动物中估计治疗有效量。动物模型还可用于确定适合的浓度范围和施用途径。然后可以将此类信息用于确定在人体内施用的有用剂量和途径。

对人体受试者确切的治疗有效量将取决于疾病状态的严重程度，受试者的总体健康状况，受试者的年龄、体重和性别，膳食，施用时间和频率，药物组合，反应敏感性和对疗法的耐受性/反应。该量可以通过常规实验确定，并且在临床医师的判断范围内。通常，抗体的治疗有效量为0.01mg/kg至500mg/kg，例如0.1mg/kg至200mg/kg或1mg/kg至100mg/kg。

适合的剂量将根据例如所使用的特定抗体、所治疗的受试者、给药模式以及所治疗病症的性质和严重性而变化。在一个具体的实施方案中，通过皮下途径或作为肌内注射施用通过根据本发明的方法获得的重构的喷雾干燥的蛋白质制剂。

现在通过实施例并且参照附图中示例的实施方案进一步描述本发明。

实施例

实施例1

在pH5.6的30mM组氨酸、200mM山梨醇中160mg/ml浓度的水溶液中提供人源化IgG单克隆抗体(mAb1)，其具有约6.1的等电点(pI)。全部赋形剂获自Sigma-Aldrich(Steinheim^TM，德国)。使用体积至多为15ml的Amicon Ultra-15 30K(Millipore^TM)离心过滤器进行缓冲剂交换。进行2-3次稀释的四个循环，包括在20℃(相对离心力＝4000·g)下重复离心2小时。用pH 5.6的15mM组氨酸缓冲液制备储备溶液。所有制剂均包含2.5％蔗糖(相当于73mM蔗糖)。表1显示了本研究中使用的氨基酸的浓度。

表1

在缓冲剂交换后，用相应的储备溶液稀释制剂至mAb1的浓度为50mg/ml，然后喷雾干燥。

使用Büchi小型喷雾干燥机B-290进行喷雾干燥，出口空气通过除湿机(BüchiLabortechnik，Flawil，瑞士)。将入口温度设置在120℃，且出口温度在55-60℃之间。将抽吸器设置在100％，其相当于35m3/h的空气流速。液体进料流量的速率设定为3ml/min(根据10％泵速)，而雾化N2气流的速率为600l/h。用两流体喷嘴(0.7mm液体孔内径)将制剂(9-15ml)雾化。喷雾干燥后，通过旋风分离器将粉末收集在玻璃容器中，转移到塑料瓶中，并在2-8℃的冰箱中储存。对于每种制剂，将四个小瓶装满包含约100mg的mAb1的喷雾干燥的粉末。三个小瓶用于重构时间评价。

将喷雾干燥的制剂用0.9ml MilliQ水重构至约100mg/ml的浓度。目视观察并记录粉末完全溶解的时间。将一式三份的样品重构以研究给定制剂的重构时间的变化。重构时，用连接至Cary50Bio UV紫外可见分光光度计(Varian)的SoloVPE(CE Technologies)在280nm处的紫外吸光度未稀释的情况下测定mAb1的浓度，消光系数ε＝1.33ml.mg-1.cm-1。

将喷雾干燥的制剂一式三份重构，计算不同喷雾干燥的mAb1制剂的平均值和标准偏差。与2.5％蔗糖相比，全部制剂均显示出更快的重构时间，但使用亮氨酸和苯丙氨酸的制剂除外(图1)。包含亮氨酸的制剂显示出非常乳状的外观和存在大量聚集体(数据未显示)，这影响了重构时间。相反，包含苯丙氨酸的制剂是透明的，并且显示几乎没有形成(亚)可见的颗粒(数据未显示)，但是仍然导致比单独蔗糖更长的重构时间。这些实验表明，糖，例如蔗糖与氨基酸例如甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸，脯氨酸、赖氨酸和色氨酸的组合与单独的蔗糖相比减少了喷雾干燥的抗体制剂的重构时间。

实施例2

分析了表面活性剂对减少重构时间的影响。使用切向流渗滤将mAb1存储缓冲液与含有糖(0.1M)和乳酸盐(0.05M)或L-精氨酸HCl(0.24M)、海藻糖(0.1M)和L-组氨酸(0.05M)的储备水溶液(pH 5.0)进行交换。渗滤步骤后，将溶液进一步浓缩并过滤(聚醚砜，0.22um，Merck Millipore，Bedford Massachusetts，U.S.)。使用在280nm处UV吸光度与消光系数1.33(mg/ml)^-1cm^-1测量mAb1制剂的浓度，并将其调整为100mg/ml。通过添加剩余赋形剂的过滤(0.22um)的溶液来制备制剂筛选期间使用的进料溶液。向在SD方法参数筛选实验(表2)期间使用的溶液中掺入聚山梨酯20，并用超纯水稀释(1型(在25℃时ρ≥18.2MΩcm)，并且过滤(0.22um))至其终浓度。氢氧化钠储备溶液、L-组氨酸单盐酸盐一水合物和聚山梨酯20获自Merck(Darmstadt，德国)。L-精氨酸单盐酸盐、L-赖氨酸单盐酸盐和D(+)-海藻糖二水合物获自Sigma-Aldrich(St.Louis，Missouri，U.S.)。D(+)-蔗糖购自Applichem(Darmstadt，德国)。L-组氨酸购自Merck和Sigma-Aldrich，分别用于该制剂和喷雾干燥(SD)工艺参数筛选制剂。乳酸和盐酸储备溶液由Fisher scientific(Pittsburgh，Pennsylvania，U.S.)提供。

使用配备了0.7mm双流体喷嘴的BüchiB-290小型喷雾干燥机、高性能旋风分离器、小采集容器和B-296除湿机(Büchi Labortechnik AG,Flawil，瑞士)以50mg/ml的mAb1浓度和15ml的总进料体积喷雾干燥用于制剂筛选实验的进料溶液。设置基于内部程序，并对所有制剂筛选实验保持不变。将入口气温设置在120℃(监测出口温度，且范围在55-60℃之间)，入口空气流速为580l/min，喷嘴N²流速为10l/min，且将溶液进料速率设置在3ml/min。

然后将来自收集容器(收集器)的粉末与从旋风分离器中回收的粉末合并，并分配到2ml I型透明管状玻璃注射瓶(Schott AG，Mainz，德国)中，该瓶用FluroTec橡胶注射塞(West pharmaceutical services，West Whiteland Township，Pennsylvania，U.S.)和铝蜷曲密封件(Adelphi医疗保健包装，West Sussex，U.K.)封闭。最终，将样品在5℃或40℃下保存4周期限，然后在重构前在5℃下保存。

表2

将从制剂筛选设计的不同因子水平获得的数据用于拟合每个响应的包含标称因子的回归模型。由于JMP软件按项表示名义变量，其参数估计值在所有水平上平均为零，n水平名义因子将由n-1个指标变量表示以进行处理。因此，对于制剂筛选仅可以直接得到n-1个参数估计值，因为通过获取对应于某个水平的平均响应与所有水平的平均响应之差来计算参数估计值。然后，基于以下知识单独计算最终因子水平的参数估计值：将通过名义变量所有水平的参数估计值限制至总和为零，即，将最终项计算为其他n-1水平的估计值总和的负值。这意味着扩展的参数估计值之间存在依赖性(JMP Genomics 8手册)。

以100mg/ml(其为进料溶液中mAb1喷雾干燥前浓度的两倍)将喷雾干燥的制剂一式三份重构，并且图2中显示了所得模型的扩展参数估计值。对于表面活性剂因素和L-精氨酸HCl和L-组氨酸HCl的单一氨基酸盐水平，在0.05水平参数估计值显著。

添加聚山梨酯20代替糖并不会导致重构时间减少。图3显示了实施例1的包含蔗糖和甘氨酸、蔗糖和丙氨酸、蔗糖和精氨酸以及蔗糖和脯氨酸的mAb1的喷雾干燥制剂与包含聚山梨酯20而不是蔗糖的喷雾干燥制剂所获得的重构时间的比较。如图3中所示，在没有蔗糖存在下，对于氨基酸与表面活性剂组合，在每种情况下重构时间均较差。

类似地，如图4、5、6和7中所示，对于在有表面活性剂(聚山梨酯20)和糖(如图4和5中所示的蔗糖，或如图6和7中所示的海藻糖)存在，不存在一种或多种氨基酸例如L-精氨酸HCl、L-赖氨酸HCl、L-组氨酸HCL或它们的组合的情况下喷雾干燥的制剂，重构时间未减少。

实施例3

使用Amicon Ulta-15-30K(Millipore)离心过滤器将包含200mg/ml的Fab’-PEG抗体(具有约7.0的pI)的制剂与在10mM组氨酸缓冲液pH 5.5中氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺和精氨酸)和蔗糖的不同制剂进行了缓冲剂交换。

所制备的制剂如表3中所示。

表3

用连接至用于在喷雾干燥前预除湿干燥空气的除湿机B-296(无需设置)的BüchiB290小型喷雾干燥机对制剂进行喷雾干燥。使用表4中所示的工艺参数喷雾干燥包含50mg/mL Fab′-PEG抗体的制剂。

表4

参数	值
		吸气速率(气流入口)	35m<sup>3</sup>/h(设定:100％)
入口空温度	120℃
		喷嘴气流量	600L/h N2(设定:最大)
喷嘴	0.7mm
		泵速	～145mL/h(设定10％)
测量的空气出口温度	53-72℃

将喷雾干燥的产品用900μL MilliQ水重构，得到100mg/mL的浓度。测量粉末完全溶解成澄清溶液的时间。在t0时，将一式三份的样品重构以评价给定制剂的重构时间的变化。根据未用连接至Cary50Bio UV-可见分光光度计(Varian)的SoloVPE(CETechnologies)稀释的280nm处的UV吸收或在用Spectramax M5读板仪(MolecularDevices)稀释至约1mg/mL后的280nm处的UV吸收，测定了Fab’-PEG浓度，ε＝0.86mL.mg-1.cm-1。

如图8中所示，与不含甘氨酸的相同制剂相比，在2.5％蔗糖和增加浓度的甘氨酸存在下100mg/ml的Fab'-PEG抗体的喷雾干燥的制剂的重构时间减少(约25分钟)。

关于仅在2.5％蔗糖中包含Fab’-PEG抗体的制剂的重组时间，所测试的其它氨基酸也显示出优异效果。如图9中所示，关于单独蔗糖，包含所选择的氨基酸导致重构时间减少(Gln>Ala>Ser>Gly>Lys>Arg>Pro)。

实施例4

进一步分析了添加氨基酸和/或糖对重构时间的影响。以在15mM组氨酸pH 5.6中浓度为50mg/ml的水溶液提供mAb1。以不同的摩尔浓度(对于氨基酸为0、50、100和150mM，对于糖为30、75、120mM)各自测试了不同氨基酸(Arg-HCl；Gly-HCl，Lys-HCl和Pro-HCl)和一种糖(海藻糖)。

所制备的制剂如表5中所示。

表5

按照实施例3进行了制剂的喷雾干燥、重构和重构时间的评价。

如图10B中所示，与不含精氨酸的相同制剂相比，存在糖(在此为二糖海藻糖，不论摩尔浓度是多少)和增加浓度的精氨酸的50mg/ml(重构时100mg/mL)的mAb1的喷雾干燥制剂的重构时间减少(约22分钟)。图10C强调，当将糖和氨基酸的摩尔浓度合并时(累积摩尔浓度)，该作用进一步增强，直至达到平台(在此为约200mM累积摩尔浓度)。

相比之下，甘氨酸的存在没有改善mAb1的重构时间，无论其摩尔浓度或糖的摩尔浓度是多少。

考虑累积摩尔浓度时，其他所测试的氨基酸(脯氨酸和赖氨酸)也显示出重构时间减少的趋势(参见图12C和13C)，不过相比于使用精氨酸而言较不显著。

实施例5

用mAb2(人源化IgG单克隆抗体，具有约7.6的pI)以50mg/mL(重构时100mg/mL)进一步分析了添加氨基酸和糖对重构时间的影响。在0.01％w/v PS20(重构时0.02％w/v)存在下，在15mM组氨酸缓冲液pH 5.6中，仅以一种摩尔浓度(对于氨基酸为100mM，且对于糖为75mM)测试了不同氨基酸(Arg-HCl；Gly-HCl，Lys-HCl和Pro-HCl)和一种糖(海藻糖)。对照制剂不含氨基酸。

图14强调，尽管与仅包含75mM糖的制剂相比，所测试的所有氨基酸均能够减少重构时间，但使用精氨酸得到了最佳结果，接着是脯氨酸和赖氨酸。

Claims

1.用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法，其中该方法包括喷雾干燥蛋白质制剂，该蛋白质制剂包含蛋白质，存在糖和一种或多种氨基酸，其中所述的糖为二糖，且其含量为1.0至20％w/v，并且其中所述一种或多种氨基酸的含量为50mM至200mM或大于50mM至200mM。

2.根据权利要求1的方法，其中所述的蛋白质为抗体或其片段。

3.根据权利要求的1或2方法，其中所述的糖为蔗糖、海藻糖或它们的混合物。

4.根据上述权利要求任一项的方法，其中所述的氨基酸为甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物。

5.根据上述权利要求任一项的方法，其中所述的糖为蔗糖或海藻糖，且所述的氨基酸为L-精氨酸盐酸盐、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐或它们的混合物。

6.根据上述权利要求任一项的方法，其中该方法包括喷雾干燥蛋白质制剂，该蛋白质制剂还包含表面活性剂。

7.根据权利要求6的方法，其中所述的表面活性剂为聚山梨酯，优选聚山梨酯20。

8.用于减少喷雾干燥的蛋白质制剂的重构时间的方法，它包括下列步骤：

a.制备包含蛋白质、糖和一种或多种氨基酸的蛋白质制剂；

b.喷雾干燥步骤a)中制备的蛋白质制剂；

c.回收步骤b)的喷雾干燥的蛋白质制剂；

其中重构时间RT1少于在没有糖和一种或多种氨基酸的存在下制备的相同蛋白质制剂的重构时间，其中所述的糖为二糖，且其含量为1.0至20％w/v，并且其中所述一种或多种氨基酸的含量为50mM至200mM或大于50mM至200mM。

9.根据权利要求8的方法，其中所述的蛋白质为抗体或其片段。

10.根据权利要求8或9的方法，其中所述的糖为蔗糖、海藻糖或它们的混合物。

11.根据权利要求8至10任一项的方法，其中所述的氨基酸为甘氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸或它们的混合物。

12.根据权利要求8至11任一项的方法，其中所述的糖为蔗糖或海藻糖，且所述的氨基酸为L-精氨酸盐酸盐、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐或它们的混合物。

13.根据权利要求8至12任一项的方法，其中该方法包括喷雾干燥蛋白质制剂，该蛋白质制剂还包含表面活性剂。

14.根据权利要求13的方法，其中所述的表面活性剂为聚山梨酯，优选聚山梨酯20。

15.通过根据权利要求8至14任一项的方法得到的蛋白质制剂。

16.根据权利要求15的蛋白质制剂，其用于疗法或诊断中。